CN109152843A - Protac抗体缀合物及其使用方法 - Google Patents

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L·施塔本
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P·阿迪卡里
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Abstract

本申请所述的主题涉及抗体‑PROTAC缀合物(PAC)、含有它们的药物组合物以及其在治疗其中靶标蛋白降解是有益的疾病和病症中的用途。

Description

PROTAC抗体缀合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月20日提交的美国临时申请62/339,257的权益，将其全部内容通过引用的方式并入本申请。
通过EFS-WEB提交为文本文件的序列表的引用
序列表的官方副本通过EFS-Web以电子方式提交，作为ASCII格式的序列表，其中包含一个名为SEQLIST.TXT的文件，该文件于2016年5月20日创建，大小为77千字节并与说明书同时提交。该ASCII格式文档中包含的序列表是说明书的一部分并且将其全部内容通过引用的方式并入本申请。有意地省略SEQ ID NOs.1-6。
技术领域
本申请所述的主题涉及抗体-(蛋白水解-靶标嵌合体(proteolysis-targetingchimera,PROTAC))缀合物分子，其用于促进靶标蛋白的细胞内降解。
背景技术
细胞维持和正常功能需要细胞蛋白的受控降解。例如，调节蛋白的降解引发细胞周期中的事件，诸如DNA复制、染色体分离等。因此，蛋白的这种降解对细胞的增殖、分化和死亡具有影响。
虽然蛋白抑制剂可以阻断或降低细胞中的蛋白活性，但细胞中的蛋白降解也可以降低活性或完全除去靶标蛋白。因此，利用细胞的蛋白降解途径可以提供减少或除去蛋白活性的手段。细胞的主要降解途径之一被称为泛素-蛋白酶体系统。在该系统中，通过使蛋白泛素化将蛋白标记以由蛋白酶体降解。蛋白的泛素化是通过E3泛素连接酶实现的，该连接酶与蛋白结合并将泛素分子添加到蛋白中。所述E3泛素连接酶是包括E1和E2泛素连接酶的途径的一部分，其使泛素可被用于E3泛素连接酶以添加到蛋白中。
为了利用这种降解途径，已经开发出PROTAC。PROTAC将E3泛素连接酶与蛋白结合在一起，该蛋白可用于降解。为了促进蛋白被蛋白酶体降解，PROTAC由与E3泛素连接酶结合的基团和与希望降解的蛋白结合的基团组成。这些基团通常与接头连接。这种分子构建体可以使E3泛素连接酶与蛋白接近，从而使其泛素化并被标记以降解。
本领域一直需要将PROTAC增强地并靶向递送至含有蛋白靶标的细胞。使用抗体-PROTAC缀合物的靶标递送可以使用抗体的特异性增强PROTAC向特定细胞的递送并且还可以相对于PROTAC的其他给药模式诸如输注来增强PROTAC递送至细胞的药代动力学。
发明内容
在一方面，本申请所述的主题涉及具有下式的PROTAC-抗体缀合物(PAC)：
Ab―(L1―D)p
其中D为具有结构E3LB―L2―PB的PROTAC；其中E3LB为E3连接酶结合基团，其共价结合至L2；L2为接头，其共价结合至E3LB和PB；PB为蛋白结合基团，其共价结合至L2；Ab为抗体，其共价结合至L1；L1为接头，其共价结合至Ab和D；且p具有约1至约8的值。
本申请所述的主题的另一方面为药物组合物，其包含PAC和一种或多种药用赋形剂。
本申请所述的主题的另一方面为PAC在治疗病症和疾病的方法中的用途，通过对受试者给予包含PAC的药物组合物。
本申请所述的主题的另一方面为制备PAC的方法。
本申请所述的主题的另一方面为制品，其包括包含PAC的药物组合物、容器和包装说明书或标签，所述包装说明书或标签指明所述药物组合物可用于治疗疾病或病症。
附图说明
图1显示通过蛋白质印迹针对PROTAC(不含Ab)、化合物P1以及PROTAC-抗体缀合物(PAC)PAC1和PAC2检测ER-α。
图2描绘了针对在工程化的HER2-MCF7细胞系中处理3天的Endox-XIAP PAC如通过荧光强度确定的ERα的定量。介质：10％CS-FBS/无酚红RPMI。
具体实施方式
本申请公开了抗体-蛋白水解靶标嵌合体缀合物，其在本申请称为PROTAC-抗体缀合物(PAC)，其用于靶标的蛋白降解以及治疗相关疾病和病症。本申请所述的主题利用抗体靶标将PROTAC导向至靶标细胞或组织。如本文所述，已显示将抗体与PROTAC连接以形成PAC，其将PROTAC递送至靶标细胞或组织。如本文所示，例如在实施例1和2中，表达抗原的细胞可以被抗原特异性PAC靶标，由此PAC的PROTAC部分在细胞内递送至靶标细胞。同样如本文所示，包含针对细胞上未发现的抗原的抗体的PAC不会导致PROTAC向细胞的显著的细胞内递送。
因此，本申请所述的主题涉及PROTAC-抗体缀合物(PAC)组合物，其导致靶标蛋白的泛素化以及随后的蛋白降解。该组合物包含共价连接至接头(L1)的抗体，其在任何可与PROTAC的连接点处共价连接，其中所述PROTAC包含E3泛素连接酶结合(E3LB)部分，其中所述E3LB部分识别E3泛素连接酶蛋白和蛋白结合部分(PB)，后者识别靶标蛋白。本申请所述的主题用于调节蛋白活性并且治疗与蛋白活性相关的疾病和病症。
现在将在下文中更全面地描述本发明公开的主题。然而，本发明主题所属领域的技术人员将会想到本文所述的本公开主题的许多修改和其他实施方案，其具有前述描述中呈现的教导的益处。因此，应理解，本申请公开的主题不限于所公开的特定实施方案并且修改和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。换句话说，本文描述的主题涵盖所有替代、修改和等同物。如果所引用的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包括但不限于定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用的方式将其全部内容并入本申请。
I.定义
术语“PROTAC”是指蛋白水解-靶标嵌合体分子，其通常具有三种组分，即E3泛素连接酶结合基团(E3LB)、接头L2和蛋白结合基团(PB)。
术语“残基”、“部分”或“基团”是指与另一组分共价结合或连接的组分。例如，“PROTAC的残基”是指PROTAC，其共价连接至一个或多个基团诸如接头L2，其本身可任选进一步连接至抗体。
术语“共价结合”或“共价连接”是指通过共享一个或多个电子对所形成的化学键。
本申请使用的术语“肽模拟物”或PM是指非肽化学部分。肽是通过肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的短链，当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时形成共价化学键。最短的肽是二肽，其由通过单个肽键连接的2个氨基酸组成，然后是三肽、四肽等。肽模拟化学部分包括非氨基酸化学部分。肽模拟化学部分也可包括一个或多个氨基酸，其被一个或多个非氨基酸化学单元分隔。肽模拟化学部分不在其化学结构的任何部分中含有两个或多个由肽键连接的相邻的氨基酸。
本申请的术语“抗体”以最广泛的意义使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出所需生物活性(Miller et al(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或衍生自其他物种。抗体是由免疫系统生成的能够识别并结合特异性抗原的蛋白质(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5th Ed.,Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有多个结合位点，也称作表位，其由多种抗体上的CDR(互补决定区)识别。特异性结合不同表位的每一抗体具有不同结构。因此，一种抗原可具有多于一种的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性地结合目标靶标抗原或其部分的抗原结合位点的分子，这些靶标包括但不限于癌细胞或产生与自体免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文公开的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来自任何物种。然而，在一个方面，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。
本申请使用的术语"抗体片段"包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微型抗体(Olafsen et al(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)，由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体，CDR(互补决定区)和免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的本文所述的任何抗体的表位结合片段，单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本申请使用的术语“单克隆抗体”是指自大致上均质抗体的群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，从而针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。除特异性外，单克隆抗体的优势还在于，其合成不会受到其他抗体的污染。修饰语“单克隆”指示抗体是从大致上均质的抗体群体获得的特性且不应解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler et al(1975)Nature,256:495描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如：US 4816567；US5807715)。单克隆抗体也可以使用例如Clackson et al(1991)Nature,352:624-628；Markset al(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597所述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
本文中的单克隆抗体尤其包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体种类或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体种类或子类的抗体中的相应序列相同或同源以及这类抗体的片段，只要其展现所需生物活性(US 4816567；和Morrison et al(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。本文中的目标嵌合抗体包括包含源于非人灵长类动物(例如旧世界猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来自不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指由其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本申请使用的术语“完整抗体”是包含VL结构域和VH结构域以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域、CH1、CH2及CH3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，其指可归因于抗体Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及细胞表面受体(诸如B细胞受体和BCR)的下调。
本申请使用的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C端区。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另有规定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所描述。
本申请使用的术语“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文中定义的Fc区的重链的抗体。
“人抗体”为具有某一氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或来源于利用人抗体全部组成成分或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的大致上全部，其中全部或大致上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR并且全部或大致上全部FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已进行人源化的抗体。
“分离的抗体”为已与天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至纯度大于95％或99％，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或反相HPLC)所测定的。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B
848:79-87(2007)。
“分离的核酸”是指已从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
“编码抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单个载体中的这种核酸分子或单独的载体以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的核酸分子。
“裸抗体”是指与异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标签不缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N末端至C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端至C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，之后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以指定为两种类型之一，称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于测定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的多种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司创造且原始码已与用户文件一起在美国版权办公室(U.S.Copyright Office,WashingtonD.C.,20559)备案，其中其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可公开从Genentech公司(South San Francisco,California)获得，或可从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用于UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上。所有序列比较参数皆由ALIGN-2程序设置且不改变。
在其中使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对于、与或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以可替代地表述为给定氨基酸A具有或包含相对于、与或针对给定氨基酸序列B的特定氨基酸序列同一性％)如下计算：
100乘以分数X/Y
其中X是在序列比对程序ALIGN-2的A和B的比对中由该程序记录为相同匹配的氨基酸残基的数目并且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别说明，否则本文使用的所有氨基酸序列同一性％值如在紧接的前述段落中所述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
取决于其重链的恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可分成不同的“类别”。存在五种主要类别的完整免疫球蛋白抗体：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM并且这些类别中的几种可进一步分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA以及IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux et al(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund et al(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US 2005/0048572；US2004/0229310)。
本申请使用的术语“人共有框架”为代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的框架。一般说来，人免疫球蛋白VL或VH序列选自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组为如Kabat等(上文)中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组为如Kabat等(上文)中的亚组III。
用于本文目的的“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下定义。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以包含氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下或2以下。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与使抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似结构，其中各结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt et al.KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域来分离以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域的在序列方面高度可变和/或形成结构确定环(“高变环”)的各区。一般说来，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)处(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65及H3的氨基酸残基95-102处(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含作为接触抗原的残基的“特异性决定残基”或“SDR”。SDR包含在CDR的称为缩短CDR或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58及H3的氨基酸残基95-102处(See Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指示，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如FR残基)在本文中是根据Kabat等(上文)加以编号。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
术语“表位”是指抗原分子上的抗体所结合的特定位点。
“表位4D5”或“4D5表位”或“4D5”是抗体4D5(ATCC CRL 10463)和曲妥珠单抗结合的HER2细胞外结构域中的区域。该表位接近HER2的跨膜结构域并且在HER2的结构域IV内。为了筛选与4D5表位结合的抗体，可以进行常规的交叉阻断测定，例如描述于Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中。或者，可以进行表位作图以评估抗体是否结合HER2的4D5表位(例如HER2的约残基550至约610的区域中的任何一个或多个残基(SEQ ID NO:39))。
“表位2C4”或“2C4表位”是抗体2C4结合的HER2的细胞外结构域中的区域。为了筛选与2C4表位结合的抗体，可以进行常规的交叉阻断测定，例如described in Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所述的测定。或者，可以进行表位作图以评估抗体是否结合HER2的2C4表位。表位2C4包含来自HER2细胞外结构域中的结构域II的残基。2C4抗体和帕妥珠单抗在结构域I、II和III的连接处结合HER2的细胞外结构域(Franklin et al.Cancer Cell 5:317-328(2004))。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法(包括本文所述的)加以测量。测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案在下文中描述。在某些实施方案中，本申请所述的抗体所具有的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这种改变的亲本抗体相比，这种改变导致抗体对抗原的亲和力提高。
如本文所用的术语“载体”是指能够使其所连接的另一种核酸增殖的核酸分子。所述术语包括呈自我复制核酸结构的载体以及并入其已引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用的术语“游离半胱氨酸氨基酸”是指半胱氨酸氨基酸残基，其已被改造为亲本抗体，具有硫醇官能团(-SH)并且不配对作为分子内或分子间二硫键。本文所用的术语“氨基酸”是指甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或瓜氨酸。
本申请使用的术语“接头”、“接头单元”或“连接物”是指化学部分，其包含将PROTAC部分共价连接至抗体的原子链，或将PROTAC的组分连接至PROTAC的另一组分。在各个实施方案中，接头是二价基团，指定为L1或L2。
“患者”、“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人和非人灵长类，诸如猴)、兔以及啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，所述患者、个体或受试者为人。在一些实施方案中，所述患者可为“癌症患者”，即患有或有风险患有癌症的一种或多种症状的患者。
“患者群体”是指一组癌症患者。所述群体可用于证明药物的统计学显著功效和/或安全性。
“复发”患者是在缓解后有癌症体征或症状的患者。任选地，患者在辅助或新辅助治疗后复发。
“显示HER表达、扩增或活化”的癌症或生物样品是在诊断测试中表达(包括过表达)HER受体的癌症或生物样品，其已经扩增HER基因，和/或以其他方式证明HER受体的活化或磷酸化。
“新辅助治疗”或“术前治疗”在本文中是指在手术前给予的疗法。新辅助治疗的目标是提供即时的全身治疗，可能根除微转移，其如果遵循手术的标准序列，然后进行全身治疗，则微转移会增殖。新辅助治疗还可以帮助减小肿瘤大小，从而允许完全切除最初不可切除的肿瘤或保留器官的部分及其功能。此外，新辅助治疗允许体内评估药物功效，这可以指导后续治疗的选择。
“辅助治疗”在本文中是指在确定性手术后给予的治疗，其中不能检测到残留疾病的证据，从而降低疾病复发的风险。辅助治疗的目标是预防癌症复发，从而减少癌症相关死亡的机会。本文的辅助治疗特别排除了新辅助治疗。
使用“确定性手术”，因为该术语在医学界内使用。确定性手术包括例如手术或外科手术，其导致肿瘤的去除或切除，包括导致去除或切除所有明显可见肿瘤的手术。确定性手术包括例如完全或治愈性切除或完全切除肿瘤。确定性手术包括在一个或多个阶段中发生的手术并且包括例如在切除肿瘤之前执行一个或多个手术或其他手术的多阶段外科手术。确定性手术包括移除或切除肿瘤的程序，包括涉及的器官、器官和组织的部分以及周围器官，例如淋巴结，器官或组织的一部分。去除可能是不完整的，使得即使未检测到肿瘤细胞也可能保留。
“存活”是指患者保持存活并且包括无疾病存活(DFS)、无进展存活(PFS)和整体存活(OS)。可以通过Kaplan-Meier方法估计存活率并且使用分层对数秩检验计算存活率的任何差异。
“无进展存活”(PFS)是从治疗的第一天到记录的疾病进展(包括分离的CNS进展)或研究中任何原因导致的死亡的时间，以先发生者为准。
“无疾病存活(DFS)”是指患者在没有复发癌症的情况下保持存活一段规定的时间，例如从开始治疗或初步诊断起约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年等。在本文所述主题的一个方面，根据意在治疗(intent-to-treat)原则分析DFS，即，基于其指定的治疗评估患者。在DFS分析中使用的事件可以包括癌症的局部、区域和远处复发，继发性癌症的发生以及没有先前事件(例如乳癌复发或第二原发癌症)的患者的任何原因导致的死亡。
整体存活”是指从开始治疗或初始诊断开始，患者保持存活一段规定的时间，例如约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年等。
“延长存活”是指相对于未治疗的患者，或相对于对照治疗方案，增加治疗患者的DFS和/或OS。监测存活在开始治疗后或初步诊断后至少约六个月，或至少约1年，或至少约2年，或至少约3年，或至少约4年，或至少约5年，或至少约10年，等等。
“单一疗法”是指治疗方案，其在治疗期间仅包括用于治疗癌症或肿瘤的单一治疗剂。
“维持治疗”是指用于降低疾病复发或进展的可能性的治疗方案。可以提供维持治疗任何时间长度，包括直到受试者寿命的延长时间段。可在初始治疗后或与初始或其他疗法一起提供维持治疗。用于维持治疗的剂量可以变化并且与用于其他类型治疗的剂量相比可以包括减少的剂量。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用且是指其中已引入外源性核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和自其衍生的后代，而不考虑传代次数。子代在核酸内含物方面可能不完全与母细胞相同，而是可能含有突变。本文包括具有如在原始转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变型子代。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长/增殖不受调控的生理病状。“肿瘤”包括一种或多种癌性细胞。在本申请其他处提供癌症的实例。
“HER2阳性”癌症包括具有高于正常水平的HER2的癌细胞。HER2阳性癌症的实例包括HER2阳性乳腺癌和HER2阳性胃癌。任选地，HER2阳性癌症具有2+或3+的免疫组织化学(IHC)评分和/或≥2.0的原位杂交(ISH)扩增比。术语“HER2阳性细胞”是指在其表面上表达HER2的细胞。
术语“早期乳癌(EBC)”或“早发乳癌”在本文中用于指未扩散到乳房或腋窝淋巴结之外的乳腺癌。这包括原位导管癌和I期、IIA期、IIB期和IIIA期乳癌。
将肿瘤或癌症称为“阶段0”、“阶段I”、“阶段II”、“阶段III”或“阶段IV”以及该分类中的各个子阶段，表示肿瘤或癌症的分类，其使用本领域已知的整体阶段分组或罗马数字分期方法。虽然癌症的实际阶段取决于癌症的类型，但一般来说，0期癌症是原位病变，I期癌症是局部小肿瘤，II期和III期癌症是局部晚期肿瘤，其表现为牵涉局部淋巴结以及IV期癌症代表转移性癌症。每种类型肿瘤的具体阶段是本领域临床医生已知的。
术语“转移性乳癌”是指乳癌的状态，其中癌细胞通过血管或淋巴管从原始部位传递到身体其他部位的一个或多个部位，以在一个或多个除乳房之外的器官中形成一个或多个继发性肿瘤。
“晚期”癌症是通过局部侵袭或转移扩散到原位或器官之外的癌症。因此，术语“晚期”癌症包括局部晚期和转移性疾病。“复发性”癌症是在对初始治疗例如手术的反应后在初始部位或远处部位再生的癌症。“局部复发性”癌症是在与先前治疗的癌症相同的位置治疗后复发的癌症。“可手术的”或“可切除的”癌症是这样的癌症，其局限于主要器官并且适于手术(切除)。“非切除的”或“不可切除的”癌症不能通过手术去除(切除)。
本申请使用的术语“细胞毒素剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒素剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核溶酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下面公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括：烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；乙撑亚胺类和甲基密胺类，包括六甲密胺、曲他胺、三乙撑膦酰胺、三乙撑硫化磷酰胺和三羟甲密胺；番荔枝内酯类(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚,)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱类；白桦脂酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康CPT-11(伊立替康,)、乙酰基喜树碱、东莨菪素和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；cryptophycin类(具体为cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；duocarmycin(包括合成类似物即KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如刺孢霉素，尤其是刺孢霉素γ1I和刺孢霉素ωI1(参见例如Nicolaou等人,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323即一种口服α-4整合素抑制剂；dynemicin，包括dynemicin A；埃斯培拉霉素；及新抑癌蛋白生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、aclacinomysin类、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素类、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉子基多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂脂质体多柔比星TLC D-99聚乙二醇化脂质体多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类例如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢剂，例如甲氨喋呤、吉西他滨替加氟卡培他滨埃坡霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨喋呤、喋罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、伊诺他滨、氟尿苷；雄激素类，例如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素剂，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；伊达曲杀；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；根瘤菌剂；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基肼；丙卡巴肼；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2’-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉烷，例如紫杉醇紫杉醇白蛋白工程化纳米粒制剂(ABRAXANETM)和多西他赛苯丁酸氮芥；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂剂，例如顺铂、奥沙利铂(例如)和卡铂；长春胺类，其使微管蛋白聚合不会形成微管，包括长春碱长春新碱长春地辛和长春瑞滨依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；亚叶酸；诺消灵；伊达曲杀；柔红霉素；氨基喋呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇类，例如维甲酸，包括贝沙罗汀二膦酸盐，例如氯膦酸盐(例如或)、依替膦酸盐NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐阿伦膦酸盐帕米膦酸盐替鲁膦酸盐或利塞膦酸盐曲沙他滨(一种1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，具体为对异常细胞增殖所涉及的信号传导途径中的基因表达进行抑制的那些反义寡核苷酸，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如)；rmRH(例如)；BAY439006(索拉非尼；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼,Pfizer)；哌立福辛、COX-2抑制剂(例如塞来考昔或艾托考昔)、蛋白体抑制剂(例如PS341)；硼替佐米CCI-779；替吡法尼(R11577)；索拉非尼、ABT510；Bcl-2抑制剂，例如奥利默森钠(一种反义寡核苷酸)；pixantrone；EGFR抑制剂(参见以下定义)；酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，例如雷帕霉素(西罗莫司,)；法尼基转移酶抑制剂，例如洛那法尼(SCH 6636,SARASARTM)；和上述任何物质的药用盐、酸或衍生物；及上述两种或更多种物质的组合，例如CHOP即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写；及FOLFOX即用奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和亚叶酸的组合进行的治疗方案的缩写。
本申请定义的化学治疗剂包括用于使可促进癌症生长的激素作用得以调节、降低、阻断或抑制的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。其可为激素本身，包括但不局限于：具有混合型激动剂/拮抗剂性质的抗雌激素剂，包括他莫昔芬4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬艾多昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬曲沃昔芬、雷洛西芬和选择性雌激素受体调节剂(SERM)例如SERM3；不具有激动剂性质的纯抗雌激素剂，例如氟维司群和EM800(上述药物可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、增加ER转化和/或压制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括甾体芳香酶抑制剂例如福美坦和依西美坦和非甾体芳香酶抑制剂例如阿那曲唑来曲唑和氨鲁米特及其它芳香酶抑制剂，包括伏氯唑醋酸甲地孕酮法倔唑和4(5)-咪唑类；黄体化激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(和)、戈舍瑞林、布舍瑞林和曲普瑞林；性甾体，包括妊娠素类例如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮、雌激素类例如己烯雌酚和倍美力及雄激素类/类视黄醇类例如氟甲睾酮、全反式视黄酸和芬维A胺；奥那司酮；抗黄体酮类；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；及上述任何物质的药用盐、酸或衍生物；及上述两种或更多种物质的组合。
本申请针对辅助疗法而使用的术语“免疫抑制剂”是指用于使本申请所治疗的哺乳动物的免疫系统得以抑制或屏蔽的物质。其可包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或屏蔽MHC抗原的物质。上述药物的实例包括：2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利4,665,077)；非甾体抗炎剂(NSAID)；更昔洛韦、他克莫司、糖皮质激素例如考的松或醛固酮、抗炎剂例如环氧化酶抑制剂、5-脂氧化酶抑制剂或白细胞三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂，例如硫唑嘌呤或霉酚酸酯(MMF)；烷化剂，例如环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其如美国专利4,120,649所描述的那样屏蔽MHC抗原)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；甾体，例如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物例如泼尼松、包括SOLU-琥珀酸甲泼尼龙钠在内的甲泼尼龙和地塞米松；二氢叶酸还原酶抑制剂，例如甲氨喋呤(口服或皮下)；抗疟剂，例如氯喹和羟氯喹；柳氮磺吡啶；来氟米特；细胞因子或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(英夫利昔单抗或阿达木单抗)、抗TNF-α免疫粘合素(依那西普)、抗TNF-β抗体、抗白细胞介素-2(IL-2)抗体、抗IL-2受体抗体、抗白细胞介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂(例如ACTEMRATM(托珠单抗))；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异种抗淋巴细胞球蛋白；泛T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(在90年7月26日公开的WO90/08187)；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T细胞受体(Cohen等人,美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等人,Science,251:430-432(1991)；WO90/11294；Ianeway,Nature,341:482(1989)；和WO91/01133)；BAFF拮抗剂，例如BAFF抗体、BR3抗体和zTNF4拮抗剂(综述参见Mackay和Mackay,Trends Immunol.,23:113-5(2002)且也参见以下定义)；对T细胞辅助信号进行干扰的生物剂，例如抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)，包括针对CD40-CD40配体的阻断性抗体(例如Durie等人,Science,261:1328-30(1993)；Mohan等人,J.Immunol.,154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck等人,Science,265:1225-7(1994))；及T细胞受体抗体(EP340,109)，例如T10B9。本申请一些优选的免疫抑制剂包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、来氟米特、MMF或甲氨喋呤。
本申请使用的“治疗”是指试图使所治疗的个体的自然过程发生改变的临床介入且可出于预防目的而进行或在临床病理过程中进行。所期望的治疗作用包括但不局限于预防疾病发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理结果、预防转移、降低疾病进展速率、使疾病状态转佳或减轻和缓和或改善预后。在一些实施方案中，本申请抗体用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。
与一种或多种其它药物“并行”给药的药物在与所述一种或多种其它药物相同的治疗周期中、在与所述一种或多种其它药物相同的治疗日且任选在与所述一种或多种其它药物相同的时间给药。例如，就每3周给予一次的癌症疗法而言并行给药的药物各自在3周周期的第1日给药。
试剂例如药物制剂的“有效量”是指在按照剂量且持续必要时段的情况下有效实现所需要的治疗或预防结果的量。例如，药物用于治疗癌症的有效量可减少癌症细胞数目；减小肿瘤尺寸；抑制(即在一定程度上减缓且优选停止)癌症细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓且优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。当药物可阻止生长和/或杀死现有癌症细胞时，其可以是细胞抑制性和/或细胞毒性的。有效量可延长无进展存活(例如通过实体瘤响应评价标准(RECIST)或CA-125变化来测量)、引起客观响应(包括部分响应(PR)或完全响应(CR))、增加整体存活时间和/或改善癌症的一种或多种症状(例如通过FOSI来评价)。
本申请使用的术语“治疗有效量”是指与未接受该量的相应受试者相比导致疾病、病症或副作用的治疗或疾病或病症的进展率降低的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。针对治疗用途，治疗有效量的PAC及其盐可以作为原料化学品给药。另外，活性成分可以作为药物组合物存在。
如本文所用，除非在权利要求中另外定义，否则术语“任选地”意指随后描述的事件可能发生或可能不发生并且包括发生的事件和不发生的事件。
如本文所用，除非另外定义，否则术语“任选取代”、“取代”或其变体表示任选取代，包括多个取代度，取代有一个或多个取代基，例如一个、两个或三个。该短语不应被解释为与本文描述和描述的取代重复。
术语“药物制剂”是指以下制剂，其形式使其所含有的活性成分的生物活性是有效的且其不含有任何对于接受所述制剂的受试者来说具有不可接受的毒性的额外组分。
“药用赋形剂”是指药物制剂中除活性成分外的成分，其对于受试者来说是无毒性的。药用载体包括但不局限于缓冲剂、载体、稳定剂或防腐剂。
本申请使用的短语“药用盐”是指分子的药用有机或无机盐。示例性盐包括但不局限于硫酸盐、枸橼酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式枸橼酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1,1’-亚甲基-二(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药用盐可涉及包含其它分子例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可为使母体化合物上的电荷得以稳定任何有机或无机部分。另外，药用盐在其结构中可具有多于一个荷电原子。在多个荷电原子为药用盐的部分的情况下可具有多个抗衡离子。因此，药用盐可具有一个或多个荷电原子和/或一个或多个抗衡离子。
其它非药用盐可用于制备本申请所述的化合物并且这些盐应被视为形成本主题的另一方面。这些盐，例如草酸盐或三氟乙酸盐，虽然本身不是药学上可接受的，但可用于制备可用作获得本文所述化合物及其药用盐的中间体的盐。
本申请使用的术语“多数”是指两个或多个缀合物。每个缀合物可以与多个缀合物中的任何其他缀合物相同或不同。
“小分子”或“小分子化合物”通常是指尺寸小于约5千道尔顿(Kd)的有机分子。在一些实施方案中，所述小分子小于约4Kd、3Kd、约2Kd或约1Kd。在一些实施方案中，所述小分子小于约800道尔顿(D)、约600D、约500D、约400D、约300D、约200D或约100D。在一些实施方案中，小分子小于约2000g/mol、小于约1500g/mol、小于约1000g/mol、小于约800g/mol或小于约500g/mol。在一些实施方案中，小分子为非聚合物。小分子不是蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、多糖、糖蛋白、蛋白多糖等。小分子的衍生物是指与原始小分子具有相同结构核心的分子，但可以是由原始小分子的一系列化学反应制备。
本申请使用的术语“烷基”是指长度为一个至十二个碳原子(C1-C12)的饱和的直链或支链的一价的烃基，其中所述烷基可任选独立取代有一个或多个下述取代基。在另一个实施方案中，烷基具有一个至八个碳原子(C1-C8)或一个至六个碳原子(C1-C6)。烷基的实例包括但不局限于甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3、1-庚基、1-辛基等。
本申请使用的术语“亚烷基”是指长度为一个至十二个碳原子(C1-C12)的饱和的直链或支链的二价的烃基，其中所述亚烷基可任选独立取代有一个或多个下述取代基。在另一个实施方案中，亚烷基具有一个至八个碳原子(C1-C8)或一个至六个碳原子(C1-C6)。亚烷基的实例包括但不局限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)等。
术语“烯基”是指长度为两个至八个碳原子(C2-C8)的具有至少一个不饱和位置即碳-碳sp2双键的直链或支链的一价的烃基，其中所述烯基可任选独立取代有一个或多个本申请所描述的取代基且包括具有“顺式”和“反式”取向或“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不局限于乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)等。
术语“亚烯基”是指长度为两个至八个碳原子(C2-C8)的具有至少一个不饱和位置即碳-碳sp2双键的直链或支链的二价的烃基，其中所述亚烯基可任选独立取代有一个或多个本申请所描述的取代基且包括具有“顺式”和“反式”取向或“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不局限于亚乙烯基(-CH＝CH-)、亚烯丙基(-CH2CH＝CH-)等。
术语“炔基”是指长度为两个至八个碳原子(C2-C8)的具有至少一个不饱和位置即碳-碳sp叁键的直链或支链的一价的烃基，其中所述炔基可任选独立取代有一个或多个本申请所描述的取代基。实例包括但不局限于乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基、-CH2C≡CH)等。
术语“亚炔基”是指长度为两个至八个碳原子(C2-C8)的具有至少一个不饱和位置即碳-碳sp叁键的直链或支链的二价的烃基，其中所述亚炔基可任选独立取代有一个或多个本申请所描述的取代基。实例包括但不局限于亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基(亚炔丙基、-CH2C≡C-)等。
术语“碳环”、“碳环基”和“环烷基”是指具有3-12个碳原子(C3-C12)呈单环形式或具有7-12个碳原子呈二环形式的一价的非芳族的饱和或部分不饱和的环。具有7至12个原子的二环碳环可排列成例如二环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，而具有9或10个环原子的二环碳环可排列成二环[5,6]或[6,6]系统或桥接系统例如二环[2.2.1]庚烷、二环[2.2.2]辛烷和二环[3.2.2]壬烷。螺环部分也包括在该定义的范围内。单环碳环的实例包括但不局限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等。碳环基任选独立取代有一个或多个本申请所描述的取代基。
“芳基”意指具有6-20个碳原子(C6-C20)的通过由母体芳环系统的一个碳原子除去一个氢原子而衍生的一价的芳族的烃基。一些芳基在示例性结构中表示为“Ar”。芳基包括二环基团，其包含与饱和环、部分不饱和环或芳族碳环稠合的芳环。典型的芳基包括但不局限于来源于苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、联苯、茚、茚满、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘等的基团。芳基任选独立取代有一个或多个本申请所描述的取代基。
“亚芳基”意指具有6-20个碳原子(C6-C20)的通过由母体芳环系统的两个碳原子除去两个氢原子而衍生的二价的芳族的烃基。一些亚芳基在示例性结构中表示为“Ar”。亚芳基包括二环基团，其包含与饱和环、部分不饱和环或芳族碳环稠合的芳环。典型的亚芳基包括但不局限于来源于苯(亚苯基)、取代的苯、萘、蒽、联苯、茚、茚满、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘等的基团。亚芳基任选取代有一个或多个本申请所描述的取代基。
术语“杂环”和“杂环基”在本申请中可互换使用且是指具有3至约20个环原子的饱和或部分不饱和(即在环中具有一个或多个双键和/或叁键)的碳环基团，其中至少一个环原子为选自氮、氧、磷和硫的杂原子，其余环原子为C，其中一个或多个环原子任选独立取代有一个或多个下述取代基。杂环可为具有3-7个环成员(2-6个碳原子和1-4个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7-10个环成员(4-9个碳原子和1-6个选自N、O、P和S的杂原子)的二环例如二环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。杂环参见Paquette,Leo A.；“Principles ofModern Heterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968)，具体为第1、3、4、6、7和9章；“The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs”(JohnWiley&Sons,New York,1950年至今)，具体为第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。“杂环基”还包括以下基团，其中杂环基团与饱和环、部分不饱和环或芳族碳环或杂环稠合。杂环的实例包括但不局限于吗啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯烷-1-基、硫吗啉-4-基、S,S-二氧代硫吗啉-4-基、氮杂环辛烷-1-基、氮杂环丁烷-1-基、八氢吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮杂环庚烷-1-基、吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶子基、吗啉代、硫吗啉代、硫杂氧杂环己基、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧杂氮杂基、二氮杂基、硫杂氮杂基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、吡唑啉基、二硫杂环己烷基、二硫杂环戊烷基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂二环[3.1.0]己基、3-氮杂二环[4.1.0]庚基、氮杂二环[2.2.2]己基、3H-吲哚基、喹嗪基和N-吡啶基脲。螺环部分也包括在该定义的范围内。其中2个环原子取代有氧代(＝O)部分的杂环基团的实例为嘧啶酮基和1,1-二氧代-硫吗啉基。杂环在本申请中任选独立取代有一个或多个本申请所描述的取代基。
术语“杂芳基”是指呈5、6或7元环形式的一价的芳族基团且包括具有5-20个原子的稠合环系(其中至少一个环是芳族的)，其含有一个或多个独立选自氮、氧和硫的杂原子。杂芳基的实例为吡啶基(包括例如2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、1-甲基-1H-苯并[d]咪唑基、[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶基、嘧啶基(包括例如4-羟基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、喋啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。杂芳基任选独立取代有一个或多个本申请所描述的取代基。
杂环或杂芳基可经碳(碳连)键合或在可能的情况下经氮(氮连)键合。例如但不局限于此，经碳键合的杂环或杂芳基在以下位置键合：吡啶的2、3、4、5或6位、哒嗪的3、4、5或6位、嘧啶的2、4、5或6位、吡嗪的2、3、5或6位、呋喃、四氢呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位、噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位、异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位、氮丙啶的2或3位、氮杂环丁烷的2、3或4位、喹啉的2、3、4、5、6、7或8位或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。
例如但不局限于此，经氮键合的杂环或杂芳基在以下位置键合：氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉或1H-吲唑的1位、异吲哚或异吲哚啉的2位、吗啉的4位和咔唑或β-咔啉的9位。
术语“手性”是指具有镜像配对体不可重叠性的分子，而术语“非手性”是指可与其镜像配对体重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同的化学组成但就原子或基团的空间排列而言是不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质例如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体的混合物可通过高分辨率分析措施例如电泳和色谱来区分。
“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，其互为不可重叠的镜像。
本申请使用的立体化学定义和规范遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；和Eliel,E.and Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。多种有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面发生旋转的能力。当描述光学活性化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子围绕其(多个)手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于指定化合物所致平面偏振光旋转的标识，其中(-)或1意指化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。就所给定的化学结构而言，这些立体异构体是相同的，除了它们互为镜像。具体立体异构体也可称为对映异构体且上述异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，其可出现在化学反应或方法尚未具有立体选择性或立体特异性的情况下。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种对映异构体物质的等摩尔混合物，其没有光学活性。
本申请的其他术语、定义和缩写包括：野生型("WT")；半胱氨酸工程化的突变体抗体("thio")；轻链("LC")；重链("HC")；6-马来酰亚胺己酰基(“MC”)；马来酰亚胺丙酰基(“MP”)；缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”),丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”),对氨基苄基(“PAB”)和对氨基苄氧基羰基(“PABC”)；A118C(EU编号)＝A121C(顺序编号)＝轻链的重链K149C(Kabat编号)的A114C(Kabat编号)。除此之外，本申请还提供了额外的定义和缩写。
II.PROTAC-抗体缀合物(PAC)
本申请所述的PROTAC-抗体缀合物(PAC)分子包含经接头(L1)与PROTAC缀合的抗体，其中所述PROTAC包含泛素E3连接酶结合基团(“E3LB”)、接头(“L2”)和蛋白结合基团(“PB”)。PAC的通式为：
Ab―(L1―D)p
其中D为P具有结构E3LB―L2―PB的PROTAC；其中E3LB为E3连接酶结合基团，其共价结合至L2；L2为接头，其共价结合至E3LB和PB；PB为蛋白结合基团，其共价结合至L2；Ab为抗体，其共价结合至L1；L1为接头，其共价结合至Ab和D；且p具有约1至约50的值。变量p反映了抗体可连接至一个或多个L1-D基团。在一个实施方案中，p为约1至8。在另一实施方案中，p为约2。
以下章节描述了包含PAC的组分。为了获得具有有效功效和理想治疗指数的PAC，提供以下组分。
1.抗体(Ab)
如本文所述，抗体例如单克隆抗体(mAB)用于将PROTAC递送至靶标细胞，例如表达由抗体靶标的特定蛋白的细胞。PAC的抗体部分可以靶标表达抗原的细胞，由此抗原特异性PAC通常通过内吞作用而细胞内递送至靶标细胞。当包含针对细胞表面上未发现的抗原的抗体的PAC可能导致PROTAC部分向细胞中的不太特异性细胞内递送时，PAC可能仍然经历胞饮作用。本文所述的PAC及其使用方法有利地利用细胞表面的抗体识别和/或PAC的胞吞作用来递送细胞内的PROTAC部分。
a.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。人抗体一般描述于van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过向转基因动物施用免疫原制备人抗体，所述转基因动物已经被修饰以响应抗原性攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，该基因座替换内源免疫球蛋白基因座或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利5,770,429；描述K-M技术的美国专利7,041,870和描述技术的美国专利申请公开US 2007/0061900)。可以进一步修饰例如通过与不同的人恒定区组合来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；and Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。另外的方法包括例如在美国专利7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后，可将此类可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。下文描述了从抗体文库中选择人抗体的技术。
b.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离用于PAC的抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库和筛选具有所需结合特性的抗体的此类文库。此类方法综述于例如Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)并进一步描述于例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks and Bradbury,inMethods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的组库并在噬菌体文库中随机重组，然后其可以用来筛选抗原结合噬菌体，如Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中描述。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以克隆(例如从人)初始库(naive repertoire)以给多种非自体抗原也和没有任何免疫作用的自体抗原提供单一来源的抗体，如由Griffiths et al.,EMBOJ,12:725-734(1993)描述。最后，还可以通过克隆来自干细胞的未重排的V基因片段和使用含有编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的随机序列的PCR引物来通过合成制备初始文库，如由Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)描述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利5,750,373和美国专利公开2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
认为从人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
c.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类诸如猴的可变区)和人恒定区。在又一个实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类别或亚类与亲本抗体的类别或亚类相比已经改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般说来，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)来源于非人抗体并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选还将包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法例如在Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述并且在例如以下中进一步描述：Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)and Klimka et al.,Br.J.癌症,83:252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta et al.J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的框架区(参见，例如Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
d.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。本申请使用的术语“多特异性抗体”是指包含具有多表位特异性的抗原结合结构域的抗体(即，能够特异性结合一个生物分子上的两个或更多个不同表位，或者能够特异性结合两种或更多种不同生物分子上的表位)。
在一些实施方案中，多特异性抗体是对至少两种不同抗原结合位点(例如双特异性抗体)具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以结合同一分子内的两个表位(分子内结合)。例如，多特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以结合相同蛋白质分子上的两个不同表位。在某些实施方案中，多特异性抗体结合的两个不同表位是通常不被一种单特异性抗体结合的表位，所述一种单特异性抗体例如常规抗体或一个免疫球蛋白单可变结构域。在某些实施方案中，多特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以结合位于两个不同分子内的表位(分子间结合)。例如，多特异性抗体的第一抗原结合结构域可以结合一个蛋白质分子上的一个表位，而多特异性抗体的第二个抗原结合结构域可以结合不同蛋白质分子上的另一个表位，从而交联两个分子。
在一些实施方案中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原结合结构域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元特异性结合第一表位并且第二VH/VL单元特异性结合第二表位，其中每个VH/VL单元包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。这样的多特异性抗体包括但不限于全长抗体，具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三抗体的抗体片段，已经共价或非共价连接的抗体片段。还包含重链可变区的至少一部分和/或轻链可变区的至少一部分的VH/VL单元也可称为“臂”或“半聚体”或“半抗体”。在一些实施方案中，半聚体包含重链可变区的足够部分，以允许与第二半聚体形成分子内二硫键。在一些实施方案中，半聚体包含结突变或穴突变，例如以允许与包含互补穴突变或结突变的第二半聚体或半抗体异源二聚化。本文将进一步讨论结突变和穴突变。
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗体可以是双特异性抗体。本申请使用的术语“双特异性抗体”是指抗原结合结构域的多特异性抗体，该抗原结合结构域能够特异性结合一个生物分子上的两个不同表位，或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特异性抗体在本文中也可以被称为具有“双特异性”或“是双特异性的”。示例性双特异性抗体可结合蛋白和任何其他抗原两者。在某些实施方案中，结合特异性中的一者用于蛋白且另一这用于CD3。参见例如美国专利5,821,337。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合相同蛋白分子的两个不同的表位。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合两种不同蛋白质分子上的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达蛋白质的细胞。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983),WO 93/08829,和Traunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991))和“结-入-穴”(knob-in-hole)工程化(参见例如美国专利5,731,168,WO2009/089004,US2009/0182127,US2011/0287009,Marvin and Zhu,Acta Pharmacol.Sin.(2005)26(6):649-658,和Kontermann(2005)ActaPharmacol.Sin.,26:1-9)。本文使用的术语“结入穴”或“KnH”技术是指在体外或体内将两个多肽配对在一起的技术，这种技术是通过在它们相互作用的界面处将突起(结)引入一个多肽中并且将空腔(穴)引入到另一个多肽中来进行的。例如，KnH已被引入抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面(参见例如US 2011/0287009,US2007/0178552,WO 96/027011,WO 98/050431,Zhu et al.,1997,蛋白Science 6:781-788,和WO2012/106587)。在一些实施方案中，在制造多特异性抗体期间，KnH驱动两种不同重链的配对。例如，在Fc区中具有KnH的多特异性抗体可以进一步包含与每个Fc区连接的单个可变结构域，或者还包含与相似或不同的轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。KnH技术也可以用于将两个不同的受体胞外结构域或任何其他包含不同靶识别序列(例如包括亲和体、肽体和其他Fc融合体)的多肽序列配对。
如本文所用的术语“结突变”是指在其中多肽与另一种多肽相互作用的界面处将突起(结)引入多肽中的突变。在一些实施方案中，另一种多肽具有穴突变。
如本文所用的术语“穴突变”是指在其中多肽与另一种多肽相互作用的界面处将空腔(穴)引入多肽中的突变。在一些实施方案中，另一种多肽具有结突变。
“突起”是指从第一多肽的界面突出并因此可位于相邻界面(即第二多肽的界面)中的互补空腔中以使异源多聚体稳定并因此例如有利于异源多聚体形成而非同源多聚体形成的至少一个氨基酸侧链。突起可存在于原始界面中或可合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，将编码第一多肽的界面的核酸改变以编码突起。为了实现这一点，将编码第一多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个“输入”氨基酸残基的核酸置换，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积。应理解，可存在多于一个原始残基和相应输入残基。各种氨基残基的侧链体积示于例如US2011/0287009的表1中。引入“突起”的突变可以被称为“结突变”。
在一些实施方案中，用于形成突起的输入残基是天然存在的选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)的氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基是色氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中，用于形成突起的原始残基具有小的侧链体积，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
“空腔”是指从第二多肽的界面凹入并且因此容纳第一多肽的相邻界面上的相应突起的至少一个氨基酸侧链。空腔可存在于原始界面中或可合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，编码第二多肽的界面的核酸经过改变来编码空腔。为了实现这一点，将编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA置换，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。应理解，可存在多于一个原始残基和相应输入残基。在一些实施方案中，用于形成空腔的输入残基是天然存在的选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)的氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，用于形成空腔的原始残基具有大的侧链体积，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。引入“空腔”的突变可以被称为“穴突变”。
突起“可定位”在空腔中意指分别第一多肽和第二多肽的界面上的突起和空腔的空间位置以及突起和空腔的大小是这样的，即突起可位于空腔中而不显著扰乱界面处第一多肽和第二多肽的正常缔合。因为诸如Tyr、Phe和Trp的突起通常不从界面的轴垂直延伸并且具有优选的构象，所以在一些情况下，突起与相应空腔的对准依赖于基于三维结构(诸如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的三维结构)建模突起/空腔对。这可以使用本领域中广泛接受的技术来实现。
在一些实施方案中，IgG1恒定区中的结突变是T366W(EU编号)。在一些实施方案中，IgG1恒定区中的穴突变包含选自T366S、L368A和Y407V(EU编号)的一个或多个突变。在一些实施方案中，IgG1恒定区中的穴突变包含T366S、L368A和Y407V(EU编号)。
在一些实施方案中，IgG4恒定区中的结突变是T366W(EU编号)。在一些实施方案中，IgG4恒定区中的穴突变包含选自T366S、L368A和Y407V(EU编号)的一个或多个突变。在一些实施方案中，IgG4恒定区中的穴突变包含T366S、L368A和Y407V(EU编号)。
多特异性抗体也可通过以下方法来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(WO2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利4,676,980,和Brennan et al.,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt et al.J.Immunol.147:60(1991)所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼状抗体”或“双重可变结构域免疫球蛋白”(参见例如US 2006/0025576A1,和Wu et al.NatureBiotechnology(2007))。本申请抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含与靶标及另一种不同的抗原结合的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820)。
e.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段以及本文所述的其他片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv的综述，参见，例如Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)中；还参见WO 93/16185；和美国专利5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。
双抗体是可为二价或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson etal.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利6,248,516 B1)。
抗体片段可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于如本文所述的完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生。
f.抗体变体
在某些实施方案中，本申请涉及本申请提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，对抗体的结合亲和力和/或其它生物学性质进行改善可以是合乎需要的。抗体的氨基酸序列变体可如下制备：将合适的改造引入到对抗体进行编码的核苷酸序列中或进行肽合成。上述改造包括例如对抗体的氨基酸序列中的残基进行缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需要的特征例如抗原结合。
i.取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，本申请提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。就取代诱变而言所关注的位点包括HVR和FR。保守取代在表1中显示在表头“优选的取代”下。更多的取代变化在表1中提供在表头“示例性取代”下且如以下参考氨基酸侧链类别所进一步描述的那样。可将氨基酸取代引入到所关注的抗体中且针对所需要的活性例如保留的/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或CDC对产物进行筛选。抗体-dependent cellular cytotoxicity(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
表1.氨基酸取代
可根据共同的侧链性质对氨基酸进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代所要进行的是，将这些类别中的一个类别的成员替换为另一个类别。
一种类型的取代变体涉及对母体抗体(例如人化或人抗体)中的一个或多个高变区残基进行取代。通常，被选择用于进一步研究的所得变体与母体抗体相比将在某些生物学性质方面具有改造(例如改善)(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)和/或将基本上保留母体抗体的某些生物学性质。示例性取代变体为亲和力成熟抗体，其可常规产生，例如使用基于噬菌体显示的亲和力成熟技术例如本申请所描述的那些亲和力成熟技术。简言之，使一个或多个HVR残基发生突变且使变体抗体在噬菌体上显示且针对具体生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
变更(例如取代)可在HVR中进行以例如改善抗体亲和力。上述变更可在HVR“热点”即在体细胞成熟过程中高频率地经受突变的密码子所编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行，其中针对结合亲和力对所得到的变体VH或VL进行测试。通过从二级库中构建和再选来进行亲和力成熟已经描述在例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过各种方法(例如易错PCR、链改组或由寡核苷酸引导的诱变)中的任何一种将多样性引入到针对成熟来选择的可变基因中。然后产生二级库。然后对库进行筛选以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。用于引入多样性的另一种方法涉及由HVR引导的措施，其中几个HVR残基(例如一次4-6个残基)被随机化。参与抗原结合的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来具体鉴定。具体地，CDR-H3和CDR-L3经常被靶向。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR中，只要上述变更不实质上降低抗体与抗原结合的能力。例如，不实质上降低结合亲和力的保守变更(例如本申请提供的保守取代)可在HVR中进行。上述变更可在HVR“热点”或SDR外。在上述变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未变更的或含有不多于一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于对抗体中可被靶向以诱变的残基或区域进行鉴定的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，其参见Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085。在该方法中，靶标残基中的残基或基团(例如荷电残基例如arg、asp、his、lys和glu)被鉴定且替换为中性或荷负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)以确定抗体与抗原的相互作用是否被影响。可在对最初取代显示出功能敏感性的氨基酸位置进行进一步取代。可选择或额外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。上述接触残基和邻近残基作为用于取代的候选对象可被靶向或删除。可对变体进行筛选以确定其是否含有所需要的性质。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端蛋氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如就ADEPT而言)或多肽的融合，其增加了抗体的血清半衰期。
ii.半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如“THIOMABTM抗体”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定的实施方案中，取代的残基出现在抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团因此定位在抗体的可接近位点并且可以用于将抗体与其他部分例如L1-PROTAC基团缀合以产生PAC，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，任何一个或多个下列残基可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A140(EU编号)；重链的L174(EU编号)；重链的Y373(EU编号)；轻链的K149(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。在特定的实施方案中，本申请所述的抗体包含HC-A140C(EU编号)半胱氨酸取代。在特定的实施方案中，本申请所述的抗体包含LC-K149C(Kabat编号)半胱氨酸取代。在特定的实施方案中，本申请所述的抗体包含HC-A118C(EU编号)半胱氨酸取代。
半胱氨酸工程化抗体可如例如在美国专利7,521,541中所述来产生。
在某些实施方案中，所述抗体包含以下重链半胱氨酸取代中的一者：
表2.HC半胱氨酸取代
链(HC/LC) 残基 EU突变位点# Kabat突变位点#
HC T 114 110
HC A 140 136
HC L 174 170
HC L 179 175
HC T 187 183
HC T 209 205
HC V 262 258
HC G 371 367
HC Y 373 369
HC E 382 378
HC S 424 420
HC N 434 430
HC Q 438 434
在某些实施方案中，所述抗体包含以下轻链半胱氨酸取代中的一者：
表3.LC半胱氨酸取代
链(HC/LC) 残基 EU突变位点# Kabat突变位点#
LC I 106 106
LC R 108 108
LC R 142 142
LC K 149 149
LC V 205 205
非限制性示例性hu7C2.v2.2.LA轻链(LC)K149C THIOMABTM抗体具有SEQ ID NOs:26和30的重链和轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu7C2.v2.2.LA重链(HC)A118CTHIOMABTM抗体具有SEQ ID NOs:31和25的重链和轻链氨基酸序列。
PAC包括半胱氨酸工程化抗体，其中野生型或亲本抗体的一个或多个氨基酸替换为半胱氨酸氨基酸。可以如此改造任何形式的抗体，即突变。例如，可以将亲本Fab抗体片段工程化以形成半胱氨酸改造的Fab，在本文中称为“ThioFab”。类似地，可以将亲本单克隆抗体工程化以形成ThiomabTM抗体。应当注意，单个位点突变产生ThioFab中的单个工程化半胱氨酸残基，而单个位点突变由于IgG抗体的二聚体性质而在ThiomabTM抗体中产生两个工程化的半胱氨酸残基。评估具有被替换的(“工程化的”)半胱氨酸(Cys)残基的突变体的新引入的工程化半胱氨酸硫醇基团的反应性。硫醇反应性值是0至1.0范围内的相对数值项并且可以测量任何半胱氨酸改造的抗体。用于PAC的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.6至1.0的范围内；0.7到1.0；或0.8到1.0。
为了通过诱变制备半胱氨酸工程化抗体，通过本领域已知的多种方法制备编码起始多肽的氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括但不限于通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变，PCR诱变和早期制备的编码多肽的DNA的盒式诱变制备。也可以通过限制性片段操作或通过与合成寡核苷酸的重叠延伸PCR来构建重组抗体的变体。诱变引物编码半胱氨酸密码子替换。可以使用标准诱变技术来产生编码这种突变体半胱氨酸工程化抗体的DNA。一般的指导可见于Sambrook et al Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；和Ausubel et al CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NewYork,N.Y.,1993。
半胱氨酸氨基酸可以在抗体中的反应位点工程化并且不形成链内或分子间二硫键(Junutula,et al.,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan et al(2009)Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249,Shen et al(2012)Nature Biotech.,30(2):184-191；Junutula et al(2008)Jour of Immun.Methods 332:41-52)。工程化的半胱氨酸硫醇可以与接头试剂或本文所述的接头L1-PROTAC中间体反应，其具有硫醇反应性的亲电子基团，例如马来酰亚胺，活化的二硫化物(例如4-硝基吡啶基二硫化物)或α-卤代酰胺，以形成具有半胱氨酸工程化抗体(T ThiomabTM抗体)和PROTAC残基的PAC。因此可以设计、控制和已知PROTAC部分的位置。可以控制PROTAC/抗体比(“PAR”)，因为工程化的半胱氨酸硫醇基团通常以高产率与硫醇反应性接头试剂或接头L1-PROTAC中间体反应。设计抗体以通过在重链或轻链上的单个位点处的取代来引入半胱氨酸氨基酸，在对称抗体上产生两个新的半胱氨酸。可以实现约2的PAR并且接近共轭产物的均匀性。
半胱氨酸工程化抗体优选保留其野生型亲本抗体对应物的抗原结合能力。因此，半胱氨酸工程化抗体能够优选特异性结合抗原。这些抗原包括例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其他细胞表面分子、跨膜蛋白、信号转导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与(例如已知的或怀疑在功能上有助于)组织发育或分化之相关的分子、淋巴因子、细胞因子、参与细胞周期调节的分子、参与血管发生的分子和与(例如已知或怀疑在功能上有助于)血管生成相关的分子。肿瘤相关抗原可以是簇分化因子(即CD蛋白)。半胱氨酸工程化抗体能够结合的抗原可以是上述类别之一的子集的成员，其中所述类别的其他子集包含具有不同特征的其他分子/抗原(与感兴趣的抗原相关)。
制备半胱氨酸工程化抗体以用于通过链内二硫化物基团的还原和再氧化与接头L1中间体缀合。
iii.糖基化变体
在某些实施方案中，对本申请提供的抗体进行更改以提高或降低抗体被糖基化的程度。可通过更改氨基酸序列以形成或除去一个或多个糖基化位点而方便地向抗体中添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可对与其连接的碳水化合物进行更改。哺乳动物细胞所产生的天然抗体通常包含枝化双触角寡糖，其通常通过N连接物而与Fc区的CH2结构域中的Asn297连接。参见例如Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸及与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本申请抗体中的寡糖进行改造，从而产生具有某些改善的性质的抗体变体。
在一个实施方案中，本申请提供的抗体变体所具有的碳水化合物结构缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖。例如，岩藻糖在上述抗体中的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量如下确定：相对于与Asn297连接的所有糖结构(例如复合物、杂化物和高甘露糖结构)的总和对岩藻糖在处于Asn297的糖链中的平均量进行计算，其通过MALDI-TOF质谱来测量且参见例如WO2008/077546。Asn297是指在Fc区中处于约297位的天冬酰胺残基(对Fc区残基进行Eu编号)；然而，Asn297还可由于抗体中很小的序列变化而处于在297位的上游或下游约±3个氨基酸处即在294位和300位之间。上述岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开文本US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；Presta,L的美国专利申请US2003/0157108A1；和Adams等人的WO2004/056312A1且尤其是实施例11)和敲除细胞系例如α-1,6-岩藻糖转移酶基因即FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗体变体还配备有一分为二的寡糖，例如其中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖通过GlcNAc来一分为二。上述抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。上述抗体变体的实例参见例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)。还提供在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。上述抗体变体可具有改善的CDC功能。上述抗体变体参见例如WO1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO1999/22764(Raju,S.)。
iv.Fc区变体
在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸改造引入到本申请提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸改造(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，本申请涉及具有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使其成为就其中抗体体内半衰期是重要的而某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要或有害的应用而言所期望的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的降低/消失。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞即NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。FcR在造血细胞上的表达概括在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页表3中。用于对所关注的分子的ADCC活性进行评价的体外测定的非限制性实例参见美国专利5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可选择地，可使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。可用于上述测定的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择或额外地，可在体内对所关注的分子的ADCC活性进行评价，例如在Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)所公开的动物模型中。还可进行C1q结合测定以证实抗体不能与C1q结合且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评价补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可使用本领域已知的方法来确定FcRn结合和体内清除率/半衰期(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
在一些实施方案中，可将一个或多个氨基酸改造引入到本申请提供的抗体的Fc部分中，从而增加IgG与新生儿Fc受体的结合。在某些实施方案中，抗体包含以下三个根据EU编号的突变：M252Y、S254T和T256E(“YTE突变”)(美国专利8,697,650；也参见Dall’Acqua等人,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524(2006))。在某些实施方案中，YTE突变不影响抗体与其同源抗原结合的能力。在某些实施方案中，YTE突变与天然(即非YTE突变)抗体相比使抗体的血清半衰期得以增加。在一些实施方案中，YTE突变与天然(即非YTE突变)抗体相比使抗体的血清半衰期增加3倍。在一些实施方案中，YTE突变与天然(即非YTE突变)抗体相比使抗体的血清半衰期增加2倍。在一些实施方案中，YTE突变与天然(即非YTE突变)抗体相比使抗体的血清半衰期增加4倍。在一些实施方案中，YTE突变与天然(即非YTE突变)抗体相比使抗体的血清半衰期增加至少5倍。在一些实施方案中，YTE突变与天然(即非YTE突变)抗体相比使抗体的血清半衰期增加至少10倍。参见例如美国专利8,697,650；也参见Dall’Acqua等人,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524(2006)。
在某些实施方案中，YTE突变体提供了对抗体的抗体依赖性由细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性进行调节的手段。在某些实施方案中，YTEO突变体提供了对引向人抗原的人化IgG抗体的ADCC活性进行调节的手段。参见例如美国专利8,697,650；也参见Dall’Acqua等人,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524(2006)。
在某些实施方案中，YTE突变体允许同时对血清半衰期、组织分布和抗体活性(例如IgG抗体的ADCC活性)进行调节。参见例如美国专利8,697,650；也参见Dall’Acqua等人,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524(2006)。
效应子功能降低的抗体包括其中对Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(根据EU编号)中的一个或多个进行取代的那些抗体(美国专利6,737,056)。上述Fc突变体包括其中在氨基酸265、269、270、297和327(根据EU编号)位中的两个或更多个处进行取代的Fc突变体，包括其中残基265和297(根据EU编号)用丙氨酸取代的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利7,332,581)。在某些实施方案中，Fc突变体包括以下两个氨基酸取代：D265A和N297A。在某些实施方案中，Fc突变体由以下两个氨基酸取代组成：D265A和N297A。
在某些实施方案中，处于野生型人Fc区的329位(EU编号)的脯氨酸(P329)被取代为甘氨酸或精氨酸或大到足以使Fc的P329与FcgRIII的色氨酸残基W87和W110形成的Fc/Fcγ受体界面中的脯氨酸夹层得以破坏的氨基酸残基(Sondermann等人,Nature 406,267-273(2000年7月20日))。在另一个实施方案中，Fc变体中的至少一个其它氨基酸取代为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S且在另一个实施方案中，所述至少一个其它氨基酸取代为人IgG1Fc区中的L234A和L235A或人IgG4 Fc区中的S228P和L235E，其都根据EU编号(美国专利8,969,526,将其全部内容引入作为参考)。
在某些实施方案中，多肽包含野生型人IgG Fc区的Fc变体，其中所述多肽的人IgGFc区中的P329被取代为甘氨酸且其中所述Fc变体包含至少两个其它氨基酸取代即人IgG1Fc区中的L234A和L235A或人IgG4 Fc区中的S228P和L235E且其中残基根据EU编号来编号(美国专利8,969,526,将其全部内容引入作为参考)。在某些实施方案中，包含P329G、L234A和L235A(EU编号)取代的多肽显示出与人FcγRIIIA和FcγRIIA的降低的亲和力以将ADCC下调为包含野生型人IgG Fc区的多肽所诱导的ADCC的至少20％和/或下调ADCP(美国专利8,969,526,将其全部内容引入作为参考)。
在具体实施方案中，包含野生型人Fc多肽的Fc变体的多肽包含三重突变：根据EU编号在Pro329位的氨基酸取代、L234A和L235A突变(P329/LALA)(美国专利8,969,526,将其全部内容引入作为参考)。在具体实施方案中，所述多肽包含以下氨基酸取代：根据EU编号的P329G、L234A和L235A。
描述了与FcR的结合得以改善或降低的某些抗体变体(参见例如美国专利6,737,056；WO 2004/056312,和Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体所包含的Fc区具有一个或多个使ADCC得以改善的氨基酸取代例如在Fc区的298、333和/或334位(残基的EU编号)的取代。
在一些实施方案中，对Fc区进行变更，这使C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)发生更改(即改善或降低)，其例如参见美国专利6,194,551；WO99/51642；和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
半衰期增加且与负责将母体IgG转运至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)；和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))的结合得以改善的抗体参见US2005/0014934A1(Hinton等人)。这些抗体所包含的Fc区具有一个或多个使Fc区与FcRn的结合得以改善的取代。上述Fc变体包括在以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利7,371,826)。Fc区变体的其它实例也参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利5,648,260；美国专利5,624,821；及WO94/29351。
g.抗体衍生物
在某些实施方案中，可对本申请提供的抗体进行进一步改造以含有本领域已知且可容易得到的额外非蛋白质性部分。适于对抗体进行衍生的部分包括但不局限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不局限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧杂环戊烷、聚1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和右旋糖酐或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇和其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可在制备中具有优点。聚合物可具有任何分子量且可以是枝化或非枝化的。与抗体连接的聚合物的数目是可变的且若连接有多于一个聚合物，则其可为相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于所考虑的因素来确定，包括但不局限于待改善的抗体的具体性质或功能、抗体衍生物是否将在所定义的条件下用于疗法等。
在另一个实施方案中，本申请提供抗体和以下非蛋白质性部分的缀合物，所述非蛋白质性部分可通过暴露于辐射而被选择性加热。在一个实施方案中，所述非蛋白质性部分为碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。所述辐射可具有任何波长且包括但不局限于以下波长，其不损害普通细胞，但是将非蛋白质性部分加热至使与抗体-非蛋白质性部分接近的细胞被杀死的温度。
h.肿瘤相关抗原
可用于本申请所述的PAC的癌症治疗中的半胱氨酸工程化抗体包括但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。某些肿瘤相关抗原是本领域已知的并且可以使用本领域公知的方法和信息来制备用于产生抗体。在试图发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶标时，研究人员试图鉴定跨膜或其他肿瘤相关多肽，与在一种或多种正常的非癌细胞上表达相比，这些多肽在一种或多种特定类型的癌细胞表面上特异性表达。通常，与非癌细胞表面上表达相比，这些肿瘤相关多肽在癌细胞表面上更丰富地表达。这种肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经产生了通过基于抗体的疗法来特异性靶向癌细胞以便进行破坏的能力。
肿瘤相关抗原TAA的实例包括但不限于本文列出的TAA(1)-(53)。为了方便起见，本文列出了与这些抗原有关的信息，所有这些都是本领域已知的并包括名称、替代名称、Genbank登录号和主要参考文献，遵循美国国家生物技术信息中心(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定惯例。对应于TAA(1)-(53)的核酸和蛋白质序列可在公共数据库如GenBank中获得。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括以下所有氨基酸序列变体和同种型，其相对于在所引用参考文献中鉴定的序列具有至少约70％、80％、85％、90％或95％序列同一性，或展现与具有在所引用的参考文献中发现的序列的TAA大致上相同的生物学性质或特性。例如，具有变体序列的TAA通常能够特异性结合与具有列出的相应序列的TAA特异性结合的抗体。本文特别引用的参考文献中的序列和公开内容明确地通过引用并入。
i.重组方法和组合物
抗体可使用重组方法和组合物来产生，例如如美国专利4,816,567所描述的那样。在一个实施方案中，本申请提供经分离的对本申请所描述的抗体进行编码的核酸。上述核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，本申请提供一种或多种包含上述核酸的载体(例如表达载体)。在另一个实施方案中，本申请提供包含上述核酸的宿主细胞。在一个上述实施方案中，所述宿主细胞包含(例如已经转化有)：(1)包含以下核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列；或(2)包含以下核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含以下核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，本申请提供制备抗体的方法，其中所述方法包括如以上所提供的那样在适于抗体表达的条件下对包含编码抗体的核酸的宿主细胞进行培养和任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
为了重组产生抗体，对如以上描述的那样编码抗体的核酸进行分离且插入到一种或多种用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达的载体中。上述核酸可使用常规措施来容易地分离和测序(例如通过使用能够与对抗体的重链和轻链进行编码的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
适于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本申请所描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。抗体片段和多肽在细菌中的表达参见例如美国专利5,648,237、5,789,199和5,840,523(也参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页,描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，抗体可在可溶性级份中与细菌细胞糊分离且可进一步纯化。
除了原核生物，真核微生物例如丝状真菌或酵母也为适于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括以下真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经被“人化”且由此产生具有部分或完整人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞还来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了多种可与昆虫细胞一起使用的杆状病毒菌株，其具体用于转染草地夜蛾细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例为通过SV40(COS-7)来转化的猴肾CV1细胞系；人胚肾细胞系(如例如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)所描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利细胞(如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)所描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；如例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)所描述的TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；及骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
现参照抗体亲和力，在实施方案中，所述抗体与选自(1)-(53)的一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合：
(1)BMPR1B(骨形成蛋白受体IB型,Genbank登录号NM_001203)
ten Dijke,P.,et al Science 264(5155):101-104(1994),Oncogene 14(11):1377-1382(1997))；WO2004063362(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003134790-A1(第38-39页)；WO2002102235(权利要求13；第296页)；WO2003055443(第91-92页)；WO200299122(实施例2；第528-530页)；WO2003029421(权利要求6)；WO2003024392(权利要求2；图112)；WO200298358(权利要求1；第183页)；WO200254940(第100-101页)；WO200259377(第349-350页)；WO200230268(权利要求27；第376页)；WO200148204(实施例；图4)
NP_001194骨形成蛋白受体，IB型/pid＝NP_001194.1-
交叉参考:MIM:603248；NP_001194.1；AY065994
(2)E16(LAT1,SLC7A5,Genbank登录号NM_003486)
Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999),Nature 395(6699):288-291(1998),Gaugitsch,H.W.,et al(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273)；WO2004048938(实施例2)；WO2004032842(实施例IV)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003016475(权利要求1)；WO200278524(实施例2)；WO200299074(权利要求19；第页127-129)；WO200286443(权利要求27；第222,393页)；WO2003003906(权利要求10；第293页)；WO200264798(权利要求33；第93-95页)；WO200014228(权利要求5；第133-136页)；US2003224454(图3)；WO2003025138(权利要求12；第150页)；
NP_003477溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运蛋白，y+系统)，成员5/pid＝NP_003477.3-智人
交叉参考:MIM:600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1
(3)STEAP1(前列腺的六跨膜上皮抗原,Genbank登录号NM_012449)
癌症Res.61(15),5857-5860(2001),Hubert,R.S.,et al(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528)；WO2004065577(权利要求6)；WO2004027049(图1L)；EP1394274(实施例11)；WO2004016225(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003157089(实施例5)；US2003185830(实施例5)；US2003064397(图2)；WO200289747(实施例5；第618-619页)；WO2003022995(实施例9；图13A,实施例53；第173页,实施例2；图2A)；
NP_036581前列腺的六跨膜上皮抗原
交叉参考:MIM:604415；NP_036581.1；NM_012449_1
(4)0772P(CA125,MUC16,Genbank登录号AF361486)
J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001))；WO2004045553(权利要求14)；WO200292836(权利要求6；图12)；WO200283866(权利要求15；第116-121页)；US2003124140(实施例16)；US 798959.交叉参考:GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1
(5)MPF(MPF,MSLN,SMR,巨核细胞增强因子，间皮素,Genbank登录号NM_005823)Yamaguchi,N.,et al Biol.Chem.269(2),805-808(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996),J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995))；WO2003101283(权利要求14)；(WO2002102235(权利要求13；第287-288页)；WO2002101075(权利要求4；第308-309页)；WO200271928(第320-321页)；WO9410312(第52-57页)；交叉参考:MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1
(6)Napi2b(Napi3b,NAPI-3B,NPTIIb,SLC34A2,溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b,Genbank登录号NM_006424)
J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002),Genomics 62(2):281-284(1999),Feild,J.A.,et al(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582)；WO2004022778(权利要求2)；EP1394274(实施例11)；WO2002102235(权利要求13；第326页)；EP875569(权利要求1；第17-19页)；WO200157188(权利要求20；第329页)；WO2004032842(实施例IV)；WO200175177(权利要求24；第139-140页)；
交叉参考:MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1
(7)Sema 5b(FLJ10372,KIAA1445,Mm.42015,SEMA5B,SEMAG,脑信号蛋白5b Hlog，sema结构域，七凝血栓蛋白重复序列(1型和1型样的)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域，(脑信号蛋白)5B,Genbank登录号AB040878)
Nagase T.,et al(2000)DNA Res.7(2):143-150)；WO2004000997(权利要求1)；WO2003003984(权利要求1)；WO200206339(权利要求1；第50页)；WO200188133(权利要求1；第41-43,48-58页)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003101400(权利要求11)；
登陆:Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1.Genew；HGNC:10737；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKENcDNA 2700050C12基因,Genbank登录号AY358628)；Ross et al(2002)癌症Res.62:2546-2553；US2003129192(权利要求2)；US2004044180(权利要求12)；US2004044179(权利要求11)；US2003096961(权利要求11)；US2003232056(实施例5)；WO2003105758(权利要求12)；US2003206918(实施例5)；EP1347046(权利要求1)；WO2003025148(权利要求20)；
交叉参考:GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1
(9)ETBR(内皮素B型受体,Genbank登录号AY275463)；
Nakamuta M.,et al Biochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991；Ogawa Y.,et al Biochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991；Arai H.,et alJpn.Circ.J.56,1303-1307,1992；Arai H.,et al J.Biol.Chem.268,3463-3470,1993；Sakamoto A.,Yanagisawa M.,et al Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991；Elshourbagy N.A.,et al J.Biol.Chem.268,3873-3879,1993；Haendler B.,et alJ.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992；Tsutsumi M.,et al Gene 228,43-49,1999；Strausberg R.L.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；BourgeoisC.,et al J.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997；Okamoto Y.,et alBiol.Chem.272,21589-21596,1997；Verheij J.B.,et al Am.J.Med.Genet.108,223-225,2002；Hofstra R.M.W.,et al Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997；Puffenberger E.G.,etal Cell 79,1257-1266,1994；Attie T.,et al,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995；Auricchio A.,et al Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996；Amiel J.,et alHum.Mol.Genet.5,355-357,1996；Hofstra R.M.W.,et al Nat.Genet.12,445-447,1996；Svensson P.J.,et al Hum.Genet.103,145-148,1998；Fuchs S.,et al Mol.Med.7,115-124,2001；Pingault V.,et al(2002)Hum.Genet.111,198-206；WO2004045516(权利要求1)；WO2004048938(实施例2)；WO2004040000(权利要求151)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200261087(图1)；WO2003016494(图6)；WO2003025138(权利要求12；第144页)；WO200198351(权利要求1；第124-125页)；EP522868(权利要求8；图2)；WO200177172(权利要求1；第297-299页)；US2003109676；US6518404(图3)；US5773223(权利要求1a；Col 31-34)；WO2004001004；
(10)MSG783(RNF124,假定蛋白质FLJ20315,Genbank登录号NM_017763)；
WO2003104275(权利要求1)；WO2004046342(实施例2)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003083074(权利要求14；第61页)；WO2003018621(权利要求1)；WO2003024392(权利要求2；图93)；WO200166689(实施例6)；
交叉参考:LocusID:54894；NP_060233.2；NM_017763_1
(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺的六跨膜上皮抗原2，六跨膜前列腺蛋白,Genbank登录号AF455138)
Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002))；WO2003087306；US2003064397(权利要求1；图1)；WO200272596(权利要求13；第54-55页)；WO200172962(权利要求1；图4B)；WO2003104270(权利要求11)；WO2003104270(权利要求16)；US2004005598(权利要求22)；WO2003042661(权利要求12)；US2003060612(权利要求12；图10)；WO200226822(权利要求23；图2)；WO200216429(权利要求12；图10)；
交叉参考:GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1
(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员4,Genbank登录号NM_017636)
Xu,X.Z.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001),Cell109(3):397-407(2002),J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003))；US2003143557(权利要求4)；WO200040614(权利要求14；第100-103页)；WO200210382(权利要求1；图9A)；WO2003042661(权利要求12)；WO200230268(权利要求27；第页391)；US2003219806(权利要求4)；WO200162794(权利要求14；图1A-D)；
交叉参考:MIM:606936；NP_060106.2；NM_017636_1
(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎癌衍生的生长因子,Genbank登录号NP_003203或NM_003212)
Ciccodicola,A.,et al EMBO J.8(7):1987-1991(1989),Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991))；US2003224411(权利要求1)；WO2003083041(实施例1)；WO2003034984(权利要求12)；WO200288170(权利要求2；第52-53页)；WO2003024392(权利要求2；图58)；WO200216413(权利要求1；第94-95页,105)；WO200222808(权利要求2；图1)；US5854399(实施例2；Col 17-18)；US5792616(图2)；
交叉参考:MIM:187395；NP_003203.1；NM_003212_1
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒受体)或Hs.73792Genbank登录号M26004)
Fujisaku et al(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125)；Weis J.J.,et alJ.Exp.Med.167,1047-1066,1988；Moore M.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987；Barel M.,et al Mol.Immunol.35,1025-1031,1998；Weis J.J.,et alProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986；Sinha S.K.,et al(1993)J.Immunol.150,5311-5320；WO2004045520(实施例4)；US2004005538(实施例1)；WO2003062401(权利要求9)；WO2004045520(实施例4)；WO9102536(图9.1-9.9)；WO2004020595(权利要求1)；
登陆:P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1.
(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白相关的β),B29,Genbank登录号NM_000626或11038674)
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131,Blood(2002)100(9):3068-3076,Muller et al(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625)；WO2004016225(权利要求2,图140)；WO2003087768,US2004101874(权利要求1,第102页)；WO2003062401(权利要求9)；WO200278524(实施例2)；US2002150573(权利要求5,第15页)；US5644033；WO2003048202(权利要求1,第306和309页)；WO 99/558658,US6534482(权利要求13,图17A/B)；WO200055351(权利要求11,第1145-1146页)；
交叉参考:MIM:147245；NP_000617.1；NM_000626_1
(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a),SPAP1B,SPAP1C,Genbank登录号NM_030764,AY358130)
Genome Res.13(10):2265-2270(2003),Immunogenetics 54(2):87-95(2002),Blood 99(8):2662-2669(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001),Xu,M.J.,et al(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775；WO2004016225(权利要求2)；WO2003077836；WO200138490(权利要求5；图18D-1-18D-2)；WO2003097803(权利要求12)；WO2003089624(权利要求25)；
交叉参考:MIM:606509；NP_110391.2；NM_030764_1
(17)HER2(ErbB2,Genbank登录号M11730)
Coussens L.,et al Science(1985)230(4730):1132-1139)；Yamamoto T.,et alNature 319,230-234,1986；Semba K.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985；Swiercz J.M.,et al J.Cell Biol.165,869-880,2004；Kuhns J.J.,et alJ.Biol.Chem.274,36422-36427,1999；Cho H.-S.,et al Nature 421,756-760,2003；Ehsani A.,et al(1993)Genomics 15,426-429；WO2004048938(实施例2)；WO2004027049(图1I)；WO2004009622；WO2003081210；WO2003089904(权利要求9)；WO2003016475(权利要求1)；US2003118592；WO2003008537(权利要求1)；WO2003055439(权利要求29；图1A-B)；WO2003025228(权利要求37；图5C)；WO200222636(实施例13；第95-107页)；WO200212341(权利要求68；图7)；WO200213847(第71-74页)；WO200214503(第114-117页)；WO200153463(权利要求2；第41-46页)；WO200141787(第15页)；WO200044899(权利要求52；图7)；WO200020579(权利要求3；图2)；US5869445(权利要求3；Col 31-38)；WO9630514(权利要求2；第56-61页)；EP1439393(权利要求7)；WO2004043361(权利要求7)；WO2004022709；WO200100244(实施例3；图4)；
登陆:P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1.EMBL；M11761；AAA35808.1.
(18)NCA(CEACAM6,Genbank登录号M18728)；
Barnett T.,et al Genomics 3,59-66,1988；Tawaragi Y.,et alBiochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988；Strausberg R.L.,et alProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903,2002；WO2004063709；EP1439393(权利要求7)；WO2004044178(实施例4)；WO2004031238；WO2003042661(权利要求12)；WO200278524(实施例2)；WO200286443(权利要求27；第427页)；WO200260317(权利要求2)；
登陆:P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728；
(19)MDP(DPEP1,Genbank登录号BC017023)
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002))；WO2003016475(权利要求1)；WO200264798(权利要求33；第85-87页)；JP05003790(图6-8)；WO9946284(图9)；
交叉参考:MIM:179780；AAH17023.1；BC017023_1
(20)IL20Rα(IL20Rα,ZCYTOR7,Genbank登录号AF184971)；
Clark H.F.,et al Genome Res.13,2265-2270,2003；Mungall A.J.,et alNature 425,805-811,2003；Blumberg H.,et al Cell 104,9-19,2001；Dumoutier L.,etal J.Immunol.167,3545-3549,2001；Parrish-Novak J.,et al J.Biol.Chem.277,47517-47523,2002；Pletnev S.,et al(2003)Biochemistry 42:12617-12624；Sheikh F.,et al(2004)J.Immunol.172,2006-2010；EP1394274(实施例11)；US2004005320(实施例5)；WO2003029262(第74-75页)；WO2003002717(权利要求2；第63页)；WO200222153(第45-47页)；US2002042366(第20-21页)；WO200146261(第57-59页)；WO200146232(第63-65页)；WO9837193(权利要求1；第55-59页)；
登陆:Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1.
(21)Brevican(BCAN,BEHAB,Genbank登录号AF229053)
Gary S.C.,et al Gene 256,139-147,2000；Clark H.F.,et al Genome Res.13,2265-2270,2003；Strausberg R.L.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；US2003186372(权利要求11)；US2003186373(权利要求11)；US2003119131(权利要求1；图52)；US2003119122(权利要求1；图52)；US2003119126(权利要求1)；US2003119121(权利要求1；图52)；US2003119129(权利要求1)；US2003119130(权利要求1)；US2003119128(权利要求1；图52)；US2003119125(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200202634(权利要求1)；
(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5,Genbank登录号NM_004442)
Chan,J.and Watt,V.M.,Oncogene 6(6),1057-1061(1991)Oncogene 10(5):897-905(1995),Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998),Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000))；WO2003042661(权利要求12)；WO200053216(权利要求1；第41页)；WO2004065576(权利要求1)；WO2004020583(权利要求9)；WO2003004529(第128-132页)；WO200053216(权利要求1；第42页)；
交叉参考:MIM:600997；NP_004433.2；NM_004442_1
(23)ASLG659(B7h,Genbank登录号AX092328)
US20040101899(权利要求2)；WO2003104399(权利要求11)；WO2004000221(图3)；US2003165504(权利要求1)；US2003124140(实施例2)；US2003065143(图60)；WO2002102235(权利要求13；第299页)；US2003091580(实施例2)；WO200210187(权利要求6；图10)；WO200194641(权利要求12；图7b)；WO200202624(权利要求13；图1A-1B)；US2002034749(权利要求54；第45-46页)；WO200206317(实施例2；第320-321页,权利要求34；第321-322页)；WO200271928(第468-469页)；WO200202587(实施例1；图1)；WO200140269(实施例3；第190-192页)；WO200036107(实施例2；第205-207页)；WO2004053079(权利要求12)；WO2003004989(权利要求1)；WO200271928(第233-234,452-453页)；WO 0116318；
(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体,Genbank登录号AJ297436)
Reiter R.E.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998；Gu Z.,etal Oncogene 19,1288-1296,2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788；WO2004022709；EP1394274(实施例11)；US2004018553(权利要求17)；WO2003008537(权利要求1)；WO200281646(权利要求1；第164页)；WO2003003906(权利要求10；第288页)；WO200140309(实施例1；图17)；US2001055751(实施例1；图1b)；WO200032752(权利要求18；图1)；WO9851805(权利要求17；第97页)；WO9851824(权利要求10；第94页)；WO9840403(权利要求2；图1B)；
登陆:O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1.
(25)GEDA(Genbank登录号AY260763)；
AAP14954脂肪瘤HMGIC融合伴侣样蛋白/pid＝AAP14954.1-智人
物种：智人(人)
WO2003054152(权利要求20)；WO2003000842(权利要求1)；WO2003023013(实施例3,权利要求20)；US2003194704(权利要求45)；
交叉参考:GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3,BR3,Genbank登录号AF116456)；BAFF受体/pid＝NP_443177.1-智人
Thompson,J.S.,et al Science 293(5537),2108-2111(2001)；WO2004058309；WO2004011611；WO2003045422(实施例；第32-33页)；WO2003014294(权利要求35；图6B)；WO2003035846(权利要求70；第615-616页)；WO200294852(Col 136-137)；WO200238766(权利要求3；第133页)；WO200224909(实施例3；图3)；
交叉参考:MIM:606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600
(27)CD22(B-细胞受体CD22-B同种型,BL-CAM,Lyb-8,Lyb8,SIGLEC-2,FLJ22814,Genbank登录号AK026467)；
Wilson et al(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003072036(权利要求1；图1)；
交叉参考:MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1
(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白相关α，一种与Igβ(CD79B)共价相互作用并与Ig M分子形成表面复合物的B细胞特异性蛋白，其转导参与B细胞分化的信号),pI:4.84,MW:25028TM:2[P]基因染色体:19q13.2,Genbank登录号NP_001774.10)
WO2003088808,US20030228319；WO2003062401(权利要求9)；US2002150573(权利要求4,第13-14页)；WO9958658(权利要求13,图16)；WO9207574(图1)；US5644033；Ha et al(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531；Mueller et al(1992)Eur.J.Biochem.22:1621-1625；Hashimoto et al(1994)Immunogenetics 40(4):287-295；Preud’homme et al(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146；Yu et al(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi et al(1988)EMBO J.7(11):3457-3464；
(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，一种由CXCL13趋化因子激活的G蛋白偶联受体，在淋巴细胞迁移和体液防御中起作用，在HIV-2感染中起作用并且可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展中中起作用)；372aa,pI:8.54MW:41959TM:7[P]基因染色体:11q23.3,Genbank登录号NP_001707.1)
WO2004040000；WO2004015426；US2003105292(实施例2)；US6555339(实施例2)；WO200261087(图1)；WO200157188(权利要求20,第269页)；WO200172830(第12-13页)；WO200022129(实施例1,第152-153页,实施例2,第254-256页)；WO9928468(权利要求1,第38页)；US5440021(实施例2,col 49-52)；WO9428931(第56-58页)；WO9217497(权利要求7,图5)；Dobner et al(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799；Barella et al(1995)Biochem.J.309:773-779；
(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原)，其结合肽并将它们呈递到CD4+T淋巴细胞)；273aa,pI:6.56MW:30820TM:1[P]基因染色体:6p21.3,Genbank登录号NP_002111.1)
Tonnelle et al(1985)EMBO J.4(11):2839-2847；Jonsson et al(1989)Immunogenetics 29(6):411-413；Beck et al(1992)J.Mol.Biol.228:433-441；Strausberg et al(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；Servenius et al(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766；Beck et al(1996)J.Mol.Biol.255:1-13；Naruse etal(2002)Tissue Antigens 59:512-519；WO9958658(权利要求13,图15)；US6153408(Col35-38)；US5976551(col 168-170)；US6011146(col 145-146)；Kasahara et al(1989)Immunogenetics 30(1):66-68；Larhammar et al(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119；
(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5，由胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经发生，缺陷可能有助于特发性逼尿肌不稳定的病理生理状况)；422aa),pI:7.63,MW:47206TM:1[P]基因染色体:17p13.3,Genbank登录号NP_002552.2)
Le et al(1997)FEBS Lett.418(1-2):195-199；WO2004047749；WO2003072035(权利要求10)；Touchman et al(2000)Genome Res.10:165-173；WO200222660(权利要求20)；WO2003093444(权利要求1)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003029277(第82页)；
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)蛋白质序列完整配基...tafrfpd(1..359；359aa),pI:8.66,MW:40225TM:1[P]基因染色体:9p13.3,Genbank登录号NP_001773.1)
WO2004042346(权利要求65)；WO2003026493(第51-52,57-58页)；WO200075655(第105-106页)；Von Hoegen et al(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877；Strausberg et al(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白，调节B细胞活化和细胞凋亡，功能的丧失与患有系统性红斑狼疮的患者的疾病活性增加相关)；661aa,pI:6.20,MW:74147TM:1[P]基因染色体:5q12,Genbank登录号NP_005573.1)
US2002193567；WO9707198(权利要求11,第39-42页)；Miura et al(1996)Genomics 38(3):299-304；Miura et al(1998)Blood 92:2815-2822；WO2003083047；WO9744452(权利要求8,第57-61页)；WO200012130(第24-26页)；
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，免疫球蛋白Fc结构域的推定受体，其包含C2型Ig样和ITAM结构域，在B-淋巴细胞20分化中可以具有作用)；429aa,pI:5.28,MW:46925TM:1[P]基因染色体:1q21-1q22,Genbank登录号NP_443170.1)
WO2003077836；WO200138490(权利要求6,图18E-1-18-E-2)；Davis et al(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17):9772-9777；WO2003089624(权利要求8)；EP1347046(权利要求1)；WO2003089624(权利要求7)；
(35)FCRH5(IRTA2,免疫球蛋白超家族受体易位相关2，在B细胞发育和淋巴瘤发生中可能有作用的推定的免疫受体；由易位引起的基因失调发生在一些B细胞恶性疾病中)；977aa,pI:6.88MW:106468TM:1[P]基因染色体:1q21,Genbank登录号Human:AF343662,AF343663,AF343664,AF343665,AF369794,AF397453,AK090423,AK090475,AL834187,AY358085；Mouse:AK089756,AY158090,AY506558；NP_112571.1
WO2003024392(权利要求2,图97)；Nakayama et al(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127；WO2003077836；WO200138490(权利要求3,图18B-1-18B-2)；
(36)TENB2(TMEFF2,tomoregulin,TPEF,HPP1,TR,假定的跨膜蛋白聚糖，与EGF/调蛋白家族生长因子和卵泡抑素有关)；374aa,NCBI登陆:AAD55776,AAF91397,AAG49451,NCBI RefSeq:NP_057276；NCBI Gene:23671；OMIM:605734；SwissProt Q9UIK5；Genbank登录号AF179274；AY358907,CAF85723,CQ782436
WO2004074320(SEQ ID NO 810)；JP2004113151(SEQ ID NOS 2,4,8)；WO2003042661(SEQ ID NO 580)；WO2003009814(SEQ ID NO 411)；EP1295944(第69-70页)；WO200230268(第329页)；WO200190304(SEQ ID NO 2706)；US2004249130；US2004022727；WO2004063355；US2004197325；US2003232350；US2004005563；US2003124579；Horie et al(2000)Genomics 67:146-152；Uchida et al(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602；Liang et al(2000)癌症Res.60:4907-12；Glynne-Jones et al(2001)Int J癌症.Oct 15；94(2):178-84；
(37)PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；ME20；gp100)BC001414；BT007202；M32295；M77348；NM_006928；McGlinchey,R.P.et al(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(33),13731-13736；Kummer,M.P.et al(2009)J.Biol.Chem.284(4),2296-2306；
(38)TMEFF1(具有EGF样和跨膜蛋白抑制素样结构域1的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；H7365；C9orf2；C9ORF2；U19878；X83961；NM_080655；NM_003692；Harms,P.W.(2003)Genes Dev.17(21),2624-2629；Gery,S.et al(2003)Oncogene 22(18):2723-2727；
(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；U95847；BC014962；NM_145793NM_005264；Kim,M.H.et al(2009)Mol.Cell.Biol.29(8),2264-2277；Treanor,J.J.et al(1996)Nature 382(6586):80-83；
(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1)；NP_002337.1；NM_002346.2；de Nooij-van Dalen,A.G.et al(2003)Int.J.癌症103(6),768-774；Zammit,D.J.et al(2002)Mol.Cell.Biol.22(3):946-952；WO2013/17705；
(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲爪蛙)；SHISA2)；NP_001007539.1；NM_001007538.1；Furushima,K.et al(2007)Dev.Biol.306(2),480-492；Clark,H.F.et al(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；
(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D,MEGT1)；NP_067079.2；NM_021246.2；Mallya,M.et al(2002)Genomics 80(1):113-123；Ribas,G.et al(1999)J.Immunol.163(1):278-287；
(43)LGR5(含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49,GPR67)；NP_003658.1；NM_003667.2；Salanti,G.et al(2009)Am.J.Epidemiol.170(5):537-545；Yamamoto,Y.et al(2003)Hepatology 37(3):528-533；
(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；NP_066124.1；NM_020975.4；Tsukamoto,H.et al(2009)癌症Sci.100(10):1895-1901；Narita,N.et al(2009)Oncogene28(34):3058-3068；
(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；NP_059997.3；NM_017527.3；Ishikawa,N.et al(2007)癌症Res.67(24):11601-11611；deNooij-van Dalen,A.G.et al(2003)Int.J.癌症103(6):768-774；
(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；NP_006134.1；NM_006143.2；Montpetit,A.and Sinnett,D.(1999)Hum.Genet.105(1-2):162-164；O’Dowd,B.F.et al(1996)FEBSLett.394(3):325-329；
(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；NP_115940.2；NM_032551.4；Navenot,J.M.et al(2009)Mol.Pharmacol.75(6):1300-1306；Hata,K.et al(2009)Anti癌症Res.29(2):617-623；
(48)ASPHD1(含有天冬氨酸β-羟化酶结构域的1；LOC253982)；NP_859069.2；NM_181718.3；Gerhard,D.S.et al(2004)Genome Res.14(10B):2121-2127；
(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；NP_000363.1；NM_000372.4；Bishop,D.T.et al(2009)Nat.Genet.41(8):920-925；Nan,H.et al(2009)Int.J.癌症125(4):909-917；
(50)TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；NP_001103373.1；NM_001109903.1；Clark,H.F.et al(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；Scherer,S.E.etal(2006)Nature 440(7082):346-351
(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；NP_078807.1；NM_024531.3；Ericsson,T.A.et al(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(11):6759-6764；Takeda,S.et al(2002)FEBS Lett.520(1-3):97-101.
(52)CD33,与唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素家族成员,一种67kDa糖基化跨膜蛋白。CD33除定型骨髓单核细胞和红细胞祖细胞外还在大多数髓细胞性和单核细胞性白血病细胞上表达。其在早期多能干细胞、成熟粒细胞、淋巴样细胞或非造血细胞上没有观察到(Sabbath et al.,(1985)J.Clin.Invest.75:756-56；Andrews et al.,(1986)Blood 68:1030-5)。CD33在其胞质尾区上含有两个酪氨酸残基，其各自跟随有与在多种抑制性受体中观察到的基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)类似的疏水性残基。
(53)CLL-1(CLEC12A,MICL和DCAL2),对C型凝集素/C型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族成员进行编码。该家族成员分享共同的蛋白质折叠且具有各种功能例如细胞粘附、细胞-细胞信号传导和糖蛋白周转且在炎症和免疫响应中发挥作用。该基因所编码的蛋白质为粒细胞和单核细胞功能的负性调节剂。已经描述了该基因的几种可变剪接的转录变体，但是这些变体中的一些的全长性质尚未确定。该基因与染色体12p13上的天然杀伤基因复合体区域中的其它CTL/CTLD超家族成员紧密关联(Drickamer K(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9(5):585-90；van Rhenen A,et al.,(2007)Blood 110(7):2659-66；Chen CH,et al.(2006)Blood 107(4):1459-67；Marshall AS,et al.(2006)Eur.J.Immunol.36(8):2159-69；Bakker AB,et al(2005)癌症Res.64(22):8443-50；Marshall AS,et al(2004)J.Biol.Chem.279(15):14792-802)。已经显示CLL-1为II型跨膜受体，其包含单一C型凝集素样结构域(其不被预期与钙或糖结合)、柄区、跨膜结构域和含有ITIM基序的短胞质尾区。
在一个方面，PAC的抗体可以是针对在许多细胞或组织类型上发现的蛋白质的抗体。此类抗体的实例包括gD和EpCAM。换句话说，PAC可用于将PROTAC递送至许多细胞或组织而非特异性细胞类型或组织类型，如同使用靶向抗体时一样。
如本申请所述，PAC可包含抗体，例如选自以下的抗体：
抗Ly6E抗体
在某些实施方案中，PAC可包含抗Ly6E抗体。淋巴细胞抗原6复合物基因座E(Ly6E)也称为维甲酸所诱导的基因E(RIG-E)和干细胞抗原2(SCA-2)。其为与GPI关联的长度为131个氨基酸的～8.4kDa的功能未知的不具有已知结合配对体的蛋白质。其最初在小鼠中被鉴定为在未成熟胸腺细胞即胸腺髓上皮细胞中表达的转录物(Mao等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:5910-5914)。在一些实施方案中，本申请提供免疫缀合物，其包含PCT公开文本WO2013/177055描述的抗Ly6E抗体。
在一些实施方案中，本申请提供包含抗Ly6E抗体的PAC，所述Ly6E抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。
在一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-H3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQID NO:10的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。
在另一个方面，PAC包含抗体，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HVR-H1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-H2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-H3；及(b)VL结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-L2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQID NO:12的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQID NO:14的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ IDNO:10的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，PAC中的抗Ly6E抗体是人化的。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体包含任何上述实施方案中的HVR且还包含人接纳体框架例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个方面，PAC中的抗Ly6E抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗Ly6E抗体保留与Ly6E结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:8中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:8中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQ ID NO:8的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-H3。
在另一个方面，提供PAC中的抗Ly6E抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ IDNO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗Ly6E抗体保留与Ly6E结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:7中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:7中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQ IDNO:7的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ IDNO:10的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。
在另一个方面，提供包含抗Ly6E抗体的PAC，其中所述抗体包含任何上述实施方案中的VH和任何上述实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供PAC，其中所述抗体包含分别为SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:7的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与本申请提供的抗Ly6E抗体相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与包含分别为SEQ ID NO:8的VH序列和SEQ ID NO:7的VL序列的抗Ly6E抗体相同的表位。
在本申请另一个方面，任何上述实施方案的PAC中的抗Ly6E抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，PAC中的抗Ly6E抗体为抗体片段例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双特异性抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体为基本上全长抗体例如IgG1抗体、IgG2a抗体或本申请定义的其它抗体类别或同种型。在一些实施方案中，PAC包含抗Ly6E抗体，其所包含的重链和轻链包含分别为SEQ ID NO:16和15的氨基酸序列。
表4.Ly6E抗体序列
抗HER2抗体
在某些实施方案中，PAC包含抗HER2抗体。在本申请一个实施方案中，本申请ADC中的抗HER2抗体包含人化抗HER2抗体例如US5821337的表3描述的huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8，将其具体引入到本申请中作为参考。这些抗体含有人框架区，其具有与HER2结合的鼠抗体(4D5)的互补决定区。人化抗体huMAb4D5-8也称为曲妥珠单抗，其以商品名市售。在本申请另一个实施方案中，PAC中的抗HER2抗体包含人化抗HER2抗体例如US7862817描述的人化2C4。示例性人化2C4抗体为帕妥珠单抗，其以商品名市售。
在本申请另一个实施方案中，PAC中的抗HER2抗体包含人化7C2抗HER2抗体。人化7C2抗体为抗HER2抗体。
在一些实施方案中，本申请提供包含抗HER2抗体的PAC，所述抗HER2抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23、27或28的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ IDNO:24或29的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:19的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQID NO:20的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:21的HVR-L3。在一些实施方案中，本申请提供包含抗HER2抗体的PAC，所述抗HER2抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQID NO:23的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQID NO:19的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQID NO:21的HVR-L3。
在一方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23、27或28的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24或29的HVR-H3。在一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQID NO:23的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23、27或28的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24或29的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQID NO:23的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:19的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:21的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:19的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:21的HVR-L3。
在另一个方面，PAC包含抗体，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23、27或28的HVR-H2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24或29的HVR-H3；及(b)VL结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:19的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:21的HVR-L3。在另一个方面，本申请抗体-药物缀合物包含抗体，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(ii)含有氨基酸序列SEQ IDNO:23的HVR-H2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3；及(b)VL结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:19的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:21的HVR-L3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23、27或28的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24或29的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:19的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:21的HVR-L3。在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:19的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:21的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，PAC中的抗HER2抗体是人化的。在一个实施方案中，抗体-药物缀合物中的抗HER2抗体包含任何上述实施方案中的HVR且还包含人接纳体框架例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个方面，PAC中的抗HER2抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗HER2抗体保留与HER2结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:18中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:18中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗HER2抗体包含SEQ IDNO:18的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1,(b)含有氨基酸序列SEQ IDNO:23的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3。
在另一个方面，提供PAC中的抗HER2抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ IDNO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗HER2抗体保留与HER2结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:17中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:17中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗HER2抗体包含SEQ ID NO:17的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:19的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:21的HVR-L3。
在另一个方面，提供包含抗HER2抗体的PAC，其中所述抗体包含任何上述实施方案中的VH和任何上述实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供包含抗体的PAC，其中所述抗体包含分别为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:17的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，提供包含抗体的PAC，其中所述抗体包含SEQ ID NO:30的人化7C2.v2.2.LA(hu7C2)K149Cκ轻链序列。
在一个实施方案中，提供包含抗体的PAC，其中所述抗体包含SEQ ID NO:31的Hu7C2A118C IgG1重链序列.
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与本申请提供的抗HER2抗体相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与包含分别为SEQ ID NO:18的VH序列和SEQ ID NO:17的VL序列的抗HER2抗体相同的表位。
在本申请另一个方面，任何上述实施方案的PAC中的抗HER2抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，PAC的抗HER2抗体为抗体片段例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双特异性抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，PAC包含抗体，所述抗体为基本上全长抗体例如IgG1抗体、IgG2a抗体或本申请定义的其它抗体类别或同种型。
表5.人化7C2抗HER2抗体序列
抗MUC16抗体
在某些实施方案中，PAC包含抗MUC16抗体。
在一些实施方案中，本申请提供包含抗MUC16抗体的PAC，所述抗MUC16抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:35的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的HVR-L3。
在一方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:35的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:35的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQID NO:36的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-H3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的HVR-L3。
在另一个方面，本申请PAC包含抗体，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:35的HVR-H1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的HVR-H2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-H3；及(b)VL结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的HVR-L3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQID NO:35的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQID NO:37的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQID NO:33的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，PAC中的抗MUC16抗体是人化的。在一个实施方案中，抗MUC16抗体包含任何上述实施方案中的HVR且还包含人接纳体框架例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个方面，PAC中的抗MUC16抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:39具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:39具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗MUC16抗体保留与MUC16结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:39中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:39中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗MUC16抗体包含SEQID NO:39的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:35的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-H3。
在另一个方面，提供PAC中的抗MUC16抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQID NO:38具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:38具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗MUC16抗体保留与MUC16结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:38中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:38中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗MUC16抗体包含SEQ ID NO:38的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的HVR-L3。
在另一个方面，提供包含抗MUC16抗体的PAC，其中所述抗体包含任何上述实施方案中的VH和任何上述实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供PAC，其中所述抗体包含分别为SEQ ID NO:39和SEQ IDNO:38的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与本申请提供的抗MUC16抗体相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与包含分别为SEQ ID NO:39的VH序列和SEQ ID NO:38的VL序列的抗MUC16抗体相同的表位。
在本申请另一个方面，任何上述实施方案的PAC中的抗MUC16抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，PAC中的抗MUC16抗体为抗体片段例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双特异性抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体为基本上全长抗体例如IgG1抗体、IgG2a抗体或本申请定义的其它抗体类别或同种型。
表6.MUC16抗体序列
抗STEAP-1抗体
在某些实施方案中，PAC包含抗STEAP-1抗体。
在一些实施方案中，本申请提供包含抗STEAP-1抗体的PAC，所述抗STEAP-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:44的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L3。
在一方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQID NO:41的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-H3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:44的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:44的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L3。
在另一个方面，本申请PAC包含抗体，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的HVR-H1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的HVR-H2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-H3；及(b)VL结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:44的HVR-L2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQID NO:40的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQID NO:42的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQID NO:44的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，PAC中的抗STEAP-1抗体是人化的。在一个实施方案中，抗STEAP-1抗体包含任何上述实施方案中的HVR且还包含人接纳体框架例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个方面，PAC中的抗STEAP-1抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:46具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:46具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗STEAP-1抗体保留与STEAP-1结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:46中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:46中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗STEAP-1抗体包含SEQ ID NO:46的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的HVR-H1,(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-H3。
在另一个方面，提供PAC中的抗STEAP-1抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQID NO:47具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:47具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗STEAP-1抗体保留与STEAP-1结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:47中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:47中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗STEAP-1抗体包含SEQ ID NO:47的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:44的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L3。
在另一个方面，提供包含抗STEAP-1抗体的PAC，其中所述抗体包含任何上述实施方案中的VH和任何上述实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供PAC，其中所述抗体包含分别为SEQ ID NO:46和SEQ IDNO:47的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与本申请提供的抗STEAP-1抗体相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与包含分别为SEQ ID NO:46的VH序列和SEQ ID NO:47的VL序列的抗STEAP-1抗体相同的表位。
在本申请另一个方面，任何上述实施方案的PAC中的抗STEAP-1抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，PAC中的抗STEAP-1抗体为抗体片段例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双特异性抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体为基本上全长抗体例如IgG1抗体、IgG2a抗体或本申请定义的其它抗体类别或同种型。
表7.STEAP抗体序列
抗NaPi2b抗体
在某些实施方案中，PAC包含抗NaPi2b抗体。
在一些实施方案中，本申请提供包含抗NaPi2b抗体的PAC，所述抗NaPi2b抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在一方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQID NO:49的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在另一个方面，本申请PAC包含抗体，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3；及(b)VL结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQID NO:48的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQID NO:50的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQID NO:52的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，PAC中的抗NaPi2b抗体是人化的。在一个实施方案中，抗NaPi2b抗体包含任何上述实施方案中的HVR且还包含人接纳体框架例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个方面，PAC中的抗NaPi2b抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗NaPi2b抗体保留与NaPi2b结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:54中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:54中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗NaPi2b抗体包含SEQ ID NO:54的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1,(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3。
在另一个方面，提供PAC中的抗NaPi2b抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQID NO:55具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:55具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗NaPi2b抗体保留与NaPi2b结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:55中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:55中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗NaPi2b抗体包含SEQ ID NO:55的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在另一个方面，提供包含抗NaPi2b抗体的PAC，其中所述抗体包含任何上述实施方案中的VH和任何上述实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供PAC，其中所述抗体包含分别为SEQ ID NO:54和SEQ IDNO:55的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与本申请提供的抗NaPi2b抗体相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与包含分别为SEQ ID NO:54的VH序列和SEQ ID NO:55的VL序列的抗NaPi2b抗体相同的表位。
在本申请另一个方面，任何上述实施方案的PAC中的抗NaPi2b抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，PAC中的抗NaPi2b抗体为抗体片段例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双特异性抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体为基本上全长抗体例如IgG1抗体、IgG2a抗体或本申请定义的其它抗体类别或同种型。
表8.NaPi2b抗体序列
抗CD79b抗体
在某些实施方案中，PAC包含抗CD79b抗体。
在一些实施方案中，本申请提供包含抗CD79b抗体的PAC，所述抗CD79b抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:63的HVR-L3。
在一方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQID NO:59的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:63的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:63的HVR-L3。
在另一个方面，本申请PAC包含抗体，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-H1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-H2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H3；及(b)VL结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-L2；和(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:63的HVR-L3。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQID NO:58的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQID NO:60的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQID NO:62的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:63的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，PAC中的抗CD79b抗体是人化的。在一个实施方案中，抗CD79b抗体包含任何上述实施方案中的HVR且还包含人接纳体框架例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个方面，PAC中的抗CD79b抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:56具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:56具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗CD79b抗体保留与CD79b结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:56中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:56中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗CD79b抗体包含SEQID NO:8的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-H1,(b)含有氨基酸序列SEQID NO:59的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H3。
在另一个方面，提供PAC中的抗CD79b抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQID NO:57具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:57具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于所述参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗CD79b抗体保留与CD79b结合的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:57中总共1-10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:57中总共1-5个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在处于HVR外(即FR中)的区域。任选地，抗CD79b抗体包含SEQ ID NO:57的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，所述VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:63的HVR-L3。
在另一个方面，提供包含抗CD79b抗体的PAC，其中所述抗体包含任何上述实施方案中的VH和任何上述实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供PAC，其中所述抗体包含分别为SEQ ID NO:56和SEQ IDNO:57的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在另一个方面，本申请提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与本申请提供的抗CD79b抗体相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供包含抗体的PAC，所述抗体结合于与包含分别为SEQ ID NO:56的VH序列和SEQ ID NO:57的VL序列的抗CD79b抗体相同的表位。
在本申请另一个方面，任何上述实施方案的PAC中的抗CD79b抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，PAC中的抗CD79b抗体为抗体片段例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双特异性抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体为基本上全长抗体例如IgG1抗体、IgG2a抗体或本申请定义的其它抗体类别或同种型。
表9.CD79b抗体序列
抗CD22抗体
在某些实施方案中，PAC可包含抗CD22抗体，其包含三个轻链高可变区(HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3)和三个重链高可变区(HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3)。在一个实施方案中，PAC的抗CD22抗体包含三个轻链高可变区和三个重链高可变区(SEQ ID NO:66-71)，该序列如下所示。在一个实施方案中，PAC的抗CD22抗体包含SEQ ID NO:72的轻链序列和SEQ ID NO:73的可变重链序列。在一个实施方案中，本发明的PAC的抗CD22抗体包含SEQ ID NO:74的轻链序列和SEQ ID NO:75的重链序列：
表10.抗CD22抗体
抗CD33抗体
在某些实施方案中，PAC可包含抗CD33抗体，其包含三个轻链高可变区和三个重链高可变区，该序列(SEQ ID NO:76-81)如下所示。在一个实施方案中，PAC的抗CD33抗体包含SEQ ID NO:82的可变轻链序列和SEQ ID NO:83的可变重链。
表11.
在一个实施方案中，PAC的抗CD33抗体包含SEQ ID NO:84的轻链序列和SEQ IDNO:85的重链序列。在一个实施方案中，PAC的抗CD33抗体包含三个轻链高可变区和三个重链高可变区，其序列(Seq ID NO:84-89)如下所示。在一个实施方案中，PAC的抗CD33抗体包含SEQ ID NO:90的可变轻链序列和SEQ ID NO:91的可变重链。在一个实施方案中，PAC的抗CD33抗体包含SEQ ID NO:92的可变轻链序列和SEQ ID NO:93的可变重链序列。在一个实施方案中，本发明的PAC的抗CD33抗体包含SEQ ID NO:94的可变轻链序列和SEQ ID NO:95的可变重链序列。在一个实施方案中，本发明的PAC的抗CD33抗体包含SEQ ID NO:96的可变轻链序列和SEQ ID NO:97的可变重链序列。
表12.
抗体亲和力
在某些实施方案中，本申请提供的抗体所具有的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM且任选为≥10-13M(例如10-8M或更小,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd如下测量：如以下测定所描述的那样用所关注的抗体的Fab版本和其抗原进行经放射性标记的抗原结合测定(RIA)。Fab针对抗原的溶液结合亲和力如下测量：在一系列未经标记的滴定抗原存在下用最小浓度的经(125I)标记的抗原对Fab进行平衡，然后用经抗Fab抗体涂覆的板捕获所结合的抗原(参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确定测定条件，多孔板(ThermoScientific)用5μg/ml捕获用抗Fab抗体(Cappel Labs)/50mM碳酸钠(pH 9.6)涂覆过夜，然后在室温(约23℃)用2％(w/v)牛血清白蛋白/PBS阻断2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中将100pM或26pM[125I]-抗原与所关注的Fab的系列稀释液混合(例如与Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中对抗VEGF抗体即Fab-12进行的评价一致)。然后将所关注的Fab孵育过夜；然而，孵育可持续更长时段(例如约65小时)以确保达到平衡。然后将混合物转移到捕获板中以在室温进行孵育(例如1小时)。然后除去溶液且板用0.1％聚山梨酯20(吐温-)/PBS洗涤8次。当板已经干燥时，加入150μl/孔闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对板进行计数10分钟。选择每种Fab实现小于或等于20％最大结合的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一个实施方案，通过表面等离子共振测定在25℃使用带有固定抗原CM5芯片的-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)以～10个响应单位(RU)对Kd进行测量。简言之，经羧基甲基化的右旋糖酐生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)根据供应商提供的说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速进行注射以实现偶联蛋白的约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/min的流速注射Fab在具有0.05％聚山梨酯20(吐温-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM-500nM)。缔合速率(kon)和离解速率(koff)使用简单一对一Langmuir结合模型(评价软件3.2版)通过同时对缔合和离解传感图进行拟合来计算。将平衡解离常数(Kd)计算为比例koff/kon。参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若上述表面等离子共振测定所给出的缔合速率超过106M-1s-1，则缔合速率可通过使用荧光淬灭技术来确定，所述荧光淬灭技术对20nM抗抗原抗体(Fab形式)在PBS(pH 7.2)中的溶液在25℃在浓度增加的抗原存在下的荧光发射强度的提高或降低(激发＝295nm；发射＝340nm,16nm带通)进行测量，其在光谱仪例如配备有停流的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量。
2.接头(L1)
如本文所述，“接头”(L1)是双功能或多功能部分，其可用于将一个或多个PROTAC部分(D)与抗体(Ab)连接以形成PAC。在一些实施方案中，可以使用具有反应性官能团的L1制备PAC，以共价连接PROTAC和抗体。例如，在一些实施方案中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头的反应性官能团或接头L1-PROTAC基团形成键以制备PAC。具体地，接头的化学结构可以对PAC的功效和安全性具有显着影响(Ducry&Stump,Bioconjugate Chem,2010,21,5-13)。选择正确的接头影响适当的药物递送至靶细胞的预期细胞区室。
接头通常可分为两类：可切割的(如肽、腙或二硫化物)或不可切割的(如硫醚)。可以通过溶酶体酶(例如组织蛋白酶B)水解的肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)已经用于将药物与抗体连接(US 6,214,345)。它们是特别有用的，部分原因在于它们在体循环中的相对稳定性和在肿瘤中有效释放药物的能力。然而，天然肽表示的化学空间是有限的；因此，需要具有多种非肽接头，其作用类似于肽并且可被溶酶体蛋白酶有效切割。更多样化的非肽结构可以产生肽接头不能提供的新颖的有益特性。本文提供了可以被溶酶体酶切割的接头L1的不同类型的非肽接头。
a.肽模拟接头
本文提供了不同类型的用于PAC的非肽肽模拟接头，其可被溶酶体酶切割。例如，二肽(例如Val-Cit)中间的酰胺键被酰胺模拟物取代；和/或整个氨基酸(例如Val-Cit二肽中的缬氨酸氨基酸)被非氨基酸部分(例如环烷基二羰基结构(例如环大小＝4或5))替换。
当L1为肽模拟接头时，其由下式表示：
—Str—(PM)—Sp—
其中
Str为延伸单元，其共价结合至Ab；
Sp为键或间隔单元，其共价结合至PROTAC部分；且
PM为选自以下的非肽化学部分：
W为-NH-杂环烷基-或杂环烷基；
Y为杂芳基、芳基、-C(O)C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基-NH2、C1-C6亚烷基-NH-CH3、C1-C6亚烷基-N-(CH3)2、C1-C6烯基或C1-C6烷基烯基；
每个R1独立为C1-C10烷基、C1-C10烯基、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立为H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基或杂芳基烷基，或R3和R2可一起形成C3-C7环烷基；且
R4和R5各自独立为C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(C1-C10烷基)OCH2-，或R4和R5可形成C3-C7环烷基环。
应当注意的是，L1可经E3LB、L2或PB基团中任一者连接至PROTAC。
在一些实施方案中，Y为杂芳基；R4和R5一起形成环丁基环。
在一些实施方案中，Y为选自以下的部分：
在一些实施方案中，Str为由下式表示的化学部分：
其中R6选自C1-C10亚烷基、C1-C10烯基、C3-C8环烷基、(C1-C8亚烷基)O-和C1-C10亚烷基-C(O)N(Ra)-C2-C6亚烷基，其中每个亚烷基可被一至五个选自以下的取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺、亚砜、羟基、烷氧基、酯、羧酸、烷基硫基、C3-C8环烷基、C4-C7杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂芳基，每个Ra独立为H或C1-C6烷基；Sp为—Ar—Rb—，其中Ar为芳基或杂芳基，Rb为(C1-C10亚烷基)O-。
在一些实施方案中，Str具有下式：
其中R7选自C1-C10亚烷基、C1-C10烯基、(C1-C10亚烷基)O-、N(Rc)-(C2-C6亚烷基)-N(Rc)和N(Rc)-(C2-C6亚烷基)；其中每个Rc独立为H或C1-C6烷基；Sp为—Ar—Rb—，其中Ar为芳基或杂芳基，Rb为(C1-C10亚烷基)O-或-C1-C6亚烷基-C(O)NH-。
在一些实施方案中，L1为由下式表示的非肽化学部分：
R1为C1-C6烷基、C1-C6烯基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立为H或C1-C10烷基。
在一些实施方案中，L1为由下式表示的非肽化学部分：
R1为C1-C6烷基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；
R4和R5一起形成C3-C7环烷基环。
在一些实施方案中，L1为由下式表示的非肽化学部分：
R1为C1-C6烷基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2且W如上定义。
在一些实施方案中，所述接头可为肽模拟接头，例如在WO2015/095227、WO2015/095124或WO2015/095223中所述的那些。
b.非肽模拟接头
在一方面，接头L1与抗体形成二硫键。在一方面，所述接头具有以下结构：
其中R1和R2独立选自H和C1-C6烷基，或R1和R2形成3、4、5或6元环烷基或杂环基。所述接头如下共价结合至抗体和PROTAC：
在一个方面，接头的羰基与PROTAC中的氨基连接。还注意到与Ab连接的硫原子是来自抗体中半胱氨酸的硫基团。在另一个方面，接头L1具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能团。这种反应性官能团的非限制性实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α-脲基乙酰基、活化酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。参见例如在Klussman,et al(2004),BioconjugateChemistry 15(4):765-773中第766页的缀合方法以及本申请的实施例。
在一些实施方案中，接头具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能团。这种亲电子基团的实例包括但不限于醛和酮羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。这种反应性官能团的非限制性实例包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸盐和芳基酰肼。
接头可包含一个或多个接头组分。示例性接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(“MCC”)。各种接头组分是本领域已知的，其中一些在下面描述。
接头可以是“可切割的接头”，促进PROTAC的释放。非限制性示例性可切割接头包括酸不稳定接头(例如包含腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)接头、光不稳定接头或含二硫化物的接头(Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992)；US 5208020)。
在某些实施方案中，接头具有下式：
-Aa-Ww-Yy-
其中A为“延伸单元”且a为0至1的整数；W为“氨基酸单元”且W为0至12的整数；Y为“间隔单元”且y为0、1或2。所述接头的示例性实施方案描述于美国专利7,498,298。
在一些实施方案中，接头组分包含“延伸单元”，其将抗体与另一接头组分或PROTAC部分连接。如下示出非限制性示例性延伸单元(其中波浪线表示与抗体、PROTAC或其他接头组分的共价连接位点)：
3.PROTAC(“D”)
有用的PROTAC具有上述通式。具体的PROTAC描述于US 7,208,157、WO2013/106643、WO2013/106646和WO2015/160845。PROTAC包括具有以下组分的那些。
a.E3泛素连接酶结合基团(E3LB)
E3泛素连接酶(其中600多种在人类中已知)赋予泛素化的底物特异性。已知有与这些连接酶结合的配体。如本文所述，E3泛素连接酶结合基团是可以结合E3泛素连接酶的肽或小分子。
具体的E3泛素连接酶包括：von Hippel-Lindau(VHL)、Cereblon、XIAP、E3A、MDM2、后期促进复合物(APC)、UBR5(EDD1)、SOCS/BC-box/eloBC/CUL5/RING、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、WWP2、Parkin、A20/TNFAIP3、AMFR/gp78、ARA54、β-TrCP1/BTRC、BRCA1、CBL、CHIP/STUB1、E6、E6AP/UBE3A、F-box蛋白15/FBXO15、FBXW7/Cdc4、GRAIL/RNF128、HOIP/RNF31、cIAP-1/HIAP-2、cIAP-2/HIAP-1、cIAP(pan)、ITCH/AIP4、KAP1、MARCH8、Mind Bomb 1/MIB1、Mind Bomb 2/MIB2、MuRF1/TRIM63、NDFIP1、NEDD4、NleL、Parkin、RNF2、RNF4、RNF8、RNF168、RNF43、SART1、Skp2、SMURF2、TRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、TRAF-4、TRAF-5、TRAF-6、TRIM5、TRIM21、TRIM32、UBR5和ZNRF3。
下表13-27列出某些E3连接酶。
表13.E3连接酶，HECT型
表14E3连接酶，RING型
表15.E3连接酶，PARKIN-Finger型
表16.3连接酶，RING-变体型
表17.E3连接酶，U-box型
表18.E3连接酶，A20-finger型
表19.E3连接酶，PIAS-finger型
表20.E3连接酶，PHD-finger型
表21.E3连接酶，Skp1-样型
表22.E3连接酶，Cullin型
表23.E3连接酶，F-box型
表24.E3连接酶，SOCS-box型
表25.E3连接酶，BTB型
表26.E3连接酶，DDB1-样型
表27.E3连接酶，APC/Cyclosome型
具体的E3泛素连接酶是von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制因子，E3连接酶复合物VCB的底物识别亚基，其也由延长蛋白B和C、Cul2和Rbx1构成。VHL的主要底物是缺氧诱导因子lα(HIF-lα)，其是响应于低氧水平而上调诸如促血管生成生长因子VEGF和诱导细胞因子促红细胞生成素的红细胞的基因的转录因子。结合VHL的化合物可以是羟脯氨酸化合物例如WO2013/106643中公开的那些以及US2016/0045607、WO2014187777、US20140356322和US9,249,153中描述的其他化合物。
另一具体的E3泛素连接酶为MDM2。MDM2的小分子结合化合物的实例包括“nutlin”化合物，例如nutlin 3a和nutlin 3，具有以下结构：
还包括作为MDM2结合化合物的是在如下中描述的那些：WO2012/121361；WO2014/038606；WO2010/082612；WO2014/044401；WO2009/151069；WO2008/072655；WO2014/100065；WO2014/100071；WO2014/123882；WO2014/120748；WO2013/096150；WO2015/161032；WO2012/155066；WO2012/065022；WO2011/060049；WO2008/036168；WO2006/091646；WO2012/155066；WO2012/065022；WO2011/153509；WO2013/049250；WO2014/151863；WO2014/130470；WO2014/134207；WO2014/200937；WO2015/070224；WO2015/158648；WO2014/082889；WO2013/178570；WO2013/135648；WO2012/116989；WO2012/076513；WO2012/038307；WO2012/034954；WO2012/022707；WO2012/007409；WO2011/134925；WO2011/098398；WO2011/101297；WO2011/067185；WO2011/061139；WO2011/045257；WO2010/121995；WO2010/091979；WO2010/094622；WO2010/084097；WO2009/115425；WO2009/080488；WO2009/077357；WO2009/047161A1；WO2008/141975A1；WO2008/141917A1；WO2008/125487A1；WO2008/034736A2；WO2008/055812A1；WO2007/104714A1；WO2007/104664A1；WO2007/082805A1；WO2007/063013A1；WO2006/136606A2；WO2006/097261A1；WO2005/123691A1；WO2005/110996A1；WO2005/003097A1；WO2005/002575A1；WO2004/080460A1；WO2003/051360A1；WO2003/051359A1；WO1998/001467；WO2011/023677；WO2011/076786；WO2012/066095；WO2012/175487；WO2012/175520；WO2012/176123；WO2013/080141；WO2013/111105；WO2013/175417；WO2014/115080；WO2014/115077；WO2014/191896；WO2014/198266；WO2016/028391A9；WO2016/028391A2；WO2016/026937；WO2016/001376；WO2015/189799；WO2015/155332A1；WO2015/004610A8；WO2013/105037A1；WO2012/155066A3；WO2012/155066A2；WO2012/033525A3；WO2012/047587A2；WO2012/033525A2；WO2011/106650A3；WO2011/106650A2；WO2011/005219A1；WO2010/058819A1；WO2010/028862A1；WO2009/037343A1；WO2009/037308A1；WO2008/130614A3；WO2009/019274A1；WO2008/130614A2；WO2008/106507A3；WO2008/106507A2；WO2007/107545A1；WO2007/107543A1；WO2006032631A1；WO2000/015657A1；WO1998/001467A2；WO1997/009343A3；WO1997/009343A2；WO1996/002642A1；US2007/0129416；Med.Chem.Lett,2013,4,466-469；J.Med.Chem.,2015,58,1038-1052；Bioorg.Med.Chem.Lett.25(2015)3621-3625；Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)3310-3314。与PAC一起使用的MDM2的小分子结合化合物的其他具体实例包括RG7112、RG7388、MI 773/SAR 405838、AMG 232、DS-3032b、RO6839921、RO5045337、RO5503781、Idasanutlin、CGM-097、MK-8242。
另一种具体的E3泛素连接酶是X连锁的凋亡抑制剂(XIAP)。XIAP是一种阻止凋亡细胞死亡的蛋白质。XIAP的失调与癌症、神经变性疾病和自身免疫有关。在肺癌的发展中，XIAP的过表达抑制半胱天冬酶。在发展前列腺癌中，XIAP是前列腺上皮中过表达的四种IAP之一。XIAP基因的突变可导致严重且罕见的炎性肠病。XIAP基因的缺陷也可导致称为X连锁淋巴组织增生性疾病的极为罕见的病症。XIAP的降解可通过阻止XIAP与半胱天冬酶结合来增强细胞凋亡。这允许正常的胱天蛋白酶活性进行。
XIAP的小分子结合化合物的实例包括披露于以下中的化合物：US 9,096,544；WO2015187998；WO 2015071393；US 9,278,978；US 9,249,151；US 20160024055；US20150307499；US 20140135270；US 20150284427；US 20150259359；US 20150266879；US20150246882；US 20150252072；US 20150225449；US 8,883,771,J.Med.Chem.,2015,58(16)6574-6588和Small-molecule Pan-IAP Antagonists:A Patent Review(2010)ExpertOpin Ther Pat；20:251-67(Flygare&Fairbrother)。具体化合物包括具有下式的所有四氢-苯并二氮杂酮化合物：
披露于WO 2015/071393。XIAP的其他小分子结合化合物包括AEG35156、Embelin、TWX006和TWX024。当XIAP结合部分用作PROTAC的部分时，所述XIAP结合部分可结合XIAP的BIR2或BIR3域或两者。
另一种具体的E3泛素连接酶是Cereblon。Cereblon是一种蛋白质，其与受损的DNA结合蛋白1(DDB1)、Cullin-4A(CUL4A)和cullins 1(ROC1)的调节因子形成E3泛素连接酶复合物。这种复合物使许多其他蛋白质泛素化。靶蛋白的Cereblon泛素化导致成纤维细胞生长因子8(FGF8)和成纤维细胞生长因子10(FGF10)的水平增加。FGF8继而调节许多发育过程，例如肢体和听觉囊泡形成。在没有Cereblon的情况下，DDB1与DDB2形成复合物，其作为DNA损伤结合蛋白起作用。
已知沙利度胺、来那度胺、泊马度胺及其类似物与Cereblon结合。具有沙利度胺和衍生化合物的Cereblon的晶体结构描述于US2015/0374678中。结合Cereblon的其他小分子化合物也是已知的，例如US2016/0058872和US2015/0291562中公开的化合物。此外，邻苯二甲酰亚胺与BET布罗莫结构域的结合物例如拮抗剂缀合可以为PROTAC提供高选择性的依赖于Cereblon的BET蛋白降解。Winter et al.,Science,June 19,2015,p.1376。所述PROTAC可与本申请所述的抗体缀合以形成PAC。
b.蛋白结合基团(PB)
PB组分是与要降解的靶蛋白结合的基团。术语“蛋白质”包括足够长度的寡肽和多肽序列，它们可以与PB基团结合。如本文另外描述的，真核系统或微生物系统中的任何蛋白质，包括病毒、细菌或真菌，是本文所述化合物介导的泛素化的靶标。
PB基团包括例如与蛋白质特异性结合的任何部分(与靶蛋白结合)并且包括以下小分子靶蛋白部分的非限制性实例：Hsp90抑制剂、激酶抑制剂、MDM2抑制剂、靶向人BET布罗莫结构域的蛋白质的化合物、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂、免疫抑制化合物和靶向芳烃受体(AHR)的化合物等。下面描述的组合物举例说明了这九种类型的小分子靶蛋白结合部分的一些成员。这种小分子靶蛋白结合部分还包括这些组合物的药用盐、对映异构体、溶剂化物和多晶型物以及可以靶向目的蛋白质的其他小分子。
通常，靶蛋白可包括例如结构蛋白、受体、酶、细胞表面蛋白、与细胞整合功能相关的蛋白质，包括参与催化活性、芳香酶活性、运动活性、解旋酶活性、代谢过程(合成代谢和破坏性)、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成的蛋白质；具有激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节剂活性、信号转导活性、结构分子活性、结合活性(蛋白质，脂质碳水化合物)、受体活性、细胞运动性、膜融合、细胞通讯、生物过程、发育、细胞分化的调节、对刺激的反应的蛋白质；行为蛋白、细胞粘附蛋白；参与细胞死亡的蛋白质；参与运输(包括蛋白质转运蛋白活性、核转运、离子转运蛋白活性、通道转运蛋白活性、载体活性、通透酶活性、分泌活性、电子转运蛋白活性、发病机制、分子伴侣调节活性、核酸结合活性、转录调节活性、细胞外组织和生物发生活性、翻译调节活性)的蛋白质。感兴趣的蛋白质可以包括来自真核和原核生物的蛋白质，包括作为药物治疗的靶标的人类，其他动物包括驯养动物，用于测定抗生素和其他抗微生物剂和植物的靶标的微生物，甚至是许多其他的病毒。
因此，PAC的PB组分为任何肽或小分子，其结合蛋白靶标诸如：FoxOl、HDAC、DP-1、E2F、ABL、AMPK、BRK、BRSK I、BRSK2、BTK、CAMKK1、CAMKKα、CAMKKβ、Rb、Suv39HI、SCF、p19INK4D、GSK-3、pi 8INK4、myc、细胞周期蛋白E、CDK2、CDK9、CDG4/6、环化素D、pl6INK4A、cdc25A、BMI1、SCF、Akt、CHKl/2、C 1δ、CK1γ、C 2、CLK2、CSK、DDR2、DYRK1A/2/3、EF2K、EPH-A2/A4/B1/B2/B3/B4、EIF2A 3、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、p53、p21Cipl、PAX、Fyn、CAS、C3G、SOS、Tal、Raptor、RACK-1、CRK、Rapl、Rac、KRas、NRas、HRas、GRB2、FAK、PI3K、spred、Spry、mTOR、MPK、LKBl、PAK 1/2/4/5/6、PDGFRA、PYK2、Src、SRPK1、PLC、PKC、PKA、PKBα/β、PKCα/γ/δ、PKD、PLKl、PRAK、PRK2、WAVE-2、TSC2、DAPKl、BAD、IMP、C-TAK1、TAKl、TAOl、TBK1、TESK1、TGFBR1、TIE2、TLK1、TrkA、TSSK1、TTBK1/2、TTK、Tpl2/cotl、MEK1、MEK2、PLDL Erkl、Erk2、Erk5、Erk8、p90RSK、PEA-15、SRF、p27KIP1、TIF la、HMGN1、ER81、MKP-3、c-Fos、FGF-R1、GCK、GSK3β、HER4、HIPK1/2/3/、IGF-1R、cdc25、UBF、LAMTOR2、Statl、StaO、CREB、JAK、Src、PTEN、NF-κB、HECTH9、Bax、HSP70、HSP90、Apaf-1、Cyto c、BCL-2、Bcl-xL、Smac、XIAP、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、CDC37、TAB、IKK、TRADD、TRAF2、R1P1、FLIP、TAKl、JNKl/2/3、Lck、A-Raf、B-Raf、C-Raf、MOS、MLKl/3、MN l/2、MSKl、MST2/3/4、MPSK1、MEKKl、ME K4、MEL、ASK1、MINK1、MKK 1/2/3/4/6/7、NE 2a/6/7、NUAK1、OSR1、SAP、STK33、Syk、Lyn、PDK1、PHK、PIM 1/2/3、Ataxin-1、mTORCl、MDM2、p21Wafl、细胞周期蛋白Dl、Lamln A、Tpl2、Myc、连环蛋白、Wnt、IKK-β、IKK-γ、IKK-α、IKK-ε、ELK、p65RelA、IRAKI、IRA2、IRAK4、IRR、FADD、TRAF6、TRAF3、MKK3、MKK6、ROCK2、RSK1/2、SGK 1、SmMLCK、SIK2/3、ULK1/2、VEGFR1、WNK l、YES1、ZAP70、MAP4K3、MAP4K5、MAPKlb、MAPKAP-K2K3、p38α/β/δ/γMAPK、Aurora A、Aurora B、Aurora C、MCAK、Clip、MAPKAPK、FAK、MARK 1/2/3/4、Mucl、SHC、CXCR4、Gap-1、Myc、β-连环蛋白/TCF、Cbl、BRM、Mcl-1、BRD2、BRD3、BRD4、AR、RAS、ErbB3、EGFR、IRE1、HPK1、RIPK2和ERα，包括所列的这些靶标蛋白的所有变体、突变体、剪接变体、插入缺失体和融合体。
具体的PB基团为小分子化合物诸如披露于US2014/0356322和US2016/0045607中的那些。本申请公开的化合物可分类为热休克蛋白90(HSP90)抑制剂、激酶和磷酸酶抑制剂、MDM2抑制剂、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂、免疫抑制化合物以及靶标以下的化合物：人BET布罗莫结构域蛋白、芳基烃受体(AHR)、REF受体激酶、FKBP、雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、甲状腺激素受体、HIV蛋白酶、HIV整合酶、HCV蛋白酶、酰基蛋白硫酯酶-1和-2(APT1和APT2)。
c.接头L2
如本文所述的PROTAC的E3LB和PB组可以与接头(L2)连接。在某些实施方案中，接头基团L2是包含A的一个或多个共价连接的结构单元(例如-A1…Aq-)的基团，其中A1是与E3LB、PB或其组合中的至少一个偶联的基团。在某些实施方案中，A1将E3LB、PB或其组合直接连接至另一E3LB、PB或其组合。在其他实施例中，A1通过Aq将EL3B、PB或其组合间接地连接到另一个E3LB、PB或其组合。
在某些实施方案中，A1至Aq各自独立地为键、CRLaRLb、O、S、SO、SO2、NRLc、SO2NRLc、SONRLc、CONRLc、NRLcCONRLd、NRLcSO2NRLd、CO、CRLa＝CRLb、C≡C、SiRLaRLb、P(O)RLa、P(O)ORLa、NRLcC(＝NCN)NRLd、NRLcC(＝NCN)、NRLcC(＝CNO2)NRLd、任选取代有0-6个RLa和/或RLb基团的C3-11环烷基、任选取代有0-6个RLa和/或RLb基团的C3-11杂环基、任选取代有0-6个RLa和/或RLb基团的芳基、任选取代有0-6个RLa和/或RLb基团的杂芳基，其中RLa或RLb各自独立地可连接至其他A基团以形成环烷基和/或杂环基部分，后者可进一步取代有0-4个RLe基团；其中RLa、RLb、RLc、RLd和RLe各自独立地为H、卤素、C1-8烷基、OC1-8烷基、SC1-8烷基、NHC1-8烷基、N(C1-8烷基)2、C3-11环烷基、芳基、杂芳基、C3-11杂环基、OC1-8环烷基、SC1-8环烷基、NHC1-8环烷基、N(C1-8环烷基)2、N(C1-8环烷基)(C1-8烷基)、OH、NH2、SH、SO2C1-8烷基、P(O)(OC1-8烷基)(C1-8烷基)、P(O)(OC1-8烷基)2、CC—C1-8烷基、CCH、CH＝CH(C1-8烷基)、C(C1-8烷基)＝CH(C1-8烷基)、C(C1-8烷基)＝C(C1-8烷基)2、Si(OH)3、Si(C1-8烷基)3、Si(OH)(C1-8烷基)2、COC1-8烷基、CO2H、卤素、CN、CF3、CHF2、CH2F、NO2、SF5、SO2NHC1-8烷基、SO2N(C1-8烷基)2、SONHC1-8烷基、SON(C1-8烷基)2、CONHC1-8烷基、CON(C1-8烷基)2、N(C1-8烷基)CONH(C1-8烷基)、N(C1-8烷基)CON(C1-8烷基)2、NHCONH(C1-8烷基)、NHCON(C1-8烷基)2、NHCONH2、N(C1-8烷基)SO2NH(C1-8烷基)、N(C1-8烷基)SO2N(C1-8烷基)2、NHSO2NH(C1-8烷基)、NHSO2N(C1-8烷基)2、NHSO2NH2。
在某些实施方案中，q为大于或等于0的整数。在某些实施方案中，q为大于或等于1的整数。
在某些实施方案中，例如其中q大于2，Aq为连接至E3LB部分的基团且A1和Aq经A的结构单元(A的结构单元数目:q-2)连接。
在某些实施方案中，例如其中q为2，Aq为连接A1和E3LB部分的基团。
在某些实施方案中，例如其中q为1，接头L2的结构为-A1-且A1为连接E3LB部分和PB部分的基团。
在其他实施方案中，q为1至100、1至90、1至80、1至70、1至60、1至50、1至40、1至30、1至20或1至10的整数。
在某些实施方案中，接头(L2)选自：
在其他实施方案中，接头基团是任选取代的(聚)乙二醇，其具有1至约100个乙二醇单元、约1至约50个乙二醇单元、1至约25个乙二醇单元、约1至10个乙二醇单元、1至约8个乙二醇单元和1和6个乙二醇单元、2至4个乙二醇单元，或任选取代的烷基，其与任选取代的O、N、S、P或Si原子相互分散。在某些实施方案中，接头被芳基、苯基、苄基、烷基、亚烷基或杂环基取代。在某些实施方案中，接头可以是不对称的或对称的。
在本文所述化合物的任何实施方案中，接头基团可以是如本文所述的任何合适的部分。在一个实施方案中，接头是取代或未取代的聚乙二醇基团，其大小范围为约1至约12个乙二醇单元、1至约10个乙二醇单元、约2个约6个乙二醇单元、约2至5个乙二醇单元、约2至4个乙二醇单元。
尽管E3LB组和PB组可以通过对接头化学合适且稳定的任何基团与接头基团共价连接。接头独立地与E3LB基团和PB基团共价键合，优选通过酰胺、酯、硫酯、酮基、氨基甲酸酯(氨基甲酸酯)、碳或醚，其中每个基团可以插入E3LB基团和PB基团的任何位置，以提供E3LB基团对泛素连接酶和待降解的靶蛋白上的PB基团的最大结合。在PB基团是E3LB组的某些方面，用于降解的靶蛋白可以是泛素连接酶本身。在某些方面，接头可以与E3LB和/或PB基团上的任选取代的烷基、亚烷基、烯基或炔基、芳基或杂环基连接。应注意，可能需要将E3LB基团或PB基团衍生化以制备与接头上的化学官能团反应的化学官能团。或者，可能需要将接头衍生化以包括可与E3LB和/或PB上发现的官能团反应的化学官能团。
L2也可由下式表示：
其中Z为基团，其连接E3LB至X；且X为连接Z与基团PB的基团。
在一些实施方案中，Z不存在(键)或为-(CH2)i-O、-(CH2)i-S、-(CH2)i-N-R、(CH2)i-X1Y1基团，其中X1Y1形成酰胺基团或氨基甲酸乙酯基团、酯或硫酯基团，或
其中每个R为H或C1-C3烷基、烷醇基团或杂环(包括水溶性杂环，优选吗啉代、哌啶或哌嗪基团，以促进接头的水溶性)；每个Y独立为键、O、S或N-R；且每个i独立为0至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；
在一些实施方案中，X为
其中每个V独立为键(不存在)或为
j为1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；
k为1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；优选k为1、2、3、4或5；
m’为1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；
n为1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、l至8、1至6、1、2、3、4或5；
X1为O、S或N-R，优选O；
Y为如上所述；且
CON为连接基团(其可为键)，当存在于接头时，其连接Z至X。
在一些实施方案中，CON为键(不存在)、杂环包括水溶性杂环诸如哌嗪基或其他基团，
其中X2为O、S、NR4、S(O)、S(O)2、-S(O)2O、-OS(O)2或OS(O)2O；
X3为O、S、CHR4、NR4；且
R为H或C1-C3烷基，其任选取代有一个或两个羟基；或其药用盐、对映异构体或立体异构体。
在另一个优选的方面，接头基团是具有1至约100个乙二醇单元、约1至约50个乙二醇单元、1至约25个乙二醇单元、约1至10个乙二醇单元、1至约8个乙二醇单元和1和6个乙二醇单元、2至4个乙二醇单元的(聚)乙二醇。
在一些实施方案中，CON为
或酰胺基团。
尽管E3LB基团和PB基团可通过任何适合且对接头化学稳定的基团与接头基团共价连接，但在优选的方面，接头通过以下独立地共价键合至E3LB基团和PB基团：酰胺、酯、硫酯、酮基、氨基甲酸酯(氨基甲酸乙酯)或醚，其中每个基团可插入E3LB基团和PB基团的任何位置，以使E3LB基团与泛素连接酶和PB基团与待降解的靶蛋白结合。换句话说，如本文所示，可以设计接头并将其连接至E3LB和PB，以最小化、消除或中和其存在可能对E3LB和PB与其各自结合配偶体的结合产生的任何影响。在某些方面，用于降解的靶蛋白可以是泛素连接酶。
额外的接头L2披露于US申请公开2016/0058872、2016/0045607、2014/0356322和2015/0291562及WO2014/063061。
现在参考PAC，PAC可以包含单个抗体，其中单个抗体可以具有多于一个PROTAC，每个PROTAC通过接头L1与抗体共价连接。“PROTAC加载”是每个抗体的PROTAC部分的平均数。PROTAC加载可以是每抗体(Ab)1至8个PROTAC(D)。也就是说，在PAC式Ab―(L1―D)p中，p的值为约1至约50、约1至约8、约1至约5、约1至约4或约1至约3。通过接头L1与抗体共价连接的每个PROTAC可以是相同或不同的PROTAC并且可以具有与抗体共价连接的任何其他L1相同类型或不同类型的接头。在一个实施方案中，Ab是半胱氨酸工程化抗体且p是约2。
来自缀合反应的PAC制备物中每个抗体的平均PROTAC数可通过常规方法表征，例如质谱、ELISA测定、电泳和HPLC。还可以确定PAC的p的定量分布。通过ELISA，可以确定特定PAC制备物中p的平均值(Hamblett et al(2004)Clin.癌症Res.10:7063-7070；Sandersonet al(2005)Clin.癌症Res.11:843-852)。然而，通过ELISA的抗体-抗原结合和检测限制，p值的分布是不可辨别的。而且，用于检测PAC的ELISA测定不确定PROTAC部分与抗体连接的位置，例如重链或轻链片段，或特定氨基酸残基。在一些情况下，均相PAC的分离、纯化和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的方法实现，其中p是来自具有其他PROTAC负载的PAC的特定值。
对于一些PAC，p可能受抗体上附着位点数量的限制。例如，抗体可以仅具有一个或几个半胱氨酸硫醇基团，或者可以仅具有一个或几个足够反应性的硫醇基团，接头可以通过所述硫醇基团连接。连接L1-Ds的Ab上的另一个反应位点是赖氨酸残基的胺官能团。p的值包括约1至约50、约1至约8、约1至约5、约1约4、约1至约3，和p等于2。在一些实施方案中，本文描述的主题涉及任何PAC，其中p为约1、2、3、4、5、6、7或8。
通常，在缀合反应期间，少于理论最大值的PROTAC部分与抗体缀合。抗体可含有例如许多不与接头L1-PROTAC基团(L1-D)或接头试剂反应的赖氨酸残基。只有最具反应性的赖氨酸基团可与胺反应性连接试剂反应。而且，只有最具反应性的半胱氨酸硫醇基团可与硫醇反应性接头试剂或接头L1-PROTAC基团反应。通常，抗体不含有许多(如果有的话)游离和反应性半胱氨酸硫醇基团，其可以与PROTAC部分连接。化合物抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫键存在并且必须在部分或全部还原条件下用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP还原。然而，PAR的PROTAC负载(PROTAC/抗体比，“PAR”)可以以几种不同的方式控制，包括：(i)限制接头L1-PROTAC组或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，和(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件。
III.L1-PROTAC化合物
本申请所述的PROTAC可共价连接接头L1以制备L1-PROTAC基团。这些化合物具有以下通式：
(L1―D)
其中D为具有结构E3LB―L2―PB的PROTAC；其中E3LB为E3连接酶结合基团，其共价结合至L2；L2为接头，其共价结合至E3LB和PB；PB为蛋白结合基团，其共价结合至L2；且L1为接头，其共价结合至D。本申请描述了针对这些组分中的每一个的有用的基团。
在具体的实施方案中，L1如在本申请其他部分所述，包括肽模拟接头。在这些实施方案中，L1-PROTAC具有下式：
其中
Str为延伸单元；
Sp为键或间隔单元，其共价结合至D，即PROTAC部分；
R1为C1-C10烷基、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；
R4和R5各自独立为C1-C10烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、(C1-C10烷基)OCH2-，或R4和R5可形成C3-C7环烷基环；
D为PROTAC部分。
L1-PROTAC化合物可由下式表示：
其中R6为C1-C10亚烷基；R4和R5一起形成C3-C7环烷基环且D为PROTAC部分。
L1-PROTAC化合物可由下式表示：
其中R1、R4和R5如在本申请其他部分所述且D为PROTAC部分。
L1-PROTAC化合物可由下式表示：
其中
Str为延伸单元；
Sp为任选的间隔单元，其共价结合至D，即PROTAC部分；
Y为杂芳基、芳基、-C(O)C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基-NH2、C1-C6亚烷基-NH-CH3、C1-C6亚烷基-N-(CH3)2、C1-C6烯基或C1-C6烷基烯基；
R1为C1-C10烷基、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立为H、C1-C10烷基、芳基烷基或杂芳基烷基，或R3和R2可一起形成C3-C7环烷基；且
D为PROTAC部分。
L1-PROTAC化合物可由下式表示：
其中R6为C1-C10亚烷基且R1、R2和R3如在本申请其他部分所述且D为PROTAC部分。
L1-PROTAC化合物可由下式表示：
其中R1、R2和R3如在本申请其他部分所述且D为PROTAC部分。
在以上L1-PROTAC化合物中任一者中，Str可具有下式：
其中R6选自C1-C10亚烷基、C3-C8环烷基、O-(C1-C8亚烷基)和C1-C10亚烷基-C(O)N(Ra)-C2-C6亚烷基，其中每个亚烷基可被一至五个选自以下的取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺、亚砜、羟基、烷氧基、酯、羧酸、烷基硫基、C3-C8环烷基、C4-C7杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂芳基；每个Ra独立为H或C1-C6烷基；Sp为—Ar—Rb—，其中Ar为芳基或杂芳基，Rb为(C1-C10亚烷基)O-。
在某些L1-PROTAC化合物中，R6为C1-C10亚烷基，Sp为—Ar—Rb—，其中Ar为芳基，Rb为(C1-C6亚烷基)O-；或R6为-(CH2)q-，q为1-10；
在以上L1-PROTAC化合物中任一者中，Str可具有下式：
其中表示能够缀合抗体的部分，R7选自C1-C10亚烷基、C1-C10亚烷基-O、N(Rc)-(C2-C6亚烷基)-N(Rc)和N(Rc)-(C2-C6亚烷基)；其中每个Rc独立为H或C1-C6烷基；
Sp为—Ar—Rb—，其中Ar为芳基或杂芳基，Rb为(C1-C10亚烷基)O-；或其中R6为C1-C10亚烷基，Sp为—Ar—Rb—，其中Ar为芳基，Rb为(C1-C6亚烷基)O-。
L1-PROTAC可具有下式，其中在每种情况下，D为PROTAC部分：
先参照PROTAC的PB基团，在具体的实施方案中，PB如在本申请其他部分所述，或选自热休克蛋白90(HSP90)抑制剂、激酶和磷酸酶抑制剂、MDM2抑制剂、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂、免疫抑制化合物以及靶标以下的化合物：人BET布罗莫结构域蛋白、芳基烃受体(AHR)、REF受体激酶、FKBP、雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、甲状腺激素受体、HIV蛋白酶、HIV整合酶、HCV蛋白酶、酰基蛋白硫酯酶-1和-2(APT1和APT2)。
在具体的实施方案中，E3LB如在本申请其他部分所述，包括结合以下的基团：XIAP、VHL、Cereblon和MDM2。
本文所述的主题还涉及由L1-PROTAC化合物制备PAC的方法，该方法包括使抗体或其变体、突变体、剪接变体、插入缺失体和融合体与L1-PROTAC在以下条件下接触：其中抗体与L1-PROTAC上的任何可用连接点共价结合，由此制备PAC。本文所述的主题还涉及由共价结合至L1的Ab-L1部分制备PAC的方法，所述Ab-L1部分即抗体或其变体、突变体、剪接变体、插入缺失体和融合体，共价连接至L1，所述方法包括在PROTAC与Ab-L1上的任何可用连接点共价结合的条件下，接触具有Ab-L1的PROTAC，由此制备PAC。该方法可以进一步包括PAC的常规分离和纯化。
现参考如本文所述的PAC和L1-PROTAC化合物，它们可以以固体或液体形式存在。在固态下，其可以以结晶或非结晶形式存在，或以其混合物存在。本领域技术人员将理解，可以形成药用溶剂化物以用于结晶或非结晶化合物。在结晶溶剂化物中，溶剂分子在结晶过程中结合到晶格中。溶剂化物可以包括非水溶剂，例如但不限于乙醇、异丙醇、DMSO、乙酸、乙醇胺或乙酸乙酯，或者它们可以包括水作为掺入晶格中的溶剂。其中水是结合到晶格中的溶剂的溶剂化物通常被称为“水合物”。水合物包括化学计量的水合物以及含有可变量水的组合物。本文描述的主题包括所有这些溶剂化物。
本领域技术人员将进一步理解，本文所述的以结晶形式存在的某些化合物和PAC，包括其各种溶剂化物，可以表现出多晶型(即在不同晶体结构中发生的能力)。这些不同的结晶形式通常称为“多晶型物”。本文公开的主题包括所有这些多晶型物。多晶型物具有相同的化学组成，但在填料、几何排列和结晶固态的其他描述性质方面不同。因此，多晶型物可具有不同的物理性质，例如形状、密度、硬度、可变形性、稳定性和溶解性质。多晶型物通常表现出不同的熔点、IR光谱和X射线粉末衍射图案，其可用于鉴定。本领域技术人员将理解，可以例如通过改变或调节用于制备化合物的反应条件或试剂来产生不同的多晶型物。例如，温度、压力或溶剂的变化可能导致多晶型物。另外，一种多晶型物可在某些条件下自发地转化为另一种多晶型物。
本文所述的化合物和PAC或其盐可以立体异构形式存在(例如它含有一个或多个不对称碳原子)。单独的立体异构体(对映异构体和非对映异构体)及其混合物包括在本文公开的主题的范围内。同样地，应理解式(I)的化合物或盐可以以不同于式中所示的互变异构形式存在并且这些也包括在本文公开的主题的范围内。应理解，本文公开的主题包括本文描述的特定基团的所有组合和子集。本文公开的主题的范围包括立体异构体的混合物以及纯化的对映异构体或对映异构/非对映异构富集的混合物。应理解，本文公开的主题包括上文定义的特定基团的所有组合和子集。
本文公开的主题还包括本文所述化合物的同位素标记形式，但是由于原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子取代一个或多个原子的事实。可掺入本文所述化合物中的同位素及其药用盐的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如2H、3H、11C、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl、123I和125I。
本文公开的化合物和PAC及其药用盐含有上述同位素和/或其他原子的其他同位素，这些都在本文公开的主题的范围内。本文公开了同位素标记的化合物，例如掺入放射性同位素如3H、14C的那些化合物可用于药物和/或底物组织分布测定。氚即3H和碳-14即14C同位素由于易于制备和检测而通常使用。11C和18F同位素可用于PET(正电子发射断层扫描)且125I同位素可用于SPECT(单光子发射计算机断层扫描)，所有这些都可用于脑成像。此外，用较重的同位素例如氘(即2H)取代可以提供某些治疗优势，这是由于更高的代谢稳定性，例如体内半衰期延长或剂量需求减少且因此在某些情况下可能是优选的。同位素标记的式I化合物通常可以通过用易于获得的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂，通过进行以下方案和/或实施例中公开的方法来制备。
本申请所述的主题包括以下实施方案：
1.一种缀合物，其具有以下化学结构：
Ab―(L1―D)p
其中
D为具有结构E3LB―L2―PB的PROTAC；
E3LB为E3连接酶结合基团，其共价结合至L2；
L2为接头，其共价结合至E3LB和PB；
PB为蛋白结合基团，其共价结合至L2；
Ab为抗体，其共价结合至L1；
L1为接头，其共价结合至Ab和D；
p具有约1至约8的值。
2.实施方案1的缀合物，其中E3LB为结合E3连接酶的基团，其中所述E3连接酶列于表13-27中，例如表13、表14、表15、表16、表17、表18、表19、表20、表21、表22、表23、表24、表25、表26或表27。
3.以上任一实施方案的缀合物，其中E3LB为结合E3连接酶的基团，其中所述E3连接酶选自von Hippel-Lindau(VHL)、Cereblon、XIAP、E3A、MDM2、后期促进复合物(APC)、UBR5(EDD1)、SOCS/BC-box/eloBC/CUL5/RING、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、WWP2、Parkin、A20/TNFAIP3、AMFR/gp78、ARA54、β-TrCP1/BTRC、BRCA1、CBL、CHIP/STUB1、E6、E6AP/UBE3A、F-box蛋白15/FBXO15、FBXW7/Cdc4、GRAIL/RNF128、HOIP/RNF31、cIAP-1/HIAP-2、cIAP-2/HIAP-1、cIAP(pan)、ITCH/AIP4、KAP1、MARCH8、MDM2/HDM2、Mind Bomb 1/MIB1、Mind Bomb 2/MIB2、MuRF1/TRIM63、NDFIP1、NEDD4、NleL、Parkin、RNF2、RNF4、RNF8、RNF168、RNF43、SART1、Skp2、SMURF2、TRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、TRAF-4、TRAF-5、TRAF-6、TRIM5、TRIM21、TRIM32、UBR5和ZNRF3。
4.以上任一实施方案的缀合物，其中E3LB为结合选自XIAP、VHL、Cereblon和MDM2的E3连接酶的基团。
5.以上任一实施方案的缀合物，其中E3LB选自结合VHL的化合物、结合VHL的羟脯氨酸化合物、结合MDM2的化合物、结合Cereblon的化合物、四氢-苯并二氮杂酮、Nutlin和本申请所述的小分子结合化合物。
6.以上任一实施方案的缀合物，其中E3LB为XIAP抑制剂，其为具有下式的四氢-苯并二氮杂酮：
其中R1、R2、R3、R4和R5如在WO/2015/071393中所述且包括其中所有化合物。
7.以上任一实施方案的缀合物，其中PB为结合以下的基团：FoxOl、HDAC、DP-1、E2F、ABL、AMPK、BRK、BRSK I、BRSK2、BTK、CAMKK1、CAMKKα、CAMKKβ、Rb、Suv39HI、SCF、p19INK4D、GSK-3、pi 8INK4、myc、细胞周期蛋白E、CDK2、CDK9、CDG4/6、环化素D、pl6INK4A、cdc25A、BMI1、SCF、Akt、CHKl/2、C 1δ、CK1γ、C 2、CLK2、CSK、DDR2、DYRK1A/2/3、EF2K、EPH-A2/A4/B1/B2/B3/B4、EIF2A 3、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、p53、p21Cipl、PAX、Fyn、CAS、C3G、SOS、Tal、Raptor、RACK-1、CRK、Rapl、Rac、KRas、NRas、HRas、GRB2、FAK、PI3K、spred、Spry、mTOR、MPK、LKBl、PAK 1/2/4/5/6、PDGFRA、PYK2、Src、SRPK1、PLC、PKC、PKA、PKBα/β、PKCα/γ/δ、PKD、PLKl、PRAK、PRK2、RIPK2、WAVE-2、TSC2、DAPKl、BAD、IMP、C-TAK1、TAKl、TAOl、TBK1、TESK1、TGFBR1、TIE2、TLK1、TrkA、TSSK1、TTBK1/2、TTK、Tpl2/cotl、MEK1、MEK2、PLDLErkl、Erk2、Erk5、Erk8、p90RSK、PEA-15、SRF、p27KIP1、TIF la、HMGN1、ER81、MKP-3、c-Fos、FGF-R1、GCK、GSK3β、HER4、HIPK1/2/3/、IGF-1R、cdc25、UBF、LAMTOR2、Statl、StaO、CREB、JAK、Src、PTEN、NF-κB、HECTH9、Bax、HSP70、HSP90、Apaf-1、Cyto c、BCL-2、Bcl-xL、Smac、XIAP、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、CDC37、TAB、IKK、TRADD、TRAF2、R1P1、FLIP、TAKl、JNKl/2/3、Lck、A-Raf、B-Raf、C-Raf、MOS、MLKl/3、MN l/2、MSKl、MST2/3/4、MPSK1、MEKKl、ME K4、MEL、ASK1、MINK1、MKK 1/2/3/4/6/7、NE 2a/6/7、NUAK1、OSR1、SAP、STK33、Syk、Lyn、PDK1、PHK、PIM 1/2/3、Ataxin-1、mTORCl、MDM2、p21Wafl、细胞周期蛋白Dl、Lamln A、Tpl2、Myc、连环蛋白、Wnt、IKK-β、IKK-γ、IKK-α、IKK-ε、ELK、p65RelA、IRAKI、IRA 2、IRAK4、IRR、FADD、TRAF6、TRAF3、MKK3、MKK6、ROCK2、RSK1/2、SGK 1、SmMLCK、SIK2/3、ULK1/2、VEGFR1、WNK l、YES1、ZAP70、MAP4K3、MAP4K5、MAPKlb、MAPKAP-K2K3、p38α/β/δ/γMAPK、Aurora A、Aurora B、Aurora C、MCAK、Clip、MAPKAPK、FAK、MARK 1/2/3/4、Mucl、SHC、CXCR4、Gap-1、Myc、β-连环蛋白/TCF、Cbl、BRM、Mcl1、BRD2、BRD3、BRD4、AR、RAS、ErbB3、EGFR、IRE1、HPK1、RIPK2和Era，包括其所有变体、突变体、剪接变体、插入缺失体和融合体。
8.以上任一实施方案的缀合物，其中PB选自热休克蛋白90(HSP90)抑制剂、激酶和磷酸酶抑制剂、MDM2抑制剂、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂、免疫抑制化合物以及靶标以下的化合物：人BET布罗莫结构域蛋白、芳基烃受体(AHR)、REF受体激酶、FKBP、雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、甲状腺激素受体、HIV蛋白酶、HIV整合酶、HCV蛋白酶和酰基蛋白硫酯酶-1和-2(APT1和APT2)。
9.以上任一实施方案的缀合物，其中PB为靶标雌激素受体α(ERα)的化合物。
10.以上任一实施方案的缀合物，其中所述Ab选自表4-12，例如表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12。
11.以上任一实施方案的缀合物，其中所述Ab为半胱氨酸工程化抗体或其变体。
12.以上任一实施方案的缀合物，其中Ab结合选自以下的一种或多种多肽：DLL3；EDAR；CLL1；BMPR1B；E16；STEAP1；0772P；MPF；NaPi2b；Sema 5b；PSCA hlg；ETBR；MSG783；STEAP2；TrpM4；CRIPTO；CD21；CD79b；FcRH2；B7-H4；HER2；NCA；MDP；IL20Rα；Brevican；EphB2R；ASLG659；PSCA；GEDA；BAFF-R；CD22；CD79a；CXCR5；HLA-DOB；P2X5；CD72；LY64；FcRH1；IRTA2；TENB2；PMEL17；TMEFF1；GDNF-Ra1；Ly6E；TMEM46；Ly6G6D；LGR5；RET；LY6K；GPR19；GPR54；ASPHD1；酪氨酸酶；TMEM118；GPR172A；MUC16；和CD33。
13.以上任一实施方案的缀合物，其中Ab结合选自以下的一种或多种多肽：CLL1、STEAP1、NaPi2b、STEAP2、TrpM4、CRIPTO、CD21、CD79b、FcRH2、B7-H4、HER2、CD22、CD79a、CD72、LY64、Ly6E、MUC16和CD33。
14.以上任一实施方案的缀合物，其中Ab为结合选自B7-H4、Her2、CLL1、CD33、CD22和NaPi2b的一种或多种多肽的抗体。
15.以上任一实施方案的缀合物，其中所述抗体结合HER2或B7-H4。
16.以上任一实施方案的缀合物，其中所述抗体结合Her2。
17.以上任一实施方案的缀合物，其中L1为肽模拟接头。
18.以上任一实施方案的缀合物，其中L1为由下式表示的肽模拟接头：
—Str—(PM)—Sp—
其中
Str为延伸单元，其共价结合至Ab；
Sp为键或间隔单元，其共价结合至PROTAC部分；
PM为选自以下的非肽化学部分：
W为-NH-杂环烷基-或杂环烷基；
Y为杂芳基、芳基、-C(O)C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基-NH2、C1-C6亚烷基-NH-CH3、C1-C6亚烷基-N-(CH3)2、C1-C6烯基或C1-C6烷基烯基；
每个R1独立为C1-C10烷基、C1-C10烯基、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立为H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基或杂芳基烷基，或R3和R2可一起形成C3-C7环烷基；且
R4和R5各自独立为C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(C1-C10烷基)OCH2-，或R4和R5可一起形成C3-C7环烷基环。
19.以上任一实施方案的缀合物，其中Y为杂芳基；R4和R5一起形成环丁基环。
20.以上任一实施方案的缀合物，其中Y为选自以下的部分：
21.以上任一实施方案的缀合物，其中
Str为由下式表示的化学部分：
其中R6选自C1-C10亚烷基、C1-C10烯基、C3-C8环烷基、(C1-C8亚烷基)O-和C1-C10亚烷基-C(O)N(Ra)-C2-C6亚烷基，其中每个亚烷基可被一至五个选自以下的取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺、亚砜、羟基、烷氧基、酯、羧酸、烷基硫基、C3-C8环烷基、C4-C7杂环烷基、杂芳基烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂芳基，每个Ra独立为H或C1-C6烷基；
Sp为-C1-C6亚烷基-C(O)NH-或—Ar—Rb—，其中Ar为芳基或杂芳基且Rb为(C1-C10亚烷基)O-。
22.以上任一实施方案的缀合物，其中Str具有下式：
其中R7选自C1-C10亚烷基、C1-C10烯基、(C1-C10亚烷基)O-、N(Rc)-(C2-C6亚烷基)-N(Rc)和N(Rc)-(C2-C6亚烷基)；其中每个Rc独立为H或C1-C6烷基；
Sp为-C1-C6亚烷基-C(O)NH-或—Ar—Rb—，其中Ar为芳基或杂芳基，Rb为(C1-C10亚烷基)O-。
23.以上任一实施方案的缀合物，其中L1具有下式：
R1为C1-C6烷基、C1-C6烯基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立为H、C1-C10烷基；且Str和Sp如本申请定义。
24.以上任一实施方案的缀合物，其中L1具有下式：
R1为C1-C6烷基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；Str和Sp如本申请定义；且
R4和R5一起形成C3-C7环烷基环。
25.以上任一实施方案的缀合物，其中L1具有下式：
Str和Sp如本申请定义；且
R1为C1-C6烷基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2。
26.以上任一实施方案的缀合物，其具有下式：
其中
Str为由下式表示的化学部分：
R6选自C1-C10亚烷基和C1-C10亚烷基-C(O)N(Ra)-C2-C6亚烷基，其中每个亚烷基可被一至五个选自以下的取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺、亚砜、羟基、烷氧基、酯、羧酸、烷基硫基、C3-C8环烷基、C4-C7杂环烷基、杂芳基烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂芳基，每个Ra独立为H或C1-C6烷基；
Ab和Sp如本申请定义；且
p为1、2、3或4。
27.以上任一实施方案的缀合物，其具有下式：
其中
Str为由下式表示的化学部分：
R6选自C1-C10亚烷基和C1-C10亚烷基-C(O)N(Ra)-C2-C6亚烷基，其中每个亚烷基可被一至五个选自以下的取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺、亚砜、羟基、烷氧基、酯、羧酸、烷基硫基、C3-C8环烷基、C4-C7杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂芳基，每个Ra独立为H或C1-C6烷基；
R1、R4、R5、Ab、D和Sp如本申请定义；且
p为1、2、3或4。
28.以上任一实施方案的缀合物，其中Y为杂芳基、芳基或烯基；R6为C1-C10亚烷基。
29.以上任一实施方案的缀合物，其中Y为：
30.以上任一实施方案的缀合物，其中Y为：
31.以上任一实施方案的缀合物，其中Y为：
32.以上任一实施方案的缀合物，其中
Str为由下式表示的化学部分：
R6为C1-C6亚烷基；
Sp为-C1-C6亚烷基-C(O)NH-或—Ar—Rb—，其中Ar为芳基，Rb为(C1-C3亚烷基)O-。
33.以上任一实施方案的缀合物，其具有下式：
其中
Ab、D、R2和R3如本申请定义；
R1为C1-C6烷基-NH2、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；且
p为1、2、3或4。
34.以上任一实施方案的缀合物，其具有下式：
其中
Ab和D如本申请定义；
p为1、2、3或4；
R1为C1-C6烷基-NH2、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；
R4和R5各自独立为C1-C6烷基，其中所述烷基为未取代的，或R4和R5与它们各自所连接的碳一起形成C3-C7环烷基环诸如环丁基。
35.以上任一实施方案的缀合物，其中L1具有下式：
其中R1和R2独立选自H和C1-C6烷基，或R1和R2形成3、4、5或6元环烷基或杂环基。
36.以上任一实施方案的缀合物，其选自PAC1、PAC2、PAC3、PAC4和PAC5。
37.以上任一实施方案的缀合物，其中PROTAC/每个抗体的比例(“PAR”)为约1.5至约3。
38.以上任一实施方案的缀合物，其中PROTAC/每个抗体的比例(“PAR”)为约2。
39.治疗有此需要的人的疾病的方法，其包括向所述人给予有效量的以上任一实施方案的缀合物。
40.一种药物组合物，其包含以上任一实施方案的缀合物和药用赋形剂。
41.治疗有此需要的人的疾病的方法，其包括向所述人给予有效量的实施方案40的药物组合物。
42.用以上任一实施方案的缀合物治疗疾病的方法，其中所述疾病为过度增殖性疾病，包括良性或恶性实体瘤和血液疾病，涉及神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮、间质、囊胚、炎症、血管生成、免疫的疾病和自身免疫疾病。
43.用以上任一实施方案的缀合物治疗疾病的方法，其中所述疾病为癌症。
44.用以上任一实施方案的缀合物治疗疾病的方法，其中所述癌症选自癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌症包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
45.实施方案43的方法，其中所述癌症为HER2阳性癌症。
46.实施方案45的方法，其中所述HER2阳性癌症为乳癌或胃癌。
47.用以上任一实施方案的缀合物治疗疾病的方法，其中所述疾病为自身免疫疾病。
48.实施方案47的方法，其中所述自身免疫疾病选自风湿病(例如类风湿性关节炎、舍格伦综合征、硬皮病、狼疮诸如系统性红斑狼疮(SLE)和狼疮性肾炎、多发性肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和银屑病关节炎)、骨关节炎、自身免疫性胃肠道和肝脏疾病(诸如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻)、血管炎(诸如ANCA相关性血管炎，包括Churg-Strauss血管炎、韦格纳肉芽肿病)、自身免疫性神经系统疾病(诸如多发性硬化、眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森病、阿尔茨海默病和自身免疫性多发性神经病)、肾脏疾病(诸如肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征和贝格尔疾病)、自身免疫性皮肤病(诸如牛皮癣、荨麻疹、荨麻疹、寻常性天疱疮、大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)、血液系统疾病(诸如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血贫血症)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力疾病(诸如内耳疾病和听力丧失)、贝切特病、雷诺综合征、器官移植和自身免疫性内分泌失调(诸如糖尿病相关自身免疫疾病诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、艾迪生病和自身免疫性甲状腺疾病(例如格雷夫斯病和甲状腺炎))。
49.实施方案47的方法，其中所述自身免疫疾病选自：类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、舍格伦综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球肾炎。
50.以上任一实施方案的缀合物在制备用于治疗哺乳动物癌症的药物中的用途。
51.制备PAC的方法，所述方法包括使接头L1-PROTAC与抗体接触。
IV.合成途径
本文所述的PAC和化合物可以通过合成路线合成，所述合成路线包括与化学领域中公知的那些类似的方法，特别是根据本文所包含的描述以及其中在以下描述的其他杂环的方法：Comprehensive Heterocyclic Chemistry II,Editors Katritzky and Rees,Elsevier,1997,e.g.Volume 3；Liebigs Annalen der Chemie,(9):1910-16,(1985)；Helvetica Chimica Acta,41:1052-60,(1958)；Arzneimittel-Forschung,40(12):1328-31,(1990)。起始物质通常购自商业来源诸如Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)或使用本领域技术人员熟知的方法容易地制备(例如通过通常描述于以下中所述的方法制备：LouisF.Fieser and Mary Fieser,Reagents for Organic Synthesis,v.1-23,Wiley,N.Y.(1967-2006ed.),或Beilsteins Handbuch der organischen Chemie,4,Aufl.ed.Springer-Verlag,Berlin,包括附录(也可经Beilstein网上数据库获得)。
用于合成本文所述的PAC和基团的合成化学转化和保护基团方法(保护和脱保护)以及必需的试剂和中间体是本领域已知的并且包括例如描述于以下中的那些：R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene andP.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Ed.,John Wiley and Sons(1999)；和L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,JohnWiley and Sons(1995)及其随后版本。在制备PAC和化合物时，可能需要保护中间体的远程官能团(例如伯胺或仲胺)。对这种保护的需求将根据远程官能团的性质和制备方法的条件而变化。合适的氨基保护基包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(CBz或CBZ)和9-芴基亚甲氧基羰基(Fmoc)。本领域技术人员容易确定对这种保护的需要。有关保护组及其用途的一般说明，参见T.W.Greene,Protective Groups in OrganicSynthesis,John Wiley&Sons,New York,1991。
一般操作和实施例提供了制备本文所述的PAC和化合物的示例性方法。本领域技术人员将理解，可以使用其他合成途径来合成PAC和化合物。尽管在方案、一般操作和实施例中描述和讨论了特定的起始原料和试剂，但是可以容易地替换其他原料和试剂以提供各种衍生物和/或反应条件。此外，根据本公开内容，使用本领域技术人员熟知的常规化学方法，可以进一步修饰通过所述方法制备的许多示例性化合物。
通常，可以通过根据WO 2013/055987、WO 2015/023355、WO 2010/009124、WO2015/095227的操作将PROTAC与L1接头试剂连接来制备PAC并将其与本文所述的任何抗体或变体、突变体、剪接变体、插入缺失体和融合体包括半胱氨酸工程化抗体缀合。或者，可通过首先将抗体或变体、突变体、剪接变体、插入缺失体和融合体包括本文所述的半胱氨酸工程化抗体与L1接头试剂连接并将其与任何PROTAC缀合来制备PAC。
以下合成途径描述了制备PAC及其组分的示例性方法。用于制备PAC及其组分的其他合成途径在本文其他地方公开。
1.接头L1
关于接头L1，方案1-4描述了示例性接头L1的合成途径，其用于二硫化物与抗体Ab的连接。Ab通过二硫键连接到L1且PROTAC通过PROTAC上的任何可用连接物连接到L1。
方案1
参考方案1，在室温使1,2-二(吡啶-2-基)二硫烷和2-巯基乙醇在吡啶和甲醇中反应，得到2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙醇。用三乙胺和乙腈中的氯甲酸4-硝基苯酯酰化得到一缩二碳酸4-硝基苯酯·2-(吡啶-2-基二硫基)乙酯9。
方案2
参考方案2，向1,2-二(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷10(1.0g,3.22mmol)在无水DMF/MeOH(25mL/25mL)中的混合物中加入HOAc(0.1mL)，随后加入2-氨基乙硫醇盐酸盐11(183mg,1.61mmol)。在将反应混合物在室温搅拌过夜后，将其真空浓缩除去溶剂并将残留物用DCM(30mL×4)洗涤得到2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)乙胺盐酸盐12，其为淡黄色固体(300mg,69.6％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.28(d,J＝2.4Hz,1H),8.56(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.24(s,4H),8.03(d,J＝8.8Hz,1H),3.15-3.13(m,2H),3.08-3.06(m,2H)。
方案3
参考方案3，将1,2-二(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷10(9.6g,30.97mmol)和2-巯基乙醇(1.21g,15.49mmol)在无水DCM/CH3OH(250mL/250mL)中的溶液在室温在氮气下搅拌24h。在将混合物真空浓缩后，将残留物用DCM(300mL)稀释。加入MnO2(10g)并将混合物在在室温搅拌另外的0.5h。将混合物在硅胶柱色谱上纯化(DCM/MeOH＝100/1至100/1)得到2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)乙醇13(2.2g,61.1％)，其为棕色油状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.33(d,J＝2.8Hz,1H),8.38-8.35(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),7.67(d,J＝9.2Hz,1H),4.10(t,J＝7.2Hz,1H),3.81-3.76(q,2H),3.01(t,J＝5.2Hz,2H)。
向13(500mg,2.15mmol)在无水DMF(10mL)中的溶液中加入DIEA(834mg,6.45mmol)，随后加入PNP碳酸酯(一缩二碳酸二(4-硝基苯基)酯,1.31g,4.31mmol)。将反应溶液在室温搅拌4h并将混合物经制备性-HPLC(FA)纯化得到一缩二碳酸4-硝基苯酯·2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)乙酯14(270mg,33.1％)，其为浅棕色油状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.30(d,J＝2.4Hz,1H),8.43-8.40(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.30-8.28(m,2H),7.87(d,J＝8.8Hz,1H),7.39-7.37(m,2H),4.56(t,J＝6.4Hz,2H),3.21(t,J＝6.4Hz,2H)。
方案4
参考方案4，在0℃(冰/丙酮)在氩气气氛下将磺酰氯(2.35mL 1.0M DCM溶液,2.35mmol)逐滴加入至搅拌的5-硝基吡啶-2-硫醇(334mg,2.14mmol)在无水DCM(7.5mL)中的混悬液中。反应混合物由黄色混悬液变为黄色溶液并温热至室温，然后搅拌2小时，之后将溶剂真空蒸发除去得到黄色固体。将固体重新溶解于DCM(15mL)并在0℃在氩气气氛下逐滴用(R)-2-巯基丙-1-醇(213mg,2.31mmol)在无水DCM(7.5mL)中的溶液处理。将反应混合物温热至室温并搅拌20小时，此时LC/MS分析显示在保留时间1.41分钟基本上产物形成(ES+)m/z 247([M+H]+.,～100％相对强度)。将析出物经滤过除去并真空蒸发滤液得到橙色固体，将其用H2O(20mL)处理并用氢氧化铵溶液碱化。将混合物用DCM(3×25mL)萃取并将合并的萃取物用H2O(20mL)、盐水(20mL)洗涤，干燥(MgSO4)，滤过并真空蒸发得到粗产物。经快速色谱纯化(梯度洗脱:1％增量:100％DCM至98:2v/v DCM/MeOH)得到(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙-1-醇15，其为油状物(111mg,21％收率)。
在20℃向三光气,Cl3COCOOCCl3,Sigma Aldrich,CAS Reg.No.32315-10-9(241mg,0.812mmol)在DCM(10mL)中的溶液中逐滴加入(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙-1-醇15(500mg,2.03mmol)和吡啶(153mg,1.93mmol)在DCM(10mL)中的溶液。在将反应混合物在20℃搅拌30min后，将其浓缩且氯甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯16无需进一步纯化可直接用于经氯甲酸酯基团共价连接PROTAC上任何可用基团。
2.半胱氨酸工程化抗体
关于通过还原和再氧化进行缀合的半胱氨酸工程化抗体，它们通常可以如下制备。根据Kabat(Kabat等人,Sequences of proteins of immunological interest,(1991)第5版,USDept of Health and Human Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD)对轻链氨基酸进行编号。根据EU编号系统(Edelman等人(1969)Proc.Natl.Acad.of Sci.63(1):78-85)对重链氨基酸进行编号，除了当指明为Kabat系统时。使用单字母氨基酸缩写。
在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸工程化单克隆抗体(THIOMABTM)由于细胞培养条件而携带有半胱氨酸加合物(胱氨酸)或在所工程化的半胱氨酸上被谷胱甘肽化。因此，由CHO细胞纯化的THIOMABTM不能与Cys-反应性接头L1-PROTAC中间体缀合。可如下使半胱氨酸工程化抗体具有反应性以与本申请所述的接头-PROTAC中间体缀合：用还原剂例如DTT(Cleland’s试剂即二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐；Getz等人(1999)Anal.Biochem.Vol 273:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)处理，然后用温和的氧化剂例如脱氢抗坏血酸再次形成链间二硫化物键(再次氧化)。在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸工程化单克隆抗体(THIOMABTM)(Gomez等人(2010)Biotechnology and Bioeng.105(4):748-760；Gomez等人(2010)Biotechnol.Prog.26:1438-1445)例如用约50倍过量的DTT在具有2mM EDTA的50mM Tris(pH 8.0)中在室温还原过夜，这除去了Cys和谷胱甘肽加合物且还原了抗体中的链间二硫化物键。加合物的除去通过反相LCMS使用PLRP-S柱来监测。将经还原的THIOMABTM稀释且通过加到至少4倍体积的10mM琥珀酸钠pH 5缓冲液中来酸化。
可选择地，将抗体稀释且如下酸化：加到至少4倍体积的10mM琥珀酸盐(pH 5)中且与10％乙酸一起研磨直到pH为约5。然后将经pH降低和稀释的THIOMABTM加载到HiTrap S阳离子交换柱上，用几倍柱体积的10mM乙酸钠(pH 5)洗涤且用具有150mM氯化钠的50mM Tris(pH 8.0)洗脱。通过进行再次氧化而在存在于母体Mab中的半胱氨酸残基之间再次形成二硫化物键。上述所洗脱的经还原的THIOMABTM用15×脱氢抗坏血酸(DHAA)处理约3小时或可选择地用200nM-2mM硫酸铜(CuSO4)水溶液在室温处理过夜。可使用本领域已知的其它氧化剂和氧化条件。环境空气氧化也可以是有效的。该温和的部分的再次氧化步骤可有效和高保真地形成链内二硫化物。再次氧化通过反相LCMS使用PLRP-S柱来监测。经再次氧化的THIOMABTM用上述琥珀酸盐缓冲液稀释以达到pH约5且如上所述用S柱进行纯化，除了用具有300mM氯化钠的10mM琥珀酸盐(pH 5)(缓冲液B)在10mM琥珀酸盐(pH 5)(缓冲液A)中的梯度进行洗脱。向所洗脱的THIOMABTM中加入EDTA至最终浓度为2mM且按需浓缩以达到大于5mg/mL的最终浓度。将所得到的准备用于缀合的THIOMABTM以等分液形式贮存在-20℃。用6200系列TOF或QTOF Agilent LC/MS进行液相色谱/质谱分析。用加热至80℃的PRLP-1000A微孔柱(50mm×2.1mm,Polymer Laboratories,Shropshire,UK)对样品进行色谱。使用30-40％B(溶剂A:0.05％TFA/水,溶剂B:0.04％TFA/乙腈)的线性梯度且洗脱液使用电喷雾源来直接离子化。收集数据且通过MassHunter软件来进行解卷积。进行LC/MS分析前，抗体或药物缀合物(50微克)在37℃用PNGase F(2单位/ml；PROzyme,San Leandro,CA)处理2小时以除去经N连接的碳水化合物。
可选择地，抗体或药物缀合物在37℃用LysC(0.25μg/50μg(微克)抗体或缀合物)部分消化15分钟，得到Fab和Fc片段以进行LCMS分析。对经解卷积的LCMS谱中的峰进行归属和量化。PROTAC与抗体比例(DAR)如下计算：对与缀合有PROTAC的抗体相应的一个或多个峰的强度相对于所观察到的所有峰的比例进行计算。
3.接头L1-PROTAC基团与抗体的缀合
在接头L1-PROTAC化合物与抗体的缀合的一个方法中，在上述还原和再次氧化操作后，半胱氨酸工程化抗体(THIOMABTM)在10mM琥珀酸盐(pH 5)、150mM NaCl、2mM EDTA中的溶液用1M Tris进行pH调节至pH 7.5-8.5。将过量的即约3-20摩尔当量的具有硫醇反应性基团(例如马来酰亚胺或4-硝基吡啶基二硫化物)的接头-PROTAC中间体溶解在DMF或DMA中且加到经还原、再次氧化和pH调节的抗体中。将反应混合物在室温或37℃孵育且进行检测直到完成(1至约24小时)，其通过对反应混合物进行LC-MS分析来确定。当反应完成时，缀合物通过几种方法中的一种或任何组合来纯化，目的是除去剩余的未反应的接头-PROTAC中间体和聚集的蛋白质(若以显著的水平存在)。例如，缀合物可用10mM组氨酸-乙酸盐(pH5.5)稀释直到最终pH为约5.5且通过S阳离子交换色谱使用与Akta纯化系统(GEHealthcare)连接的HiTrap S柱或S maxi旋转柱(Pierce)来纯化。可选择地，缀合物可通过凝胶过滤色谱使用与Akta纯化系统连接的S200柱或Zeba旋转柱来纯化。可选择地，可进行透析。使用凝胶过滤或透析将THIOMABTM抗体PROTAC缀合物配制到具有240mM蔗糖的20mMHis/乙酸盐(pH 5)中。经纯化的缀合物通过离心超滤来浓缩且在无菌条件下过滤通过0.2μm过滤器且冷冻贮存。PAC如下表征：进行BCA测定用于确定蛋白质浓度，进行分析型SEC(尺寸排阻色谱)用于聚集分析且在用Lysine C内肽酶(LysC)处理后进行LC-MS用于计算PAR。
使用Shodex KW802.5柱在具有0.25mM氯化钾和15％IPA的0.2M磷酸钾(pH 6.2)中以0.75ml/min的流速对缀合物进行尺寸排阻色谱。缀合物的聚集状态通过对280nm处的洗脱峰面积吸光度进行积分来确定。
可使用Agilent QTOF 6520ESI仪器对PAC进行LC-MS分析。例如，PAR用1:500w/w内蛋白酶Lys C(Promega)在Tris(pH 7.5)中在37℃处理30min。将所得到的裂解片段加载到加热至80℃的(Angstrom),8μm(微米)PLRP-S(高度交联的聚苯乙烯)柱上且用历时5分钟30％B至40％B的梯度洗脱。流动相A为具有0.05％TFA的H2O且流动相B为具有0.04％TFA的乙腈。流速为0.5ml/min。蛋白质洗脱通过280nm处的UV吸光度检测来监测，然后进行电喷雾离子化和MS分析。通常对未缀合的Fc片段、残余的未缀合的Fab和经药物化的Fab进行色谱分辨。使用Mass HunterTM软件(Agilent Technologies)对所得到的m/z谱进行解卷积以计算抗体片段的质量。
V.制剂
本申请所述的治疗性PROTAC-抗体-缀合物(PAC)的药物制剂通常与药用胃肠外载体一起制备成单位剂量注射用形式用于胃肠外给药即推注、静脉内、肿瘤内注射。具有所需纯度的PAC任选与药用稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合成冻干制剂或水溶液形式(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980),第16版,Osol,A.Ed.)。
PAC可以根据标准药学实践配制成药物组合物。根据该方面，提供了一种药物组合物，其包含PAC和一种或多种药用赋形剂。
典型的制剂通过使PAC与赋形剂诸如载体和/或稀释剂混合来制备。适宜的载体、稀释剂和其他赋形剂是本领域技术人员公知的并包括物质诸如碳水化合物、蜡、水可溶解的和/或可溶胀的聚合物、亲水性或疏水性物质、明胶、油、溶剂、水等。所用的具体载体、稀释剂或其他赋形剂取决于PAC将适用的方式和目的。溶剂通常基于本领域技术人员认为对给予哺乳动物安全的溶剂(GRAS)来选择。
通常，安全溶剂为无毒含水溶剂诸如水和在水中可溶或可混溶的其它无毒溶剂。合适的含水溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如PEG 400、PEG 300)等及它们的混合物。可接受的稀释剂、载体、赋形剂和增溶剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐，和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
所述制剂还可包含一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、增甜剂、芳香剂、矫味剂和其它已知的添加剂以提供PAC的优美外观或有助于药品的制造。所述制剂可用常规溶解和混合操作步骤来制备。
制剂可通过以下方法来进行：在适当的pH，在环境温度并以期望的纯度与生理学可接受的载体(即在所用剂量和浓度下对受者无毒的载体)混合。制剂的pH主要取决于化合物的具体用途和浓度，但可为约3至约8。在pH5的乙酸盐缓冲液中的制剂为适当的实施方案。
PAC制剂优选地是无菌的。具体地，要用于体内给药的制剂必须是无菌的。此种灭菌易于通过经无菌滤膜的过滤来实现。
PAC通常可作为固体组合物、冻干制剂或作为水溶液来储存。
包含PAC的药物组合物将以与良好医学操作规范一致的方式(即量、浓度、时间表、过程、媒介物和给药途径)来配制和给药。该背景中需考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病况、病症的原因、药剂递送部位、给药方法、给药程序安排和医学从业者已知的其它因素。要给予的化合物的“治疗有效量”会受这种考虑约束并且是预防、改善或治疗凝血因子介导的病症必需的最小量。此种量优选地在对主体有毒或致使主体对出血明显地更加敏感的量以下。
PAC可配制成药物剂型以提供容易可控的药物剂量并使患者能够顺应开具的用药方案。供施用的药物组合物(或制剂)可取决于给予药物所用的方法以多种方式来包装。通常，用于分配的物品包括已在其中放置适当形式药物制剂的容器。合适的容器是本领域技术人员公知的并包括物质诸如瓶(塑料的和玻璃的)、小药囊(sachets)、安瓿、塑料袋、金属圆筒(cylinders)等。所述容器还可包括防干扰装置(tamper-proof assemblage)以防止欠慎重地获取包装的内容物。此外，所述容器已在其上放置了描述容器内容物的标签。所述标签还可包括适当的警告。
药物组合物可为无菌可注射制剂的形式，诸如无菌可注射的含水或油质混悬液。该混悬液可按照已知的技术使用已在上面提到的那些适宜的分散剂或湿润剂和助悬剂来配制。所述无菌可注射制剂可为无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂诸如1,3-丁二醇中的溶液或混悬液。所述无菌可注射制剂也可制备为冻干粉末。在可接受的媒介物和溶剂之中可使用的是水、林格溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌固定油照例可用作溶剂或混悬介质。为此，可使用任何温和的固定油，其包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸同样可用于可注射制剂的制备。
可与载体材料组合以生产单个剂型的PAC的量会取决于所治疗的主体和具体的给药模式而改变。例如，意欲对人口服给药的定时释放制剂可含有大约1至1000mg与适当且便利的量的载体物质化合的活性物质，所述载体物质可占总体组合物的约5至约95％(重量:重量)。可制备药物组合物为给药提供可容易测量的量。例如，意欲静脉输注的水溶液可每毫升溶液含有约3至500μg所述活性成分，从而使合适容量的输注能以约30mL/小时的速率进行。
适于肠胃外给药的制剂包括含水的和非水的无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与预期受者血液等渗的溶质；及含水的和非水的无菌混悬液，其可包括助悬剂和增稠剂。
所述制剂可包装在单位剂量或多个剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶并可储存在冷冻干燥(冻干)条件下，使用之前仅需加入无菌液体载体，例如水，立即供注射用。临时的注射液和混悬液是从先前所描述的这类无菌粉末、颗粒和片剂制备的。优选的单位剂量制剂是如本文上面所详述含每日剂量或单位每日亚剂量活性成分的那些制剂，或其适当部分的活性成分的那些制剂。
本发明还提供了兽用组合物，其因此包含与兽用载体一起使用的至少一种如上文所定义的活性成分。兽用载体是用于给予所述组合物的物质并可为固体、液体或气态物质，所述物质以其它方式是兽医学领域惰性的或可接受的并且是与所述活性成分相容的。这些兽用组合物可以肠胃外给药、口服给药或以任何其它期望的途径给药。
VI.适应症和治疗方法
预期本发明的PROTAC-抗体缀合物(PAC)可用于治疗各种疾病或病症。示例性病状或过度增殖性病症包括良性或恶性实体肿瘤和血液病症例如白血病和淋巴恶性肿瘤。其他病状或过度增生性病症包括神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮、间质、囊胚腔、炎症性、血管生成和免疫病症(包括自身免疫性病症)。
一般地，待治疗的疾病或病症为过度增殖性疾病诸如癌症。本申请待治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。所述癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌症包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
可使用所述PAC来治疗的自身免疫性疾病包括风湿性障碍(例如类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、狼疮例如全身性红斑狼疮(SLE)和狼疮性肾炎、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和牛皮癣性关节炎)、骨关节炎、自身免疫性胃肠和肝障碍(例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎和腹部疾病)、血管炎(例如包括丘-施血管炎、韦格纳肉芽肿病和多动脉炎在内的ANCA相关血管炎)、自身免疫性神经障碍(例如多发性硬化、眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森病、阿尔茨海默病和自身免疫性多神经病)、肾部障碍(例如肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征和贝尔热隆疾病)、自身免疫性皮肤障碍(例如牛皮癣、荨麻疹、风疹、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)、血液学障碍(例如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力疾病(例如内耳疾病和听力丧失)、贝切特病、雷诺综合征、器官移植和自身免疫性内分泌障碍(例如糖尿病相关自身免疫性疾病例如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、艾迪生病和自身免疫性甲状腺疾病(例如格雷夫斯病和甲状腺炎))。更优选的上述疾病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、斯耶格伦综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球肾炎。
在某些实施方案中，包含抗NaPi2b抗体诸如如上所述的那些的PAC用于治疗实体瘤例如卵巢癌的方法中。
在另一实施方案中，包含抗CD33抗体诸如如上所述的那些的PAC用于治疗血液系统恶性肿瘤诸如非霍奇金淋巴瘤(NHL)、弥漫性大型造血淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病(AML)和骨髓细胞白血病(MCL)且包括B-细胞相关的癌症和增殖性疾病的方法中。参见US 8226945；Li et al(2013)Mol.Cancer.Ther.12(7):1255-1265；Polson et al(2010)Leukemia 24:1566-1573；Polson et al(2011)Expert Opin.Investig.Drugs 20(1):75-85。
在另一实施方案中，包含抗MUC16抗体诸如如上所述的那些的PAC用于治疗卵巢癌、乳癌和胰腺癌的方法中。所述癌症可与MUC16/CA125/O772P多肽的表达或活性相关。参见WO 2007/001851；US 7989595；US 8449883；US 7723485；Chen et al(2007)CancerRes.67(10):4924-4932；Junutula,et al.,(2008)Nature Biotech.,26(8):925-932。
在某些实施方案中，包含抗HER2抗体诸如如上所述的那些的PAC用于治疗癌症例如乳癌或胃癌、更具体地HER2+乳癌或胃癌的方法中，其中所述方法包括向需要所述治疗的患者给予所述PAC。在一个所述实施方案中，所述PAC包含抗HER2抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。
PAC可通过适于待治疗的病症的任何途径来给药。所述ADC通常将胃肠外即输注、皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外给药。
PAC可单独使用或与疗法中的其他药物组合使用。例如PAC可与至少一种额外的治疗及共同给药。上述组合疗法涵盖组合给药(其中两种或更多种治疗剂包含在同一或不同制剂中)和分开给药(其中PAC的给药在给药额外的治疗剂和/或辅助剂前、与给药额外的治疗剂和/或辅助剂同时或在给药额外的治疗剂和/或辅助剂后进行)。PAC还可与放射疗法联用。
PAC(和任何额外的治疗剂)可通过任何合适的方式来给药，包括胃肠外、肺内和鼻内及在需要局部治疗的情况下的病灶内给药。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。给药可通过任何合适的途径来进行，例如通过注射例如静脉内或皮下注射，这部分取决于给药是短期的还是长期的。本申请涉及各种给药方案，包括但不局限于单次或历经多个时间点的多次给药、推注给药和脉冲输注。
PAC适于预防或治疗疾病的剂量(当单独使用或与一种或多种其它额外的治疗剂联用时)将取决于待治疗的疾病的类型、PAC的类型、疾病的严重度和过程、PAC的给药是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对PAC的响应及主治医师的判断。所述PAC适于一次性或历经一系列治疗而给药于患者。约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)PAC可为给药于患者的最初候选剂量，这取决于疾病的类型和严重度，无论是例如通过一次或多次分开给药，还是通过连续输注。一种典型的每日剂量可为约1μg/kg至100mg/kg或更多，这取决于上述因素。就历时几天或更长时间的重复给药(取决于病症)而言，治疗通常可持续到出现对疾病症状的所需抑制。PAC的一种示例性剂量可为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可向患者给药一剂或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)。上述剂量可间歇给药，例如每周或每三周(例如从而使患者接受约两剂至约二十剂或例如约六剂所述抗体)。可先后给药最初较高负荷剂量和一个或多个较低剂量。然而，可使用其它剂量方案。该疗法的过程通过常规技术和测定来容易地监测。
VII.制品
在另一方面，提供了一种制品例如“试剂盒”，其含有可用于治疗上文所描述的疾病和病症的材料。该试剂盒包括含有PAC的容器。该试剂盒包含容器和容器上或与容器相关的标签或包装说明书。术语“包装说明书”用于指习惯上包括在治疗产品商品化包装内的说明书，其含有涉及这些治疗产品使用的有关适应症、用法、用量、给药方法、禁忌症和/或警告的信息。
合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。“小瓶”是适于容纳液体或冻干制剂的容器。在一个实施方案中，小瓶是一次性小瓶，例如带有塞子的20毫升一次性小瓶。容器可由多种物质诸如玻璃或塑料形成。容器可容纳对治疗所述疾病有效的PAC或其制剂并可以具有无菌存取口(sterile access port)(例如容器可为具有可被皮下注射针头刺破的塞子的静脉内注射液袋或小瓶)。
组合物中至少一种活性剂为PAC。标签或药品说明书标明所述组合物用于治疗选择的疾病，诸如癌症。另外，标签或包装说明书可指示待治疗的患者是患有诸如过度增殖性疾病、神经变性、心脏肥大、疼痛、偏头痛或神经损伤疾病或事件的疾病的患者。在一个实施方案中，标签或药品说明书标明包含PAC的组合物可用于治疗由异常细胞生长造成的病症。标签或包装说明书还可标明组合物可用于治疗其它病症。可选择地，或另外地，制品还可包含第二容器，其包含药用缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它还可包含从商业或使用者观点期望的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、注射针头和注射器。
试剂盒可以进一步包括给予PAC的指导，如果存在，还包括第二药物制剂的给药指导。例如，如果试剂盒包含含有PAC和第二药物制剂的第一组合物，则试剂盒可以进一步包括将第一和第二药物组合物同时、顺序或分开给予有需要的患者的说明。
在另一实施方案中，试剂盒适于递送固体口服形式的PAC，诸如片剂或胶囊。这种试剂盒优选地包含若干单位剂量。这些试剂盒可包含具有以其预期使用顺序为导向的剂量的卡片。这种试剂盒的实例为“泡罩包装”。泡罩包装为包装工业中所公知的并广泛用于包装药物单位剂型。如果需要，可提供记忆辅助器(memory aid)，例如以数字、字母或其它标记的形式或用日历插页，其在治疗时间表中指明可给药的日期。
按照一个实施方案，试剂盒可包含(a)其中包含PAC的第一容器；和任选的(b)其中包含第二药物制剂的第二容器，其中所述第二药物制剂包含具有抗过增殖活性的第二化合物。可选择地，或另外地，所述试剂盒还可包含第三容器，其包含药用缓冲剂，诸如抑菌的注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它还可包含从商业或使用者观点期望的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、注射针头和注射器。
在其中试剂盒包含PAC和第二治疗剂的某些其他实施方案中，试剂盒可包括用于容纳分开的组合物的容器，例如分开的瓶子或分开的箔包；然而，单独的组合物也可以包含在单个未分开的容器中。通常，试剂盒包括用于给药单独组分的说明。当单独的组分优选以不同的剂型(例如口服和肠胃外)给药，以不同的剂量间隔给药，或者当处方医师需要滴定组合的各个组分时，试剂盒形式是特别有利的。
提供以下实施例是为了示例说明而不是为了限制。
实施例
实施例1
合成PAC
A.化学合成PROTAC
i.接头(L2)与E3连接酶结合基团(E3LB)的连接
4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯甲酸甲酯
在氮气下向N-[(1S)-1-[[(3S,4S)-7-氰基-1-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-4-甲基-2-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-3-基]氨基甲酰基]乙基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(3.00g,5.25mmol)在1,2-二氯乙烷(50mL)中的溶液中加入三乙胺(2.6g,25.7mmol)和4-(氯羰基)苯甲酸甲酯(3.10g,15.61mmol)。将所得的溶液在80℃搅拌5h并冷却至室温。加入水(100mL)。将所得的溶液用3×100mL二氯甲烷萃取且合并有机层并经无水硫酸钠干燥且真空浓缩。将残留物经硅胶快速色谱法纯化(用乙酸乙酯/石油醚(1:1)洗脱)。得到3.10g(81％)4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯甲酸甲酯，其为棕色固体。MS(ESI):[M+H]+＝734.4。
4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯甲酸
在室温将LiOH水溶液(30mL,1M)加入至4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯甲酸甲酯(3.10g,4.22mmol)在四氢呋喃(30mL)中的溶液中。将所得的溶液在室温搅拌5h。加入乙醚(20mL)。分离各相。将水相用1NHCl溶液酸化直到pH为约7。将所得的混合物用2×80mL乙酸乙酯萃取且合并有机层并经无水硫酸钠干燥且真空浓缩。得到2.5g 4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯甲酸，其为棕色固体。MS(ESI):[M+H]+＝720.5。
2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸甲酯盐酸盐
在室温向2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸盐酸盐(500mg,2.505mmol)在2,2-二甲氧基丙烷(5mL,40.327mmol)中的溶液中逐滴加入浓HCl(0.2mL)。将反应混合物在25℃搅拌15h且真空浓缩。残留物无需进一步纯化即直接使用。
2-(2-[2-[(4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯基)甲酰氨基]乙氧基]乙氧基)乙酸甲酯
在氮气下在室温向4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯甲酸(500mg,0.695mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(6mL)中的溶液中加入来自前面步骤的粗2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸甲酯盐酸盐(500mg)、HATU(528mg,1.389mmol)和DIPEA(897mg,6.94mmol)。将所得的溶液在25℃搅拌1小时并用水淬灭。将所得的溶液用二氯甲烷萃取且合并有机层。将有机相用盐水洗涤并经无水硫酸钠干燥且真空浓缩。将残留物经硅胶快速色谱法纯化(用二氯甲烷/甲醇(20:1)洗脱)。得到550mg(90％)2-(2-[2-[(4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯基)甲酰氨基]乙氧基]乙氧基)乙酸甲酯，其为黄色固体。MS(ESI):[M+H]+＝879.5。
2-(2-[2-[(4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯基)甲酰氨基]乙氧基]乙氧基)乙酸
在室温向2-(2-[2-[(4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯基)甲酰氨基]乙氧基]乙氧基)乙酸甲酯(500mg,0.569mmol)在四氢呋喃(8mL)中的溶液中加入氢氧化锂一水合物(95mg,2.26mmol)在水(1mL)中的溶液。将混合物在25℃搅拌1小时。将混合物用水稀释并用1N柠檬酸酸化至pH约4，用乙酸乙酯(2×)萃取。合并有机相并用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并减压浓缩。将残留物在C18硅胶上经反相快速色谱法纯化(流动相:5mM NH4HCO3水溶液和CH3CN(0-95％))得到370mg(75％)2-(2-[2-[(4-[[(2S,3S)-3-[(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]丙酰氨基]-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯基)甲酰氨基]乙氧基]乙氧基)乙酸，其为白色固体。MS(ESI):[M+H]+＝865.5。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.70(d,J＝8.6Hz,1H),8.46(t,J＝5.5Hz,1H),8.21(d,J＝8.7Hz,1H),8.10(d,J＝8.6Hz,1H),7.95(d,J＝9.1Hz,1H),7.89(dd,J＝8.6,1.9Hz,1H),7.69(d,J＝8.1Hz,1H),7.50(d,J＝9.2Hz,1H),7.30(m,1H),7.18(d,J＝1.9Hz,1H),7.13(t,J＝7.5Hz,1H),7.00(d,J＝8.1Hz,2H),6.13(d,J＝15.1Hz,1H),5.78(d,J＝8.0Hz,2H),5.51(d,J＝15.0Hz,1H),5.04(brs,1H),4.61-4.52(m,1H),4.22(dd,J＝11.9,8.5Hz,1H),3.99(s,2H),3.96(s,3H),3.68-3.44(m,7H),3.37(s,1H),2.76(s,3H),1.40-1.31(m,12H),1.12(d,J＝6.1Hz,3H)。
ii.PB与E3LB经接头(L2)的连接
4-((2S,3S)-8-氰基-5-((2-甲氧基萘-1-基)甲基)-2-甲基-3-((S)-2-(甲基氨基)丙酰氨基)-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[b][1,4]二氮杂-1-羰基)-N-(2-(2-(2-((2-(4-(1-(4-羟基苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基)苯氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺(“化合物P1”)
向2-[2-[2-[[4-[(3S,4S)-3-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-7-氰基-1-[(2-甲氧基-1-萘基)甲基]-4-甲基-2-氧代-3,4-二氢-1,5-苯并二氮杂-5-羰基]苯甲酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸(74mg,0.0855mmol)在2-甲基四氢呋喃(0.855mL)中的溶液中加入HATU(1.1当量,36.5mg,0.0941mmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.0当量,0.045mL,0.257mmol)。将混合物在室温搅拌30分钟，然后加入4-[1-[4-[2-(甲基氨基)乙氧基]苯基]-2-苯基-丁-1-烯基]苯酚(1.05当量,33.5mg,0.0898mmol)在2-甲基四氢呋喃(60,0.5mL,400mg,5mmol)中的溶液，随后加入0.2mL DMF。将混合物在室温搅拌22h。加入水并将溶液用iPrOAc萃取三次。合并有机层，然后用硫酸钠干燥并真空浓缩。
将粗物质溶于二氯甲烷(0.85mL)并逐滴加入三氟乙酸(0.26mL)。将反应混合物在室温搅拌直到观察到无气体释出。1h后，将溶液真空浓缩并经反相HPLC纯化得到45mg(45％收率,经2步)预期产物。
M+H＝560.9,1120.7；δ1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39,9.14(重叠的单峰,1H),8.85-8.70(m,1H),8.44-8.36(m,1H),8.20(d,J＝8.8Hz,1H),8.10(d,J＝8.6Hz,1H),7.97-7.82(m,2H),7.70-7.64(m,1H),7.50-7.44(m,1H),7.34-7.27(m,1H),7.21-7.04(m,9H),7.03-6.87(m,4H),6.78-6.67(m,2H),6.62-6.54(m,2H),6.44-6.33(m,1H),6.12(d,J＝15.1Hz,1H),5.78(d,J＝8.0Hz,2H),5.52(d,J＝15.0Hz,1H),4.99-4.89(m,1H),4.33-4.04(m,4H),4.00-3.88(m,1H),3.94(s,3H),3.68-3.61(m,1H),3.60-3.42(m,5H),3.38-3.32(m,1H),3.03-2.78(m,3H),2.45-2.35(m,2H),2.32(s,3H),1.23(d,J＝6.4Hz,3H),1.11(d,J＝6.1Hz,3H),0.89-0.76(m,4H)。
B.制备L1-PROTAC
iii.接头L1与PROTAC的连接
N-[(1S)-1-[[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-[4-[(1Z)-1-(4-[2-[2-(2-[2-[(4-[[(2S,3S)-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-3-[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰氨基]-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯基)甲酰氨基]乙氧基]乙氧基)-N-甲基乙酰氨基]乙氧基]苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基]苯氧基甲基]苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基]-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(“化合物LP2”)
在0℃向(2S)-N-[(3S,4S)-7-氰基-5-[(4-[[2-(2-[[(2-[4-[(1Z)-1-(4-羟基苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基]苯氧基]乙基)(甲基)氨基甲酰基]甲氧基]乙氧基)乙基]氨基甲酰基]苯基)羰基]-1-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-4-甲基-2-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-3-基]-2-(甲基氨基)丙酰胺(化合物P1,48mg,0.043mmol)和N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(氯甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(90mg,0.152mmol)在DMF(0.9mL)中的溶液中加入K2CO3(60mg,0.43mmol)。将反应混合物在0℃搅拌4h并用预先冷却的DMF(0.9mL)稀释。将固体滤出。将滤液采用以下条件经制备性HPLC纯化：柱,SunFirePrep C18OBD柱,19*150mm 5μm,10nm；流动相,水(0.1％TFA)和CH3CN(5％CH3CN直至48％,10min)；检测器,UV 254/220nm，得到22mg(31％)N-[(1S)-1-[[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-[4-[(1Z)-1-(4-[2-[2-(2-[2-[(4-[[(2S,3S)-8-氰基-5-[(2-甲氧基萘-1-基)甲基]-2-甲基-3-[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰氨基]-4-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1,5-苯并二氮杂-1-基]羰基]苯基)甲酰氨基]乙氧基]乙氧基)-N-甲基乙酰氨基]乙氧基]苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基]苯氧基甲基]苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基]-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺，其为白色固体。MS(ESI):[M+H]+＝1675.1；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)10.15(s,1H),9.95-9.72(m,1H),9.52-9.41(m,1H),9.31-9.14(m,1H),8.43(brs,1H),8.20-8.18(m,1H),8.17-8.07(m,2H),7.93(m,2H),7.70(d,J＝8Hz,1H),7.70-7.65(m,3H),7.48-7.42(m,2H),7.41-7.36(m,1H),7.33-7.28(m,1H),7.23(m,1H),7.18-7.07(m,7H),7.02-7.01(m,1H),6.99(s,3H),6.96-6.92(m,2H),6.76-6.67(m,2H),6.60-6.58(m,2H),6.40(d,J＝8.4Hz,1H),6.13-6.08(m,1H),5.99(s,1H),5.80(d,J＝7.6Hz,2H),5.55(d,J＝15.2Hz,1H),5.44(brs,1H),5.02-4.93(m,1H),7.43-4.36(m,3H),4.26-4.02(m,6H),3.95-3.88(m,4H),3.66-3.63(m,3H),3.57-3.53(m,4H),3.39-3.36(m,4H),3.05-2.81(m,5H),2.68(s,2H),2.42-2.39(m,3H),2.22-2.07(m,2H),2.03-1.91(m,1H),1.71(brs,2H),1.62(brs,3H),1.50-1.36(m,6H),1.21-1.17(m,5H),0.87-0.82(m,10H)。
C.制备PAC
iv.抗体(Ab)与PROTAC经接头L1的连接
如下完成PROTAC与HER2和B7H4抗体的缀合以产生PROTAC-抗体缀合物(PAC)。
将10mM琥珀酸盐pH 5、150mM NaCl、2mM EDTA中的半胱氨酸工程化抗体(THIOMABTM抗体)用1M Tris调节至pH 7.5-8.5。将具有硫醇反应性基团的3至10当量的接头L1-PROTAC溶解在DMF或DMA中并加到还原的、再氧化的且pH调节的抗体中。将反应混合物在室温或37℃孵育并监测直至完成(1至约24小时)，如通过反应混合物的LC-MS分析测定。当反应完成时，通过几种方法中的一种或任何组合纯化缀合物，目标是除去剩余的未反应的接头L1-PROTAC中间体和聚集的蛋白质(如果以显著水平存在)。例如，可以用pH 5.5的10mM组氨酸-乙酸盐稀释缀合物直至最终pH为约5.5并使用连接至Akta纯化系统(GE Healthcare)的HiTrap S柱或S maxi旋转柱(Pierce)通过S阳离子交换色谱法纯化。或者，可以使用连接至Akta纯化系统的S200柱或Zeba旋转柱通过凝胶过滤色谱法纯化缀合物。或者，可以使用透析。
使用凝胶过滤或透析将THIOMABTM抗体PROTAC缀合物配制到具有240mM蔗糖的20mMHis/乙酸盐pH 5中。通过离心超滤浓缩纯化的缀合物并在无菌条件下通过0.2μm过滤器过滤并冷冻储存。
实施例2
表征PAC
表征PAC以确定蛋白浓度(例如经BCA测定)、聚集水平(经分析性SEC)、PAR(例如经LC-MS)。
尺寸排阻色谱使用Shodex KW802.5柱在具有0.25mM氯化钾和15％IPA的0.2M磷酸钾pH 6.2中以0.75ml/min的流速进行。通过280nm洗脱峰面积吸光度的积分来确定缀合物的聚集状态。
LC-MS分析使用Agilent QTOF 6530ESI仪器进行。作为实例，PAC在37℃用Tris(pH7.5)中的1:500w/w内蛋白酶Lys C(Promega)处理30分钟。将所得裂解片段负载到加热至80℃的8μm(微米)PLRP-S(高度交联的聚苯乙烯)柱上并在5分钟内用30％B至40％B的梯度洗脱。流动相A为具有0.05％TFA的H2O并且流动相B为具有0.04％TFA的乙腈。流速为0.5ml/min。在电喷雾电离和MS分析之前，通过在280nm的UV吸光度检测来监测蛋白质洗脱。通常实现未缀合的Fc片段、残余未缀合的Fab和经PROTAC缀合的Fab的色谱分辨。使用Mass HunterTM软件(Agilent Technologies)将获得的m/z谱解卷积以计算抗体片段的质量。
表28.若干PAC的表征
MC-VC-PAB是指(6-马来酰亚胺己酰基)-(缬氨酸-瓜氨酸)-(对氨基苄基)。
Thio是指ThiomabTM抗体。
LC K149C是指轻链中位置149处的K已经变化为C。
Hu是指人。
抗HER2和抗B7-H4分别是指结合HER2和B7-H4的抗体。
实施例3
检测含HER-2的PAC对雌激素受体α密度的影响
以下实验描述了在用PROTAC和PROTAC-抗体缀合物处理后通过蛋白质印迹检测MCF7-neo/HER2细胞系中的雌激素受体α(ER-α)。
将工程化以表达HER2/NEU受体的MCF7细胞接种在12孔板中，细胞密度为每孔40×104个细胞。为了消耗雌二醇，使细胞生长在含有10％(v/v)活性炭剥离血清(Gemini Bio-products)、4mM L-谷氨酰胺、各100U的青霉素和链霉素以及非必需氨基酸(Gibco,LifeTechnologies)的无酚红RPMI培养基中。3天后，将细胞用胰蛋白酶消化并以一半密度重新接种。
第二天，将未缀合的PROTAC或缀合抗体(PAC)的PROTAC以10μg/ml(＝134nMPROTAC)和1μg/ml(＝13.4nM PROTAC)加到培养基中。3天后，用PBS洗涤细胞一次并在100μL尿素裂解缓冲液(6M尿素、20mM Tris pH7.5、12.5mM NaCl、2.5mM MgCl2、0.1％Triton X-100、蛋白酶抑制剂混合物(Roche))中裂解。通过BCA(ThermoFisher)测定总蛋白质浓度。对于每个样品，在4-12％Bis-Tris凝胶上分离10μg总细胞蛋白并转移至Invitrolon PVDF膜(Thermofisher)。将膜在含有10％脱脂乳粉的PBS-0.1％Tween-20中封闭并用1:1000稀释的针对雌激素受体α(Santa Cruz,SC-8002)和GAPDH(Santa Cruz,SC25778HRP)的一抗进行探测，随后通过1:5000稀释的针对小鼠IgG的二抗(GE Healthcare)进行探测。
使用化学发光(Perkin Elmer)使蛋白质条带可视化。结果如图1所示。
实施例4
含HER-2的PAC对雌激素受体α密度的影响的定量
以下实验描述了在用PROTAC和PROTAC-抗体缀合物处理后MCF7-neo/HER2细胞中ERα的定量。
细胞铺板
将neoMCF7/HER2细胞(CL130220)在37℃解冻，然后如下转移至生长培养基(RPMI,10％胎牛血清F2442(FBS))中：在1200RCF使细胞旋转下来两次(3分钟)并除去上清液且用生长培养基替换。然后将细胞转移到150cm2烧瓶(Ref:431465)中并生长至融合。一旦融合，将细胞在PBS中洗涤一次，吸出PBS并向烧瓶中加入10ml 10×0.5％胰蛋白酶(Cat#15400-054)以覆盖细胞。立即吸出过量胰蛋白酶并将烧瓶转移至37℃培养箱中且保持5分钟。孵育后，将20ml生长培养基(无酚红-RPMI(Cat#11835-030)10％活性炭剥离-FBS(SKU:F6765))加到烧瓶中并用Vicell仪器测定细胞密度。加入生长培养基以使细胞密度为10,000个细胞/0.05ml。然后将50μl细胞转移到两块Greiner 384孔板(Ref:781946)的每个孔中，将其在37℃培养箱中储存过夜，然后在第二天进行化合物处理。
化合物处理
将PAC在室温解冻并在37℃生长培养基中各自稀释至60μg/ml，然后在384孔板(Ref:781091)上进行20点2×连续稀释。将来自连续稀释的各10μl样品转移到细胞板的孔中。PAC的最高工作浓度为10μg/ml。未处理细胞板第1、2、23和24列以用于数据归一化，而第3-22列含有PAC稀释液。化合物处理后，将细胞板在37℃培养箱中储存72小时。
染色
在72小时化合物处理后，将细胞用15μl 16％多聚甲醛(Cat#15710-S)在每个孔中固定30分钟。吸出内容物，向每个孔中加入50μl透化/阻断缓冲液(PBS,BSA 0.5％(w/v),Triton X100 0.1％(v/v))。10分钟后，吸出透化/阻断缓冲液并用PBS洗涤两次。然后吸出孔的内容物并在透化/阻断缓冲液中用25μl 1/1000的mAb抗ESR1(Clone F10)(Santa Cruzsc-8002)处理并在室温孵育2小时，然后在PBS中洗涤4次。再次吸出孔的内容物并用25μl1/1000经Alexafluor 488缀合的抗小鼠(LifeTechnologies#A21202)和1/1000Hoechst33258(Cat#H3569)处理并孵育3小时。然后将板在PBS中洗涤3次并密封。
数据采集
Cellomics Arrayscan用于收集细胞计数和ERα荧光强度(MeanCircAvgIntenCh2)，其与细胞核中存在的ERα的量成比例。然后将数据相对于未处理的细胞对照归一化并绘制在GraphPad Prism中。GraphPad Prism使用“滞后(抑制剂)对响应-变量斜率”函数计算EC50。
表29报道了来自定量试验的IC50数据。
表29
结果显示在图2中。用含有PAC抗HER2(Endox-XIAP)的HER2抗体处理表达HER2的细胞导致雌激素受体-α(ERα)水平显著降低。用含有PAC抗B7-H4(Endox-XIAP)的B7-H4抗体处理表达HER2的细胞没有导致ERα水平的显著降低。
已经努力确保关于所使用的数字(例如量，温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。
本领域技术人员将认识到与本文所述的那些类似或等同的许多方法和材料，其可用于实践本文所述的主题。本公开绝不仅限于所描述的方法和材料。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义并且符合：Singleton et al(1994)Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,2nd Ed.,J.Wiley&Sons,New York,NY；和Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immunobiology,5th Ed.,GarlandPublishing,New York。
在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括/包含”以非排他性的意义使用。应理解，本文描述的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
如本文所用，术语“约”在提及数值时意在包括从指定量在一些实施方案中为±50％、在一些实施方案中为±20％、在一些实施方案中为±10％、在一些实施方案中为±5％、在一些实施方案中为±1％、在一些实施方案中为±0.5％并且在一些实施方案中为±0.1％的变化，因为这样的变化适合于实施所公开的方法或使用所公开的组合物。
在提供一定范围的值的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则涵盖了范围的上限和下限之间的每个中间值以及在规定的范围内的任何其他规定值或中间值(至下限单位的十分之一)。这些小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围中，也包括在规定的范围内的任何特别排除的限制之内。如果规定的范围包括一个或两个限制，则还包括排除这些限制中的一个或两个的范围。
受益于前述描述和相关附图中呈现的教导，本方面所属领域的技术人员将会想到本文所阐述的许多修改和其他实施方案。因此，应理解，本发明不限于所公开的特定实施方案并且修改和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定术语，但它们仅用于一般性和描述性意义，而不是用于限制的目的。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司.
<120> PROTAC抗体缀合物及其使用方法
<130> P33536-WO
<141> 2017-05-19
<150> US 62/339,257
<151> 2016-05-20
<160> 92
<170> PatentIn版本3.5
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
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<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Trp
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
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Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
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Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
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Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
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Met Ile His Pro Leu Asp Ala Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe Arg
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Asp
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Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 26
<211> 448
<212> PRT
<213> 人类
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Leu Asp Ala Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类
<400> 27
Met Ile His Pro Met Asp Ser Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Asp
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类
<400> 28
Met Ile His Pro Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Asp
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 29
Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Lys Tyr
1 5
<210> 30
<211> 219
<212> PRT
<213> 人类
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser
20 25 30
Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 31
<211> 448
<212> PRT
<213> 人类
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Met Ile His Pro Leu Asp Ala Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 32
<211> 448
<212> PRT
<213> 人类
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Met Ile His Pro Leu Asp Ala Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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115 120 125
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130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
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355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类
<400> 33
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 34
Gln Gln Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类
<400> 35
Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类
<400> 36
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 37
Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr
1 5
<210> 38
<211> 108
<212> PRT
<213> 人类
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 39
<211> 116
<212> PRT
<213> 人类
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
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50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类
<400> 40
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5 10
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类
<400> 41
Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人类
<400> 42
Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类
<400> 43
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类
<400> 44
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 45
Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 46
<211> 124
<212> PRT
<213> 人类
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 113
<212> PRT
<213> 人类
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类
<400> 48
Gly Phe Ser Phe Ser Asp Phe Ala Met Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 18
<212> PRT
<213> 人类
<400> 49
Ala Thr Ile Gly Arg Val Ala Phe His Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 人类
<400> 50
Ala Arg His Arg Gly Phe Asp Val Gly His Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 人类
<400> 51
Arg Ser Ser Glu Thr Leu Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类
<400> 52
Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 53
Phe Gln Gly Ser Phe Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 54
<211> 120
<212> PRT
<213> 人类
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg His Arg Gly Phe Asp Val Gly His Phe Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 113
<212> PRT
<213> 人类
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Glu Thr Leu Val His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Phe Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 56
<211> 117
<212> PRT
<213> 人类
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
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Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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85 90 95
Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 112
<212> PRT
<213> 人类
<400> 57
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类
<400> 58
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu
1 5 10
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> 人类
<400> 59
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类
<400> 60
Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人类
<400> 61
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类
<400> 62
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 63
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 64
<211> 219
<212> PRT
<213> 人类
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Glu Thr Leu Val His Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 65
<211> 450
<212> PRT
<213> 人类
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Gly Arg Val Ala Phe His Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Arg Gly Phe Asp Val Gly His Phe Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 66
<211> 16
<212> PRT
<213> 人类
<400> 66
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Val Gly Asn Thr Phe Leu Glu
1 5 10 15
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类
<400> 67
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 68
Phe Gln Gly Ser Gln Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类
<400> 69
Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ser Trp Met Asn
1 5 10
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类
<400> 70
Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类
<400> 71
Asp Gly Ser Ser Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 72
<211> 113
<212> PRT
<213> 人类
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Val Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 73
<211> 120
<212> PRT
<213> 人类
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Ser Ser Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 74
<211> 219
<212> PRT
<213> 人类
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Val Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 75
<211> 450
<212> PRT
<213> 人类
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Ser Ser Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人类
<400> 76
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类
<400> 77
Leu Gly Val Asn Ser Val Ser
1 5
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类
<400> 78
Asn His Ala Ile Ser
1 5
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类
<400> 79
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类
<400> 80
Glu Trp Ala Asp Val Phe Asp Ile
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类
<400> 81
Glu Trp Ala Asp Val Phe Asp Ile
1 5
<210> 82
<211> 112
<212> PRT
<213> 人类
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Val Asn Ser Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 117
<212> PRT
<213> 人类
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Asn His
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Ala Asp Val Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类
<400> 84
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类
<400> 85
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类
<400> 86
Gly Asn Tyr Met Ser
1 5
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类
<400> 87
Gly Asn Tyr Met Ser
1 5
<210> 88
<211> 16
<212> PRT
<213> 人类
<400> 88
Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类
<400> 89
Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val
1 5 10
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 118
<212> PRT
<213> 人类
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Asn Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 118
<212> PRT
<213> 人类
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 95
<211> 118
<212> PRT
<213> 人类
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 97
<211> 118
<212> PRT
<213> 人类
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 1255
<212> PRT
<213> 人类
<400> 98
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 1000 1005
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr
1010 1015 1020
Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly
1025 1030 1035
Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg
1040 1045 1050
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu
1055 1060 1065
Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser
1070 1075 1080
Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
1085 1090 1095
Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser
1100 1105 1110
Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val
1115 1120 1125
Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro
1130 1135 1140
Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro
1145 1150 1155
Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly
1175 1180 1185
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala
1190 1195 1200
Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp
1205 1210 1215
Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro
1220 1225 1230
Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255

Claims (46)

1.一种缀合物，其具有以下化学结构：
Ab―(L1―D)p
其中
D为具有结构E3LB―L2―PB的PROTAC；
E3LB为共价结合至L2的E3连接酶结合基团；
L2为共价结合至E3LB和PB的接头；
PB为共价结合至L2的蛋白结合基团；
Ab为共价结合至L1的抗体；
L1为共价结合至Ab和D的接头；且
p具有约1至约8的值。
2.权利要求1的缀合物，其中E3LB为结合E3连接酶的基团，其中所述E3连接酶列于表13-27中。
3.权利要求1的缀合物，其中E3LB为结合E3连接酶的基团，其中所述E3连接酶选自vonHippel-Lindau(VHL)、Cereblon、XIAP、E3A、MDM2、后期促进复合物(APC)、UBR5(EDD1)、SOCS/BC-box/eloBC/CUL5/RING、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、WWP2、Parkin、A20/TNFAIP3、AMFR/gp78、ARA54、β-TrCP1/BTRC、BRCA1、CBL、CHIP/STUB1、E6、E6AP/UBE3A、F-box蛋白15/FBXO15、FBXW7/Cdc4、GRAIL/RNF128、HOIP/RNF31、cIAP-1/HIAP-2、cIAP-2/HIAP-1、cIAP(pan)、ITCH/AIP4、KAP1、MARCH8、Mind Bomb 1/MIB1、Mind Bomb 2/MIB2、MuRF1/TRIM63、NDFIP1、NEDD4、NleL、Parkin、RNF2、RNF4、RNF8、RNF168、RNF43、SART1、Skp2、SMURF2、TRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、TRAF-4、TRAF-5、TRAF-6、TRIM5、TRIM21、TRIM32、UBR5和ZNRF3。
4.权利要求1的缀合物，其中E3LB为结合选自XIAP、VHL、Cereblon和MDM2的E3连接酶的基团。
5.权利要求1的缀合物，其中E3LB选自结合VHL的化合物、结合VHL的羟脯氨酸化合物、结合MDM2的化合物、结合Cereblon的化合物、四氢-苯并二氮杂酮、Nutlin、沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
6.权利要求1的缀合物，其中E3LB为XIAP抑制剂，其为具有下式的四氢-苯并二氮杂酮：
其中R1、R2、R3、R4和R5如在WO/2015/071393中所述。
7.权利要求1的缀合物，其中PB为结合以下的基团：FoxOl、HDAC、DP-1、E2F、ABL、AMPK、BRK、BRSK I、BRSK2、BTK、CAMKK1、CAMKKα、CAMKKβ、Rb、Suv39HI、SCF、p19INK4D、GSK-3、pi 8INK4、myc、细胞周期蛋白E、CDK2、CDK9、CDG4/6、环化素D、pl6 INK4A、cdc25A、BMI1、SCF、Akt、CHKl/2、C 1δ、CK1γ、C 2、CLK2、CSK、DDR2、DYRK1A/2/3、EF2K、EPH-A2/A4/B1/B2/B3/B4、EIF2A 3、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、p53、p21Cipl、PAX、Fyn、CAS、C3G、SOS、Tal、Raptor、RACK-1、CRK、Rapl、Rac、KRas、NRas、HRas、GRB2、FAK、PI3K、spred、Spry、mTOR、MPK、LKBl、PAK 1/2/4/5/6、PDGFRA、PYK2、Src、SRPK1、PLC、PKC、PKA、PKBα/β、PKCα/γ/δ、PKD、PLKl、PRAK、PRK2、RIPK2、WAVE-2、TSC2、DAPKl、BAD、IMP、C-TAK1、TAKl、TAOl、TBK1、TESK1、TGFBR1、TIE2、TLK1、TrkA、TSSK1、TTBK1/2、TTK、Tpl2/cotl、MEK1、MEK2、PLDL Erkl、Erk2、Erk5、Erk8、p90RSK、PEA-15、SRF、p27 KIP1、TIF la、HMGN1、ER81、MKP-3、c-Fos、FGF-R1、GCK、GSK3β、HER4、HIPK1/2/3/、IGF-1R、cdc25、UBF、LAMTOR2、Statl、StaO、CREB、JAK、Src、PTEN、NF-κB、HECTH9、Bax、HSP70、HSP90、Apaf-1、Cyto c、BCL-2、Bcl-xL、Smac、XIAP、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、CDC37、TAB、IKK、TRADD、TRAF2、R1P1、FLIP、TAKl、JNKl/2/3、Lck、A-Raf、B-Raf、C-Raf、MOS、MLKl/3、MN l/2、MSKl、MST2/3/4、MPSK1、MEKKl、ME K4、MEL、ASK1、MINK1、MKK 1/2/3/4/6/7、NE 2a/6/7、NUAK1、OSR1、SAP、STK33、Syk、Lyn、PDK1、PHK、PIM 1/2/3、Ataxin-1、mTORCl、MDM2、p21 Wafl、细胞周期蛋白Dl、Lamln A、Tpl2、Myc、连环蛋白、Wnt、IKK-β、IKK-γ、IKK-α、IKK-ε、ELK、p65RelA、IRAKI、IRA 2、IRAK4、IRR、FADD、TRAF6、TRAF3、MKK3、MKK6、ROCK2、RSK1/2、SGK 1、SmMLCK、SIK2/3、ULK1/2、VEGFR1、WNK l、YES1、ZAP70、MAP4K3、MAP4K5、MAPKlb、MAPKAP-K2K3、p38α/β/δ/γMAPK、Aurora A、Aurora B、Aurora C、MCAK、Clip、MAPKAPK、FAK、MARK 1/2/3/4、Mucl、SHC、CXCR4、Gap-1、Myc、β-连环蛋白/TCF、Cbl、BRM、Mcl1、BRD2、BRD3、BRD4、AR、RAS、ErbB3、EGFR、IRE1、HPK1、RIPK2和ERα，包括其所有变体、突变体、剪接变体、插入缺失体和融合体。
8.权利要求1的缀合物，其中PB选自热休克蛋白90(HSP90)抑制剂、激酶和磷酸酶抑制剂、MDM2抑制剂、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂、免疫抑制化合物以及靶标以下的化合物：人BET布罗莫结构域蛋白、芳基烃受体(AHR)、REF受体激酶、FKBP、雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、甲状腺激素受体、HIV蛋白酶、HIV整合酶、HCV蛋白酶以及酰基蛋白硫酯酶-1和-2(APT1和APT2)。
9.权利要求1的缀合物，其中PB为靶标雌激素受体α(ERa)的基团。
10.权利要求1的缀合物，其中所述Ab为半胱氨酸工程化抗体或其变体。
11.权利要求1的缀合物，其中Ab结合选自以下的一种或多种多肽：DLL3、EDAR、CLL1、BMPR1B、E16、STEAP1、0772P、MPF、NaPi2b、Sema 5b、PSCA hlg、ETBR、MSG783、STEAP2、TrpM4、CRIPTO、CD21、CD79b、FcRH2、B7-H4、HER2、NCA、MDP、IL20Rα、Brevican、EphB2R、ASLG659、PSCA、GEDA、BAFF-R、CD22、CD79a、CXCR5、HLA-DOB、P2X5、CD72、LY64、FcRH1、IRTA2、TENB2、PMEL17、TMEFF1、GDNF-Ra1、Ly6E、TMEM46、Ly6G6D、LGR5、RET、LY6K、GPR19、GPR54、ASPHD1、酪氨酸酶、TMEM118、GPR172A、MUC16和CD33。
12.权利要求10的缀合物，其中Ab结合选自以下的一种或多种多肽：CLL1、STEAP1、NaPi2b、STEAP2、TrpM4、CRIPTO、CD21、CD79b、FcRH2、B7-H4、HER2、CD22、CD79a、CD72、LY64、Ly6E、MUC16和CD33。
13.权利要求12的缀合物，其中Ab为结合选自B7-H4、HER2、CLL1、CD33、CD22和NaPi2b的一种或多种多肽的抗体。
14.权利要求12的缀合物，其中所述抗体结合HER2或B7-H4。
15.权利要求14的缀合物，其中所述抗体结合HER2。
16.权利要求1的缀合物，其中L1为肽模拟接头。
17.权利要求16的缀合物，其中L1为由下式表示的肽模拟接头：
—Str—(PM)—Sp—
其中
Str为共价结合至Ab的延伸单元；
Ab为抗体；
Sp为键或共价结合至PROTAC部分的间隔单元；
PM为选自以下的非肽化学部分：
W为-NH-杂环烷基-或杂环烷基；
Y为杂芳基、芳基、-C(O)C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基-NH2、C1-C6亚烷基-NH-CH3、C1-C6亚烷基-N-(CH3)2、C1-C6烯基或C1-C6烷基烯基；
每个R1独立为C1-C10烷基、C1-C10烯基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2、(C1-C6烷基)NHC(O)NH2、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立为H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基或杂芳基烷基，或R3和R2可一起形成C3-C7环烷基；且
R4和R5各自独立为C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(C1-C10烷基)OCH2-，或R4和R5可一起形成C3-C7环烷基环。
18.权利要求17的缀合物，其中Y为杂芳基；R4和R5一起形成环丁基环。
19.权利要求17的缀合物，其中Y为选自以下的部分：
20.权利要求17的缀合物，其中
Str为由下式表示的化学部分：
其中R6选自C1-C10亚烷基、C1-C10烯基、C3-C8环烷基、(C1-C8亚烷基)O-和C1-C10亚烷基-C(O)N(Ra)-C2-C6亚烷基，其中每个亚烷基可被一至五个选自以下的取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺、亚砜、羟基、烷氧基、酯、羧酸、烷基硫基、C3-C8环烷基、C4-C7杂环烷基、杂芳基烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂芳基，每个Ra独立为H或C1-C6烷基；且
Sp为-C1-C6亚烷基-C(O)NH-或—Ar—Rb—，其中Ar为芳基或杂芳基且Rb为(C1-C10亚烷基)O-。
21.权利要求17的缀合物，其中Str具有下式：
其中R7选自C1-C10亚烷基、C1-C10烯基、(C1-C10亚烷基)O-、N(Rc)-(C2-C6亚烷基)-N(Rc)和N(Rc)-(C2-C6亚烷基)；其中每个Rc独立为H或C1-C6烷基；且
Sp为-C1-C6亚烷基-C(O)NH-或—Ar—Rb—，其中Ar为芳基或杂芳基且Rb为(C1-C10亚烷基)O-。
22.权利要求17的缀合物，其中L1具有下式：
R1为C1-C6烷基、C1-C6烯基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立为H、C1-C10烷基。
23.权利要求17的缀合物，其中L1具有下式：
R1为C1-C6烷基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；
R4和R5一起形成C3-C7环烷基环。
24.权利要求17的缀合物，其中L1具有下式：
R1为C1-C6烷基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2。
25.权利要求1的缀合物，其具有下式：
其中
Sp为键或共价结合至PROTAC部分D的间隔单元；
Y为杂芳基、芳基、-C(O)C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基-NH2、C1-C6亚烷基-NH-CH3、C1-C6亚烷基-N-(CH3)2、C1-C6烯基或C1-C6烷基烯基；
R1独立为C1-C10烷基、C1-C10烯基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2、(C1-C6烷基)NHC(O)NH2、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立为H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基或杂芳基烷基，或R3和R2可一起形成C3-C7环烷基；且
Str为由下式表示的化学部分：
R6选自C1-C10亚烷基和C1-C10亚烷基-C(O)N(Ra)-C2-C6亚烷基，其中每个亚烷基可被一至五个选自以下的取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺、亚砜、羟基、烷氧基、酯、羧酸、烷基硫基、C3-C8环烷基、C4-C7杂环烷基、杂芳基烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂芳基，每个Ra独立为H或C1-C6烷基；
p为1、2、3或4。
26.权利要求1的缀合物，其具有下式：
其中
Sp为键或共价结合至PROTAC部分D的间隔单元；
R4和R5各自独立为C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(C1-C10烷基)OCH2-，或R4和R5可一起形成C3-C7环烷基环；
R1独立为C1-C10烷基、C1-C10烯基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2、(C1-C6烷基)NHC(O)NH2、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；
Str为由下式表示的化学部分：
R6选自C1-C10亚烷基和C1-C10亚烷基-C(O)N(Ra)-C2-C6亚烷基，其中每个亚烷基可被一至五个选自以下的取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺、亚砜、羟基、烷氧基、酯、羧酸、烷基硫基、C3-C8环烷基、C4-C7杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂芳基，每个Ra独立为H或C1-C6烷基；
p为1、2、3或4。
27.权利要求25的缀合物，其中Y为杂芳基、芳基或烯基；R6为C1-C10亚烷基。
28.权利要求25的缀合物，其中Y为：
29.权利要求25的缀合物，其中Y为：
30.权利要求25的缀合物，其中Y为：
31.权利要求25的缀合物，其中
Str为由下式表示的化学部分：
R6为C1-C6亚烷基；
Sp为-C1-C6亚烷基-C(O)NH-或—Ar—Rb—，其中Ar为芳基，Rb为(C1-C3亚烷基)O-。
32.权利要求1的缀合物，其具有下式：
其中
Y为杂芳基、芳基、-C(O)C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基-NH2、C1-C6亚烷基-NH-CH3、C1-C6亚烷基-N-(CH3)2、C1-C6烯基或C1-C6烷基烯基；
R1为C1-C6烷基-NH2、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立为H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基或杂芳基烷基，或R3和R2可一起形成C3-C7环烷基；且
p为1、2、3或4。
33.权利要求1的缀合物，其具有下式：
其中
p为1、2、3或4；
R1为C1-C6烷基-NH2、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；
R4和R5各自独立为C1-C6烷基，其中所述烷基为未取代的，或R4和R5可形成C3-C7环烷基环。
34.权利要求1的缀合物，其中L1具有下式：
其中R1和R2独立选自H和C1-C6烷基，或R1和R2形成3、4、5或6元环烷基或杂环基。
35.权利要求1的缀合物，其选自PAC1、PAC2、PAC3、PAC4和PAC5。
36.权利要求1的缀合物，其中p为约1.0至约3。
37.权利要求1的缀合物，其中p为约2。
38.一种药物组合物，其包含权利要求1的缀合物和一种或多种药用赋形剂。
39.治疗有此需要的人的疾病的方法，其包括向所述人给予有效量的权利要求1的缀合物或权利要求38的组合物。
40.权利要求39的方法，其中所述疾病为癌症。
41.权利要求40的方法，其中所述癌症选自癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌症包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
42.权利要求41的方法，其中所述癌症为HER2阳性癌症。
43.权利要求42的方法，其中所述HER2阳性癌症为乳癌或胃癌。
44.权利要求39的方法，其中所述疾病为自身免疫疾病。
45.权利要求44的方法，其中所述自身免疫疾病选自风湿病、骨关节炎、自身免疫性胃肠道和肝脏疾病、血管炎、自身免疫性神经系统疾病、肾脏疾病、自身免疫性皮肤病、血液系统疾病、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力疾病、贝切特病、雷诺综合征、器官移植、自身免疫性内分泌失调、艾迪生病和自身免疫性甲状腺疾病。
46.权利要求45的方法，其中所述自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、舍格伦综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球肾炎。
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