KR20020093029A - 다가 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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레오나르드 지. 프레스타
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위가 있는 개조된 항체, 및 이러한 개조된 항체의 치료 용도와 같은 용도에 관한 것이다.

Description

다가 항체 및 그의 용도 {Multivalent Antibodies And Uses Therefor}
<관련 기술의 설명>
천연 발생 항체의 구조
천연 발생 항체 (이뮤노글로불린)은 이황화 결합에 의해 결합된 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄 (경쇄 하나씩 이황화 결합에 의해 각 중쇄에 결합되어 있음)를 포함한다. 각 중쇄의 한 말단에는 가변 도메인 (VH)가 있고, 이 도메인 뒤에는 다수의 불변 도메인 (항체 부류에 따라 3개 또는 4개의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4))이 있다.
각 경쇄의 한 말단에는 가변 도메인 (VL)이 있고 다른 말단에는 불변 도메인 (CL)이 있으며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되어 있고, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다 (본 명세서의 도 1 참조).
특정한 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 사이에 경계를 형성하는 것으로 생각된다 [문헌 (Chothia et al., J. Mol. Biol. 186: 651-663 (1985); andNovotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4592-4596 (1985)) 참조].
불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대, 항체가 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 참여하는 것에 관여한다. 경쇄와 중쇄로 구성된 각 쌍의 가변 도메인들은 항체와 항원의 결합에 직접 관여한다. 천연 발생 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 동일한 일반 구조를 갖는데, 각각은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결되어 있는 4개의 골격 영역 (FR)을 포함하고, 상기 골격 영역의 서열은 다소 보존되어 있다 [문헌 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)) 참조]. 4개의 FR은 주로 베타-쉬이트 구조를 취하고, CDR은 루프 연결부를 형성하고 몇몇 경우에는 베타-쉬이트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 CDR은 FR에 의해 가깝게 위치해 있고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항원 결합 부위의 형성에 기여한다.
도 2A-E는 5종의 주요 천연 발생 이뮤노글로불린 이소타입의 구조를 나타낸다. IgG, IgD 및 IgE 이뮤노글로불린은 단지 두 개의 항원 결합 부위만을 갖는다. 반대로, IgA 및 IgM은 더 높은 결합가를 갖는 중합체적 구조를 형성할 수 있다.
IgM은 5개의 단량체 단위가 그들의 카르복실-말단 (Cμ4/Cμ4) 도메인과 Cμ3/Cμ3 도메인을 연결시키는 이황화 결합에 의해 연결되어 있는 오량체로서 혈장 세포에 의해 분비된다. 5개의 단량체 하위단위는 상기 오량체의 중심에 있는 Fc 영역 및 분자의 말단에 있는 10개의 항원 결합 부위와 배열되어 있다. 각 오량체는 J쇄 (연결쇄)로 불리는 Fc-결합 폴리펩티드를 추가로 함유하고 있는데, 이 폴리펩티드는 2개의 10μ쇄의 카르복실-말단 시스테인 잔기에 이황화 결합되어 있다. J쇄는 오량체 IgM을 형성하기 위한 단량체의 중합에 필요한 것으로 보이는데, 상기 J쇄는 오량체의 분비 직전에 부가된다. IgM 분자는 10개의 헵텐 소분자와 결합할 수 있으나, 입체적 장애 (steric hindrance) 때문에 5개의 보다 큰 항원 분자에만 동시에 결합할 수 있다. 오량체 IgM의 증가된 결합가는 바이러스 입자 및 적혈구 (RBC)와 같은 다차원적 항원에 결합하는 IgM의 능력을 증가시킨다.
IgA는 종종 이량체, 삼량체 및 심지어 사량체와 같은 중합체적 형태로 나타나기도 하지만 주로 단량체 형태로 존재한다. 외부 분비의 IgA는 이량체 또는 사량체, J쇄 폴리펩티드 및 분비 성분으로 불리는 폴리펩티드쇄로 구성되어 있다.
임상적 용도를 위한 항체
모노클로날 항체, 특히 마우스를 포함하는 설치류로부터 유래된 모노클로날 항체가 널리 사용되고 있으나, 이들 항체는 종종 인간에게 임상적으로 사용할 때 항원성을 나타낸다. 예를 들어, 설치류 모노클로날 항체의 임상적 사용에 있어서 주요 한계는 치료 기간동안의 항-글로불린 반응이다 (Miller et al., Blood 62: 988-995 (1983); and Schroff, R. W. et al., Cancer Res. 45: 879-885 (1985)).
당업계는 동물 항원 결합 가변 도메인을 인간 불변 도메인에 연결시킨 "키메라" 항체를 제작함으로써 이 문제점을 극복하고자 시도한 바 있다 (Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); and Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985)). 인간 불변 도메인의 이소타입은 키메라 항체가 ADCC 및 CDC에 참여할 수 있도록 선택할 수 있다 (see e. g. Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987); Riechmann et al., Nature 332 : 323-327 (1988); Love et al., Methods in Enzymology 178: 515-527 (1989); and Bindon et al., J. Exp. Med. 168: 127-142 (1988)). 대표적인 실시양태에서, 이러한 키메라 항체는 약 1/3의 설치류 (또는 비-인간 종) 서열을 함유하므로 인간에서 상당한 항-글로불린 반응을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 뮤린 항-CD3 항체인 OKT3의 경우, 대부분의 항-글로불린 반응은 불변 영역보다는 가변 영역에 대해 일어난다 (Jaffers et al., Transplantation 41: 572-578 (1986)).
항체의 항원 결합 기능을 해석하고 인간 항체에 있어서 이종 서열의 사용을 최소화하기 위한 다른 노력에 있어서, 윈터 (Winter) 및 그의 동료들은 인간 항체의 상응하는 절편을 설치류 CDR들 또는 CDR 서열로 치환한 바 있다 (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332 : 323-327 (1988); and Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)).
이러한 방법의 치료적 전망은 CAMPATH-1 항원에 특이적인 인간화 항체가 두 명의 비-호치킨 림프종 환자 (이 중 한 명은 과거에 모계 래트 항원에 대한 항-글로불린 반응을 나타낸 경험이 있음)에서 임상적으로 효능이 있다는 사실에 의해 지지된다 (Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); and Hale et al., Lancet i: 1394-1399 (1988)).
몇몇 경우, 인간 골격의 인간 CDR을 설치류 항체의 CDR로 치환하는 것은 높은 항원 결합 친화도를 전달하는 데 충분한 반면 (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)), 다른 경우 하나 의 골격 잔기 (Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988)) 또는 여러개의 골격 잔기 (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989))를 더 치환할 필요가 있다 [문헌 (Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869-2873 (1991); 미국 특허 제5,821,337호 (Carter et al.); 및 미국 특허 제5,530,101호 (Queen et al.)) 참조]. 항체의 인간화에 관한 다른 문헌에는 문헌 (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4181-4185 (1991); Daugherty et al., Nucleic Acids Research 19 (9): 2471-2476 (1991); Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2663-2667 (1991); and Junghans et al., Cancer Research 50: 1495-1502 (1990))이 포함된다.
키메라/인간화 항체 대신에, 뮤린 항체에 대해 일어나는 인간 항체 ("HAMA 반응"으로 알려져 있음)를 피하기 위해 환자를 인간 항체로 치료할 수 있다. 여러 기술이 인간 항체를 생성시키는 데 이용될 수 있다.
인간 항체는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선별할 수 있다. 파지 디스플레이는 면역화되지 않은 공여자로부터 인간 항체를 선별하는 데 사용된 바 있다 (Marks et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)). 이 방법에 따라, PCR을 이용하여 인간 말초 혈액 림프구 (PBL)로부터 얻은 mRNA로부터 가변 도메인 유전자를 증폭한다. 프라이머는 IgG 및 IgM 중쇄 둘 다 및 κ쇄 및 λ쇄 둘 다가 증폭되도록 사용한다. 그 다음, 이들 유전자를 무작위적으로 조합하고 M13 파지의 유전자 III 코트 단백질에 융합된 단일쇄 Fv (scFv)로서 발현시킨다. 이어서, 생장 및 원하는 항원 (예를 들어, 고정된 항원)과의 결합에 의한 선별을 반복함으로써 상기 항원에 대한 인간 항체를 찾을 수 있다 (Griffiths et al. EMB0 J. 12: 725-734 (1993).
"합성" 파지-항체 레파토리도 클로닝된 인간 VH-유전자 절편들로부터 제작된 바 있다. 49개의 각 절편과 함께, 5개 또는 8개의 무작위적 잔기로 구성된 짧은 H3 루프를 사용하여 레파토리 (2 X 107클론)를 먼저 제작하고, 고정된 경쇄와 조합시킨다 (Hoogenboom et al. J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992)). 12개 이하의 잔기들로 구성된 다양한 길이의 H3 루프를 부가함으로써, 단일 라이브러리를 만들었고, 이 라이브러리로부터 20가지 이상의 결합 특이성을 선별할 수 있었다 (Winter et al. Ann. Rev. Immuno. 12: 433-55 (1994)). 인간 항체의 CDR을 무작위로 골라 단일 항체의 골격으로부터 다른 합성 라이브러를 제작한 바 있다 (Garrard and Henner Gene 128: 103-109 (1993)). 이러한 합성 파지-항체 레파토리로부터 유래된 항체도 본 명세서에서 "인간" 항체로 간주된다.
친화성이 낮은 "1차" 파지-항체의 친화도는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 개선시킬 수 있다. 한 방법은 VH 도메인을 일정하게 유지한 후 VL 유전자의 본래 라이브러리와 재조합시키고 고정된 항원과의 결합에 의해 단단히 결합된 것들을 선별하는 체인-셔플링법을 이용하는 것이다. 이 주기는 새로운 VL 도메인을 고정시키고 본래의 VH 라이브러리와 재조합시킴으로써 반복한다 (Marks et al. Bio/Technology 10: 779-783 (1992)). 별법으로, 오류를 일으키기 쉬운 PCR을 이용하여 점 돌연변이를 일차 항체에 도입하고 파지 디스플레이를 사용하여 친화도가 보다 더 높은 항체를 선별한다 (Gram et al. PNAS (USA) 89: 3576-3580 (1992)).
또한, 인간 항체를 발현하도록 유전적으로 개조된 마우스를 면역화시켜 인간 항체를 생산할 수도 있다. 중증복합면역결핍 (SCID) 마우스는 재조합 효소 유전자의 결함으로 인해 자신의 면역글로불린을 생산할 수 없다. 여러 그룹들이 인간 말초혈 림프구 (PBL)의 전달에 의해 이들 마우스에서 기능성 체액 면역시스템을 재구성한 바 있다. 이들 hu-PBL-SCID 마우스는 항원으로 면역화시킬 때 인간 항체를 생성시키는 데 사용할 수 있다 (Duchosal et al. Nature 355: 258-262 (1992)). 다른 방법을 이용하여, 마우스 내의 중쇄 및 경쇄 유전자의 기능을 불활성화시킨 후, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 함유하는 큰 DNA 서열을 사용하여 개조한 효모 인공 염색체 (YAC)를 마우스 내에 도입시킨다. 이러한 "제노마우스"는 원하는 항원으로 면역화시킬 때 인간 항체를 생산할 수 있다 (미국 특허 제5,434,340호; 제5,591,699호; 제5,569,825호; 제5,545,806호; 및 제5,545,807호를 참조).
인간 모노클로날 항체는 원하는 항체를 생산하는 인간 B 림프구를 불멸 세포로 만들어 생성시킬 수도 있다. 활성 인간 B 림프구를 생성시키기 위해 인간을 면역화시키는 것에 대한 윤리적 문제는 시험관내에서 인간 림프구를 면역화시킴으로써 해결할 수 있다. 인간 PBL (Borrebaeck et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3995-4000 (1988)) 및 인간 비장세포 (Boerner et al. J. Immunol. 147,86-95 (1991)) 둘 다가 시험관내에서 성공적으로 면역화된 바 있다. 인간 하이브리도마 기술은 마우스-인간 헤테로하이브리드를 융합 파트너로 사용하여 개선시킬 수 있다(Boerner et al.).
항체 변이체
항체는 그의 항원-결합가가 증가되도록 변형시킨다. 예를 들어, 게티 등 (Ghetie et al.)은 두 개의 이종이관능성 가교결합제를 사용하여 한 쌍의 IgG 사이에 티오에테르 결합을 화학적으로 도입시킴으로써 종양-반응성 모노클로날 항체 (항-CD19, 항-CD20, 항-CD21, 항-CD22 및 항-HER2 항체)를 동종이량체화시킨 바 있다 (Ghetie et al. PNAS (USA) 94: 7509-7514 (1997); and WO 99/02567). 울프 등 (Wolff et al.)도 이종이관능성 가교결합제를 사용하여 IgG 모노클로날 항체 (CHiBR96)를 화학적으로 결합시켜 누드 마우스에서의 항-종양 활성이 상승된 모노클로날 항체 동종이량체를 생성시킨 바 있다 (Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)).
쇼페스 등 (Shopes et al.)은 인간 IgG1 중쇄의 카르복실 말단 근처의 세린 잔기 (Ser444)를 시스테인으로 대체시켰다. Cys444잔기 사이에 도입된 분자간 이황화 결합은 이뮤노글로불린쌍을 "테일-투-테일"로 결합시켜 공유결합성 이량체 (H2L2)2를 형성한다. 항-댄실 이량체는 헵텐-보유 적혈구의 항체-의존성 보체 매개 세포용해에 있어서 단량체 인간 IgG1보다 더 효율적인 것으로 알려져 있다 (Shopes, B. J. Immunol. 148 (9): 2918-2922 (1992); and WO 91/19515). 시스테인 잔기의 도입을 수반하는 이 방법은 CAMPATH-1H 항체의 동종이량체 형태를 생성시키는 데에도 사용된다. 동종이량체 형태의 CAMPATH-1H 항체는 낮은 밀도로 항원을 발현하는 표적 세포를 사용할 경우 개선된 세포용해능을 나타내지만, 높은 밀도로 항원을 발현하는 세포를 사용하는 경우에는 세포용해능의 개선이 관찰되지 않았다 (Greenwood et al. Ther. Immunol. 1: 247255 (1994)). 또한, 중쇄의 위치 444에서 세린을 시스테인으로 치환시켜 IgG의 COOH 말단에 쇄간 이황화 결합을 형성시킨 개조된 항-CD33 항체에 관한 문헌 (Caron et aL J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992))도 참고한다. 동종이량체 IgG는 모 IgG와 유사한 결합성을 나타내지만, 표적 백혈병 세포에 내재화하여 방사성동위원소를 보유하는 개선된 능력을 명백히 보이고, 인간 이펙터를 사용하여 보체-매개 백혈병 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성에 있어서 더 높은 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다.
문헌 (Coloma and Morrison Nature Biotech. 15: 159-163 (1997))에는 IgG3 항-댄실 항체의 C-말단 (CH3-scFv) 또는 힌지 (힌지-scFv) 다음에 단일쇄 항-댄실 항체 Fv (scFv)를 코딩하는 DNA를 융합시킴으로써 개조한 4가 이중특이적 항체가 기재되어 있다 (WO95/009917도 참고). 스미쓰 및 모리슨은 (1) IgM 중쇄의 Cys414 또는 (2) IgM 중쇄의 Cys575, 또는 (1) 및 (2) 둘 다를 IgG3 중쇄 유전자 내로 도입시켜 mu-유사 IgG3의 3가지 버젼을 만들었다. 이 3가지 돌연변이 제작물은 Sp2/O 세포에 의해 발현시키고 6개 이하의 H2L2서브유닛을 함유하는 중합체로 어셈블링하였다. 이로써 생성된 IgG의 "IgM-유사" 중합체는 IgG의 Fc 감마 수용체 결합성 및 IgM의 보다 더 강력한 보체 활성 둘 다를 갖는 것으로 생각되었다 (Smith and Morrison Bio/Technology 12: 683-688 (1994)).
슈포드 (Shuford) 및 그의 동료들은 형질감염된 골수종 세포주로부터 인간 IgG1 항-그룹 B 스트렙토코코스 항체 올리고머를 단리하였다 (Shuford et al. Science 252: 724-727 (1991)). 면역화학적 분석 및 DNA 시퀀싱은 상기 세포주가 정상 카파 경쇄 및 37kD의 V-V-C 변이체 경쇄 (L37) 둘 다를 생산한다는 것을 보여주었다. 중쇄 및 L37을 코딩하는 벡터의 동시형질감염은 올리고머 형태의 IgG를 생성시켰다.
미국 특허 제5,641,870호 (Rinderknecht et al.)에는 경쇄와 동시분비되는 중쇄 단편 (VH-CH1-VH-CH1)의 탠덤 반복부를 포함하는 2가 직쇄 F(ab')2단편이 기재되어 있다. CH1의 C-말단은 임의의 외부 결합 단백질 서열 없이 VH의 N-말단에 연결시켰다.
항체 변이체에 대한 다른 문헌에는 WO 00/06605; 미국 특허 제5,591,828호; 미국 특허 제5,959,083호; 미국 특허 제6,027,725호; W098/58965; W094/13804; 문헌 (Tutt et al. J. Immunol. 147: 60-69 (1991)); W099/37791; 미국 특허 제5,989,830호; W094/15642; 유럽 특허 제628,078B1호; W097/14719; 문헌 (Stevenson et al. 항-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989))이 포함된다.
ErbB 수용체 티로신 키나제
ErbB 수용체 티로신 티나제는 세포의 생장, 분화 및 생존의 중요 매개자이다. 상기 수용체과에는 상피 성장인자 수용체 (EGFR 또는 ErbB1), HER2 (ErbB2 또는 p185neu), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4 또는 tyro2)을 비롯한 4가지 이상의 구성원이 포함된다.
erbB1 유전자에 의해 코딩되는 EGFR은 통상 인간 악성종양에 관여한다. 특히, EGFR의 증가된 발현은 유방암, 방광암, 폐암, 두경부암 및 위암뿐 아니라 신경교아종에서 관찰된다. 증가된 EGFR 수용체 발현은 상기 종양 세포에 의한 EGFR 리간드, 즉 형질전이 성장인자 알파 (TGF-알파)의 증가된 생산과 종종 관련되어 있고, 상기 EGFR 리간드는 자가분비 자극성 경로를 통해 수용체를 활성화시킨다 (Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994)). EGFR 또는 그의 리간드 (TGF-알파 및 EGF)에 대한 모노클로날 항체는 이러한 악성종양의 치료에 있어서 치료제로 평가된 바 있다 (예를 들어, 문헌 (Baselga and Mendelsohn., supra; Masui et al. Cancer Research 44: 1002-1007 (1984); and Wu et al. J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995)) 참조).
ErbB과의 제2 구성원인 p185neu는 처음에는 화학적으로 처리된 래트의 신경교아종으로부터 유래된 형질전이 유전자의 생성물로서 확인되었다. neu 프로토온코진 (protooncogene)의 활성화 형태는 코딩된 단백질의 막횡단 영역에 있는 점 돌연변이 (발린에서 글루탐산으로)에 의해 만들어진다. neu의 인간 동족체의 증폭은 유방암 및 난소암에서 관찰되고 약한 예후와 상호관련되어 있다 (Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989); 및 미국 특허 제4,968,603호). 현재까지, 인간 종양에서 neu 프로토온코진의 점 돌연변이와 유사한 점 돌연변이가 발견된 적은 없다. HER2의 과발현 (유전자 증폭으로인해 한결같이 과발현되지는 않지만 종종 과발현됨)은 위암, 자궁내막암, 내분비선암, 폐암, 신장암, 결장암, 갑상선암, 췌장암 및 방광암을 비롯한 다른 암에서도 관찰된 바 있다.
래트 p185neu및 인간 HER2 단백질 생성물에 대한 항체도 기재된 바 있다. 드레빈 (Drebin) 및 그의 동료들은 래트의 neu 유전자 생성물 p185neu에 대한 항체를 생성시켰다 [예를 들어, 문헌 (Drebin et al., Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991); and W094/22478)을 참조함]. 문헌 (Drebin et al. Oncogene 2: 273-277 (1988))에는 p185neu의 두 개의 상이한 영역과 반응하는 항체의 혼합물이 누드 마우스 내로 이식된 neu-형질전환 NIH-3T3 세포에 대한 상승작용적 항-종양 효과를 나타내었음을 보고한 바 있다. 1998년 10월 20일 간행된 미국 특허 제5,824,311호도 참고한다.
문헌 (Hudziak et al., Mol. Cell. BioL 9 (3): 1165-1172 (1989))에는 인간 유방 종양 세포주 SKBR3를 사용하여 특징을 규명한 항-HER2 항체의 패널을 만든 것이 기재되어 있다. SKBR3 세포를 상기 항체에 노출시킨 후 상기 세포의 상대적인 세포 증식을 72시간 후 단일층의 크리스탈 바이올렛 염색으로 측정하였다. 이 분석을 이용하여, 세포 증식을 56% 억제하는 항체 (4D5로 불림)로 최대 억제를 달성하였다. 상기 패널에서 다른 항체들은 이 분석에서 보다 더 적은 정도로 세포 증식을 감소시켰다. 항체 4D5는 HER2-과발현 유방 종양 세포주가 TNF-알파의 세포독성 효과에 민감하게 한다는 것도 밝혀졌다. 1997년 10월 14일 허여된 미국 특허제5,677,171호도 참고한다. 후드지악 (Hudziak) 등에 의해 논의된 항-HER2 항체의 다른 특징은 문헌 [Fendly et al. Cancer Research 50: 1550-1558 (1990); Kotts et al. In Vitro 26 (3): 59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1: 72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11 (3): 117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11 (2): 979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9: 1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269 (20): 14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56: 1457-1465 (1996); and Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)]에서 찾을 수 있다.
뮤린 항-HER2 항체 4D5 (rhuMAb HER2 또는 HERCEPTIN (등록상표); 제넨텍 인크사 (South San Francisco)로부터 시판됨)의 재조합 인간화 IgG1 버젼은 과거에 다양한 항암 요법을 받은 HER2-과발현 전이성 유방암 환자에서 임상적으로 활성을 나타낸다 (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996)). HERCEPTIN (등록상표)은 HER2 단백질을 과발현하는 전이성 유방암을 앓는 환자의 치료에 사용할 수 있도록 식품의약안정청으로부터 1998년 9월 25일 시판 승인을 받았다.
다양한 성질을 나타내는 다른 항-HER2 항체가 문헌 [Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51: 5361-5369 (1991); Bacus et al. MolecularCarcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52: 2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993); W094/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancock et al. Cancer Res. 51: 4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res. 54: 1367-1373 (1994); Arteaga etal. CancerRes. 54: 3758-3765 (1994); Harwerth etal. J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992); 미국 특허 제5,783,186호; Klapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997); WO 98/77797; 및 미국 특허 제5,783,186호]에 기재되어 있다. 상동성 스크리닝 결과, 두 가지 다른 ErbB 수용체과 구성원인 HER3 (미국 특허 제5,183,884호 및 제5,480,968호, Kraus et al. PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) 및 HER4 (유럽 특허 출원 제599,274호; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); and Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993))를 찾았다. 이들 수용체는 둘 다 적어도 몇몇 유방암 세포주 상에서 증가된 발현을 나타낸다.
ErbB 수용체는 일반적으로 세포에서 다양한 조합 형태로 발견되고, 다양한 ErbB 리간드에 대한 세포 반응의 다양성을 증가시키는 것으로 생각된다 (Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR은 6가지 상이한 리간드, 즉 상피 성장인자 (EGF), 형질전이 성장인자 알파 (TGF-알파), 앰피레귤린, 헤파린 결합 상피 성장인자 (HB-EGF), 베타셀룰린 및 에피레귤린 (Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994))에 의해 결합된다. 단일 유전자의 얼터네이티브 스플리싱으로부터 생성된 헤레귤린 단백질과는 HER3 및 HER4에대한 리간드이다. 헤레귤린과에는 알파, 베타 및 감마 헤레귤린 (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); 미국 특허 제5,641,869호; and Schaefer et al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)); neu 분화 인자 (NDF), 아교세포 성장인자 (GGF); 아세틸콜린 수용체 유도 활성 (ARIA); 및 감각 및 운동 신경 유래 인자 (SMDF)가 포함된다. 자세한 검토를 위해서는 문헌 (Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996) and Lee et al. Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995))을 참고한다. 최근에, 두 가지 추가 ErbB 리간드, 즉 HER3 또는 HER4에 결합하는 것으로 보고되어 있는 뉴레귤린-2 (NRG-2) (Chang et al., Nature 387 509-512 (1997); and Carraway et al Nature 387: 512-516 (1997)) 및 HER4에 결합하는 뉴레귤린-3 (Zhang et al. PNAS (USA) 94 (18): 9562-7 (1997))을 찾았다. HB-EGF 베타셀룰린 및 에피레귤린도 HER4에 결합한다.
EGF 및 TGF-알파는 HER2에 결합하지 않지만, EGF는 EGFR 및 HER2를 자극하여 이종이량체를 형성하고, 이 이종이량체는 EGFR을 활성화시키고 이종이량체 내의 HER2를 트랜스인산화시킨다. 이량체화 및(또는) 트랜스인산화는 HER2 티로신 키나제를 활성화시키는 것으로 생각된다 (Earp et al., supra). 마찬가지로, HER3가 HER2와 동시발현되는 경우, 활성 신호전달 결합체가 형성되고 HER2에 대한 항체가 이 결합체를 파괴시킬 수 있다 (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665 (1994)). 또한, 헤레귤린 (HRG)에 대한 HER3의 친화도는 HER2와 동시발현되는 경우 더 높은 친화도 상태로 증가된다. HER2-HER3 단백질 결합체에 대해서는 문헌 (Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995);Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995); and Lewis et al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996))을 참고한다. HER3처럼 HER4도 HER2와 함께 활성 신호전달 결합체를 형성한다 (Carraway and Cantle, Cell 78 : 5-8 (1994)).
TNF 수용체 상과 (superfamily)
종양 괴사 인자-알파 ("TNF-알파"), 종양 괴사 인자-베타 ("TNF-베타"), 림프독소-알파 ("LT-alpha"), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, OX40 리간드, 4-1BB 리간드, Apo-1 리간드 (Fas 리간드 또는 CD95 리간드로도 불림), Apo-2 리간드 (TRAIL로도 불림), Apo-3 리간드 (TWEAK로도 불림), 오스테오프로테게린 (OPG), APRIL, RANK 리간드 (TRANCE로도 불림) 및 TALL-1 (BlyS, BAFF 또는 THANK로도 불림)와 같은 다양한 분자가 사이토킨의 종양 괴사 인자 ("TNF") 과의 구성원으로 확인된 바 있다 (Gruss and Dower, Blood, 85: 3378-3404 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3: 673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72: 847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357: 80-82 (1992); WO 97/01633 published January 16,1997; WO 97/25428 published July 17, 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8: 525-528 (1998); Simonet et al., Cell, 89: 309-319 (1997); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272: 32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188: 1185-1190 (1998); W098/28426 published July 2,1998; W098/46751 published October 22,1998; WO/98/18921 published May 7, 1998; Moore et al., Science, 285: 260-263(1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65: 680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189: 1747-1756 (1999); and Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274: 15978-15981 (1999)). 이들 분자들 중에서, TNF-알파, TNF-베타, CD30 리간드, 4-1BB 리간드, Apo-1 리간드, Apo-2 리간드 (Apo2L/TRAIL) 및 Apo-3 리간드 (TWEAK)가 아폽토시스성 세포 사멸에 관여하는 것으로 보고되어 있다. TNF-알파 및 TNF-베타 둘 다가 감수성 종양 세포에서 아폽토시스성 사멸을 유도하는 것으로 보고된 바 있다 (Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17: 689 (1987)).
TNF 과의 다양한 분자는 면역시스템의 기능 또는 발달에서도 중요한 역할을 한다 (Gruss et al., Blood, 85: 3378 (1995)). 문헌 (Zheng et al., Nature, 377: 348-351 (1995))에는 TNF-알파가 CD8-양성 T 세포의 자극 후 아폽토시스에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 다른 연구자들도 CD30 리간드가 흉선에서 자가-반응성 T 세포의 소멸에 관여할 수 있음을 보고한 바 있다 (Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. No. 10, (1995)). CD40 리간드는 증식, 이뮤노글로불린 분비 및 생존을 비롯한 B 세포의 많은 기능을 할성화시킨다 (Renshaw et al., J. Exp. Med., 180: 1889 (1994)). 또한, 최근에 찾은 또다른 TNF과 사이토킨인 TALL-1 (BlyS)도 특정한 조건 하에서 B 세포 증식 및 이뮤노글로불린 분비를 유도하는 것으로 보고된 바 있다 (Moore et al., supra ; Schneider et al., supra; Mackay et al., J. Exp. Med., 190: 1697 (1999)).
마우스 Fas/Apo-1 수용체 또는 리간드 유전자 (각각 Ipr 및 gld로 불림)의 돌연변이는 몇몇 자가면역 질환과 관련되어 있는데, 이는 Apo-1 리간드가 말초 기관에서의 자가 반응성 림프구의 클론 소멸을 조절하는 데 작용할 수 있음을 암시한다 (Krammer et al., Curr. Op. Immuno., 6:279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267: 1449-1456 (1995)). Apo-1 리간드는 CD4-양성 T 림프구 및 B 림프구에서 자극 후 아폽토시스를 유도하고 그의 기능이 더 이상 필요하지 않을 때 활성화된 림프구의 소멸에 관여할 수 있다고 보고되어 있다 (Krammer et al., supra; Nagata et al., supra). Apo-1 수용체에 특이적으로 결합하는 아고니스트 마우스 모노클로날 항체는 TNF-알파와 필적하거나 유사한 세포 사멸 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Yonehara et al., J. Exp. Med., 169: 1747-1756 (1989)).
이러한 TNF과 사이토킨에 의해 매개되는 다양한 세포 반응의 유도는 상기 사이토킨과 특정한 세포 수용체의 결합에 의해 개시되는 것으로 생각된다. 대략 55-kDa의 TNF 수용체 (TNFR1) 및 75-kDa의 TNF 수용체 (TNFR2)를 찾았다 (Hohman et al., J. Biol. Chem., 264: 14927-14934 (1989); Brockhaus etal., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3127-3131 (1990); EP 417,563, published March 20, 1991; Loetscher et al., Cell, 61: 351 (1990); Schall et al., Cell, 61: 361 (1990); Smith et al., Science, 248: 1019-1023 (1990); Lewis etal., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11: 3020-3026 (1991)). 이들 TNFR은 세포외 영역, 막횡단 영역 및 세포내 영역을 비롯한 세포 표면 수용체의 전형적인 구조를 공유하는 것으로 밝혀졌다. 이들 두 수용체의 세포외 영역은 가용성 TNF-결합 단백질로서도 천연적으로 발견되었다 (Nophar et al., EMBO J., 9: 3269 (1990); and Kohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 87: 8331 (1990); Hale et al., J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p. 113 (P424)).
타입 1 및 타입 2 TNFR (TNFR1 및 TNFR2)의 세포외 영역은 NH2-말단으로부터 시작하여 1 내지 4로 표시되는 4개의 시스테인-풍부 도메인 (CRD)으로 구성된 반복 아미노산 서열 패턴을 함유한다 (Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra; Banner et al., Cell, 73: 431-435 (1993)). CRD의 유사한 반복 패턴은 p75 신경 성장인자 수용체 (NGFR) (Johnson et al., Cell, 47: 545 (1986); Radeke et al., Nature, 325: 593 (1987)), B 세포 항원 CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 1403 (1989)), T 세포 항원 OX40 (Mallet et al., EMBO J., 9: 1063 (1990)) 및 Fas 항원 (Yonehara et al., supra and Itoh et al., Cell, 66: 233-243 (1991))을 비롯한 여러 가지 다른 세포 표면 단백질에 존재한다. CDR은 쇼프 (Shope)의 가용성 TNFR (sTNFR)-유사 T2 단백질 및 점액종 폭스바이러스에서도 발견된다 (Upton et al., Virology, 160: 20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176: 335 (1991); Upton et al., Virology, 184: 370 (1991)). 이들 서열의 최적 정렬은 시스테인 잔기의 위치가 잘 보존되어 있음을 의미한다. 이들 수용체는 종종 TNF/NGF 수용체 상과의 구성원으로서 총칭된다.
림프독소-알파를 제외하고 현재까지 확인된 TNF과 리간드는 C-말단이 세포외에 있는 타입 II 막횡단 단백질이다. 반대로, 현재까지 확인된 TNF 수용체 (TNFR)과의 대부분의 수용체는 타입 I 막횡단 단백질이다. 그러나, TNF 리간드과 및 수용체과 둘 다에서, 과 구성원 사이에 확인된 상동성은 주로 세포외 도메인 ("ECD")에서 발견된다. TNF-알파, Apo-1 리간드 및 CD40 리간드를 비롯한 TNF과 사이토킨 중 여러 사이토킨이 세포 표면에서 단백질분해효소에 의해 절단되고, 각 경우에서 생성된 단백질은 전형적으로 가용성 사이토킨으로서 작용하는 동종삼량체 분자를 형성한다. TNF 수용체과 단백질도 통상 단백질분해효소에 의해 절단되어 동족 사이토킨의 억제제로 작용할 수 있는 가용성 수용체 ECD를 방출시킨다.
가장 최근에는, TNFR과의 다른 구성원도 찾았다. 문헌 (von Bulow et al., Science, 278: 138-141 (1997))에는 막횡단 활성화제 및 CAML-상호작용자 또는 "TACI"로 불리는 혈장막 수용체가 기재되어 있다. TACI 수용체는 TNFR과의 특징인 시스테인-풍부 모티프를 함유하는 것으로 보고되어 있다. 시험관내 분석에서, TACI-특이적 항체로 형질감염된 Jurkat 세포의 표면 상에 있는 TACI의 가교결합은 NF-κB를 활성화시킨다 (1998년 9월 18일 공개된 WO 98/39361 참조).
문헌 (Laabi et al., EMBO J., 11: 3897-3904 (1992))은 B 세포 말단 성숙 (maturation)과 일치하는 것으로 밝혀진 발현을 보이는 "BCM"으로 불리는 새로운 유전자를 찾은 것을 보고했다. BCM은 BCM 정상 cDNA의 오픈 리딩 프레임으로부터 단일 막횡단 도메인을 갖는 184개의 아미노산 폴리펩티드로서 예측되었다. 상기 문헌의 연구자들은 나중에 이 유전자를 "BCMA"로 지칭하였다 (Laabi et al.,Nucleic Acids Res., 22: 1147-1154 (1994)). BCMA mRNA 발현은 프로-B 림프구 단계를 나타내는 인간 악성 B 세포주에서는 관찰되지 않는 것으로 보고되었고, 따라서, 상기 BCMA mRNA 발현은 림프구의 분화 단계와 연결되어 있는 것으로 생각된다 (Gras etal., Int. Immunology, 7: 1093-1106 (1995)). 문헌 (Madry etal., Int. Immunology, 10: 1693-1702 (1998))에는 뮤린 BCMA cDNA의 클로닝이 기재되어 있다. 뮤린 BCMA cDNA는 인간 BCMA 폴리펩티드와의 동일성이 62%인 185개 아미노산 길이의 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 알려져 있다. 뮤린 BCMA 단백질 서열과 인간 BCMA 단백질 서열의 정렬은 N-말단 영역에 6개의 시스테인으로 구성된 보존 모티프가 있는 것을 보여주는데, 이는 BCMA 단백질이 TNFR 상과에 속하는 것임을 암시한다 (Madry et al., supra).
문헌 (Marsters et al., Curr. Biol., 6: 750 (1996))에는 세포외 시스테인 풍부 반복부에서 TNFR과와 유사성을 나타내고 세포질 사멸 도메인 서열을 함유한다는 점에서 TNFR1 및 CD95와 유사한, Apo-3로 불리는 전장 천연 서열 인간 폴리펩티드가 기재되어 있다 (Marsters et al., Curr. Biol., 6: 1669 (1996)). Apo-3는 다른 연구자들에 의해 DR3, wsl-1, TRAMP 및 LARD로 불리기도 한다 (Chinnaiyan et al., Science, 274: 990 (1996); Kitson et al., Nature, 384: 372 (1996); Bodmer et al., Immunity, 6: 79 (1997); Screaton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 4615-4619 (1997)).
팬 (Pan) 등은 "DR4"로 불리는 또다른 TNF 수용체과 구성원을 개시한 바 있다 (Pan et al., Science, 276: 111-113 (1997); see also W098/32856 publishedJuly 30,1998). DR4는 세포 자살 기구를 사용할 수 있는 세포질 사멸 도메인을 함유하는 것으로 보고되었다. 팬 (Pan) 등은 DR4가 Apo2L/TRAIL로 알려진 리간드에 대한 수용체인 것으로 생각된다고 개시하였다.
문헌 (Sheridan et al., Science, 277: 818-821 (1997) and Pan et al., Science, 277: 815-818 (1997))에는 Apo2L/TRAIL에 대한 수용체인 것으로 생각되는 또다른 분자가 기재되어 있다 (W098/51793 published November 19,1998; and W098/41629 published September 24,1998). 이 분자는 DR5로 불린다 (이 분자는 Apo-2, TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 또는 KILLER로도 불림) (Screaton et al., Curr. Biol., 7: 693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16: 5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17: 141-143 (1997); W098/35986 published August 20,1998; EP870, 827 published October 14,1998; W098/46643 published October 22,1998; W099/02653 published January 21,1999; W099/09165 published February 25,1999; and W099/11791 published March 11,1999). DR4와 마찬가지로, DR5는 세포질 사멸 도메인을 함유하고 아폽토시스를 신호전달할 수 있는 것으로 보고되어 있다. Apo2L/TRAIL와 DR5 사이에 형성된 결합체의 결정 구조는 문헌 (Hymowitz et al., Molecular Cell, 4: 563-571 (1999))에 기재되어 있다.
또다른 사멸 도메인-함유 수용체인 DR6가 최근에 확인되었다 (Pan et al., FEBS Letters, 431: 351-356 (1998)). 잠정적인 세포외 시스테인 풍부 도메인 및 세포질 사멸 도메인을 함유하는 것 이외에, DR6는 세포질 영역의 프롤린-풍부 모티프와 겹쳐지는 잠정적인 류신-지퍼 서열을 함유하는 것으로 생각된다. 프롤린-풍부 모티프는 많은 세포내 신호전달 분자에서 발견되는 src-상동-3 도메인에 결합하는 서열과 유사하다.
최근에 찾은 또다른 수용체군은 "유인 수용체"로 불리며, 이 수용체들은 신호 전달자보다는 억제제로 작용하는 것으로 생각된다. 이 수용체군에는 DcR1 (TRID, LIT 또는 TRAIL-R3로도 불림) (Pan et al., Science, 276: 111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277: 818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272: 25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416: 329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186: 1165-1170 (1997); and Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160: 3-6 (1998)) 및 DcR2 (TRUNDD 또는 TRAIL-R4로도 불림) (Marsters et al., Curr. Biol., 7: 1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424: 41-45 (1998); Degli Esposti et al., Immunity, 7: 813-820 (1997))이 포함되고, 상기 두 세포 표면 분자뿐 아니라 OPG (Simonet et al., supra; Emery et al., infra) 및 DcR3 (Pitti et al., Nature, 396: 699-703 (1998))도 분비되는 가용성 단백질이다.
추가로 새로 찾은 TNFR과 구성원에는 CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1 및 TNFL1이 포함된다 (Brojatsch et al., Cell, 87: 845-855 (1996); Montgomery et al., Cell, 87: 427-436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem., 272: 14029-14032 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6216-6221 (1997); Emery eta/., J. Biol. Chem., 273: 14363-14367 (1998); W099/04001 published January 28,1999; W099/07738 published February 18,1999; W099/33980published July 8, 1999).
테와리 (Tewari) 등에 의해 최근에 조사된 바와 같이, TNFR1, TNFR2 및 CD40은 전사 인자 NF-κB의 활성화를 통해 전구염증성 및 동시자극성 사이토킨, 사이토킨 수용체 및 세포 부착 분자의 발현을 조절한다 (Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop., 6: 39-44 (1996)). NF-κB는 보존된 Rel 영역을 함유하는 서브유닛을 갖는 이량체 전사 인자과의 원형체이다 (Verma et al., Genes Develop., 9: 2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14: 649-681 (1996)). NF-κB는 그의 잠재적 형태로 I-κB 억제제과의 구성원과 결합하고, 특정 자극에 반응한 I-κB의 불활성화시, 방출된 NF-κB는 핵으로 이동하고 이 핵에서 특정한 DNA 서열에 결합하여 유전자 전사를 활성화시킨다. 상술한 바와 같이, 현재까지 밝혀진 TNFR과는 세포내 사멸 도메인 영역을 포함하거나 포함하지 않는다. 사멸 도메인을 갖지 않는 몇몇 TNFR 분자, 예컨대, TNFR2, CD40, HVEM 및 GITR은 NF-κB 활성을 조절할 수 있다 (Lotz etal., J. Leukocyte Biol., 60: 1-7 (1996)).
사이토킨 및 그의 수용체들의 TNF과에 대한 검토를 위해서는 문헌 (Ashkenazi and Dixit, Science, 281: 1305-1308 (1998); Golstein, Curr. Biol., 7: 750-753 (1997); Gruss and Dower, supra, and Nagata, Cell, 88: 355-365 (1997))을 참고한다.
B 세포 표면 항원
림프구는 조혈 과정동안 골수에서 생성되는 많은 타입의 백혈구 중 하나이다. 림프구는 B 림프구 (B 세포) 및 T 림프구 (T 세포)로 나누어진다. 본원에서특히 관심있는 림프구는 B 세포이다.
B 세포는 골수 내에서 성숙하고 그의 세포 표면 상에서 항원-결합 항체를 발현하면서 골수를 떠난다. 천연 B 세포가 그의 막결합 항체에 특이적인 항원을 처음 만난 경우, 상기 B 세포는 신속히 분열되기 시작하고 그의 프로제니 (progeny)는 기억 B 세포 및 "혈장 세포"로 불리는 이펙터 세포로 분화된다. 기억 B 세포는 더 긴 수명을 갖고 본래의 모세포와 동일한 특이성을 갖는 막결합 항체를 계속 발현한다. 혈장 세포는 막결합 항체를 생산하지 못하지만 대신에 분비될 수 있는 형태로 항체를 생산한다. 분비된 항체는 체액성 면역의 주요 이펙터 분자이다.
CD20 항원 (인간 B-림프구-제한 분화 항원 Bp35로도 불림)은 전구-B 림프구 및 성숙 B 림프구 상에 위치한, 대략 35kD의 분자량을 갖는 소수성 막횡단 단백질이다 (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287 (1989); and Einfeld et al. EMBO J. 7 (3): 711-717 (1988)). 상기 항원은 90%를 초과하는 B 세포 비-호치킨 림프종 (NHL)에서도 발현되지만 (Anderson et al. Blood 63 (6): 1424-1433 (1984)), 조혈 줄기세포, 전구-B 세포, 정상 혈장 세포 또는 다른 정상 조직에서는 발견되지 않는다 (Tedder et al. J. Immunol. 135 (2): 973-979 (1985)). CD20은 세포 주기 개시 및 분화를 위한 활성화 과정의 초기 단계(들)를 조절하고 (Tedder et al., supra), 칼슘 이온 채널로서 작용할 수 있다 (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D : 195 (1990)).
B 세포 림프종에서 CD20이 발현되면, 이 항원은 이러한 림프종의 "표적화"에 대한 후보물질로 작용할 수 있다. 본질적으로, 상기 표적화는 다음과 같이 일반화할 수 있다: B 세포의 CD20 표면 항원에 특이적인 항체를 환자에게 투여한다. 이 항-CD20 항체는 정상 B 세포 및 악성 B 세포 둘 다의 CD20 항원에 특이적으로 결합하고, CD20 표면 항원에 결합된 항체는 종양발생성 B 세포의 파괴 및 소멸을 야기할 수 있다. 또한, 종양을 파괴할 수 있는 잠재력을 갖는 화학물질 또는 방사성 표지를 항-CD20 항체에 결합시켜 상기 화학물질 또는 방사성 표지가 종양발생성 B 세포에 특이적으로 "전달되도록" 할 수 있다. 방법과는 관계없이, 주요 목적은 종양을 파괴하는 것이고, 구체적인 방법은 사용할 특정 항-CD20 항체에 따라 결정할 수 있으므로, CD20 항원을 표적화시키는 데 이용할 수 있는 방법은 매우 다양할 수 있다.
CD19는 B 세포 계통의 세포의 표면 상에서 발현되는 또다른 항원이다. CD20과 마찬가지로, CD19는 줄기 세포 단계로부터 혈장 세포로의 말기 분화 직전의 시점까지 세포 계통의 분화 전체에 걸쳐 세포 상에서 발견된다 (Nadler, L. Lymphocyte Typing ll2 : 3-37 and Appendix, Renling et al. eds. (1986) by Springer Verlag). 그러나, CD20과는 달리, CD19와 항체의 결합은 CD19 항원의 내재화를 초래한다. CD19 항원은 다른 것들 중에서 HD237-CD19 항체 ("B4" 항체로도 불림)에 의해 확인된다 (Kiesel et al. Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)). CD19 항원은 말초혈, 비장, 림프절 또는 편도선으로부터 단리된 4-8%의 말초혈 단핵 세포 및 90%를 넘는 B 세포 상에 존재한다. CD19는 말초혈 T 세포, 단핵구 또는 과립구 상에서는 검출되지 않는다. 실질적으로 모든 비-T 세포 급성 림프아세포 백혈병 (ALL), B 세포 만성 림프구 백혈병 (CLL) 및 B 세포 림프종은 항체 B4에의해 검출될 수 잇는 CD19를 발현한다 (Nadler et al. J. Immunol. 131: 244 (1983); and Nadler et al., in Progress in Hematology Vol. XII pp. 187-206. Brown, E. ed. (1981) by Grune & Stratton, Inc).
B 세포 계통의 세포에 의해 발현되는 분화 단계 - 특이적 항원을 인식하는 다른 항체도 찾았다. 이들 중에는 CD21 항원에 특이적인 B2 항체, CD22 항원에 특이적인 B3 항체, 및 CD10에 특이적인 J5 항체 (CALLA로도 불림)가 있다. 1997년 1월 21일 허여된 미국 특허 제5,595,721호 (Kaminski et al.)를 참조한다.
리툭시마브 (리툭산 (RITUXAN); 등록상표) 항체는 CD20 항원에 특이적인, 유전공학적으로 개조된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 리툭시마브는 1998년 4월 7일 허여된 미국 특허 제5,736,137호에서 "C2B8"로 불린 항체이다 (Anderson et al.). 리툭산 (등록상표)은 재발성 또는 난치성 저급 또는 여포성 CD20 양성 B 세포 비-호치킨 림프종을 앓는 환자의 치료를 위한 것이다. 작용 연구의 시험관내 메카니즘은 리툭산 (등록상표)이 인간 보체에 결합하고 CDC를 통해 림프성 B 세포주를 용해시킨다는 것을 입증한 바 있다 (Reff et al. Blood 83 (2): 435-445 (1994)). 또한, 리툭산은 ADCC에 대한 분석에서 상당한 활성을 나타낸다. 보다 최근에, 리툭산은 삼중수소 처리된 티미딘 삽입 분석에서 항-증식 효과를 나타내고 아폽토시스를 직접 유도하지만, 다른 항-CD19 및 항-CD20 항체는 항-증식 효과도 나타내지 못하고 아폽토시스도 유도하지 못하는 것으로 밝혀진 바 있다 (Maloney et al., Blood 88 (10): 637a (1996)). 리툭산과 화학요법 및 독소 사이의 상승작용도 실험적으로 관찰되었다. 구체적으로, 리툭산은 약물 내성 인간 B세포 림프종 세포주가 독소루비신, CDDP, VP-16, 디프테리아 독소 및 리신의 세포독성 효과에 민감하도록 한다 (Demidem et al. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3): 177-186 (1997)). 생체내 임상전 연구는 리툭산이 짐작컨대 보체- 및 세포-매개 과정을 통해 시아노몰구스 원숭이의 말초혈, 림프절 및 골수로부터 B 세포를 고갈시킨다는 것을 밝힌 바 있다 (Reff et al. Blood 83 (2): 435-445 (1994)).
발명의 요약
본 발명은 항체의 폴리펩티드쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생산될 수 있는, 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체 (예를 들어, 4가 항체)를 제공한다. 한 실시양태에서, 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함하거나 Fc 영역 또는 힌지 영역으로 구성되어 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 이량체화 도메인 및 그의 아미노 말단에 있는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 Fc 영역, 및 이 영역의 아미노-말단에 있는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 본 명세서에서 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위 (일반적으로 본원에서 확인된 바와 같이 모두 "기능"을 가짐)을 포함하거나 상기 항원 결합 부위로 구성되어 있다. 한 실시양태에서, 다가 항체는 5개 이상 (예를 들어, 약 8개 이하)의 항원 결합 부위를 포함한다. 본 명세서에서 다가 항체는 천연 서열 IgA 또는 IgM이 아닌 것이 바람직하고, Fc 영역을 갖지 않거나 하나의 Fc 영역만을 가질 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 다가 항체는 하나 이상의 폴리펩티드쇄 (바람직하게는 두 개의 폴리펩티드쇄)를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩티드쇄(들)은 2개 이상의 가변 도메인들을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드쇄(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있는데, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역으로 구성된 한 폴리펩티드쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드쇄(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역쇄; VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역쇄; VL-CL-가요성 링커-VL-CL-Fc 영역쇄; 또는 VL-CL-VL-CL-Fc 영역쇄를 포함할 수 있다. 폴리펩티드쇄 (또는 폴리펩티드쇄들)이 Fd-가요성 링커-Fd를 포함하는 경우, 가요성 링커는 gly-ser, gly-ser-gly-ser (서열 10), ala-ser 또는 gly-gly-gly-ser (서열 11)과 같은 펩티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 다가 항체는 두 개 이상 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 다가 항체는 예를 들어, 두 개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 본 명세서에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
본 명세서에서 다가 항체는 무엇보다도 치료적인 관점에서 바람직한 성질을 갖는다. 예를 들어, 다가 항체는 (1) 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 빨리 내재화될 수 있고(있거나 이화될 수 있고); (2) 아고니스트 항체일 수 있고(있거나); (3) 다가 항체가 결합될 수 있는 항원을 발현하는 세포의 세포 사멸 및(또는) 아폽토시스를 유도할 수 있다. 다가 항체의 1종 이상의 항원 결합 특이성을 제공하는 "모항체"는 항체가 결합되는 항원을 발현하는 세포에 의해 내재화되고(되거나 이화되는) 항체일 수 있고(있거나), 아고니스트, 세포 사멸 유도 항체 및(또는) 아폽토시스 유도 항체일 수 있고, 본 명세서에 기재된 항체의 다가 형태는 이러한 성질들 중 하나 이상의 성질에서의 개선을 나타낼 수 있다. 더욱이, 모항체는 이러한 성질들 중 어느 하나 이상의 성질을 가지고 있지 않을 수 있으나, 본 명세서에 기재된 다가 항체로서 해석되는 경우 상기 성질들을 부여받을 수 있다.
본원의 다가 항체의 3개 이상의 항원 결합 부위는 모두 동일한 항원에 결합할 수 있거나, 두 가지 이상 (예컨대, 2가지 내지 약 3가지)의 다양한 항원에 결합할 수 있다.
다가 항체는 (1) 종양 세포에 의해 발현되는 (또는 과발현되는) 세포 표면 단백질, 예를 들어, 상피 성장인자 수용체 (EGFR), HER2 수용체, HER3 수용체, HER4 수용체 또는 DcR3; (2) 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 상과에 속하는 수용체 (예를 들어, DR4, DR5, DcR1 또는 DcR2와 같은 Apo2L 수용체); 및(또는) (3) B 세포 표면 항원 (예컨대, CD19, CD20, CD22 또는 CD40)에 결합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 다가 항체의 모든 기능성 항원 결합 부위는 상기 나열한 것과 동일한 항원에 결합한다 (예를 들어, 4가 항체의 4개 항원 결합 부위 모두가상기 (1), (2) 또는 (3)에 결합함).
본 발명은 세포독성제에 결합된 다가 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트도 제공한다. 본 명세서에서 세포독성제는 일단 내재화되었을 때 세포를 사멸시키는 데 있어서 활성적인 물질일 수 있다.
또한, 본 발명은 VD1-(X1)n-VD2(X2)n-Fc를 포함하는 폴리펩티드쇄에 관한 것으로, 여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역으로 구성된 한 폴리펩티드쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드쇄는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역쇄; VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역쇄; VL-CL-가요성 링커-VL-CL-Fc 영역쇄; 또는 VL-CL-VL-CL-Fc 영역쇄를 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드쇄는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-이량체화 도메인; VH-CH1-VH-CH1-이량체화 도메인; VL-CL-가요성 링커-VL-CL-이량체화 도메인; 또는 VL-CL-VL-CL-이량체화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드쇄는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-힌지 영역; VH-CH1-VH-CH1-힌지 영역을 포함할 수 있다. 본 발명은 이러한 폴리펩티드쇄를 하나 이상 (바람직하게는 2개) 포함하는 항체도 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 2개 이상 (바람직하게는 4개)의 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 폴리펩티드도 포함하는데, 여기서 상기 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 VL-CL를 포함하고, 중쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 VH-CH1를 포함한다.
본 발명은 3개 이상의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄도 제공하는데, 여기서 상기 가변 도메인 각각은 3개 이상의 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 폴리펩티드와 결합하여 3개 이상의 항원 결합 부위를 형성하고, 각 항원 결합 부위는 동일한 항원에 대해 유도된 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드쇄를 포함하는 단리된 항체도 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드쇄가 3개 이상의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 경우, 항체는 바람직하게는 중쇄 가변 도메인과 결합하여 3개 이상의 항원 결합 부위를 형성하는 3개 이상의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드도 포함한다. 이러한 항체의 예는 도 23D (3개의 항원 결합 부위가 있음) 및 도 23E (4개의 항원 결합 부위가 있음)에 기재되어 있다. 또한, 본 발명은 식 (a) VL-CL-가요성 링커-VL-CL-가요성 링커-VL-CL; (b) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1; (c) (VL-CL)n(여기서, n은 3 이상임); 또는 (d) (VH-CH1)n(여기서, n은 3 이상임)을 포함하는 폴리펩티드쇄를 제공한다.
본 발명은 다가 항체 또는 폴리펩티드쇄를 코딩하는 단리된 핵산; 다가 항체 또는 폴리펩티드쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 (임의로, 상기 핵산은 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있음); 다가 항체 또는 폴리펩티드쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 (예를 들어, 상기 핵산으로 형질전환된) 숙주 세포; 상기 숙주 세포를 배양하여 핵산이 발현되도록 하고 임의로 상기 숙주 세포 배양물 (예컨대, 숙주 세포 배양 배지)로부터 다가 항체 또는 폴리펩티드쇄를 회수하는 것을 포함하는, 다가 항체 또는 폴리펩티드쇄의 제조 방법도 제공한다. 다가 항체의 (1) 중쇄 가변 도메인 및 (2) 경쇄 가변도메인을 코딩하는 핵산은 상기 (1) 및 (2) 둘 다로 형질전환된 숙주 세포에 의해 동시 발현되는 것이 바람직하다. 상기 핵산 (1) 및 (2)는 동일하거나 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
본 명세서에 개시된 다가 항체의 진단 및 치료 용도도 고려된다. 한 진단 분야에서, 본 발명은 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 다가 항체에 노출시키고, 상기 다가 항체와 샘플의 결합을 측정하는 것을 포함하는, 원하는 항원의 존재를 확인하는 방법을 제공한다. 시험관내 및 생체내 진단 방법도 제공한다.
한 치료 분야에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 치료 유효량의 다가 항체 또는 상기 다가 항체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 특정 질환 또는 장애를 앓거나 앓기 쉬운 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서 치료할 질환은 암일 수 있고, 이 경우 상기 방법은 치료 유효량의 세포독성제를 포유동물에게 투여하는 것도 포함할 수 있다. 본 발명은 암세포를 본 명세서에 기재된 다가 항체에 노출시키는 것을 포함하는, 암세포의 아폽토시스를 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 다가 항체는 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 상과 중 한 수용체에 결합한다. 상기 방법은 B 세포 표면 항원에 결합하는 다가 항체에 B 세포를 노출시킴으로써 B 세포를 사멸시키는 것을 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 방법은 ErbB 수용체를 발현하는 (또는 과발현하는) 세포를 ErbB 수용체에 결합하는 항체에 노출시키는 것을 포함하는, 상기 세포를 사멸시키는 것에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 개조된 항체 및 이러한 개조된 항체의 치료 용도와 같은 용도에 관한 것이다.
도 1은 천연 IgG 및 (1) 파파인으로 절단하여 얻은 두 개의 Fab 단편 및 Fc 영역 또는 (2) 펩신으로 절단하여 얻은 F(ab')2단편 및 다수의 소단편을 나타낸다. 이황화 결합은 CH1 도메인 및 CL 도메인과 두 개의 CH2 도메인 사이에 선으로 표시되어 있다. V는 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, L은 경쇄를 나타내고, H는 중쇄를 나타낸다.
도 2A-E는 5가지 주요 천연 발생 이뮤노글로불린 이소타입 IgG (도 2A), IgD (도 2B), IgE (도 2C), IgA 이량체 (도 2D) 및 IgM 오량체 (도 2E)의 구조를 나타낸다.
도 3은 천연 서열 IgG Fc 영역의 배열을 나타낸다. 천연 서열 인간 IgG Fc 영역 서열 humlgG1 (비-A 및 A 동종이형 (allotype)) (각각 서열 1 및 2), humlgG2 (서열 3), humlgG3 (서열 4) 및 humlgG4 (서열 5)가 기재되어 있다. 인간 IgG1 서열은 비-A 동종이형이고, 이 서열과 A 동종이형 사이의 차이 (위치 356 내지 358에서의 차이; EU 번호부여 시스템)는 인간 IgG1 서열 아래에 기재되어 있다. 천연 뮤린 IgG Fc 영역 서열 murlgG1 (서열 6), murlgG2A (서열 7), murlgG2B (서열 8) 및 murlgG3 (서열 9)도 기재되어 있다.
도 4A-B에는 본 발명에 따른 4가 항체가 도시되어 있다. 도 4A에서, 4개의 항원 결합 Fab에 번호가 부여되어 있고 (4가 항체의 각 아암 (arm)에 대해 1 및 2), X는 이량체화 도메인을 나타낸다. 도 4B에서, 4가 항체의 이량체화 도메인은 Fc 영역이다.
도 5에는 실시예 1의 4가 항-HER2 항체 (OctHER2)의 발현에 사용되는 제작물이 도시되어 있다.
도 6A-C에는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)를 이용하여 측정할 때 OctHER2 (도 6A); 293 세포에 의해 발현되는 2가 IgG1 rhuMAb 4D5-8 (도 6B); 및 바이알 HERCEPTIN (등록상표) (차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 발현됨) (도 6C)과 HER2 세포외 도메인 (ECD)의 결합이 나타나 있다.
도 7에는 HER2 ECD와 OctHER2의 결합을 한외원심분리 분석으로 분석한 것이 도시되어 있다. 평균 분자량 (이론치 또는 실험치) 대 HER2 ECD에 대한 OctHER2의 몰비가 기재되어 있다. 4개의 완전한 기능성 항원 부위를 갖는 4가 항체로 추정되는 항체의 이론적으로 계산된 평균 분자량은 원형으로 나타내었고, 3개의 완전한 기능성 항원 부위를 갖는 4가 항체로 추정되는 항체의 이론적으로 측정된 평균 분자량은 정사각형으로 나타내었고, 삼각형은 실험적으로 측정된 분자량을 나타낸다.
도 8A-D에는 SKBR3를 (3+ HER2를 과발현함) (도 8A), MDA361 (2+ HER2를 과발현함) (도 8B), BT474 (3+ HER2를 과발현함) (도 8C) 및 MCF7 (0+ HER2를 발현함) (도 8D) 세포주를 사용하여 OctHER2와 비교한 HERCEPTIN (등록상표)의 생장 억제 활성이 기재되어 있다.
도 9에는 MDA231 세포 (1+ HER2를 과발현함) 또는 SKBR3 (3+ HER2를 과발현함)을 사용할 때 4가 항-HER2 항체의 생장 억제 활성에 대한 가요성 링커의 효과가 기재되어 있다.
도 10A-B는 MDA453 세포 (2+ HER2를 과발현함) 또는 SKBR3 (3+ HER2를 과발현함) 세포주를 사용하여 HERCEPTIN (등록상표) (도 10B)의 내재화/이화에 대한 OctHER2 내재화/이화의 비율을 비교한 것이다.
도 11A-I는 OctHER2의 내재화를 보여주는 전자 현미경 사진이다. 도 11A-F는 SKBR3 세포에서125I-OctHER2의 세포내 위치를 나타낸다. 오토래디오그래프성 은 입자가 첨단 세포막의 융모 (도 11A), 형성 코팅 소와 근처 (도 11B, 화살표), 매끄러운 세포질 소포 (도 11C 및 11D) 및 엔도좀 (도 11E 및 11F)와 결합되어 있는 것으로 관찰되었다. 막대 = 0.25μM. 도 11G-I는 0시간 (도 11 G) 및 5시간 (도 11H 및 11I)에서의 내재화를 나타낸다.
도 12A-E는 비암세포주 대조구인 HUMEC (도 12E)와 비교할 때, 암세포주 COLO 205 (도 12A), SK-MES-1 (도 12B), HCT116 (도 12C) 및 HOP 92 (도 12D) 상에 있는 항-DR5 4가 항체 (16E2 옥토퍼스), 항-DR5 이가 IgG 항체 (16E2 IgG) 및 Apo2L/TRAIL (Apo2L)에 의해 유도된 아폽토시스를 나타낸다.
도 13A-D는 아폽토시스 세포를 검출하기 위해 염색한 조직학적 슬라이드이다. 16E2 옥토퍼스 또는 Apo2L/TRAIL로 처리된 마우스로부터 얻은 종양 조직을 10% 포르말린으로 고정시킨 후, 파라필름 내로 포매하고 절편으로 만들어 슬라이드 상에 놓은 후, 이 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 400X 배율 하에 관찰하였다. 6시간 및 24시간에서 16E2 옥토퍼스의 효과는 각각 도 13A 및 13B에 나타나 있고, 대조구-처리 세포는 도 13C에, Apo2L/TRAIL-처리 세포는 도 13D에 나타나 있다.
도 14는 흉선절개 누드 마우스 내의 COLO 205 종양에 대한 Apo2L/TRAIL (60mg/kg, 5x/주), 3H3 2가 IgG (0, 3, 5 및 9일에 5mg/kg씩 투여함), 16E2 2가 IgG (16E2) (0, 3, 5 및 9일에 5mg/kg씩 투여함) 및 16E2 옥토퍼스 (0, 3, 5 및 9일에 5mg/kg씩 투여함)의 생체내 활성을 나타낸다.
도 15는 Apo2L 표준 양성 대조구와 비교할 대 마우스 연구에서 사용된 물질 (Apo2L/TRAIL 및 16E2 옥토퍼스)의 아폽토시스 활성을 확인시켜주는 알라마르블루 (alamarBlue) 시험관내 분석을 나타낸다. 마우스 연구에서 음성 대조구로 사용된 항-IgE 항체 (E25)는 아폽토시스 활성을 갖지 않는 것으로 확인되었다.
도 16은 항-DR5 3H3 옥토퍼스와 항-DR5 16E2 옥토퍼스의 다양한 배치를 비교하는 크리스탈 바이올렛 아폽토시스 분석의 결과를 나타낸다.
도 17A-B는 5% 소태아 혈청 (FBS)의 존재 하에 SK-MES-1 (도 17A) 및 Jurkat (도 17B) 세포를 항-FLAG 항체 (W097/25428)에 의해 가교결합된 FLAG 에피토프-태그가 있는 Apo2L/TRAIL (W097/25428), 항-DR5 3H3 옥토퍼스 항체, 항-DR5 16E2 옥토퍼스 항체 및 Apo2L/TRAIL로 처리한 알라마르블루 아폽토시스 분석의 결과를 나타낸다.
도 18A-C는 Apo2L/TRAIL (아래 그래프)와 비교할 때, 처리한 2일째에 백혈병, 비-소세포 폐암, 결장암, 중추신경계(CNS)암, 흑색종, 난소암, 신장암, 전립선암 및 유방암 인간 종양 세포주의 생장에 대한 항-DR5 16E2 (위 그래프)의 효과를 나타내는 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 결과는 NCIDTP (National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program)로부터 얻었다. 모든 샘플은 원액(16E2 옥타포스 원액 0.2mg/ml)의 1%부터 시작하여 4 x 0.5 log 희석하면서 5종의 농도에서 시험하였다.
도 19A-C는 Apo2L/TRAIL (아래 그래프)와 비교할 때, 처리한 6일째에 백혈병, 비-소세포 폐암, 결장암, 중추신경계(CNS)암, 흑색종, 난소암, 신장암, 전립선암 및 유방암 인간 종양 세포주의 생장에 대한 항-DR5 16E2 (위 그래프)의 효과를 나타내는 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 결과는 NCIDTP (National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program)로부터 얻었다. 모든 샘플은 원액 (16E2 옥타포스 원액 0.2mg/ml)의 1%부터 시작하여 4 x 0.5 로그씩 희석하면서 5종의 농도에서 시험하였다.
도 20A-B에는 생장 억제 (GI50), 생장 정지 (TGI) 및 독성 (LC50)을 분석하기 위해 항-DR5 16E2 옥토퍼스 (도 20A)와 Apo2L/TRAIL (도 20B)를 비교하여 NCIDTP (National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program)로부터 얻은 2일째 시험관내 결과의 정량적 요약이 기재되어 있다.
도 21A-B는 생장 억제 (GI50), 생장 정지 (TGI) 및 독성 (LC50)을 분석하기 위해 항-DR5 16E2 옥토퍼스 (도 21A)와 Apo2L/TRAIL (도 21B)를 비교하여 NCIDTP (National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program)로부터 얻은 6일째 시험관내 결과의 정량적 요약이 기재되어 있다.
도 22에는 항-CD20 항체 리툭산 (등록상표), 항-인간 IgG와 교차 결합된 리툭산 (등록상표) (리툭산-IgG) 및 4가 항-CD20 항체 (OctCD20)에 의한 Wil-2 세포의 아폽토시스가 나타나 있다.
도 23A-E는 천연 IgG (도 23A)와 비교할 때 전장 옥토퍼스/4가 항체 (도 23B), 옥토퍼스 F(ab')2(도 23C), POPoct-3 Fab (도 23D) 및 POPoct-4 Fab (도 23E)를 나타내는 그림이다. 항-CD20 (C2B8) 옥토퍼스 단백질의 트리스-글리신 겔을 코마시에 블루로 염색한 결과로부터 비-환원 조건 하에서 무손상 항체의 크기를 비교하고 (도 23F), 이황화 결합이 파괴되어 중쇄와 경쇄가 분리되는 환원 조건 하에서 중쇄의 크기를 비교한다 (도 23G).
도 24에는 옥토퍼스 F(ab')2골격의 구조가 나타나 있다. 임의의 VH/CH1 영역은 BamHl, Nhel 및 BspEl 제한효소 부위를 통해 F(ab')2골격내로 치환될 수 있다.
도 25에는 POPoct-3 중쇄의 구조가 나타나 있다.
도 26에는 POPoct-4 중쇄의 구조가 기재되어 있다.
도 27에는 BT474 세포를 사용한 세포증식억제 분석에 있어서 다가 항-HER2 항체의 활성이 기재되어 있다.
도 28A-B에는 SKBR3 세포를 사용한 세포증식억제 분석에 있어서 다가 항-HER2 항체의 활성이 기재되어 있다. 도면은 n = 4 세포증식억제 분석의 대표적인 도면이다.
도 29A-B는 SKBR3 세포 (도 29A) 및 BT474 세포 (도 29B)에서 다가 항-HER2 항체의 내재화 능력을 나타낸다.
도 30A-B는 다가 항-DR5 항체에 의한 COL0205 세포의 아폽토시스를 나타낸다.
도 31A-B는 캐스파제 경로를 통한 다가 항-DR5 항체의 신호전달을 나타낸다.
도 32는 IgG 가교 결합 리툭산 (등록상표) (리툭산-IgG) 및 IgG 가교 결합 OctCD20 (OctCD20-IgG)에 의해 유도된 아폽토시스를 비교한 것이다.
도 33은 다가 항-CD20 항체, IF5 항-CD20 항체 (Clark et al. PNAS (USA) 82: 1766-1770 (1985)) 및 IgG 가교 결합 IF5 항체 (IF5 + IgG-X)에 의한 WIL2 세포의 아폽토시스를 나타낸다.
도 34는 IF5 항-CD20 항체, IgG 가교 결합 IF5 항체 및 POPoct-3 CD20에 의해 유도된 WIL2S 세포의 동형 세포 부착을 나타낸다.
도 35는 DB, WIL2 및 라모스 B 세포 림프종 세포주에 대한 리툭산 또는 OctCD20의 내재화/이화를 나타낸다.
<바람직한 실시양태의 상세한 설명>
1. 정의
본원의 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 이뮤노글로불린 중쇄에 있는 잔기의 번호부여는 본 명세서에 그 내용이 포함되는 것으로 하는 문헌 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))에 기재된 EU 지수의 번호부여이다. "카바트 (Kabat)에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호부여를 말한다.
"ErbB 수용체"는 ErbB 수용체과에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나제이고, EGFR, HER, ErbB3 및 ErbB4 수용체뿐만 아니라, TEGFR (미국 특허 제5,708,156호) 및 앞으로 동정될 상기 과의 기타 구성원이 포함된다. 이러한 ErbB 수용체는 일반적으로 ErbB 리간드와 결합할 수 있는 세포외 도메인; 친지성 막횡단 도메인; 보존된 세포내 티로신 키나제 도메인; 및 인산화될 수 있는 수 개의 티로신 잔기를 갖는 카르복실-말단 신호전달 도메인을 포함할 것이다. 상기 ErbB 수용체는 천연 서열 ErbB 수용체 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 ErbB 수용체는 천연 서열 인간 ErbB 수용체이다.
"ErbB 리간드"란 ErbB 수용체에 결합하고(하거나) ErbB를 활성화시키는 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 특히 관심있는 ErbB 리간드는 천연 서열 인간 ErbB 리간드, 예를 들면 상피 성장인자 (EGF) [Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)]; 형질전이 성장인자 알파 (TGF-알파) [Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)]; 신경초종 또는 각질세포 자가분비 성장인자로서도 공지되어 있는 앰피레귤린 [Shoyab et al., Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature 348:257-260 (1990); and Cook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)]; 베타셀룰린 [Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); and Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)]; 헤파린-결합성 상피 성장인자 (HB-EGF) [Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)]; 에피레귤린 [Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); and Komurasaki et al., Oncogene 15:2841-2848 (1997)], 헤레귤린 [하기 참조]; 뉴레귤린-2 (NRG-2)[Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)]; 뉴레귤린-3 (NRG-3) [Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)]; 또는 크립토 (CR-1) [Kannan et al., J. Biol. Chem. 272 (6):3330-3335 (1997)]이다. EGFR과 결합하는 ErbB 리간드에는 EGF, TGF-알파, 앰피레귤린, 베타셀룰린, HB-EGF 및 에피레귤린이 포함된다. HER3과 결합하는 ErbB 리간드에는 헤레귤린이 포함된다. HER4와 결합할 수 있는 ErbB 리간드에는 베타셀룰린, 에피레귤린, HB-EGF, NRG-2, NRG-3 및 헤레귤린이 포함된다.
본 명서서에 사용된 "헤레귤린" (HRG)은 미국 특허 제5,641,869호 및 문헌 (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993))에 개시된 헤레귤린 유전자 생성물에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 이 폴리펩티드의 생물 활성 변이체를 말한다. 헤레귤린의 예에는 헤레귤린-알파, 헤레귤린-베타1, 헤레귤린-베타2 및 헤레귤린-베타3 (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); and U. S. Patent No. 5,641,869); neu 분화 인자 (NDF) (Peles et al. Cell 69 : 205-216 (1992)); 아세틸콜린 수용체-유도 활성 (ARIA) (Falls et al. Cell 72 : 801-815 (1993)); 아교 성장인자 (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)); 감각 및 운동 신경 유래의 인자 (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)); 감마-헤레귤린 (Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997))이 포함된다. 천연 서열 HRG 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편/아미노산 서열 변이체의 예는 EGF-유사 도메인 단편 (예: HRG베타1177-244)이다.
본 명세서에서 "ErbB 헤테로-올리고머"는 2개 이상의 상이한 ErbB 수용체를 포함하는 비공유적으로 결합된 올리고머이다. 이러한 결합체는 둘 이상의 ErbB 수용체를 발현하는 세포가 ErbB 리간드에 노출되는 경우에 형성될 수 있고, 예를 들면 문헌 [Sliwkowski et al. J. Biol. Chem., 269 (20):14661-14665 (1994)]에 기재된 바와 같이 면역침전에 의해 단리하여 SDS-PAGE로 분석할 수 있다. 이러한 ErbB 헤테로-올리고머의 예로는 EGFR-HER2, HER2-HER3 및 HER3-HER4 결합체가 있다. 또한, 이러한 ErbB 헤테로-올리고머는 상이한 ErbB 수용체, 예를 들면 HER3, HER4 또는 EGFR와 결합된 둘 이상의 HER2 수용체를 포함할 수 있다. 사이토킨 수용체 서브유닛 (예: gp 130)과 같은 기타 단백질도 헤테로-올리고머에 포함될 수 있다.
용어 "ErbB1", "상피 성장인자 수용체" 및 "EGFR"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 예를 들면 문헌 [Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)]에 기재된 바와 같은 천연 서열 EGFR을 및 그의 천연 돌연변이체 형태 [예를 들면, 문헌 (Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990))에 기재된 바와 같은 결실 돌연변이체 EGFR]를 말한다.erbB1은 EGFR 단백질 생성물을 코딩하는 유전자를 말한다. EGFR에 결합하는 항체의 예에는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 제4,943,533호, Mendelsohn et al.) 및 그의 변이체, 예컨대, 키메라 225 (C225) 및 재구성 인간 225 (H225) (WO 96/40210, Imclone Systems Inc.)가 포함된다.
"ErbB2" 및 "HER2"란 표현은 본원에 상호교환적으로 사용되고, 예를 들면 문헌 [Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-8501 (1985) and Yamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986)]에 기재된 천연 서열 인간 HER2 단백질 (진뱅크 승인번호 X03363) 및 그의 변이체를 말한다. 용어 "erbB2"는 인간 HER2를 코딩하는 유전자를 말하고, "neu"는 래트의 p185neu를 코딩하는 유전자를 말한다. 바람직한 HER2는 천연 서열 인간 HER2이다. HER2와 결합하는 항체의 예로는 MAbs 4D5 (ATCC CRL 10463), 2C4 (ATCC HB-12697), 7F3 (ATCC HB-12216) 및 7C2 (ATCC HB-12215)가 있다 [미국 특허 제5,772,997호; WO 98/77797; 및 미국 특허 제5,840,525호 참조]. 인간화 항-HER2 항체로는 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (헤르셉틴 (등록상표)) [미국 특허 제5,821,337호의 표 3에 기재된 바와 같음]; 인간화 520C9 (WO 93/21319)가 있다. 인간 항-HER2 항체는 미국 특허 제5,772,997호 (1998. 6. 30자로 허여됨) 및 WO 97/00271 (1997. 1. 3자로 공개됨)에 기재되어 있다.
"ErbB3" 및 "HER3"는 예를 들면, 미국 특허 제5,183,884호 및 제5,480,968호 뿐만 아니라 문헌 [Kraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)]에 기재된 바와 같은 수용체 폴리펩티드, 및 그의 변이체를 말한다. HER3와 결합하는 항체의 예, 예를 들면 8B8 항체 (ATCC HB 12070) 또는 그의 인간화 변이체가 미국 특허 제5,968,511호 (Akita and Sliwkowski)에 기재되어 있다.
용어 "ErbB4" 및 "HER4"는 예를 들면, 문헌 [EP Pat Appln No 599,274;Plowman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750 (1993); and Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)]에 기재된 바와 같은 수용체 폴리펩티드, 및 WO 99/19488에 기재된 HER4 이소폼과 같은 그의 변이체를 말한다.
본 명세서에서, "B 세포 표면 마커"는 결합되는 항체로 표적화될 수 있는 B 세포의 표면 상에서 발현되는 항원이다. B 세포 표면 마커의 예에는 CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 마커가 포함된다. 특히 관심있는 B 세포 표면 마커는 포유동물의 다른 비-B 세포 조직과 비교할 때 B 세포 상에서 선택적으로 발현되고, 전구 B 세포 및 성숙 B 세포 상에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 마커는 CD20 또는 CD19처럼 줄기세포 단계부터 혈장 세포로의 말기 분화 직전의 시점까지 계통의 분화 전체를 통해 B 세포 상에서 발견되는 것이다. 본 명세서에서 바람직한 B 세포 표면 마커는 CD19, CD20, CD22 및 CD40이다.
"CD20" 항원은 말초혈 또는 림프성 기관의 B 세포의 90%를 넘는 B 세포의 표면 상에서 발견되는 약 35 kDa의 비-글리코실화 인단백질이다. CD20은 초기 전구-B 세포 발단 단계동안 발현되고 혈장 세포가 분화할 때까지 남아있다. CD20은 정상 B 세포 및 악성 B 세포 둘 다에 존재한다. 문헌에서 CD20의 다른 명칭에는 "B 림프구-제한 항원" 및 "Bp35"가 포함된다. CD20 항원은 예를 들어, 문헌 (Clark et al. PNAS (USA) 82: 1766 (1985))에 기재되어 있다. CD20 항원에 결합하는 항체의 예에는 현재 "리툭시마브" ("리툭산 (등록상표)) (본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 특허 제5,736,137호)로 불리는 "C2B8"; "Y2B8"로 지칭되는 이트륨-[90]-표지 2B8 뮤린 항체 (본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 특허 제5,736,137호); 임의로 "131I-B1" 항체 (BEXXAR(상표명))를 생성하기 위해131I로 표지한 뮤린 IgG2a (본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 특허 제5,595,721호); 뮤린 모노클로날 항체 "1F5" (Press et al. Blood 69 (2): 584-591 (1987)); "키메라 2H7" 항체 (본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 특허 제5,677,180호); 및 국제 백혈구 타이핑 워크숍으로부터 얻을 수 있는 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))가 포함된다.
"CD19" 항원은 예를 들어, HD237-CD19 또는 B4 항체에 의해 확인된 약 90 kDa의 항원을 말한다 (Kiesel et al. Leukemia Research 11, 12: 1119 (1987)). CD20처럼 CD19는 줄기세포 단계부터 혈장 세포로의 말기 분화 직전의 시점까지 계통의 분화 전체를 통해 B 세포 상에서 발견된다. CD19와 항체의 결합은 CD19 항원의 내재화를 야기할 수 있다. CD19 항원에 결합하는 항체의 예에는 문헌 (Hekman et al. Cancer Immunol. Immunother. 32: 364-372 (1991) and Vlasveld et al, Cancer Immunol. Immunother. 40: 37-47 (1995))에 기재된 항-CD19 항체 및 문헌 (Kiesel et al. Leukemia Research 11, 12: 1119 (1987))에 기재된 B4 항체가 포함된다.
"CD22" 항원은 약 140,OOOkD의 분자량을 갖는다. CD22는 초기 전구-B 세포및 원시세포의 세포질에서 발현되고, 성숙 B 세포 및 비-호치킨 림프종 (NHL) 세포 의 표면에서만 보이고, 혈장 세포 단계 전의 말기 분화 과정동안 세포 및 세포질 둘 다로부터 사라진다. 항-CD22 항체의 예는 문헌 (uweid et al. Cancer Research 55: 5899-5907 (1995))에 기재된 LL2 항체 및 그의 키메라/인간화 변이체이다.
"CD40" 항원은 B 세포, B 세포 악성종양, 여포성 수상세포, 기저상피세포 및 암종을 포함하는 다양한 유형의 세포 상에서 발현되는 세포 표면 인산화 당단백질이다. CD40은 CD40 리간드 (CD40L)에 결합한다. B 세포 표면 항원인 것 이외에, CD40은 TNF 수용체 상과의 구성원이기도 하다. CD40에 결합하는 항체의 예에는 (1) CD40/CD40L 상호작용을 방해하고 항-종양발생성을 갖는 항체 (Armitage et aL.,미국 특허 제5,674,492호); (2) CD40을 통한 신호전달을 길항하는 항체 (deBoer et al., 미국 특허 제5,677,165호); (3) CD40을 통한 자극성 신호를 전달하지만 CD40과 CD40L 사이의 상호작용을 증가시키지 못하는 항체, 예를 들어, G28-5 (Ledbetter et al., 미국 특허 제5,182,368호); (4) CD40과 CD40L 사이의 상호작용을 증가시키는 항체, 예를 들어, CD40.4 (5C3) (PharMingen, San Diego, California) 및 S2C6 (1999년 5월 25일 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC), (Manassass, Virginia)에 기탁됨, 기탁번호 PTA-110)가 포함된다.
본 명세서에서 "종양 괴사 인자 수용체 상과" 또는 "TNF 수용체 상과"는 TNF과의 사이토킨에 의해 결합되는 수용체 폴리펩티드를 말한다. 일반적으로, 이러한 수용체는 그의 세포외 도메인에 하나 이상의 시스테인 풍부 반복 서열이 있는 타입 I 막횡단 수용체이다. TNF 수용체 상과는 (1) 사멸 수용체; (2) 유인 수용체; 및(3) 사멸 도메인이 없는 신호전달 수용체로 더 나눌 수 있다. "사멸 수용체"는 그의 세포질 또는 세포내 영역에 "사멸 도메인", 즉 아폽토시스 또는 특정 유전자의 유도를 일으킬 수 있는 세포에서 신호를 전달하는 작용을 하는 영역 또는 서열을 함유한다. "유인 수용체"는 기능성 사멸 도메인을 갖지 않고 아폽토시스를 일으키는 신호를 전달할 수 없다. TNF 유전자과의 사이토킨의 예에는 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), 종양 괴사 인자-베타 (TNF-베타 또는 림프독소), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, OX-40 리간드, 4-1BB 리간드, Apo-1 리간드 (Fas 리간드 또는 CD95 리간드로도 불림), Apo-2 리간드 (TRAIL로도 불림), Apo-3 리간드 (TWEAK로도 불림), 오스테오프로테게린 (OPG), APRIL, RANK 리간드 (TRANCE로도 불림), 및 TALL-1 (BlyS, BAFF 또는 THANK로도 불림)이 포함된다. TNF 수용체 상과의 수용체의 예에는 타입 1 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR1), 타입 2 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR2), p75 신경 성장인자 수용체 (NGFR), B 세포 표면 항원 CD40, T 세포 항원 OX-40, Apo-1 수용체 (Fas 또는 CD95로도 불림), Apo-3 수용체 (DR3, swl-1, TRAMP 또는 LARD로도 불림), "막횡단 활성화제 및 CAML-상호작용제" 또는 "TACI"로 불리는 수용체, BCMA 단백질, DR4, DR5 (Apo-2, TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 또는 KILLER로도 불림), DR6, DcR1 (TRID, LIT 또는 TRAIL-R3로도 불림), DcR2 (TRAIL-R4 또는 TRUNDD로도 불림), OPG, DcR3 (TR6 또는 M68로도 불림), CAR1, HVEM (ATAR 또는 TR2로도 불림), GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, CD30, 림프독소 베타 수용체 (LTBr), 4-1BB 수용체 및 TR9 (EP988,371 A1)가 포함된다.
용어 "Apo-2 리간드" 또는 "Apo2L"는 1997년 7월 17일 공개되고 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 W097/25428에 개시된 Apo2L 폴리펩티드를 말한다. 본원의 목적상, 이들 용어는 1997년 1월 16일 공개된 W097/01633 및 1998년 6월 9일 허여된 미국 특허 제5,763,223호 (본 명세서에 그 내용이 포함되는 것으로 함)에 개시된 TRAIL로 불리는 폴리펩티드를 말하기도 한다.
"Apo2L 수용체"는 Apo2L가 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "Apo2L 수용체"는 천연 서열 Apo2L 수용체 및 그의 변이체를 포함한다. 이들 용어는 인간을 비롯한 다양한 포유동물로부터의 Apo2L 수용체를 포함한다. Apo2L 수용체는 인간 조직 또는 다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리할 수 있거나, 재조합 방법 또는 합성 방법으로 제조할 수 있다. "천연 서열" Apo2L 수용체의 예에는 Apo-2 폴리펩티드 또는 DR5 (본 명세서에 포함되는 것으로 하는 WO98/51793), 문헌 (Pan et al. Science 276: 111-113 (1997))에 기재된 천연 서열 DR4, 문헌 (Sheridan et al., Science 277: 818-821 (1997))에 기재된 천연 유인 수용체 1 또는 DcR1, 문헌 (Marsters et al., Curr. Biol. 7: 1003-1006 (1997))에 기재된 천연 유인 수용체 2 또는 DcR2, 천연 서열 오스테오프로테게린 (Simonet et al, Cell 89 : 309-319 (1997); and Emery et aL J. Interferon and Cytokine Research 18 (5): A47 Abstract 2.17 (1998))이 포함된다. 항-DR5 항체의 예에는 3F11.39.7 (ATCC HB-12456), 3H3.14.5 (ATCC HB-12534), 3D5.1.10 (HB12536) 및 3H1.18.10 (HB-12535), 16E2 및 20E6 (본 명세서에 포함되는 것으로 하는 WO 98/51793)이 포함된다. 항-DR4 항체의 예에는 4E7.24.3(ATCC HB-12454) 및 4H6.17.8 (ATCC HB-12455)가 포함된다 (본 명세서에 포함되는 것으로 하는 WO 99/37684 참조).
천연 서열 "DcR3"는 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 W099/14330에 기재되어 잇다. 상기 특허 공개에는 DcR3에 대한 mAb, 즉 4C4.1.4 (ATCC HB-12573); 5C4.14.7 (ATCC HB-12574); 11C5.2.8 (ATCC HB-12572); 8D3.1.5 (ATCC HB-12571); 및 4B7.1.1 (ATCC HB-12575)이 기재되어 있다.
"천연 서열" 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 임의의 포유동물로부터 얻은 천연 발생 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열" 폴리펩티드는 폴리펩티드 중 자연적으로 발생하는 말단절단 형태 또는 분비 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 얼터네이티브 스플라이싱 형태) 및 폴리펩티드의 천연 발생 대립유전자 변이체를 포괄한다.
폴리펩티드 "변이체"는 천연 서열 폴리펩티드와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체에는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 부가되어 있거나, 결실되어 있는 폴리펩티드가 포함된다. 통상적으로, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.
"아폽토시스"는 계획된 세포 사멸을 말한다. 아폽토시스가 일어났음을 표시하는 생리적인 이벤트에는 DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 확장, 세포의 단편화, 및(또는) 막 소포 (아폽토시스체로 불리움)의 형성이 포함된다. 다양한 방법을 이용하여 아폽토시스와 관련된 세포 이벤트를 평가한다. 예를 들어, 포스패티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 V 결합으로 측정할 수 있고, DNA 단편화는 DNA 래더링 또는 프로피듐-요오드 염색을 통해 평가할 수 있고, DNA 단편화와 함께 일어나는 핵/염색체 수축은 저이배체 세포 (hypodiploid cell)의 증가로 평가할 수 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체 (전장 또는 무손상 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (단, 이들은 원하는 생물 활성을 나타내어야 함)이 포함된다.
달리 명시하지 않는 한, 용어 "다가 항체"는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 지칭하는 것으로 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된다. 다가 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 개조하는 것이 바람직하고 일반적으로 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.
"항체 단편"은 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 부위를 비롯한 무손상 항체의 일부만을 포함하므로, 항원에 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 본 정의에 포함되는 항체 단편의 예에는 (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편; (ii) CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab'단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; (iv) VH 및 CH1 도메인을 갖고, CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편; (v) 항체의 단일 아암으로 구성된 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341,544-546 (1989)); (vii) 단리된 CDR 영역; (viii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 결합된 두 개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2단편; (ix) 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, 단일쇄 Fv; scFv) (Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); and Huston et al., PNAS (USA) 85: 5879-5883 (1988)); (x) 동일한 폴리펩티드쇄에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결되어 있는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 두 개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아보디" (EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)); (xi) 상보적인 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 단편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "직쇄 항체" (Zapata et al. Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995); 및 미국 특허 제5,641,870호)가 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적이다. 더욱이, 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다. 수식어구 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법으로 항체를 생성하는 것을 필요로 한다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 유용한 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음으로 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 [미국 특허 제4,816,567호 참조]으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들면 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본 명세서에서 모노클로날 항체에는 구체적으로 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래된 항체 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있지만, 상기 쇄의 나머지 부분이 또다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 뿐만 아니라, 목적하는 활성을 나타내는, 상기 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있는 "키메라" 항체가 포함된다 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)].
비-인간 (예: 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 가진 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않은 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 증진시키도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로, 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조할 수 있다 .
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체 또는 본 명세서에 개시된 인간 항체를 제조하기 위한 기술 중 임의의 기술을 이용하여 제조한 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외된다. 인간 항체는 당업계에 알려진 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선별한다 (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996): Sheets et al. PNAS (USA) 95: 6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marksetal., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)). 인간 항체는 내재 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 형질전환 동물, 예를 들어, 마우스 내에 인간 이뮤노글로불린 좌위를 도입함으로써 제조할 수도 있다. 챌린지시, 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레파토리를 비롯한 모든 점에서 인간에서 보여지는 것과 매우 유사한 인간 항체의 생성이 관찰된다. 이 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호 및 문헌 [Marks et al., BiolTechnology 10 : 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intem. Rev. Immunol. 13 : 65-93 (1995)]에 기재되어 있다. 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 유도된 항체를 생산하는 인간 B 림프구 (예컨대, B 림프구는 개체로부터 회수하거나 시험관내에서 면역화시킬 수 있음)의 불멸화를 통해 제조할 수 있다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991); 및 미국 특허 제5,750,373호).
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정한 부위가 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타내는 사실을 말하고, 특정한 항원과 각 특정 항체의 항원 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 이러한 가변성이 항체 가변 도메인의 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에 있는초가변 영역으로 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인 중 보다 높은 보존성을 갖는 부위를 골격 영역 (FR)이라 부른다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 β-쉬이트 구조를 취하며 3개의 초가변 영역으로 연결되어 있는 4개의 FR을 포함하는데, 상기 FR은 β-쉬이트 구조를 연결하고, 몇몇 경우에는, 상기 β-쉬이트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 밀접하게 유지되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데에는 직접적으로 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체가 참여하는 것과 같은 각종 이펙터 기능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합에 관여하는, 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 이러한 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 [예: 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 1-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [예: 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol.Biol. 196:901-917 (1987)]를 포함한다. "골격 영역" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 말한다.
무손상 항체는 그의 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 다양한 클래스 (class)로 나눌 수 있다. 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 무손상 항체가 있고, 이들 중 일부는 "서브클래스" (이소타입), 예를 들어, IgG1 (비-A 동종이형 및 A 동종이형을 포함함), IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 나눌 수 있다. 다양한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 다양한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원적 구조는 잘 알려져 있다.
임의의 척추동물 종으로부터 얻은 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 명백히 다른 타입 중 하나로 분류될 수 있다.
용어 "Fc 영역"은 무손상 항체의 파파인 절단에 의해 생성될 수 있는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있다 하더라도, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상 Fc 영역의 위치 약 Cys226 또는 위치 약 Pro230의 아미노산 잔기부터 카르복실-말단까지 걸쳐있는 스트레치로 정의된다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 두 개의 불변 도메인, 즉 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 "Fc 영역쇄"는 Fc 영역의 두 폴리펩티드쇄 중 하나를 의미한다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인 ("Cγ2" 도메인으로도 불림)은 일반적으로 아미노산 잔기 약 231 위치부터 아미노산 잔기 약 340 위치까지 걸쳐있다. CH2 도메인은 또다른 도메인과 가깝게 짝짓지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 두 개의 N-결합 탄수화물 분지쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 두 CH2 도메인 사이에 끼여있다. 상기 탄수화물은 도메인-도메인 짝짓기에 대한 대용물을 제공할 수 있고 CH2 도메인을 안정화시키는 데 도움을 줄 수 있는 것으로 생각된다 (Burton, Molec. Immunol. 22 : 161-206 (1985)). 본 명세서에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다.
"CH3 도메인"은 Fc 영역에서 C-말단 잔기부터 CH2 도메인까지 걸쳐있는 스트레치 (즉, IgG의 약 341 위치의 아미노산 잔기부터 약 447 위치의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본 명세서에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인 (예를 들어, 한 쇄에 "돌기"가 도입되어 있고 다른 쇄에 상응하는 "공동 (cavity)이 도입되어 있는 CH3 도메인; 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 특허 제5,821,333호)일 수 있다. 이러한 변이체 CH3 도메인은 본 명세서에 기재된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)를 제조하는 데 사용할 수 있다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 약 Glu216 또는 약 Cys226부터 약 Pro230까지 걸쳐있는 스트레치로 정의된다 (Burton, Molec. Immunol. 22 : 161-206 (1985)). 다른 IgG 이소타입의 힌지 영역은 동일한 위치에서 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫번째 시스테인 잔기 및 마지막 시스테인 잔기를 도입함으로써 IgG1 서열과 정렬시킬 수 있다. 본 명세서에서 힌지 영역은 천연 서열 힌지 영역 또는 변이체 힌지 영역일 수 있다. 변이체 힌지 영역의 두 폴리펩티드쇄는 일반적으로 폴리펩티드쇄 당 하나 이상의 시스테인 잔기를 보유하고 있어, 변이체 힌지 영역의 두 폴리펩티드쇄가 두 쇄 사이에 이황화 결합을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 바람직한 힌지 영역은 천연 서열 인간 힌지 영역, 예를 들어, 천연 서열 인간 IgG1 힌지 영역이다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 1종 이상의 "이펙터 기능"을 갖는다. 예시적 "이펙터 기능"에는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 대식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 수 있는 Fc 영역을 필요로 하고, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 당업계에 알려진 다양한 분석을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 천연적으로 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 도 3은 천연 서열 인간 및 뮤린 IgG Fc 영역의 아미노산 서열을 제공한다.
"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모폴리펩티드의 Fc 영역과 비교할 때 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역 또는 모폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및(또는) 모폴리펩티드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
"항체-의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비-특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식한 후 표적 세포를 용해시키는 세포-매개 반응을 말한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464쪽의 표 3에 요약되어 있다. 원하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 부가적으로, 원하는 분자의 ADCC 활성은, 예를 들면 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 RcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있지만, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 상기 이펙터 세포는 그의 천연 공급원, 예를 들면 상기 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합되는 수용체를 말한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, 이것에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체가 포함되는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체와 얼터네이티브 스플라이싱 (alternative splicing) 형태를 포함한다. FcγRII 수용체에는 주로 세포질 도메인에서만 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함된다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 [M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]. FcR에 대해서는 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]을 참조한다. 앞으로 동정될 것을 포함한 기타 FcR이 본 명세서의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어에는 모체 IgG를 태아에게 전달시키는 신생아 수용체 FcRn도 포함된다 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)].
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포를 용해시키는 능력을 말한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)과 동종 항원에 결합된 분자 (예: 항체)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
"친화 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는, 하나 이상의 CDR에서의 1종 이상의 변형을 갖지 않는 모항체와 비교할 때 상기 변형을 갖는 항체이다. 바람직한 친화 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 단위의 친화도를 가질 것이다. 친화 성숙 항체는 당업계에 알려진 방법에 의해 제조된다. 문헌 (Marks et al., BiolTechnology 10: 779-783 (1992))에는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화 성숙이 기재되어 있다. CDR 및(또는) 골격 잔기의 무작위적 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 "아미노산 서열 동일성(%)"은 서열을 정렬하고, 필요하다면, 최대 서열 동일성(%)을 얻기 위해 갭 (gap)을 도입한 후 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 상태에서 선택된 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(%)을 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술에 속하는 다양한 방법, 예컨대,BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈린 (Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 전장 서열의 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 측정에 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성(%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 아래에 기재된 바와 같이 얻는다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사에 의해 개발되었고, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (Washington D. C., 20559)에 사용자 문서로 등록되어 있고, 미국 저작권 등록번호는 TXU510087이고, 제넨텍, 인크사 (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 이용가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서 사용할 수 있도록 편집될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.
본원의 목적상, 해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 해당 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 해당 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
"폴리펩티드쇄"는 하나의 폴리펩티드를 말하고, 이 때, 각 도메인이 비-공유결합성 상호작용 또는 이황화 결합과 반대로 펩티드 결합(들)에 의해 다른 도메인에 연결되어 있는 폴리펩티드이다.
본 명세서에서 "가요성 링커"는 펩티드 결합에 의해 연결된 두 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 말하고, 이렇게 결합된 두 폴리펩티드 (예컨대, 두 Fd 영역)에게 더 많은 회전 자유를 제공한다. 이러한 회전 자유는 가요성 링커에 의해 연결된 두 개 이상의 항원 결합 부위가 더 효율적으로 표적 항원(들)에 접근할 수 있게 한다. 적당한 가요성 링커 펩티드 서열의 예에는 gly-ser, gly-ser-gly-ser (서열 10), ala-ser 및 gly-gly-gly-ser (서열 11)이 포함된다. 바람직하게는, 상기 가요성 링커는 2 내지 약 10개의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 4개 이하의 잔기를 포함한다.
"이량체화 도메인"은 두 개 이상의 아미노산 잔기 (일반적으로 시스테인 잔기) 또는 두 개 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드 (동일하거나 상이한 아미노산 서열일 수 있음)의 결합으로 형성된다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 공유결합 및(또는) 비-공유결합을 통해 서로 상호작용할 수 있다. 본 명세서에서 이량체화 도메인의 예에는 Fc 영역; 힌지 영역; CH3 도메인; CH4 도메인; CH1-CL 쌍; 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 미국 특허 제5,821,333호에 기재된 유전공학적으로 개조된 "마디" 및(또는) "돌기"가 있는 "계면"; 류신 지퍼 [예를 들어, jun/fos 류신 지퍼(Kostelney et al., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992)) 또는 효소 GCN4 류신 지퍼]; 이소류신 지퍼; 수용체 이량체쌍 (예를 들어, 인터루킨-8 수용체 (IL-8R)); LFA-1 및 GPIIIb/IIIa와 같은 인테그린 이종이량체) 또는 그의 이량체화 영역(들); 이량체성 리간드 폴리펩티드 [예를 들어, 신경 성장인자 (NGF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 인터루킨-8 (IL-8), 혈관 내피 성장인자 (VEGF) 및 뇌-유래 향신경성 인자 (BDNF) (Arakawa et al. J. Biol. Chem. 269 (45): 27833-27839 (1994) and Radziejewski et al. Biochem. 32 (48): 1350 (1993)), 또는 그의 이량체화 영역(들); 이황화 결합을 형성할 수 있는 한 쌍의 시스테인 잔기; 한 쌍의 펩티드 또는 폴리펩티드 [각각 하나 이상의 시스테인 잔기 (예를 들어, 약 1, 2 또는 3개 내지 약 10개의 시스테인 잔기를 포함하여 이황화 결합(들)이 펩티드 또는 폴리펩티드 사이에 형성될 수 있음] (이하, "합성 힌지"로 불림); 및 항체 가변 도메인이 포함된다. 본 명세서에서 가장 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역이다.
"천연 발생 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 코딩되는 아미노산 잔기)는 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라진 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile); 류신 (Leu); 라이신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 구성된 군으로부터 선택할 수 있다. "비-천연 발생 아미노산 잔기"는 상기 나열된 천연 발생 아미노산 잔기 이외의 잔기를 말하고, 이 비-천연 발생아미노산 잔기는 폴리펩티드쇄에서 인접한 아미노산 잔기(들)을 공유결합시킬 수 있다. 비-천연 발생 아미노산 잔기의 예에는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 문헌 [Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991)]에 기재된 것과 같은 기타 아미노산 동족체가 포함된다. 이러한 비-천연 발생 아미노산 잔기를 생성시키기 위해, 문헌 [Noren et al. Science 244: 182 (1989) and Ellman et al., supra]의 방법을 이용할 수 있다. 요약하면, 이 방법은 비-천연 발생 아미노산 잔기를 사용한 서프레서 tRNA의 화학적 활성화 후 RNA의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다.
"단리된" 폴리펩티드는 그의 천연 환경 요소로부터 확인되고 분리 및(또는) 회수된 폴리펩티드이다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 일반적으로 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리 (Lowry) 방법으로 측정시 폴리펩티드를 95 중량%, 가장 바람직하게는 99 중량%를 초과하는 정도로 정제되거나, (2) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. 폴리펩티드의 천연 환경 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내의 제자리 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.
항체의 "기능성 항원 결합 부위"는 표적 항원에 결합할 수 있는 부위이다. 항원 결합 부위의 항원 결합 친화도는 반드시 항원 결합 부위가 유래된 모항체만큼 강한 것은 아니지만, 항원에 결합하는 능력은 항원과 항체의 결합을 평가하기 위한 다양한 공지된 방법 중 하나를 이용하여 측정될 수 있어야 한다. 더욱이, 본원의 다가 항체의 항원 결합 부위 각각의 항원 결합 친화성은 정량적으로 동일할 필요는 없다. 본원의 다가 항체의 경우, 기능성 항원 결합 부위의 수는 하기 실시예 2에 기재된 한외원심분리 분석을 이용하여 평가할 수 있다. 이 분석법에 따라, 표적 항원 대 다량체 항체의 다양한 비를 조합하고, 결합체의 평균 분자량을 계산하여 기능성 황원 결합 부위의 수를 추정한다. 이러한 이론치는 기능성 결합 부위의 수를 평가하기 위해 얻은 실질적인 실험치와 비교한다.
""수용체의 리간드 활성화"는 수용체 (또는 원하는 수용체를 포함하는 수용체 결합체)와 결합하는 리간드에 의해 매개되는 신호 전달 (예를 들어, 티로신 키나제 수용체의 경우, 수용체 또는 기질 폴리펩티드의 티로신 잔기를 인산화시키는 티로신 키나제 수용체의 세포내 키나제 도메인에 의해 일어나는 신호 전달)을 의미한다. ErbB 수용체의 경우, 일반적으로 이 수용체는 ErbB 헤테로-올리고머에서 하나 이상의 ErbB 수용체의 키나제 도메인을 활성화시키는 ErbB 헤테로-올리고머와 ErbB 리간드의 결합을 수반하고, 따라서 하나 이상의 ErbB 수용체의 티로신 잔기의 인산화 및(또는) 추가 기질 폴리펩티드(들)의 티로신 잔기의 인산화를 일으킬 것이다.
수용체의 리간드 활성화를 "차단하는" 항체는 상기 정의한 바와 같은 활성화를 감소시키거나 방해하는 항체이다. 이러한 차단은 임의의 수단으로, 예를 들어, 수용체와 리간드의 결합, 수용체 결합체의 형성, 수용체 결합체의 티로신 키나제 수용체의 티로신 키나제 활성 및(또는) 수용체의 또는 수용체에 의한 티로신 키나제 잔기(들)의 인산화를 방해함으로써 일어날 수 있다. ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체의 예에는 모노클로날 항체 2C4 및 7F3 (HER2/HER3 및 HER2/HER4 헤테로올리고머의 HRG 활성화를 차단하고; EGFR/HER2 헤테로올리고머의 EGF, TGF-베타 또는 앰피레귤린 활성화를 차단함); EGFR, HER2, HER3 및 HER4를 발현하는 T47D 세포와 EGF 및 NDF의 결합을 차단하는 L26, L96 및 L288 항체 (Klapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997))가 포함된다.
지정된 항체의 "생물학적 특성"을 갖는 항체는 동일한 항원에 결합하는 다른 항체와는 구별되는 1종 이상의 생물학적 항체 특성을 갖는 항체이다.
본 명세서에서 사용된 "생장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 특정 세포의 생장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 이러한 생장 억제제는 S 주기에서의 세포의 비율을 상당히 감소시키는 것일 수 있다. 생장 억제제의 예로는 (S 주기 이외의 주기에서) 세포 사이클 진행을 차단시키는 물질, 예를 들면 G1 정지와 M-주기 정지를 유도하는 물질이 있다. 종래의 M-주기 차단제에는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 (등록상표), 및 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들면 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1 정지 여파로 S-주기 정지를 초래하는 물질은 예를 들면, DNA 알킬화제, 예를 들면 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴,메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C이다. 더 자세한 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic dr㎍s" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13]에 기재되어 있다.
"생장 억제" 항-HER2 항체의 예에는 HER2를 과발현하는 암세포에 결합하여 상기 암세포의 생장을 억제하는 항체이다. 바람직한 생장 억제 항-HER2 항체는 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서 20%보다 더 높은, 바람직하게는 50%보다 더 높은 (예컨대, 약 50% 내지 약 100%) 정도까지 세포 배양물 중의 SKBR3 유방 종양 세포의 생장을 억제하는데, 여기서, 생장 억제는 SKBR3 세포를 상기 항체에 노출시킨지 6일 후 측정한다 (1997년 10월 4일 특허결정된 미국 특허 제5,677,171호).
"세포 사멸을 유도하는" 항체는 생존가능한 세포를 생존불가능한 세포로 만드는 것이다. 이러한 세포는 일반적으로 항체가 결합하는 항원을 발현하는 항체, 특히 상기 항원을 과발현하는 항체이다. 바람직하게는, 상기 세포는 암 세포, 예를 들면 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 갑상선암, 췌장암 또는 방광암 세포이다. 시험관내에서는, 상기 세포가 SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 시험관내 세포 사멸은 항체-의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 유도된 세포 사멸을 구별시켜 주는 면역 이펙터 세포 및 보체의 부재 하에서 측정할 수 있다. 따라서, 세포 사멸에 대한 분석은 열 불활성화 혈청을 사용하여 (즉, 보체의 부재 하에서) 면역 이펙터 세포의 부재 하에서 수행할 수 있다. 항체가 세포 사멸을 유도할 수 있는지를 확인하기 위해서, 프로피듐 요오다이드 (PI), 트리판 블루 [Moore et al., Cytotechnology 17:1-11 (1995)] 또는 7AAD의 흡수로써 평가된 바와 같은 막 원형의 상실을 처리되지 않은 세포와 비교해서 평가할 수 있다.
"아폽토시스를 유도하는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화 (fragmentation), 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및(또는) 막 소포 (아폽토시스체로 불림)의 형성으로 확인된 바와 같이 계획된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 이러한 세포는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포이고 상기 항원을 과발현하는 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 종양 세포, 예를 들면 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 갑상선암, 췌장암 또는 방광암 세포이다. 시험관내에서, 세포는 SKBR3, BT474, Calu3 세포, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 각종 방법을 이용하여 아폽토시스와 연관된 세포 이벤트를 조사할 수 있다. 예를 들면, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편화는 본 명세서의 실시예에 개시된 DNA 래더링 (laddering)을 통하여 평가할 수 있고, DNA 단편화와 함께 일어나는 핵/염색체 수축은 하이포디플로이드 (hypodiploid) 세포의 임의의 증가에 의해서 확인할 수 있다. 바람직하게는, 아폽토시스를 유도하는 항체는 이 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 사용하는 아넥신 결합 분석에 있어서 처리되지 않은 세포와 비교하여 아넥신 결합을 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배만큼 유도하는 항체이다.
아폽토시스를 유도하는 항체의 예에는 항-HER2 모노클로날 항체 7F3 (ATCC HB-12216) 및 7C2 (ATCC HB 12215) 뿐만 아니라 그의 인간화 및(또는) 친화 성숙 변이체; 항-DR5 항체 3F11.39.7 (ATCC HB-12456); 3H3.14.5 (ATCC HB-12534) ; 3D5.1.10 (ATCC HB-12536); 및 3H3.14.5 (ATCC HB-12534) 및 그의 인간화 및(또는) 친화 성숙 변이체; 인간 항-DR5 수용체 항체 16E2 및 20E6 뿐만 아니라 그의 친화 성숙 변이체 (본 명세서에 포함되는 것으로 하는 W098/51793); 항-DR4 항체 4E7.24.3 (ATCC HB-12454); 4H6.17.8 (ATCC HB-12455); 1H5.25.9 (ATCC HB-12695); 4G7.18.8 (ATCC PTA-99); 및 5G11.17.1 (ATCC HB-12694) 및 그의 인간화 및(또는) 친화 성숙 변이체가 포함된다.
원하는 항체에 의해 결합된 항원 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌 (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988))에 기재된 것과 같은 통상적인 교차-차단 분석을 수행할 수 있다.
"아고니스트 항체"는 수용체에 결합하여 수용체를 활성화시키는 항체이다. 일반적으로, 아고니스트 항체의 수용체 활성화 능력은 적어도 수용체의 천연 아고니스트 리간드와 정성적으로 유사할 것이다 (본질적으로 정량적으로 유사함). 아고니스 항체의 예는 TNF 수용체 상과에 속하는 수용체에 결합하여 TNF 수용체를 발현하는 세포의 아폽토시스를 유도하는 항체이다. 아폽토시스의 유도를 측정하기 위한 분석은 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 W098/51793 및 W099/37684에 기재되어 있다.
"질환"은 항체로 치료하여 효과를 얻을 수 있는 임의의 증상이다. 이 질환에는 포유동물이 해당 질환을 앓기 쉽게 하는 병리학적 증상을 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 본 명세서에서 치료할 질환의 비-제한적 예에는 양성 및 악성 종양; 백혈병 및 림프성 악성종양; 신경, 아교, 성상세포, 시상하부 및 다른 내분비선, 대식세포, 상피세포, 간질 및 포배강 질환; 및 염증, 혈관신생 및 면역학적 질환이 포함된다.
용어 "치료 유효량"은 포유동물의 질환 또는 장애를 치료하기에 효과적인 약물량을 말한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암세포의 수를 감소시키고(거나); 종양 크기를 축소시키고(거나); 암세포가 말초 기관으로 침윤하는 것을 억제하고(하거나) (즉, 어느 정도 늦추고, 바람직하게는 중단시킴); 종양 전이를 억제하고(하거나) (즉, 어느 정도 늦추고, 바람직하게는 중단시킴); 종양 생장을 어느 정도 억제하고(하거나); 질환과 관련된 1종 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. 약물이 암세포의 생장을 방해하고(하거나) 존재하는 암세포를 사멸시키기 위해서는, 상기 약물은 세포증식을 억제할 수 있고(있거나) 세포독성을 나타낼 수 있다. 암치료의 경우, 생체내 효능은 예를 들어, 질환 진행 시간 (TTP)을 평가하고(하거나) 반응 속도 (RR)를 측정함으로써 측정할 수 있다.
"치료"는 치유적인 치료 및 예방학적 또는 방지적 처치 둘 다를 말한다. 치료가 필요한 대상에는 이미 질환을 앓는 대상뿐 아니라 질환이 예방되야 할 대상도 포함된다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 생장을 특징으로 하는, 포유동물의 생리학적 증상을 말한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병이 포함된다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포암, 소(小)세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포암종, 복막암, 간암, 위장암, 췌장암, 신경교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다.
본 명세서에서 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직으로부터 발생되어 개체 자신에 대해 유도되는 비-악성 질환 또는 장애이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예에는 건선 및 피부염 (예를 들어, 아토피성 피부염)을 비롯한 염증성 피부 질환; 전신성 피부경화증 및 경화증; 염증성 장 질환과 관련된 반응 (예컨대, 크론병 및 위궤양); 호흡 곤란 증후군 (성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS)을 포함함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 결장염; 사구체신염; 습진 및 천식과 같은 알레르기성 증상, 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증성 반응을 수반하는 다른 증상; 죽상경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스성 관절염; 전신홍반성 루프스 (SLE); 당뇨병 (예를 들어, 타입 I 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이나우드 (Reynaud) 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼르렌 증후군; 연소기 발병성 당뇨병; 전형적으로 결핵, 유육종증, 다발성근염, 육아종 및 혈관염에서 발견되는 사이토킨 및 T 림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민반응과 관련된 면역반응; 악성빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출증을 수반하는 질환; 중추신경계 (CNS) 염증 질환; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (한랭글로불린혈증 또는크움즈 (Coombs) 양성 빈혈을 포함하나, 이에 제한되지 않음); 중증근무력증; 항원-항체 결합체 매개 질환; 항-사구체기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이톤 (Lambert-Eaton) 근무력증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발성내분비병증; 레이터병 (Reiter's disease); 스티프-만 (stiff-man) 증후군; 베세트병 (Behcet disease); 거대세포 동맥염; 면역결합체 사구체신염; IgA 신병증; IgM 다발성신경병증; 및 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
"외래 항원"은 특정 분자 또는 분자들에 노출된 포유동물에서 내재성 또는 천연 분자가 아닌 분자 또는 분자들을 의미한다. 외래 항원은 포유동물에서 면역반응, 예컨대, 체액성 및(또는) T 세포 매개 반응을 일으킬 수 있다. 일반적으로, 외래 항원은 이 항원에 대한 항체의 생성을 유도할 것이다. 본 명세서에서 고려되는 외래 항원의 예에는 면역원성 치료제, 예를 들어, 항체, 특히 비-인간 아미노산 잔기 (예컨대, 설치류, 키메라/인간화 및 영장류화 항체)를 포함하는 항체와 같은 단백질; (임의로 항체와 같은 표적 분자 (면역원성 분자일 수도 있음)에 결합되어 있는) 독소; 레트로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 유전자요법 바이러스 벡터; 이식편; 감염성 물질 (예를 들어, 박테리아 및 바이러스); 혈액 타입의 차이, 인간 림프구성 항원 (HLA), 혈소판 항원, 이식된 기관 상에서 발현되는 항원, 혈액 성분, 임신 (RH) 및 혈우병성 인자 (예컨대, 인자 VIII 및 인자 IX)와 같은 동종항원 (즉, 같은 종에 속하지만 같은 종의 다른 구성원인 항원)이 포함된다.
"면역반응을 차단한다"는 것은 외래 항원에 노출됨으로써 발생하는 1종 이상의 면역-매개 반응을 감소시키거나 방해하는 것을 의미한다. 예를 들어, 외래 항원에 대한 체액성 반응을 감소시킬 수 있다. 즉, 포유동물의 항원에 대한 항체의 생성을 방해하거나 감소시킬 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 이디오타입을 억제할 수 있고; 동종항체로 코팅된 세포의 제거를 "진정시키고", 그리고(또는) 항원 제시 세포의 소멸을 통한 동종항원 제시에 영향을 줄 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "이식편"은 수용자로 이식하기 위한, 공여자로부터 유래한 생물학적 물질을 말한다. 이식편에는 다양한 물질, 예를 들어, 소도 세포와 같은 격리된 세포; 태아의 양수막, 골수, 조혈 전구 세포 및 각막 조직과 같은 안구 조직과 같은 조직; 및 피부, 심장, 간, 비장, 췌장, 갑상선엽, 폐, 신장, 세뇨 기관 (예컨대, 소장, 혈관 또는 식도) 등과 같은 기관이 포함된다. 세뇨 기관은 식도, 혈관 또는 담관의 손상된 부위를 대체하는 데 사용할 수 있다.
피부 이식편은 화상에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 손상된 장 또는 횡경막탈장과 같은 근접한 특정 결함을 치료하기 위한 드레싱으로 사용할 수 있다. 이식편은 시체이든지 아니면 살아있는 공여자이든 관계없이 인간을 비롯한 임의의 포유동물 공급원으로부터 유래한다. 바람직하게는, 이식편은 골수 또는 심장과 같은 기관이고, 이식편의 공여자 및 숙주는 HLA 클래스 II 항원이 일치해야 한다.
본 명세서에 사용된 용어 "포유동물 숙주"는 임의의 적합한 이식 수용자를 말한다. "적합한"은 공여받은 이식편을 받을 수 있는 포유동물 숙주를 의미한다. 바람직하게는, 숙주는 인간이다. 이식편의 공여자 및 숙주 둘 다가 인간인 경우, 이들은 HLA 클래스 II 항원이 일치하여 조직적합성을 향상시킬 수 있는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "공여자"는 이식편이 유래되는, 죽은 또는 살아있는 포유동물종을 말한다. 바람직하게는, 공여자는 인간이다. 인간 공여자는 바람직하게는 신체적인 검사 및 동일한 ABO 주혈액군이 정상인 혈액-관련 자원자인데, 이는 교차 주혈액군 장애물이 동종이식편의 생존을 손상시킬 수 있기 때문이다. 그러나, 예를 들어, O 형 공여자의 신장을 A, B 또는 AB 수용자에게 인식하는 것은 가능하다.
용어 "이식" 및 그의 변형은 이식이 유전적동계이든지 (공여자 및 수용자가 유전적으로 일치하는 경우), 동종이형이든지 (공여자와 수용자가 다른 유전적 유래를 갖지만 동일한 종인 경우), 또는 이종이형이든지 (공여자와 수용자가 다른 종인 경우) 관계없이 이식편이 숙주 내로 삽입되는 것을 말한다. 따라서, 전형적인 시나리오의 경우, 숙주는 인간이고 이식편은 유전적으로 동일한 인간 또는 유전적으로 상이한 유래의 인간으로부터 유래된 동종이식편이다. 또다른 시나리오의 경우, 이식편은 이 이식편이 이식되는 숙주와는 다른 종 (계통발생학적으로 멀리 떨어진 종의 동물을 포함함)으로부터 유래되는데, 예컨대, 개코원숭이 심장을 인간 수용 숙주 내로 이식하거나, 돼지 심장판, 동물 베타 소도 세포 또는 신경 세포를 인간 숙주 내로 이식한다.
"이식을 기다리는 포유동물을 탈감작한다"는 표현은 포유동물에게 이식을 수행하기 전에 이식에 대한 알레르기성 민감성 또는 반응성을 감소시키거나 없앤다는 것을 말한다. 이는 예컨대, 인간 림프구 항원 (HLA)에 대한 항-수용자 항체가 유도된 경우 탈감작된 포유동물에서 항-수용자 항체를 감소시키는 것과 같은 임의의 메카니즘에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고(하거나) 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 말한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제; 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (이들의 단편 및(또는) 변이체를 포함함)를 포함한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화합물이다.
화학요법제의 예로는 티오테파 및 사이클로스포스파미드 (CYTOXAN (상표명)) 등의 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판 등의 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파 등의 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토제닌 (특히, 불락타신 및 불락타시논); 캠프토테신 (합성 동족 토포테칸을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 동족체를 포함함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 동족체, KW-2189 및 CBI-TM을 포함함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로로에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드 등의 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴 등의 니트로스우레아; 에네디인 항생제 (예컨대, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 γ1 1뭉 칼리케아미신 θ1 1(Annew Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)); 디네마이신 A를 비롯한 디네마이신; 에스퍼라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디인 항생제성 발색단을 포함함), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신 등의 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU) 등의 항대사제; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트 등의 폴산 동족체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌 등의 퓨린 동족체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU 등의 피리미딘 동족체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤 등의 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄 등의 항부신제; 프롤린산 등의 폴산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK (등록상표); 라족산; 리조신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리콜테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 데카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들면 파클리탁셀 [TAXOL (등록상표), Brisol-Meyers Squibb Oncology, Princeton, NJ] 및 독세탁셀 (TAXOTERE (등록상표), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴 등의 백금 동족체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 및 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 있다. 이러한 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제시키도록 작용하는 항호르몬제, 예를 들면 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타네 억제성 4(5)-이미다졸, 4-히드록실아목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (Fareston)을 포함한 항에스테로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 루이프롤리드 및 고세렐린 등의 항안드로겐; 및 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
"사이토킨"은 다른 세포 상에서 세포간 매개자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반명이다. 그러한 사이토킨의 예로는 림포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토킨 중에는 성장 호르몬, 예를 들면 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들면 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 호르몬 (LH); 간 성장인자; 섬유아세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α및 -β; 물레리안-억제 물질; 마우스 고나도트로핀 관련 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장인자, 예를 들면 NGF-α; 혈소판-성장인자; 형질전이 성장인자 (TGF), 예를 들면 TGF-α및 TGF-β; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들면 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들면 마크로파지-CSF (M-CSF); 과립구-마크로파지-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들면 IL-1, IL-1α,IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들면 TNF-α및 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)을 비롯한 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 용어 사이토킨은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물로부터 유래된 단백질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "프로드럭 (prodrug)"은 모 약물과 비교해서 종양 세포에 대해 덜 세포독성적이고 보다 활성적인 모 형태로 효소적 활성화되거나 전환될 수 있는, 제약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태이다 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]. 본 발명의 프로드럭에는 보다 활성적인 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트 함유 프로드럭, 티오포스페이트 함유 프로드럭, 설페이트 함유 프로드럭, 펩티드 함유 프로드럭, D-아미노산-변형된 프로드럭, 글리코실화 프로드럭, β-락탐 함유 프로드럭, 임의로 치환되는 페녹시아세트아미드 함유 프로드럭 또는 임의로 치환되는 페닐아세타미드 함유 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로우리딘 프로드럭이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 언급된 화학요법제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"혈관신생성 인자"는 혈관의 발생을 자극하는 성장인자이다. 본 명세서에서 바람직한 혈관신생성 인자는 혈관 내피 성장인자 (VEGF)이다.
본 명세서에 사용된 "표지"는 폴리펩티드에 직ㆍ간접적으로 결합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체가 검출가능한 것 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지)일 수 있거나, 효소 표지의 경우 검출가능한, 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.
"단리된" 핵산 분자는 폴리펩티드 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 결합되어 있는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 특정 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자에는 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는 경우 통상적으로 폴리펩티드를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자도 포함된다.
용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨대, 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 상호교환적으로 사용되고, 이들 모든 명칭에는 프로제니 (progeny)도 포함된다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"란 말에는 형질전환의 횟수와 관계없이 형질전환으로부터 유도된 일차 대상 세포 및 배양물이 포함된다. 또한, 의도적인 돌연변이 또는 우연한 돌연변이로 인해 모든 프로제니가 DNA 내용에 있어서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해해야 한다. 최초로 형질전환된 세포와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 것으로 스크리닝된 돌연변이체 프로제니도 포함된다. 구별되는 지칭이 필요한 경우, 상기 지칭은 문맥으로부터 명백해질 것이다.
II. 본 발명을 수행하기 위한 방식
A. 다가 항체
본 발명은 다가 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 다가 항체의 가변 도메인(들)이 유래될 수 있는 "모" 항체 또는 "출발" 항체를 만들기 위한 다양한 기술은 본원의 후반부에 기재될 것이다.
본원에서 특히 관심있는 다가 항체는 3개 이상 (바람직하게는, 4개 이상, 예를 들어, 4개 또는 5개 내지 약 8개)의 항원 결합 부위를 포함하는 항체이다. 일반적으로, 항원 결합 부위 모두는 상술한 바와 같이 "기능적"이다. 바람직하게는, 다가 항체는 자연에 존재하지 않고 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다. 본원의 다가 항체는 바람직하게는 한 쌍의 항체를 화학적으로 가교-결합시켜 시험관내에서 제조하지 않는다 (Ghetie et al. (1997), supra or Wolff et al. (1993), supra). 본원은 한 쌍의 Fc 영역 사이의 이황화 결합(들)을 통해 다가 항체를 제조하기 위해 모항체에 도입되는 시스테인 잔기(들)을 필요로하지 않는 다가 항체를 제공한다 (Shopes et al. (1992), supra or Caron et al. (1992), supra).
한 실시양태에서, 다가 항체는 2개 이상의 중쇄 (또는 경쇄) 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드쇄 및 2개 이상의 중쇄 (또는 경쇄) 가변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드쇄를 포함한다. 바람직하게는, 상기 제1 폴리펩티드쇄는 2개의 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드쇄도 2개의 중쇄 가변 도메인을 포함하는데, 이 중쇄 가변도메인은 상응하는 경쇄 가변 도메인 (각 폴리펩티드쇄 당 2 개 이상의 경쇄 가변 도메인)과 결합하여 4개 (또는 그 이상)의 항원 결합 부위를 형성할 수 있다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 다가 항체는 (1) 2개 (또는 그 이상)의 항원 결합 부위와 (2) 2개 (또는 그 이상)의 항원 결합 부위를 연결시키는 이량체화 도메인을 포함한다. 다양한 이량체화 도메인이 본원에서 고려되지만, 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역이다. 다가 항체가 Fc 영역 (예를들어, 천연 서열 또는 변이체 Fc 영역)을 포함하는 경우, Fc 영역은 상술한 바와 같이 "기능적"인 것이 바람직하므로, ADCC 또는 CDC와 같은 1종 이상의 항체 이펙터 기능을 수행할 수 있다. 바람직하게는 다가 항체는 단 하나의 Fc 영역을 갖거나 Fc 영역을 갖지 않는다.
다가 항체가 Fc 영역을 갖는 경우, 바람직하게는 3개 이상의 항원 결합 부위가 (상기 콜로마 및 모리슨 (1997)의 문헌에 기재된 바와 같이 Fc 영역의 카르복시 말단에 있기보다는) Fc 영역의 아미노 말단에 있다. 이것은 식 VD1-X1-VD2-X2-Fc로 나타내는 제1 폴리펩티드쇄를 제공함으로써 달성될 수 있는데, 상기 식에서 (1) VD1은 제1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 (바람직하게는 중쇄 가변 도메인)이고, (2) VD2는 제2 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 (바람직하게는 중쇄 가변 도메인)이고, (3) Fc는 Fc 영역으로 구성된 하나의 쇄이고, (4) X1 및 X2는 임의로 삽입되는 아미노산 또는 폴리펩티드이다. 바람직하게는 X1 및 X2는 CH1 도메인 (VD1 또는 VD2가 중쇄 가변 도메인인 경우) 또는 CL 도메인 (VD1 또는 VD2가 경쇄 가변 도메인인 경우)을 포함하거나 상기 CH1 도메인 또는 CL 도메인으로 구성되어 있다. 임의로, X1은 일반적으로 VD1의 C-말단 (또는 존재하는 경우 CH1 또는 CL의 C-말단)에 존재하는 가요성 링커도 포함한다. 가요성 링커는 gly-ser, gly-ser-gly-ser (서열 10), ala-ser 또는 gly-gly-gly-ser (서열 11)와 같은 펩티드를 포함할 수 있다.
본원에서 특히 관심있는 다가 항체는 항원에 각각 결합할 수 있는 3개 이상 (예를 들어, 4개 또는 5개 내지 약 8개)의 Fab 폴리펩티드를 포함한다. Fab 단편은 바람직하게는 (다가 항체가 Fc 영역을 갖는 경우) Fc 영역의 아미노 말단에 존재한다. 예를 들어, 2개 이상의 Fd 단편은 Fc 영역으로 구성된 한 쇄의 아미노 말단에 융합될 수 있다. 이렇게 개조된 폴리펩티드는 (1) 2개 이상의 Fd 단편이 Fc 영역으로 구성된 다른 쇄의 아미노 말단에 융합됨으로써 형성되는 또다른 폴리펩티드쇄뿐만 아니라, (2) 상보적인 VL 도메인 (예를 들어, 임의로 CL 도메인에 각각 융합되는 4개 이상의 VL 도메인)과 조합될 수 있다. 임의로, 항체는 2개 이상의 Fd 단편 사이의 가요성 링커를 포함한다. 다가 항체는 예를 들어, 식 (1) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc쇄 또는 (2) VH-CH1-VH-CH1-Fc쇄 (즉, 2개의 Fd 단편 사이에 가요성 링커가 없는 경우)를 갖는 한 쌍의 폴리펩티드쇄를 포함할 수 있다.
본원의 다가 항체의 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위 각각은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 형성되는 것이 바람직하다. 따라서, 2개 이상의 중쇄 가변 도메인이 서로 융합되어 있는 경우 (임의로 상술한 바와 같은 삽입 아미노산(들)이 있음), 2개 이상의 상보적인 경쇄 가변 도메인-함유 폴리펩티드는 (예를 들어, 동일한 숙주 세포에서 융합 단백질과 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드(들)를 동시에 발현시킴으로써) 중쇄 가변 도메인과 조합시킬 수 있다. 바람직하게는 항체는 임의로 CL 도메인을 각각 포함하는 4개 또는 5개 이상 (예를 들어, 약 8개 이하)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함한다.
본원의 한 실시양태에서, 3개 이상 (예를 들어, 3 내지 약 10개, 바람직하게는 3개 또는 4개)의 항원 결합 부위를 갖는 항체는 3개 이상 (예를 들어, 3개 내지 약 10개, 바람직하게는 3개 또는 4개)의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 각 가변 도메인은 항원 결합 부위를 형성하는 방식으로 3개 이상 (예를 들어, 3개 내지 약 10개, 바람직하게는 3개 또는 4개)의 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 폴리펩티드와 조합되어 있거나 결합되어 있다. 따라서, 폴리펩티드쇄가 3개 이상의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 경우, 상기 폴리펩티드쇄는 3개 이상의 상응하는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드 (예를 들어, VL-CL 폴리펩티드)와 조합되어 있거나 결합되어 있다. 별법으로, 폴리펩티드쇄가 3개 이상의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경우, 상기 폴리펩티드쇄는 3개 이상의 상응하는 중쇄 가변 도메인 폴리펩티드 (예를 들어, VH-CH1 폴리펩티드)와 조합되어 있거나 결합되어 있다. 3개 이상의 항원 결합 부위 각각은 동일한 항원에 대해 유도되는 것이 바람직하다. 이러한 항체에 의해 결합되는 항원의 예에는 (1) DR4 및 DR5와 같은 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 상과에 속하는 수용체 (이러한 수용체들은 "삼량체 수용체"일 수 있으므로, 필요한 항체는 원하는 항원 결합 부위를 3개만 포함함); (2) CD20과 같은 B 세포 표면 항원; (3) HER2 수용체에 의해 예시되는 ErbB 수용체; 또는 (4) 종양 세포에 의해 발현되는 세포 표면 단백질이 포함된다. 예를 들어, 폴리펩티드쇄는 3개 (또는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드와 결합하여 동일한 항원에 대한 3개 (또는 4개)의 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 3개 (또는 4개)의 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 도 23D (3개의 항원 결합 부위가 있음) 및 도 23E (4개의 항원 결합 부위가 있음)에 기재된 것들로 예시된다. 다가 항체는 식 (a) VL-CL-가요성 링커-VL-CL-가요성 링커-VL-CL (이 실시양태에서, 폴리펩티드는 가요성 링커에 의해 연결된 3개 내지 약 8개의 VL-CL 폴리펩티드를 포함할 수 있음); (b) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1 (이 실시양태에서, 폴리펩티드는 가요성 링커에 의해 연결된 3개 내지 약 8개의 VH-CH1 폴리펩티드를 포함할 수 있음); (VL-CL)n(여기서, n은 3 이상 (예를 들어, 3 내지 약 8, 바람직하게는 3 또는 4)임); 또는 (d) (VH-CH1)n(여기서, n은 3 이상 (예를 들어, 3 내지 약 8, 바람직하게는 3 또는 4)임)를 포함하는 폴리펩티드쇄도 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드쇄는 식 (a) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1; (b) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1; 또는 (c) (VH-CH1)n(여기서, n은 3 또는 4임)를 포함한다.
본원의 다가 항체는 생체내 치료 및 진단에 특히 바람직한 성질을 나타낸다. 예를 들어, 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 빨리 내재화되어 이화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 세포독성제 (예컨대, 일단 내재화되는 경우 세포를 사멸시키는 데 활성적인 물질)와 결합된 다가 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트를 제공한다. 이뮤노컨쥬게이트를 생성시키기 위한 다양한 세포독성제는 본 명세서에 기재되어 있지만, 바람직한 세포독성제는 방사성 동위원소, 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신이다.
다가 항체, 및(또는) 모항체 (다가 항체의 항원 결합 특이성 중 적어도 하나가 이 모항체로부터 유래되었음)는 특정한 성질을 가질 수 있다. 예를 들어, 다가 항체 및(또는) 모항체는 (1) 아고니스 항체일 수 있고(있거나) (항체에 의해 결합되는 항원이 TNF 수용체과의 수용체 또는 B 세포 표면 항원인 경우); (2) 아폽토시스를 유도할 수 있고(있거나) (예를 들어, 항체에 의해 결합되는 항원이 ErbB 수용체 또는 TNF 수용체 상과의 수용체인 경우); (3) 종양 세포 상에 발현된 세포 표면 단백질 (예컨대, B 세포 표면 항원 또는 ErbB 수용체)에 결합할 수 있고(있거나); (4) 종양 세포에 의해 과발현되는 세포 표면 단백질 (예컨대, 상피 성장인자 수용체 (EGFR), HER2 수용체, ErbB3 수용체 ErbB4 수용체 또는 DcR3 수용체)에 결합할 수 있고(있거나); (5) 생장 억제 항체일 수 있다.
본원의 다가 항체는 단지 하나의 항원, 또는 하나 이상이 항원 (예컨대, 2개 내지 약 3개의 항원)에 대한 특이성을 나타낼 수 있다. 한 실시양태에서, 다가 항체의 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위는 모두 동일한 항원 (바람직하게는 다가 항체가 "단일특이적"인 것으로 생각되는 경우 한 항원의 동일한 에피토프)에 결합할 수 있다. 본원은 "다중특이적" 항체도 제공한다. 따라서, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위는 2개 이상 (예를 들어, 2개 내지 약 3개)의 다양한 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다.
본원은 수용체 항원에 대해 유도된 다가 항체가 천연 리간드와 정량적으로 유사한 정도의 아고니스트성 및(또는) 아폽토시스-유도 능력을 갖도록 유전공학적으로 개조될 수 있음을 밝힌다. 본 명세서에서 "정량적으로 유사한"은 다가 항체가 아고니스트 활성 및(또는) 아폽토시스-유도 활성을 측정하는 분석에서 천연 리간드의 아고니스트 활성 및(또는) 아폽토시스-유도 활성의 약 10배 이내, 바람직하게는 약 5배 이내의 상기 활성을 갖는다는 것을 의미한다. 이 실시양태에서, 아고니스트 활성 및(또는) 아폽토시스-유도 활성을 갖는 항체의 활성이 하기 실시예 3에 기재된 것과 같은 아폽토시스 분석에서 Apo2L의 활성의 약 10배 이내, 예컨대, 약 5배 이내인 경우, 상기 활성을 갖는 항체는 TNF 수용체 상과에 속하는 수용체, 예컨대, DR4, DR5, DcR1 및 DcR2 (바람직하게는 DR4 또는 DR5)와 같은 Apo2L 수용체에 대한 특이성을 갖는 것일 수 있다.
본원의 다가 항체는 본 발명의 한 실시양태에서 B 세포 표면 항원에 결합할 수 있다. 바람직한 B 세포 표면 항원에는 CD19, CD20, CD22 및 CD40이 포함되고, 가장 바람직하게는 상기 항원은 CD20이다.
본원의 다가 항체의 다양한 용도도 고려되고 하기에 더 자세히 기재되어 있다. 다가 항체가 하나 이상의 Fc 영역을 갖는 경우, 이 다가 항체는 이펙터 기능 (예컨대, ADCC 및 CDC)을 매개하는 능력을 갖고 Fc 영역을 갖지 않는 다가 항체보다 더 긴 반감기를 갖는 것으로 기대된다. 이러한 다가 항체는 종양 세포 또는 암세포와 같은 세포의 사멸이 바람직한 경우 사용할 수 있다. Fc 영역을 갖지 않는 본원의 다가 항체의 다른 형태는 보다 짧은 반감기가 바람직한 경우 (예컨대, 심혈관 또는 염증 질환 또는 장애의 치료를 위한 경우, 또는 항체가 세포독성제와 결합되어 있는 경우); 항체의 내재화가 바람직한 경우 (예컨대, 항체 및 세포독성제를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트를 사용하는 치료의 경우); 고형 종양의 개선된 침투를 위한 경우; 비-포유동물 숙주 세포 (예컨대, 이. 콜라이 숙주 세포와 같은 원핵 숙주 세포)에서의 다가 항체의 발현이 바람직한 경우; 비-종양성 질환 또는 장애의 치료를 위한 경우; 및(또는) 이펙터 기능(들)을 갖는 특정 항체를 환자에게 투여할 때 관찰되는 '제1 투여량 효과'를 피해야 할 경우에 바람직할 수 있다. 이러한 항체 형태는 류신 지퍼 도메인에 융합된 항체 힌지 영역을 포함하는 이량체화 도메인을 포함는 다가 항체 (상기 류신 지퍼 도메인은 이량체화 도메인을 형성하는 폴리펩티드의 결합을 용이하게 하지만, 환자에게 투여하기 전에 단백질분해효소에 의해 제거할 수 있음) (도 23C); 도 23D에 기재된 것과 같은 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체; 또는 도 23E에 기재된 것과 같은 4개의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체를 포함할 수 있다.
B. 항원 결합 특이성
본원의 다가 항체는 하나 이상의 표적 항원(들)에 대하여 지시되거나, 이들에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 다가 항체가 결합된 항원들 중 하나 이상은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이며, 질병 또는 질환을 앓는 포유동물에게 이 항체를 투여하면 이 동물의 치료에 이로울 수 있다. 그러나, 비폴리펩티드 항원 (예컨대, 종양-관련 당지질 항원; 미국 특허 제5,091,178호 참조)에 대해 지시되는 항체가 또한 고려된다.
항원이 폴리펩티드인 경우, 항원은 막횡단 분자 (예컨대, 수용체) 또는 리간드, 예를 들어 성장 인자일 수 있다. 항원의 예로는 레닌과 같은 분자; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 (TF), 및 폰 빌레브란트 (von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C; 심방 나트륨배설증가인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성자, 예를 들어 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 활성화된 T-세포에 의한 발현 및 분비를 조절); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민; 뮬러리안 (Muellerian)-억제성 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예를 들어 베타락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예를 들어 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티즘성 인자; 신경영양성 인자, 예를 들어 골-유도 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 변형 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD25 (IL-2 수용체의 Tac 서브유닛); 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 쇠퇴 촉진 인자;바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 엔벨로프의 부분; 운반 단백질; 호밍 (homing) 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 또는 VCAM; 종양 관련 항원, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 나열된 임의의 폴리펩티드의 단편이 포함된다.
본 발명에 포함되는 항체에 대한 바람직한 표적 분자로는 백혈구 표면 마커 또는 CD 단백질, 예를 들어 CD1a-c, CD2, CD2R, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16, CD16b, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, C41, CD42a-d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD45A, CD45B, CD450, CD46-CD48, CD49a-f, CD50, CD51, CD52, CD53-CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CDw65, CD66a-e, CD68-CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a-b, CD80-CD83, CDw84, CD85-CD89, CDw90, CD91, CDw92, CD93-CD98, CD99, CD99R, CD100, CDw101, CD102-CD106, CD107a-b, CDw108, CDw109, CD115, CDw116, CD117, CD119, CD120a-b, CD121a-b, CD122, CDw124, CD126-CD129, 및 CD130; ErbB 수용체 군의 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, HER2 수용체, HER3 수용체 또는 HER4 수용체; 전립선 특이적 항원(들); 세포 부착 분자, 예를 들어 IIb/IIIa, LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, α4/β7 인테그린, 및 αv/β3 인테그린 (그의 α또는 β서브유닛 포함) (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예를 들어 VEGF; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (α-IFN); 인터루킨, 예를 들어 IL-8; IgE;혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; c-mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등이 포함된다.
임의로 다른 분자와 연결된 가용성 항원 또는 그의 단편이 항체를 발생시키기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예를 들어 수용체의 경우, 그의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)을 면역원으로 사용할 수 있다. 또는, 막횡단 분자를 발현시키는 세포를 면역원으로 사용할 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예를 들어, 암세포주)으로부터 유래하거나, 막횡단 분자를 발현시키기 위한 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태는 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에서 다가 항체에 대한 바람직한 표적 항원으로는 (1) ErbB 수용체 (EGFR, HER2, HER3 및 HER4 포함); (2) TNF 수용체 거대족의 수용체, 예를 들어 Apo2L 수용체, 예를 들어 DR4, DR5, DcR1 및 DcR2; (3) B 세포 표면 항원, 특히 CD19, CD20, CD22 및 CD40; (4) 종양 세포에 의해 발현되는 항원; (5) 종양 세포에 의해 과다발현되는 항원 (예를 들어, ErbB 수용체; DcR3 수용체); (6) 다량체 (예를 들어, 이량체 또는 삼량체) 리간드에 의해 활성화된 수용체 (예를 들어, TNF 수용체 거대족의 수용체; VEGF 수용체 등)가 포함된다. 한 실시양태에서, 다가 항체의 항원 결합 부위들 중 3곳 이상 (예를 들어, 4곳 내지 약 8곳)은 모두 상기 항원들 중 하나에서 동일한 항원 결정자 또는 에피토프에 대해 지시될 수 있다.
본원은 또한 다중특이적 항체, 즉, 2개 이상의 상이한 에피토프 또는 항원 결정자에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 제공한다. 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체; BsAb)는 폭넓은 임상 분야에서 시험관내 및 생체내 면역진단 및 치료, 및 진단 면역분석용 표적 분자로서 상당한 가능성을 갖는다.
이중특이적 항체는 세포 표면 분자의 기능적 특성을 조사하고 다른 Fc 수용체가 세포독성을 매개하는 능력을 정의하는데 있어서 매우 유용한 것으로 밝혀졌다 (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12: 101-124 (1992)). 문헌 (Nolan et al., Biochem. Biophys. Acta. 1040: 1-11 (1990))은 BsAb에 대한 다른 진단 용도를 기재하고 있다. 특히, 효소 면역분석에 사용되는 효소를 고정하도록 BsAb를 구성할 수 있다. 이를 달성하기 위해, BsAb의 하나의 암 (arm)이 효소상의 특정의 에피토프에 결합하도록 설계하는데, 이 결합은 효소 저해를 일으키기 않으며, BsAb의 다른 암은 고정 매트릭스에 결합하여 효소가 목적하는 부위에서 고밀도로 존재하도록 보장한다. 이러한 진단 BsAb의 예로는 문헌 (Hammerling et al., J. Exp. Med. 128 : 1461-1473 (1968))에 기재된 토끼 항-IgG/항-페리틴 BsAb가 포함되며, 이를 사용하여 표면 항원을 위치화하였다. 또한, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)뿐만 아니라 호르몬에 대하여 결합 특이성을 갖는 BsAb가 개발되었다. BsAb에 대한 다른 잠재적인 면역화학적 용도로는 2-부위 면역분석에 있어서 이들의 용도가 포함된다. 예를 들어, 분석 대상 단백질상의 2가지 다른 에피토프에 결합하는 2가지 BsAb가 생산되었는데, 이 중 하나의 BsAb는 결합물을 불용성 매트릭스에 결합시키며, 다른 BsAb는 지시 효소와 결합한다 (문헌 (Nolan et al., supra)을 참조).
다중특이적 항체는 또한 암과 같은 다양한 질병의 시험관내 또는 생체내 면역진단에 사용될 수도 있다 (Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79: 315(1990)). BsAb의 이러한 진단 용도를 용이하게 하기 위해, BsAb의 하나의 암은 종양 관련 항원에 결합할 수 있으며, 다른 암은 검출가능한 마커, 예를 들어 방사성핵종에 단단하게 결합하는 킬레이트제와 결합할 수 있다. 이러한 방법을 이용하여, 문헌 (Le Doussal et al)에서는 종양배 항원 (CEA)과 결합한 하나의 암 및 디에틸렌트리아민펜트아세트산 (DPTA)과 결합한 다른 암을 갖는, 결장직장암 및 갑상선암의 방사성면역검출에 유용한 BsAb를 제조하였다 (문헌 (Le Doussal et al., Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62 (1992) and Le Doussal et al., J. Nucl. Med. 34: 1662-1671 (1993))을 참조한다). 스티크니 (Stickney) 등의 문헌에는 유사하게 방사성면역검출법을 이용하여 CEA를 발현시키는 결장직장암을 검출하는 전략이 기재되어 있다. 이들 발명자들은 CEA뿐만 아니라 히드록시에틸티오우레아-벤질-EDTA (EOTUBE)와 결합하는 BsAb를 기재하고 있다 (문헌 (Stickney et al., Cancer Res. 51: 6650-6655 (1991))을 참조한다).
또한, 다중특이적 항체는 표적 (예를 들어, 병원체 또는 종양 세포)과 결합하는 하나의 암 및 세포독성 개시 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 또는 Fc 감마 수용체와 결합하는 다른 암을 제공함으로써 재지시된 세포독성에서 인간 치료에 사용될 수도 있다. 따라서, 다중특이적 항체를 사용하여 종양 세포 또는 감염성 물질에 대해 특이적으로 대상의 세포 면역 방어 메카니즘을 지시할 수 있다. 이러한 전략을 이용하여, Fc 감마 RIII (즉, CD16)에 결합하는 이중특이적 항체가 시험관내에서 자연 살 (NK) 세포/대형 과립 림프구 (LGL) 세포에 의한 종양 세포 사멸을 매개할 수 있고, 생체내에서 종양 증식을 방지하는데 효과적임을 입증하였다(Segal et al., Chem. Immunol. 47: 179 (1989) and Segal et al., Biologic Therapy of Cancer 2 (4) DeVita et al. eds. J. B. Lippincott, Philadelphia (1992) p.1). 유사하게, Fc 감마 RIII와 결합하는 하나의 암 (arm) 및 HER2 수용체에 결합하는 다른 암을 갖는 이중특이적 항체가, HER2 항원을 과다발현하는 난소 및 유방 종양의 치료를 위해 개발되었다 (Hseih-Ma et al. Cancer Research 52: 6832-6839 (1992) and Weiner et al. Cancer Research 53: 94-100 (1993)). 이중특이적 항체는 또한 T 세포에 의한 사멸을 매개할 수도 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체는 T 세포상의 CD3 결합물을 종양 관련 항원에 연결시킨다. 항-p185HER2에 연결된 항-CD3로 구성된 완전한 인간화 F(ab')2BsAb를 사용하여 T 세포를 표적화함으로써 HER2 수용체를 과다발현하는 종양 세포를 사멸시켰다 (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 (1) : 217 (1992)). 이중특이적 항체를 초기 단계의 여러 임상 실험에서 시험하여 만족할만한 결과를 얻었다. 한 실험에서, 폐암, 난소암 또는 유방암을 앓는 12명의 환자에게 항-CD3/항-종양 (MOC31) 이중특이적 항체와 함께 표적화된 활성화 T-림프구를 주입하여 치료하였다 (deLeij et al. Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger and Segal Eds., Lienhart (1991) p.249). 표적화된 세포는 종양 세포를 국소적으로 상당히 용해시켰고, 경증의 염증 반응을 유도하였지만, 항-마우스 항체 반응 또는 독성 부작용은 없었다. B 세포 종양에 걸린 환자에서 항-CD3/항-CD19 이중특이적 항체에 대한 매우 예비적인 실험에서, 말초 종양 세포수가 또한 상당히 감소되었다(Clark et al. Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger and Segal Eds., Lienhart (1991) p.243). 또한, 다중특이적 항체에 대한 치료적 사용에 관하여는 문헌 (Kroesen et al., Cancer Immunol. Immunother 37: 400407 (1993), Kroesen et al., Br. J. Cancer 70: 652-661 (1994) and Weiner et al., J. Immunol. 152: 2385 (1994))을 참조한다.
다중특이적 항체는 또한 섬유소용해제 또는 백신 보조제로 사용될 수도 있다. 또한, 이들 항체는 감염성 질병의 치료에 사용되거나 (예를 들어, 이펙터 세포를 바이러스에 감염된 세포, 예를 들어 HIV 또는 인플루엔자 또는 원생동물, 예를 들어 톡소플라즈마 곤델 (Toxoplasma gondel)로 표적화하기 위해), 면역독소를 종양 세포에 전달하는데 사용되거나, 또는 면역 결합물을 세포 표면 수용체로 표적화하는데 사용될 수 있다 (문헌 (Fanger et al., supra)을 참조한다).
다양한 다중특이적 항체가 본원에 포함된다. 예를 들어, 다중특이적 항체는 목적 항원상의 2개 이상의 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 또는, 다중특이적 항체는 (1) 표적 세포에 의해 발현되는 항원 (예를 들어, 표적 세포가 종양 세포인 경우) 및 (2) 백혈구상의 개시 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예, CD2 또는 CD3), 또는 IgG (Fc 감마 R)에 대한 Fc 수용체, 예를 들어 Fc 감마 RI (CD64), Fc 감마 RII (CD32) 및 Fc 감마 RIII (CD16)에 대한 특이성을 보유하여, 세포 방어 메카니즘을 항원-발현 세포로 집중시킬 수 있다. 다중특이적 항체를 사용하여 표적 항원을 발현시키는 세포에 세포독성제를 집중시킬 수 있다. 이러한 항원은 표적 항원과 결합하는 암 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 인터페론-알파, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)와 결합하는 암을 보유한다.
WO 96/16673은 이중특이적 항-HER2/항-Fc 감마 RIII 항체를 기재하고 있으며, 미국 특허 제5,837,234호는 이중특이적 항-HER2/항-Fc 감마 RI 항체를 개시하고 있다. 이중특이적 항-HER2/Fc 알파 항체는 W098/02463에 나타나 있다. 미국 특허 제5,821,337호는 이중특이적 항-HER2/항-CD3 항체를 교시한다.
C. 모항체의 제조
다가 항체를 생성하기 위해, 하기에 기재된 것과 같은, 항체 제조를 위한 다양한 방법을 이용하여 항원에 대하여 지시되는 가변 도메인을 갖는 "모" 또는 "출발" 항체를 제조할 수 있다. 출발 또는 모항체의 가변 도메인의 서열은 본 발명의 다가 항체를 설계하는데 사용될 수 있다.
(i) 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제를 피하 (sc) 또는 복강내 (ip)로 여러번 주사하여 동물내에서 유발시킨다. 그 관련 항원을, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 삿갓조개 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 타이로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에, 이관능성 작용제 또는 유도화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 결합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기에서, R 및 R1은 상이한알킬기임)을 사용하여 결합시키는 것이 유용할 수 있다.
동물을 예를 들면, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 결합물 (각각 토끼와 마우스에 대해)을 3 부피의 프로인드(Freund's) 완전 보조제와 혼합하고, 이 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 결합물 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에, 동물을 원래의 양의 1/5 내지 1/10의 프로인드 완전 보조제 중의 펩티드 또는 결합물로 다수 부위에 피하 주사함으로써 재면역시켰다. 7 내지 14일 후, 동물을 채혈하고, 혈청을 항체 역가에 대해 분석하였다. 역가가 정체 (plateau)될 때까지 동물을 재면역시킨다. 바람직하게는, 동일한 항원을 상이한 단백질에, 및(또는) 상이한 가교결합제를 통해 결합시킨 결합물로 동물을 재면역화한다. 결합물은 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양을 통해 제조할 수 있다. 또한, 적합하게는 명반(alum)과 같은 응집제를 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.
(ii) 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 실질적으로 균질 항체의 집단으로부터 얻으며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 소량 존재할 수 있는 가능한 자연 변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변형 "모노클로날"은 별개의 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 지시한다.
예를 들면, 모노클로날 항체는 문헌[코흘러 (Kohler) 등, Nature, 256: 495 (1975)]에서 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)을 이용하여 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 면역화를 위해 사용된 단백질에 충분하게 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하도록 마우스, 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물을 상기한 바와 같이 면역화시킨다. 별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [고딩 (Goding), Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].
이렇게 제조한 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합 골수종 모세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배지 중에 접종하고 배양시킨다. 예를 들면, 골수종 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11, 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 매릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것과 같은 쥐 골수종 세포주이다. 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되었다 [코즈보르 (Kozbor), J. Immunol., 133: 3001 (1984); 및 브로듀어 (Brodeur) 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
하이브리도마 세포가 성장하는 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침강법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들면, 먼슨 (Munson) 등 [Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐차드 (Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 방법에 의해 클론을 서브클로닝하고 표준 방법 [고딩, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]으로 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로즈 (Sepharose), 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 항체 정제 방법에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리시킨다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법 (예를 들면, 쥐과동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)을 이용하여 쉽게 단리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 기원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 백터내로 넣을 수 있고, 이어서, 그렇지 않으면 항체 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킨다. 항체를 코딩하는 DNA의 세균에서의 재조합 발현에 대한 리뷰 문헌은 문헌[스케라 (Skerra) 등, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993); 및 플뤼턴 (Plueckthun), Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)]을 포함한다. 항체의 재조합 발현은 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.
다른 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 문헌 [맥카퍼티 (McCafferty) 등, Nature, 348: 551-554 (1990)]에 기술된 기법을 이용하여 생산된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌[클랙슨 (Clackson) 등, Nature, 352: 624-628 (1991) 및 막스 (Marks) 등, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]에서는 파아지 라이브러리를 사용하는 쥐과동물 및 인간 항체의 단리를 각각 기술하였다. 이후의 문헌에서는 체인 서플링(chain shuffling)에 의한 고친화도(nM 범위)의 인간 항체의 생산 [막스 등, Bio/Technology 10: 779-783 (1992)] 뿐만 아니라, 매우 큰 파아지 라이브러리의 제조 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 [워터하우스 (Waterhouse) 등, Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)]을 기술하였다. 따라서, 이들 기법은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기법에 대한 가능한 대안이다.
DNA는 또한 예를 들면, 동종 쥐과동물 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 문헌[모리슨 (Morrison) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)]), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.
전형적으로 그러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어 항원에 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.
(iii) 인간 항체
융합 대상물로 인간 B 림프구를 사용하여 콜러 (Kohler) 및 밀스타인 (Milstein)에 의해 기재된 제1 하이브리도마 방법의 적용을 통해 인간 모노클로날 항체를 제조하였다. 목적 항체를 생산하는 인간 B 림프구는 예를 들어 사전 동의를 구한 다음 인간 개체로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 개체는 전신성 홍반성 루프스 (Shoenfeld et al. J. Clin. Invest. 70: 205 (1982)), 면역-매개 혈소판감소성자반병 (ITP) (Nugent et al. Blood 70 (1) : 16-22 (1987)) 또는 암과 같은 특정 질병에서 발생하는 자가항원에 대한 항체를 제조할 수 있다. 별법으로 또는추가로, 시험관내에서 림프구를 면역화할 수 있다. 예를 들어, 단리된 인간 말초 혈액 림프구를 시험관내에서 리소좀영양제 (예를 들어, L-루이신-0-메틸 에스테르, L-글루탐산 디메틸 에스테르 또는 L-루이실-L-루이신-O-메틸 에스테르) (미국 특허 제5,567,610호, Borrebaeck et al.)에 노출시키고(시키거나), T-세포 결핍된 인간 말초 혈액 림프구를 시험관내에서 보조제, 예를 들어 8-메르캅토구아노신 및 사이토킨 (미국 특허 제5,229,275호, Goroff et al.)으로 처리할 수 있다.
이어서, 대상으로부터 수획되거나 시험관내에서 면역화된 B 림프구는 일반적으로 인간 모노크로날 항체를 생성하기 위해 불멸화된다. B 림프구를 불멸화하는 기술로는 (a) 인간 B 림프구를 인간, 쥐과동물 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포와 함께 융합하는 방법; (b) 바이러스 형질전환 (예를 들어, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스로의 형질전환; 예를 들어, 문헌 (Nugent et al., supra) 참조); (c) 림프아형 세포주와의 융합; 또는 (d) 림프종 세포와의 융합이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킬 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이렇게 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 골수종 모세포의 증식 또는 생존을 억제하는 한가지 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지중에 접종하여 증식시킨다. 예를 들어, 골수종 모세포에 효소인 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 통상적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이러한 물질은 HGPRT 결핍 세포의 성장을 억제할 것이다. 적합한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 문헌 (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))에 기재되어 있다. 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를, 항원에 대하여 지시되는 모노클로날 항체의 생산에 관하여 분석하였다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 분석법, 예를 들어 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)에 의해 결정한다.
바람직한 특이성, 친화성 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 다음, 제한 희석법에 의해 클론을 서브클로닝하여 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 들 수 있다. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 적합하게는, 예를 들어 단백질 A 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 이뮤노글로불린 정제 방법에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리한다.
인간 항체를 생산할 수 있는 마우스 등의 비인간 숙주를 이용하여 인간 항체를 생성시킬 수도 있다. 상기 언급한 바와 같이, 면역화에 있어서 내생 이뮤노글로불린 생산의 부재하에 완전한 인간 항체 목록을 생산할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 본 발명에 이용할 수 있다. 예를 들어, 키메릭 및 배선 (germ-line) 돌연변이 마우스에서의 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동종접합 결실은 내생 항체 생산을 완전히 억제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 배선 돌연변이 마우스내에 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 배열을 전달하면 항원 투여시 인간 항체를 생산하게 될 것이다 (예를 들어, 문헌 (Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); 미국 특허 제5,591,669호; 미국 특허 제5,589,369호; 및 미국 특허 제5,545,807호)을 참조한다). 인간 항체는 SCID-hu 마우스를 이용하여 제조할 수도 있다 (Duchosal et al. Nature 355: 258-262 (1992)).
다른 실시양태에서, 인간 항체는 인간 항체 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택할 수 있다. 항체 또는 그의 단편에 대한 라이브러리의 제조는 당업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 방법들 중 어떤 것을 이용하여 숙주 세포내에 도입될 수 있는 형질전환 벡터 종류를 구성할 수 있다. 파아지에서 항체 경쇄 및 중쇄의 라이브러리 (Huse et al., Science, 246: 1275 (1989)) 또는 파아지 또는 파아지미드에서 융합 단백질의 라이브러리는 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 7978-7982 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 4457-4461 (1992) ; Griffiths et al., EMBO Journal, 13: 3245-3260 (1994); de Kruif et al., J. Mol. Biol., 248: 97-105 (1995); WO 98/05344; WO 98/15833; WO 97/47314; WO 97/44491; WO 97/35196; WO 95/34648; 미국 특허 제5,712,089호; 동 제5,702,892호; 동 제5,427,908호; 동 제5,403,484호; 동 제5,432,018호; 동 제5,270,170호; WO 92/06176; WO 99/06587; 미국 특허 제5,514,548호; W097/08320; 및 미국 특허 제5,702,892호)을 참조한다. 표적 항원에 결합하는 파아지-항체를 선별하는 분야에 공지된 방법을 이용하여 목적 항원을 파아지 라이브러리에 대하여 패닝한다.
(iv) 인간화 항체
비인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비인간 기원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 부르며, 전형적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열 대신 초가변 영역 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [존스 (Jones) 등, Nature, 321: 522-525 (1986); 리치만 (Riechmann) 등, Nature, 332: 323-327 (1988); 베르호옌 (Verhoeyen) 등, Science, 239: 1534-1536 (1988)]에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 온전한 인간 가변 도메인이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 유사한 부위로부터의잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하기 위해 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 도메인 모두)의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "베스트핏 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용한다 [심스 (Sims) 등, J. Immunol, 151: 2296 (1993); 코티아 (Chothia) 등, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)]. 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 [카터 (Carter) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); 프레스타 (Presta) 등, J. Immnol., 151: 2623 (1993)].
항원에 대한 높은 친화도와 다른 양호한 생물학적 특성을 보유하면서 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모서열과 다양한 구상되는 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조한다. 3차원 이뮤노글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하고, 당업계의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 배위 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이를 점검하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보이뮤노글로불린의 능력에 영향을 끼치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특성을 성취하도록, 수용체 및 임포트 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 결합시킬 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역의 잔기는 항원 결합에 영향을 주는데 직접적으로, 가장 실질적으로 관여된다.
(v) 항체 단편
항체 단편을 생성하기 위한 각종 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체를 단백질 분해적 분해함으로써 유도된 것이었다 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]. 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성할 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접적으로 회수할 수 있고, F(ab')2단편을 형성하도록 화학적으로 커플링시킬 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 또 다른 접근법에 따라서, F(ab')2단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리할 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 기타 기술이 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다. 기타 양태에서는, 선택된 항체가 단일쇄 Fv 단편 (svFv)이다 [WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 동 제5,587,458호 참조]. 이러한 항체 단편은 또한, 예를 들면 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일 특이적이거나 이중 특이적일 수 있다.
(vi) 항체 변이체 서열
본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형물(들)이 고려된다. 예를 들면, 이러한 항체의 결합 친화도 및(또는) 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오티드를 변화를 상기 항체 핵산에 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형에는, 예를 들면 항체의 아미노산 서열내의 잔기로부터의 결실, 및(또는) 잔기로의 삽입 및(또는) 잔기의 치환이 포함된다. 최종 구조물에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합도 가능한데, 단 최종 구조물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 상기 아미노산 변화는 또한, 항체의 번역 후 과정을 변화시킬 수 있는데, 예를 들면 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다. 이러한 변화는 모항체 및(또는) 다가 항체에 적용될 수 있고(있거나) 서열이 만들어지는 시기에 다가 항체 아미노산 서열내에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발에 바람직한 위치인, 항체의 특정 잔기 또는 영역을 동정하는데 유용한 방법이 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리운다. 여기서는, 표적 잔기 또는 잔기 그룹을 동정하고 (예를 들면, 하전된 잔기, 예를 들면 arg, asp, his, lys 및 glu), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시킴으로써, 상기 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 이러한 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산부위들은, 추가의 또는 기타 변이체를 치환 부위에 또는 치환 부위 대신에 도입함으로써 정련된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되긴 하지만, 돌연변이 자체의 성질은 예정될 필요가 없다. 예를 들면, 소정의 부위에서의 돌연변이의 수행을 분석하기 위해서, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발을 수행하고, 발현된 다가 항체를 대상으로 하여, 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입물에는 길이가 1개의 잔기에서 수 백개 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합물 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입물이 포함된다. 말단 삽입물의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체가 포함된다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예: ADEPT용 효소)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단의 융합물이 포함된다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기로써 대체된, 항체 분자내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환적 돌연변이 유발에 가장 큰 관심을 끄는 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변형도 또한 고려된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환부"란 표제하에 표 1에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 1에서 "예시적 치환부"로 명명되거나 아미노산 부류를 참조하여 다음에 추가로 기재된 바와 같은 보다 실제적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물을 스크리닝하게 된다.
본래의 잔기 예시적 치환기 바람직한 치환기
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gln; his; asp; lys; arg gln
Asp (D) glu; asn glu
Cys (C) ser; ala ser
Gln (Q) asn; glu asn
Glu (E) asp; gln asp
Gly (G) ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; 노르루이신 leu
Leu (L) 노르루이신; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro (P) ala ala
Ser (S) Thr thr
Thr (T) Ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; 노르루이신 leu
항체의 생물학적 특성에 있어서의 실제적인 변화는 (a) 치환 영역내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 공통의 측쇄 특성에 기초하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다.
항체의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 항체에 부가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다.
특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모항체 (예: 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환한 것과 관련이 있다. 일반적으로, 이로써 생성된, 추가의 개발을 위해 선택된 변이체(들)은 이들이 생성되는 모항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 지닐 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성시키는 편리한 방법은 파아지 디스플레이를 이용하는 친화도 성숙화 과정을 포함한다. 간략하게 언급하면, 몇 개의 초가변 영역 부위 (예: 6 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에 가능한 모든 아미노산 치환부를 생성시킨다. 이로써 생성된 항체 변이체는, 각 입자내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 필라멘트상 파아지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파아지 디스플레이된 변이체를 대상으로 하여, 본원에 기재된 바와 같이 이들의 생물학적 활성 (예: 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형에 적합한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기위해서는, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여, 실질적으로 항원 결합성에 기인되는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 상기 항체와 항원 간의 접촉점을 동정하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기와 이에 이웃하는 잔기가 본원에서 검토된 기술에 따른 치환 대상 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 대상으로 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 분석법에서 탁월한 특성을 나타내는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.
항체의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 항체내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
글리코실화 부위의 항체로의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조된다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연의 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 올리고뉴클레오티드 매개된 (또는 부위 지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 항체의 항원-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 향상시키도록, 본 발명의 항체를 이펙터 기능에 대하여 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 상기 항체의 Fc 영역내의 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 변이체 Fc 영역을 생성시킴으로써 달성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 가변 Fc 영역은 인간 이펙터 세포의 존재하에 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 보다 효과적으로 매개하거나, 천연 서열 Fc 영역보다 더 높은 친화성을 가지고 Fc 감마 수용체 (FcγR)와 결합할 수 있다. 이러한 Fc영역 변이체는 Fc 영역의 위치 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 또는 430 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
FcγR에 대한 결합이 감소된 Fc 영역 변이체는 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
예를 들어, Fc 영역 변이체는 FcγRI에 대하여 감소된 결합을 나타내며, Fc 영역의 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 327 또는 329 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
Fc 영역 변이체는 FcγRII에 대하여 감소된 결합을 나타내며, Fc 영역의 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 또는 439 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
대상 Fc 영역 변이체는 FcγRIII에 대하여 감소된 결합을 나타내며, Fc 영역의 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278,289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 또는 437 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
다른 실시양태에서, Fc 영역 변이체는 FcγR에 대하여 향상된 결합을 나타내며, Fc 영역의 아미노산 위치 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 298, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 326, 330, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 또는 430 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
예를 들어, Fc 영역 변이체는 FcγRIII에 대해 증가된 결합을 나타낼 수 있으며, 임의로, FcγRII에 대한 감소된 결합을 또한 나타낼 수 있다. 전형적인 이러한 변이체는 Fc 영역의 위치(들) 298 및(또는) 333에서 아미노산 변형(들)을 포함하며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
Fc 영역 변이체는 FcγRII에 대해 증가된 결합을 나타낼 수 있으며, Fc 영역의 아미노산 위치 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 326, 330, 331, 337, 340, 378, 398 또는 430 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다. FcγRII에 증가된 결합을 나타내는 이러한 Fc 영역 변이체는 임의로 FcγRIII에 대해 감소된 결합을 또한 나타낼 수 있으며, 예를 들어 Fc 영역의 아미노산 위치 268, 272, 298, 301, 322 또는 340 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
변이체 Fc 영역은 별법으로 또는 추가로 신생아기의 변형된 Fc 수용체 (FcRn) 결합 친화성을 가질 수 있다. 이러한 변이체 Fc 영역은 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 또는 447 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다. FcRn에 대하여 감소된 결합을 나타내는 Fc 영역 변이체는 Fc 영역의 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 또는 447 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다. 또는, 상기 언급된 Fc 영역 변이체는 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
변화된 (향상 또는 감퇴된) C1q 결합 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖는 Fc 영역 변이체는 W099/51642에 기재되어 있다. 이러한 변이체는 Fc 영역의 아미노산 위치 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 또는 334 중 한곳 이상에서아미노산 치환을 포함할 수 있다. 또한, Fc 영역 변이체에 관하여는 문헌 (Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260호; 동 제5,624,821호; 및 W0 94/29351)을 참조한다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 항체 (특히, 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자 (예, IgG1, IgG2, IgG3또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 의미한다.
(vii) 이뮤노컨쥬게이트
본 발명은 또한 항체가 세포독성제, 예를 들면 화학요법제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 작은 분자 독소 또는 효소적 활성 독소, 및 그의 단편 및(또는) 변이체), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성결합물)에 결합된 이뮤노컨쥬게이트에 관한 것이다.
그러한 이뮤노컨쥬게이트를 생성시키는 데 유용한 화학요법제는 위에 기재되어 있다.
항체 및 하나 이상의 작은 분자 독소, 예를 들면 칼리케아미신, 메이탄신 (미국 특허 제5,208,020호), 트리코텐 및 CC1065의 결합물이 고려된다.
본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 항체는 하나 이상의 메이탄신 분자 (예를 들면, 항체 분자 당 약 1 내지 약 10개의 메이탄신 분자)에 결합된다. 메이탄신은, 예를 들면 May-SH3로 환원될 수 있는 May-SS-Me로 전환될 수 있으며 변형된 항체와 반응하여 메이탄시노이드-항체 이뮤노컨쥬게이트를 형성할 수 있다 [Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)].
또 다른 당해 이뮤노컨쥬게이트는 1개 이상의 칼리케아미신 분자에 결합된 항체를 포함한다. 이중 가닥 DNA를 생산할 수 있는 칼리케아미신 계열의 항생물질은 피코몰 이하의 농도에서 파괴된다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체로는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θ1 I이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 [본원에 참고로 인용된 Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993) and Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1988); 및 미국 특허 제5,714,586호; 동 제5,712,374호; 동 제5,264,586호; 및 동 제5,773,001호 참조].
사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 있다 [1993. 10. 28에 공개된 WO 93/21232 참조].
본 발명은 또한 항체와 핵분해 활성을 가진 화합물 (예를 들면, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에형성되는 이뮤노컨쥬게이트를 포함한다.
방사성결합된 항-ErbB2 항체의 생산에 각종 방사성 동위원소가 이용될 수 있다. 그 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소가 있다.
항체와 세포독성제와의 결합물은 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들면 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예: 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Scence 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DPTA)은 항체에 대한 방사성 뉴클레오티드의 결합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다 (WO 94/11026 참조). 링커는 세포내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산 불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커가 사용될 수 있다 (Chari et al. Cancer Research 52:127-131 참조).
별법으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질이, 예를 들면 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 양태에서는, 당해 항체를 종양 예비표적화에 이용하기 위하여 "수용체" (예: 스트렙타비딘)에 결합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 결합물을 환자에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환계로부터 비결합된 결합물을 제거한 후, 세포독성제 (예: 방사성 핵종)에 결합되는 "리간드" (예: 아비딘)를 투여한다.
(viii) 항체 의존성 효소 매개 전구약물 요법 (ADEPT)
본 발명의 항체는, 전구약물 (예: 펩티딜 화학요법제; WO 81/01145 참조)을 활성 항암제로 전환시키는 전구약물 활성화 효소에 당해 항체를 결합시킴으로써, ADEPT에 사용할 수도 있다 [예를 들면, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조].
ADEPT에 유용한 이뮤노컨쥬게이트의 효소 성분에는, 이를 보다 활성이고 세포독성인 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물 상에서 작용할 수 있는 효소가 포함된다.
본 발명의 방법에 유용한 효소에는 포스페이트 함유 전구약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 포스파타제; 술페이트 함유 전구약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들면, 세라티아 프로테아제, 더몰리신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카텝신 (예: 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화 전구약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물 절단성 효소, 예를 들면, β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 이들의 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 각각 자유 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들면, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 한편, 당해 분야에서 "아브자임 (abzyme)"으로서 공지되기도 하는, 효소적 활성을 지닌 항체를 사용하여 본 발명의 전구약물을 자유 활성 약물로 전환시킬 수 있다 [Massey, Nature 328:457-458 (1987)]. 항체-아브자임 결합물은 아브자임을 종양 세포 집단에 전달하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명의 효소는 상기 논의된 헤테로-이관능성 가교결합 시약을 사용하는 것과 같이, 당해 분야에 널리 공지된 기술에 의해 항체에 공유 결합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합성 영역을 포함하는 융합 단백질은, 당해 분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성할 수 있다 [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)].
(ix) 기타 항체 변형물
항체의 기타 변형물이 본원에 고려된다. 예를 들면, 항체를 각종 비단백질 함유 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜 중의 하나에 연결할 수 있다. 당해 항체는 또한, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합 반응 (예를 들면, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐내에 포획될 수 있다. 이러한 기술이 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 항체는 면역리포솜으로서 제제화될 수도 있다. 당해 항체를 함유하는 리포솜은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호; 및 WO 97/38731 (1997. 10.23자로 공개됨)]에 기재된 방법으로 제조한다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜을 일정한 공극 크기의 필터를 통하여 압출시켜, 목적하는 직경을 지닌 리포솜을 생성시킨다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 디술피드 교환 반응을 통하여 문헌[Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 결합시킬 수 있다. 화학요법제가 이러한 리포솜에 임의로 함유된다 [문헌 (Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)) 참조].
D. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명은 또한 본원에 개시된 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 그 핵산을 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 및 그 항체를 생산하기 위한 재조합 기술을 제공한다.
항체의 재조합 생산을 위해, 그를 코딩하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터내로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용함으로써 (예를 들면, 항체를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열화된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분에는, 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
본 발명의 다가 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드인 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 바람직하게 선택되는 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이여야 한다. 본래의 다가 항체 신호 서열을 인식하지 않고 이를 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을, 예를 들면 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정한 장독소 II 리더의 군 중에서 선택된 원핵 신호 서열로 치환시킨다. 효모 분비를 위해서는, 본래의 신호 서열을, 예를 들면 효모 인버타제, α 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더) 또는 산 포스파타제 리더, 씨, 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호로 치환시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들면 단순 포진 gD 신호도 이용가능하다.
그러한 전구체 영역에 대한 DNA는 리딩 프레임에서 다가 항체를 코딩하는 DNA에 라이게이션된다.
(ii) 복제 기점 성분
발현 벡터와 클로닝 벡터 모두는 이 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포내에서 복제할 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유하고 있다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는, 상기 서열이, 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제될 수 있게 해주는 것이고, 이에는 복제 기점 또는 자율 복제 서열이 포함된다. 이러한 서열은 각종 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점이 대부분의 그람-음성 세균용으로 적합하고, 2 μ플라스미드 기점은 효모용으로 적합하며, 각종 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에는 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 통상적으로 사용될 수 있다).
(iii) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 또한 선별 마커로 명명되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생물질 또는 기타 독소, 예를 들면 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주거나, (b) 보조영양 결핍을 보충해주거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 입수 가능하지 않은 중요한 영양소를 공급해주는 단백질을 코딩한다 (예를 들면, 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자).
선별 도식의 한 예는 숙주 세포의 성장을 억제하는 약물을 이용한다. 이종 유전자에 의해 성공적으로 형질전환되는 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하므로, 선별 섭생을 생존시킨다. 이러한 우성적 선별의 예들은 약물인 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용하고 있다.
포유동물 세포용으로 적합한 선별 마커의 또 다른 예는 다가 항체 핵산을 수용하는데 적격인 세포의 동정을 가능케 해주는 것인데, 예를 들면 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.
예를 들면, DHRF 선별 유전자로 형질전환시킨 세포는 먼저, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 상기 형질전환체 모두를 배양함으로써 확인된다. 야생형 DHFR이 이용되는 경우에 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.
별법으로, 다가 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선별 마커, 예를 들면, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환시키거나 또는 공동-형질전환시킨 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는, 아미노글리코시드성 항생물질, 예를 들면 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별 마커용 선별제를 함유하는 배지에서 세포 성장시킴으로써 선별할 수 있다 (미국 특허 제4,965,199호 참조).
효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39, 1979]. trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 돌연변이체 효모 균주, 예를 들면 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85:12, 1977]. 이때, 효모 숙주 세포 게놈내에 trp1 병변이 존재하는 것은, 트립토판 부재하에서의 성장에 의한 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍성 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하고 있는 공지된 플라스미드로써 보충된다.
또한, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1으로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현계는 케이. 락티스에 대해 보고되었다 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 선택에 적합한 다중 카피 발현 벡터도 또한 기재되어 있다 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 생물에 의해 인식되고 다가 항체핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터계, 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터계, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들면 tac 프로모터가 있다. 그러나, 다른 공지된 세균성 프로모터도 적합하다. 세균계에 사용하기 위한 프로모터는 다가 항체를 코딩하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실제적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 하단에 위치한 AT-풍부 영역을 갖고 있다. 많은 유전자의 전사 개시 부위로부터 70 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 모든 뉴클레오티드일 수 있다)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 AATAAA 서열이 있는데, 이는 폴리 A 테일을 코딩 서열의 3' 말단에 부가하기 위한 신호일 수 있다. 이들 서열 모두는 진핵생물 발현 벡터내에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기에 적합한 프로모팅 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들면 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.
성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 이점을 갖고 있는 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연계된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 활용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서가 또한 효모 프로모터와 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포내의 벡터로부터의 다가 항체 전사는, 폴리오마 바이러스, 전염성 상피종 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들면, 아데노바이러스 2), 소의 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻은 프로모터; 이종 포유동물 프로모터, 예를 들면 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터; 열-충격 프로모터에 의해 조절될 수 있지만, 단 이러한 프로모터들은 숙주 세포계에 적합해야 한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 함유하기도 하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 벡터로서 소의 유두종 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 인간 β-인터페론 cDNA를 마우스 세포에서 발현시키는 것에 관해서는 문헌 [Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)]을 참조하면된다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체를 프로모터로서 사용할 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
보다 고등 진핵생물에 의해 본 발명의 다가 항체를 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종 인핸서 서열을 벡터내로 삽입함으로써 증가된다. 현재, 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 당 업자는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그의 예에는 복제 기점 뒤쪽의 (bp 100-270) SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 뒤쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)]을 참조하면 된다. 이러한 인핸서는 벡터내에서 다가 항체 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 상기 프로모터의 5' 부위에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 기타 다세포 생물로부터의 핵형성 세포)에 사용된 발현 벡터는 또한 전사를 종결하고 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 종종 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 입수할 수 있다. 이들 영역은 다가 항체 코딩 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 유용한 전사 종결 성분의 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다 [WO 94/11026 및 이 문헌에 기재된 발현 벡터를 참조한다].
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원에서 벡터내의 DNA를 클로닝하거나 발현시키는데 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 상기 언급된 바와 같은 고등 진핵 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵생물에는 그람-음성 또는 그람-양성 생물, 예를 들면 엔테로박테리아세애, 예를 들면 에세리키아, 예를 들면 이. 콜라이, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들면 살로넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 또는 세라티아, 예를 들면 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라, 및 바실러스, 예를 들면 비. 서브틸리스 및 비. 리체니포르미스 (예를 들면, 1989. 4. 12에 공개된 DD 266,710에 기재된B. licheniformis41P), 슈도모나스, 예를 들면 피. 아에루기노사 및 스트렙토마이세스가 포함된다. 한가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)와 같은 기타 균주도 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시일 뿐이다.
원핵생물 이외에도, 필라멘트상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 다가 항체 코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용되고 있는 것은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 제빵용 효모이다. 그러나, 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces)숙주, 예를 들면 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. Wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 월티 (K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 더모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus), 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)(EP 183,070), 칸디다 (Candida), 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 슈와니오마이세스, 예를 들면 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) 및 필라멘트상 진균, 예를 들면 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들면 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)와 같은 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에서 사용된다.
글리코실화 다가 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수많은 바쿨로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 애집티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) 숙주 세포와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용 가능한 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 이러한 각종 바이러스성균주, 예를 들면 오토그라파 칼리포니카 (Autographa califonica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 입수 가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따른 바이러스로서 본원에 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.
그러나, 가장 큰 관심은 척추동물 세포에 있으며, 척추동물 세포를 배양물 (조직 배양물)에서 증식시키는 것이 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (293 세포 또는 현탁 배양물에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포; Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니스 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개과동물 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2); 및 골수종 또는 림프종 세포 (예, YO, J558L,P3 및 NSO 세포) (미국 특허 제5,807,715호 참조)이다.
숙주 세포를 상기 언급된 다가 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지내에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포 배양
본 발명의 다가 항체를 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. 햄스 (Ham's) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 입수 가능한 배지가 상기 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 동 제4,657,866호; 동 제4,927,762호; 동 제4,560,655호; 또는 동 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 제30,985호]에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 상기 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중의 어떠한 것에도 필요에 따라, 호르몬 및(또는) 기타 성장 인자 (예를 들면, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예를 들면, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생물질 (예를 들면, 겐타마이신 (등록상표) 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원을 보충할 수 있다. 기타 다른 필수 보충물을, 당업자에게 공지되어 있는 적당한 농도로 포함시킬 수 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것이며, 이는 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.
(ix) 정제
재조합 기술을 이용할 때, 다가 항체는 세포내 또는 주변세포질 공간내에서 생산되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 다가 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 원심분리 또는 한외여과에 의해 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립형 세포 부스러기를 제거한다. 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 방법에 대해서는 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]을 참조하면 된다. 간단하게 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 부스러기는 원심분리에 의해 제거한다. 다가 항체가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로 그러한 발현계로부터의 상등액을 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 장치와 같은 시판되는 단백질 농축 필터를 사용하여 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제를 상기 임의의 단계에 포함시켜 단백질분해를 억제할 수 있고 또한 항생물질을 포함시켜 외래 오염물의 증가를 방지할 수 있다.
세포로부터 제조된 다가 항체 조성물은, 예를 들면 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 단백질 A의 친화성 리간드로서의 적합성은 다가 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 영역의 종 및 이소타입에 따라 좌우된다. 단백질 A를 이용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제할 수 있다 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 추천된다 [Guss et al., EMBO J 5:1567-1575 (1986)]. 친화성 리간드가 부착될 매트릭스로는 대부분 아가로스가 사용되지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 조절된 공극을 갖는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스보다 더 빠른 유속 및 더 단축된 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 다가 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX (등록상표) 수지 (J.T. Baker; Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 회수될 다가 항체에 따라서 이온 교환 컬럼 상에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE (등록상표) 상에서의 크로마토그래피, 또는 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산 암모늄 침전과 다른 단백질 정제 기술이 이용될 수도 있다.
E. 제약 제제
다가 항체의 치료 제제는, 목적하는 순도를 가진 다가 항체를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합함으로써, 수용액제, 또는 동결건조 또는 기타 건조 제제 형태로 저장되도록 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용된 투여량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에는 인산염, 시트르산염 및 기타 유기 산 등의 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제 (예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (잔기 약 10개 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한, 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨 등의 당; 나트륨 등의 염 형성 카운터 이온; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN (등록상표), PLURONICS (등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면활성제가 포함된다.
본원의 제제는 또한, 치료받는 특정한 증상에 대해 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 대해 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖고 있는 화합물을 함유할 수 있다. 활성 화합물의 조합의 예는 문헌 ("In Vivo Uses for the Multivalent Antibody")의 섹션 G에 제공되어 있다. 이러한 분자는 적합하게는, 의도한 목적에 유효한 양으로 조합하여 존재한다.
활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들면 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐과 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐을 각각 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐내에 포획될 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 무균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지속 방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예에는 당해 다가 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 LUPRON DEPOT (등록상표) (젖산-글리콜산 공중합체와 로이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있지만, 어떤 히드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 체내에 장시간 잔류하는 경우, 이들 항체는 37 ℃의 습도에 노출된 결과로변성되거나 응집될 수 있어서, 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 변화를 초래할 수 있게 된다. 관련된 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통해 분자내 S-S 결합을 형성시키는 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발하여 안정화를 달성할 수 있다.
F. 다가 항체의 비-치료적 용도
본 발명의 다가 항체는 친화성 정제용 물질로서 사용될 수 있다. 이러한 과정에서는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 상기 다가 항체를 세파덱스 수지 또는 여과지 상에 고정시킨다. 이와 같이 고정된 다가 항체를 정제하고자 하는 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후 지지체를 적합한 용매로 세척하여, 고정된 다가 항체에 결합된 항원을 제외하고는 샘플 중의 거의 모든 물질을 제거시킨다. 최종적으로, 지지체를 또 다른 적합한 용매 (예: pH 5.0의 글리신 완충액)로 세척하여 다가 항체로부터 항원을 방출시킨다.
다가 항체는 진단 분석, 예를 들면 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 목적 항원의 발현을 검출하는데 유용할 수도 있다.
진단 용도의 경우, 다가 항체는 통상적으로 검출가능한 잔기로 표지될 것이다. 일반적으로 다음 범주로 나눌 수 있는 수많은 표지가 이용가능하다:
(a)35S,14C,125I,3H 및131I 등의 방사성 동위원소. 다가 항체를, 예를 들면 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 상기 방사성 동위원소로 표지시킬 수 있고, 섬광계수법을 이용하여 방사활성을 결정할 수 있다.
(b) 희토류 킬레이트 (에우로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드 등의 형광성 표지가 이용가능하다. 이러한 형광성 표지는, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 참조]에 기재된 기술을 사용하여 다가 항체에 결합시킬 수 있다. 형광측정기를 이용하여 형광을 정량할 수 있다.
(c) 각종 효소-기질 표지가 이용가능하며, 미국 특허 제4,275,149호는 이들 중의 몇몇을 논의하고 있다. 효소는 일반적으로 각종 기술을 이용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들면, 효소는 기질의 색상 변화를 촉매할 수 있는데, 이는 분광광도측정법으로 측정할 수 있다. 또는, 효소는 기질의 형광성 또는 화학발광성을 변화시킬 수 있다. 형광성 변화를 정량하는 기술은 상기에 언급되어 있다. 화학발광성 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, 측정될 수 있는 (예를 들어, 화학발광측정기 사용하여 측정함) 빛을 방사하거나 형광 수용체로 에너지를 제공할 수 있다. 효소 표지의 예로는 루시퍼라제 (예: 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균성 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제 (예: 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)), 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예: 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예: 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 있다. 항체에 효소를 결합시키는 방법이 문헌 [O'Sullivan et a., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H.Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 결합물의 예에는 다음이 포함된다:
(i) 기질로서의 수소 퍼옥시다제와 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와의 결합물 (여기서, 상기 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예: 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다);
(ii) 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼리 포스파타제 (AP)와의 결합물; 및
(iii) 발색 기질 (예: p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제와 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와의 결합물.
수 많은 기타 효소-기질 결합물이 당해 분야의 숙련인에게 입수 용이하다. 이들에 대한 일반적인 고찰은 미국 특허 제4,275,149호 및 동 제4,318,980호를 참조할 수 있다.
종종, 상기 표지를 다가 항체와 간접적으로 결합시킨다. 당해 분야의 숙련인은 이를 달성하기 위한 각종 기술을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들면, 다가 항체를 바이오틴과 결합시킨 다음, 상기 언급된 표지의 3가지 광범위한 범주 중의 어느 하나를 아비딘과 결합시킬 수 있는데, 이와 반대의 순서도 가능하다. 바이오틴은 아비딘과 선택적으로 결합하므로, 표지를 이러한 간접 방식으로 다가 항체와 결합시킬 수 있다. 또 다른 방법으로는, 표지와 다가 항체의 간접 결합을 달성하기 위하여, 다가 항체를 작은 합텐 (예: 디곡신)과 결합시키고, 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중의 하나를 항-합텐 다가 항체 (예: 항-디곡신 항체)와 결합시킨다. 이로써, 표지와 다가 항체의 간접적인 결합을 달성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 다가 항체를 표지시킬 필요가 없고, 그의 존재는 다가 항체와 결합되는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 다가 항체는 공지된 어떠한 분석 방법, 예를 들면 경쟁적 결합 분석, 직접적 및 간접적 샌드위치 분석, 및 면역침강 분석에서 이용할 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodis: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].
다가 항체를 또한, 생체내 진단 분석에 사용할 수도 있다. 일반적으로, 다가 항체를 방사성핵종 (예:111In,99Tc,14C,131I,125I,3H,32P 또는35S)로 표지시키고, 이뮤노신티오그래피를 이용하여 항원 또는 항원을 발현시키는 세포의 위치를 확인할 수 있다.
G. 다가 항체의 생체내 용도
본 발명의 다가 항체를 사용하여 포유동물, 예를 들어 이 다가 항체의 투여에 의해 호전될 수 있는 질병 또는 질환을 앓거나 앓기 쉬운 대상을 치료할 수 있을 것으로 고려된다.
항체가 ErbB 수용체, 예를 들어 HER2와 결합하는 경우, 이 항체를 사용하여 치료되는 증상으로는 양성 또는 악성 종양; 백혈병 및 림프계 악성 종양; 기타 질환, 예를 들면 신경성, 신경교성, 성상세포성, 시상하부, 선상, 마크로파지성, 상피, 스트로마, 블라스토코엘릭 (blastocoelic), 염증성, 혈관형성 및 면역학적 질환이 포함된다. 일반적으로, ErbB 수용체와 결합하는 항체를 사용하여 치료하고자 하는 질병 또는 질환은 암이다.
본원에서 치료하고자 하는 암의 예에는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프계 악성 종양이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선종 및 폐의 편평 세포 암종을 포함한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 신경교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종뿐만 아니라 두부암 및 경부암이 포함된다.
이러한 암은 일반적으로 항체가 암과 결합할 수 있도록, 항체에 의해 결합된 항원을 발현시키는 세포를 포함할 것이다. 한 실시양태에서, 암의 특징은 항원을 과다발현시키는 것 (예를 들어, ErbB 수용체를 과다발현시키는 것)일 수 있다. 암에 의한 항원의 발현을 측정하기 위해, 다양한 진단/예후 분석을 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원의 과다발현을 IHC, 예를 들어 HERCEPTEST (등록상표)(Dako)를 사용하여 분석할 수도 있으며, 항원은 HER2이다. HER2 IHC 테스트에서, 종양 생검으로부터의 파라핀 매입된 조직 절편을 IHC 분석하고, 다음과 같은 HER2 단백질 염색 강도 기준에 일치시킬 수 있다:
스코어 0
어떠한 염색도 관찰되지 않거나 종양 세포의 10% 미만에서 막 염색이 관찰된다.
스코어 1+
종양 세포의 10% 이상에서 희미하게 인지가능한 막 염색이 검출된다. 이러한 세포는 이들 막의 일부만이 염색된다.
스코어 2+
종양 세포의 10% 이상에서 약한 수준 내지는 중간 수준의 막 염색이 관찰된다.
스코어 3+
종양 세포의 10% 이상에서 중간 내지는 강한 수준의 막 염색이 관찰된다.
HER2 과다발현 평가에 대한 0 또는 1+ 스코어를 나타내는 종양은 HER2를 과다발현하지 않는 것을 특징적으로 나타낼 수 있는 반면, 2+ 또는 3+ 스코어를 나타내는 종양은 HER2를 과다발현하는 것을 특징적으로 나타낼 수 있다.
별법으로 또는 추가적으로, FISH 분석, 예를 들면 INFORM (등록상표) (공급원: Ventana, Arizona) 또는 PATHVISION (등록상표) (Vysis, Illinois)를 포르말린-고정되고 파라핀 매입된 종양 조직 상에서 수행하여 해당 종양에 의해 과다발현되는 정도 (있을 경우)를 결정할 수 있다.
한 양태에서는, 암은 EGFR, ErbB3 및 ErbB4로 이루어진 군으로부터 선택된 ErbB 수용체를 발현하는 (과다발현할 수도 있는) 것일 수 있다. EGFR, ErbB3 또는 ErbB4를 발현/과다발현할 수 있는 암의 예에는 편평 세포암; 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선종 및 폐의 편평 세포 암종을 포함한 폐암; 복막암; 간세포암; 위장암을 포함한 위암; 췌장암; 신경교아종; 자궁경부암; 난소암; 간암; 방광암; 간암; 유방암; 결장암; 결장직장암; 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암; 간암; 전립선암; 음문암; 갑상선암; 간 암종뿐만 아니라 두부암 및 경부암이 포함된다.
본원에서 치료하고자 하는 암은 ErbB 수용체, 예를 들면, EGFR의 과도한 활성화를 특징적으로 나타내는 것일 수 있다. 이러한 과도한 활성화는 ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드의 과다발현 또는 생산 증가로부터 비롯된 것일 수 있다. 본 발명의 한 양태에서는, 진단 또는 예후 분석을 수행하여, 환자의 암이 ErbB 수용체의 과도한 활성화를 특징적으로 나타내는지를 결정할 것이다. 예를 들면, 암에서 ErbB 유전자 증폭 및(또는) ErbB 수용체의 과다발현을 결정할 수 있다. 이러한 증폭/과다발현을 결정하기 위한 각종 분석은 당해 분야에서 이용가능하고 이에는 상기 언급된 IHC, FISH 및 쉐드 (shed) 항원 분석이 포함된다. 별법으로 또는 추가적으로, 종양내 또는 종양과 관련된 ErbB 리간드 (예: TGF-α)의 수준을 공지된 방법에 따라서 결정할 수 있다. 이러한 분석에 의해 시험하고자 하는 샘플내에서 단백질 및(또는) 이를 코딩하는 핵산을 검출할 수 있다. 한 양태에서는, 종양내의ErbB 리간드 수준을 면역조직화학 (IHC)을 사용하여 결정할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Scher et al. Clin. Cancer Research i:545-550 (1995))을 참조한다]. 별법으로 또는 추가적으로, 예를 들면 형광성 in situ 혼성화 또는 FISH, 서던 블롯팅 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 통하여, 시험하고자 하는 샘플 중의 ErbB 리간드 코딩 핵산 수준을 평가할 수 있다.
또한, ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드 과다발현 또는 증폭은 생체내 진단 분석을 이용하여, 예를 들어 검출하고자 하는 분자와 결합되고 검출가능한 표지 (예: 방사성 동위원소)로 표지된 분자 (예: 항체)를 투여한 다음, 표지의 위치를 알아보기 위해 환자를 외적으로 스캐닝함으로써 평가할 수 있다.
항체가 B 세포 표면 항원과 결합하는 경우, 항체를 사용하여 B 세포 림프종 (저급/소포성 비-호지킨 림프종 (non-Hodkin's lymphoma; NHL); 소 림프구 (SL) NHL; 중급/소포성 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고급 면역아세포 NHL; 고급 림프아세포 NHL; 고급 소 비-절단된 세포 NHL; 거대 질병 NHL; 맨틀 (mantle) 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 매크로글로불리네미아증 (Waldenstrom's Macroglobulinemia) 포함); 만성 림프구 백혈병 (CLL); 급성 림프아세포 백혈병 (ALL); 모발 세포 백혈병; 및 만성 골수아세포 백혈병; 및 이식후 림프구증식성 질환 (PTLD)을 치료할 수 있다.
또한, 항체, 예를 들어 항-B 세포 표면 항원 항체를 사용하여 자가면역 질환을 치료할 수 있다. 자가면역 질병 또는 질환의 예로는 염증성 반응, 예를 들어 염증성 피부 질환 (건선 및 피부염 (예, 아토피성 피부염)을 포함); 전신성 경피증및 경화증; 염증성 장질환 (예를 들어, 크론 (Crohn's) 병 및 궤양성 대장염)과 관련된 반응; 호흡 장애 증후군 (성인성 호흡 장해 증후군; ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 알러지 증상, 예를 들어 습진 및 천식, 및 T 세포 침윤 및 만성 염증성 반응을 포함하는 다른 증상; 아테롬성경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스성 관절염; 전신성 홍반성 루프스 (SLE); 당뇨병 (예, 타입 I 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노이드 (Reynaud's) 증후군; 자가면역성 갑상선염증; 알러지성 뇌척수염; 소르젠 (Sjorgen's) 증후군; 유년기 개시 당뇨병; 및 결핵증, 유육종증, 다발성근염, 육아종증 및 혈관염에서 전형적으로 나타나는 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민증과 관련된 면역 반응; 악성 빈혈 (애디슨 (Addison's) 병); 백혈구 혈구누출과 관련된 질병; 중추신경계 (CNS) 염증 질환; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (크리오글로비네미아 (cryoglobinemia) 또는 쿰스 (Coombs) 양성 빈혈을 포함하지만 이에 한정되지는 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 결합물 매개 질병; 항-사구체 기저막 질병; 항-인지질 증후군; 알러지성 신경염; 그레이브 (Graves') 병; 램버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다내분비질환; 레이터 (Reiter's) 병; 스티프-만 (stiff-man) 증후군; 베셋 (Behcet) 병; 거대 세포 동맥염; 면역 복합 신장염; IgA 신경병증; IgM 다신경병증; 면역 혈소판감소성 자반병 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 등이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
B 세포 표면 항원에 대하여 지시되는 항체를 사용하여 외래 항원에 대한 면역 반응을 차단할 수도 있다. 본원에서 "외래 항원"이란 그에게 노출되는 포유동물에서 내생성이거나 천연의 것이 아닌 분자 또는 분자들을 의미한다. 외래 항원은 포유동물에서 면역 반응, 예를 들어 체액성 및(또는) T 세포 매개 반응을 유도할 수 있다. 일반적으로, 외래 항원은 그에 대한 항체의 생산을 자극할 것이다. 본원에서 고려되는 외래 항원의 예로는 면역원성 치료제, 예컨대 단백질, 예를 들어 항체, 특히 비인간 아미노산 잔기를 포함하는 항체 (예, 설치류, 키메라/인간화, 및 영장류화 항체); 독소 (임의로, 항체와 같은 표적 분자에 결합되며, 표적 분자는 또한 면역원성일 수도 있음); 유전자 요법 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 및 아데노바이러스; 이식편; 감염성 물질 (예, 박테리아 및 바이러스); 동종항원 (즉, 동일한 종의 몇몇에서 발생하지만, 이들의 다른 구성원에서는 발생하지 않는 항원), 예를 들어 혈액형의 차이, 인간 림프구 항원 (HLA), 혈소판 항원, 이식된 기관에서 발현되는 항원, 혈액 성분, 임신 (Rh), 및 혈우병 인자 (예를 들어, 인자 VIII 및 인자 IX)를 들 수 있다.
항-B 세포 표면 항원 항체를 사용하여 이식 대기중인 포유동물을 비감응화할 수도 있다.
TNF 수용체 거대족의 수용체에 대해 지시되는 항체를 사용하여 암세포에서 아폽토시스를 활성화하거나 자극할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 세포독성제와 결합된 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트를 환자에게 투여한다. 바람직하게는, 이뮤노컨쥬게이트및(또는) 그가 결합하는 항원은 세포에 의해 내부화되어, 암세포를 사멸시키는데 있어서 암세포와 결합하는이뮤노컨쥬게이트의 치료 효능은 증가된다. 바람직한 실시양태에서, 세포독성제는 암세포에서 핵산을 표적화하거나 간섭한다. 이러한 세포독성제의 예로는 본원에 언급된 화학치료제 (예를 들어, 메이탄시노이드 또는 칼리케아마이신), 방사성 동위원소, 또는 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제 중 어떤 것을 들 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 다가 항체는 ADEPT에 사용될 수도 있다.
본원에는 다가 항체 (또는 그의 이뮤노컨쥬게이트)를, 특히 암 치료를 위한 하나 이상의 치료제(들)과 조합하는 것이 포함된다. 예를 들어, 다가 항체를 다른 다가 항체 (또는 다가 항체들), 1가 또는 2가 항체 (또는 항체들), 화학치료제(들) (화학치료제들의 혼합물 포함), 다른 세포독성제(들), 항-혈관형성제(들), 사이토카인 및(또는) 성장억제제(들)과 공동투여할 수 있다. 다가 항체가 아폽토시스를 유도하는 경우, 다가 항체를, 아폽토시스를 유도하는 하나 이상의 다른 치료제(들)과 조합하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 예를 들어, B 세포 표면 항원 (예, RITUXAN (등록상표), ZEVALIN (등록상표) 또는 BEXXAR (등록상표) 항-CD20 항체)에 대해 지시되는 아폽토시스유발성 항체 (예, 2가 또는 다가 항체)를 (1) 아폽토시스유발성 항체 (예, TNF 수용체 거대족의 수용체에 대해 지시되는 2가 또는 다가 항체, 예를 들어 항-DR4 또는 항-DR5 항체) 또는 (2) TNF 사이토카인 족의 사이토카인 (예, Apo2L)과 조합할 수 있다. 유사하게, 항-ErbB 항체 (예, HERCEPTIN (등록상표) 항-HER2 항체)를 상기 (1) 및(또는) (2)와 조합할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 환자에게 방사선 요법 (예, 외부 방사선 조사, 또는 항체와 같은 방사성 표지 물질을 사용한 치료)을 병행할 수 있다. 상기 언급된 이와 같은 병행 요법은조합 투여 (이 경우, 2가지 이상의 물질이 동일 또는 별도의 제제중에 포함됨), 및 분리 투여를 포함하며, 이 경우, 다가 항체를 보조 치료제 또는 치료제들의 투여 이전 및(또는) 이후에 투여할 수 있다.
다가 항체 (및 치료 첨가제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내 투여를 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 투여하며, 국소 치료를 위해서는 병소내 투여가 바람직하다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 다가 항체는 적합하게는 펄스 주입에 의해, 특히 감소된 투여량으로 투여된다. 바람직하게는, 투여는 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공되며, 부분적으로는 투여가 단기성인지 또는 장기성인지에 따라 달라진다.
항체 단백질을 환자에게 투여하는 것과는 별개로, 본원은 항체를 유전자 치료법에 의해 투여하는 것을 고려한다. 항체를 코딩하는 핵산 투여는 "치료 유효량의 항체를 투여하는"이란 표현으로 포괄된다. 예를 들면, 세포내 항체를 생성시키는 유전자 치료법의 사용에 관한 WO 96/07321 (1996. 3. 14에 공개됨)을 참조할 수 있다.
환자의 세포내로 핵산 (임의로 벡터내에 포함됨)을 주입하기 위한 두 가지 주요 접근법이 있다 (생체내 및 생체외). 생체내 전달의 경우에는, 통상 항체가 요구되는 부위에서 항체를 환자에게 직접 주사한다. 생체외 치료인 경우에는, 환자의 세포를 꺼낸 다음, 이들 단리된 세포내로 핵산을 도입하고, 이와 같이 변형된 세포를 환자에게 직접적으로 투여하거나, 또는 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막내에 캡슐화시킴으로써 투여한다 [미국 특허 제4,892,538호; 및 동 제5,283,187호]. 핵산을 살아있는 세포에 도입하는데 이용가능한 각종 기술이 있다. 이러한 기술은 핵산이 시험관내의 배양된 세포내로 전달되는가, 아니면 생체내에서 의도된 숙주의 세포내로 전달되는가에 따라서 다양하다. 시험관내에서 핵산을 포유동물 세포에 전달하는데 적합한 기술에는 리포솜의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등이 포함된다. 이러한 유전자의 생체외 전달에 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다. 현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스성 벡터 (예: 아데노바이러스, 단순 포진 I 바이러스, 또는 아데노계 바이러스) 및 지질-기재 시스템 (유전자의 지질 매개 전달에 유용한 지질은 예를 들면, DOTMA, DOPE, 및 DC-Chol이다)을 이용한 형질감염이 포함된다. 몇몇 상황하에서는, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등의, 표적 세포를 표적화하는 물질을 상기 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용된 경우에는, 세포내이입과 연관된 세포 표면 막 단백질과 결합하는 단백질을 이용하여, 예를 들면 특정한 세포 유형에 대해 친화성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내부화를 수행하는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 배치를 표적화하고 세포내 반감기를 증진시키는 단백질을 표적화하고(하거나) 흡수를 촉진시킬 수 있다. 수용체 매개 세포내이입 기술은, 예를 들면 문헌 [Wu et al. J. Biol.Chem. 262:4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 치료법 프로토콜에 대한 고찰은 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992); WO 93/25673 및 이 문헌에 인용된 참조문헌].
질병의 예방 또는 치료의 경우, 다가 항체의 적정 투여량은 치료될 질병의 유형, 질병의 중증도 및 진행 경과, 예방 또는 치료 목적으로 다가 항체를 투여할지 여부, 기존의 치료, 환자의 임상 이력 및 다가 항체에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 고려에 따라 달라질 것이다. 다가 항체는 적합하게는 1회 치료시 또는 일련의 치료 동안에 환자에게 투여된다.
질병의 유형 및 중증도에 따라 다르지만, 환자에 대한 다가 항체의 초기 후보 투여량은 예를 들어 1회 이상 별도 투여하든지 계속 주입하든지 간에 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예, 0.1 내지 20 mg/kg)이다. 통상적인 일일 투여량 범위는 상기 언급한 인자에 따라 다르지만 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상이다. 수일 이상에 걸쳐 반복적으로 투여하는 경우, 증상에 따라 다르지만, 치료는 질병 증상이 바람직하게 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링된다.
다가 항체 조성물은 우수한 의학적 처치와 일치하는 방식으로 제제화, 복용 및 투여될 것이다. 이러한 경우에 고려되는 인자들로는 치료될 특정 증상, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 증상, 질환의 원인, 제제 투여 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 의사가 알고 있는 다른 인자들을 들 수 있다. 투여될 다가 항체의 "치료 유효량"은 이러한 고려사항에 따라 달라질 것이며, 질병 또는 질환을 예방, 완화 또는 치료하는데 필요한 최소량이다. 다가 항체는 필요한 것은 아니지만, 임의로 당해 질환을 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 한가지 이상의 물질과 함께 제제화된다. 이러한 다른 물질의 유효량은 제제 중에 존재하는 다가 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 좌우된다. 이들은 일반적으로 상기에서 사용된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나, 상기에서 사용된 투여량의 약 1 내지 약 99%로 사용된다.
H. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 언급된 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 이러한 제품은 용기와, 이러한 용기 상에 또는 이러한 용기와 연결된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들면 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 이러한 용기는 유리나 플라스틱과 같은 각종 재료로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 해당 질환을 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고 있으며, 멸균된 입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 이러한 용기는 피하 주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 백 또는 바이알일 수 있다). 이러한 조성물 중의 하나 이상의 활성제가 다가 항체이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 해당 조성물이 선택된 질환, 예를 들면 암을 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 당해 제품은 (a) 다가 항체를 함유하는 조성물이 포함된 제1 용기; 및 (b) 세포독성제를 추가로 포함하는 조성물이 포함된 제2 용기를 포함할 수 있다. 이러한 본 발명의 양태에서의 제품은 상기 제1 및 제2 항체 조성물이 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 표시해주는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 당해 제품은 제약학적으로 허용되는 완충제,예를 들면 세균증식 억제성 주사용수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업용 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질 (기타 완충제, 희석제, 여과제, 바늘 및 주사기 포함)을 추가로 포함할 수 있다.
I. 물질의 기탁
다음의 하이브리도마 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA; ATCC)에 기탁하였다:
항체 명칭 ATCC 번호 기탁일
7C2 (항-HER2)ATCC HB-122151996. 10. 17
7F3 (항-HER2)ATCC HB-122161996. 10. 17
4D5 (항-HER2)ATCC CRL 104631990. 5. 24
2C4 (항-HER2)ATCC HB-126971999. 4. 8
3F11.39.7 (항-DR5)HB-124561998. 1. 13
3H3.14.5 (항-DR5)HB-125341998. 6. 2
3D5.1.10 (항-DR5)HB-125361998. 6. 2
3H1.18.10 (항-DR5)HB-125351998. 6. 2
4E7.24.3 (항-DR4)HB-124541998. 1. 13
4H6.17.8 (항-DR4)HB-124551998. 1. 13
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 보다 상세히 이해될 것이다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 생각해서는 안된다. 언급된 모든 문헌 및 특허 인용 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1
다가 항체의 구성
"옥토퍼스 (Octopus) 항체" (OctHER2)라 불리는 4가 항-HER2 항체를 생성하는데 사용된 구조물은 본원의 도 5에 나타나 있다. 이 옥토퍼스 항체의 골격은 재조합 인간화 모노클로날 항체 4D5 변이체 8 (rhuMAb 4D5-8) (미국 특허 제5,821,337호, Carter et al., 본원에 참고로 포함됨)이다. rhuMAb 4D5-8의 중쇄를 pRK5 벡터 (EP 307,247, 1989. 3. 15 공고)내에 서브클로닝하였다. 중쇄의 VH-CH1 영역을 돌연변이유발에 의해 제거하고, 3개의 특이적 제한 부위 (BamHI; NheI; BspEI)를 삽입하였다. 이들 부위를, 다른 항체로부터의 VH-CH1 영역을 증폭시키도록 설계된 PCR 프라이머내에 혼입시켰다. 생성된 단편을 벡터내에 서브클로닝하여 옥토퍼스 중쇄를 생성시켰다. 포유동물 세포 형질감염에서 pRK5 벡터로 옥토퍼스 중쇄를 적절한 경쇄와 공동발현시켜 완전한 옥토퍼스 항체를 생성하였다 (도 4).
직선상 Fd 영역들 사이에 삽입된 가요성 (flexible) 링커를 포함하는 옥토퍼스 구조물을 또한 조작하였다. 돌연변이유발을 통해, "gly-ser" (flex 1 링커) 또는 "gly-ser-gly-ser" (서열 10) (flex 2 링커)를 코딩하는 DNA를, 중쇄의 VH-CH1 영역을 코팅하는 DNA 사이에 삽입시켰다.
실시예 2
항-HER2 옥토퍼스 항체의 평가
OctHER2는 일시적으로 형질감염된 293 세포에서 발현되었으며 (Graham et al. J. Gen. Virol. 36: 5972 (1977)), 단백질 A 세파로스 칼럼상에서 정제하였다. 완전한 항체는 모항체의 분자량 150 kDa에 비해서 대략 245 kDa이었다. 옥토퍼스 중쇄는 75 kDa (탄수화물 제외)이었으며, 경쇄는 30 kDa이었다.
항원 결합
HER2 ELISA 분석 (Sias et al. J. Immunol. Methods 132 : 73-80 (1990))을 이용하여, OctHER2가 항원인 HER2 세포외 도메인 (HER2 ECD)에 결합하는 것을 분석하였다. 96 웰 플레이트를 HER2 세포외 도메인 (ECD) (W0 90/14357)으로 코팅하고, 항-HER2 항체의 여러 다른 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 세척하여 제거한 다음, 퍼옥시다제-결합된 제2의 항체를 가하여 ECD에 결합된 항-HER2 항체를 검출하였다. 이어서, 적절한 기질을 첨가하고, 웰을 가시화한 다음, 플레이트 판독기로 562 nm에서 정량하였다.
293 세포에 의해 발현되는 2가 인간 IgG1 항-HER2 항체 rhuMAb 4D5-8인 OctHER2 또는 2가 항-HER2 항체 HERCEPTIN (등록상표) (제넨테크, 인크 (Genentech, Inc.; South San Francisco, USA)사에서 시판)에 대한 ELISA 결과는 도 6A-C에 나타나 있다. ELISA 분석으로 분석했을 때, OctHER2는 HERCEPTIN (등록상표)과 유사한 HER2 ECD와 결합한다. 293 세포에 의해 발현되는 rhuMAb 4D5-8은 바이알화된 HERCEPTIN (등록상표) (차이니스 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포에 의해 생산됨)에 동일하게 결합하며, 이는 293 세포가 실질적으로 항체의 항원 결합 능력을 변화시키지 않음을 나타낸다.
초원심분리 분석을 이용하여, OctHER2가 4개의 항원 결합 부위 모두를 갖는 표적과 결합할 수 있는지를 결정하였다. 여러가지 양의 HER2 세포외 도메인 (ECD) (W090/14357)을 옥토퍼스 항체를 사용하여 적정하였으며, 이 비율을 기준으로 결합물의 평균 분자량을 계산하여 옥토퍼스 항체가 4개의 완전한 관능성 결합 부위 또는 3개의 관능성 결합 부위를 갖는 것으로 추정하였다. 이러한 이론치 (원형, OctHER2는 4개의 관능성 결합 부위를 갖는 것으로 추정; 사각형, OctHER2는 3개의 관능성 결합 부위를 갖는 것으로 추정)를 실제로 구한 실험값 (삼각형)과 비교하였다. 도 7에 나타낸 실험값은 4개의 결합 부위를 나타내는 곡선에 보다 가깝지만, 관찰된 편차는 4개의 부위 모두가 동일한 친화성으로 결합하지 않을 수 있음을 나타낸다.
생물학적 기능
항증식 분석: HER2 과다발현 종양 세포주의 성장 억제를 측정하는 기능 분석에서 OctHER2를 HERCEPTIN (등록상표)과 비교하였다. 문헌 (Lewis et al. Cancer Immuno. Immunother. 37: 255-263 (1993))에 기재된 성장 억제 분석을 이용하였다. 요컨대, OctHER2 및 HERCEPTIN (등록상표)의 단계적 희석물을 플레이트화 세포의 배지에 가한 다음, 5일 동안 계속 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음, 분광광도법에 의해 정량하였다. 크리스탈 바이올렛은 세포를 염색하여 처리한 후 세포 성장을 측정할 수 있게 하는 비색 염료이다.
3+ HER2 과다발현 세포 (HERCEPTIN (등록상표)은 이 세포에 매우 효과적임)에서, OctHER2는 SKBR3 세포의 성장을 억제하는데 있어서 유사하거나 약간 더 우수하였지만 (도 8A), BT474 세포에 대하여는 효과적이지 못하다 (도 8B). 흥미롭게도, OctHER2는 HERCEPTIN (등록상표)보다 2+ 과다발현 세포주인 MDA 361을 더 효과적으로 억제하였다 (도 8B).
도 9에 나타낸 바와 같이, 가요성 링커 옥토퍼스 구조물 (OctHER2flex1, OctHER2flex2)은 HERCEPTIN (등록상표)보다 세포 성장을 더 효과적으로 억제하였다.
내부화 분석: 면역독소 요법에서 옥토퍼스 항체의 이용을 평가하기 위해, 그의 내부화 능력을 평가하였다. 항체 아밍 (arming) 또는 면역독소 요법에서, 세포독성제를 항체에 결합시키거나 그와 융합시키며, 이렇게 하여 생성된 면역독소는 그의 세포내 표적에 특이적으로 결합하고; 이와 같이 결합된 세포는 항체를 내부화하여, 세포를 사멸시키는 독소를 방출하는 항체를 이화시키거나 분해한다.
본원에서 수행된 내부화 분석에서, 항체를 방사성요오드화하고, 여러 시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 상등액 중의 온전한 비결합 항체의 양, 세포 표면에 결합된 양, 내부화된 양, 및 마지막으로 이화 및 분해된 양을 측정하였다.
3+ 과다발현 세포주 (SKBR3) 및 2+ 과다발현 세포주 (MDA453)에 대하여 수행된 내부화 분석의 결과 (굵은 선은 2+ HER2 과다발현자를 나타내며, 대쉬 라인은 3+ 과다발현자를 나타냄)는 도 10A-B에 나타나 있다. 이러한 결과는 놀랍게도 OctHER2가 상기 두 세포주에서 HERCEPTIN (등록상표)보다 2배 빠르게 내부화 및 이화된다는 것을 나타낸다. 옥토퍼스 항체에 의해 나타내어지는 빠른 내부화 및 이화는 암드 (armed) 항체에 있어서 이상적이다. 비결합된 HERCEPTIN (등록상표)에 비해, 2+ 과다발현 세포에서 자유 옥토퍼스 항체는 매우 적다. 즉, 이러한 결과는 옥토퍼스 항체가 종양 전달에 있어서 세포독성제를 결합시키는데 우수한 후보임을 시사한다.
전자현미경 오토라디오그래피: 옥토퍼스 항체가 적절한 소포내로 내부화 및 분해되었는지를 확인하기 위해, 특이적인 것만은 아니지만, 전자현미경 (EM) 오토라디오그래피를 이용하였다. 옥토퍼스 항체를 요오드화하고, 내부화 분석에서와 동일한 방식으로 세포와 함께 인큐베이션하였다. 도 11A-C에 나타낸 결과는 옥토퍼스 항체가 정확한 소포 (초기 엔도좀, 도 11B; 및 라이소좀, 도 11C)내로 내부화되었음을 확인시켜준다. 또한, 이러한 분석에서 OctHER2 및 HERCEPTIN (등록상표)을 사용하여 관찰된 내부화 비율은 내부화 분석에서의 측정 결과와 일치한다.
실시예 3
항-DR5 옥토퍼스 항체의 평가
DR5는 삼량체 Apo2L/TRAIL (Apo2L)과 결합하는 TNF 수용체 거대족의 구성원이다. Apo2L 수용체가 Apo2L과 결합하여 클러스터링된 다음, 수용체의 세포질 영역에서 사멸 도메인은 카스파제가 세포의 아폽토시스를 개시하도록 유도한다. 항-DR5 옥토퍼스 구조물의 두가지 형태가 제조되었는데, 하나는 단쇄 인간 Fv 파아지 라이브러리 (본원에 참고로 포함되는 W0 98/51793 참조)로부터 클로닝된 항-DR5인 16E2로부터의 유래하는 것이고; 다른 하나의 항-DR5 옥토퍼스 항체는 가교결합되는경우 아폽토시스를 유도하는 쥐과동물 항-DR5 MAb인 Mab 3H3.14.5 ("3H3" 항체; ATCC HB-12534, W0 99/64461)로부터 제조되었다. 항-사멸 수용체 모노클로날 항체는 아폽토시스를 개시하는 가교결합을 필요로 할 수 있기 때문에, 이들 항체는 옥토퍼스 항체 구조물에 대한 후보가 된다. 상기 기재된 OctHER2 구조물의 가변 도메인을 16E2 또는 3H3로부터의 VL 및 VH 도메인으로 대체하여 항-DR5 옥토퍼스 항체를 제조하였다.
아폽토시스 분석에서 크리스탈 바이올렛 또는 알라마블루 (alamarBlue) 염색을 이용하여 항-DR5 옥토퍼스 항체를 분석하였다. 요컨대, 옥토퍼스 항체 또는 Apo2L의 단계적 희석물을 플레이트화 세포의 배지에 가한 다음, 24시간 동안 계속 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하거나, 또는 알라마블루를 배지에 가하고 세포와 함께 잠깐동안 인큐베이션하였다. 크리스탈 바이올렛은 세포를 염색시켰고, 알라마블루는 배양 배지에서 대사 활성을 검출하였으며, 따라서 이들 염료를 사용하여 처리한 후에 생존한 세포를 측정하였다. 두가지 비색 염료, 즉 크리스탈 바이올렛 및 알라마블루에 의해 염색된 것을 분광광도법에 의해 정량하였다.
도 12A-E에 나타낸 바와 같이, 16E2 옥토퍼스는 놀랍게도 폐 (SK-MES-1; HOP 92) 및 결장 (HCT116; COLO 205) 종양 세포주에서 Apo2L에 대해 상당한 효능으로 아폽토시스를 유도하였지만, 정상 대조 세포주 (HUMEC)에서는 아폽토시스를 일으키지 않았다. 16E2 옥토퍼스에 의해 유도되는 아폽토시스는 카스파제-의존성이다.
항-DR5 16E2 옥토퍼스는 또한 생체내에서 아폽토시스를 유도하고, 흉선 없는누드 마우스에서 결장 종양인 인간 COL0205를 감소시키는데 효과적이었다. 도 13A-D에 나타낸 바와 같이, 16E2 옥토퍼스 또는 Apo2L로 처리된 마우스 유래의, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 종양 조직의 조직 슬라이드는 아폽토시스 세포를 유사한 수준으로 유도하였다.
16E2 옥토퍼스-처리된 마우스는 또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, Apo2L 및 2개의 2가 항-DR5 mAb인 16E2 및 3H3에 대하여 측정된 것과 유사하게 종양 부피를 상당히 감소시키는 것으로 입증되었다. 어떠한 항-DR5 항체 또는 Apo2L (소포)도 투여받지 않은 마우스는 조절되지 않은 성장으로 인해 그의 종양 부피가 크게 증가하는 것으로 나타났다.
마우스 연구에 사용된 물질의 아폽토시스 활성은 도 15의 시험관내 아폽토시스 분석에서 확인되었다. 이 연구에 사용된 항-DR5 16E2 옥토퍼스 및 Apo2L을 알라마르블루 아폽토시스 분석에서 Apo2L 표준 양성 대조구 및 항-IgE MAb (E25) 음성 대조구와 비교하였다.
도 16은 다른 항-DR5 옥토퍼스인 3H3 옥토퍼스가 16E2 옥토퍼스와 유사한 아폽토시스를 유도할 수 있음을 입증한다. 또한, 도 16은, 다른 날짜에 제조된 여러 16E2 옥토퍼스 항체가 유사한 기능을 보유하는 것과 같이, 옥토퍼스 항체의 아폽토시스 활성이 로트 의존성이 아님을 보여준다.
도 17A 및 B에서, 16E2 및 3H3 옥토퍼스 항체 둘 다의 아폽토시스 활성은 폐종양 세포주인 SK-MES-1 (도 17A) 및 T 세포 종양주인 Jurkat (도 17B)상의 Apo2L보다 더 양호하다. 항-DR5 옥토퍼스 항체는 종양 세포 표면에 DR5를 클러스터링하는데 있어서 Apo2L보다 더 효과적일 수 있다.
16E2 옥토퍼스를 인간 종양 세포주의 국립 암 연구소 (NCI) 패널에 대하여 Apo2L과 비교하여 2-일 및 6-일 스크린으로 분석하였다. 도 18A-C는 여러 인간 백혈병, 비-소세포 폐암, 결장암, 중추신경계 (CNS) 암, 흑색종, 난소암, 신장암, 전립선암 및 유방암 종양세포주의 성장에 대한 16E2 옥토퍼스 및 Apo2L의 효과를 보여주는 2-일 투여 반응 곡선을 나타내지만, 도 19A-C는 6-일 스크린으로부터의 투여 반응 곡선을 보여준다. 대부분의 종양 세포주에 대한 16E2 옥토퍼스 및 Apo2L에 관하여 비교할말한 결과가 관찰되었으며, 이는 또한 항-DR5 옥토퍼스가 Apo2L과 유사하게 기능한다는 것을 나타낸다. 폐 및 결장암 세포주의 유사한 억제에 의해, 상기 암들의 세포주에 대한 16E2 옥토퍼스 및 Apo2L과 비교하는 아폽토시스 분석으로부터 상기 시험관내 및 생체내 결과를 확인하였다. 여러 종양 세포주를 사멸시키는 16E2 옥토퍼스의 능력은 예상치 못한 것이었으며, 이들 세포주로는 예를 들어 CNS 암세포주, SF-295 (도 19B), 및 2가지 신장암 세포주인 ACHN 및 RXF393가 있다 (도 19C).
NCI 종양 패널 스크린의 결과는 도 20A 및 B (2-일 결과), 및 도 21A 및 B (6-일 결과)에 정량적으로 나타나 있으며, 이는 치료되는 종양 세포주의 성장 억제 (G150), 정지상태 (TGI) 및 독성 (LC50)에 대한 16E2 옥토퍼스의 효과를 Apo2L과 비교하여 요약한다. 또한, 이러한 결과는 16E2 옥토퍼스가 상기 관찰된 것보다 더 많은 유형의 암에 대하여 효과적일 수 있음을 시사한다.
실시예 4
항-CD20 옥토퍼스 항체의 평가
키메라 항-CD20 항체 C2B8 (RITUXAN (등록상표); 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,736,137호)의 효능을 향상시키기 위한 노력으로, 연구된 한가지 방법은 종양 세포의 아폽토시스를 개시하는 항체의 능력에 관한 것이다. 문헌 (Koopman et aL Blood 84: 1415-1420 (1994))에 기재된 아폽토시스 분석을 수행하였다. 항-CD20 옥토퍼스 항체의 제조에서 C2B8 VL 및 VH 도메인을 사용하여 옥토퍼스 항-CD20 항체 (OctCD20)를 제조하였다. OctCD20 항체는 293 세포에서 발현되며, 앞선 실시예에 기재된 바와 같이 단백질 A 세파로스 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
도 22에 나타낸 바와 같이, RITUXAN (등록상표)은 그가 항-인간 IgG (RITUXAN (등록상표)-IgG)와 가교결합되지 않는다면 단독으로는 비-호지킨 림프종 B 세포주인 Wil-2의 아폽토시스를 많이 개시하지 않는다. 그러나, OctCD20는 Wil-2 세포에서 가교결합과는 독립적으로 아폽토시스를 유도할 수 있다. OctCD20와 함께 관찰된 아폽토시스의 수준은 가교결합된 RITUXAN (등록상표)의 것보다 더 낮지만, 이는 OctCD20의 아폽토시스 활성이 아마도 가요성 링커를 사용함으로써 향상될 수 있음을 시사한다.
실시예 5
추가의 다가 항체의 구성
항체 힌지 영역 이량체 도메인을 갖는 실시예 2 (항-HER2), 실시예 3 (항-DR5) 및 실시예 4 (항-CD20)의 옥토퍼스 항체 (본원에서 "옥토퍼스 F(ab')2"로 명명함)의 형태를 조작하였다. 단백질로서 발현되는 경우 이량체화하여 옥토퍼스 Fab 암과 효과적으로 연결되는 루이신-지퍼 모티프를 코딩하는 서열로 중쇄 cDNA의 Fc 영역을 대체하여 항-HER2 옥토퍼스 F(ab')2구조물을 조작하였다 (도 23C). 옥토퍼스 F(ab')2는 루이신 지퍼 모티프를 유지할 수 있거나, 필요에 따라 이 모티프가 예를 들어 단백질분해에 의해 제거될 수 있다. 도 24에 나타낸 바와 같이, PCR을 이용하여 이중 VH/CH1 도메인을 증폭시키고, 제한 부위를 옥토퍼스 중쇄 cDNA (NotI)의 말단에 삽입하여 루이신-지퍼 모티프를 포함하는 벡터 (VG15)내에 프레임내 서브클로닝할 수 있었다. PCR을 다시 이용하여 중쇄 말단 코돈의 하류에 다른 제한 부위 (XhoI)를 부가하여 포유동물 세포에서 발현을 위한 pRK 벡터내에 서브클로닝할 수 있었다. 특이적 제한 부위 BamHI, NheI 및 BspEI를 사용하여 항-DR5 Mab16E2 및 항-CD20 Mab C2B8의 VH/CH1 도메인을 Oct F(ab)'2중쇄 백본내에 치환하였다.
Fab 도메인들을 함께 직선상 반복으로 연결하여 선형 Fab 다량체를 형성함으로써 "POPoctopus" 항체를 생성하였다. "POPoct-3"는 3개의 연결된 Fab 도메인을 포함하지만 (도 23D), "POPoct-4"는 4개의 Fab 반복부를 포함한다 (도 23E). 항-HER2 (rhuMab 4D5) 및 항-DR5 (16E2) POPoct-4 구조물과 같이 항-HER2 (rhuMab 4D5), 항-DR5 (16E2), 및 항-CD20 (C2B8) POPoct-3 구조물을 생성하였다. flex 1 링커 있거나 없이 POPoct-3 항체를 조작하였다.
도 25는 POPoct-3 중쇄 cDNA의 구성을 나타낸다. PCR을 이용하여, 5'-BspEI 부위 및 3'-NotI 부위를 부가한 VH/CH1 도메인을 증폭시켰다. 이 서열을 절단하고, BamHI/BspEI 절단된 옥토퍼스 중쇄와 함께 pRK 벡터내에 라이게이션하여 3개의 VH/CH1 도메인에 대한 서열을 포함하는 옥토퍼스 중쇄를 생성하였다. BspEI 부위는 세린 및 글리신 잔기를 코딩한다.
POPoct-4 항체를 조작하기 위해 (도 26), 부위-지시적 올리고돌연변이유발을 이용하여 사일런트 돌연변이를 도입함으로써 옥토퍼스 중쇄 cDNA상의 2중 VH/CH1 도메인들 사이에서 NheI 제한 부위를 제거하였다. 올리고돌연변이유발을 다시 이용하여 제2의 VH/CH1 서열의 인접 하류에 NheI 제한 부위를 부가하였다. 이 cDNA를 POPoct-3 구조물과 함께 BamHI/NheI 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단하고, pRK 벡터와 함께 라이게이션하여 4개의 VH/CH1 도메인에 대한 서열을 포함하는 중쇄 cDNA를 생성시켰다.
다른 옥토퍼스 중쇄를 적절한 경쇄 cDNA와 함께 사용하여 293 포유동물 세포를 일시적으로 공동형질감염시켜, 3개의 Fab 도메인 (POPoct-3 Fab) 또는 4개의 Fab 도메인 (전장 옥토퍼스; 옥토퍼스 F(ab)'2; POPoct-4 Fab)을 포함하는 항체를 발현시켰다. 천연 IgG Mab 및 전장 옥토퍼스 항체를 단백질 A 세파로스상에서 정제하고, 옥토퍼스 F(ab)'2및 POPoct-3 및 -4를 단백질 G 세파로스 칼럼상에서 정제하였다.
옥토퍼스 F(ab)'2는 약 200 kDa (도 23F, 레인 4)로서, 전장 옥토퍼스 항체의 240 kDa 보다 더 작지만 (도 23F, 레인 3) 150 kDa의 천연 IgG Mab 보다는 더 크다 (도 23F, 레인 1 및 2). 약 140 kDa (도 23F, 레인 5)의 POPoct-3는 천연 IgG Mab보다 약간 더 작지만, POPoct-4는 190 kDa로 약간 더 크다. 옥토퍼스 F(ab)'2(도 23G, 레인 4)의 중쇄는 55 kDa의 천연 IgG Mab 중쇄 (도 23G, 레인 1 및 2)와 대략 동일한 크기이다. POPoct-3 중쇄 (도 23G, 레인 5)는 전장 옥토퍼스 중쇄 (도 23G, 레인 3)와 비슷한 크기이지만, 약 97 kDa의 POPoct-4는 가장 큰 중쇄를 갖는다.
실시예 6
항-HER2 다가 항체의 평가
항증식 분석: OctHER F(ab)'2, POPoct-3 HER2, OctHER2, OctHER2flex1, 및 rhuMAb 4D5 (HERCEPTIN(등록상표))를 3+ HER2 과다발현 종양 세포주인 BT474에 동몰의 농도로 가하고, 세포 성장을 억제하는 이들의 능력에 대하여 크리스탈 바이올렛 염색으로 측정하여 평가하였다. 이러한 분석의 결과는 도 27에 나타나 있다. 모든 항체가 BT474 세포의 약간의 세포발육억제를 유도하였지만, POPoct-3HER2 및 rhuMAb 4D5는 가장 효능이 있는 것으로 나타났으며 동등하게 성장을 억제하였지만, OctHER2 F(ab)'2는 그의 농도가 감소됨에 따라 빠르게 효능을 상실하였다. OctHER2flex1은 OctHER2 (n = 6)에 대하여 약간이기는 하지만 지속적인 향상을 입증하였고, 이는 향상된 가요성이 Fab의 HER2 표적에 대한 접근성을 증가시킬 수 있음을 시사한다.
OctHER2, OctHER2 flex-1, POPoct-3HER2, POPoct-3HER2 flex-1 및 rhuMAb 4D5 (HERCEPTIN (등록상표))를 또한 크리스탈 바이올렛 세포발육억제 분석에 의해 다른 3+ HER2 과다발현 세포주인 SKBR3상에서 동몰의 농도로 평가하였다. 이 분석의 결과는 도 28에 나타나 있다. 이 세포주에서, 시험된 모든 옥토퍼스 구조물은 세포 성장을 rhuMab 4D5 (n = 4)와 동등하거나 더 많이 억제하였다. OctHER2 또는 POPoct-3의 Fab 암들 사이에서의 가요성 링커로 인한 효능에서의 어떤 증가는 이러한 세포주에서 덜 분명하였다.
내부화 분석: 2가지 3+ HER2 과다발현 종양 세포주인 SKBR3 및 BT474에 대한 내부화 분석에서 POPoct-3HER2를 OctHER 및 HERCEPTIN (등록상표)과 비교하여, 면역독소 요법에서의 적용에 있어서 그의 후보성을 평가하였다. 전장 OctHER2 항체와 구조적으로 다르기는 하지만, POPoct-3HER2는 두 세포주 (도 29A 및 B)에 의해 내부화되어 OctHER2와 동일하게 HERCEPTIN (등록상표)의 2배의 속도로 이화되었다.
실시예 7
항-DR5 다가 항체의 평가
아폽토시스 분석: 항-DR5 16E2 MAb의 다가 형태를 이 샘플에서 평가하였다. Oct1DR5, OctDR5flex-1, OctDR5F(ab)'2, POPoct-3DR5, POPoct-3DR5flex-1 및 POPoct-4DR5를 결장 종양 세포주 COL0205에 동몰의 농도로 가하고, 크리스탈 바이올렛 아폽토시스 분석으로 16E2 MAb (n = 4)와 비교하여 분석하였다. 결과는 도30A 및 B에 나타나 있다. 모든 옥토퍼스 항체는 16E2 MAb보다 더 아폽토시스를 유도하였는데, 효능은 가장 강한 것에서 가장 약한 것 순서로 다음과 같다: OctDR5flex-1 > OctDR5 = POPoct-4DR5 = POPoct-3flex-1DR5 = POPoct-3DR5 > OctDR5F(ab)'2> 16E2 MAb. OctDR5flex-1은 OctDR5와 비교하여 더 낮은 농도에서 증가된 효능을 나타내었으며 (도 30A), 이는 Fab 암들 사이의 가요성이 효능을 향상시킨다는 것을 암시한다. POPoct-3flex-1DR5는 OctHER과 동등한 수준으로 아폽토시스를 유도하였으며 (도 30A), POPoct16-3 및 POPoct16-4와 유사한 효능을 나타내었다 (도 30B).
세포 신호화: Apo2L은 사멸 수용체에 결합하며, 카스파제 신호화 경로를 통해 세포의 아폽토시스를 개시한다. 도 31A 및 B에 나타낸 바와 같이, 항-DR5 옥토퍼스 항체는 Apo2L과 동일한 신호화 경로를 통해 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다. Oct16E2는 폐 종양 세포주 SK-MES-1상에서 APO2L과 유사한 수준의 아폽토시스를 개시하였지만 (도 31A, 대쉬 라인), 카스파제 3 및 9의 억제제인 ZVAD의 첨가 이후에 Apo2L 및 Oct16E2 둘 다에 의해 개시된 세포의 아폽토시스는 억제되었다 (도 31B, 굵은 선). 항-DR5 옥토퍼스 항체가 Apo2L과 동일한 경로를 통해 신호화되었다는 추가의 증거가 DISC (DeathInducedSignalingComplex) 분석에 의해 나타났다 (도 31B). BJAB 세포, DR5를 발현시키는 B-세포 림프종 라인을 여러 시간 동안 2가지 항-DR5 옥토퍼스 항체인 Oct16E2 및 Oct3H3의 2가지 다른 농도에서 인큐베이션하였다. 항체-DR5 결합물은 정제 이후에 웨스턴 블롯 분석하여 결합물과함께 공동정제된 신호화 분자를 확인하였다. Apo2L과 같이, 신호화 분자 카스파제 8 및 FADD는 수용체가 Oct16E2 및 Oct3H3에 의해 결합된 후에 DR5와 결합하였다 (도 31 B).
실시예 8
항-CD20 옥토퍼스 항체의 평가
아폽토시스 분석: 도 22에 나타낸 바와 같이, RITUXAN (등록상표)은 먼저 항-IgG 항체에 의해 가교결합되지 않는다면 시험관내에서 B-세포 림프종 세포주 WIL-2상에서 아폽토시스를 효과적으로 개시하지 않았다. OctCD20는 RITUXAN (등록상표) 단독보다는 더 높은 수준이지만 항-IgG-가교결합된 RITUXAN (등록상표)보다는 약간 더 낮은 수준으로 가교결합과는 독립적으로 WIL-2 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있었다. 항-IgG 항체와 가교결합된 경우, OctCD20는 가교결합된 RITUXAN (등록상표)보다 WIL-2 세포의 아폽토시스를 더 유도하였다 (도 32). 생체내에서 RITUXAN (등록상표)의 효능에 대한 한가지 가능성있는 설명은 항체가 보체 또는 FcγR 보유 세포에 의해 가교결합된다는 것이기 때문에, 이러한 관찰 결과는 OctCD20가 생체내에서 보다 더 효능이 있을 것임을 시사한다.
OctCD20 F(ab)'2, POPoct-3CD20 및 POPoct-3CD20flex-1을 아폽토시스 분석에서 WIL-2 세포와 함께 여러 농도로 시험하였으며, 최적 투여량은 도 33에서 최대 반응 곡선으로 나타나 있다. 옥토퍼스 항체를 항-CD20 항체 1F5 (Clark et al. supra)와 비교하였는데, 이는 그가 항-IgG 항체와 가교결합하지 않는다면 아폽토시스를 유도하지 않는다는 점에서 RITUXAN (등록상표)과 유사하게 기능한다. 시험한 두 옥토퍼스 항체는 가교결합된 IF5 항-CD20과 유사하거나 (OctCD20 F(ab)'2), 더 높은 수준 (POPoct-3CD20, POPoct-3CD20flex-1)의 아폽토시스를 유도하였다. 또한, 옥토퍼스 항체는 가교결합된 항-CD20보다 상당히 더 낮은 농도에서도 효능이 있었다.
가교결합된 항-CD20 항체가 B 세포 림프종 라인 WIL-2S에 첨가되는 경우, 세포의 동종유형 부착이 관찰되었다. 이러한 세포 엉김은 세포가 CD20을 통해 활성화되었음을 나타내는 한 예이다. 옥토퍼스 항-CD20 항체는 가교결합제와 독립적으로 상기 동일한 동종유형 부착 현상을 유도하며, 도 34에 나타낸 바와 같이 POPoct-3CD20는 가교결합된 IF5 항-CD20보다 훨씬 낮은 농도이다.
만성 림프구 백혈병 (CLL)에 걸린 환자로부터 채혈한 혈액을 사용하여 다양한 항-CD20 항체에 의한 아폽토시스 유도를 추가로 평가하였다. 덱스트란 침전을 이용하여 PBL을 분리하여 세척하고, 샘플 없이, 1F5 (20 ㎍/ml), 1F5+ 가교결합 마우스 항-IgG (100 ㎍/ml), 약 0.5 또는 1.0 ㎍/ml의 OctCD20 F(ab')2및 0.5 ㎍/ml의 POPoct-3CD20과 함께 밤새 처리된 혈청-무함유 림프구 배지중에 플레이팅하였다.
아넥신 및 PI 염색을 이용하여 아폽토시스 분석을 수행하였다. 아폽토시스 세포의 비율은 다음과 같았다.
비처리 38.5%
1F5 37.1%
항-IgG와 연결된 1F5X 25.1%
POPoct-3 CD20 (0.5 ㎍) 50.2%
OctCD20 F(ab')2(0.5 ㎍) 37.7%
OctCD20 F(ab')2(1.0 ㎍) 48.6%
데이타는 다가 항-CD20 항체 (특히 POPoct-3 CD20)가 투여량 의존적인 방식으로 아폽토시스를 증대시킨다는 것을 나타낸다.
내부화 분석: 내부화 분석에서 3가지 B-세포 림프종 라인인 DB, WIL-2 및 Ramos상에서 OctCD20를 면역독소 요법에 대한 후보로 평가하고, RITUXAN (등록상표)과 비교하였다. 도 35에 나타낸 바와 같이, OctCD20은 세포에 의해 구별가능한 수준으로 내부화되지 않은 RITUXAN (등록상표)에 비해 세포에 의해 2배 더 내부화되었다. 증가된 수의 결합 부위로 인해 다가 항체에 대해 예상되는 더 높은 수준은, 더 많은 OctCD20가 시간에 따라 RITUXAN (등록상표)에 비해 세포의 세포 표면에 결합되어 있다는 사실에서 분명하다.

Claims (93)

  1. Fc 영역, 및 이 Fc 영역의 아미노 말단에 있는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 4개의 항원 결합 부위를 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 5개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 2개 이상의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드쇄가 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함하고, VD1이 제1 가변 도메인이고, VD2가 제2 가변 도메인이고, Fc가 Fc 영역의 한 폴리펩티드쇄이고, X1 및 X2가 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n이 0 또는 1인 항체.
  6. 제5항에 있어서, VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc을 각각 포함하는 2개 이상의 폴리펩티드쇄를 포함하는 항체.
  7. 제1항에 있어서, 식 (a) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역쇄; 또는 (b) VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역쇄를 갖는 하나 이상의 폴리펩티드쇄를 포함하는 항체.
  8. 제1항에 있어서, 2개 이상의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함하는 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드가 CL 도메인을 추가로 포함하는 것인 항체.
  10. 제1항에 있어서, Fd-가요성 링커-Fd를 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 가요성 링커가 gly-ser, gly-ser-gly-ser (서열 10), ala-ser 및 gly-gly-gly-ser (서열 11)로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드를 포함하는 것인 항체.
  12. 제1항에 있어서, 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 빨리 내재화되는 항체.
  13. 제1항에 있어서, 아고니스트 항체인 항체.
  14. 제1항에 있어서, 아폽토시스를 유도하는 항체.
  15. 제1항에 있어서, 3개 이상의 항원 결합 부위 모두가 동일한 항원에 결합하는 것인 항체.
  16. 제1항에 있어서, 3개 이상의 항원 결합 부위가 2개 이상의 상이한 항원에 결합하는 것인 항체.
  17. 제1항에 있어서, 종양 세포에 의해 발현되는 세포 표면 단백질에 결합하는 항체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 세포 표면 단백질이 상피 성장인자 수용체 (EGFR), HER2 수용체, HER3 수용체, HER4 수용체 및 DcR3 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 세포 표면 단백질이 HER2 수용체인 항체.
  20. 제1항에 있어서, 종양 세포에 의해 과발현되는 세포 표면 단백질에 결합하는 항체.
  21. 제1항에 있어서, 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 상과 (superfamily)에 속하는 수용체에 결합하는 항체.
  22. 제21항에 있어서, TNF 수용체가 Apo2L 수용체인 항체.
  23. 제22항에 있어서, Apo2L 수용체가 DR4, DR5, DcR1 및 DcR2로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  24. 제22항에 있어서, Apo2L 수용체가 DR4 또는 DR5인 항체.
  25. 제21항에 있어서, 아고니스트 항체인 항체.
  26. 제21항에 있어서, 아폽토시스를 유도하는 항체.
  27. 제1항에 있어서, B 세포 표면 항원에 결합하는 항체.
  28. 제27항에 있어서, B 세포 표면 항원이 CD19, CD20, CD22 및 CD40로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  29. 제27항에 있어서, 상기 B 세포 표면 항원이 CD20인 항체.
  30. 세포독성제에 결합되어 있는 제1항의 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트.
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포독성제가 일단 내재화되었을 때 세포를 사멸시키는 데 활성적인 이뮤노컨쥬게이트.
  32. 제30항에 있어서, 상기 세포독성제가 방사성 동위원소, 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 이뮤노컨쥬게이트.
  33. 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 상과에 속하는 수용체에 결합할 수 있는, 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체.
  34. 제33항에 있어서, 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아닌 항체.
  35. 제33항에 있어서, 단 하나의 Fc 영역을 갖고 있거나 Fc 영역을 갖지 않는 항체.
  36. 제33항에 있어서, 2개 이상의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 항체.
  37. 제33항에 있어서, TNF 수용체에 각각 결합할 수 있는 4개의 항원 결합 부위를 포함하는 항체.
  38. 제33항에 있어서, TNF 수용체가 Apo2L 수용체인 항체.
  39. 제38항에 있어서, Apo2L 수용체가 DR4, DR5, DcR1 및 DcR2로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  40. 제38항에 있어서, Apo2L 수용체가 DR4 또는 DR5인 항체.
  41. 제33항에 있어서, 아고니스트 항체인 항체.
  42. 제33항에 있어서, 아폽토시스를 유도하는 항체.
  43. ErbB 수용체에 결합할 수 있는, 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체.
  44. 제43항에 있어서, 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아닌 항체.
  45. 제43항에 있어서, 단 하나의 Fc 영역을 갖고 있거나 Fc 영역을 갖지 않는 항체.
  46. 제43항에 있어서, 2개 이상의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 항체.
  47. 제43항에 있어서, ErbB 수용체에 각각 결합할 수 있는 4개의 항원 결합 부위를 포함하는 항체.
  48. 제43항에 있어서, 상기 ErbB 수용체가 상피 성장인자 수용체 (EGFR), HER2 수용체, HER3 수용체 및 HER4 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  49. 제43항에 있어서, ErbB 수용체가 HER2 수용체인 항체.
  50. B 세포 표면 항원에 결합할 수 있는, 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체.
  51. 제50항에 있어서, 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아닌 항체.
  52. 제50항에 있어서, 단 하나의 Fc 영역을 갖고 있거나 Fc 영역을 갖지 않는 항체.
  53. 제50항에 있어서, 2개 이상의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 항체.
  54. 제50항에 있어서, B 세포 표면 항원에 각각 결합할 수 있는 4개의 항원 결합 부위를 포함하는 항체.
  55. 제50항에 있어서, B 세포 표면 항원이 CD19, CD20, CD22 및 CD40로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  56. 암세포에 의해 과발현되는 항원에 결합할 수 있는, 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체.
  57. (a) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-이량체화 도메인; 또는 (b) VH-CH1-VH-CH1-이량체화 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄.
  58. 제57항의 폴리펩티드쇄를 포함하는 단리된 항체.
  59. 제58항에 있어서, 2개 이상의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함하는 항체.
  60. 제59항에 있어서, 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드가 VL-CL을 포함하는 것인 항체.
  61. 이량체화 도메인, 및 이 도메인의 아미노-말단에 있는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체.
  62. 제61항에 있어서, 이량체화 도메인이 힌지 영역, Fc 영역, CH3 도메인 및 CH4 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  63. 제62항에 있어서, 이량체화 도메인이 힌지 영역인 항체.
  64. 제63항에 있어서, 이량체화 도메인이 류신 지퍼를 추가로 포함하는 것인 항체.
  65. 제63항에 있어서, 식 (a) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-힌지 영역; 또는 (b) VH-CH1-VH-CH1-힌지 영역을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 항체.
  66. 3개 이상의 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 폴리펩티드와 결합하여 동일한 항원에 대해 특이적인 3개 이상의 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 3개 이상의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄.
  67. 제67항에 있어서, 3개 이상의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드와 결합하여 동일한 항원에 대해 특이적인 3개의 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 3개의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄.
  68. 제66항에 있어서, 4개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드와 결합하여 동일한 항원에 대해 특이적인 4개의 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 4개의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄.
  69. 제66항에 있어서, 항원이 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 상과에 속하는 수용체인 폴리펩티드쇄.
  70. 제66항에 있어서, 항원인 B 세포 표면 항원인 폴리펩티드쇄.
  71. 제66항에 있어서, 항원이 ErbB 수용체인 폴리펩티드쇄.
  72. 제66항에 있어서, 항원이 종양 세포에 의해 발현되는 세포 표면 단백질인 폴리펩티드쇄.
  73. 식 (a) VL-CL-가요성 링커-VL-CL-가요성 링커-VL-CL; (b) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1; (c) (VL-CL)n(여기서, n은 3 이상임); 또는 (d) (VH-CH1)n(여기서, n은 3 이상임)을 포함하는 폴리펩티드쇄.
  74. 제67항에 있어서, 식 (a) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1; (b) VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1; 또는 (c) (VH-CH1)n(여기서, n 은 3 또는 4임)을 포함하는 폴리펩티드쇄.
  75. 제66항의 폴리펩티드쇄를 포함하는 단리된 항체.
  76. 제75항에 있어서, 3개 이상의 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함하는 단리된 항체.
  77. 제76항에 있어서, VL-CL을 각각 포함하는 3개 이상의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함하는 단리된 항체.
  78. 제77항에 있어서, VL-CL을 각각 포함하는 4개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함하는 단리된 항체.
  79. (a) VL-CL-가요성 링커-VL-CL-이량체화 도메인; (b) VL-CL-VL-CL-이량체화 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄.
  80. 세포독성제와 결합된 제75항의 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트.
  81. 제1항의 항체, 제57항의 폴리펩티드쇄 또는 제66항의 폴리펩티드쇄를 코딩하는 단리된 핵산.
  82. 제81항의 핵산을 포함하는 벡터.
  83. 제81항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  84. 핵산이 발현되도록 제83항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체 또는 폴리펩티드쇄의 제조 방법.
  85. 제84항에 있어서, 숙주 세포 배양물로부터 항체 또는 폴리펩티드쇄를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 항체 또는 폴리펩티드쇄를 숙주 세포 배양 배지로부터 회수하는 방법.
  87. 치료 유효량의 제1항의 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 질환을 치료하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 질환이 암인 방법.
  89. 제87항에 있어서, 치료 유효량의 세포독성제를 포유동물에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  90. 암세포를 제33항의 항체에 노출시키는 것을 포함하는, 암세포의 아폽토시스를 유도하는 방법.
  91. B 세포를 제50항의 항체에 노출시키는 것을 포함하는, B 세포를 사멸시키는 방법.
  92. ErbB 수용체를 발현하는 세포를 제43항의 항체에 노출시키는 것을 포함하는, 상기 세포를 사멸시키는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 세포가 ErbB 수용체를 과발현하는 암세포인 방법.
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