ES2612383T3 - WSX-1/IL-27 como una diana para respuestas antiinflamatorias - Google Patents

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Abstract

Una composición para el uso en el tratamiento de una afección inflamatoria que comprende: un complejo de WSX-1 soluble/IL-27 aislado o recombinante, en donde la afección inflamatoria se selecciona de: un trastorno inmunitario, una infección, cáncer, una alergia, artritis, asma, enteropatía inflamatoria, enfermedad de Crohn, uveitis, psoriasis, lupus, esclerosis múltiple, una enfermedad infecciosa crónica, tuberculosis, espondilitis anquilosante, rechazo de trasplantes, sarcoidosis and hepatitis.

Description

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DESCRIPCION
WSX-1/IL-27 como una diana para respuestas antiinflamatorias Campo de la invencion
La invencion se refiere a complejos aislados o recombinantes que incluyen WSX-1 soluble o protemas de fusion de WSX-1 aisladas o recombinantes para el uso en el tratamiento de afecciones inflamatorias.
Antecedentes de la invencion
Un numero de citocinas recombinantes se usa en una variedad de entornos clmicos. Estas incluyen interleucina-2 (IL-2), GM-CSF, IL-11, IL-12 e interferones (IFN) tipo I. Estas protemas se estan usando principalmente como estimuladores de celulas inmunitarias y para actuar como factores de crecimiento o para impulsar respuestas anticancerosas o virales. Pocas citocinas se han usado para inhibir el sistema inmunitario; por ejemplo, se ha intentado la inhibicion con IL-10, que trabaja indirectamente sobre funciones celulares accesorias necesarias para las funciones de celulas T y que se estuvo desarrollando espedficamente con la enfermedad de Crohn y la enteropatfa inflamatoria como dianas, y TGF. El exito con estos ha sido limitado.
Se han probado antagonistas de p 40 de IL-12 en examenes clmicos para pacientes con enfermedad de Crohn con algun exito.
Se han probado antagonistas de IL-15 en examenes clmicos para artritis basandose en la observacion de que esta citocina estaba implicada en el desarrollo de esta enfermedad.
El antagonista del receptor de IL-1 es un producto disponible comercialmente que se usa para tratar pacientes con artritis reumatoide. Este es un producto que bloquea la interaccion de la citocina proinflamatoria IL-1 con su receptor.
Varias comparuas han desarrollados anticuerpos/antagonistas espedficos para la citocina TNF-a que actualmente se usan en el tratamiento de pacientes con artritis reumatoide. Este enfoque se basa en la neutralizacion de citocina endogena para prevenir la inflamacion. Un enfoque similar se ha buscado con anticuerpos espedficos para IL-1 e IL- 6. Una cuestion de seguridad es que estos tratamientos estan asociados con el desarrollo de infecciones oportunistas incluyendo TB y toxoplasmosis. Ademas, Villarino AV y cols. (J Immunol 2006; 176:237-247) se refiere al problema de tratar una enfermedad inflamatoria mediante la inhibicion de mecanismos inmunopatologicos a traves de la senalizacion de IL-27 y describe mecanismos celulares para los efectos antiinflamatorios de IL-27.
Sumario de la invencion
WSX-1 es un receptor de citocina recientemente descrito que se une a la citocina heterodfmera IL-27. Los estudios de los presentes inventores han sugerido que este par citocina/receptor esta implicado en la regulacion negativa de respuestas inflamatorias mediadas por celulas T. La identificacion de un papel para WSX-1 en la supresion de la hiperactividad de celulas T tiene implicaciones clmicas para trastornos inflamatorios mediados por celulas T y representa una nueva diana para terapias basadas inmunitariamente. El trabajo de este laboratorio ha continuado para enfocarse a los efectos inhibidores de IL-27 en diferentes respuestas de celulas T, y los presentes inventores han hecho varias observaciones que han proporcionado nuevas perspectivas en la biologfa de este sistema receptor de citocina y han sugerida nuevos modos para usar esta informacion para desarrollar terapias antiinflamatorias.
Esta claro a partir de los estudios de los presentes inventores que WSX-1 tiene un efecto negativo sobre respuestas de celulas T. IL-27 puede inhibir respuestas de Th1 y Th2 y la capacidad de estas celulas para elaborar el factor de crecimiento de celulas T IL-2. Ademas, IL-27 inhibe un nuevo subgrupo de celulas T - T17 (celulas T que producen IL-17) - que se cree que es un subgrupo de celulas T patologico importante. Una protema de fusion, WSX-1Fc, es capaz de impulsar la capacidad de IL-27 para inhibir la produccion de celulas T de IL-2 e IFNy. Esto implica que una version liberada de este receptor puede facilitar que IL-27 o sus componentes individuales senalicen celulas T. Esto se basa en parte en la biologfa del componente de citocina/receptor estrechamente relacionado para la actividad de IL-6. Esta idea esta apoyada por la observacion de que p28 recombinante (suministrada por eBioscience, y tambien conocida como IL-30), aunque no es tan eficaz como IL-27, es capaz de antagonizar la produccion de IL-2 e IL-17. Estos datos implican para los presentes inventores que p28 sola, modificada o como parte de otra molecula o complejo que incluye WSX-1 representa un enfoque terapeutico util para modular celulas del sistema inmunitario. De forma similar, los polipeptidos y complejos de WSX-1 soluble tambien representan un enfoque terapeutico util. Puesto que IL-27 puede senalizar a traves de un complejo receptor que incluye tanto WSX-1 como gp130, los polipeptidos y complejos de gp130 soluble representan otro enfoque terapeutico util mas.
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Segun esto, la presente invencion proporciona una composicion para el uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria que comprende un complejo de WSX-1 soluble/IL-27 aislado o recombinante, en donde la afeccion inflamatoria se selecciona de: un trastorno autoinmunitario; una infeccion; cancer; una alergia; artritis; asma; enteropatfa inflamatoria, enfermedad de Crohn; uveitis; psoriasis; lupus; esclerosis multiple; una enfermedad infecciosa cronica; tuberculosis; espondilitis anquilosante; rechazo de trasplantes; sarcoidosis; hepatitis.
En un aspecto, la composicion es antiinflamatoria. La composicion incluye opcionalmente un excipiente farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, en realizaciones en las que la composicion se va a administrar a un sujeto. En una realizacion, la composicion suprime el desarrollo de celulas IL-17 a partir de celulas T vfrgenes inducidas por IL-6 y factor de crecimiento transformante beta.
La composicion puede incluir una o mas celulas, por ejemplo, una o mas celulas T, celulas B, mastocitos, neutrofilos, macrofagos, celulas dendnticas, u otras celulas que expresen gp130 o WSX-1. El complejo puede afectar a una funcion o actividad de la celula. En una realizacion, la composicion incluye una celula T, y la composicion altera una funcion o actividad de la celula T. Por ejemplo, la celula T puede presentar una expresion alterada de IL-2, IFN- gamma, TNF-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5 o CD25, proliferacion alterada o supervivencia alterada. La composicion incluye opcionalmente factor de crecimiento transformante beta.
Una clase de realizaciones proporciona una protema de fusion de WSX-1 recombinante o aislada para el uso en el tratamiento de un afeccion inflamatoria, en donde la afeccion inflamatoria se selecciona de: un trastorno inmunitario; una infeccion; cancer; una alergia; artritis; asma; enteropatfa inflamatoria, enfermedad de Crohn; uveitis; psoriasis; lupus; esclerosis multiple; una enfermedad infecciosa cronica; tuberculosis; espondilitis anquilosante; rechazo de trasplantes; sarcoidosis; hepatitis. La protema de fusion incluye un polipeptido de WSX-1, que puede estar, p. ej., en el extremo N de la protema de fusion, en el extremo C de la protema de fusion, o ser interno a la protema de fusion. El polipeptido de WSX-1 puede incluir un dominio extracelular, o una subsecuencia del mismo, de un WSX-1 natural (p. ej., WSX-1 humano) o una variante del mismo.
En una clase de realizaciones, la protema de fusion comprende uno o mas dominios que reconocen un marcador espedfico de una celula, por ejemplo, uno o mas dominios de anticuerpo que reconocen el marcador. Marcadores ejemplares incluyen CD4, CD8, CD11c, CD11b y NK1.1. En una clase de realizaciones, la protema de fusion comprende uno o mas dominios polipeptfdicos derivados de p28 o EBI3.
Tambien se divulga en la presente una protema de fusion de p28 recombinante o aislada. La protema de fusion incluye un polipeptido de p28, que puede estar, p. ej., en el extremo N de la protema de fusion, en el extremo C de la protema de fusion, o ser interno a la protema de fusion. El polipeptido de p28 se puede derivar de una p28 natural (p. ej., p28 humana) o una variante de la misma.
La protema de fusion comprende opcionalmente uno o mas dominios de anticuerpo. Por ejemplo, la protema de fusion puede incluir uno o mas dominios de anticuerpo que reconocen un marcador espedfico de una celula, p. ej., CD4, CD8, CD11c, CD11b o NK1.1.
Tambien se describen en la presente polinucleotidos que codifican protemas de fusion de WSX-1 y p28. Por ejemplo, se proporciona un acido nucleico que codifica una protema de fusion de WSX-1 recombinante o aislada, en donde la protema de fusion comprende uno o mas dominios que reconocen un marcador espedfico de una celula o uno o mas dominios polipeptfdicos derivados de p28 o EBI3. El acido nucleico opcionalmente codifica uno o mas dominios polipeptfdicos seleccionados de: un dominio de anticuerpo, una region Fc, un dominio de p28 o un dominio de EBI3, asf como codifica un polipeptido de WSX-1. Ademas, se proporciona un acido nucleico que incluye una protema de fusion de p28 recombinante o aislada.
Tambien se proporcionan anticuerpos que se unen a polipeptidos y complejos de la invencion. Asf, se proporciona un anticuerpo que se une espedficamente a un polipeptido de WSX-1 soluble, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/p28 o a un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/IL-27. El anticuerpo potencia opcionalmente una actividad del polipeptido o el complejo polipeptfdico.
Un aspecto de la invencion proporciona composiciones para el uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria en un sujeto mairnfero, p. ej., un sujeto humano. Afecciones inflamatorias a tratar pueden incluir un trastorno inmunitario (p. ej., una enfermedad autoinmunitaria); una infeccion; cancer, tal como mieloma multiple y leucemia mielogena y otras, asf como metastasis tumorales; una alergia; artritis; asma; enteropatfa inflamatoria, tal como colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn; uveitis; psoriasis; lupus; esclerosis multiple; una enfermedad infecciosa cronica; tuberculosis; espondilitis anquilosante; rechazo de trasplantes; sarcoidosis; hepatitis. Enfermedades adicionales que se divulgan en este contexto son inflamacion del sistema nervioso central; smdrome de inmunodeficiencia adquirida; pancreatitis aguda; enfermedad de Addison; lesion hepatica inducida por el alcohol incluyendo cirrosis alcoholica; enfermedad de Alzheimer; esclerosis lateral amiotrofica; asma y otras enfermedades pulmonares; aterosclerosis; vasculitis autoinmunitaria; lesion hepatica inducida por hepatitis autoinmunitaria; cirrosis biliar; caquexia/anorexia, incluyendo caquexia inducida por sida; smdrome de fatiga cronica; dolencias asociadas con Clostridium, incluyendo diarrea asociada con Clostridium; afecciones e indicaciones coronarias, incluyendo insuficiencia cardfaca congestiva,
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reestenosis coronaria, infarto de miocardio, disfuncion del miocardio e injerto de derivacion de la arteria coronaria; diabetes, incluyendo diabetes mellitus tipo 1 de comienzo juvenil y resistencia a insulina; endometriosis, endometritis y afecciones relacionadas; epididimitis; resistencia a eritropoyetina; fiebre; fibromialgia o analgesia; glomerulonefritis; enfermedad del injerto contra el hospedador/rechazo de trasplantes; enfermedad de Graves; smdrome de Guillain- Barre; enfermedad de Hashimoto; anemia hemolrtica; choque hemorragico; hiperalgesia; afecciones inflamatorias de una articulacion y enfermedades reumaticas incluyendo osteoartritis, artritis reumatoide, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, smdrome de Reiter y artritis reactiva, enfermedad de Still, artritis psoriasica, artritis enteropatica, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistemica, vasculitis (p. ej., enfermedad de Kawasaki), vasculitis cerebral, enfermedad de Lyme, artritis inducida por estafilococos, smdrome de Sjogren, fiebre reumatica, policondritis y polimialgia reumatica y arteritis de celulas gigantes; una enfermedad ocular inflamatoria, que puede estar asociada con, por ejemplo, trasplante corneal; enteroparta inflamatoria; isquemia, incluyendo isquemia cerebral; enfermedad de Kawasaki; deterioro del aprendizaje; enfermedades pulmonares; nefritis por lupus; esclerosis multiple; miastenia grave; miopartas; enfermedades neuroinflamatorias; neurotoxicidad; enfermedades y afecciones oculares, incluyendo degeneracion ocular y uveitis; osteoporosis; dolor, incluyendo dolor relacionado con el cancer; enfermedad de Parkinson; penfigo; enfermedad periodontal; pitiriasis roja pilosa; parto prematuro; prostatitis y afecciones relacionadas; psoriasis y afecciones relacionadas; artritis psoriasica; fibrosis pulmonar; lesion por reperfusion; fiebre reumatica; artritis reumatoide; sarcoidosis; escleroderma; choque septico; efectos secundarios de la radioterapia; smdrome de Sjogren; trastornos del sueno; espondiloartropartas; lupus eritematoso sistemico; enfermedad de la articulacion mandibular temporal; tiroiditis; trasplante de tejido o una afeccion inflamatoria resultante de distension muscular, esquince, dano del cartflago, traumatismo y cirugfa ortopedica; vasculitis; o una afeccion inflamatoria resultante de distension muscular, esguince, dano del cartflago, traumatismo, cirugfa ortopedica, infeccion u otros procesos de enfermedad.
Metodos divulgados en la presente incluyen administrar al sujeto un resto aislado o recombinante seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido de WSX-1 soluble, un polipeptido de p28, un complejo polipeprtdico de WSX-1 soluble/p28, un complejo polipeprtdico de WSX-1 soluble/EBI3, un complejo polipeprtdico de WSX-1 soluble/IL-27, un complejo de gpl3o soluble/lL-27, un complejo polipeprtdico de gp130 soluble/p28, un complejo polipeprtdico de gp130 soluble/EBI3, un polipeptido de p28 y un polipeptido de WSX-1 soluble, un polipeptido de EBI3 y un polipeptido de WSX-1 soluble, IL-27 y un polipeptido de WSX-1 soluble, un polipeptido de gp130 soluble y un polipeptido de p28, un polipeptido de gp130 soluble e IL-27, un polipeptido de gp130 soluble y un polipeptido de EBI3, y una variante de los mismos. En los casos en los que se administra una combinacion de polipeptidos recombinantes o aislados (p. ej., un polipeptido de p28 y un polipeptido de WSX-1 soluble), los polipeptidos pueden pero no necesitan formar un complejo, y los polipeptidos se pueden coadministrar o administrar separadamente. Los metodos incluyen opcionalmente diagnosticar al paciente con la afeccion inflamatoria antes de dicha administracion. El resto aislado o recombinante se administra opcionalmente al sujeto en combinacion con un segundo compuesto, por ejemplo, factor de crecimiento transformante beta.
Tales metodos pueden incluir administrar al sujeto un resto que se une espedficamente a o modula una actividad de un complejo de gp130/WSX-1/IL-27, o que modula la formacion del complejo en una celula, tratando de ese modo la afeccion del sujeto. El resto puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un antagonista, un agonista y un modulador de la actividad.
Se divulgan ademas metodos para identificar un compuesto que se une a o modula una actividad de un polipeptido de WSX-1 soluble, un complejo polipeprtdico de WSX-1 soluble/p28, un complejo polipeprtdico de WSX-1 soluble/IL- 27, un complejo polipeprtdico de wSX-1 soluble/EBI3, un complejo polipeprtdico de gp130 soluble/p28, un complejo polipeprtdico de gp130 soluble/IL-27 o un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/EBI3. En los metodos, una muestra biologica o bioqmmica que comprende el polipeptido o complejo se pone en contacto con un compuesto de prueba. Se detecta la union del compuesto de prueba al polipeptido o complejo o la modulacion de la actividad del polipeptido o complejo por el compuesto de prueba, identificando de ese modo el compuesto que se une a o modula la actividad del polipeptido o complejo. Opcionalmente, el compuesto potencia la inhibicion de una respuesta de celulas T por el polipeptido o complejo, potencia la actividad antagonista contra IL-2 o IL-17 o altera la proliferacion, supervivencia o expresion de celulas T de IL-2, IFN-y, TNF-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5 o CD25.
Breve descripcion de los dibujos
Los Paneles A y B de la Figura 1 ilustran la expresion de IL-27 en el cerebro durante TE. El Panel A presenta graficos de barras de resultados de PCR en tiempo real cuantitativa sobre ARN celular total aislado de los cerebros de ratones WT C57BL/6 no infectados e infectados cronicamente (Dfa 30 despues de la infeccion) para detectar ARNm de ebi3 e Il27 (p28). El Panel B presenta graficos de barras de resultados de PCR en tiempo real cuantitativa de ARNm de ebi3 e Il27 aislado de cultivos de astrocitos WT C57BL/6 primarios. Se sembraron 1 x 106 astrocitos/pocillo y se estimularon durante 18 h seguido por aislamiento del ARN. Los resultados de la PCR en tiempo real se normalizaron frente a ARNm para Actb (p-actina). Los datos son representativos de dos experimentos independientes. ND, no detectado.
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Los Paneles A-H de la Figura 2 ilustran que se requiere IL-27 para la resistencia a TE cronico. El Panel A presenta un grafico lineal que muestra la supervivencia de ratones Il27ra-/- (n = 8) y WT C57BL/6 (n = 10) infectados intraperitonealmente con 20 quistes procedentes de la cepa Me49 de T. gondii y tratados con CTLA4-Ig. Las flechas indican d^as de tratamiento con CTLA4-Ig. El Panel B presenta un grafico lineal que muestra la supervivencia de ratones Il27ra-/- (n = 10) o WT (n = 10) tratados con sulfadiazina el dfa 5 despues de la infeccion (flecha). El tratamiento se detuvo despues de dos semanas. El Panel C presenta fotograffas del analisis histopatologico del hffgado y los pulmones el dfa 14 y 30 despues de la infeccion de ratones Il27ra-/- tratados con CTLA4-Ig. El Panel D presenta fotograffa para el analisis de la patologfa en el cerebro de ratones WT y Il27ra-/- cronicamente infectados el dfa 30 despues de la infeccion con marcador espedfico de astrocitos GFAP. El Panel E presenta un grafico de barras de ADN de parasito aislado de los cerebros de ratones WT y Il27ra-/- cronicamente infectados medidos mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los resultados son representativos de dos experimentos con 4-5 ratones por grupo. Los Paneles F-H presentan graficos de barras que muestran la produccion de NO (Panel F), IFN-y (Panel G) e IL-12 (Panel H) a partir de BMNC aisladas de ratones WT o Il27ra-/- reestimuladas in vitro en presencia de STAg; despues de 48 h, los sobrenadantes se recogieron y se analizaron. Los resultados son representativos de cuatro experimentos independientes con resultados similares y las barras de que indican la SEM.
Los Paneles A-E de la Figura 3 ilustran que el agotamiento de celulas T CD4+ rescata ratones Il27ra-/- y reduce la inflamacion en el cerebro. El Panel A presenta un grafico de barras de BMNC totales recogidas de grupos de 4-5 ratones Il27ra-/- y WT infectados cronicamente. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. El Panel B presenta un grafico de barras de celulas T CD4+, celulas T CD8+, macrofagos y microglia. El porcentaje de celulas T CD4+, celulas T CD8+, macrofagos y microglia en cada preparacion de BMNC, segun se determina mediante citometna de flujo, se uso para calcular el numero total de celulas en cada poblacion. Las barras estan coloreadas como en el Panel A. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes con grupos de 4-5 ratones. El Panel B presenta un grafico lineal que muestra la supervivencia de ratones Il27ra-/- infectados con 20 quistes de Me49 y, el dfa 5 despues de la infeccion, tratados con sulfadiazina durante 2 semanas para controlar la replicacion de parasitos; a las cuatro semanas se inicio el agotamiento de celulas T CD4+. Los datos representan dos experimentos independientes con tres ratones por grupo. El Panel D ilustra la citometna de flujo sobre BMNC o esplenocitos aislados y tenidos con respecto a CD4 y CD8 para cuantificar el exito del agotamiento de CD4 en el cerebro. El Panel E presenta fotograffas de secciones del cerebro, tomadas el dfa 35 despues de la infeccion para histologfa. * indica un valor de P < 0,05.
Los Paneles A-D de la Figura 4 ilustran que IL-27 inhibe la produccion de IL-17 en el cerebro de ratones infectados cronicamente con T. gondii. El Panel A presenta graficos de barras de PCR en tiempo real cuantitativa para ARNm para IL-17, IL-6 y TNF en el cerebro de ratones Il27ra-/- y WT cronicamente infectados (Dfa 30 despues de la infeccion). Los datos son representativos de dos experimentos independientes. El Panel B presenta graficos de barras un ensayo ELISA sobre sobrenadantes procedentes de BMNC aisladas de ratones WT o Il27ra-/- reestimulados in vitro en presencia de STAg durante 48 h y evaluadas con respecto a IL-17, IL-6 y TNF. Los resultados son representativos de cuatro experimentos independientes con resultados similares y las barras de error que indican la SEM. El Panel C presenta un grafico de barras de un ensayo ELISA sobre sobrenadantes procedentes de BMNC aisladas de ratones WT y reestimuladas con STAg en presencia o ausencia de IL-23, IL-27 o IL-23 y IL-27 durante 48 h. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes con resultados similares y las barras de error representan la SEM. El Panel D ilustra la citometna de flujo de BMNC procedentes de ratones Wt y Il27ra-/- estimuladas durante 2 h ex vivo con PMA e ionomicina en presencia de BFA y tenidas intracelularmente con respecto a IL-17. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes con resultados similares. ND, no detectado.
Los Paneles A-C de la Figura 5 ilustran que IL-27 inhibe la produccion de IL-17 mediante celulas Th-17 generadas in vitro. Los Paneles A-C ilustran la citometna de flujo sobre celulas T CD4+ (Paneles A y C) y CD8+ (Paneles B y C) aisladas de ratones C57BL/6 y activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones inductoras de Th-17 en presencia o ausencia de IL-27 (Paneles A, B y C) o p28 (Panel C). Las celulas T CD4+ y CD8+ T cultivadas durante cuatro y tres dfas respectivamente se estimularon con PMA e ionomicina en presencia de BFA durante 4 h antes de tenir con respecto a IL-17 (Paneles A, By C), TNF (Paneles A y B) o IFN-y (Panel C) intracelulares. Los graficos se limitan a celulas T CD4+ o CD8+ cuando se especifique; los numeros en los cuadrantes representan la frecuencia de celulas en cada uno. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Los Paneles A-F de la Figura 6 ilustran que la inhibicion mediada por IL-27 de la produccion de IL-17 por celulas T es independiente de SOCS3. Los Paneles A y B presentan graficos de barras de un ensayo ELISA sobre sobrenadantes procedentes de celulas T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 bajo condiciones inductoras de Th-17 con concentraciones crecientes de IL-27 en presencia o ausencia de anticuerpo anti-IL-6 para la produccion de IL- 17. El Panel C ilustra la citometna de flujo sobre celulas T CD4+ purificadas procedentes de ratones gp130Y757F o controles de companeros de camada Wt tenidos con respecto a P-STAT3 intracelular despues de la estimulacion con IL-6 (5 min., 60 min. o 24 h). El Panel D ilustra la citometna de flujo sobre celulas T cD4+ aisladas de ratones gp130Y757F o controles de companeros de camada WT y estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones inductoras de Th-17 en presencia o ausencia de IL-27 cuatro dfas antes de tenir con respecto a IL-17 e IFN-y
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intracelulares. El Panel E presenta un grafico de barras de un ensayo ELISA sobre sobrenadantes procedentes de celulas T CD4+ de controles de companeros de camada gp130Y757F o WT desarrollados bajo las condiciones inductoras de Th-17 en presencia de cantidades crecientes de IL-27 para la produccion de IL-17. El Panel F ilustra la citometna de flujo de celulas T CD4+ Socs3-/- aisladas de ratones CreMMTVSocs3fl/fl activadas para inducir la produccion de IL-17 en presencia o ausencia de IL-27 antes de tenir con respecto a IL-17 intracelular. Los graficos se limitan a celulas T CD4+; los numeros en los cuadrantes representan la frecuencia de celulas en cada uno. Los datos son representativos detres experimentos independientes. Las barras de error representan la SEM.
Los Paneles A-B de la Figura 7 ilustran que la inhibicion mediada por IL-27 de la produccion de IL-17 por celulas T depende de STAT1 pero no de T-bet. El Panel A ilustra la citometna de flujo sobre celulas T CD4+ aisladas de ratones CD57BL/6, Statl-/- o Tbx21-/- y activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones inductoras de Th-17 en presencia o ausencia de IL-27 y a continuacion tenidas con respecto a IL-17 y TNF intracelulares. Los datos representan tres experimentos independientes. El Panel B presenta un grafico de barras de un ensayo ELISA sobre sobrenadantes de esplenocitos aislados de ratones C57BL/6 (n = 3) o Statl-/- (n=3) siete dfas despues de la infeccion intraperitoneal con 20 quistes precedentes de la cepa Me49 de T. gondii y reestimulados durante 48 h en presencia o ausencia de STAg para la produccion de IL-17. Los graficos se limitan a celulas T CD4+; los numeros en los cuadrantes representan la frecuencia de celulas en cada uno. Las barras de error indican la SEM.
La Figura 8 presenta datos de citometna de flujo que ilustran que celulas T aisladas de los cerebros de ratones Il27ra-/- y WT infectados cronicamente presentan un fenotipo activado. Las BMNC se aislaron de ratones Il27ra-/- y WT infectados cronicamente. Las celulas T CD4+ y CD8+ se tineron con respecto a los marcadores de activacion CD44 y CD62L. Los graficos se limitan a celulas T CD4+ o CD8+ T cuando se indique. Los datos son representativos detres experimentos independientes.
La Figura 9 presenta datos de citometna de flujo que ilustran que IL-27 inhibe la produccion de IL-17 por celulas T CD4+ sin la estimulacion con PMA e ionomicina. Celulas T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 se activaron con a- CD3 y a-CD28 bajo condiciones no polarizantes (anti-IFN-Y, anti-IL-4). Se usaron TGF-p solo o en combinacion con IL-6 o IL-6, IL-1-p, TNF se usaron para generar celulas Th-17 en presencia o ausencia de IL-27. Las celulas se tineron con respecto a IL-17 e IFN-y intracelulares sin estimulacion con PMA ni ionomicina el dfa cuatro. Los graficos se limitan a celulas T CD4+; los numeros en los cuadrantes representan la frecuencia de celulas en cada uno. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
La Figura 10 presenta datos de citometna de flujo que ilustran que la inhibicion por IL-27 de la produccion de IL-17 por celulas T es independiente de SOCS3. Celulas T CD4+ procedentes de ratones gp130Y757F o controles de companeros de camada WT se desarrollaron bajo condiciones inductoras de Th-17 en presencia o ausencia de IL- 27. Sin embargo, en este experimento las celulas T se estimularon con PMA e ionomicina mas BFA durante 4 h en dfa 4 antes de tenir con respecto a IL-17 y TNF intracelulares. Los graficos se limitan a celulas T CD4+; los numeros en los cuadrantes representan la frecuencia de celulas en cada uno. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
La Figura 11 presenta un grafico de barras de niveles de IL-17, que muestra que la inhibicion por IL-27 de IL-17 se produce independientemente de su capacidad para inhibir la produccion de IL-2. Celulas T CD4+ aisladas de ratones DO11.10 transgenicos se activaron con peptido de ovoalbumina bajo condiciones inductoras de Th-17 en presencia o ausencia de IL-27. Las celulas se cultivaron durante cuatro dfas en presencia o ausencia IL-2 humana antes de analizar los sobrenadantes celulares con respecto a IL-17 mediante ELISA. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
La Figura 12 presenta graficos lineales de niveles de IL-2 e IFNy, que ilustran que la inhibicion de la produccion de IL-2 e IFNy por IL-27 esta potenciada por un polipeptido de WsX-1 soluble en celulas T CD4+ procedentes de ratones inactivados en WSX-1.
Los Paneles A-C de la Figura 13 ilustran esquematicamente estrategias para modular la respuesta inflamatoria al modular la senalizacion a traves del receptor de IL-27 o sus componentes WSX-1 y gp130. El Panel A representa esquematicamente la senalizacion a traves del receptor de IL-27 mediante IL-27 (un heterodfmero de EBI3 y p28). El Panel B ilustra esquematicamente la senalizacion a traves de gp130 mediante un complejo de WSX-1 soluble/p28 o un complejo de WSX-1 soluble/IL-27. El Panel C ilustra esquematicamente la senalizacion a traves de WSX-1 mediante un complejo de gp130 soluble/p28 o un complejo de gp130 soluble/IL-27.
Los Paneles A-C de la Figura 14 ilustran que IL-27 promueve la produccion de IL-10 por celulas T CD4+ y CD8+. El Panel A presenta un grafico de barras que muestra resultados del bioensayo RodentMAP™, que se expresan como el porcentaje de cambio entre celulas cultivadas bajo condiciones no polarizantes y las estimuladas con IL-27. Los Paneles B y C ilustran la produccion de IL-10 por celulas T CD4+ (Panel B) y celulas T CD8+ (Panel C) segun se mide mediante citometna de flujo y ELISA de sobrenadantes de cultivo de 72 h (barras de error, d. e.). Se aislaron
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celulas T del bazo y los nodulos linfaticos de ratones C57BL/6 y se activaron con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27. Celulas T CD4+ y CD8+ T cultivadas durante 4 d y 3 d, respectivamente, se estimularon durante 4 h con PMA e ionomicina en presencia de brefeldina A antes de la tincion con respecto a IL-10 intracelular. Los numeros en las cajas indican porcentaje de celulas IL-10+. Los numeros en negrita representan la intensidad de fluorescencia media (MFI). Los resultados en los Paneles B y C son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
Los Paneles A-C de la Figura 15 ilustran que la produccion de IL-10 se reduce en ausencia de senalizacion de IL- 27R. El Panel A presenta un grafico de barras de ELISA de IL-10 en los sobrenadantes procedentes de celulas T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 silvestres (WT) o Il-27ra-/-; las celulas se desarrollaron bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares (barras de error, d. e.). El Panel B ilustran la citometna de flujo de BMNC y bazos procedentes de ratones WT e Il-27ra-/- cronicamente infectados con T. gondii; las celulas se estimularon 5 h ex vivo con PMA e ionomicina en presencia de brefeldina A y se tineron intracelularmente con respecto a IL-10. Los numeros en las cajas indican porcentaje de celulas IL-10+. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. El Panel C presenta un grafico lineal de ELISA de IL-10 en sobrenadantes procedentes de BMNC WT (n = 4) reestimuladas durante 48 h in vitro con antigeno toxoplasmatico soluble (STAg) en presencia o ausencia de IL-27. Barras de error, d. e. *, P = 0.0275.
Los Paneles A-B de la Figura 16 ilustran que las celulas T CD4+ elaboran IL-10 en respuesta a IL-27 bajo Th1 y Th2 pero no condiciones de Th17. El Panel A muestra el analisis de dilucion de CFSE de celulas T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27 (tiempo, graficos anteriores) antes de tenir con respecto a IL-10 intracelular. Los graficos se limitan a celulas T CD4+. El Panel B ilustra la citometna de flujo de celulas T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 activadas con anti- CD3 y anti-CD28 bajo condiciones polarizantes de Th1, Th2 o Th17 en presencia o ausencia de IL-27 antes de la tincion intracelular de IL-10. Los numeros en negrita representan la MFI. Para los Paneles A y B, los numeros en cajas indican porcentaje de celulas IL-10+. Los datos son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
Los Paneles A-B de la Figura 17 ilustran que IL-27 induce la generacion de celulas T CD4+ IFN-Y+IL-10+ bajo condiciones de Th1. El Panel A ilustra la citometna de flujo de celulas T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 y activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones polarizantes de Th1, TH2 o Th17 en presencia o ausencia de IL-27 antes de tenir con respecto a IL-10 intracelular y citocinas asociadas a Th firmadas IFN-y, IL-13 o IL-17. El Panel B ilustra la citometna de flujo de celulas T CD4+ aisladas de ratones IL-10-/- activadas con anti-CD3 y anti- CD28 bajo condiciones inductoras de Th17 en presencia o ausencia de IL-27 antes de tenir con respecto a IL-10 e IL-17 intracelulares. Los graficos se limitan a celulas T CD4+; los numeros en los cuadrantes representan la frecuencia de celulas en cada uno. Los datos son representativos de tres (Panel A) o dos (Panel B) experimentos independientes.
Los Paneles A-C de la Figura 18 ilustran que TGF-p aumenta la produccion de IL-10 conducida por IL-27 por celulas T CD4+. La produccion de IL-10 por celulas T CD4+ se mide mediante citometna de flujo (Panel A) y ELISA (Panel B) de sobrenadantes de cultivo de 72 h. Celulas T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6 se activaron con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27, TGF-p o la combinacion de ambas citocinas. Celulas T CD4+ cultivadas durante 4 d se estimularon durante 4 h con PMA e ionomicina en presencia de brefeldina A antes de tenir con respecto a IL-10 intracelular. Los numeros en cajas indican porcentaje de celulas IL- 10+; los numeros en negrita representan la MFI. Los datos son la media ± d. e. de diez ratones. El Panel C ilustra la citometna de flujo de celulas T CD4+ aisladas de ratones indicadores Foxp3GFP activadas con anti-CD3 y anti- CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27, TGF-p o la combinacion de ambas citocinas. Celulas T CD4+ cultivadas durante 3 d se estimularon durante 4 h con PMA e ionomicina en presencia de brefeldina A antes de tenir con respecto a IL-10 y GFP intracelulares. Los graficos se limitan a celulas T CD4+; los numeros en los cuadrantes representan la frecuencia de celulas en cada uno. Los datos son representativos de tres (a, b) o dos (c) experimentos independientes.
Los Paneles A-D de la Figura 19 ilustran que IL-6 se comporta sinergicamente con TGF-p para promover la produccion de IL-10. La produccion de IL-10 por celulas T CD4+ se mide mediante citometna de flujo (Panel A) y ELISA (Panel B) de sobrenadantes de cultivo de 72 h. Celulas T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6 se activaron con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-6, TGF-p o la combinacion de ambas citocinas. Celulas T CD4+ cultivadas durante 4 d se estimularon durante 4 h con PMA e ionomicina en presencia de brefeldina A antes de tenir con respecto a IL-10 intracelular. Los numeros en cajas indican el porcentaje de celulas IL-10+; los numeros en negrita representan la MFI. Los datos son la media ± d. e. de triplicados. Los Paneles C y D ilustran la citometna de flujo de celulas T CD4+ purificadas procedentes de ratones C57BL/6; las celulas se dejaron sin estimular o se estimularon con IL-6 o IL-27 (tiempo, graficos anteriores), a continuacion se tineron con respecto a STAT1 (Panel C) (P-STAT1) o (Panel D) STAT3 (P-STAT3) fosforilados intracelulares. Los numeros en cajas representan el porcentaje de celulas T CD4+ (Panel C) P-STAT1+ o (Panel D)
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P-STAT3+. Los datos son representativos de tres (Paneles A y B) o dos (Paneles C y D) experimented independientes.
Los Paneles A-F de la Figura 20 ilustran la induccion de IL-10 dependiente de STAT. Citometna de flujo de celulas T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6, Statl-/- (Panel A) Tbx21-/- (Panel B) Stat3CD4-/- (Panel C) o Stat4-/- (Panel D) activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27 y a continuacion tenidas con respecto a IL-10 intracelular. Citometna de flujo of celulas T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6, Statl-/- (Panel E) o Stat3CD4-/- (Panel F) activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones no polarizantes con IL-6 en presencia o ausencia de TGF-p y a continuacion tenidas con respecto a IL-10 intracelular. Los numeros en cajas representan el porcentaje de celulas IL-10+. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
La Figura 21 presenta datos de citometna de flujo que ilustran que IL-6 induce la generacion de celulas T CD4+ IL- 10+ bajo condiciones de Th2. Citometna de flujo de celulas T CD4+ aisladas de ratones C57BL/6 y activadas con anti-CD3 y anti-CD28 bajo condiciones polarizantes de Th1 o Th2 en presencia o ausencia de IL-27 antes de tenir con respecto a IL-10 intracelular. Los numeros en cajas representan el porcentaje de celulas IL-10+; los numeros en negrita representan la MFI. Los datos son representativos detres experimentos independientes.
La Figura 22 presenta datos de citometna de flujo que ilustran que la produccion de IL-10 bajo condiciones Th1 depende de STAT4. Citometna de flujo de celulas T CD4+ aisladas de ratones C7BL/6 y Stat4-/- activadas con anti- CD3 y anti-CD28 bajo condiciones polarizantes de Th1 en presencia o ausencia de IL-27 y a continuacion tenidas con respecto a IL-10 intracelular. Los numeros en cajas representan el porcentaje de celulas IL-10+. Los datos son representativos detres experimentos independientes.
Definiciones
A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente tienen el mismo significado que es entendido comunmente por un experto normal en la especialidad de la que trata la invencion. Las siguientes definiciones complementan las de la especialidad y se dirigen a la presente solicitud y no deben ser atribuidas a ningun caso relacionado o no relacionado, p. ej., a cualquier patente o solicitud de propietario comun. Aunque cualesquiera metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente se pueden usar en la practica para las pruebas de la presente invencion, los materiales y metodos preferidos se describen en la presente. Segun esto, la terminologfa usada en la presente tiene el proposito de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa.
Segun se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" "uno(a)" y "el(la)" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Asf, por ejemplo, la referencia a "una protema” incluye una pluralidad de protemas; la referencia a "una celula" incluye mezclas de celulas, y similares.
El termino "aislado" se refiere a un material biologico, tal como un acido nucleico o un polipeptido, que esta sustancialmente libre de componentes que normalmente acompanan a o interactuan con el en su ambiente presente en la naturaleza. El material aislado comprende opcionalmente material no encontrado con el material en su ambiente natural, p. ej., una celula. Por ejemplo, si el material esta en su ambiente natural, tal como una celula, el material se ha situado en una localizacion de la celula (p. ej., genoma o elemento genetico) no natural para un material encontrado en ese ambiente. Por ejemplo, un acido nucleico presente en la naturaleza (p. ej., una secuencia codificante, un promotor, un intensificador, etc.) se afsla si se introduce por medios no presentes en la naturaleza en un locus del genoma (p. ej., un vector, tal como un plasmido o un vector viral, o un amplicon) no natural para ese acido nucleico. Tales acidos nucleicos tambien se denominan acidos nucleicos "heterologos". Un polipeptido aislado, por ejemplo, esta en un ambiente (p. ej., un sistema de cultivo celular, o purificado del cultivo celular) distinto al ambiente natural del polipeptido silvestre. Preferiblemente, el polipeptido aislado esta sustancialmente libre de protema o polipeptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que podnan interferir con su uso terapeutico, diagnostico, profilactico, de investigacion u otro.
El termino "recombinante" indica que el material (p. ej., un acido nucleico o un polipeptido) ha sido alterado artificialmente o sinteticamente (no naturalmente) mediante intervencion humana. La alteracion se puede realizar sobre el material dentro de, o retirado de, su ambiente o estado natural. Por ejemplo, un "acido nucleico recombinante" es uno que se elabora al recombinar acidos nucleicos, p. ej., durante la clonacion, barajado de ADN u otros procedimientos; un "polipeptido recombinante" o una "protema recombinante" es, p. ej., un polipeptido o una protema que se produce mediante la expresion de un acido nucleico recombinante.
El termino "acido nucleico" abarca cualquier cadena ffsica de unidades de monomero que se puede corresponder con un cadena de nucleotidos, incluyendo un polfmero de nucleotidos (p. ej., un polfmeros de ADN o ARN tfpico), ANP, oligonucleotidos modificados (p. ej., oligonucleotidos que comprenden nucleotidos que no son tfpicos de ARN
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o ADN biologico, tales como oligonucleotidos metilados en 2'-O), y similares. Un acido nucleico puede ser, p. ej., de una sola hebra o de doble hebra. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de acido nucleico particular abarca secuencias complementarias, ademas de la secuencia indicada expKcitamente.
Una "secuencia polinucleotidica" o "secuencia nucleotidica" es un poKmero de nucleotidos (un oligonucleotido, un ADN, un acido nucleico, etc.) o una cadena de caracteres que representa un polfmero de nucleotidos, dependiendo del contexto. A partir de cualquier secuencia polinucleotfdica especificada, se puede determinar bien el acido nucleico dado o bien la secuencia polinucleotidica complementaria (p. ej., el acido nucleico complementario).
"Expresion de un gen" o "expresion de un acido nucleico" significa la transcripcion de ADN en ARN (incluyendo opcionalmente la modificacion del ARN, p. ej., el enlace), la traduccion de ARN en un polipeptido (posiblemente incluyendo la modificacion posterior del polipeptido, p. ej., modificacion postraduccional), o tanto la transcripcion como la traduccion, segun se indique por el contexto.
El termino "gen" es usa ampliamente para referirse a cualquier acido nucleico asociado con una funcion biologica. Los genes incluyen tfpicamente secuencias codificantes y/o las secuencias reguladoras requeridas para la expresion de tales secuencias codificantes. El termino "gen" se aplica a una secuencia genomica espedfica, asf como a un ADNc o un ARNm codificado por esa secuencia genomica. Genes tambien incluyen segmentos de acido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras protemas. Secuencias reguladoras no expresadas incluyen "promotores" e "intensificadores", a los que se unen protemas reguladoras tales como factores de transcripcion, dando como resultado la transcripcion de secuencias adyacentes o proximas. Un promotor o intensificador "espedfico de un tejido" es uno que regula la transcripcion en un tipo de tejido o tipo de celula, o tipos, espedficos.
Un "vector de expresion" es un vector, tal como un plasmido, que es capaz de promover la expresion asf como la replicacion de un acido nucleico incorporado en el mismo. Tfpicamente, el acido nucleico que se va a expresar esta "ligado operativamente" a un promotor y/o intensificador, y esta sometido a control regulador de la transcripcion por el promotor y/o intensificador.
Segun se usa en la presente, el termino "codificar" se refiere a cualquier procedimiento por el que se usa la informacion en una macromolecula polimerica o cadena de secuencia para dirigir la produccion de una segunda molecula o cadena de secuencia que es diferente de la primera molecula o cadena de secuencia. Segun se usa en la presente, el termino se usa ampliamente, y puede tener una variedad de aplicaciones. En un aspecto, el termino codificar describe el proceso de replicacion de ADN semiconservativa, donde una hebra de una molecula de ADN de doble hebra se usa como una plantilla para codificar una hebra hermana complementaria recientemente sintetizada mediante una ADN polimerasa dependiente de ADN. En otro aspecto, el termino codificar se refiere a cualquier proceso por el que la informacion en una molecula se usa para dirigir la produccion de una segunda molecula que tiene una naturaleza qmmica diferente de la primera molecula. Por ejemplo, una molecula de ADN puede codificar una molecula de ARN (p. ej., mediante el proceso de transcripcion que incorpora una enzima ARN polimerasa dependiente de ADN). Ademas, una molecula de ARN puede codificar un polipeptido, como en el proceso de traduccion. En otro aspecto, una molecula de ADN puede codificar un polipeptido, donde se entiende que "codificar" segun se usa en ese caso incorpora los procesos tanto de transcripcion como de traduccion.
Un "polipeptido" es un polfmero que comprende dos o mas residuos de aminoacido (p. ej., un peptido o una protema). El polfmero puede comprender adicionalmente elementos distintos a aminoacidos tales como etiquetas, desactivadores, grupos de bloqueo, o similares, y puede comprender opcionalmente modificaciones tales como glicosilacion o similares. Los residuos de aminoacido del polipeptido pueden ser naturales o no naturales y pueden estar no sustituidos, no modificados, sustituidos o modificados.
Una "secuencia de aminoacidos" es un polfmero de residuos de aminoacido (una protema, un polipeptido, etc.) o una cadena de caracteres que representa un polfmero de aminoacidos, dependiendo del contexto.
"Interleucina-27" o "IL-27" es una citocina heterodfmera que incluye "EBI3" y "p28." Otros nombres para p28 en la bibliograffa incluyen interleucina 30 o IL30. p28 se describe, por ejemplo, en la entrada 608273 en la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man, en Internet en www (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/Omim. Veanse ademas las id de secuencia protemica NP_663634 y NP_663611.1, el numero de registro de secuencia nucleotfdica NM_145659 y NM_145636.1, y la ID genica 246778 y 246779, disponibles, p. ej., a traves de navegadores de protemas, nucleotidos y genes de the National Center for Biotechnology Information's Entrez en Internet en www (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/entrez. EBI3 ("gen inducido por el virus de Epstein-Barr 3") se describe, por ejemplo, en la entrada 605816 en la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man. Veanse ademas las id de secuencias protefnicas NP_005746 y NP_056581.1, el numero de registro de secuencia nucleotfdica NM_005755 y NM_015766 y la ID genica 10148 y 50498.
IL-27 senala a traves de un complejo receptor que incluye los receptores de citocina de clase I "WSX-1" y "gp130." Otros nombres para WSX-1 en la bibliograffa incluyen receptores de citocina de celulas T (TCCR), receptor de interleucina 27 alfa (IL27RA) y receptor de interleucina 27 (IL27R). WSX-1 se describe, por ejemplo, en la entrada
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605350 en la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man. Veanse ademas las id de secuencia protemica NP_004834 y NP_057880.1, el numero de registro de secuencia nucleotidica NM_004843 y NM_01667l y la ID genica 9466 y 50931. Otros nombres para gp130 en la bibliograffa incluyen transductor de senales de interleucina 6 (IL6ST). gpl3o se describe, por ejemplo, en la entrada 600694 en la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man. Veanse ademas las id de secuencia protemica NP_002175 y NP_034690, el numero de registro de secuencia nucleotidica NM_002184 y NM_010560 y la ID genica ID 3572 y 16195.
Un "polipeptido de WSX-1" (o, analogamente, "polipeptido de gp130, "polipeptido de p28" o "polipeptido de EBI3") se refiere a un polipeptido que incluye la secuencia de aminoacidos de longitud completa de un WSX-1 (o gp130, p28 o EBI3) presente en la naturaleza o una secuencia o fragmento del mismo, o una variante del mismo (es decir, una variante de la secuencia de longitud completa o la subsecuencia). Polipeptidos de WSX-1, gp130, p28 y EBI3 ejemplares se presentan anteriormente; polipeptidos de WSX-1, gp130, p28 y EBI3 tambien incluyen polipeptidos homologos o sustancialmente identicos a los mismos, y subsecuencias o variantes de los mismos.
Una "subsecuencia" o "fragmento" es cualquier porcion de una secuencia entera, hasta e incluyendo la secuencia completa. Tfpicamente, una subsecuencia o fragmento comprende menos de la secuencia de longitud completa. Opcionalmente, y dependiendo de la longitud de la secuencia completa, una subsecuencia puede incluir, p. ej., al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300 o al menos aproximadamente 500 aminoacidos contiguos de la secuencia completa.
El termino "variante" (o "derivado") con respecto a un polipeptido indica que la variante tiene una secuencia de aminoacidos que esta alterada por uno o mas aminoacidos con respecto a una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia presente en la naturaleza). La variante puede tener cambios "conservativos", en los que un aminoacido sustituido tiene propiedades estructurales o qmmicas similares, p. ej., sustitucion de leucina por isoleucina. Alternativamente, una variante puede tener cambios "no conservativos", p. ej., sustitucion de una glicina por un triptofano. Una variacion menor analoga tambien puede incluir supresion o insercion de aminoacidos, o ambas. Directrices para determinar que residuos de aminoacido se pueden sustituir, insertar o suprimir sin eliminar actividad biologica o inmunologica se pueden encontrar usando programas informaticos muy conocidos en la especialidad, por ejemplo, el software DNASTAR. Ejemplos de sustituciones conservativas tambien se describen posteriormente. Las variantes tambien incluyen protemas de fusion y polipeptidos derivados de otro modo del polipeptido. Opcionalmente, la variante es al menos aproximadamente 60% identica a la secuencia de referencia (p. ej., una secuencia presente en la naturaleza, p. ej., una secuencia polipeptfdica de WSX-1, gp130, p28 o eBI3 de ser humano o raton) o una subsecuencia de la misma. Frecuentemente, tales secuencias son al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos
aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos
aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o al menos aproximadamente 99,5% identicas a la secuencia de referencia, por ejemplo, sobre una subsecuencia de la secuencia de referencia incluyendo, p. ej., al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 75, al menos
aproximadamente 100, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300 o al menos
aproximadamente 500 aminoacidos contiguos de la secuencia de referencia.
El termino "derivado de" se refiere a un componente que se afsla de o se elabora usando una molecula especificada, o informacion procedente de la molecula especificada. Por ejemplo, un polipeptido que se deriva de un segundo polipeptido puede incluir una secuencia o subsecuencia de aminoacidos que es identica o sustancialmente identica a la secuencia o subsecuencia de aminoacidos del segundo polipeptido. En el caso de polipeptidos, la especie derivada se puede obtener, por ejemplo, mediante mutagenesis presente en la naturaleza, mutagenesis dirigida artificial, mutagenesis aleatoria artificial, u otras tecnicas para producir polipeptidos recombinantes. La mutagenesis de un polipeptido implica tfpicamente la manipulacion del polinucleotido que codifica el polipeptido.
El termino "protema de fusion" indica que la protema incluye componentes polipeptfdicos derivados de mas de una protema o un polipeptido parental. Tfpicamente, una protema de fusion se expresa a partir de un gen de fusion en el que una secuencia nucleotfdica que codifica una secuencia polipeptfdica procedente de una protema se adjunta en el marco con, y opcionalmente separada por un ligador de, una secuencia nucleotfdica que codifica una secuencia polipeptfdica procedente de una protema diferente. El gen de fusion puede ser expresado a continuacion por una celula (o en un sistema de expresion in vitro) como una sola protema de fusion recombinante. Como otro ejemplo, una protema de fusion se puede producir al conectar covalentemente (p. ej., in vitro) los componentes polipeptfdicos despues de que cada componente se produzca separadamente.
Un "polipeptido de WSX-1 soluble" o "WSX-1 soluble" comprende la totalidad o parte del dominio extracelular de un polipeptido de WSX-1 (p. ej., un WSX-1 presente en la naturaleza o una variante del mismo) pero no el dominio transmembranario o el dominio intracelular. El polipeptido (o un complejo que incluye el polipeptido) opcionalmente es soluble en solucion acuosa en una concentracion de al menos aproximadamente 10 pg/ml, al menos aproximadamente 100 pg/ml, al menos aproximadamente 1 mg/ml o al menos aproximadamente 10 mg/ml.
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Un "polipeptido de gp130 soluble" o "gp130 soluble" comprende la totalidad o parte del dominio extracelular de un polipeptido de gp130 (p. ej., una gp130 presente en la naturaleza o una variante de la misma) pero no el dominio transmembranario o el dominio intracelular. El polipeptido (o un complejo que incluye el polipeptido) opcionalmente es soluble en solucion acuosa en una concentracion de al menos aproximadamente 10 pg/ml, al menos aproximadamente 100 pg/ml, al menos aproximadamente 1 mg/ml o al menos aproximadamente 10 mg/ml.
Un "dominio" de una protema es cualquier porcion de la protema entera, hasta e incluyendo la protema completa, pero tfpicamente comprendiendo menos de la protema completa. Un dominio puede, pero no necesita, plegarse independientemente del resto de la cadena protemica y/o correlacionarse con una funcion biologica o localizacion particular (p. ej., un dominio de union a ligando o un dominio citosolico, transmembranario o extracelular).
El termino "afeccion inflamatoria" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno u otra afeccion en los que este presente inflamacion. La inflamacion puede ser, p. ej., aguda, cronica, localizada y/o sistemica y puede estar mediada por celulas de la respuesta inmunitaria innata y/o adaptiva.
Una composicion "antiinflamatoria" es una que mejora la inflamacion. Por ejemplo, la composicion puede provocar la resolucion de o prevenir el empeoramiento adicional de una afeccion inflamatoria.
Un "sujeto" en la presente es tfpicamente un ser humano, pero puede ser un mairnfero no humano. Mamfferos no humanos ejemplares incluyen animales de laboratorio, domesticos, de comparMa, deportivos y de ganado, p. ej., ratones, gatos, perros, caballos y vacas. En un aspecto, tal sujeto es elegible para el tratamiento de una afeccion inflamatoria. Para los propositos de la presente, tal sujeto elegible es un que este experimentado o haya experimentado uno o mas signos, smtomas u otras indicaciones de la afeccion inflamatoria. El diagnostico de la afeccion (y la determinacion de la elegibilidad para el tratamiento) se puede realizar segun se establece en la especialidad.
"Tratamiento" de un sujeto en la presente se refiere tanto a un tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen una afeccion inflamatoria asf como aquellos en los que se ha de prevenir la inflamacion. De aim que el sujeto pueda haber sido diagnosticado con una afeccion inflamatoria o pueda estar predispuesto o ser sensible a la afeccion inflamatoria.
El termino "mejoraf o "mejora" segun se usa en la presente se refiere a una disminucion, reduccion o eliminacion de una afeccion, enfermedad, trastorno o fenotipo, incluyendo una anormalidad o un smtoma.
Un "smtoma" de una afeccion, enfermedad o trastorno es cualquier fenomeno morbido o separacion de lo normal en estructura, funcion o sensacion, experimentado por un sujeto e indicativo de la afeccion, enfermedad o trastorno.
La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz para prevenir, mejorar o tratar una afeccion, enfermedad o trastorno. Por ejemplo, una "cantidad terapeuticamente eficaz" de un polipeptido o complejo se refiere a una cantidad del polipeptido o complejo que es eficaz para prevenir, mejorar o tratar la afeccion inflamatoria especificada. De forma similar, una "cantidad terapeuticamente eficaz" de una combinacion de un polipeptido o complejo y un segundo compuesto (p. ej., un anticuerpo, otro polipeptido o complejo o un farmaco) se refiere a una cantidad del polipeptido o complejo y una cantidad del segundo compuesto que, en combinacion, son eficaces para prevenir, mejorar o tratar la afeccion especificada.
Se ha de entender que la terminologfa "una combinacion de" dos compuestos no significa que los compuestos se tengan que administrar mezclados entre sf. Asf, el tratamiento con o el uso de tal combinacion abarca una mezcla de los compuestos o la administracion separada de los compuestos, e incluye la administracion el mismo dfa o en dfas diferentes. Asf, la terminologfa "combinacion" significa que se usan dos o mas compuestos para el tratamiento, bien individualmente o bien mezclados entre sf. Cuando un polipeptido o complejo y un segundo compuesto, por ejemplo, se administran en combinacion a un sujeto, el polipeptido o complejo esta presente en el sujeto en un momento en el que el segundo compuesto tambien esta presente en el sujeto, ya se administren el polipeptido o complejo y el segundo compuesto individualmente o mezclados al sujeto.
El termino "anticuerpo" en la presente memoria se usa en el sentido mas amplio y cubre espedficamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (p. ej. anticuerpos biespedficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo con tal de que exhiban la actividad biologica deseada. Un anticuerpo es una protema que comprende uno o mas polipeptidos sustancialmente o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de regiones constantes kappa, lambda, alfa, y, delta, epsilon y mu, asf como un gran numero de genes de regiones variables de inmunoglobulina.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porcion de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la region de union a antfgeno de la misma. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
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Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros as^ como una region Fc.
Los "anticuerpos naturales" son habitualmente glicoprotemas heterotetrameras de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras light (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta ligada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el numero de enlaces disulfuro vana entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tienen puentes de diisulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido por un numero de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoacido particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada.
El termino "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren mucho en secuencia entre anticuerpos y se usan en la union y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antfgeno particular. Sin embargo, la variabilidad no esta uniformemente distribuida a traves de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones mas altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones de marco (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada una cuatro FR, que adoptan principalmente un configuracion de lamina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de lamina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen en estrecha proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antfgeno de los anticuerpos (vease Kabat y cols. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antfgeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participacion del anticuerpo en la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos.
La digestion con papama de anticuerpos produce dos fragmentos de union a antfgeno identicos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de union a antfgeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse facilmente. El termino "region Fc" se refiere a tal fragmento que no se une a antfgeno resultante de la digestion de todo el anticuerpo, ya este en forma monomera o multimera. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de union a antfgeno y todavfa es capaz de reticular el antfgeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mmimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antfgeno y union a antfgeno. Esta region consiste en un dfmero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociacion intensa no covalente. Es en esta configuracion que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactuan para definir un sitio de union a antfgeno sobre la superficie del dfmero Vh-Vl. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo especificidad de union a antfgeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende solo tres regiones hipervariables espedficas para un antfgeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antfgeno, aunque con menor afinidad que el sitio de union entero.
El fragmento Fab tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de nuevos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o mas cistemas de la region de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominacion en la presente para Fab' en la que el residuo o los residuos de cistema de los dominios constantes soportan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cistemas de bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos qmmicos de fragmentos de anticuerpo. Vease, p. ej., Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), para una descripcion mas detallada de otros fragmentos de anticuerpo.
Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpo en cuanto a la digestion de un anticuerpo intacto, un experto apreciara que tales fragmentos se pueden sintetizar de novo bien qmmicamente o bien al utilizar tecnologfa de ADN recombinante. Asf, el termino anticuerpo, segun se usa en la presente, incluye anticuerpo o fragmentos de los mismos bien producidos mediante la modificacion de anticuerpos enteros o bien sintetizados de novo usando tecnologfas de ADN recombinante.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) procedentes de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (k) y lambda (A), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e
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IgA2. Los dominios constantes de cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a (alfa), 8 (delta), £ (epsilon), y (gamma) y p (mu), respectivamente. Las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios Vh y Vl de anticuerpo, en donde estos dominios estan presentes en una sola cadena polipeptidica. Preferiblemente, el polipeptido de Fv comprende ademas un ligador polipeptidico entre los dominios Vh y Vl que permite que scFv forme la estructura deseada para la union al antfgeno. Para una revision de scFv, vease Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).
El termino "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequenos con dos sitios de union a antigeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptfdica (Vh-Vl). Al usar un ligador que sea demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, las cadenas se fuerzan para aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union a antigeno. Los diacuerpos se describen mas a fondo, por ejemplo, en los documentos Ep 404.097; WO 1993/11161; y Hollinger y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
El termino "anticuerpo monoclonal" segun se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos y/o se unen al mismo epttopo, excepto para posibles variantes que pueden surgir durante la produccion del anticuerpo monoclonal, estando presentes generalmente tales variantes en cantidades secundarias. En contraste con preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen tfpicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epftopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante sobre el antfgeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que no estan contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo que se obtiene a partir de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no se debe considerar que requiera la produccion del anticuerpo mediante ningun metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar segun la presente invencion se pueden elaborar mediante el metodo del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler y cols., Nature, 256:495 (1975), o se pueden elaborar mediante metodos de ADN recombinante (vease, p. ej., la Pat. EE. UU. N° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" tambien se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las tecnicas descritas en Clackson y cols., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y cols., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen espedficamente anticuerpos “quimericos" (inmunoglobulinas) en los que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena o las cadenas es identico u homologo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asf como fragmentos de tales anticuerpos, con tal de que exhiban la actividad biologica deseada (Pat. EE. UU. N° 4.816.567; Morrison y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticuerpos quimericos de interes en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de union a antfgeno de dominios variables derivadas de un primate no humano (p. ej. monos del Viejo Mundo, tales como babuino, mono Rhesus o mono cynomolgus) y secuencias de region constante humanas (Pat. EE. UU. N° 5.693.780).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., marinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos procedentes de una region hipervariable del receptor se reemplazan por residuos procedentes de una region hipervariable de una especia no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de regiones de marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos. Por otra parte, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donantes. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente la totalidad de al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las FR son las de una secuencia inmunoglobulmica humana, excepto por la sustitucion o sustituciones de FR que se apuntan anteriormente. El anticuerpo humanizado tambien comprendera opcionalmente al menos una porcion de una region constante inmunoglobulmica, tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, veanse Jones y cols., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y cols., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593596 (1992).
El termino "region hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoacido de un anticuerpo que son responsables de la union al antfgeno. La region hipervariable comprende residuos de aminoacido procedentes de una "region determinante de la complementariedad" o "CDR" (vease, p. ej., Kabat y cols.
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Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los residuos procedentes de un "bucle hipervariable" (vease, p. ej., Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos de "marco" o "FR" son los residuos de dominio variable distintos a los residuos de la region hipervariable segun se define en la presente.
Los terminos "receptor de Fc" y "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol 9:457-92; Capel y cols. (1994) Immunomethods 4:25-34; y de Haas y cols. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-41. Otros FcR, incluyendo los que se van a identifican en el futuro, son abarcados por el termino "FcR" en la presente. El termino tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer y cols. (1976) J. Immunol. 117:587 y Kim y cols. (1994) J. Immunol. 24:249).
Un "modulador de la actividad" modula (intensifica o inhibe) una actividad de un polipeptido o complejo (p. ej., un receptor o ligando de receptor), bien parcialmente o bien completamente. Un modulador puede ser, p. ej., una molecula pequena, un polipeptido, un acido nucleico, etc.
Un "agonista" es un compuesto (p. ej., una sustancia endogena o un farmaco) que se une a y activa un receptor, iniciando de ese modo una respuesta (p. ej., una respuesta fisiologica o farmacologica) caractenstica de ese receptor. Los agonistas pueden ser, p. ej., agonistas totales o agonistas parciales.
Un "antagonista" es un compuesto (p. ej., un farmaco) que se puede unir a un receptor y evitar que un agonista se una a y active ese receptor. Tfpicamente, la union de un antagonista a un receptor forma un complejo que no da lugar a ninguna respuesta, como si el receptor estuviera desocupado. Alternativamente, el antagonista puede ser un agonista parcial.
Merece la pena apuntar que ciertos compuestos se pueden clasificar como un agonista y como un antagonista. Por ejemplo, un "agonista-antagonista mixto" (tambien llamado un "agonista parcial") es un compuesto que posee afinidad para un receptor, pero que, a diferencia de un agonista total, provocara solo un pequeno grado de la respuesta caractenstica de ese receptor, aunque una alta proporcion de receptores esten ocupados por el compuesto. Tal ocupacion de los receptores por el agonista parcial puede evitar la union de un agonista total (p. ej., un agonista endogeno) al receptor.
Una variedad de terminos adicionales se define o se caracteriza de otro modo en la presente.
Descripcion detallada
Existen numerosas afecciones inflamatorias en las que las celulas T son mediadores cnticos de la enfermedad, y se ha enfocado mucho esfuerzo en el desarrollo de estrategias para inhibir espedficamente respuestas de celulas T. Por ejemplo, la enteropatfa inflamatoria, la enfermedad de Crohn, la esclerosis multiple, la uveitis, la psoriasis, la artritis, el asma, el lupus y el rechazo de trasplantes son todas afecciones que implican a celulas T. La respuesta inmunitaria tambien se ha relacionado con una variedad de otras afecciones idiopaticas, tales como espondilitis anquilosante y sarcoidosis. Para todas estas afecciones, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos enfoques terapeuticos. El reconocimiento de que WSX-1 es importante en la inhibicion de respuestas de celulas T significa que este receptor representa una diana viable para prevenir este tipo de respuestas inflamatorias. Alternativamente, el bloqueo de este receptor se podna usar para aumentar respuestas de celulas T, por ejemplo durante la vacunacion o la terapia mediada inmunitariamente para el cancer. Ademas, ciertos tipos de tumores que expresan WSX-1 pueden ser sensibles a la senalizacion inhibidora a traves de este receptor.
Otras celulas que expresan WSX-1 o su socio gp130 (incluyendo celulas que expresan ambos) se pueden elegir como diana de forma similar. Se pueden modular respuestas mediadas bien por celulas que expresan WSX-1 o bien por celulas que expresan gp130, por ejemplo, mediante un polipeptido o complejo de gp130 soluble o un polipeptido o complejo de WSX-1 soluble, respectivamente, o mediante p28. Asf, las respuestas mediadas por celulas B, mastocitos, neutrofilos, macrofagos, celulas dendnticas y/o similares se pueden modular mediante la activacion o el bloqueo del receptor o los receptores pertinentes.
Usos y aplicaciones comerciales potenciales
p28, sola o en combinacion con una forma soluble de WSX-1, se pueden usar para suprimir muchas afecciones inflamatorias incluyendo, pero no limitadas a, alergias, artritis, enteropatfa inflamatoria, uveitis, ciertos canceres, psoriasis, lupus, esclerosis multiple y enfermedades infecciosas cronicas tales como tuberculosis y hepatitis. A partir de estas observaciones, se sugieren enfoques similares como enfoques terapeuticos utiles. Asf, una protema de fusion de WSX-1 (p. ej., con una inmunoglobulina) es util debido a que interactua con IL-27 endogena y promueve su interaccion con gp130 y promueve efectos negativos sobre las dianas. Tambien se pueden construir moleculas terapeuticas para que tengan funciones dobles; por ejemplo, tal molecula se puede basar en una estructura de
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anticuerpo en la que una cadena puede reconocer un marcador espedfico de una celula tal como, pero no limitado
а, CD4, CD8, CD11c, etc. y la otra cadena contiene una fusion de WSX-1 o p28. Esto permite la eleccion como diana de tipos de celulas muy espedficos. Adicionalmente, el reconocimiento de que la biologfa del receptor abarca elementos de senalizacion trans conduce a la idea de que las formas solubles de gp130 en complejos con IL-27 o p28 (o incluso EBI3) tambien pueden actuar para promover una senalizacion espedfica a traves de WSX-1. Sin limitacion a ningun mecanismo particular, en el modelo actual de los presentes inventores las diferentes cadenas receptoras del receptor de IL-27 tienen funciones de senalizacion unicas y pueden afectar a distintas funciones de las celulas T. Este concepto conduce al diseno de moleculas que afectan a la produccion de celulas T de citocinas particulares muy espedficamente. Basandose exclusivamente en el trabajo y los datos de los presentes inventores, estos sugieren que este enfoque se puede usar para elegir como diana, por ejemplo, IL-2, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-
б, IL-4, IL-13, IL-17 e IL-25, asf como IL-10, IL-5 y/o CD25. Todas estas representan dianas farmacologicas validas para biotecnologfa y son importantes en muchas enfermedades inflamatorias mediadas por celulas T. Los Paneles A-C de la Figura 13 esbozan algunas posibles estrategias. Segun se analiza con mas detalle y con ejemplos adicionales en la presente, existen muchos enfoques adicionales que se pueden formular basandose en esta informacion que permite a los presentes inventores elegir como diana racionalmente funciones inmunitarias discretas.
Composiciones antiinflamatorias
Un aspecto de la invencion proporciona composiciones que incluyen nuevos polipeptidos y complejos, que comprenden un complejo de WsX-1 soluble/IL-27 aislado o recombinante para el uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria, en donde la afeccion inflamatoria se selecciona de: un trastorno inmunitario; una infeccion; cancer; una alergia; artritis; asma; enteropatfa inflamatoria, enfermedad de Crohn; uveitis; psoriasis; lupus; esclerosis multiple; una enfermedad infecciosa cronica; tuberculosis; espondilitis anquilosante; rechazo de trasplantes; sarcoidosis; hepatitis. A modo de ejemplo, un "complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/p28" comprende un polipeptido de WSX-1 soluble en complejo con un polipeptido de p28, y una variante del complejo incluye un polipeptido de WSX-1 soluble variante y/o un polipeptido de p28 variante.
En un aspecto, la composicion es antiinflamatoria. Opcionalmente, la composicion disminuye la inflamacion cuando se administra a un sujeto, p. ej., un ser humano o un animal que exhibe inflamacion antes de tal administracion. De forma similar, opcionalmente, la composicion altera (p. ej., disminuye) una o mas actividades celulares caractensticas de una respuesta inflamatoria, por ejemplo, la expresion de citocinas particulares, en celulas a las que se aplica la composicion con relacion a celulas no expuestas a la composicion. Opcionalmente, la composicion incluye un excipiente farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, en realizaciones en las que la composicion se va a administrar a un sujeto. En una realizacion, la composicion suprime el desarrollo de celulas que producen IL-17 (tambien llamadas celulas T17) a partir de celulas T vfrgenes inducidas por IL-6 y factor de crecimiento transformante beta (TGF-p). Por ejemplo, la composicion puede suprimir el desarrollo de celulas cooperadoras T (Th-17) CD4+ que producen IL17 a partir de celulas T vfrgenes inducidas por IL-6 y factor de crecimiento transformante beta. De forma similar, opcionalmente la composicion suprime una o mas funciones de las celulas T17. En una realizacion, la composicion incluye TGF-p.
La composicion puede incluir una o mas celulas, por ejemplo, una o mas celulas T, celulas B, mastocitos, neutrofilos, macrofagos, celulas dendnticas u otras celulas que expresan gp130 (p. ej., celulas endoteliales) o WSX-1. El complejo puede afectar a una funcion o actividad de la celula. En una realizacion, la composicion incluye una celula T y la composicion altera una funcion o actividad de la celula T, con relacion a una celula T correspondiente no tratada con la composicion. Por ejemplo, la celula T puede presentar una expresion alteradas de IL-2, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5 o Cd25, proliferacion alterada o supervivencia alterada. La expresion de las diversas citocinas se puede detectar mediante cualquiera de una variedad de tecnicas muy conocidas en la especialidad, p. ej., para detectar niveles de ARNm y/o protema. Tfpicamente, la expresion de las citocinas (p. ej., IL-2 e IFN-gamma) es regulada a la baja por el complejo, aunque la produccion de la citocina inhibidora IL-10 tfpicamente se incrementa. Tfpicamente, un complejo de wSX-1 se usa para modular la actividad de una celula que expresa gp130 (y opcionalmente tambien WSX-1), mientras que un complejo de gp130 se usa para modular la actividad de una celula que expresa WSX-1 (y opcionalmente tambien gp130).
Polipeptidos de WSX-1 y gp130 solubles adecuados incluyen, por ejemplo, el dominio extracelular de WSX-1 o gp130 o una porcion (una subsecuencia) del mismo. El dominio extracelular opcionalmente es parte de una protema de fusion, p. ej., una de las descritas en la presente o una fusion con una region Fc, p. ej., un dominio Fc de IgG. Vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. 20040185049 de Hunter y Villarino titulada "Methods for modulating an inflammatory response" y Wirtz y cols. "Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27" J. Exp. Med. 10.1084/jem.20060471 para una descripcion de polipeptidos de WSX-1 soluble ejemplares. Se construyen facilmente polipeptidos de WSX-1 soluble adicionales, y algunos estan disponibles comercialmente. Por ejemplo, quimeras de TCCR/WSX-1/Fc de ser humano y raton estan disponibles de R&D Systems (en Internet en www (dot) rndsystems (dot) com). Se pueden producir analogamente polipeptidos de Gp130 soluble; vease, p. ej., Jostock y cols. (2001) "Gp130 soluble is the natural inhibitor of soluble interleukin-6 receptor transsignaling responses" Eur. J. Biochem. 268:160-167 y Lin y cols. (2006) "The functional
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expression of a biologically active fragment of gp130 soluble as an ELP fusion protein in transgenic plants: purification via inverse-transition-cycling" Biochem J. 23 de mayo doi:10.1042/BJ20060544. De forma similar, polipeptidos de p28 y EBI3 adecuados incluyen, p. ej., p28 o EBI3 o una subsecuencia de los mismos. Los componentes del complejo opcionalmente estan asociados no covalentemente en el complejo, u opcionalmente estan conectados covalentemente por un reticulador qmmico o similares en el complejo.
Las protemas de fusion son otra caractenstica de la invencion. Segun esto, una clase general de realizaciones proporciona una protema de fusion de WSX-1 recombinante o aislada para el uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria, en donde la afeccion inflamatoria se selecciona de: un trastorno inmunitario; una infeccion; cancer; una alergia; artritis; asma; enteropatfa inflamatoria, enfermedad de Crohn; uveitis; psoriasis; lupus; esclerosis multiple; una enfermedad infecciosa cronica; tuberculosis; espondilitis anquilosante; rechazo de trasplantes; sarcoidosis; hepatitis. La protema de fusion incluye un polipeptido de WSX-1, que puede estar, p. ej., en el extremo N de la protema de fusion, en el extremo C de la protema de fusion, o ser interno a protema de fusion. El polipeptido de WSX-1 puede incluir el dominio extracelular, o una subsecuencia del mismo, de un WSX-1 presente en la naturaleza (p. ej., WSX-1 humano) o una variante del mismo.
En una clase de realizaciones, la protema de fusion comprende uno o mas dominios que reconocen un marcador espedfico de una celula, por ejemplo, uno o mas dominios de anticuerpo (p. ej., dominios Vh y Vl) que reconocen el marcador. El marcador espedfico para una celula puede ser esencialmente cualquier marcador espedfico para una celula, por ejemplo, un marcador para una poblacion de linfocitos, una celula T, una celula de la respuesta inmunitaria innata tal como un neutrofilo, una celula dendntica o un mastocito, o una celula cancerosa. Se conoce en la especialidad una variedad de tales marcadores para diversos tipos de celulas, y se pueden determinar mas mediante tecnica muy conocidas en la especialidad. En una clase de realizaciones, el marcador espedfico para una celula se selecciona de CD4, CD8, CD11c, CD11b y NK1.1.
En un caso, la protema de fusion comprende uno o mas dominios polipeptfdicos derivados de p28 o EBI3. La protema de fusion incluye opcionalmente dominios derivados tanto de p28 como de EBI3. El polipeptido de WSX-1 se puede enlazar al polipeptido de p28 o EBI3 a traves de un ligador. Se conocen en la especialidad muchos ligadores adecuados (p. ej., ligadores que incluyen 4-6 residuos de Gly y/o Ala) y se disenan facilmente ligadores adicionales (vease, p. ej., Crasto y Feng (2000) "LINKER: A program to generate linker sequences for fusion proteins" Protein Engineering 13:309-312).
La protema de fusion puede ser monomera, dfmera (p. ej., homodfmera o heterodfmera) o multfmera. Preferiblemente, la protema de fusion es soluble. Opcionalmente, la protema de fusion forma un complejo con p28, EBI3 o IL-27.
Esencialmente todas las caractensticas apuntadas para las realizaciones anteriores se aplican tambien a estas realizaciones, segun sea pertinente. Por ejemplo, una composicion que incluye la protema de fusion incluye opcionalmente un excipiente farmaceuticamente aceptable, una celula (p. ej., una celula T) y/o TGF-p.
Tambien se divulga en la presente una protema de fusion de p28 recombinante o aislada. La protema de fusion incluye un polipeptido de p28, que puede estar, p. ej., en el extremo N de la protema de fusion, en el extremo C de la protema de fusion, o ser interno a la protema de fusion. El polipeptido de p28 se puede derivar de una p28 presente en la naturaleza (p. ej., p28 humana) o una variante de la misma.
La protema de fusion comprende opcionalmente uno o mas dominios de anticuerpo. Por ejemplo, la protema de fusion puede incluir uno o mas dominios de anticuerpo que reconocen un marcador espedfico de una celula.
Esencialmente todas las caractensticas apuntadas para las realizaciones anteriores se aplican tambien a estas realizaciones, segun sea pertinente, por ejemplo, con respecto a marcadores espedficos de celulas, solubilidad, estado monomero, dfmero o multimero, formacion de complejos, inclusion en composiciones (p. ej., con un excipiente farmaceuticamente aceptable, una celula y/o TGF-p) y/o similares.
Sera evidente que se construyen analogamente protemas de fusion de gp130 y EBI3.
Cribado de moduladores
Los compuestos que modulan la actividad de WSX-1, p28, EBI3 y/o gp130 pueden ser utiles, por ejemplo, para tratar la inflamacion o modular de otro modo la respuesta inflamatoria. Se divulgan en la presente metodos para identificar un compuesto que se une a o modula una actividad de un polipeptido de WSX-1 soluble, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/p28, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/IL-27, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/EBI3, un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/p28, un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/IL-27 o un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/EB13. En los metodos, una muestra biologica o bioqmmica que comprende el polipeptido o complejo se pone en contacto con un compuesto de prueba. Se detecta la union del compuesto de
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prueba al polipeptido o complejo o la modulacion de la actividad del polipeptido o complejo por el compuesto de prueba, identificando de ese modo el compuesto que se une a o modula la actividad del polipeptido o complejo.
En una clase de realizaciones, el compuesto potencia la inhibicion de una respuesta de celulas T por el polipeptido o complejo, potencia la actividad antagonista contra IL-2 o IL-17, o altera la proliferacion, la supervivencia o la expresion de celulas T de IL-2, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5 o CD25 con relacion a una celula T correspondiente no tratada con el compuesto. El compuesto se une opcionalmente al receptor de IL- 27, bloquea la interaccion entre WSX-1 y gp130, potencia la interaccion entre WSX-1 y gp130, potencia la interaccion de p28 con WSX-1 o el receptor de IL-27, o similares. Compuestos ejemplares incluyen anticuerpos (p. ej., anticuerpos contra polipeptidos de WSX-1, p28, EBI3 y/o gp130), agonistas, antagonistas y moduladores de la actividad, por ejemplo, moleculas pequenas.
La muestra biologica o bioqmmica puede incluir polipeptidos o complejos aislados o recombinantes, celulas (p. ej., celulas T), muestras de tejidos y/o similares. Respuestas de celulas T tales como proliferacion, supervivencia y expresion de marcadores se pueden evaluar mediante tecnicas conocidas en la especialidad.
Anticuerpos
Se divulgan en la presente anticuerpos que se unen espedficamente a un polipeptido de WSX-1 soluble, un polipeptido de p28, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/p28 aislado o recombinante, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/EBI3 aislado o recombinante, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/IL-27 aislado o recombinante, un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/IL-27 aislado o recombinante, un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/p28 aislado o recombinante, un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/EBI3 aislado o recombinante, o una variante de los mismos. Opcionalmente, tal anticuerpo modula, p. ej., potencia, una actividad del polipeptido o complejo polipeptfdico. En un caso, el anticuerpo se une a o modula una actividad de un complejo de gp130/WSX-1/IL-27 o modula la formacion del complejo en una celula. Por ejemplo, el anticuerpo puede incrementar la semivida del complejo. Tales anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quimericos, humanizados, monocatenarios, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresion de Fab. Tales anticuerpos encuentran uso, por ejemplo, en el tratamiento de afecciones inflamatorias. Se describiran aqu metodos para generar tales anticuerpos.
El antfgeno que se va a usar para la produccion de, o el cribado con respecto a, un anticuerpo o anticuerpos puede ser, p. ej., una forma soluble de WSX-1, p28, gp130 o EBI3 o una porcion o complejo de la misma, que contiene el epttopo deseado. Alternativamente, o adicionalmente, celulas que expresan WSX-1 o gp130 en su superficie celular se pueden usar para generar, o cribar con respecto a, un anticuerpo o anticuerpos. Otras formas de polipeptidos de WSX-1, p28, gp130 o EBI3 utiles para generar anticuerpos seran evidentes para los expertos en la especialidad. Anticuerpos que facilitan la accion de IL2 e IL6 son conocidos en la especialidad; el cribado con respecto a anticuerpos que facilitan la accion de WSX-1, p28, gp130 y/o EBI3 se pueden obtener a traves de metodos similares. Vease, p. ej., Boyman y cols. (2006) "Selective Stimulation of T Cell Subsets with Antibody-Cytokine Immune Complexes" Science 311:1924-1927 y Suzuki y cols. (1994) "Antibody against interleukin-6 reduces inflammation and numbers of cysts in brains of mice with toxoplasmic encephalitis" Infect Immun. 62: 2773-2778. Por ejemplo, anticuerpos producidos contra polipeptidos (incluyendo complejos) de WSX-1, p28, gp130 y/o EBI3 se pueden ensayar con respecto a la union a los polipeptidos o complejos de los mismos o ensayar para determinar si modulan la actividad de los polipeptidos o complejos usando tecnicas conocidas en la especialidad. Un anticuerpo que se une a un complejo es opcionalmente un anticuerpo que se une a un componente polipeptfdico del complejo independientemente de si ese polipeptido es parte del complejo o no, o es opcionalmente un anticuerpo que se une espedficamente al complejo y no a ningun componente polipeptfdico del complejo (p. ej., el anticuerpo se puede unir al complejo con al menos 1.000 veces mas afinidad que se une a un componente del complejo).
Numerosos metodos para producir anticuerpos son conocidos por los expertos en la especialidad, y se pueden adaptar para producir anticuerpos espedficos para polipeptidos o complejos de la invencion. Veanse las secciones posteriores, asf como, p. ej., Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites y cols. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y la referencias citadas allf; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2a ed.) Academic Press, Nueva York, NY; Fundamental Immunology, p. ej., 4a Edicion (o posterior), W.E. Paul (ed.), Raven Press, N.Y. (1998); y Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Otras tecnicas adecuadas para la preparacion de anticuerpos incluyen la seleccion de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fagicos o similares. Veanse Huse y cols. (1989) Science 246: 1275-1281; y Ward, y cols. (1989) Nature 341: 544-546. Detalles adicionales sobre la produccion de anticuerpos y las tecnicas de manipulacion se pueden encontrar en el documento USPN 5.482.856, Borrebaeck (ed) (1995) Antibody Engineering, 2a Edicion Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty y cols. (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, Inglaterra (McCafferty), Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul), Ostberg y cols. (1983) Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, el documente USPN 4.634.664, y Engelman y cols. documento USPN 4.634.666. Anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonal y policlonales espedficos) y antisueros espedficos se uniran habitualmente con una Kd de al menos
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aproximadamente 0,1 jM, preferiblemente al menos aproximadamente 0,01 jM o mejor, y lo mas tipicamente y preferiblemente, 0,001 jM o mejor. Como se apreciara, las caractensticas de union de tal anticuerpo dependeran tipicamente de la aplicacion espedfica a la que se dedica el anticuerpo, incluyendo las caractensticas ambientales, p. ej., pH, concentracion de sal y similares. En ciertos aspectos preferidos, las condiciones ambientales tipicamente incluiran las de los sistemas biologicos, p. ej., pH entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9 (p. ej., aproximadamente 7) y niveles de sal a una fuerza ionica bioqmmicamente pertinente, p. ej., entre aproximadamente 0 mM y 100 mM.
Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales se producen preferiblemente en animales mediante multiples inyecciones subcutaneas o intraperitoneales del antigeno pertinente y un adyuvante. Puede ser util conjugar el antigeno pertinente a una protema que es inmunogenica en la especie que se va a inmunizar, p. ej., hemocianina de lapa de ojo de cerradura, albumina serica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o de derivacion, por ejemplo, ester de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugacion a traves de residuos de cistema), N- hidroxisuccinimida (a traves de residuos de lisina), glutaraldeddo, anddrido sucdnico, SOCl2 o R'N=C=NR, donde R y R' son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizaron contra el antfgeno, conjugados inmunogenicos o derivados al combinar, p. ej., 100 |jg o 5 jg de la protema o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volumenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solucion intradermicamente en multiples puntos. Un mes despues se les administra a los animales una dosis de recuerdo con de 1/5 a 1/10 de la cantidad he original de peptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyeccion subcutanea en multiples puntos. De 7 a 14 dfas mas tarde se extrae sangre de los animales y el suero se ensaya con respecto al tftulo de anticuerpo. Se les administran a los animales dosis de recuerdo hasta que el tftulo se estabiliza. Preferiblemente, se le administra al la dosis de recuerdo con el conjugado del mismo antfgeno, pero conjugado a una protema diferente y/o a traves de un reactivo de reticulacion diferente. Los conjugados tambien se pueden elaborar en cultivo celular recombinante como fusiones protemicas. Ademas, agentes de agregacion tales como alumbre se usan adecuadamente para intensificar la respuesta inmunitaria.
Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos y/o se unen al mismo epftopo excepto por posibles variantes que surgen durante la produccion del anticuerpo monoclonal, estando presentes generalmente tales variante en cantidades pequenas. Asf, el modificador "monoclonal" indica que el caracter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden elaborar usando el metodo del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler y cols., Nature, 256:495 (1975), o se pueden elaborar mediante metodos de ADN recombinante (Pat. EE. UU. N° 4.816.567).
En el metodo del hibridoma, un raton u otro animal hospedador apropiado, tal como un hamster, se inmuniza como se describe anteriormente en la presente para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran espedficamente a la protema usada para la inmunizacion. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuacion, los linfocitos se fusionan con celulas de mieloma usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las celulas de hibridoma asf preparadas se siembran y se desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluira tfpicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que evitan el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.
Celulas de mieloma preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan la produccion estable a alto nivel de anticuerpo mediante las celulas productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, lmeas celulares de mieloma preferidas son lmeas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de raton MOPC-21 y MPC-11 disponibles de the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. EE. UU. de A., y celulas SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de the American Type Culture Collection, Rockville, Md. EE. UU. de A. Tambien se han descrito lmeas celulares de mieloma humano y heteromieloma de raton-ser humano para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y cols., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
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El medio de cultivo en que se estan desarrollando celulas de hibridoma se ensaya con respecto a la produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antfgeno. Preferiblemente, la especificidad de union de anticuerpos monoclonales producidos por celulas de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorcion con enzimas ligadas (ELISA). La afinidad de union del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el analisis de Scatchard de Munson y cols., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Despues de que se identifique que las celulas de hibridoma producen anticuerpos de la especificidad, la afinidad y/o la actividad deseadas, los clones se pueden subclonar al limitar procedimientos de dilucion y desarrollar mediante metodos estandar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores asdticos en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido asdtico o suero mediante procedimientos de purificacion de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, agarosa reticulada con protema A-Sepharose®, cromatograffa en hidroxilapatito, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se afsla y somete a secuenciacion facilmente usando procedimientos convencionales (p. ej., al usar sondas oligonucleotidicas que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede introducir en vectores de expresion, que a continuacion se transfectan en celulas hospedadoras tales como celulas de E. coli, celulas COS sfmicas, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que no producen de otro modo protema inmunoglobulmica, para obtener la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas hospedadoras recombinantes. Artmulos de revision sobre la expresion recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y cols., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
Ademas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpo generadas usando tecnicas descritas en McCafferty y cols., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson y cols., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y cols., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la produccion de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) mediante barajado de cadenas (Marks y cols., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), asf como infeccion y recombinacion in vivo combinatorias como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y cols., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Asf, estas tecnicas son alternativas viables para tecnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El DNA tambien se puede modificar, por ejemplo, al sustituir la secuencia codificante por dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homologas (Pat. EE. UU. N° 4.816.567; Morrison, y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o al enlazar covalentemente a la secuencia codificante inmunoglobulmica la totalidad o parte de la secuencia codificante para un polipeptido no inmunoglobulmico.
Opcionalmente, tales polipeptidos no inmunoglobulmicos sustituyen a los dominios es de un anticuerpo o sustituyen a los dominios variables de un sitio de combinacion con antfgeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimerico que comprende un sitio de combinacion con antfgeno que tiene especificidad para un antfgeno y otro sitio de combinacion con antfgeno que tiene especificidad para un antfgeno diferente.
Anticuerpos humanizados
Se han descrito en la especialidad metodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacido introducidos en el desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoacido no humanos se denominan a menudo residuos "importados", que se toman tfpicamente de un dominio variable "importado". La humanizacion se puede realizar esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones y cols., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y cols., Nature, 332:323327 (1988); Verhoeyen y cols., Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano por secuencias de la region hipervariable. Segun esto, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (Pat. de EE. UU. N° 4.816.567) en los que menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente procedentes de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son tfpicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la region hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR estan sustituidos por residuos procedentes de sitios analogos en anticuerpos de roedor.
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La eleccion de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se van a usar para elaborar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Segun el llamado metodo de "ajuste optimo", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que esta mas cerca a la del roedor se acepta entonces como la region de marco (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims y cols., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia y cols., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro metodo usa una region de marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas. El mismo marco se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y cols., J. Immunol., 151:2623(1993)).
Tambien es importante que los anticuerpos se humanicen con retencion de alta afinidad para el antigeno y otras propiedades biologicas favorables. Para alcanzar este objetivo, segun un metodo preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Estan disponibles comunmente modelos tridimensionales de inmunoglobulinas y son familiares para los expertos en la especialidad. Estan disponibles programas informaticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de posibles secuencias inmunoglobulmicas seleccionadas. La inspeccion de estas presentaciones permite el analisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la posible secuencia inmunoglobulmica, es decir, el analisis de residuos que influyen en la capacidad de la posible inmunoglobulina para unirse a su antfgeno. De este modo, residuos de fR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras e importadas de modo que se alcance la caractenstica deseada del anticuerpo, tal como afinidad incrementada para el antfgeno o los antfgenos diana. En general, los residuos de la region hipervariable estan directamente y lo mas sustancialmente implicados en influir en la union al antfgeno.
Anticuerpos humanos
Como una alternativa a la humanizacion, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgenicos (p. ej., ratones) que son capaces, al ser inmunizados, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulinas endogenas. Por ejemplo, se ha descrito que la supresion homocigotica del gen de la region de enlace a cadena pesada del anticuerpo (Jh) en ratones mutantes quimericos y de la lmea germinal da como resultado la inhibicion completa de la produccion de anticuerpos endogenos. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de la lmea germinal humanos en tales ratones mutantes de la lmea germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos al excitar al antfgeno. Veanse, p. ej., Jakobovits y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y cols., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y cols., Year in Immuno., 7:33 (1993); y las Pat. EE. UU. N° 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807.
Alternativamente, la tecnologfa de despliegue en fagos (McCafferty y cols., Nature 348:552-553 (1990)) se puede usar para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpo humanos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominios variables (V) inmunoglobulmicos procedentes de donantes no inmunizados. Segun esta tecnica, los genes de dominios V de anticuerpo se clonan en el marco en un gen de protema de revestimiento bien principal o bien secundario de un bacteriofago filamentoso, tal como M13 o fd, y se despliegan como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partmula de fago. Debido a que la partmula filamentosa contiene una sola copia de ADN de una sola hebra del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo tambien dan como resultado la seleccion del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Asf, el fago imita algunas de las propiedades de la celula B. El despliegue en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revision, veanse, p. ej., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de genes V se pueden usar para el despliegue en fagos. Clackson y cols., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una serie diversa de anticuerpos antioxazolona de una pequena biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V procedentes de donantes humanos no inmunizados y los anticuerpos para una serie diversa de antfgenos (incluyendo autoantfgenos) se pueden aislar siguiendo esencialmente las tecnicas descritas por Marks y cols., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith y cols., EMBO J. 12:725-734 (1993). Veanse, ademas, las Pat. EE. UU. N° 5.565.332 y 5.573.905.
Tambien se pueden generar anticuerpos humanos mediante celulas B activadas in vitro (veanse las Pat. EE. UU. N° 5.567.610 y 5.229.275).
Fragmentos de anticuerpo
Se han desarrollados diversas tecnica para la produccion de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban a traves de la digestion proteolftica de anticuerpos intactos (vease, p. ej., Morimoto y cols., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y cols., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente mediante celulas hospedadoras recombinantes.
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Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. Alternativamente, se pueden recuperar directamente fragmented Fab'-SH de E. coli acoplarse qmmicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y cols., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Segun otro enfoque, se pueden aislar directamente fragmentos F(ab')2 de un cultivo de celulas hospedadoras recombinantes. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpo seran evidentes para el experto. Alternativamente, el anticuerpo de eleccion es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Vease el documento Wo 1993/16185 y las Pat. EE. UU. N° 5.571.894 y 5.587.458. El fragmento de anticuerpo tambien puede ser un "anticuerpo lineal", p. ej., como el descrito en la Pat. EE. UU. N° 5.641.870. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespedficos o biespedficos.
Anticuerpos biespedficos
Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos que tienen especificidades de union para al menos dos epftopos diferentes. Anticuerpos biespedficos ejemplares se pueden unir a dos epftopos diferentes del antfgeno de WSX-1, p28, gp130 o EBI3. Otros anticuerpos se pueden unir a uno de WSX-1, p28, gp130 o EBI3 y ademas unirse a otro de WSX-1, p28, gp130 o EBI3 o un marcador de la superficie de celulas T. Los anticuerpos biespedficos tambien se pueden usar para localizar farmacos o agentes citotoxicos en una celula que comprende el antfgeno; estos anticuerpos poseen un brazo de union a WSX-1, p28, gp130 o EBI3 y un brazo que se une al farmaco o agente citotoxico. Los anticuerpos biespedficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (p. ej. antecuerpos biespedficos F(ab')2).
Se conocen en la especialidad metodos para elaborar anticuerpos biespedficos. La produccion tradicional de anticuerpos biespedficos de longitud completa se basa en la coexpresion de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y cols., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas de anticuerpo mixture diferentes, de las cuales una tiene la estructura biespedfica correcta. La purificacion de la molecula correcta, que habitualmente se realiza mediante etapas de cromatograffa de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se divulgan en el documento WO 1993/08829 y en Traunecker y cols., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Segun un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion de anticuerpo-antfgeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera region constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la union a la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. ADN que codifican las fusiones de cadena pesad de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertaron en vectores de expresion separados, y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptfdicos en realizaciones cuando relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptfdicas usadas en la construccion proporcionan los rendimientos optimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptfdicas en un vector de expresion cuando la expresion de al menos dos cadenas polipeptfdicas en relaciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no son particularmente significativas.
En una realizacion preferida de este enfoque, los anticuerpos biespedficos estan compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina hterida con una primera especificidad de union en un brazo y un par de cadena pesada- cadena ligera de inmunoglobulina hterido (que proporciona una segunda especificidad de union) en el otro brazo. Se encontro que esta estructura asimetrica facilita la separacion del compuesto biespedfico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molecula biespedfica proporciona un modo de separacion facil. Este enfoque se divulga en el documento WO 1994/04690. Para detalles adicionales de la generacion de anticuerpos biespedficos, vease, por ejemplo, Suresh y cols., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
Segun otro enfoque descrito en la Pat. EE. UU. N° 5.731.168, la interfase entre un par de moleculas de anticuerpo se puede manipular para maximizar el porcentaje de heterodfmeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio Ch3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, uno o mas cadenas laterales de aminoacido pequenas procedentes de la interfase de la primera molecula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mayores (p. ej. tirosina o triptofano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamano identico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes sobre la interfase de la segunda molecula de anticuerpo al reemplazar cadenas laterales de aminoacido grandes por unas mas pequenas (p. ej. alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodfmero sobre otros productos finales no deseados tales como homodfmeros.
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Anticuerpos biespedficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede estar acoplado a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir celulas del sistema inmunitario a celulas no deseadas (Pat. EE. UU. N° 4,676,980) y para el tratamiento de la infeccion por VIH (documentos WO 1991/00360, WO 1992/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar usando cualesquiera metodos de reticulacion convenientes. Agentes de reticulacion adecuados son muy conocidos en la especialidad y se divulgan, por ejemplo, en la Pat. EE. UU. N° 4.676.980, junto con un numero de tecnicas de reticulacion.
Tambien se han descrito en la bibliograffa tecnicas para generar anticuerpos biespedficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespedficos usando ligacion qmmica. Brennan y cols., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se segmentan proteoltticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito sodico para estabilizar ditioles vecinos y prevenir la formacion de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuacion en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'- TNB se convierte a continuacion en el Fab'-tiol mediante reduccion con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespedfico. Los anticuerpos biespedficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.
Tambien se han descritos diversas tecnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpo biespedfico directamente de un cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespedficos usando cremalleras de leucina. Kostelny y cols., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los peptidos de cremallera de leucina procedentes de las protemas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusion genica. Los homodfmeros de anticuerpo se redujeron en la region de bisagra para formar monomeros y a continuacion se reoxidaron para formar los heterodfmeros de anticuerpo. Este metodo tambien se puede utilizar para la produccion de homodfmeros de anticuerpo. La tecnologfa de los "diacuerpos" descrita por Hollinger y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo biespedfico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) por un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Segun esto, los dominios Vh y Vl de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de union a antfgeno. Tambien se ha presentado otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespedfico mediante el uso de dfmeros de Fv monocatenario (sFv). Vease Gruber y cols., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpo triespedficos. Tutt y cols. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Sera evidente que ciertas protemas de fusion, p. ej., ciertas protemas de fusion de WSX-1 o p28, se pueden preparar usando tecnicas analogas a aquellas para la produccion de anticuerpos biespedficos. Una protema de fusion de WSX-1 o p28 basada en un anticuerpo biespedfico puede poseer un brazo que se une a un marcador espedfico de una celula (p. ej., CD4, CD8, CD11c, CD11b y NK1.1) y un brazo en el que los dominios de union a antfgeno se reemplazan por un polipeptido de WSX-1 o p28.
Conjugados y otras modificaciones del anticuerpo
El anticuerpo usado en los metodos o incluidos en los artmulos de fabricacion en la presente esta opcionalmente conjugado a un farmaco, p. ej., segun se describe en el documento WO 2004/032828 y la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. 2006/0024295. Los anticuerpos divulgados en la presente tambien se pueden conjugar con una enzima activadora de profarmaco que convierte un profarmaco (p. ej. un agente quimioterapeutico peptidflico, vease el documento WO 1981/01145) en un farmaco anticanceroso u otro activo. Veanse, por ejemplo, el documento WO 1988/07378, la Pat. EE. UU. N° 4.975.278 y la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. 2006/0024295.
Se contemplan en la presente otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede ligar a uno de una variedad de polfmeros no protefnicos, p. ej., polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolfmeros de polietilenglicol y polipropilenglicol.
Los anticuerpos divulgados en la presente tambien se pueden formular como liposomas. Liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante metodos conocidos en la especialidad, tales como los descritos en Epstein y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); las Pat. EE. UU. N° 4.485.045 y 4.544.545; y el documento WO 1997/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Liposomas con tiempo en circulacion intensificado se divulgan en la Pat. EE. UU. N° 5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente utiles mediante el metodo de evaporacion en fase inversa con una composicion lipfdica que comprende fosfatidilcolina, colesterol fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a traves de filtros de tamano de poro definido para dar liposomas con el diametro
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deseado. Fragmentos Fab' de un anticuerpo divulgado en la presente se pueden conjugar a los liposomas segun se describe en Martin y cols. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) a traves de una reaccion de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapeutico esta contenido opcionalmente dentro del liposoma. Vease Gabizon y cols. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989).
Se contemplan una modificacion o modificaciones de la secuencia de aminoacidos de los anticuerpos protemicos o peptidicos. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del anticuerpo. Se preparan variantes de la secuencia de aminoacidos del anticuerpo al introducir cambios de nucleotidos apropiados en el acido nucleico del anticuerpo, o mediante smtesis de peptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoacidos del anticuerpo. Cualquier combinacion de supresion, insercion y sustitucion se realiza para llegar a la construccion final, con tal de que la construccion final posea las caractensticas deseadas. Los cambios de aminoacidos tambien pueden procedimientos postraduccionales del anticuerpo, tales como un cambio del numero o la posicion de sitios de glicosilacion.
Un metodo util para la identificacion de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferidas para mutagenesis se denomina "mutagenesis de barrido de alanina" segun se describe por Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqm, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (p. ej., residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplaza por un aminoacido neutro o cargado negativamente (lo mas preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interaccion de los aminoacidos con el antfgeno. Las localizaciones de aminoacidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuacion al introducir variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitucion. Asf, aunque el sitio para introducir una variacion de la secuencia de aminoacidos esta predeterminado, la naturaleza de la mutacion de por sf no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutacion en un sitio dado, se efectua mutagenesis de barrido de alanina o aleatoria en el codon o la region diana y las variantes del anticuerpo expresadas se criban con respecto a la actividad deseada.
Inserciones en la secuencia de aminoacidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que vanan en longitud de un residuo a polipeptidos que contienen cien o mas residuos, asf como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoacido individuales o multiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal o al anticuerpo fusionado a un polipeptido citotoxico. Otras variantes de insercion de la molecula de anticuerpo incluyen la fusion al extremo N o C del anticuerpo de una enzima, o un polipeptido que incrementa la semivida serica del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante de sustitucion de aminoacidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoacido en la molecula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interes para la mutagenesis de sustitucion de anticuerpos incluyen las regiones hipervariables, pero tambien se contemplan alteraciones de FR. Tales sustituciones pueden ser conservativas o no conservativas.
Cualquier residuo de cistema no implicado en mantener la conformacion apropiada del anticuerpo tambien se puede sustituir, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molecula y prevenir la reticulacion aberrante. A la inversa, se pueden anadir un enlace o enlaces de cistema al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).
Un tipo de variante de sustitucion implicar sustituir uno o mas residuos de la region hipervariable de un anticuerpo original. Generalmente, la variante o variantes resultantes seleccionadas para una investigacion adicional tendran propiedades biologicas mejoradas con relacion al anticuerpo original a partir del que se generan. Un modo conveniente de generar tales variantes de sustitucion es la maduracion por afinidad usando despliegue de fagos. Brevemente, varios sitios de la region hipervariable (p. ej. 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoacido en cada sitio. Los fragmentos de anticuerpo asf generados se despliegan en de un modo monovalente a partir de partteulas de fago filamentosas como fusiones con el producto genico III de M 13 empaquetado dentro de cada partteula. Las variantes con fagos desplegados se criban a continuacion con respecto a su actividad biologica (p. ej. afinidad de union) segun se divulga en la presente. A fin de identificar posibles sitios de la region hipervariable para la modificacion, se puede realizar mutagenesis de barrido de alanina para identificar residuos de la region hipervariable que contribuyen significativamente a la union al antfgeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antfgeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antfgeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitucion segun las tecnicas elaboradas en la presente. Una vez que se generan tales variantes, el conjunto de variantes se somete a cribado segun se describe en la presente y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o mas ensayos pertinentes se pueden seleccionar para una investigacion adicional.
Otro tipo de variante de aminoacido del anticuerpo altera el patron de glicosilacion original del anticuerpo. Tal alteracion incluye suprimir uno o mas restos de carbohidrato del anticuerpo, y/o anadir uno o mas sitios de glicosilacion que no estan presentes en el anticuerpo.
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La glicosilacion de polipeptidos tipicamente esta ligada a No ligada a O. Ligada a N se refiere al enlace del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptidicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoacido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para el enlace enzimatico del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Asf, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptfdicas en un polipeptido crea un sitio de glicosilacion potencial. La glicosilacion ligada a O se refiere al enlace de uno de los azucares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoacido, lo mas comunmente serina o treonina, aunque tambien se puede usar 5-hidroxiprolina o 5- hidroxilisina.
La adicion de sitios de glicosilacion al anticuerpo se efectua convenientemente al alterar la secuencia de aminoacidos de modo que contenga una o mas de las secuencias tripeptfdicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilacion ligados a N). La alteracion tambien se puede realizar mediante la adicion de, o la sustitucion por, uno o mas residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilacion ligados a O).
Cuando el anticuerpo comprende una region Fc, el carbohidrato enlazado al mismo se puede alterar o retirar. Por ejemplo, en una variante de glicosilacion de la presente, se introducen una o mas sustituciones de aminoacido en una region Fc de un anticuerpo para eliminar uno o mas sitios de glicosilacion. Tal anticuerpo aglicosilado puede tener una funcion efectora reducida, p. ej., en comparacion con IgG1 humana, de modo que se disminuye su capacidad para inducir la activacion del complemento y/o la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos , y el anticuerpo aglicosilado puede tener union reducida (o nula) al receptor de Fc.
Para ciertos anticuerpos, p. ej., anticuerpos agotadores, puede ser deseable la modificacion del anticuerpo para intensificar la ADCC y/o CDC del anticuerpo. Por ejemplo, anticuerpos con una estructura de carbohidrato madura que carecen de fucosa enlazada a una region Fc del anticuerpo se describen en el documento 2003/0157108 de EE. UU. (Presta, L.). Vease ademas el documento 2004/0093621 de EE. UU. (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GlcNAc) bisectante en el carbohidrato enlazado a una region Fc del anticuerpo se mencionan en el documento WO 2003/011878, Jean-Mairet y cols. y la Pat. EE. UU. N° 6.602.684, Umana y cols. Anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacarido enlazado a una region Fc del anticuerpo se presentan en el documento WO 1997/30087, Patel y cols. Veanse, ademas, los documentos WO 1998/58964 (Raju, S.) y WO 1999/22764 (Raju, S.) que tratan de anticuerpos con carbohidrato alterado enlazado a la region Fc del mismo.
Asf, una variante de glicosilacion comprende opcionalmente una region Fc, en donde una estructura de carbohidrato enlazada a la region Fc carece de fucosa. Tales variantes tienen funcion de ADCC mejorada. Opcionalmente, la region Fc comprende ademas una o mas sustituciones de aminoacido en la misma que mejoran adicionalmente la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la region Fc (numeracion Eu de residuos). Ejemplos de publicaciones relacionadas con anticuerpos "desfucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: los documentos 2003/0157108 de EE. UU.; WO 2000/61739; WO 2001/29246; 2003/0115614 de EE. UU.; 2002/0164328 de EE. UU.; 2004/0093621 de EE. UU.; 2004/0132140 de EE. UU.; 2004/0110704 de EE. UU.; 2004/0110282 de EE. UU.; 2004/0109865 de EE. UU.; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; Okazaki y cols. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); y Yamane-Ohnuki y cols. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos lmeas celulares que producen anticuerpos desfucosilados incluyen celulas Lec13 CHO deficientes en fucosilacion de protema (Ripka y cols. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); documento 2003/0157108 de EE. UU., Presta, L; y documento WO 2004/056312, Adams y cols., especialmente en el Ejemplo 11), y lmeas celulares inactivadas, tales como celulas CHO con inactivacion de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, (Yamane- Ohnuki y cols. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).
La modificacion del anticuerpo con respecto a una funcion efectora, p. ej. a fin de intensificar la ADCC y/o CDC del anticuerpo, se puede alcanzar al introducir una o mas sustituciones de aminoacido en una region Fc de un anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, se puede introducir un residuo o residuos de cistema en la region Fc, permitiendo de ese modo la formacion de enlaces disulfuro intercatenarios en esta region. El anticuerpo homodfmero asf generado puede tener una capacidad de internalizacion mejorada y/o una destruccion celular mediada por el complemento y una ADCC incrementadas. Veanse Caron y cols., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol 148:2918-2922 (1992). Tambien se pueden preparar anticuerpos homodfmeros con actividad antitumoral intensificada usando reticuladores heterobifuncionales como los descritos en Wolff y cols. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede manipular un anticuerpo que tenga regiones Fc dobles y de ese modo puede tener capacidades de lisis del complemento y ADCC intensificadas. Vease Stevenson y cols. AntiCancer Drug Design 3:219-230 (1989). El documento WO 2000/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con funcion de ADCC mejorada en presencia de celulas efectoras humanas, donde los anticuerpos comprenden sustituciones de aminoacido en la region Fc del mismo. Preferiblemente, el anticuerpo con ADCC mejorada comprende sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la region Fc. Preferiblemente, la region Fc alterada es una region Fc de IgG1 Fc humana que comprende o que consiste en sustituciones en uno, dos o tres de estas posiciones.
Anticuerpos con union a C1q y/o CDC alteradas se describen en el documento WO 1999/51642 y las Pat. de EE. UU. N° 6.194.551, 6.242.195, 6.528.624 y 6.538.124 (Idusogie y cols.). Los anticuerpos comprenden una sustitucion
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de aminoacido en una o mas de las posiciones de aminoacido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de la region Fc del mismo.
Para incrementar la semivida serica del anticuerpo, se puede incorporar un epftopo de union al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) segun se describe en la Pat. EE. UU. N° 5.739.277, por ejemplo. Segun se usa en la presente, el termino epftopo de union al receptor de rescate se refiere a un epftopo de la region Fc de una molecula de IgG (p. ej., IgGi, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de incrementar la semivida serica in vivo de la molecula de IgG. Anticuerpos con sustituciones en una region Fc de los mismos y semividas sericas incrementadas tambien se describen en el documento WO 2000/42072 (Presta, L.).
Cualquiera de los anticuerpos no agotadores (u otros) divulgados en la presente puede comprender al menos una sustitucion en la region Fc que mejore la union a FcRn o la semivida serica. Por ejemplo, se divulga ademas en la presente un anticuerpo que comprende una region Fc variante con afinidad de union alterada al receptor de Fc neonatal (FcRn). FcRn es estructuralmente similar al complejo principal de histocompatibidad (MHC) y consiste en una cadena a unida no covalentemente a p2-microglobulina. Las multiples funciones del receptor de Fc neonatal se revisan en Ghetie y Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18:39-766. El FcRn representa un papel en el aporte pasivo de inmunoglobulina IgG de madre a hijo y la regulacion de niveles sericos de IgG. FcRn actua como un receptor de rescate, que se une a y transporta IgG pinocitosadas en forma intacta tanto dentro de como a traves de las celulas, y que las rescata de un ruta degradativa por defecto. Aunque los mecanismos responsables de salvar IgG todavfa no estan claros, se cree que las IgG no unidas se dirigen hacia la proteolisis en los lisosomas, mientras que las IgG unidas se reciclan hacia la superficie de las celulas y se liberan. Este control tiene lugar dentro de las celulas the endoteliales situadas en todos los tejidos adultos. FcRn es expresa al menos en el hugado, la glandula mamaria y el intestino adulto. FcRn se une a IgG; la interaccion FcRn-IgG se ha estudiado ampliamente y parece implicar a residuos en la interfase de los dominios CH2, CH3 de la region Fc de IgG. Estos residuos interactuan con residuos principalmente situados en el dominio a2 de FcRn.
Un anticuerpo variante no agotador segun se divulga en la presente puede desplegar una union incrementada a FcRn y comprender una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 de la region Fc, en donde la numeracion de los residuos en la region Fc es la del mdice EU como en Kabat. Veanse, p. ej., la Patente de EE. UU. 6.737.056; y Shields y cols., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001). Opcionalmente, tal anticuerpo comprende una region Fc de IgG variante que comprende al menos una sustitucion de aminoacido en Asn 434 hasta His (N434H). Opcionalmente, tal anticuerpo comprende una region Fc de IgG variante que comprende al menos una sustitucion de al menos un aminoacido en Asn 434 hasta Ala (N434A). Tfpicamente, estas variantes comprenden una afinidad de union superior para FcRN que polipeptidos que tienen la region Fc de la secuencia natural/secuencia silvestre. Este polipeptido y los anticuerpos variantes de Fc tienen la ventaja de ser salvados y reciclados en vez de degradados. Estos anticuerpos no degradantes se pueden usar en los metodos proporcionados en la presente.
Tambien se contemplan anticuerpos manipulados con tres o mas (preferiblemente cuatro) sitios de union a antfgeno funcionales (documento US 2002/0004587 A1, Miller y cols.).
Moleculas de acido nucleico que codifican variantes de la secuencia de aminoacidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de metodos conocidos en la especialidad. Estos metodos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de la secuencia de aminoacidos presentes en la naturaleza) o la preparacion mediante mutagenesis mediada por oligonucleotidos (o dirigida al sitio), mutagenesis por PCR y mutagenesis por insercion de casete de una variante o una version no variante previamente preparada del anticuerpo.
Tratamiento de la inflamacion
Un aspecto de la invencion proporciona composiciones para el uso en metodos de tratamiento de una afeccion inflamatoria en un sujeto mairnfero, p. ej., un ser humano. La afeccion inflamatoria que se va a tratar se selecciona de: un trastorno inmunitario, una infeccion, cancer, una alergia, artritis, asma, enteropatfa inflamatoria, enfermedad de Crohn, uveitis, psoriasis, lupus, esclerosis multiple, una enfermedad infecciosa cronica, tuberculosis, espondilitis anquilosante, rechazo de trasplantes, sarcoidosis y hepatitis. Opcionalmente, la afeccion esta mediada por celulas T; por ejemplo, la afeccion puede estar mediada por celulas Th1, celulas Th2, celulas T17, celulas Th-17, celulas T CD4+, celulas T CD8+, celulas T gamma/delta, celulas T asesinas naturales y/o celulas T reguladoras. Afecciones inflamatorias ejemplares que se van a tratar incluyen, pero no se limitan a, un trastorno inmunitario (p. ej., una enfermedad autoinmunitaria); una infeccion; cancer, tal como mieloma multiple y leucemias mielogena y otra, asf como metastasis tumoral; una alergia; artritis; asma; enteropatfa inflamatoria, tal como colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn; uveitis; psoriasis; lupus; esclerosis multiple; una enfermedad infecciosa cronica; tuberculosis; espondilitis anquilosante; rechazo de trasplantes; sarcoidosis; hepatitis; inflamacion del sistema nervioso central; smdrome de inmunodeficiencia adquirida; pancreatitis aguda; enfermedad de Addison; lesion hepatica inducida por alcohol incluyendo cirrosis alcoholica; enfermedad de Alzheimer; esclerosis lateral amiotrofica; asma y otras
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enfermedades pulmonares; aterosclerosis; vasculitis autoinmunitaria; lesion hepatica inducida por hepatitis autoinmunitaria; cirrosis biliar; caquexia/anorexia, incluyendo caquexia inducida por sida; smdrome de fatiga cronica; una dolencia asociada a Clostridium, incluyendo diarrea asociada a Clostridium; afecciones e indicaciones coronarias, incluyendo insuficiencia cardfaca congestiva, reestenosis coronaria, infarto de miocardio, disfuncion de miocardio e injerto de derivacion de la arteria coronaria; diabetes, incluyendo diabetes mellitus tipo 1 de comienzo juvenil y resistencia a insulina; endometriosis, endometritis y afecciones relacionadas; epididimitis; resistencia a eritropoyetina; fiebre; fibromialgia o analgesia; glomerulonefritis; enfermedad del injerto contra el hospedador/rechazo de trasplantes; enfermedad de Graves; smdrome de Guillain-Barre; enfermedad de Hashimoto; anemia hemolftica; choque hemorragico; hiperalgesia; afecciones inflamatorias de una articulacion y enfermedades reumaticas incluyendo osteoartritis, artritis reumatoide, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, smdrome de Reiter y artritis reactiva, enfermedad de Still, artritis psoriasica, artritis enteropatica, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistemica, vasculitis (p. ej., enfermedad de Kawasaki), vasculitis cerebral, enfermedad de Lyme, artritis inducida por estafilococos, smdrome de Sjogren, fiebre reumatica, policondritis y polimialgia reumatica y arteritis de celulas gigantes; una enfermedad ocular inflamatoria, que puede estar asociada con, por ejemplo, trasplante corneal; enteropatfa inflamatoria; isquemia, incluyendo isquemia cerebral; enfermedad de Kawasaki; deterioro del aprendizaje; enfermedades pulmonares; nefritis por lupus; esclerosis multiple; miastenia grave; miopatfas; enfermedades neuroinflamatorias; neurotoxicidad; enfermedades y afecciones oculares, incluyendo degeneracion ocular y uveitis; osteoporosis; dolor, incluyendo dolor relacionado con cancer; enfermedad de Parkinson; penfigo; enfermedad periodontal; pitiriasis roja pilosa; parto prematuro; prostatitis y afecciones relacionadas; psoriasis y afecciones relacionadas; artritis psoriasica; fibrosis pulmonar; lesion por reperfusion; fiebre reumatica; artritis reumatoide; sarcoidosis; escleroderma; choque septico; efectos secundarios de la radioterapia; smdrome de Sjogren; trastornos del sueno; espondiloartropatfas; lupus eritematoso sistemico; enfermedad de la articulacion mandibular temporal; tiroiditis; trasplante de tejido o una afeccion inflamatoria resultante de distension muscular, esquince, dano del cartflago, traumatismo y cirugfa ortopedica; vasculitis; o una afeccion inflamatoria resultante de distension muscular, esguince, dano del cartflago, traumatismo, cirugfa ortopedica, infeccion u otros procesos de enfermedad.
En una clase, los metodos incluyen administrar al sujeto un resto aislado o recombinante seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido de WSX-1 soluble, un polipeptido de p28, un polipeptido de gp130 soluble, un polipeptido de EBI3, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/p28, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/EBl3, un complejo polipeptfdico de WSX-1 soluble/IL-27, un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/IL-27, un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/p28, un complejo polipeptfdico de gp130 soluble/EBI3, un polipeptido de p28 y un polipeptido de WSX-1 soluble, un polipeptido de EBI3 y un polipeptido de WSX-1 soluble, IL-27 y un polipeptido de WSX-1 soluble, un polipeptido de gp130 soluble y un polipeptido de p28, un polipeptido de gp130 soluble e IL-27, un polipeptido de gp13o soluble y un polipeptido de EBI3, y una variante de los mismos. En casos en los que se administra una combinacion de polipeptidos recombinantes o aislados (p. ej., un polipeptido de 28 y un polipeptido de WSX-1 soluble), los polipeptidos pueden pero no necesitan formar un complejo, y los polipeptidos se pueden coadministrar o administrar separadamente.
En otra clase de realizaciones, los metodos incluyen administrar al sujeto un resto que se une a o modula espedficamente la actividad de un complejo de gp130/WSX-1/IL-27, o que modula la formacion de complejo en una celula (p. ej., en la membrana plasmatica), tratando se ese modo la afeccion del sujeto. El resto puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un antagonista, un agonista y un modulador de la actividad. Opcionalmente, el resto potencia la formacion o la actividad de un complejo de gp130/WSX-1/IL-27.
En cualquier clase de realizaciones, los metodos incluyen opcionalmente diagnosticar al paciente con la afeccion inflamatoria antes de dicha administracion. Tfpicamente, se administra al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz del resto. Opcionalmente, se verifica la respuesta al tratamiento del sujeto. En una clase de realizaciones, despues del inicio del tratamiento el sujeto presenta una disminucion de la inflamacion, por ejemplo, numeros reducidos de celulas inflamatorias, una reduccion en el numero de celulas T IL17+ en circulacion o en la zona de inflacion y/o una disminucion de la expresion de IL17.
Sera evidente que se pueden formar complejos pertinentes opcionalmente in vivo. Por ejemplo, en realizaciones en las que se administra un polipeptido, el polipeptido puede formar un complejo activo con una protema o protemas endogenas. Como un ejemplo, cuando se administra al sujeto un polipeptido de WSX-1 soluble (p. ej., una protema de fusion de WSX-1Fc), el WSX-1 puede formar un complejo con p28 y/o IL-27 endogenas, conduciendo a resultados terapeuticos. Un polipeptido que se va a administrar es opcionalmente una variante que tiene una afinidad superior para los componentes del receptor, p. ej., que la protema silvestre (p. ej., una p28 variante que tiene una afinidad superior para WSX-1 o el complejo receptor de WSX-1/gp130 que una p28 disponible en la naturaleza correspondiente de la que se deriva la variante, o un WSX-1 soluble variante que tiene una afinidad incrementada para gp130).
En un aspecto, los metodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una combinacion del resto y al menos un segundo compuesto. El segundo compuesto es tfpicamente uno que se usa para tratar la afeccion inflamatoria, por ejemplo, un patron de cuidado o tratamiento experimental. Segundos compuestos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, moduladores inmunitarios que afectan a IL-23, IL-12, IL-6 o TGF (p. ej.,
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anticuerpos espedficos para p40 de IL-12, p35 o p19 de IL-23); anticuerpos o reactivos que antagonizan las funciones de IL-1 (p. ej., anakinra (Kineret®), receptor de IL-1 soluble) y TNF (p. ej., anticuerpos anti-TNF, etanercept, infliximab y leflunomida); un agente citotoxico; un agente inmunosupresor (p. ej., ciclofosfamida); un antagonista de marcador superficial de celulas B; un anticuerpo para un marcador superficial de celulas B; un anticuerpo para CD20, p. ej., Rituximab, vease el documento US 20060051345); un anticuerpo o un agente de bloqueo para CD5, CD28 o CD40; un corticosteroide (p. ej., prednisona), CTLA4-Ig, un anticuerpo o antagonista para alfa4-integrina tal como natalizumab (Tysabri®), micofenolato de mofetilo, una estatina, un anticuerpo o agente de bloqueo para LFA-1 o CD-11a (vease la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. 20050281817 de Jardieu y cols. titulada "Method for treating multiple sclerosis"), un anticuerpo para interleucina-12, un interferon beta (p. ej., un interferon p-1a tal como Avonex® o Rebif®, o un interferon p-1b tal como Betaseron®), acetato de glatiramer (Copaxone®), un anticuerpo para CD52 tal como alemtuzumab (CamPath®), un anticuerpo para receptor de interleucina tal como daclizumab (Zenapax®, un anticuerpo para la subunidad alfa del receptor de interleucina-2), etc. En una clase de realizaciones, el segundo compuesto es factor de crecimiento transformante beta (TGF-p).
En una realizacion, el sujeto nunca se ha tratado previamente con un farmaco o farmacos para tratar la afeccion inflamatoria y/o nunca se ha tratado previamente con un resto de la invencion. En otra realizacion, el sujeto se ha tratado previamente con un farmaco o farmacos para tratar la afeccion inflamatoria y/o se ha tratado previamente con tal resto.
Tfpicamente, el sujeto el elegible para el tratamiento de la afeccion inflamatoria, es decir, un sujeto elegible. Para los propositos de la presente, tal sujeto elegible es uno que esta experimentando, ha experimentado o es probable que experimente uno o mas signos, smtomas u otros indicadores de la afeccion inflamatoria; ha sido diagnosticado con la afeccion inflamatoria, ya sea, por ejemplo, recientemente diagnosticado, previamente diagnosticado con una nueva recidiva o exacerbacion, previamente diagnosticado y en remision, etc.; y/o tiene riesgo de desarrollar la afeccion inflamatoria.
Administracion
Como se entendera por los expertos normales en la especialidad, las dosis apropiadas de restos de la invencion (p. ej., polipeptidos, complejos, etc.) generalmente estara alrededor de las ya empleadas en terapias clmicas en las que se administran restos similares solos o en combinacion con otros agentes terapeuticos. Probablemente, se producira una variacion en la dosificacion dependiendo de la afeccion que se trate. El medico que administra el tratamiento sera capaz de determinar la dosis apropiada para el sujeto individual. La preparacion y los esquemas de dosificacion para segundos compuestos disponibles comercialmente administrados en combinacion con los restos se pueden usar segun las instrucciones de los fabricantes o pueden ser determinados empmcamente por el profesional experto.
Para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad, la dosificacion apropiada del resto y cualquier segundo compuesto administrado en combinacion con el resto dependera del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, segun se define anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, ya se administre el resto o la combinacion con propositos preventivos o terapeuticos, terapia previa, los antecedentes del paciente y la respuesta al anticuerpo o la combinacion, y el criterio del medico responsable. El resto o la combinacion se administra adecuadamente al paciente en un momento o mas tfpicamente a lo largo de una serie de tratamientos.
Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 pg/kg a 50 mg/kg (p. ej. 0,1-20 mg/kg) del resto es una posible dosificacion inicial para la administracion al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o mas administraciones separadas, o mediante infusion continua. Una dosificacion diaria tfpica podna variar de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios dfas o mas, dependiendo de la afeccion, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresion deseada de los smtomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser utiles otros regfmenes de dosificacion. Tfpicamente, el profesional clmico administrara un resto de la invencion (solo o en combinacion con un segundo compuesto) hasta que se alcancen una dosificacion o dosificaciones que proporcionen el efecto biologico deseado. El avance de la terapia de la invencion se verifica facilmente mediante tecnicas y ensayos convencionales.
El resto se puede administrar mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la administracion parenteral, topica, subcutanea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal y/o intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administracion intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutanea. Tambien se contempla la administracion intratecal (vease, p. ej., la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. 2002/0009444 de Grillo- Lopez). Ademas el resto se puede administrar adecuadamente mediante infusion pulsatil, p. ej., con dosis decrecientes del resto. Opcionalmente, la dosificacion se aporta intravenosamente o subcutaneamente y opcionalmente mediante infusion o infusiones intravenosas. Cada una de las exposiciones se puede proporcionar usando medios de administracion iguales o diferentes. En una realizacion, cada una de las exposiciones es mediante administracion intravenosa.
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Segun se apunta, el resto se puede administrar solo o en combinacion con al menos un segundo compuesto. Estos segundos compuestos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con vfas de administracion como las usadas hasta ahora, o aproximadamente de 1 a 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora. Si se usan estos segundos compuestos, opcionalmente se usan en cantidades menores que si no estuviera presente el resto, a fin de eliminar o reducir efectos secundarios provocados por los mismos.
La administracion del resto de la invencion y cualquier segundo compuesto se puede realizar simultaneamente, p. ej., como una sola composicion o como dos o mas composiciones distintas usando vfas de administracion iguales o diferentes. Alternativamente, o adicionalmente, la administracion se puede realizar secuencialmente, en cualquier orden. En ciertas realizaciones, se pueden presentar intervalos que vanan de minutos a dfas, a semanas a meses, entre las administraciones de las dos o mas composiciones. Por ejemplo, el resto se puede administrar en primer lugar, seguido por el segundo compuesto de la invencion. Sin embargo, tambien se contempla la administracion simultanea o la administracion del segundo compuesto de la invencion en primer lugar.
Un tercer, cuarto, etc. compuesto se administra opcionalmente en combinacion con el resto y el segundo compuesto. De forma similar, se puede administrar al sujeto un tratamiento para smtomas secundarios o relacionados con la afeccion inflamatoria (p. ej., espasticidad, incontinencia, dolor, fatiga, etc.), p. ej., durante el tratamiento con el resto o la combinacion.
Formulaciones farmaceuticas
Se preparan para almacenamiento formulaciones terapeuticas de los restos de la invencion (p. ej., polipeptidos, complejos, etc.) usadas segun la presente invencion al mezclar un resto que tiene el grado de pureza deseado con vehmulos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehmulos, excipientes o estabilizantes aceptables son atoxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butflico o bendlico; alquilparabenos tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10 residuos); protemas, tales como albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; iones conjugados formadores de sales tales como sodio; complejos metalicos (p. ej. complejos de Zn- protema); y/o tensioactivos no ionicos tales como Tween®, Pluronics® o pEg.
Formulaciones liofilizadas adaptadas para la administracion subcutanea se describen, por ejemplo, en la Pat. EE. UU. N° 6.267.958 (Andya y cols.). Tales formulaciones liofilizadas se pueden reconstituir con un diluyente adecuado hasta una alta concentracion de protema y la formulacion reconstituida se puede administrar subcutaneamente al
marnffero que se va a tratar en la presente. Tambien se contemplan formas cristalizadas del resto. Vease, por
ejemplo, el documento U.S. 2002/0136719A1 (Shenoy y cols.).
La formulacion de la presente tambien puede contener al menos un segundo compuesto segun sea necesario para la indicacion particular que se trate, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sf Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente factor de crecimiento
transformante beta (TGF-p), un agente citotoxico (p. ej. metotrexato, ciclofosfamida o azatioprina), un agente
quimioterapeutico, un agente inmunosupresor, una citocina, un antagonista o anticuerpo para citocina, un factor de crecimiento, una hormona, una integrina, un antagonista o anticuerpo para integrina (p. ej., un anticuerpo para LFA-1 un anticuerpo para integrina alfa 4 tal como natalizumab), un farmaco de la clase de los interferones tal como IFN- beta-1a o IFN-beta-1b, un oligopeptido tal como acetato de glatiramer, una inmunoglobulina intravenosa (gammaglobulina), un farmaco agotador de linfocitos (p. ej., mitoxantrona, ciclofosfamida, CamPath® anticuerpos o cladribina), un farmaco inmunosupresor no agotador de linfocitos (p. ej., MMF o ciclosporina), un farmaco reductor del colesterol de la clase de las "estatinas", estradiol, un farmaco que trata smtomas secundarios o relacionados con lupus o MS (p. ej., espasticidad, incontinencia, dolor, fatiga), un inhibidor de TNF, un farmaco antirreumatico modificador de la enfermedad, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo, un corticosteroide (p. ej., metilprednisolona, prednisona, dexametasona o glucorticoide), levotiroxina, ciclosporina A, un analogo de somatastatina, un antimetabolito, un anticuerpo/antagonista superficial de celulas To B, etc., u otros segun se apunta anteriormente en la formulacion. El tipo y las cantidades eficaces de tales otros agentes dependen, por ejemplo, de la cantidad de resto presente en la formulacion, el tipo de afeccion inflamatoria que se trate y los parametros clmicos del sujeto.
Los ingredientes activos tambien se pueden encerrar en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas coloidales de aporte de farmacos (por
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ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartmulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Tales tecnicas se divulgan, p. ej., en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberacion sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polfmeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, matrices que estan en forma de artmulos conformados, p. ej. pelmulas, o microcapsulas. Ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vimlico)), polilactidos (Pat. EE. UU. ° 3.773.919), copolfmeros de acido L-glutamico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolfmeros de acido lactico-acido glicolico degradables tales como el Lupron Depot® (microesferas inyectables compuestas por copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida), y poli(acido D-(-)-3-hidroxibutmco).
Las formulaciones que se van a usar para la administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se consigue facilmente mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.
Analisis de tecnologfas relacionadas
Existen varias citocinas o antagonistas espedficos de citocinas que actualmente se estan desarrollando o estan disponibles comercialmente:
Un numero de citocinas recombinantes se usa en una variedad de entornos clmicos. Estas incluyen IL-2, GM-CSF, IL-11, IL-12 e IFN tipo I. Estas protema se estan usando principalmente como estimulantes de celulas inmunitarias y para actuar como factores de crecimiento o para intensificar las respuestas anticancerosas y virales. Se han usado pocas citocinas para inhibir el sistema inmunitario; por ejemplo, IL-10, que trabaja indirectamente sobre funciones celulares accesorias necesarias para funciones de celulas T y que se estaba desarrollando espedficamente con la enfermedad de Crohn y la enteropatfa inflamatoria como objetivos, y TGF. El exito con estos ha sido limitado.
Se han probado con algun exito antagonistas de p40 de IL-12 en examenes clmicos para pacientes con enfermedad de Crohn.
Se someten a examenes clmicos para artritis antagonistas de IL-15 basandose en la observacion de que esta citocina estaba implicada en el desarrollo de esta enfermedad.
El antagonista del receptor de IL-1 es un producto disponible comercialmente que se usa para tratar a pacientes con artritis reumatoide. Este es un producto que bloquea la interaccion de la citocina proinflamatoria IL-1 con su receptor.
Amgen, Schering Plough y Centrocor (entre otros) han desarrollado anticuerpos/antagonistas espedficos para la citocina TNF-a que se usan actualmente en el tratamiento de pacientes con artritis reumatoide. Este es un enfoque que se basa en la neutralizacion de una citocina endogena para prevenir la inflamacion. Un enfoque similar se ha investigado con anticuerpos espedficos para IL-1 e IL-6. Un problema de seguridad es que estos tratamientos estan asociados con el desarrollo de infecciones oportunistas incluyendo TB y toxoplasmosis.
Diferencias/ventajas sobre otros productos
Muchos de estos productos (en particular IL-10) no se dirigen directamente a la respuesta de celulas T durante la inflamacion. Puesto que el WSX-1 es expresado por celulas T, se anticipa que las estrategias que se dirigen a este receptor tendran un efecto mucho mas espedfico que algunos de los otros enfoques que se estan usando o investigando actualmente. Adicionalmente, muchas de las dianas actuales son moleculas individuales aguas abajo de la actividad de celulas T mientras que p28/WSX-1 (y otras protemas de fusion y complejos descritos en la presente) se dirige directamente a muchos de estos factores (p. ej., IL-2, IFN-gamma, IL-4, IL-17, TNF, IL-6) y puede incrementar adicionalmente la expresion de IL-10, amplificando de ese modo su efecto terapeutico. Adicionalmente, aunque se aprecian efectos secundarios con muchas citocinas (IL-2, IL-12, IFN) los presentes inventores no han observado signos obvios de enfermedad clmica en ratones tratados con IL-27 recombinante.
Secuencias y variantes de acido nucleico y polipeptido
Estan disponibles publicamente secuencias para una variedad de protemas y acidos nucleicos de WSX-1, gp130, p28 y EBI3 presentes en la naturaleza. Veanse, por ejemplo, la identificacion de secuencia protemica NP_663634 y el numero de registro de la secuencia nucleotfdica Nm_145659 para p28 humana, la identificacion de secuencia protemica NP_005746 y el numero de registro de la secuencia nucleotfdica NM_005755 para EBI3 humana, la identificacion de secuencia protemica NP_004834 y el numero de registro de la secuencia nucleotfdica NM_004843 para WSX-1 humano, la identificacion de secuencia protemica NP_002175 y el numero de registro de la secuencia nucleotfdica NM_002184 para gp130 humana, la identificacion de secuencia protemica NP_663611.1 y el numero de
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registro de la secuencia nucleotidica NM_145636.1 para p28 murina, la identificacion de secuencia protemica NP_056581.1 y el numero de registro de la secuencia nucleotfdica NM_015766 para EBI3 de raton, la identificacion de secuencia protemica NP_057880.1 y el numero de registro de la secuencia nucleotidica NM_016671 para WSX-1 de raton y la identificacion de secuencia protemica NP_034690 y el numero de registro de la secuencia nucleotfdica NM_010560 para gp130 de raton. Tambien son de interes en la presente invencion secuencias homologas o sustancialmente identicas a estas secuencias de nucleotidos o aminoacidos. Segun se apunta en la presente, se han descrito diversas variantes solubles y/o de fusion de tales protemas (veanse, p. ej., la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. 20040185049 y Wirtz y cols., supra) y variedades recombinantes de p28 y EBI3 estan disponibles comercialmente
Se describe en la presente un numero de nuevos polipeptidos adicionales, incluyendo protemas de fusion de WSX-1 y p28. Tales protemas de fusion pueden incluir dominios de anticuerpo y, segun se detalla anteriormente, se basan opcionalmente en anticuerpos biespedficos.
Se proporciona una variedad de polinucleotidos que codifican los nuevos polipeptidos de la invencion. Por ejemplo, se proporciona un acido nucleico que codifica una protema de fusion de WSX-1 recombinante o aislada, en donde la protema de fusion comprende uno o mas dominios que reconocen un marcador espedfico de una celula o uno o mas dominios polipeptfdicos derivados de p28 o EBI3. Opcionalmente, el acido nucleico codifica uno o mas dominios polipeptfdicos seleccionados de: un dominio de anticuerpo, una region Fc, un dominio de p28 o un dominio de EBI3, asf como que codifica un polipeptido de WSX-1. Ademas, se divulga un acido nucleico que incluye una protema de fusion de p28 recombinante o aislada. Como para los casos precedentes, el acido nucleico codifica opcionalmente uno o mas de un dominio de anticuerpo, una region Fc y un dominio de EBI3, asf como un polipeptido de p28.
Un experto apreciara que se proporcionan muchas secuencias relacionadas con las funciones descritas en la presente, por ejemplo, polinucleotidos que codifican una protema de fusion de WSX-1, una protema de fusion de p28, una protema de fusion de gp130, una protema de fusion de EBI3, un polipeptido de WSX-1 soluble, un polipeptido de gp130 soluble, etc.
Debido a la degeneracion del codigo genetico, muchos polinucleotidos codifican equivalentemente una secuencia polipeptfdica dada. Secuencias polinucleotfdicas complementarias a cualquiera de las secuencias descritas anteriormente se incluyen entre los polinucleotidos divulgados en la presente. De forma similar, un acido nucleico artificial o recombinante que se hibrida a un polinucleotido indicado anteriormente bajo condiciones altamente restrictivas a lo largo de sustancialmente toda la longitud del acido nucleico (y es distinto a un polinucleotido presente en la naturaleza) es un polinucleotido divulgado en la presente.
En ciertos casos, un vector (p. ej., un plasmido, un cosmido, un fago, un virus, etc.) comprende un polinucleotido divulgado en la presente. En un caso, el vector es un vector de expresion. En otro caso, el vector de expresion incluye un promotor ligado operativamente a uno o mas de los polinucleotidos divulgados en la presente. En otro caso, una celula comprende un vector que incluye un polinucleotido divulgado en la presente.
Un experto tambien apreciara que se incluyen en la presente muchas variantes de las secuencias divulgadas. Por ejemplo, se incluyen en la presente variaciones conservativas de las secuencias divulgadas que dan una secuencia funcionalmente similar. Se considera que se incluyen en la presente variantes de las secuencias polinucleotfdicas de acido nucleico, en donde las variantes se hibridan a al menos una secuencia divulgada. Tambien se incluyen en la presente subsecuencias unicas de las secuencias divulgadas en la presente, segun se determina, p. ej., mediante tecnicas de comparacion de secuencias estandar.
Variaciones conservativas
Debido a la degeneracion del codigo genetico, las "sustituciones sinonimas" (es decir, sustituciones en una secuencia de acido nucleico que no dan como resultado una alteracion en un polipeptido codificado) son una caractenstica implfcita de cualquier secuencia de acido nucleico que codifique una secuencia de aminoacidos. De forma similar, las "sustituciones de aminoacidos conservativas", en las que uno o un numero limitado de aminoacidos en una secuencia de aminoacidos estan sustituidos por aminoacidos diferentes con propiedades muy similares, tambien se identifican facilmente por ser muy similares a una construccion divulgada. Tales sustituciones conservativas de cada secuencia divulgada son una caractenstica de la presente divulgacion.
"Variaciones conservativas" de una secuencia de acido nucleico particular se refiere a los acidos nucleicos que codifican secuencias de aminoacidos identicas o sustancialmente identicas, o, cuando el acido nucleico no codifica una secuencia de aminoacidos, a secuencias esencialmente identicas. Un experto reconocera que sustituciones, supresiones o adiciones individuales que alterar, anaden o suprimen un solo aminoacido o un pequeno porcentaje de aminoacidos (tfpicamente menos de 5%, mas tfpicamente menos de 4%, 2% o 1%) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas conservativamente" en las que las alteraciones dan como resultado la supresion de un aminoacido, la adicion de un aminoacido o la sustitucion de un aminoacido por un aminoacido qmmicamente similar, mientras que retienen la funcion pertinente. Asf, las "variaciones conservativas" de una secuencia polipeptfdica
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listada incluyen sustituciones de un pequeno porcentaje, tipicamente menos de 5%, mas tipicamente menos de 2% o 1%, de los aminoacidos de la secuencia polipeptidica, por un aminoacido del mismo grupo de sustituciones conservativas. Finalmente, la adicion de secuencias no alteran la actividad codificada de una molecula de acido nucleico, de modo que la adicion de una secuencia no funcional o de etiquetado (intrones en el acido nucleico, secuencias de poli-His o similares en el polipeptido codificado, etc.), es una variacion conservativa del acido nucleico o polipeptido basico.
Se conocen bien en la especialidad tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoacidos funcionalmente similares, en las que un residuo de aminoacido se sustituye por otro residuo de aminoacido que tiene propiedades similares (p. ej., cadenas laterales aromaticas o cadenas laterales cargadas positivamente), y por lo tanto no cambia sustancialmente las propiedades funcionales de la molecula polipeptidica. La Tabla 1 indica grupos ejemplares que contienen aminoacidos naturales de propiedades qmmicas similares, en la que la sustitucion dentro de un grupo es una "sustitucion conservativa".
Tabla 1. Sustituciones de aminoacidos conservativas
Cadenas laterales no polares y/o alifaticas
Cadenas laterales polares no cargadas Cadenas laterales aromaticas Cadenas laterales cargadas positivamente Cadenas laterales cargadas negativamente
Glicina
Serina
Alanina
Treonina Fenilalanina Lisina
Valina
Cistema Tirosina Arginina Aspartato
Leucina
Metionina Triptofano Histidina Glutamato
Isoleucina
Asparagina
Prolina
Glutamina
Hibridacion de acidos nucleicos
Se puede usar la hibridacion comparativa para identificar acidos nucleicos divulgados en la presente, incluyendo variaciones conservativas de acidos nucleicos divulgadas en la presente. Ademas, se divulgan en la presente acidos nucleicos diana que se hibridan a un acido nucleico divulgado en la presente bajo condiciones de restriccion alta, ultraalta y ultraultraalta, donde los acidos nucleicos son distintos al acido nucleico presente en la naturaleza. Ejemplos de tales acidos nucleicos incluyen aquellos con una o una pocas sustituciones de acido nucleico sinonimas o conservativas en comparacion con una secuencia de acido nucleico dada divulgada en la presente.
Se dice que un acido nucleico de prueba se hibrida espedficamente a un acido nucleico sonda cuando se hibrida al menos 50% asf como a la sonda en cuanto a la diana complementaria perfectamente emparejada, es decir, con una relacion de senal a ruido al menos la mitad de alta que la hibridacion de la sonda a la diana bajo condiciones en las que la sonda perfectamente emparejada se une a la diana complementaria perfectamente emparejada con una relacion de senal a ruido que es al menos aproximadamente 5 veces-10 veces tan alta como la observada para la hibridacion de cualquiera de los acidos nucleicos diana no emparejados.
Los acidos nucleicos se "hibridan" cuando se asocian, tfpicamente en solucion. Los acidos nucleicos se hibridan debido a una variedad de fuerzas fisicoqmmicas bien caracterizadas, tales como union por enlaces de hidrogeno. exclusion de disolvente, apilamiento de bases y similares. Una grna extensa para la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capftulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, Nueva York), asf como en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y cols., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado a lo largo de 2007) ("Ausubel"); Hames y Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Inglaterra, (Hames y Higgins 1) y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 2) proporcionan detalles de la smtesis, el marcaje. la deteccion y la cuantificacion de ADN y ARN, incluyendo oligonucleotidos.
Un ejemplo de condiciones de hibridacion restrictivas para la hibridacion de acidos nucleicos complementarios que tienen mas de 100 residuos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es formalina al 50% con 1 mg de heparina a 42°C, llevandose a cabo la hibridacion durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado con 0,2x SSC a 65°C durante 15 minutos (vease, Sambrook y cols., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000 ("Sambrook") para una descripcion del tampon de SSC). A menudo, el lavado altamente restrictivo esta precedido por un lavado poco restrictivo para retirar la senal de sonda de fondo. Un ejemplo de un lavado poco restrictivo es 2x SSC a 40°C durante 15 minutos. En general, una relacion de senal a ruido de 5x (o superior) que la
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observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridacion particular indica la deteccion de una hibridacion espedfica.
Las "condiciones de lavado de hibridacion restrictivas" en el contexto de experimented de hibridacion de acidos nucleicos tales como hibridaciones Southern y Northern dependen de la secuencia, y son diferentes bajo parametros ambientales diferentes. Una gma extensa para la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993), anteriormente, y en Hames y Higgins, 1 y 2. Las condiciones de hibridacion y lavado restrictivas se pueden determinar facilmente empmcamente para cualquier acido nucleico de prueba. Por ejemplo, al determinar condiciones de hibridacion y lavado restrictivas, las condiciones de hibridacion y lavado se incrementan gradualmente (p. ej., al incrementar la temperatura, disminuir la concentracion de sal, incrementar la concentracion de detergente y/o incrementar la concentracion de disolventes organicos tales como formalina en la hibridacion o el lavado), hasta que se cumple un grupo de criterios seleccionado. Por ejemplo, en condiciones de hibridacion y lavado altamente restrictivas, las condiciones de hibridacion y lavado se incrementan gradualmente hasta que una sonda se une a una diana complementaria perfectamente emparejada con una relacion de senal a ruido que es al menos 5 veces mas alta que la observada para la hibridacion de la sonda a una diana no emparejada.
Las condiciones "muy restrictivas" se seleccionan para ser iguales al punto de fusion termino (Tm) para una sonda particular. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza ionica y un pH definidos) a la que 50% de la secuencia de prueba se hibrida a una sonda perfectamente emparejada. Generalmente, las condiciones de hibridacion y lavado "altamente restrictivas" se seleccionan para ser aproximadamente 5°C inferiores que el Tm para la secuencia espedfica a una intensidad ionica y un pH definidos.
Las condiciones de hibridacion y lavado de "restriccion ultraalta" son aquellas en las que la restriccion de las condiciones de hibridacion y lavado se incrementan hasta que la relacion de senal a ruido para la union de la sonda al acido nucleico diana complementario perfectamente emparejado es al menos 10 veces mas alta que la observada para la hibridacion a cualquiera de los acidos nucleicos diana no emparejados. Se dice que un acido nucleico diana que se hibrida a una sonda bajo tales condiciones, con una relacion de senal a ruido de al menos A la del acido nucleico diana complementario perfectamente emparejado se une a la sonda bajo condiciones de restriccion ultraalta.
De forma similar, se pueden determinar niveles de restriccion todavfa superiores al incrementar gradualmente las condiciones de hibridacion y/o lavado del ensayo de hibridacion pertinente. Por ejemplo, aquellos en los que la restriccion de las condiciones de hibridacion y lavado se incrementan hasta que la relacion de senal a ruido para la union de la sonda al acido nucleico diana complementario perfectamente emparejado es al menos 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces o 500 veces o mas mas alta que la observada para la union a cualquiera de los acidos nucleicos diana no emparejados. Se dice que un acido nucleico diana que se hibrida a una sonda bajo tales condiciones, con una relacion de senal a ruido de al menos A la del acido nucleico diana complementario perfectamente emparejado se une a la sonda bajo condiciones de restriccion ultraultraalta.
Los acidos nucleicos que ni no se hibridan entre sf bajo condiciones restrictivas son todavfa sustancialmente identicos si los polipeptidos que codifican son sustancialmente identicos. Esto se produce, p. ej., cuando una copia de un acido nucleico se crea usando la maxima degeneracion codonica permitida por el codigo genetico.
Comparacion, identidad y homologfa de secuencias
Los terminos "identicas" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o mas secuencias de acido nucleico o polipeptido, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoacido o nucleotidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean para una correspondencia maxima, segun se mide usando uno de los algoritmos de comparacion de secuencias descritos posteriormente (u otros algoritmos disponibles para el experto) o mediante una inspeccion visual.
La expresion "sustancialmente identicos", en el contexto de dos acidos nucleicos o polipeptidos (p. ej., ADN que codifican un polipeptido de WSX-1, p28, EBI3 o gp130, o la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de WSX-1, p28, EBI3 o gp130) se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente 60%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o mas de identidad de nucleotidos o residuos de aminoacido, cuando se comparan y se alinean para una correspondencia maxima, segun se mide usando un algoritmo de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual. Se considera tfpicamente que tales secuencias "sustancialmente identicas" son "homologas", sin referencia a la ascendencia real. Preferiblemente, la "identidad sustancial" existe a lo largo de una region de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 50 residuos de longitud, mas preferiblemente a lo largo de una region de al menos aproximadamente 100 residuos y, lo mas preferiblemente, las secuencias son sustancialmente identicas a lo largo de al menos aproximadamente 150 residuos, o a lo largo de toda la longitud de las dos secuencias que se van a comparar.
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Las protemas y/o las secuencias protemicas son "homologas" cuando se derivan, naturalmente o artificialmente, de una protema o secuencia protemica ancestral comun. De forma similar, los acidos nucleicos y/o las secuencias de acido nucleico son homologos cuando se derivan, naturalmente o artificialmente, de un acido nucleico o secuencia de acido nucleico ancestral comun. La homologfa se infiere generalmente de una similitud de secuencia entre dos o mas acidos nucleicos o protemas (o secuencias de los mismos). El porcentaje preciso de similitud entre secuencias que es util al establecer la homologfa vana con el acido nucleico y la protema en cuestion, pero tan poco como 25% de similitud de secuencia a lo largo de 50, 100, 150 o mas residuos (nucleotidos o aminoacidos) se usa habitualmente para establecer la homologfa. Tambien se pueden usar niveles superiores de similitud de secuencia, p. ej., 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o mas, para establecer la homologfa. Metodos para determinar porcentajes de similitud de secuencias (p. ej., BLASTP y BLASTN usando parametros por defecto) se describen en la presente y generalmente estan disponibles. Los "ortologos" son genes en diferentes especies que evolucionaron de un gen ancestral comun mediante especiacion. Normalmente, los ortologos retienen la misma funcion o una similar en el transcurso de la evolucion. Segun se usa en la presente los "ortologos" se incluyen en el termino "homologos".
Para la comparacion de secuencias y la determinacion de la homologfa, tipicamente una secuencia actua como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se introducen en un ordenador, se disenan las coordenadas de las subsecuencias, si es necesario, y se disenan los parametros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparacion de secuencias calcula a continuacion el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o las secuencias de prueba con relacion a la secuencia de referencia, basandose en los parametros del programa disenados.
La alineacion optima de secuencias para comparacion se puede efectuar, p. ej., mediante el algoritmo de homologfa local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homologfa de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la busqueda del metodo de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante puestas en marcha informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspeccion visual (vease generalmente Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y cols., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., complementada a lo largo de 2007).
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y cols., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para realizar analisis BLAST esta disponible publicamente a traves de the National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencia de puntuacion alta (HSP) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia consultada, que bien esta emparejada o bien satisface alguna puntuacion T liminar de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Se hace referencia a T como el umbral de la puntuacion de la palabra proxima (Altschul y cols., supra). Estas de palabras comunes proximas iniciales actuan como semillas para busquedas iniciales para encontrar HSP mas largos que las contienen. Las palabras comunes se extienden a continuacion en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia durante tanto como se pueda incrementar la puntuacion de alineacion acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias nucleotfdicas, los parametros M (puntuacion de recompensa para un par de residuos emparejados; siempre > 0) y N (puntuacion de penalizacion para residuos no emparejados; siempre < 0). Para las secuencias de aminoacidos, se usa una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion acumulativa. La extension de las palabras comunes en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion de alineacion acumulativa se separa en la cantidad X de su valor maximo alcanzado; la puntuacion acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuos de puntuacion negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parametros del programa BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias nucleotidicas) usa como defectos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un valor de corte de 100, M=5, N=-4, y una comparacion de ambas hebras. Para secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP usa como defectos una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
Ademas de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias (vease, p. ej., Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:58735787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma menor (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad con la que un emparejamiento entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos se podna producir por casualidad. Por ejemplo, se considera que un acido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma menor en una comparacion del acido nucleico de prueba con el acido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, mas preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y lo mas preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.
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Elaboracion y aislamiento de polipeptidos recombinantes
Generalmente, los acidos nucleicos que codifican un polipeptido de la invencion para el uso en los metodos o las composiciones de la invencion se puede elaborar mediante clonacion, recombinacion, smtesis in vitro, amplificacion in vitro y/u otros metodos disponibles. Esencialmente, cualquier acido nucleico puede ser adquirido por encargo o de forma estandar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como Operon Technologies Inc. (Alameda, CA). Ademas, se puede usar una variedad de metodos recombinantes para expresar un vector de expresion que codifica un polipeptido de la invencion. Metodos recombinantes para elaborar acidos nucleicos, la expresion y el aislamiento de productos expresados son muy conocidos y se describen, p. ej., en Sambrook, Ausubel e Innis y cols. (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., San Diego, CA (1990).
Esta disponible comercialmente un gran numero de estuches para purificacion de plasmidos u otros acidos nucleicos pertinentes a partir de celulas (veanse, p. ej., EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™, de Stratagene; y QIAprep™ de Qiagen). Cualquier acido nucleico aislado y/o purificado se puede manipular adicionalmente para producir otros acidos nucleicos, usar para transfectar celulas, incorporar en vectores relacionados para infectar organismos para la expresion, y/o similares. Los vectores de clonacion tfpicos contienen terminadores de la transcripcion y la traduccion, secuencias de iniciacion de la transcripcion y la traduccion y promotores utiles para la regulacion de la expresion del acido nucleico diana particular. Los vectores comprenden opcionalmente casetes de expresion genericos que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicacion del casete en eucariotas o procariotas o ambos, (p. ej., vectores lanzadera) y marcadores de seleccion para sistemas tanto procarioticos como eucarioticos. Los vectores son adecuados para la replicacion y la integracion en procariotas, eucariotas o ambos. Veanse Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, y cols., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., y cols., Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel anteriormente, Sambrook anteriormente y Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA. Un catalogo de bacterias y bacteriofagos utiles para clonar es proporcionado, p. ej., por la ATCC, p. ej., The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage publicado anualmente por la ATCC. Procedimientos basicos adicionales para la secuenciacion, la clonacion y otros aspectos de la biologfa molecular y consideraciones teoricas subyacentes tambien se encuentran en Watson y cols. (1992) Recombinant DNA Segunda Edicion, Scientific American Books, NY.
Otras referencias utiles, p. ej. para el aislamiento y el cultivo de celulas (p. ej., para el posterior aislamiento del acido nucleico o el polipeptido) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edicion, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas allf; Payne y cols. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.
Una variedad de metodos de aislamiento y deteccion de protemas se conoce y se puede usar para aislar polipeptidos, p. ej., de cultivos recombinantes de celulas que expresan las protemas de fusion o solubles recombinantes de la invencion. Es muy conocida en la tecnica una variedad de metodos de aislamiento y deteccion de protemas, incluyendo, p. ej., los indicados en R. Scopes, Protein Purification. Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag y cols. (1996) Protein Methods, 2a Edicion Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3a Edicion Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edicion Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; y las referencias citadas en las mismas. Detalles adicionales relativos a metodos de purificacion y deteccion de protemas se pueden encontrar en Satinder Ahuja ed., Handbook of Bioseparations, Academic Press (2000).
Los polipeptidos de WSX-1 y gp130 solubles, polipeptidos de gp130 y los polipeptidos de EBI3 pueden ser asf expresados y purificados por un experto. Alternativamente, un numero de tales polipeptidos esta disponible comercialmente. Por ejemplo, p28 y EBI3 recombinantes estan disponibles de Abnova Corporation (www (dot) abnova (dot) com (dot) tw). Cuando se desean complejos polipeptfdicos, los dos (o mas) componentes polipeptfdicos del complejo opcionalmente se coexpresan y purifican conjuntamente como un complejo, o los componentes se pueden purificar separadamente y a continuacion combinarse para formar el complejo. Opcionalmente, los componentes estan asociados no covalentemente en el complejo, u opcionalmente estan conectados covalentemente mediante un reticulador qmmico o similares en el complejo.
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Ejemplos
Se ha de entender que los ejemplos y las realizaciones descritos en la presente tienen solamente propositos ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos seran sugeridos para el experto en la especialidad y se deben incluir dentro del esprntu y la competencia de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Segun esto, los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invencion reivindicada.
Ejemplo 1: la interleucina 27 regula negativamente el desarrollo de celulas cooperadoras T productoras de interleucina 17 durante la inflamacion cronica del SNC
Estudios recientes se han enfocado a los casos que influyen en el desarrollo de celulas Th-17 asociadas con autoinmunidad, tal como encefalitis autoinmunitaria experimental, pero se conoce relativamente poco acerca de las citocinas que antagonizan respuestas efectoras de Th-17. Los experimentos de la presente muestran que ratones deficientes en interleucina (IL)-27R infectados cronicamente con Toxoplasma gondii desarrollaban neuroinflamacion grave que era dependiente de celulas T CD4+ y estaba asociada con una respuesta de IL-17 prominente. El tratamiento con IL-27 in vitro de celulas T primarias naturales supriirna el desarrollo de celulas Th-17 inducido por IL- 6 y TGF-p, que era dependiente de STAT1 pero independiente de la inhibicion mediada por SOCS3 de la senalizacion de IL-6. Asf, la IL-27, un potente inhibidor del desarrollo de celulas Th-17, puede ser una diana util para tratar enfermedades inflamatorias mediadas por estas celulas. De forma similar, las protemas de fusion y los complejos descritos anteriormente en la presente proporciona enfoques utiles para tratar enfermedades inflamatorias mediadas por estas celulas.
Aunque el paradigma del tipo cooperador T 1 (Th1)-Th2 ha dominado los estudios de la funcion de celulas T cooperadoras durante casi 20 anos1, un trabajo reciente ha identificado un nuevo subgrupo de celulas T CD4+ que producen IL-17A, IL-17F, TNF e IL-6 en respuesta a IL-232, 3 Estos linfocitos 'Th-17' se han relacionado como mediadores de la inflamacion asociada con varias enfermedades autoinmunitarias, incluyendo encefalitis autoinmunitaria experimental (EAE) y artritis inducida por colageno3'7. Como consecuencia, ha existido un interes en definir la ontogenia de estas celulas T CD4+ patologicas y los factores que regulan sus actividades8'10 Aunque estudios iniciales establecieron un papel para la IL-23 en la promocion de la produccion de celulas Th-17, un trabajo mas reciente mostraba que la IL-23 no es un inductor fuerte de novo de celulas Th-17. La observacion de que las celulas T procedentes de ratones deficientes en IL-23 pueden secretar IL-17 cuando se estimulaban mediante IL-233 indicaba que otros factores promueven el desarrollo de celulas productoras de IL-17. Varios informes recientes han identificado de hecho un papel cntico para TGF-p e IL-6 en el desarrollo de novo de celulas Th-17 murinas11'13 . Aunque el exito en la demostracion de la importancia de IL-6 y TGF-p en su desarrollo ha sido relativamente rapido (al menos en ratones), se sabe considerablemente menos acerca de los antagonistas fisiologicos de celulas Th-17.
La IL-27, una citocina heterodfmera compuesta por gen 3 inducido por virus de Epstein-Barr (EBI3) y p28, senala a traves de un complejo receptor compuesto por IL-27R (WSX-1/TCCR) y gp13014,15. Aunque la expresion del IL-27R esta confinada a celulas inmunitarias15'18, su socio gp130, un componente receptor compartido de varias citocinas incluyendo IL-6, se expresa constitutivamente sobre celulas inmunitaria y no inmunitarias19,20 Aunque pocos estudios se han dirigido directamente a los episodios que conducen a la produccion de IL-27, un modelo actual sostiene que el heterodfmero de IL-27 es producido por APC activadas21. Informes iniciales enfocados a la capacidad de IL-27 para promover la proliferacion de celulas T y el desarrollo de respuestas de Th118,22; estudios posteriores han indicado que tambien puede limitar respuestas de Th1 y Th2 implicados en la resistencia a diversas infecciones parasitarias. Asf, los ratones deficientes en IL-27R (Il27ra-/-) desarrollan respuestas exageradas de celulas T cooperadoras durante las fases agudas de la toxoplasmosis, la enfermedad de Chaga, la leishmaniosis y despues de la excitacion con helmintos23-26 Recientemente, un fenotipo similar se ha relacionado con la inhibicion por IL-27 de la produccion de IL-227, pero no estaba claro si la IL-27 tiene efectos supresores adicionales sobre otros subgrupos o funciones de celulas T.
Aunque existe una apreciacion del papel de IL-27 en modelos agudos de inflamacion8, ha habido una comprension limitada de su papel en la enfermedad cronica y sus efectos espedficos para un tejido. La evidencia sugiere que se produce IL-27 durante la inflamacion en el SNC28, pero no se ha abordado una posible funcion para IL-27 durante la toxoplasmosis cronica; no ha estado claro si la IL-27 tiene efectos pro- o antiinflamatorios en el SNC 'inmunoprivilegiado'.
Los resultados descritos en la presente demuestran que ratones Il27ra-l- infectados cronicamente con T. gondii controlan la replicacion de parasitos en el cerebro pero desarrollan una patologfa mediada por celulas T letal asociada con una respuesta exagerada de Th-17. Estudios ex vivo adicionales mostraban que IL-27 o - incluso su componente p28 solo, en un menor grado - era capaz de antagonizar el desarrollo de celulas Th-17. La actividad supresora de IL-27 era independiente de la inhibicion dependiente de SOCS3 de la senalizacion de gp130 pero dependiente de STAT1. Conjuntamente, estos hallazgos identifican que la IL-27 es un antagonista del desarrollo de celulas Th-17 y por lo tanto indican una posible diana terapeutica para tratar enfermedades inflamatorias asociadas con celulas Th-17.
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Resultados
Produccion de IL-27 durante la encefalitis toxoplasmica
Se uso PCR en tiempo real para cuantificar niveles relativos de los transcritos para IL-27 durante la TE. Se detectaron cantidades de bajas a mmimas de ARNm para ebi3 (gen para EBI3) e Il27 (gen para p28) en cerebros no infectados. Sin embargo, en tejidos procedentes de ratones infectados cronicamente, habfa un incremento de > 3 veces en la cantidad de ARN de ebi3 mRNA en el cerebro y un incremento de > 500 veces en las cantidades de ARNm para Il27 (Panel A de la Figura 1). Dado que se cree que las celulas dendnticas y los macrofagos son fuentes de IL-27 en tejidos perifericos14, es posible que los trascritos de ebi3 e Il27 elevados detectados durante la TE se deban a la migracion de estas celulas al SNC. Alternativamente, celulas cerebrales residentes que son capaces de producir IL-27 incluyen microglia y monocitos residentes en el cerebro29. La activacion de astrocitos, un subgrupo de celulas residentes del SNC, durante la TE, y su capacidad para producir citocinas en respuesta a una infeccion30 sugieren que pueden representar una fuente de IL-27. Sin embargo, aunque astrocitos primarios procedentes de ratones WT expresaban niveles basales de ARNm de ebi3, no se observaba un incremento en la respuesta a la estimulacion con LPS mas IFN-y (Panel B de la Figura 1). En contraste, las cantidades de ARNm de Il27 se incrementaban casi 2.000 veces despues de la estimulacion con LPS e IFN-y. Conjuntamente, estas observaciones sugieren que ambos componentes de IL-27 se producen localmente durante la TE y que los astrocitos activados pueden expresar tanto EBI3 como p28.
El papel de IL-27 durante la infeccion cronica con T. gondii.
El enfoque previo en la IL-27 implicaba un papel para ella en la diferenciacion de celulas T vfrgenes en celulas Th1 efectoras14, 1-34. Sin embargo, se encontro que los ratones Il27ra-l- generaban respuestas de Th1 robustas cuando se excitaban con T. gondii, aunque los ratones sucumbieron a una enfermedad inflamatoria dependiente de celulas T CD4+ aguda letal caracterizada por la produccion exagerada de IFN-y e IL-226,27 asociada con una patologfa hepatica y pulmonar grave26.
Dada la propension de los ratones I127ra-l- a la toxoplasmosis aguda, se idearon varias estrategias que pudieran permitir que la infeccion cronica se desarrollara. La primera de estas era tratar a los ratones infectados con CTLA4- Ig, un antagonista de la coestimulacion de celulas T dependiente de CD2835, los dfas 7 y 10 despues de la infeccion. Despues del tratamiento con CTLA4-Ig, los ratones Il27ra-l- infectados sobrevivfan a lo largo de 14 dfas despues de la infeccion y avanzaban hasta el estadio cronico; sin embargo, el tratamiento no proporcionaba proteccion a largo plazo, ya que los ratones Il27ra-l- que recibfan el CTLA4-Ig monan en menos de cinco semanas de infeccion. La letalidad observada despues del tratamiento con CTLA4-Ig no parecfa ser una consecuencia secundaria de la supresion inmunitaria mediada por CTLA4-Ig ya que los ratones Wt que recibfan el mismo tratamiento sobrevivfan (Panel A de la Figura 2). El analisis histologico del hngado y el pulmon revelaba que aunque los ratones Il27ra-l- tratados con CTLA4-Ig sobrevivieran a la fase aguda, todavfa desarrollaban una infiltracion de celulas inmunitarias prominente, necrosis e inflamacion en estos organos el dfa 14 despues de la infeccion (Panel C de la Figura 2). La patologfa no era evidente el ratones WT infectados ya se hubieran tratado o no con CTLA4-Ig (datos no mostrados). En contraste con lo que se observaba en el hngado y los pulmones en este punto temporal, no se observaban signos histologicos de inflamacion en el cerbero de ratones Il27ra-l- o WT (datos no mostrados).
Sin embargo, en ratones Il27ra-l- que avanzaban hasta el estadio cronico de infeccion (dfa 30), la patologfa presente en el hngado y los pulmones durante la infeccion aguda se ha resuelto (Panel C de la Figura 2). En contraste, en el cerebro y el SNC, los ratones Il27ra-l- presentaban zonas de inflamacion intensa, numerosos manguitos perivasculares en el parenquima y meningitis grave (Panel D de la Figura 2). Por otra parte, los ratones WT ternan una TE de minima a leve. Por otra parte, la activacion de astrocitos, segun se evalua mediante tincion con respecto a protema fibrilar glial (GFAP), revelaba que aunque la infeccion condujera a un incremento de la expresion de esta protema estructural en animales WT, esta se incrementaba notablemente en los ratones Il27ra-l- (Panel D de la Figura 2). En un enfoque complementario para permitir que los ratones Il27ra-l- avancen hasta el estadio cronico, el tratamiento con el farmaco antiparasitario sulfadiazina empezando el dfa 5 despues de la infeccion, que inhibe la replicacion de los parasitos pero no erradica la infeccion, tambien evitaba la mortalidad aguda en los ratones Il27ra- l-. Despues del cese del tratamiento farmacologico, los ratones WT no manifestaban enfermedad clmica, pero los ratones Il27ra-l- desarrollaban smtomas de enfermedad asociados con una patologfa grave del SNC y monan en menos de 2-3 semanas (Panel B de la Figura 2). Los datos presentados en el resto de este ejemplo se derivan asf de ratones en los que se dejo que se desarrollara una enfermedad cronica a traves del tratamiento con CTLA4-Ig o sulfadiazina y no eran evidentes diferencias entres estos grupos experimentales diferentes.
Dados informes en los que IL-27 puede aumentar la produccion de IFN-y , , " , una citocina cntica para el control de T. gondii en el SNC36, la inflamacion intensificada observada en el cerebro en ausencia de senalizacion de IL-27 podna se una consecuencia de un fallo para elaborar IFN-y y la incapacidad para controlar la replicacion de parasitos. Sin embargo, no se encontro una diferencia medible en la carga de parasitos en los cerebros de ratones Il27ra-l- y WT infectados cronicamente (Panel E de la Figura 2). Por otra parte, celulas mononucleares aisladas de
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los cerebros (BMNC) de ratones WT e Il27ra-l- no eran deficientes en su capacidad para producir la molecula efectora antiparasitaria dependiente de IFN-y oxido mtrico (NO) (Panel F de la Figura 2). De acuerdo con esta observacion, BMNC procedentes de ratones WT e Il27ra-l- estimulados con STAg (antigenos de Toxoplasma solubles) produdan niveles similares de IL-12 e IFN-y (Paneles Gy H de la Figura 2). Esos hallazgos indicaban que la neuroinflamacion intensa en ratones Il27ra-/- no era el resultado de un defecto en la produccion de IFN-v o un incremento en la carga de parasitos. Debido a que la IL-27 inhibe la produccion de IL-2 por celulas T CD4+27, 7, era posible que en ausencia de senalizacion de IL-27 la produccion aumentada de este factor de crecimiento de celulas T en el cerebro pudiera contribuir a la inmunopatologfa observada. Sin embargo, de acuerdo con informes previos, no se encontraron cantidades detectables de ARNm o protema de Il2 (IL-2) en el cerebro de ratones WT infectados cronicamente y esto no se alteraba en ausencia del IL-27R (datos no mostrados). De forma similar, no habfa transcritos detectables para Il4 (IL-4) o Il13 (IL-13), dos citocinas asociadas a Th2, en el cerebro de estos grupos experimentales. Finalmente, el examen de otros subgrupos de celulas T revelaba la presencia de una poblacion secundaria de celulas T reguladoras (Treg) Foxp3+ en el cerebro, pero no habfa diferencia en los numeros de celulas entre ratones WT o Il27ra-l- infectados cronicamente (datos no mostrados).
La ausencia de IL-27R da como resultado la acumulacion de celulas T CD4+ patogenas
Dada la prominente inflamacion del SNC inducida por infeccion en ausencia del IL-27R, se realizaron experimentos para identificar el fenotipo de las celulas infiltrantes. De acuerdo con la histopatologfa, el analisis de BMNC aisladas de ratones infectados cronicamente mostraba un notable incremento en el numero de celulas recuperadas de cerebros Il27ra-l- (P < 0,05; Panel A de la Figura 3) y un incremento significativo en el numero y el porcentaje de celulas T CD4+ (P < 0,05) asf como el numero de celulas CD8+ T recuperadas (Panel B de la Figura 3). A pesar de las diferencias en la composicion de las poblaciones de celulas T, el analisis de la celulas T procedentes de los cerebros de ratones WT e Il27ra-l- presentaba un fenotipo activado de CD44hi y CD62Llow (Figura 8). Por otra parte, los monocitos procedentes de ambos grupos de ratones presentaban un fenotipo activado caracterizado por la expresion aumentada del complejo principal de histocompatibilidad clase II sobre su superficie (datos no mostrados). Sin embargo, aunque no hay diferencias en el numero de microglia residente (CD11bint, CD45int) habfa un incremento significativo en el numero de macrofagos infiltrantes (CD11bhi, CD45hi) en ausencia del IL-27R (P < 0,05; Panel B de la Figura 3).
En los estudios mencionados anteriormente, una de las caractensticas sorprendentes apuntadas en los ratones Il27ra-l- infectados cronicamente es el incremento significativo en el numero de celulas T CD4+ presentes en el cerebro. Aunque se requieren linfocitos infiltrantes para el control de la TE38; tambien pueden contribuir al desarrollo de una patologfa del sNc durante esta infeccion39. Para determinar si las celulas T CD4+ estaban implicadas en la enfermedad letal observada en los ratones Il27ra-l- infectados cronicamente, los ratones se trataron con un mAb agotador espedfico para CD4 a las cuatro semanas despues de la infeccion y se verifico la supervivencia. Los analisis de los ratones despues del tratamiento con el mAb anti-CD4 revelaron un agotamiento de > 95% de las celulas T CD4+ en el bazo y una reduccion de 50% en el cerebro (Panel C de la Figura 3). La supervivencia de los ratones Il27ra-l- tratados con mAb anti-CD4 era mas prolongada que 60 dfas despues de la infeccion, mientras que la mayona de los ratones no tratados desarrollaba una patologfa grave en el cerebro y mona por la enfermedad para el dfa 50 (Panel D de la Figura 3). Por otra parte, el analisis histologicos 7 dfas despues de este tratamiento revelaba una disminucion de la inflamacion en el parenquima y las meninges (Panel E de la Figura 3). Conjuntamente, estos datos establedan que las celulas T CD4+ infiltrantes contribuyen a la patologfa letal en el cerebro observada durante la TE en ausencia de IL-27.
La IL-27 inhibe la produccion de IL-17 por celulas T experimentadas con antfgeno
El conocimiento de que la neuropatologfa en ratones Il27ra-l- infectados cronicamente no es una consecuencia de una respuesta de Th1 defectuosa pero en cambio esta mediada por celulas T CD4+ condujo a la decision de examinar el papel positivo del subgrupo Th-17 recientemente descrito de celulas T CD4+ en la patologfa letal. Debido a que las celulas Th-17 se han caracterizado por la produccion de IL-17, IL-6 y TNF, implicados en el desarrollo de la enfermedad en un modelo de inflamacion del SNC3, la cantidad de transcritos de ARNm para estas citocinas se evaluo mediante PCR en tiempo real derivadas del cerebro de ratones WT e Il27ra-l- infectados cronicamente. Mientras que los ratones tanto WT como Il27ra-l- expresaban cantidades comparables de Il6 (IL-6) y Tnf (TNF), los transcritos para Il17 (IL-17) solo se detectaban en las muestras procedentes de ratones Il27ra-l- (Panel A de la Figura 4).
Aunque existen multiples fuentes celulares (astrocitos, microglia, macrofagos, celulas T) para IL-6 y TNF en el cerebro durante la tE, la produccion de IL-17 esta restringida en gran parte a las celulas T. Segun esto, BMNC procedentes de ratones Il27ra-l- reestimulados en presencia de STAg produdan significativamente mas IL-17, IL-6 y TNF que celulas procedentes de ratones WT (Panel B de la Figura 4). Tambien se produjeron bajas cantidades de IL-17 por BMNC WT estimulada con STAg, lo que se aumentaba al anadir IL-23 y se bloqueaba casi completamente por la adicion de IL-27 (Panel C de la Figura 4). Por otra parte, la tincion intracelular de poblaciones de celulas T CD4+ y CD8+ en preparaciones de BMNC procedentes de ratones WT e Il27ra-l- infectados cronicamente revelaba
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una produccion elevada de IL-17 por celulas del cerebro de ratones Il27ra-l- (Panel D de la Figura 4). Conjuntamente, esos resultados sugieren que la IL-27 regula la inflamacion en el SNC durante la TE cronica al limitar la actividad de Th-17.
La IL-27 inhibe la produccion de IL-17 por celulas T CD4+ y CD8+
Informes recientes sobre la diferenciacion de celulas Th-17 in vitro han concluido que se requieren TGF-p e IL-6 para la generacion de estas celulas a partir de celulas T CD4+ vfrgenes, mientras que el bloqueo de IFN-y e IL-4 apoya un ambiente favorable para el desarrollo de Th-173’11'13’40'41. Por lo tanto, las celulas T CD4+ y CD8+ T vfrgenes aisladas de los bazos de ratones C57BL/6 se cultivaron bajo estas condiciones para evaluar directamente la capacidad de IL-27 para inhibir la produccion de IL-17 por celulas T. Despues de la estimulacion con PMA e ionomicina casi todas las celulas T produdan TNF y una poblacion significativa coexpresaba IL-17 y TNF. De acuerdo con los estudios presentados anteriormente, la adicion de IL-27 inhibfa eficazmente la produccion de IL-17 por celulas T CD4+ y CD8+, pero no alteraba la produccion de TNF por estas celulas (Paneles A y B de la Figura 5). En ausencia de estimulacion con PMA e ionomicina, el porcentaje y la media de intensidad fluorescente de celulas productoras de IL-17 eran inferiores, pero la IL-27 todavfa era un antagonista potente de esta actividad (Figura 9).
La descripcion original de p28 indicaba que esta protema podfa ser secretada por sf misma, pero, a diferencia de IL- 27, no promovfa la proliferacion de celulas T o promovfa la produccion de IFN-y14. A la luz de los hallazgos de que IL-27 inhibe la produccion de IL-17 y la expresion de p28 se incrementa drasticamente en astrocitos activados, aunque la expresion de EBI3 estuviera inalterada (Panel B de la Figura 1), se realizaron estudios para determinar sin la p28 por sf misma podfa inhibir la produccion de IL-17 por celulas T. Celulas T CD4+ o CD8+ aisladas de ratones C57BL/6 se estimularon bajo condiciones inductoras de IL-17 en presencia de p28. Aunque no era tan eficaz como IL-27, el tratamiento con p28 sola podfa inhibir la produccion de IL-17 por celulas T CD4+ y CD8+ T (Panel C de la Figura 5).
Las citocinas asociadas a gp130 tienen distintos efectos sobre el desarrollo de Th-17
El trabajo reciente de multiples grupos ha revelado un papel para la IL-6 en el desarrollo de celulas Th-1711'13. Debido a que IL-6 e IL-27 senalan a traves de un componente receptor compartido, gp130, era posible que la capacidad de IL-27 para inhibir la produccion IL-17 fuera una consecuencia de la competicion con IL-6 por la union a gp130 y/o la senalizacion. Para abordar esta cuestion, se realizo una serie de experimentos usando celulas T CD4+ aisladas de los bazos de ratones C57BL/6 WT. Cuando estas celulas se activaban con anticuerpos anti-CD3 mas anti-CD28 en presencia de IL-23 o TGF-p bajo condiciones no polarizantes (anti-IFN-Y, anti-IL-4) se produda una secrecion intensa de IL-17, y la adicion de IL-27 podna inhibir la produccion de IL-17 de un modo dependiente de la dosis (Paneles A and B de la Figura 6). La neutralizacion posterior de IL-6 en las condiciones de cultivo (usando un anticuerpo anti-IL-6) daba como resultado una disminucion en la produccion de IL-17, de forma similar a informes previos11; sin embargo, incluso en esas condiciones la adicion de IL-27 todavfa reduda los niveles de IL-17 de un modo dependiente de la dosis (Paneles A y B de la Figura 6), indicando que IL-27 e IL-6, citocinas estrechamente relacionadas, tienen efectos contrapuesto sobre las celulas Th-17.
Una de las consecuencias directas de la senalizacion mediante muchas citocinas de tipo I es la activacion aguas abajo de protemas SOCS, que conduce a la supresion de respuestas de celulas T a traves de un bucle de retroalimentacion regulador negativo42. Se ha presentado previamente que como la IL-6, la IL-27 induce la expresion de SOCS3 en celulas T CD4+27,37 y se ha propuesto que esta actividad explica la capacidad de IL-27 para inhibir la
produccion de IL-237. Para explorar el p°sible papel de esta ruta sobre la capacidad de IL-27 para inhibir la actividad
de Th-17, se usaron ratones gp130Y757F, que expresan una mutacion hipermorfica en gp130 ; en estos ratones transgenicos, gp130 silvestre se ha reemplazado por una version en la que el residuo Tyr757 se reemplaza por fenilalanina. Estudios previos han asociado este residuo con la union de SOCS3 y SHP2, y de acuerdo con esta observacion esta sustitucion da como resultado la hiperactivacion de STAT3 mediada por IL-6 y la activacion impedida de la ruta Ras-ERK44.
Celulas T procedentes de los ratones gp130Y757F estimulados con IL-6 daban como resultado una fosforilacion exagerada y prolongada de STAT3 (Panel C de la Figura 6 y datos no mostrados). El maximo de fosforilacion de STAT3 se produda en 1 h y permaneda elevado en las celulas T gp130Y757F T despues de 24 h (Panel C de la Figura 6 y datos no mostrados). Posteriormente, se aislaron celulas T CD4+ de ratones gp130Y757F y controles de companeros de camada WT y se hicieron crecer bajo condiciones inductoras de Th-17 durante 4 dfas seguido por una medida de la IL-17 intracelular. En estos experimentos, esta mutacion en gp130 condujo a un incremento en un factor de 3 en la frecuencia de las celulas IL-17+ sin reestimulacion con PMA e ionomicina (Panel D de la Figura 6) aunque este efecto era menos evidente cuando se usaba estimulacion con PMA e ionomicina (Figura 10). El analisis de sobrenadantes de cultivo revelaba que las celulas T CD4+ gp130Y757F secretaban cinco veces mas IL-17 que las celulas T CD4+ WT (Panel E de la Figura 6). Esos datos establecen que la produccion de SOCS3 mediada por IL-6 limita la capacidad de IL-6 para promover IL-17 y estan de acuerdo con el informe reciente de un papel para SOCS3 como un regulador negativo de la produccion de IL-17 inducida por IL-2345. No obstante, la adicion de IL-27
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antagonizaba la produccion de IL-17 por las celulas Th-17 gp130Y757F con o sin reestimulacion con PMA e ionomicina (Panel D de la Figura 6 y Figura 10) y la IL-27 era capaz de reducir los niveles de IL-17 secretada por celulas T CD4+ mutantes y WT de un modo dependiente de la dosis (Panel E de la Fig. 6). Finalmente, para examinar directamente el papel de SOCS3 en la limitacion de la produccion de IL-17 por IL-27, se usaron ratones Cre MMTVSocsfl/fl con una supresion condicional de Socs3 en celulas T CD4+. Cuando las celulas T CD4+ CreMMTVSocsfl/fl se hadan crecer bajo condiciones inductoras de Th-17 en presencia de IL-27, la produccion de IL-17 todavfa se inhida (Panel F de la Figura 6). Conjuntamente, esos resultados indican que la capacidad de IL-27 para inhibir la produccion de IL-17 no se podfa atribuir a una moderacion mediada por SOCS3 de la senalizacion de gp130-IL-6.
IL-27 inhibe la produccion de IL-17 a traves de STAT1
Aunque IL-6 e IL-27 son citocinas estrechamente relacionadas y compartes la senalizacion mediada por gp130, los datos presentados hasta ahora demuestran que tienen efectos opuestos sobre la produccion de IL-17. Esa conclusion implica que las senales inhibidoras procedentes de IL-27 estan mediadas a traves de los componentes espedficos de IL-27R, y aunque IL-6 activa STAT3 predominantemente, varios estudios han ligado la cadena de IL- 27R unica a la activacion de STAT1 y la induccion posterior del factor de transcripcion T-bet32,33. Por lo tanto, a fin de determinar si la capacidad de IL-27 para inhibir la produccion de IL-17 implicaba a estos factores de transcripcion, celulas T CD4+ procedentes de ratones bien Statl-l- o bien Tbx21-l- (deficientes en T-bet) se estimularon bajo condiciones inductoras de Th-17 en presencia o ausencia de IL-27. Como anteriormente, la adicion de IL-27 daba como resultado una notable inhibicion de la produccion de IL-17 por celulas T CD4+ WT y deficientes en T-bet, pero el efecto estaba comprometido en ausencia de STAT1 (Panel A de la Figura 7). Esos datos identifican un papel dominante de STAT1 en la capacidad de IL-27 para antagonizar la funcion de Th-17.
Para examinar el papel de STAT1 in vivo, ratones Stat1-l- fueron infectados agudamente con T. gondii y se verifico la produccion de IL-17. La reestimulacion de esplenocitos con STAg el dfa 7 despues de la infeccion mostraba que los esplenocitos Stat1-l- secretan mas IL-17 que sus homologos WT (Panel B de la Figura 7). Aunque de acuerdo con los datos in vitro, los datos in vivo se tienen que interpretar con precaucion debido a que los ratones Stat1-l- son incapaces de controlar la replicacion de parasitos46; y sin embargo los resultados son similares a estudios con EAE7 que previamente proporcionaron in vivo una evidencia de la inhibicion de la actividad de Th-17 mediada por STAT1.
Analisis
Recientemente, un unico subgrupo de celulas T se ha ligado a la produccion de IL-17, TNF y IL-6 se han relacionado con el desarrollo de la patologfa observada en modelos de esclerosis multiple, enteropatfa inflamatoria y artritis reumatoide3-7. Aunque las respuestas de Th-17 aberrantes se asocian con autoinmunidad, tambien tienen un papel en la resistencia aguda a la excitacion con los patogenos klebsiella y toxoplasma47-49, pero en esas situaciones las respuestas de Th-17 no conducen a autoinmunidad. La implicacion de esos resultados, de forma similar a lo que se conoce para la mayona de las respuestas de celulas T, es que existen mecanismos para regular apropiadamente la actividad de Th-17; no hay una evidencia clara de que se requieran IFN-y e IL-4 para que otras celulas T cooperadoras antagonicen a celulas Th-173,13,40,41.
Los resultados de la presente mostraban que ratones Il27ra-/- infectados cronicamente con T. gondii desarrollan neuropatologfa grave mediada por celulas T CD4+, asociada con la produccion anormal de celulas T de IL-17, IL-6 y TNF, lo que indica un papel para la IL-27 en la regulacion de la actividad de Th-17. Los efectos supresores de IL-27 sobre las celulas Th-17 se demostraron mediante experimentes en los que IL-27 inhida la produccion de IL-17 por BMNC procedentes de ratones infectados cronicamente estimulados con IL-23, asf como celulas T cD4+ transgenicas para TCR y celulas T CD4+ y CD8+ derivadas del bazo. Esos resultados indican que es probable que la IL-27 regule las celulas Th-17 en otras zonas de inflamacion.
Segun se destaco anteriormente, IL-6 e IL-27 son citocinas estrechamente relacionadas que senalan ambas a traves de gp130 y sus efectos celulares estan mediados a traves de la activacion de la ruta JAK-STAT8,52, y sin embargo tienen muchos efectos diferentes sobre la actividad de Th-17. Un informe reciente ha ligado la activacion inducida por IL-23 de STAT3 a la promocion de la produccion de celulas T CD4 de IL-17 , un hallazgo coherente con la capacidad de IL-6, un activador principal de STAT3, para promover la actividad de Th-17. De forma similar, la observacion de que las celulas T gp130Y757F producen cantidades elevadas de IL-17 esta de acuerdo con modelos actuales que indican que SOCS3 es parte de un bucle de retroalimentacion negativa clasico que limita la senalizacion mediada por IL-6. Sin embargo, aunque IL-27 activa SOCS327,37 la capacidad de IL-27 para reducir la actividad de Th-17 en ausencia de IL-6 y en las celulas T CD4+ deficientes en gp130Y757F o SOCS3 indica que tiene efectos inhibidores distintos de simplemente antagonizar la senalizacion mediada por IL-6.
Aunque los informes iniciales se enfocaron a las actividades proinflamatorias de IL-27, existe un reconocimiento creciente de que IL-27 antagoniza respuestas patologicas de celulas T. Estudios recientes que muestran que IL-27 inhibe la produccion de celulas T cooperadoras de IL-2 han proporcionado percepciones de sus posibles actividades
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antiinflamatorias27. Por otra parte, la capacidad de IL-27 para disminuir la produccion de IL-17 en presencia de IL-2 endogena indica que la disminucion de la actividad de Th-17 no es simplemente una consecuencia de los niveles reducidos de IL-2 (Figura 11). En efecto, algunos datos sugieren que IL-2 promueve preferentemente respuestas de IFN-y y no de IL-17.
Los datos presentados en la presente demuestran que IL-27 emplea STAT1 para suprimir la produccion de IL-17 por celulas T CD4+ y CD8+, un efecto que es independiente de T-bet. Esa observacion contrasta con un informe previo de que la inhibicion por IL-27 de la produccion de IL-2 era independiente de STAT127. Aunque la activacion de STAT1 por IFN-y o IL-27 se ha asociado predominantemente con el desarrollo de respuestas de Th1, los presentes datos destacan que esta ruta de senalizacion tambien media en las actividades antiinflamatorias. Esta conclusion es apoyada por la observacion del desarrollo intensificado de celulas Th-17 in vivo en ratones Stat1-/'7'54 y por el hecho de que la neutralizacion de IFN-y promueve la produccion de IL-173,40,41. Por otra parte, la hipotesis de que IL-27 media en la activacion de STAT1 representa una ruta inhibidora endogena de celulas T productoras de IL-17 en el SNC puede explicar el hallazgo de que los ratones Stat1-/- desarrollen EAE mas grave55. Aunque el ultimo hallazgo se ha atribuido a la falta de senalizacion de IFN-y8, parece probable que tambien pueda ser funcion de la actividad reducida de IL-27. En la actualidad, se desconoce la base molecular de los efectos inhibidores de STAT1 en diferentes sistemas experimentales, y sin embargo continua aumentando la bibliograffa que destaca el papel de diversos STAT en la represion de respuestas inmunitarias56,57.
La inhibicion de la produccion de IL-17 por p28 sola provoca varias preguntas acerca de la biologfa de como esta protema se une a su receptor y transduce sus efectos inhibidores. Una posibilidad es que la secrecion de p28 se pueda dimerizar con EBI3 disponible constitutivamente conduciendo a la formacion de iL-27 o p28 pueda senalizar en trans de un modo similar a IL-619. Aunque ninguna de las actividades inmunoestimulantes de IL-27 se ha atribuido previamente a p2814, una mejor comprension de la biologfa de esta protema secretada puede proporcionar una percepcion de modo en los que se puede usar terapeuticamente. Los hallazgos presentados en la presente sugieren una pertinencia de la senalizacion de p28 por sf misma y la importancia de IL-27 como un antagonista fisiologico de la actividad de Th-17. Aunque se ha descubierto una fuerte evidencia de que el bloqueo de la actividad de IL-17 mejora la enfermedad en una variedad de trastornos autoinmunitarios3,50,51, 8, la neutralizacion de IL-17 elige como diana espedficamente las citocinas aguas abajo de la actividad de Th-17. En contraste, la estimulacion por IL-27 y/o su subunidad p28 puede antagonizar directamente celulas Th-17 espedficas para un antfgeno y proporcionar una oportunidad de elegir como diana espedficamente fuentes celulares de IL-17, que pueden proporcionar un enfoque mas eficaz para el tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunitarias.
Metodos
Ratones y parasitos
Los ratones C57BL/6 se obtuvieron de Jackson laboratories y los ratones WSX-1-/- (Il27ra-l-) fueron proporcionados por el Dr. Christiaan Saris (Amgen Inc.). Los ratones DO11.10 transgenicos con un TCR espedfico para el peptido de ovoalbumina de pollo (OVA(323-339)) en el contexto de I-Ad, los ratones Statl-l- y los ratones Tbx21-l- fueron proporcionados por el Dr Phillip Scott (University of Pennsylvania, Filadelfia, PA). Los ratones gp130Y757F y CreMMTVSocs3fl/fl se habfan descrito previamente4345. Los ratones se alojaron y se criaron en instalaciones libres de patogenos espedficas en the Department of Pathobiology at the University of Pennsylvania segun las directrices institucionales.
La cepa Me49 de T. gondii se preparo a partir de ratones CBA/ca infectados cronicamente y los animales experimentales se infectaron intraperitonealmente con 20 quistes. A los ratones Il27ra-l- se les administraron 200 qg de CTLA4-Ig (Bristol Meyers Squibb) intraperitonealmente el dfa 7 y 10 despues de la infeccion o se trataron el dfa 5 despues de la infeccion con 200 mg/l de sulfadiazina (Sigma) en su agua de bebida durante dos semanas. El antfgeno toxoplasmico soluble (STAg) se preparo a partir de taquizoitos de la cepa RH segun se describe previamente59. Para los examenes histologicos, los hugados, los pulmones y los cerebros se recogieron de los animales, se fijaron con formalina al 10%, se embebieron en parafina, se seccionaron y se tineron con hematoxilina y eosina. Para determinar la activacion de astrocitos, las secciones de cerebro se tineron con respecto a GFAP segun se describe previamente30. Para medir la carga de parasitos, el gen B1 de T. gondii 35 veces repetitivo se amplifico mediante PCR en tiempo real usando mezcla SYBR® Green PCR Master (Applied Biosystems) en un aparato de PCR en tiempo real rapida AB7500 (Applied Biosystems) usando las condiciones descritas previamente30. A fin de normalizar los valores de Ct obtenidos a partir de las muestras experimentales, el gen de p- actina de raton se amplifico bajo las mismas condiciones30.
Analisis de celulas mononucleares cerebrales (BMNC)
El aislamiento de BMNC de ratones WT e Il27ra-l- infectados cronicamente se realizo segun un protocolo descrito previamente30,60. Las celulas se procesaron para la tincion superficial y la tincion intracelular ex vivo segun se describe previamente27. Las celulas se tineron superficialmente usando anticuerpos contra CD4, CD8, CD44, CD45,
I-A/I-E (BD Pharmingen), CD62L y CD11b (eBioscience). Las celulas T se tineron intracelularmente usando anticuerpos contra IL-17 (BD Pharmingen), IFN-y y TNF (eBioscience). Las muestras se adquirieron en un citometro de flujo FACScaliber (Becton Dickenson) y los resultados se analizaron usando el software FloJo (TreeStar Inc.). Las BMNC se sembraron a una densidad final de 2 x 104 5 celulas por pocillo en un volumen final de 200 jl en placas de 5 fondo redondo de 96 pocillos (Costar). Las celulas se estimularon con o sin STAg (50 jg/ml) en presencia o ausencia de mIL-27 (l0o ng/ml; Amgen Inc.), IL-23 (10 ng/ml; DNAX) recombinantes o ambas. Los sobrenadantes se recogieron despues de 48 h y los niveles de IL-2, IFN-y, IL-12, IL-17, TNF e IL-6 se midieron mediante ELISA. Los niveles de oxido mtrico (NO) se midieron mediante el uso de un ensayo de Greiss.
Analisis por PCR cuantitativa en tiempo real
10 Se aislo ARN celular total de cerebros perfundido y homogeneizados de ratones WT e Il27ra-l- infectados cronicamente asf como ratones WT no infectados usando procedimientos estandar y se convirtio en ADNc segun se describe26. Ademas, se aislo ARN total de cultivos de astrocitos primarios C57BL/6 WT y se uso para elaborar ADNc. Los astrocitos primarios se recogieron de los cerebros de ratones de 1-3 dfas de edad segun se describio previamente30, y la pureza de los cultivos de astrocitos segun se juzgaba mediante tincion de protemas acidas 15 fibrilares gliales (GFAp) (anti-mouse GFAP, BD Pharmingen) era consecuentemente mayor de 90%. La expresion de TNF, IL-6, IL-27p28 y EBI3 se determino usando cebadores obtenidos de Qiagen y se llevo a cabo en un aparato de PCR en tiempo real rapida AB7500 usando reactivos Power Sybr green® (Applied Biosystems). La expresion de IL- 17 se determino usando cebadores, sonda y reactivos Taqman® obtenidos de Applied Biosystems. El gen constitutivo de p-actina se uso como un control de normalizacion en ambos casos.
20 Generacion de celulas Th-17
Se produjeron celulas T CD4+ y CD8+ productoras de IL-17 segun se describe en otras partes11,40 con cambios modificados. Brevemente, esplenocitos aislados de los susodichos ratones se agotaron de celulas CD8+ y NK1.1 + para enriquecer con respecto a celulas T CD4+ o se agotaron de celulas CD4+ y NK1.1+ para enriquecer con respecto a celulas T CD8+ mediante separacion con cuentas magneticas (Polysciences). Las celulas se sembraron 25 en placas de 96 pocillos (Costar) con una densidad de 5 x 106 celulas/ml. Las celulas T CD4+ Tg se estimularon con 5 jg/ml de peptido de OVA, mientras que las otras celulas T se estimularon con anticuerpo anti-TCR (anti-CD3; 1 jg/ml; eBioscience) y anti-CD28 (1 jg/ml; eBioscience). Para la produccion de celulas Th-17 los cultivos se complementaron bien con IL-23 de raton recombinante (10 ng/ml; DNAx) o bien con TGF-p humano (1 ng/ml; R & D) solo o en combinacion con IL-6 (10 ng/ml; eBioscience), TNF (10 ng/ml; eBioscience) e IL-1p (10 ng/ml; BD 30 Pharmingen). Adicionalmente, IFN-y e IL-4 se neutralizaron en los cultivos usando anti-IFN-Y (10 jg/ml; clon XMG1.2) y anti-IL-4 (10 jg/ml; clon 11B11). Cuando estuviera indicado, se anadio IL-27 recombinante (100 ng/ml; Amgen). La p28 recombinante fue proporcionada por eBioscience y se uso a una concentracion de 100 ng/ml cuando estuviera indicado. Las celulas T CD8+ se recogieron el dfa 3, mientras que las celulas T CD4+ se complementaron con medio y reactivos recientes el dfa 3 y se recogieron el dfa 4. Ambos tipos de celulas se tineron 35 posteriormente con respecto a IL-17, TNF e IFN-y intracelulares en presencia o ausencia de estimulacion con PMA e ionomicina mas Brefeldin A (Sigma).
Estadfstica
Se uso una prueba de la t de Student desapareada para determinar diferencias significativas y un valor de P < 0,05 se consideraba significativo.
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Ejemplo 2: el WSX-1 soluble intensifica la inhibicion de la produccion de IL-2 por IL-27
Se aislaron esplenocitos totales de dos ratones Il27ra-/- (WSX-1 KO1 y WSX-1 KO2). Los esplenocitos se agotaron de celulas NK1.1+ y CD8+ para enriquecer con respecto a celulas T CD4+. Las celulas T CD4+ se etiquetaron a continuacion con CFSE (ester succinimidflico de carboxifluorescema) y se estimularon anticuerpo anti-CD3 y anticuerpo anti-CD28. Se anadio IL-27 con o sin la protema de sIL-27R Fc (un polipeptido de WSX-1 soluble, una protema de fusion de Fc que incluye la secuencia extracelular del dominio WSX-1, proporcionada por Amgen Inc.) a los pocillos que conteman las celulas. La protema de sIL-27R Fc se incubo durante 30 minutos con IL-27 antes de la adicion a los pocillos con celulas para facilitar la union. Las celulas se incubaron durante 48 h a 37°C. Los sobrenadantes se usaron en ensayos ELISA para medir la produccion de IL-2 e IFN-y (Figura 12).
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La adicion de la protema de fusion de WSX-1 soluble sIL-27R Fc potenciaba la inhibicion de la produccion de IL-2 e IFN-y por IL-27. Los resultados demuestran que el receptor soluble puede funcional en ausencia de receptor endogeno e indican que el receptor puede trabajar en trans.
Ejemplo 3: un papel fundamental para la activacion mediada por interleucina 27 e IL-6 de STAT3 en la produccion de lL-10 por celulas T
La IL-10 tiene un papel predominante en la regulacion del equilibrio entre respuestas de celulas T protectoras y patologicas. De acuerdo con esta actividad, existen multiples fuentes de esta citocina incluyendo celulas mieloides asf como una variedad de subgrupos de celulas T. Sin embargo, aunque existen muchas rutas para regular la produccion innata de IL-10, los factores que gobiernan su produccion mediante la respuesta adaptiva son poco entendidos. Los estudios presentados en este ejemplo revelan que IL-27 e IL-6 son capaces de inducir una variedad de poblaciones de celulas T para producir IL-10. Este efecto depende de los factores de transcripcion STAT1 y STAT3 para IL-27, y STAT3 para IL-6. Conjuntamente, estos estudios identifican una nueva ruta que permite que el sistema inmunitario modere las respuestas inflamatorias.
La L-10 fue descrita inicialmente con una citocina asociada a Th2 que inhida la produccion de celulas IFN-y Th11,2 Mas tardes se supo que esto era un efecto indirecto y que su capacidad para moderar la funcion de celulas Th1 se deda a su capacidad para antagonizar una actividad celular accesoria. Asf, IL-10 reduda la capacidad de los macrofagos para producir citocinas proinflamatorias tales como IL-1, TNF e IL-12, y disminrna la expresion de moleculas coestimulantes y del MHC requeridas para respuestas de celulas T3-9. Aunque IL-10 tiene una variedad de propiedades biologicas, uno de sus principales papeles in vivo es limitar respuestas inflamatorias, de acuerdo con sus efectos inhibidores sobre celulas que presentan antigenos. Esta funcion se destaco en primer lugar en los informes iniciales que revelaban que los ratones IL-10-/- desarrollaban espontaneamente enteropatfa inflamatoria (IBD)10. Estudios posteriores usando modelos en ratones de septicemia, enfermedad infecciosa y autoinmunidad han ampliado la comprension del papel de IL-10 en la regulacion de respuestas innatas y adaptivas asociadas con las actividades de Th1, Th2 y Th17 . En el contexto de una enfermedad infecciosa, existen varios ejemplos de como
la ausencia de IL-10 conduce a una resistencia a patogenos intensificada, pero tambien da como resultado el desarrollo de una respuesta inflamatoria aberrante que puede matar al hospedador14-16 Conjuntamente, estos estudios ilustran el papel fundamental de IL-10 en el mantenimiento de un equilibrio entre la inmunidad protectora y el desarrollo de la patologfa.
Dado el importante papel de IL-10 en la limitacion de la inflamacion, quiza no sea sorprendente que haya multiples fuentes de este modulador inmunitario, incluyendo macrofagos y celulas dendnticas estimulada con productos microbianos. Ademas, aunque IL-10 se caracterizo inicialmente como una citocina Th21,2, se sabe ahora que las celulas Tr117, las celulas T reguladoras CD25+18, 19 y CD25- (Treg)20, 21 y las celulas Th122, 23 tambien secretan IL-10. La importancia relativa de estos diferentes subgrupos como fuentes de IL-10 ha sido una cuestion antigua24, 25, pero en los ultimos anos la ligazon entre celulas Treg e IL-10 ha dominado esta area de investigacion. No obstante, existe una bibliograffa establecida sobre la presencia de celulas cooperadoras T IFN-Y+IL-10+ en una variedad de entornos de enfermedad26, 27, y varios estudios recientes han destacado la importancia de la supresion inmunitaria dependiente de IL-10 por celulas T CD4+CD25-Foxp3- que tambien producen IFN-y durante la infeccion con T. gondii y en modelo no curativo de Leishmania major28, 29 No obstante, a pesar de la amplia evidencia de la importancia de la IL-10 derivada de celulas T para limitar la inflamacion, los episodios que inducen la produccion de esta citocina por celulas T han seguido sin estar claros24, 25
La IL-10 no es el unico mediador antiinflamatorio usado por el sistema inmunitario para controlar la inflamacion, y la lista de rutas (CTLA4, BTLA, PD1) implicadas en este proceso continua creciendo. Recientemente, la citocina IL-27, una citocina heterodfmera compuesta por protema inducida por Epstein-Barr 3 (EBI3) y p28 30, se ha descrito como un antagonista de varias funciones de celulas T. Esta citocina se identifico inicialmente como un factor que promueve el desarrollo de celulas Th1 31, 32, pero informes posteriores destacaron que la IL-27 tambien puede limitar respuestas de Th1, TH2 y Th17 implicadas en diversos modelos de infeccion y autoinmunidad32-4 . En efecto, estudios en estos laboratorios revelaban que, como los ratones IL-10-/-, los ratones IL-27ra-/- infectados con T. gondii desarrollaban una respuesta mediada por celulas T CD4+ letal que se caracterizaba por una produccion excesiva de citocinas proinflamatorias, grandes areas de necrosis en el hugado y la presencia de infiltrados intensos de celulas inmunitarias en multiples organos14, 33, 38, 41, 42 Las similitudes de estos fenotipos no solo destacan el importante papel que representan estas citocinas antiinflamatorias en la regulacion de una respuesta inmunitaria en marcha, sino que tambien sugieren una relacion potencial entre estos dos moduladoras inmunitarios.
A fin de comprender mejor el efecto de IL-27 sobre las celulas T, se ensayo la produccion de 67 mediadores inmunitarios solubles en presencia o ausencia de IL-27. Este analisis revelaba que aunque IL-27 inhida multiples citocinas asociadas con celulas Th1, Th2 y Th17, sorprendentemente, tambien promovfa la produccion de IL-10. Esta observacion se reflejaba in vivo ya que las celulas T procedentes de ratones IL-27ra-/- infectados cronicamente con T. gondii ternan un defecto en su capacidad para elaborar IL-10. Estudios in vitro revelaban que IL-27 podfa intensifican la produccion de IL-10 por celulas T CD4+ y CD8+, pero la mayoria de las celulas T IL-10+ inducidas por
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IL-27 no expresaba Foxp3 indicando que la IL-27 puede estimular la produccion de IL-10 por multiples poblaciones de celulas T. Por otra parte, la estimulacion de celulas T con IL-27 mas TGF-p daba como resultado un efecto aditivo sobre IL-10, e IL-6 (que como IL-27 senala a traves de gp130) cuando se combinaba con TGF-p tambien era un potente inductor de IL-10. La capacidad de IL-27 para estimular la produccion de IL-10 era independiente de la molecula de senalizacion intracelular STAT4 y el factor de transcripcion T-bet, pero era dependiente de la activacion de STAT1 y STAT3, mientras que la IL-6 solo requiere STAT3. Colectivamente, estos datos proporcionan una nueva perspectiva en el entorno de las citocinas que promueve la produccion de IL-10 por celulas T y los episodios moleculares que apuntalan esta ruta reguladora.
Resultados
IL-27 induce la produccion de IL-10 por celulas T
Aunque estudios recientes han destacado la capacidad de IL-27 para inhibir la produccion por celulas T de multiples citocinas proinflamatorias38, 43, sena de interes un cribado que pudiera identifican dianas adicionales para IL-27. Por lo tanto, celulas T CD4+ vfrgenes procedentes de ratones C57BL/6 se activaron con anticuerpos anti-TCR (a-CD3) y a-CD28 en presencia de celulas accesorias bajo condiciones no polarizantes (a-IFN-Y y a-IL-4) en presencia o ausencia de IL-27. Despues de que las celulas se cultivaran durante tres dfas los sobrenadantes se ensayaron con respecto a un conjunto de 67 productos inmunitarios secretados usando un Rodent Multi-Analyte Profile (RodentMAP™). De acuerdo con informes previos, la adicion de IL-27 a estos cultivos no polarizados condujeron a disminuciones en multiples citocinas asociadas con respuestas de Th1 (IFN-y), Th2 (IL-5) y Th17 (IL-17) pero tambien inclrnan GM-cSf, IL-1p, IL-3, MIP-1a y -p y linfotactina (Panel A de la Figura 14). Ademas, varias otras citocinas incluyendo IL-18, IL-6, IL-7 y quimocinas incluyendo MCP-1, MCP-3, M-CSF, MmP-9 no se alteraban mediante este tratamiento (Tabla 2). Sin embargo, el resultado mas sorprendente era la observacion de que la IL-27 conduda a un incremento de 1.000 veces en los niveles de IL-10 en estos sobrenadantes de cultivo (Panel A de la Figura 14 y Tabla 2).
Tabla 2. Resultados de MAP en roedores.
pg/ml
No polarizante
IL-27
Apo A1 (Apolipoprotema A1)
1,2E+05 1,3E+05
Microglobulina Beta-2
<BAJO> <BAJO>
Calbindina
51 51
Clusterina
19000 19000
CRP (Protema Reactiva C)
<BAJO> <BAJO>
Cistatina-C
64000 53000
EGF (Factor de Crecimiento Epidermico)
3,7 2,8
Endotelina-1
8 5
Eotaxina
4,4 3
Factor VII
480 330
FGF-9 (Factor de Crecimiento de Fibroblastos 9)
550 460
FGF-basico (Factor de Crecimiento de Fibroblastos basico)
800 470
Fibrinogeno
1,70E+06 1,20E+06
GCP-2 (Protema Quimiotactica de Granulocitos 2)
5,4 4,4
GM-CSF
272 96
Hormona del Crecimiento
<BAJO> <BAJO>
GST-alfa (Glutationa S-Transferasa alfa)
<BAJO> <BAJO>
GST-Mu
8700 6600
Haptoglobina
3,10E+05 2,90E+05
IFN-gamma (Interferon-gamma)
765 342
IgA (Inmunoglobulina A)
1,6E+05 1,2E+05
IL-10 (Interleucina-10)
303 3480
pg/ml
No polarizante
IL-27
IL-11 (Interleucina-11)
14 13
IL-12p70 (Interleucina-12p70)
<BAJO> 9,9
IL-17 (Interleucina-17)
1900 820
IL-18 (Interleucina-18)
180 130
IL-1 alfa (Interleucina-lalfa)
12 11
1L-1beta (Interleucina-lbeta)
430 380
IL-2 (Interleucina-2)
638 570
IL-3 (Interleucina-3)
205 93
IL-4 (Interleucina-4)
8,8 <BAJO>
IL-5 (Interleucina-5)
1600 670
IL-6 (Interleucina-6)
14 15
IL-7 (Interleucina-7)
17 23
Insulina
1,3* 1,2*
IP-10 (Protema Inducible 10)
108 121
KC/GROalfa
<BAJO> <BAJO>
Leptina
42 21
LIF (Factor Inhibidor de Leucemia)
2410 2580
Linfotactina
1690 749
MCP-1 (Protema Quimioatrayente de Monocitos 1)
12 9
MCP-3 (Protema Quimioatrayente de Monocitos 3)
8,9 7,5
MCP-5 (Protema Quimioatrayente de Monocitos 5)
1,9 0,62
M-CSF (Factor Estimulantes de Colonias de Macrofagos)
17 13
MDC (Quimocina Derivada de Macrofagos)
1450 429
MIP-1alfa (Protema Inflamatoria de Macrofagos 1 alfa)
1300 410
MIP-1beta (Protema Inflamatoria de Macrofagos 1beta)
1540 1340
MIP-1gamma (Protema Inflamatoria de Macrofagos 1gamma)
170 110
MIP-2 (Protema Inflamatoria de Macrofagos 2)
33 14
MIP-3beta (Protema Inflamatoria de Macrofagos 3beta)
380 190
MMP-9 (Metaloproteinasa de Matriz 9)
750 890
MPO (Mieloperoxidasa)
400 540
Mioglobina
<BAJO> <BAJO>
NGAL (Lipocalina 2)
9900 6700
OSM (Oncostatina M)
82 98
Osteopontina
170 270
RANTES
46 22
SAP (Amiloide Serico P)
<BAJO> <BAJO>
SCF (Factor de Celulas Madre)
17 14
SGOT (Transaminasa Glutamica-Oxaloacetica Serica)
<BAJO> <BAJO>
TIMP-1 (Inhibidor Tisular de Metaloproteinasa Tipo 1)
120 160
Factor Tisular
1700 920
TNF-alfa (Factor de Necrosis Tumoral alfa)
700 1000
TPO (Trombopoyetina)
1800 470
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pg/ml
No polarizante
IL-27
VCAM-1 (Molecula de Adhesion de Celulas Vasculares 1)
1400 1300
VEGF (Factor de Crecimiento de Celulas Endoteliales Vasculares)
2810 2460
vWF (Factor de von Willebrand)
190 230
<BAJO> los valores reflejan muestras no medibles en la curva estandar * ulU/ml
Un analisis adicional usando tincion intracelular revelaba que cuando se estimulaban bajo condiciones similares despues de la reestimulacion con 12-miristato 13-acetato de (PMA) e ionomicina, habfa un pequeno porcentaje de celulas T CD4+ y CD8+ IL-10+, pero la adicion de IL-27 conduda a un incremento notable en este porcentaje de (Paneles B y C de la Figura 14). Aunque estos resultados indican que un numero similar de celulas T CD4+ y CD8+ elaboraban IL-10 en respuesta a IL-27, la cantidad de IL-10 en el sobrenadante procedente de los cultivos enriquecidos en celulas T CD4+ era superior que la observada para los cultivos que conteman las celulas T CD8+, de acuerdo con diferencias en la intensidad fluorescente media (MFI) (Paneles B y C de la Figura 14). Por consiguiente, la mayona de los estudios presentados en este ejemplo se enfocaban a celulas T CD4+ como una fuente de IL-10.
El IL-27R se requiere para la produccion optima de IL-10 por celulas T in vitro e in vivo
Los estudios descritos anteriormente indicaban que la IL-27 podfa intensificar la produccion de IL-10 por celulas T. Para evaluar el papel del IL-27R en estos episodios, esplenocitos procedentes de ratones WT o Il-27ra-/- se activaron bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27, y se ensayo la IL-10. Mientras que las celulas procedentes de ratones WT secretaban niveles intensificados de IL-10 en respuesta a IL-27, esto no se observaba en los cultivos procedentes de ratones Il-27ra-/- (Panel A de la Figura 15). En efecto, incluso los niveles basales de IL-10 en estos sobrenadantes se redudan en comparacion con los controles WT. Para evaluar si IL- 27/IL-27R estaba implicada en la regulacion de respuestas inflamatorias in vivo, se uso un sistema experimental en el que ratones WT e Il-27ra-/- se infectaban cronicamente con T. gondii38 En estos estudios, la reestimulacion de preparaciones de celulas mononucleares cerebrales (BMNC) y esplenocitos procedentes de ratones WT infectados cronicamente ex vivo revelaba la presencia de celulas T CD4+ que producen IL-10. En contraste, cuando ser usaban celulas procedentes de los cerebros y los bazos de ratones Il-27ra-/- infectados cronicamente, habfa un defecto notable en IL-10 (Panel B de la Figura 15). A la inversa, la reestimulacion de BMNC silvestres con STAg en presencia de IL-27 daba como resultado un aumento significativo de IL-10 (Panel C de la Figura 15). Estos resultados sugieren colectivamente un papel predominante para IL-27 y el IL-27R en la promocion de la produccion de IL-10 por celulas T in vitro y en el entorno de una inflamacion inducida por infeccion cronica asociada con T. gondii.
La IL-27 induce la produccion de IL-10 bajo condiciones Th1 y Th2 pero no Th17
Aunque los estudios descritos anteriormente se realizaron bajo condiciones neutras, los datos procedentes de ratones infectados con T. gondii implican un papel para la IL-27 en el desarrollo de productores de IL-10 durante una respuesta dominada por Th1. Por lo tanto, se realizaron estudios in vitro adicionales para determinar en que punto despues de la activacion de celulas T se produda IL-10 y para evaluar la capacidad de IL-27 para promover IL-10 bajo condiciones que favoredan el desarrollo de celulas Th1, Th2 o Th17. El analisis de la produccion de IL-10 por celulas T CD4+ a lo largo de un periodo de cuatro dfas en respuesta a IL-27 revelaba que las celulas comenzaban a elaborar IL-10 48 horas despues de la activacion y que los numeros de celulas IL-10+ alcanzaban el maximo a las 72 horas y se mantema a lo largo de 96 horas (Panel A de la Figura 16). Ademas, las celulas se etiquetaban con CFSE para determinar si las celulas T productoras de IL-10 generadas por IL-27 eran activamente proliferantes o parte de una poblacion de celulas T no replicante. Segun se muestra mediante dilucion con CFSE, solo las celulas CFSE dim elaboraban IL-10 en respuesta a IL-27. Este hallazgo esta de acuerdo con modelos en los que se requiere la proliferacion para que las celulas T adquieran produccion de citocinas44 Ademas, el patron de produccion de IL-10 en estos experimentos se correlaciona con el perfil de expresion del IL-27R sobre celulas T recientemente activadas45.
De acuerdo con informes previos23, bajo condiciones Th1 (IL-12 mas a-IL-4) habfa numeros bajos de celulas T CD4+ que elaboraran IL-10, pero la adicion de IL-27 daba como resultado un incremente en el porcentaje de celulas que se teruan positivamente con respecto a IL-10 (Panel B de la Figura 16). Bajo condiciones Th2 (IL-4 mas a-IFN-Y) habfa un numero considerable de celulas T CD4+ IL-10+, de forma similar a informes previos, y la adicion de IL-27 daba como resultado un incremento notable en el porcentaje y la MFI para la tincion de lL-10. Sorprendentemente, la polarizacion de celulas T CD4+ bajo condiciones Th17 (TGF-p mas IL-6) daba como resultado la presencia de la mayor poblacion de celulas T que produdan IL-10 cuando se comparaba con todas las otras condiciones. Sin embargo, cuando se anadfa lL-27, no habfa un incremento adicional en IL-10 (Panel B de la Figura 16).
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Conjuntamente, estos datos indican que la capacidad de IL-27 para promover la produccion de IL-10 es la mas destacada bajo condiciones Th1 y Th2 pero no Th17.
Efectos de IL-27 sobre productores de citocinas dobles
Aunque IL-27 puede promover la produccion de IL-10 bajo condiciones Th1 y Th2, y hada una proporcion significativa de celulas T CD4+ IL-10+ despues de la polarizacion Th17, no estaba claro si estas celulas IL-10+ tambien produdan citocinas de firma asociadas con estos subgrupos Th. Por lo tanto, las celulas T CD4+ se estimularon bajo condiciones Th1, Th2 y THi7 y la tincion intracelular con respecto a IL-10 se combino con IFN-y, IL- 13 o IL-17, respectivamente. Cuando se estimulaban bajo condiciones Th1, la mayona de las celulas T productoras de IL-10 tambien se teruan positivamente con respecto a IFN-y, pero esta poblacion de productores dobles todavfa era una minona en comparacion con las celulas que produdan solo IFN-y (Panel A de la Figura 17). La adicion de IL-27 no reduda el numero de celulas IFN-Y+ en lugar de dar como resultado un incremento en el porcentaje de celulas T CD4+ IFN-Y+IL-10+. Bajo condiciones TH2, aproximadamente 50% de las celulas IL-10+ tambien elaboraban IL-13 (Panel A de la Figura 17). La adicion de IL-27 incrementaba el porcentaje de celulas IL-10+ y provocaba una reduccion simultanea en el numero de celulas IL-13+IL-10+ y los productores individuales de IL-13.
Inesperadamente, el analisis de celulas T cultivadas con IL-6 mas TGF-p (Th17) para la produccion de IL-17 e IL-10 revelaba la presencia de tres poblaciones distintas de celulas T: productores individuales de IL-17 o IL-10, y una poblacion de celulas IL-17+IL-10+ (Panel A de la Figura 17). De forma similar a informes previos38, la adicion de IL- 27 inhida la expresion de IL-17, pero no incrementaba el porcentaje de celulas que expresan IL-10. En cambio, existe un incremento en la expansion de las celulas T IL-10+IL-17-. Dada la presencia de celulas accesorias en estos cultivos, era posible que la capacidad de IL-27 para inhibir la produccion de IL-17 sea resultado de su capacidad para inducir la secrecion de IL-10. Sin embargo, cuando se usaban celulas T CD4+ procedentes de ratones IL-10-/-, la IL-27 todavfa era capaz de inhibir la produccion de IL-17 (Panel B de la Figura 17).
El TGF-p intensifica la capacidad de IL-27 para conducir una poblacion de celulas T CD4+ IL-10+
El hallazgo de que las celulas Th17 produdan niveles significativos de IL-10 combinado con la incapacidad de IL-27 para intensificar la IL-10 bajo estas condiciones sugena que TGF-p o IL-6 tambien pueden estar implicados en la regulacion de estos episodios. El examen de los efectos de TGF-p sobre celulas T cD4+ revelaba que, a diferencia de IL-27, el TGF-p solo daba como resultado un incremento moderado en IL-10, pero cuando se combinaba con IL- 27, tema un efecto aditivo que conduda a un incremento en el porcentaje de celulas IL-10+ asf como un incremento en la MFI (Paneles A y B de la Figura 18). Ademas, aunque el TGF-p exogeno incrementaba la produccion de IL-10, la neutralizacion de TGF-p endogeno no eliminaba la capacidad de IL-27 para promover la produccion de IL-10, sino que conduda a una reduccion moderada en el porcentaje de celulas IL-10+ (datos no mostrados).
Puesto que el TGF-p puede convertir celulas T CD4+CD25- en celulas Treg inducidas por CD4+CD25+ que expresan Foxp3 46, 4 , era posible que la inclusion de TGF-p favoreciera la expansion de Treg y que la IL-27 promoviera la secrecion por Treg de IL-10. Por lo tanto, celulas T CD4+ procedentes de ratones quimericos Foxp3GFP48 se activaron con a-CD3 y a-CD28 bajo condiciones no polarizantes en presencia de TGF-p, IL-27 o la combinacion de ambas citocinas. Despues de 72 horas de incubacion bajo condiciones no polarizantes, estaban presentes pocas celulas Foxp3GFP+ en los cultivos sin TGF-p; sin embargo, la adicion de TGF-p daba como resultado la generacion de una gran poblacion de celulas T CD4+ Foxp3GFP+ cuando menos de 10% elaboraban IL-10 (Panel C de la Figura 18). Cuando se cultivaban celulas T CD4+ en presencia de IL-27, no hada expansion de celulas Foxp3GFP+, pero 50% de las celulas Foxp3GFP+ elaboraban IL-10. Sin embargo, la mayona de las celulas T productoras de IL-10 que se generaban en respuesta a IL-27 eran Foxp3GFP- (20% frente a 1,4%). Finalmente, cuando se combinaba TGF-p con IL-27, hada una disminucion de casi 70% en el numero de celulas Foxp3GFP+ en comparacion con los cultivos que conteman TGF-p solo. Como se observa con IL-27 solo, cerca de 50% de las celulas Foxp3GFP+ elaboraban IL-10, pero la mayona de las celulas T CD4+ productoras de IL-10 segrnan Foxp3GFP-, indicando que los efectos de IL-27 sobre la produccion de IL-10 no son espedficos para Treg Foxp3+. Conjuntamente, estos datos indican que el TGF-p tiene un efecto sinergico sobre la produccion de IL-10 por celulas T CD4+ cuando se combina con IL-27, y este resultado no se debe a numeros incrementados de celulas Treg Foxp3+ en estos cultivos.
Un papel de IL-6 en la promocion de la produccion de IL-10
Aunque el TGF-p podna intensificar la capacidad de IL-27 para estimular la produccion de IL-10 solo, no podfa explicar el alto porcentaje de celulas IL-10+ presente bajo condiciones Th17. Por lo tanto, para determinar si IL-6, una citocina tipo I que comparte homologfa estructural y una subunidad reguladora con IL-27, tambien puede promover la produccion de IL-10, celulas T CD4+ se incubaron con IL-6 bajo condiciones no polarizantes. En estos experimentos, como se observa con TGF-p, la adicion de IL-6 daba como resultado solamente un incremento moderado en IL-10 (Paneles A y B de la figura 19). Sin embargo, cuando se combinaba con TGF-p, la IL-6 tema un
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efecto sinergico para promover la aparicion de una gran poblacion de celulas T CD4+ IL-10+. Puesto que la capacidad de IL-27 para regular positivamente IL-10 era la mas evidente bajo condiciones polarizantes Th1, se examino el efecto de IL-6 sobre la produccion de IL-10 bajo condiciones Th1 y Th2. A diferencia de IL-27, IL-6 no era capaz de intensificar IL-10 bajo polarizacion Th1 de seguimiento (Figura 21). En contraste, bajo condiciones de diferenciacion Th2, la adicion de IL-6 tema un efecto aditivo sobre el nivel de IL-10 que se elaboraba (Figura 21).
Un papel de Stat1 y Stat3 para la generacion de celulas T CD4+ productoras de IL-10
La activacion de protemas STAT espedfica en celulas T CD4+ es uno de los factores contribuyentes asociados con la diferenciacion de celulas T en linajes de celulas Th distintos, y se ha mostrado que IL-27 activa un numero de protemas STAT incluyendo STAT1 (y como consecuencia T-bet), STAT3 y en un menor grado STAT4 49, 50 mientras que la IL-6 activa principalmente STAT3 y en un menor grado STAT1 51, 5 . A fin de determinar la cinetica con la que IL-27 e IL-6 activan STAT1 y STAT3, celulas T CD4+ purificadas se estimularon con cada citocina a lo largo de un penodo de tres horas y se verifico la fosforilacion de estos factores de transcripcion. Estos estudios revelaban que las celulas T CD4+ tambien eran capaces de fosforilar STAT1 y STAT3 en respuesta a IL-6 e IL-27, sin embargo, la IL-6 era capaz de hacerlo a una velocidad mayor que IL-27 (Paneles C y D de la Figura 19). Aunque el numero mas alto de celulas P-STAT1+ no se observaba hasta 30 minutos despues de la estimulacion con IL-27, no habfa diferencia en el porcentaje de celulas P-STAT1+ entre el maximo de la respuesta de IL-6 e IL-27. Por otra parte, la IL-6 era un inductor tan fuerte de la fosforilacion de STAT3 que despues de 5 minutos de estimulacion aproximadamente 90% de las celulas T eran P-STAT3+, y un nivel alto de P-STAT3 se mantema a lo largo de un penodo de 3 horas. En contraste, un porcentaje mucho menor de celulas T CD4+ se tenia positivamente con respecto a P-STAT3 en respuesta a IL-27 y esta poblacion de celulas P-STAT3+ no se mantema a las 3 horas despues de la estimulacion.
Para investigar adicionalmente el papel de la ruta de senalizacion JAK-STAT en la induccion de IL-10 por IL-27, se usaron ratones deficientes en protemas STAT individuales. La capacidad de IL-27 para inhibir IL-17 se ha atribuido previamente a su capacidad para activar STAT1 38, mientras que un papel para la senalizacion de IL-27R en la promocion de la diferenciacion de Th1 se ha atribuido en gran parte a la activacion de T-bet a traves de mecanismos dependientes asf como independientes de STAT153. Por lo tanto, para determinar si la capacidad de IL-27 para promover IL-10 implicaba a estas protemas, celulas T CD4+ obtenidas de ratones Stal1-/- y Tbx21-/- (deficientes en T-bet) se estimularon bajo condiciones no polarizantes en presencia o ausencia de IL-27. Las celulas T CD4+ procedentes de ratones STAT1-/- eran incapaces de producir IL-10 en respuesta a IL-27 (Panel A de la Figura 20), mientras que la ausencia de T-bet no afectaba a la capacidad de IL-27 para promover IL-10 (Panel B de la Figura 20).
Para evaluar el papel de STAT3, celulas T CD4+ derivadas de ratones con un alelo de STAT3 “floxeado” que tambien expresa un transgen CD4-Cre (Stat3CD4-l-fA se estimularon como anteriormente en presencia o ausencia de IL-27. La retirada del alelo de STAT3 de las celulas T CD4+ reduda su capacidad para elaborar IL-10 en respuesta a IL-27 en comparacion con sus controles de companeros de camada silvestres negativos a CD4-Cre Stat3fl/fl (Panel C de la Figura 20). Estos datos indican que STAT1 y STAT3 estan implicados en la capacidad de IL- 27 para promover la produccion de IL-10.
Ademas, aunque la IL-27 tambien se ha ligado a STAT4, cuando celulas T CD4+ derivadas de ratones Stat4-/- se cultivaban bajo condiciones no polarizantes en presencia de IL-27, la ausencia de STAT4 no impedfa la capacidad de IL-27 para promover IL-10 (Panel D de la Figura 20), indicando que este es un episodio independiente de STAT4. Sin embargo, es importante apuntar que cuando celulas T STAT4-/- se cultivaban bajo condiciones Th1, produdan menos IL-10 en comparacion con celulas silvestres en respuesta a IL-12 incluso cuando se anadfa IL-27 (Figura 22).
Finalmente, se evaluo la capacidad de celulas T CD4+ procedentes de ratones Statl-/- y Stat3CD4-/- para producir IL-10 cuando se estimulaban con IL-6 sola o en combinacion con TGF-p. Las celulas T CD4+ procedentes de ratones Statl-/- y Stat3CD4-/- presentaban una capacidad reducida para elaborar IL-10 en respuesta a IL-6 (Paneles E y F de la Figura 20). En contraste, celulas T CD4+ procedentes de ratones Statl-/- elaboraban cantidades equivalentes de IL-10 cuando se incubaban con IL-6 mas TGF-p en comparacion con los controles silvestres mientras que las celulas T procedentes de ratones Stat3CD4-l- eran deficientes en su capacidad para producir IL-10 bajo estas mismas condiciones. Estos hallazgos indican que la senalizacion de STAT3, pero no STAT1, es requerida por IL-6 a fin de iniciar la produccion de IL-10 bajo condiciones Th17.
Analisis
Desde la descripcion original de IL-10 como una citocina asociada con celulas Th2, se sabe ahora que existen multiples fuentes innatas y adaptativas de IL-10 que a su vez actua como un inhibidor global de muchas clases (Th1, Th2, Th17) de respuestas inmunitarias. No obstante, a pesar de la apreciacion inicial de que las celulas T eran fuentes principales de IL-10, sigue habiendo muchas preguntas acerca de los factores que gobiernan su expresion en estos linfocitos. El trabajo inicial de Trinchieri y colaboradores implicaba a la IL-12 en la conduccion del desarrollo
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de productores dobles de IFN-y/IL-1023, 26, observaciones recapituladas aqrn por datos que muestran que bajo condiciones Th1 STAT4 esta implicado en estos episodios. Por otra parte, la estimulacion cronica de celulas T de ser humano y de raton en presencia de IL-10 condujo a la aparicion de una poblacion de celulas T cooperadoras (Tr1) que secretaban altos niveles de IL-10 y que podfan mejorar la colitis17. De forma similar, se ha observado que la estimulacion repetida de celulas T CD4+ humanas y murinas vfrgenes in vitro con dexametasona mas vitamina D3 promueve la produccion de IL-10 por una poblacion de celulas Treg55 En contraste, los estudios presentados aqrn revelan que, incluso despues de la estimulacion a corto plazo, IL-27 e IL-6 eran capaces de inducir la produccion de IL-10 por celulas T bajo una variedad de condiciones polarizantes. Esta observacion identifica una nueva ruta que promueve la produccion de IL-10 y refuerza la compleja relacion entre las propiedades pro- y antiinflamatorias de los miembros de la familia IL-6/IL-12.
Aunque la IL-27 se describio en primer lugar basandose en su capacidad para promover respuestas de Th1, se sabe ahora que esta citocina tipo I tiene un papel como un regulador negativo de la intensidad y la duracion de respuestas de celulas T32-34. Los amplios efectos antiinflamatorios de IL-27 se han atribuido a su capacidad para antaaonizar funciones de celulas T cooperadoras a traves de la inhibicion de la produccion de IFN-y, IL-2, IL-4 e IL-175056 Sin embargo, en un numero de entornos experimentales, el fenotipo de ratones Il-27ra-/- ha sido notablemente similar al de los ratones IL-10-/- , , . A modo de ejemplo, ratones tanto IL-10-/- como Il-27ra-/- infectados con T. gondii
desarrollan una inflamacion mediada por celulas T CD4+ letal que esta asociada agudamente con respuestas de Th1
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desreguladas , , , pero respuestas de Th17 alteradas en la enfermedad cronica , . En relacion con estos ultimos informes, Sher y colaboradores establecieron que se requieren celulas T CD4+CD25-Foxp3-IL-10+ para prevenir la patologfa inducida por toxoplasma29. Los datos presentados aqrn, junto con estos hallazgos, sugieren un modelo en el que una de las funciones de IL-27 es promover la produccion por celulas T de IL-10 que ayuda a limitar la patologfa mediada por celulas T durante la infeccion. Presumiblemente, esta ruta reguladora no se restringina a la toxoplasmosis sino que la inflamacion intensificada observada en ratones Il-27ra-/- en una variedad de entornos infecciosos e inflamatorios50, 56 se puede atribuir, al menos en parte, a respuestas de IL-10 defectuosas.
Aunque existen multiples fuentes celulares de IL-10, existe un numero limitado de estudios que han definido los requisitos de linaje espedficos para la transcripcion de IL-10. En macrofagos, los productos microbianos y los complejos inmunitarios pueden inducir IL-10 y MAPK, NF-KB y Sp1 estan implicados en la regulacion de la transcripcion de este gen57-51. En celulas T, se sabe mucho menos acerca de los episodios moleculares que controlan la smtesis de IL-10 aunque en celulas Th2 las protemas JUN se han relacionado con estos episodios y GATA3 se asocia con la remodelacion y la estabilidad del locus de IL-10 requerido para la transcripcion de este gen60. Puesto que IL-27 antagoniza la expresion de GATA361, parece improbable que este factor de transcripcion particular explique la capacidad de IL-27 e IL-6 para promover la transcripcion de IL-10 bajo condiciones polarizantes Th1 y Th17. En cambio, los datos presentados aqrn ligan STAT3 predominantemente, asf como STAT1 y STAT4, a la induccion de IL-10 mediada por citocina. Esta observacion esta de acuerdo con la presencia de sitios de union a STAT en el promotor de IL-10 y un informe previo de que IFN-a puede inducir la incorporacion de STAT1 y STAT3 para transactivar un indicador de IL-1062.
Es destacado que mientras que IL-6 e IL-27 senalizan ambas a traves de gp130, activan STAT1 y STAT3 y pueden promover IL-10, solo la IL-27 puede regular a la baja IL-2 e IL-17 mientras que IL-6 promueve la actividad de TH-|7. Estas observaciones son parte de una bibliograffa la que ha destacado algunos de los efectos aparentemente contradictorios de moleculas de STAT en la diferenciacion y la funcion de celulas TH. Desde mediados de los 90, se sabfa que STAT4 y STAT6 eran factores de transcripcion clave que promovfan el desarrollo de Th1 y Th263, 64 aunque estudios mas recientes han ligado STAT3 a las celulas Th1765- 7 Se esta haciendo ahora evidente que las protemas STAT median en los efectos de IL-27 en celulas T. Asi, la capacidad de IL-27 para inducir STAT1 puede antagonizar el desarrollo de Th17 mientras que STAT1 y STAT3 se requieren para que IL-27 induzca IL-10. En contraste, la capacidad de IL-6 para promover la actividad de Th17 e IL-10 es dependiente de STAT3. Una probable explicacion para estos efectos distintos es que aunque los receptores para IL-6 e IL-27 contengan ambos gp130, existen cadenas de IL-6Ra e IL-27Ra unicas. Si esto indica que un heterodfmero de STAT1/STAT3 media en los efectos de IL-27 mientras que IL-6 (cuando se combina con TGF) solo requiere homodfmeros de STAT3 sigue por estar formalmente probado. Alternativamente, la diferencia en la magnitud de la fosforilacion de STAT3 entre IL-6 e IL-27 sugiere que los altos niveles de STAT3 inducidos activamente por IL-6 pueden ser suficientes para promover IL-10 mientras que IL-27 requiere la combinacion de STAT1 y STAT3.
Aunque el enfoque de este trabajo descrito en este ejemplo se ha puesto en la capacidad de IL-6 e IL-27 para promover IL-10, quizas igualmente importante sea la observacion de que TGF-p tambien influye en esta ruta. Basandose, en parte, en la presencia de inflamacion medida por celulas T en los ratones TGF-p-/-, y la capacidad de TGF-p para inhibir directamente la produccion innata y adaptiva de IFN-y1, 69, 70 se supuso que TGF-p era una citocina antiinflamatoria. Con la comprension de que TGF-p tiene un papel destacado en el desarrollo de celulas Treg y Th17 y ahora la produccion de IL-10 por celulas no Treg, sigue sin estar claro si dirige la diferenciacion de celulas T o es un regulador fundamental compartido de la actividad de celulas T que es modulado por citocinas (IL- 12, IL-6, IL-27) presentes en el ambiente que determina el destino de las celulas.
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Aunque los estudios presentados aqu identifican IL-27 e IL-6 como factores que promueven la produccion de IL-10 por celulas T, una de las mayores cuestiones se refiere a si esta observacion indica el desarrollo de distintos subgrupos de celulas T. Cuando Mossman y Coffman describieron en primer lugar las celulas Th1 y Th2 cuestionaron la diversidad total de fenotipos de celulas T y si existen in vivo otros tipos de celulas T71. Sin limitacion a ningun mecanismo particular, una posible interpretacion de los datos presentados aqu es que los subgrupos de cooperadores T se pueden definir por su capacidad para producir IFN-y, IL-4 e IL-17 solos o en combinacion con IL-
10. Hasta la fecha, los intentos iniciales que usaban IL-27 para generar poblaciones estables de celulas T productoras de IL-10 in vitro han sido insatisfactorios. Aunque existen varios modos de interpretar estos datos preliminares, una posibilidad es que la capacidad para secretar IL-10 no sea una sena de identidad de distintos subgrupos de celulas T sino en cambio que citocinas como IL-27 e IL-6 representen modificadores para los principales subgrupos de celulas T que los permiten elaborar IL-10 en el contexto de la inflamacion cronica. De nuevo, sin limitacion, este puede ser un mecanismo que permite el establecimiento de un subgrupo de cooperadores T apropiado para enfrentarse a diferentes clases de patogenos, pero proporciona a cada uno de estos distintos subgrupos efectores un mecanismo para supervisar sus propias actividades inflamatorias. Independientemente, con la identificacion de IL-10 como una potente citocina antiinflamatoria, existen esperanzas de que se pudiera usar para tratar una variedad de afecciones autoinmunitarias. Sin embargo, por razones que no estan claras, los examenes clmicos con IL-10 han sido decepcionantes. Se espera que el uso de citocinas como IL-27 que pueden inhibir funciones efectoras de celulas T combinado con su capacidad para promover la produccion de IL-10 resulten mas utiles para el manejo de afecciones inflamatorias.
En el contexto de la presente invencion, los experimentos descritos en este ejemplo identifican la induccion de la expresion de IL-10 como otra ruta (ademas de la accion directa sobre celulas T) por la que los complejos y las protemas de fusion descritos anteriormente en la presente pueden suprimir la respuesta inflamatoria. Ademas, the los resultados descritos en este ejemplo indican que la coadministracion de factor de crecimiento transformante beta puede potenciar los efectos de los complejos y las protemas de fusion.
Metodos
Ratones y parasitos
Los ratones C57BL/6, Balb/c, Stat4-/- y Tbx21-/- se obtuvieron de Jackson laboratories. Los ratones WSX-1-/- (Il27ra-l-) fueron proporcionados por el Dr. Christiaan Saris (Amgen Inc.). Los ratones Stat1-l- fueron proporcionados por el Dr Phillip Scott (University of Pennsylvania, Filadelfia, PA). Los ratones con un indicador de GFP inactivado totalmente en el sitio de traduccion para Foxp3 se han descrito anteriormente72, y fueron proporcionados por el Dr. Laurence Turka (University of Pennsylvania). Los ratones fueron alojados y criados en instalaciones libres de patogenos espedficas en the Department of Pathobiology at the University of Pennsylvania segun las directrices institucionales.
La cepa ME49 de T. gondii se preparo a partir de ratones CBA/ca infectados cronicamente y los animales experimentales se infectaron intraperitonealmente con 20 quistes. Los ratones de control Il27ra-l- y C57BL/6 silvestres se trataron el dfa 5 despues de la infeccion con 200 mg/l de sulfadiazina (Sigma) en su agua de bebida durante dos semanas a fin de permitir que los Il-27ra-l- avanzaran hasta un estadio de infeccion cronico. El antfgeno toxoplasmatico soluble (STAg) se preparo a partir de taquizoitos de la cepa RH segun se describe previamente73. Las BMNC procedentes de ratones infectados cronicamente se aislaron segun un protocolo publicado42, 74
Generacion de celulas T productoras de IL-10
Las celulas T CD4+ y CD8+ se aislaron de esplenocitos y nodulos linfaticos que estaban agotados de celulas CD8+ y NK1.1+ para enriquecer con respecto a celulas T CD4+ o estaban agotados de CD4+ y NK1.1+ para enriquecer con respecto a celulas T CD8+ mediante separacion con cuentas magneticas (Polysciences). Las celulas se sembraron en placas de fondo redondo de 96 pocillos (Costar) a una densidad de 5 x 106 celulas/ml. Las celulas se estimularon con anticuerpo anti-TCR (a-CD3; 1 pg/ml; eBioscience) y anticuerpo anti-CD28 (1 pg/ml; eBioscience). Para la produccion de IL-10, los cultivos de celulas T se complementaron bien con IL-27 de raton recombinante (100 ng/ml; Amgen) o bien con TGF-p humano (1 ng/ml; R & D) solos o en combinacion con IL-27. Adicionalmente IFN-y e IL-4 se neutralizaron en los cultivos no polarizados usando anti-IFN-Y (10 pg/ml; clon XMG1.2) y anti-IL-4 (10 pg/ml; clon 11B11). En algunos casos, las celulas T se cultivaron bajo condiciones Th1 (10 ng/ml de IL-12 recombinante; eBioscience mas 10 pg/ml de a-IL-4), Th2 (8 ng/ml de IL-4 recombinante; eBioscience mas 10 pg/ml de a-IFN-Y) o Th17 (1 ng/ml de TGF-p; R & D, 10 ng/ml de IL-6; eBioscience, mas 10 pg/ml de a-IFN-Y y a-IL-4). Las celulas T CD8+ se recogieron el dfa 3, mientras que las celulas T CD4+ se complementaron con medio y reactivos recientes el dfa 3 y se recogieron el dfa 4. A continuacion, las celulas T se reestimularon con PMA e ionomicina mas brefeldina A (Sigma). El analisis de citometna de flujo se realizo en un instrumento FACSCaliber (BD Biosciences) o BDFACS CantoII (BD Biosciences) y se analizo usando el software FlowJo (Tree Star Inc.). Todos los anticuerpos se adquirieron de BD Pharmingen o eBioscience. Para la tincion intracelular de GFP, las celulas se tineron en primer
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lugar con un anticuerpo de raton anti-GFP (eBioscience) seguido por una segunda tincion con un anticuerpo de conejo anti-FITC de raton (Jackson Immunoresearch).
Tincion intracelular con respecto a P-STAT1 y P-STAT3
Las celulas T CD4+ se purificaron de ratones C57BL/6 usando un estuche de aislamiento de CD4+ (Milltenyi). Se incubaron 1 x 106 celulas T CD4+ purificadas con IL-6 o IL-27 durante 5, 30, 60 o 180 minutos. A continuacion, las celulas se fijaron durante 10 minutos con paraformaldehndo al 2% a 37°C. Despues de la fijacion, las celulas se impermeabilizaron a continuacion con metanol al 90% durante 30 minutos sobre hielo seguido por tincion con respecto a CD4, P-STAT1 y P-STAT3. Los anticuerpos contra residuos de tirosina fosforilados de STAT1 y STAT3 se adquirieron de BD Pharmingen.
Estadfstica
Se uso una prueba de la t de Student apareada para determinar diferencias significativas y un valor de P < 0,05 se consideraba significativo.
Referencias para el Ejemplo 3
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Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion para el uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria que comprende: un complejo de WSX-1 soluble/IL-27 aislado o recombinante,
    5 en donde la afeccion inflamatoria se selecciona de:
    un trastorno inmunitario, una infeccion, cancer, una alergia, artritis, asma, enteropatfa inflamatoria, enfermedad de Crohn, uveitis, psoriasis, lupus, esclerosis multiple, una enfermedad infecciosa cronica, tuberculosis, espondilitis anquilosante, rechazo de trasplantes, sarcoidosis and hepatitis.
  2. 2. La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en donde la composicion comprende ademas una o mas 10 celulas T, una o mas celulas B, mastocitos, neutrofilos, macrofagos, celulas dendnticas, celulas que expresan gp130
    o celulas que expresan WSX-1.
  3. 3. La composicion para el uso segun la reivindicacion 2, en donde la celula T presenta una expresion alterada de IL- 2, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-25, IL-10, IL-5 o CD25, proliferacion alterada o supervivencia alterada.
    15 4. La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en donde la composicion comprende factor de crecimiento
    transformante beta.
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