JP7229541B2 - 脊椎融合手術後の非融合を予測するためのバイオマーカーとしてのｃｄ８ｔ細胞サブセット - Google Patents

脊椎融合手術後の非融合を予測するためのバイオマーカーとしてのｃｄ８ｔ細胞サブセット Download PDF

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Description

本発明は、非融合を予測又は検出する方法に関し、特に脊椎融合手術を受ける前又は後に非融合を予測又は検出する方法に関する。
慢性腰痛は、産業の業界における障害や早期の仕事の退職の主な理由の一つである。脊椎症、脊椎症、骨軟骨症又は脊柱管狭窄のような深刻な問題をもたらす腰痛（例えば生物学的、解剖学的、変性）には、複数の原因がある。理学療法による集中的な長期保存治療の後、これらの罹患した患者のほとんどは、難治性疼痛を緩和するために、関節症の観点で脊椎骨融合手術を受けなければならない。
１９９８年から２００８年の間に、米国における脊椎融合手術の年間数は、１７４，２２３から４１３，１７１へと２．４倍（１３７％）増加した（非特許文献１）。２０１１年には、米国で４８８，０００件の脊椎融合手術が報告され、すべての居住治療の３．１％（６位）を表している。さらに、１症例あたり約２７，０００＄で、脊椎融合患者の外科的治療は最も費用がかかる（医療研究品質庁（ＡＨＲＱ））。ドイツでは、２０１１年に約２３０，０００回の脊椎手術が行われ、２００８年と比較して１３６％増加した（ドイツ・アルツテブラット）。
脊椎融合手術の外科的治療後の融合率は、４６％からほぼ１００％までの広範囲のデノボ骨形成の成功を示す。ＦＤＡのガイドラインに基づいて、遅延した融合は「３～６ヶ月の間、その場所について平均速度で治癒が進んでいないとき」と特徴づけられる。非融合（偽関節）は、「３ヶ月間レントゲン写真の進行のない、９ヶ月より長い治癒時間」によって定義される。患者の共病、インプラントの位置及び生物学的欠陥のような融合の成功に影響を与えるいくつかの要因がある。さらに、様々な利用可能な骨移植材料も脊椎融合の結果に影響を与える可能性がある。通常、最も使用される移植片材料は、腸骨に由来する。
しかし、患者の機能と生活の質を評価すると、術後の痛みや罹患率の高い割合は、多くの場合、この追加手順から生じる。患者の生物学的欠陥による上記の限定的な融合率と共に、これは高い社会経済的影響を伴う深刻な医学的問題を表す。骨形成タンパク質（ＢＭＰ－２）の使用は、これまでのところ、高費用および様々副作用のために、改訂シナリオでのみ承認されている。２０１５年にＣｈｕｎらにより「偽関節のための最良の治療法は、最初の手術後に発生するのを防ぐことである」が報告されている（非特許文献２）。
したがって、費用がかかり副作用のないＢＭＰのような支持成長因子の治療的使用をできるだけ早く個人向けにするために脊椎融合手術後の結果を予測する必要性が満たされていない。
ラジャイー ＳＳら,米国における脊椎融合：１９９８年から２００８年までの傾向の分析．２０１２年１月１日；３７（１）：６７－７ チュン ＤＳら，Ｌｕｍｂａｒ ｐｓｅｕｄａｒｔｈｒｏｓｉｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｆｏｃｕｓ．２０１５年１０月；３９日（４）
したがって、本発明の目的は、特に脊椎融合手術（ｓｐｉｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｓｕｒｇｅｒｙ）を受ける前又は脊椎融合手術の後に、非融合（ｎｏｎ－ｆｕｓｉｏｎ）の正確な予測又は検出のための手段及び方法を提供することである。
上記の目的は、請求項１又は２の特徴を有する方法及び請求項７の特徴を有するシステムにより達成される。好ましい実施形態は、従属請求項及び以下の説明の状態である。
図１は、脊椎非融合および正常融合を有する患者の末梢血中の循環免疫細胞サブセットＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。脊椎非融合患者（治癒クラス２）は、最終分化ＣＤ８＋エフェクター細胞（ＴＥＭＲＡ ＣＤ８＋）の劇的な増加を示す正常な治癒患者（治癒クラス１）と比較して、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ８＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ５７＋の割合（％））の有意に高い頻度を示した。＊＝Ｐ＜０．００１；マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定。 図２は脊椎非融合および正常融合を有する患者の末梢血中の循環免疫細胞サブセットＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析結果である。脊椎非融合患者（治癒クラス２）は、最終分化ＣＤ８＋エフェクター細胞（ＴＥＭＲＡ ＣＤ８＋）の劇的な増加を示す正常な治癒患者（治癒クラス１）と比較して、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２８－の割合（％））の有意に高い頻度を示した。＊＝Ｐ＜０．００１；マン・ホイットニーＵ検定。 図３は、脊椎非融合および正常融合を有する患者の末梢血中の循環免疫細胞サブセットＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ８＋ＣＤ５７＋２８－Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。脊椎非融合患者（治癒クラス２）は、最終分化ＣＤ８＋エフェクター細胞（ＴＥＭＲＡ ＣＤ８＋）の劇的な増加を示す正常治癒患者（治癒クラス１）と比較して、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５７＋２８－Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ５７ＣＤ２８－＋の割合（％））の有意に高い頻度を示した。＊＝Ｐ＜０．００１；マン・ホイットニーＵ検定。 図４は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ５７＋の発現の割合（％）及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２８－の割合（％）の合計に基づく受信者動作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：ＲＯＣ）を示している。ＲＯＣ分析は曲線下面積（ＡＵＣ）：０．８８６及びｐ＜０．００１で、カットオフレベル８５．６％を使用して、血中レベルに基づいて影響を受けた患者の検出において、高い感度（７６％）と特異性（９６％）を示した。 図５は、曲線下面積（ＡＵＣ）：０．８５９及びｐ＜０．００１であるＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ５７＋ＣＤ２８－の発現の割合（％）に基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）を示す。ＲＯＣ分析は、２２．７％のカットオフレベルを使用して、血中レベルに基づいて影響を受けた患者の検出において、高い感度（９０％）と特異度（７１％）を示した。３３．１％のカットオフレベルは、より高い特異度（９６％）で７１％の感度を示した。 図６は、曲線下面積（ＡＵＣ）：０．８６３及びｐ＜０．００１であるＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ５７＋の発現の割合（％）に基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）を示す。ＲＯＣ分析は、２４．４％のカットオフレベルを使用して、血中レベルに基づいて影響を受けた患者の検出において、高い感度（９０％）と特異度（６１％）を示した。３７．６％のカットオフレベルは、より高い特異度（９６％）で７１％の感度を示した。 図７は、曲線下面積（ＡＵＣ）：０．８７６およびｐ＜０．００１であるＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２８－の発現の割合（％）に基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）を示す。ＲＯＣ分析は、２８．０％のカットオフレベルを使用して、血中レベルに基づいて影響を受けた患者の検出において、高い感度（９０％）と特異度（６６％）を示した。４２．９％のカットオフレベルは、より高い特異度（９１％）で７６％の感度を示した。
これによれば、本発明の第１の態様は、非融合を有する又は発症する確率を予測する方法に関し、特に脊椎融合手術を受ける前又は脊椎融合の失敗後に修正手術を受ける前又は融合手術後に非融合を有する又は発症する確率を予測する方法に関する。この方法は患者から得られた試料中において、ＣＤ８＋ＣＤ５７＋、ＣＤ８＋ＣＤ２８－及びＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８－から選択されるＣＤ８＋細胞又はＣＤ８＋ＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞の亜集団の頻度を決定することを含む。
脊椎融合後の非融合の調査の過程で、驚くべきことに、脊椎非融合は、表現型ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２８－又はＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５７＋又はＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８－（ＣＤ８＋ ＴＥＭＲＡ）を発現する最終分化ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の頻度の有意な上昇を伴っていたことが分かった。これらの細胞は、その組織回帰特性及び強いバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）活性によって特徴付けられる。それらは、Ｔｏｌｌ受容体（ＴＬＲ）の結果として炎症組織内で誘発される先天性免疫の細胞（マクロファージや樹状細胞など）から送達されたサイトカインによって抗原非依存性物質中のＴ細胞受容体に非依存的に誘発されえる。
損傷関連分子パターン（ＤａｍＰ）の相互作用（例えばＩＬ－１２、ＩＬ－１８）は、圧倒的な炎症及び線維化を支持するこれらのＣＤ８＋ＴＥＭＲＡによる炎症性サイトカイン（例えばＩＦＮ－ガンマ）の放出を引き起こし得る。他のＴ細胞とは対照的に、これらのＣＤ８＋ＴＥＭＲＡは活性化のためにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）架橋を必要としない。
いずれかの細胞集団が本明細書の特定のマーカー分子に関して「陽性」と指定されている場合、この指定は、特に前記細胞集団がマーカー分子に対する一般的な蛍光色素標識抗体によって染色することができ、かつ、非標識細胞、又は同じ抗体で標識されるが一般的に上記マーカーが発現していないと知られる細胞、又はアイソタイプ参照抗体と比較して、少なくとも１ｌｏｇ、２ｌｏｇ又は３ｌｏｇ高い強度の蛍光シグナルを与えることを意味する。逆に、特定のマーカー分子に対して「陰性」と指定された細胞集団は、マーカー分子に対して上述した蛍光色素標識抗体によって染色することはできない。
本発明の第２の態様は、非融合の治療の経過を監視する方法に関し、特に脊椎融合手術後の非融合の治療の経過を監視する方法に関する。この方法は、前記患者から得られた試料中のＣＤ８＋ＣＤ５７＋、ＣＤ８＋ＣＤ２８－及びＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８－から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋ＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞の亜集団の頻度を決定することを含む。
「非融合（ｎｏｎ－ｆｕｓｉｏｎ）」又は「非癒合（ｎｏｎｕｎｉｏｎ）」は、医学の分野、より特に整形外科の分野で知られているその意味で使用される。特に、３ヶ月間レントゲン写真の進行のない、９ヶ月以内に２つの骨片（ｂｏｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ）が統合されないことを指し、特に２つの骨片は自然に骨格組織によって接続されていない。非癒合又は非融合は、偽関節とも呼ばれる。
有利には、脊椎融合の失敗における修正手術の場合には、非融合を有する又は発症するリスクが高いことを確認した患者へ、低用量の、例えばＢＭＰを投与することができる。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、非融合は、骨組織によって自然に接続されていない２つ以上の骨又は骨片間の非融合である。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、非融合は、２つ以上の椎骨間の非融合である。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、試料は、血液試料、特に末梢血からの試料である。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、試料は、脊椎融合手術前、脊椎融合手術中又は脊椎融合手術後に患者から得られた試料である。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、脊椎融合手術後の正常な融合を有する大集団について決定された標準値と比較した場合のＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋ＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞の亜集団の少なくとも１．５以上の高い頻度を示すサンプルは、脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有する患者に割り当てられる。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、脊椎融合後の正常な融合を有する大集団について決定された標準値と比較した場合のＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋ＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞の亜集団の少なくとも１．８以上の高い頻度を示すサンプルは、脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有する患者に割り当てられる。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、脊椎融合後の正常な融合を有する大集団について決定された標準値と比較した場合のＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋ＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞の亜集団の少なくとも２より高い頻度を示すサンプルは、脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有する患者に割り当てられる。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも２２．７％、より特に少なくとも３３．１％を意味するＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８－細胞の画分を表す試料は、脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有する患者に割り当てられる。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも８５．６％を意味するＣＤ８＋ＣＤ５７＋細胞及びＣＤ８＋ＣＤ２８－細胞の合計画分を表す試料は、脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有する患者に割り当てられる。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも２８．０％、より特に少なくとも４２．９％を意味するＣＤ８＋ＣＤ２８－細胞の画分を表す試料は、脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有する患者に割り当てられる。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも２８．０％、より特に少なくとも４２．９％を意味するＣＤ８＋ＣＤ５７＋細胞の画分を表す試料は、脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有する患者に割り当てられる。
特定の実施形態において、本発明の第１又は第２の態様に記載の方法は、ＣＤ８（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１７３２，Ｐ１０９６６）、ＣＤ２８（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１０７４７）及びＣＤ５７（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９Ｐ２Ｗ７）からなるマーカー群から選択されるマーカー分子に特異的に反応する第１のリガンドと試料とを接触させることによって行われ、かつ、第一のリガンドで印されたマーカー分子を提示する細胞の頻度を決定する、又はマーカー分子に結合した第１のリガンドの頻度を決定する。
発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、第１のリガンドは、抗体、抗体断片、抗体様分子、６～３０アミノ酸のオリゴペプチド及び長さ１０～７５ヌクレオチドの核酸アプタマー分子からなる群から選択され、リガンドは、１０―８ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で前段落に記載されたマーカー群のメンバーに結合することができる。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態では、抗体断片は、抗体のＦａｂドメイン（抗体の抗原結合領域）又は単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、すなわちペプチドリンカーで接続された抗体の軽鎖と重鎖の可変領域からなる融合タンパク質である。抗体断片又は抗体様分子は、組換えタンパク質発現などの適切な方法によって製造することができる。
このような第１のリガンドは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ又はＳＥＬＥＸなどの進化的方法によって開発することができ、ポリペプチド又はオリゴヌクレオチドは、目的の標的に対する結合親和性に従って選択される。さらに、より高い親和性阻害剤は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の進化及び選択の反復巡回によって同定してもよい。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、上記の６～３０アミノ酸のオリゴペプチドは、リガンドの一部に由来するペプチドであり、これは上述したマーカー群のメンバーによって認識される。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、上述したマーカー群のメンバーによって認識されるリガンドは、ＣＤ８０（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ３３６８１）又はＣＤ８６（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ４２０８１）から選択され、これはＣＤ２８のリガンドである。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、第１のリガンドは、ＣＤ８、ＣＤ２８又はＣＤ５７に反応する抗体であり、さらに光学的検出のための蛍光部分を含み、前段落に記載のマーカー分子は、このような抗体に結合し、かつマーカー分子を提示する細胞は、蛍光活性化細胞選別（セルソーティング）などの蛍光に基づくフローサイトメトリー法によって数を数えることができる。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、第１のリガンドは、第２のリガンドによって特異的に結合され、第２のリガンドは、酵素活性又は蛍光部分を含む。複数の異なるマーカー分子は、複数の異なる第１リガンドを用いて決定してもよく、各リガンドは、特定のマーカー分子に特異的に結合する。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態では、複数の各第１リガンドは、複数の他の各第１リガンドの酵素活性又は蛍光部分と分光学的に区別することができる上記の特定の酵素活性又は蛍光部分を含む。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態では、各第１のリガンドは、他の各第２のリガンドの酵素活性又は蛍光部分について分光学的に区別できる特定の酵素活性又は蛍光部分を有する特異的な第２のリガンドに結合される。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、第１及び第２のリガンド又はその複数は、抗体であり、そして酵素結合免疫吸着測定法において使用される。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態では、本発明の前述の態様に記載の亜集団の頻度、特にＣＤ８＋ＣＤ５７＋、ＣＤ８＋ＣＤ２８－又はＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８－Ｔ細胞の亜集団の頻度は、フローサイトメトリー測定においてＣＤ８、ＣＤ２８及びＣＤ５７からなる群から選択されるマーカー分子に対する蛍光抗体で印した細胞を数えることによって決定される。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、本発明の上記の態様又は実施形態に記載の抗体は、マウス起源のモノクローナル抗体であり、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＰＥ（フィコエリスリン）などのフローサイトメトリーにおいて光学的検出のための蛍光部分を含む。
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、抗体は、ＡＰＣ－Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ８ ｌｇＧ１、タンデム蛍光ＡＰＣ－Ｃｙ７と接合したマウスモノクローナル抗体、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ５７ ＩｇＭ、マウスモノクローナル抗体及びＡＰＣ－Ｈ７マウス抗ヒトＣＤ２８ ｌｇＧ１、すなわちＡＰＣ－Ｃｙ７の類似体であり、同じ分光特性を有するタンデム蛍光ＡＰＣ－Ｈ７と接合したマウスモノクローナル抗体からなる群から選択される。
本発明の別の態様によれば、特に脊椎融合手術が提供された後、非融合を有する又は発症する確率を予測するための抗体の組み合わせの使用が提供され、組み合わせは、抗ＣＤ８抗体及び抗ＣＤ５７抗体、又は抗ＣＤ８抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ５７抗体を含み、かつ前記抗体は蛍光に基づくフローサイトメトリーに適している。
本発明の上記態様の特定の実施形態において、本発明の上記態様に記載の抗体は、マウス起源のモノクローナル抗体であり、及びＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＰＥ（フィコエリスリン）などのフローサイトメトリーにおける光学的検出のための蛍光部分を含む。
本発明の上記の態様の特定の実施形態において、抗体は、ＡＰＣ－Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ８ ｌｇＧ１、タンデム蛍光ＡＰＣ－Ｃｙ７と接合したマウスモノクローナル抗体、ＦＩＴＣ標識マウスから選択される。抗ヒトＣＤ５７ ＩｇＭ、マウスモノクローナル抗体及びＡＰＣ－Ｈ７マウス抗ヒトＣＤ２８ ｌｇＧ１、すなわちＡＰＣ－Ｃｙ７の類似体であり、同じ分光特性を有するタンデム蛍光ＡＰＣ－Ｈ７と接合したマウスモノクローナル抗体からなる群から選択される。
本発明のさらなる態様によれば、提供された患者の、特に脊椎癒合手術後の、非融合の治療の経過を監視するための、又は特に脊椎融合手術を受ける前の非融合を有する又は発症する確率を予測するためのシステムであって、以下を含む、
－患者からの試料中の細胞集団の頻度を決定するための装置、
－プログラムされたマイクロプロセッサ、
プログラムされたマイクロプロセッサは、本発明の上記態様又は実施形態に記載の方法を実行するように構成される。
特定の実施形態において、装置は、フローサイトメーターであり、細胞を搬送および整列するためのフローセル、レーザーなどの光源およびインピーダンスなどの光又は他の生物物理学的パラメータの測定に適した検出器を含む。このような装置は、本発明の上記態様及び実施形態に記載のＣＤ８＋細胞の亜集団の頻度を決定するために使用してもよい。
特定の実施形態において、装置は、分光光度計又はプレートリーダーであり、キュベット又はマイクロチータプレートなどの試料を保持する区画、光源及びダイオードアレイなどの吸光度又は蛍光の測定に適したＵＶ／Ｖｉｓ検出器を含む。
特定の実施形態において、プログラムされたマイクロプロセッサは、前段落に記載された装置に統合されるか、又は装置を操作するための制御装置又はコンピュータの一部である。
特定の実施形態において、上記装置は、本発明の上記態様及び実施形態に記載のＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋ＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞、特にＣＤ８＋ＣＤ５７＋、ＣＤ８＋ＣＤ２８－又はＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８－Ｔ細胞の亜集団の頻度を決定するように構成される。
本発明のさらに別の態様によれば、脊椎融合手術後に非融合を予防又は治療する方法で使用するための骨形成タンパク質が提供され、骨形成タンパク質は、脊椎融合手術後に非融合を発症又は有する高い確率を有する患者へ、脊椎融合手術中又は脊椎融合手術を受けた後に投与される。
特定の実施形態において、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ２又はＢＭＰ７である。
特定の実施形態において、脊椎骨融合手術後に非融合を発症又は有する高い確率は、第１の態様又はその任意の実施形態に記載の方法によって決定された。
個々のリスクを予測するための新規バイオマーカーを定義し、新規治療標的を特定するために、発明者らは、脊椎体融合を確保した脊椎骨融合手術を受けた４４人の患者を遡及的研究に含めた。これらの患者は、ＣＴスキャン結果に基づいて、正常な椎体融合（ｎ＝２３）及び偽関節／非融合（ｎ＝２１）の患者に分類した。
表１は、遡及的研究に関与した患者（脊椎融合及び脊椎非融合患者）の特徴付けおよび血液パラメータを示す。
Figure 0007229541000001
表２：非融合患者に対する初期および修正手術における、脊椎非融合の診断をするための時間及び血液パラメータを示す。
Figure 0007229541000002
文献で確立され、診療所で日常的に使用されるように、非融合の分類のための時間依存及び放射線基準がある。非融合プロセスの定義を達成するために、患者は以下の１つ以上の基準を満たす必要がある。
時間依存条件：
椎間領域における瘢痕組織形成の存在に基づく少なくとも術後２４週後の不完全な椎体融合。（イトウゼンヤら、ＳＰＩＮＥ Ｖｏｌｕｍｅ ３５，Ｎｕｍｂｅｒ ２１，ｐｐＥ１ １０１ －Ｅ１ １０５；２０１０）
放射線＋臨床基準：
１）２つの椎体を接続する骨梁の架橋がない
２）５度を超える角運動
３）３ミリメートルを超える矢状方向移動
４）ダボと宿主の椎骨終板との間の境界面の半分以上を含む放射線透過性
この前者の分類に基づいて、非融合患者は末梢血中の免疫及び炎症性パラメータの違いを示した。特に、脊椎非融合は、表現型ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２８－及び／又はＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５７＋（ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ）を発現する最終分化ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の有意に増強された頻度（２倍より大きい）と強く関連した。
したがって、ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞のレベルが高い患者は、（例えばＣＭＶ／ＥＢＶのような持続的かつ頻繁に再活性化するウイルスによる）慢性免疫刺激の個人歴のために、正常な椎体融合を阻害する圧倒的な炎症の結果として脊椎融合手術後の椎体融合又は質が悪くなる。
本明細書に提示されるデータは、個々の免疫プロファイル（ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡの頻度）が、既知及び確立された方法で早期介入を可能にする障害のある骨融合患者を予測するための信頼性の高いバイオマーカーであることを示す。

Claims (8)

  1. 非融合を有する又は発症する確率を予測するための方法であって、脊椎融合手術を受ける前又は脊椎融合手術後であり、前記方法は、患者から得られた試料中においてＣＤ８＋ＣＤ５７＋、ＣＤ８＋ＣＤ２８－及びＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８－から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団の頻度を決定することを含み、
    － 骨融合後の正常融合を有する大集団について決定された標準値と比較した場合に、試料が前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団が少なくとも２倍高い頻度を示す場合は、患者が脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有すると予測され、及び／又は、
    － 試料が、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも２２．７％のＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８－細胞の画分を表す場合は、患者が脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有すると予測され、及び／又は、
    － 試料が、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも８５．６％のＣＤ８＋ＣＤ５７＋細胞及びＣＤ８＋ＣＤ２８－細胞の合計画分を表す場合は、患者が脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有すると予測され、及び／又は、
    － 試料が、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも２４．４％のＣＤ８＋ＣＤ５７＋細胞の画分を表す場合は、患者が脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有すると予測され、及び／又は、
    － 試料が、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも２８．０％のＣＤ８＋ＣＤ２８－細胞の画分を表す場合は、患者が脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有すると予測される、
    前記方法。
  2. － 試料が、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも３３．１％のＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８－細胞の画分を表す場合は、患者が脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有すると予測され、及び／又は、
    － 試料が、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも３７．６％のＣＤ８＋ＣＤ５７＋細胞の画分を表す場合は、患者が脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有すると予測され、及び／又は、
    － 試料が、試料中のすべてのＣＤ８＋細胞の合計の少なくとも４２．９％のＣＤ８＋ＣＤ２８－細胞の画分を表す場合は、患者が脊椎融合手術後に非融合を有する又は発症する高い確率を有すると予測される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記非融合が、骨組織によって自然に接続されていない２つ以上の骨又は骨片間の非融合である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記非融合が、２つ以上の椎骨間の非融合である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記試料が血液試料である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記試料が前記患者から脊椎融合手術前、脊椎融合手術中又は脊椎融合手術後に得られた試料である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 脊椎融合手術を受ける前又は脊椎融合手術後に、非融合を有する又は発症する確率を予測するためのシステムであって、
    － 患者から得られた試料中の細胞集団の頻度を決定する装置
    － プログラムされたマイクロプロセッサを含み、
    前記マイクロプロセッサは、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法を実行するように構成される、
    前記システム。
  8. 請求項１～６のいずれか一項に記載の方法における抗体の組み合わせの使用であって、脊椎融合手術を受ける前又は脊椎融合手術後であり、前記組み合わせが抗ＣＤ８抗体及び抗ＣＤ５７抗体、又は抗ＣＤ８抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ５７抗体を含み、かつ前記抗体は蛍光に基づくフローサイトメトリーに適している、前記使用。
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