KR20070095949A - 자가면역 장애의 치료 방법 - Google Patents

자가면역 장애의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자가면역 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 본 발명은 TCCR 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 자가면역 장애는 Th1 반응에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. 일 실시양태에서, 자가면역 장애는 CD8+ T-세포 증식에 의해 적어도 부분적으로 매개된다.
자가면역 장애, TCCR 효능제, Th1 반응, CD8+ T-세포 증식

Description

자가면역 장애의 치료 방법 {METHODS FOR TREATING AUTOIMMUNE DISORDERS}
자가면역 장애는 복합적인 상호연결된 생물학적 경로의 징표 또는 결과이다. 정상적인 생리학에서, 상기 생물학적 경로는 상해 또는 손상에 반응하고, 상해 또는 손상으로부터 복구를 개시하고, 외래 유기체에 대해 선천적 및 후천적 방어를 갖추는데 중요하다. 질환 또는 병리증상은 상기 정상적인 생리학적 경로가 반응의 강도에 관련된 것으로서, 비정상적 조절 또는 과다한 자극의 결과로서, 스스로에 대한 반응으로서, 또는 이들의 조합으로서, 추가의 상해 또는 손상을 유발시킬 경우 일어날 수 있다.
상기 장애의 발생은 종종 다단계 경로, 종종 다중의 여러가지 생물학적 시스템/경로와 관련되지만, 상기 경로의 하나 이상에서 중요한 지점에서의 개입은 개량적 또는 치료적 효과를 가질 수 있다. 치료적 개입은 해로운 과정/경로의 길항 또는 유익한 과정/경로의 자극에 의해 일어날 수 있다.
포유동물의 면역계는 숙주를 박테리아, 바이러스, 독소, 및 기타 비-숙주 물질의 침입으로부터 방어하는데 협력하여 작용하는 다수의 고유한 세포로 이루어진다. T 및 B 세포 둘다인 림프구는 면역계의 특이성을 크게 담당한다. T 세포는 그의 표시를 흉선에서 발달되는 것으로부터 취하는 반면, B 세포는 골수에서 발달된다.
T 림프구 (T 세포)는 포유동물 면역 반응의 중요한 성분이다. T 세포는 주 조직적합성 복합체 (MHC) 내의 유전자에 의해 코딩되는 자가-분자와 결합되는 항원을 인식한다. 항원은 MHC 분자와 함께 항원 제시 세포, 바이러스 감염된 세포, 암 세포, 이식편 등의 표면 상에 제시될 수 있다. T 세포 시스템은 숙주 포유동물에 건강상 위협을 가하는 상기 변형된 세포를 제거한다. T 세포는 헬퍼 T 세포 (CD4+) 및 세포독성 T-림프구 (CD8+)를 포함한다. 헬퍼 T 세포 (TH)는 항원 제시 세포 상의 항원-MHC 복합체를 인식한 후 광범위하게 증식한다. 헬퍼 T 세포는 또한 B 세포, 세포독성 T-림프구, 및 면역 반응에 참여하는 다양한 다른 세포의 활성화에 중추적인 역할을 하는, 림포킨과 같은 다양한 사이토킨을 분비한다. 세포독성 T-림프구는 다른 세포의 파괴를 유발할 수 있다.
체액성 및 세포 매개된 면역 반응 둘다에서 중심적인 사건은 헬퍼 T 세포의 활성화 및 클론 팽창이다. 헬퍼 T 세포 활성화는 항원 제시 세포의 표면 상의 항원-MHC와의 T 세포 수용체 (TCR) - CD3 복합체의 상호작용에 의해 개시된다. 상기 상호작용은 휴지 헬퍼 T 세포가 세포 주기로 진입하는 것 (G0에서 G1으로의 전이)을 유도하며, IL-2에 대한 고 친화도 수용체의 발현을 초래하는 생화학적 사건의 캐스케이드를 매개한다. 활성화된 T 세포는 기억 세포 또는 효과기 세포로의 주기 증식 및 분화를 통해 진행된다.
T-헬퍼 세포 하위집단 (Th1 및 Th2)은 면역의 2가지 경로, 즉 세포-매개된 면역 및 체액성 면역을 한정한다. Th1 및 Th2 아형에 대한 사이토킨의 방출 프로 파일은 효과기 메카니즘 및 세포독성 세포의 선택에 영향을 준다 (문헌 [Mosmann et al., 1989, Adv. Immunol., 46:111-147]; [Mosmann et al., 1996, Immunol. Today, 17:138-146]). CD4+ 세포의 기능적 하위집단인 Th1 세포는 세포-매개된 면역을 후원하고 Il-2, 인터페론-감마 및 림포톡신 베타를 비롯한 사이토킨을 생성하는 그의 능력을 특징으로 한다 ([Mosmann et al., 1989, 1996], 상기 문헌). Th1 세포에 의해 분비된 Il-2 및 인터페론-감마는 대식세포 및 세포독성 세포를 활성화시킨다. Th2 세포는 또한 CD4+ 세포이지만, Th1 세포와 구별된다. Th2 세포는 항체 생성과 같은 체액성 면역을 후원하는 그의 능력을 특징으로 한다. Th2 세포는 Il-4, Il-5 및 Il-10을 비롯한 사이토킨을 생성한다 ([Mosmann et al., 1989, 1996, 상기 문헌]). Th2 세포에 의해 분비된 Il-4, Il-5 및 Il-10은 호산구 및 비만 세포의 생성을 증가시킬 뿐만 아니라, IgE를 비롯한 항체의 생성을 증진시키고, 세포독성 세포의 기능을 감소시킨다 (문헌 [Powrie et al., 1993, Immunol. Today, 14:270]).
Th1 및 Th2 사이토킨 방출은 상호 억제성 Th1 및 Th2 반응을 조절한다. 예를 들어, IL-4는 Th1 세포로부터의 인터페론-감마의 발현을 억제하는 반면, 인터페론-감마는 Th2 세포로부터의 IL-4의 발현을 억제한다 ([Mosmann et al., 1989], 상기 문헌).
4개 나선 다발 사이토킨 족의 구성원 (문헌 [Bazan, 1990, PNAS, 87:6934])은 공통적인 전구체로부터 Th1 및 Th2 효과기 세포의 별개의 집단으로의 T 헬퍼 세 포의 팽창 및 말단 분화를 조절한다 (문헌 [O'Garra, A., 1998, Immunity, 8:275-83]). 예를 들어, IL-4는 Th2 세포의 발생에 영향을 주는 반면, IL-12는 Th1 세포의 분화에 관여한다 (문헌 [Hsieh et al., 1993, Science, 260:547-9]; [Seder et al., 1993, PNAS, 90:10188-92]).
TCCR (T-세포 사이토킨 수용체)은 IL-12 β-2 수용체, G-CSFR 및 IL-6 수용체에 대해 상동성을 갖는 사이토킨 수용체의 WS(G)XWS 부류이다. 상기 수용체는 세포, 특히 혈액 세포 성장 및 분화에 관여하는 세포의 성장 및 분화를 제어할 수 있는 신호를 변환한다. TCCR은 T-헬퍼 세포 반응에 관여하는 것으로 제안되었다. 구체적으로, TCCR 및 그의 리간드 IL-27은 Th1 반응을 촉진한다고 가정되었다 (문헌 [Chen et al., 2000, Nature, 407:916-920]; [Yoshida et al., 2001, Immunity, 15:569-578]; [Pflanz et al., 2002, Immunity, 16:779-790]).
Th1 및 Th2 세포 중 하나 또는 둘다에 의해 생성된 사이토킨의 과다생성은 다수의 의학적 장애에 영향을 준다. 예를 들어, Th1 사이토킨의 과다생성은 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염과 같은 다양한 자가면역 장애의 발병기전에 기여한다. Th2 사이토킨의 과다생성은 알레르기성 장애의 발병기전에 기여한다.
CD8+ 세포독성 T-림프구 (CTL)는 일부 자가면역 질환에서 조직의 병리학적 파괴에 관여한다. 예를 들어, CTL은 자가면역 제I형 당뇨병의 과정 동안 췌장 β 세포의 파괴와 관련된다 (문헌 [Kagi et al., 1997, J. Exp. Med., 186:989-997]). CTL은 또한 실험적 자가면역 뇌척수염과 관련된다 (문헌 [Huseby et al., 2001, J Exp. Med., 194(5):669-676]). CTL은 이식편-대 숙주 질환 (GVHD)과 관련된 조직 손상을 매개한다 (문헌 [Graubert et al., 1997, J. Clin. Invest., 100:904-911]).
다발성 경화증 (MS)은 뇌 및 척수에 영향을 주는 중추 신경계의 장애이다. MS의 통상적인 징후 및 증상으로는 하나 이상의 사지, 몸통, 또는 얼굴 중 한 측면 상의 감각이상; 다리 또는 손의 약화 또는 둔함; 또는 시각 장애 (예를 들어 부분 실명 및 한쪽 눈의 통증), 시각의 흐림 또는 암점을 들 수 있다. 다른 통상적인 초기 증상은 이중 시각 (복시)을 초래하는 안구 마비, 하나 이상의 사지의 일시적인 약화, 사지의 가벼운 경직 또는 비정상적인 피로, 약간의 보행 장애, 방광 제어의 곤란, 현기증 및 약한 감정 장애이다 (문헌 [Berkow et al. (ed.), 1999, Merck Manual of Diagnosis and Therapy: 17th Ed]). MS에 대한 현행 치료로는 코르티코스테로이드, 베타 인터페론 (베타페론(Betaferon), 아보넥스(Avonex), 레비프(Rebif)), 글라티라머 아세테이트 (코팍손(Copaxone)), 메토트렉세이트, 아자티오프린, 시클로포스파미드, 클라드리빈, 바클로펜, 티자니딘, 아미트립틸린, 카르바마제핀을 들 수 있다 ([Berkow et al. (ed.), 1999], 상기 문헌).
류마티스성 관절염 (RA)은 전형적으로 작고 큰 관절에 영향을 주어 그의 점진적인 파괴를 초래하는 관절의 윤활막염을 특징으로 하는 만성 자가면역 장애이다 ([Berkow et al. (ed.), 1999], 상기 문헌). RA의 증상으로는 경직, 압통, 윤활막 비후, 굴곡 구축, 내장 결절, 다리 궤양을 유발하는 혈관염 또는 다발성 단신경염, 흉막 또는 심장막 삼출 및 열을 들 수 있다 ([Berkow et al. (ed.), 1999], 상기 문헌).
RA에 대한 현행 치료로는 비-스테로이드성 항염증성 약물 (살리실레이트 포함), 금 화합물, 메토트렉세이트, 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 페니실라민, 코르티코스테로이드 및 세포독성 또는 면역억제성 약물을 들 수 있다 (문헌 [Berkow et al. (ed.), 1999, Merck Manual of Diagnosis and Therapy: 17th Ed.]).
자가면역 장애의 기존의 요법 중 어느 것도 제한된 효능 및/또는 상당한 독성 때문에 만족할 만한 것으로 입증되지 않았다. 따라서, MS 및 RA와 같은 자가면역 장애의 치료를 위한 신규한 방법이 필요하다.
발명의 요약
천연의 비분화된 T 세포 (Th-O)는 Th-O 세포의 성숙 T-헬퍼 세포로의 분화를 유도하는 상이한 신호에 반응한다. 본 발명에 이르러, 예를 들어 IL-27과 같은 TCCR의 효능제의 투여에 의한 세포성 수용체 TCCR의 활성화는 T-림프구 증식을 감소시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. T-림프구 증식의 감소는 IL-10 및 SOCS-3의 증가된 발현과 상호관련되었다. TCCR을 발현하는 동물은 자가면역 질환에 덜 감수성인 것으로 밝혀졌다.
EAE 질환 모델에서의 추가의 연구는 IL-27 수용체 (TCCR)-결핍 마우스가 자가면역 질환에 과민성임을 나타내었다. Th-세포 분화 및 면역 장애에 있어서의 IL-27의 역할의 연구로, IL-27이 Th 발생에서 다중 수준으로 작용하는 면역억제성이라는 놀라운 발견을 하였다. IL-27은 Th-IL17 세포의 생성을 억제하고, IL-6의 생 성을 억제하고, IL-6을 비롯한 ThIL17 사이토킨의 생성을 억제한다. IL-27은 Th-IL17 세포의 추가의 억제제인 IL-10 및 IL-4의 생성을 유도하고, IL12 수용체의 생성 및 Th-1 세포의 분화를 자극한다. 본원에 개시된 데이타는 IL-27이 Th-1, Th-2 및 Th-17 세포에 대한 중요한 억제 활성을 비롯한 중요한 면역억제 기능을 가짐을 나타낸다.
본 발명은 IL-27과 같은 IL27R (TCCR)의 효능제의 투여에 의한, 다발성 경화증 (MS) 및 류마티스성 관절염 (RA)을 비롯한 자가면역 장애의 치료 방법을 제공한다. 유용한 TCCR의 효능제는 IL27R의 변이체 및 단편, IL-27과 같은 IL-27R 리간드 및 그의 변이체 및 단편, 뿐만 아니라 IL27R 또는 IL27R 리간드에 결합하는 효능제 항체를 포함하며, IL27-매개된 반응을 자극하거나, 유도하거나, 증진시킨다. 본 발명은 또한 IL27/IL27R 반응을 자극하거나, 유도하거나, 증진시키는 효능제를 투여하는 것을 포함하는, Th-IL17 세포를 비롯한 T-림프구 및/또는 세포독성 T-림프구의 증식의 억제 방법을 제공한다.
도 1은 TCCR/IL-27 수용체 복합체의 구조의 개략도이다.
도 2는 모노클로날 항체: 2685-IgG2a, 2686-IgG1, 2688-IgG1, 대조군 이소형 IgG2a 및 대조군 이소형 IgG1에 반응하여 인간 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 3은 뮤린 IL-3 (양성 대조군) 및 항체 2686에 반응하여 인간 TCCR을 발현 하는 Ba/F3 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 4는 항체 2686에 반응하여, 인간 TCCR, 뮤린 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포, 및 어느 것도 발현하지 않는 대조군 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 5는 TCCR을 발현하지 않는 비세포의 증식에 비해 항-CD3 자극에 반응하여 TCCR을 발현하는 비세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 6은 TCCR을 발현하지 않는 CD4+ T 세포의 증식에 비해 항-CD3 자극에 반응하여 TCCR을 발현하는 CD4+ T 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 7은 TCCR을 발현하지 않는 CD8+ T 세포의 증식에 비해 항-CD3 자극에 반응하여 TCCR을 발현하는 CD8+ T 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 8은 넉아웃 (TCCR -/-) 및 야생형 (TCCR +/+) 마우스에서 MOG 유도된 EAE의 임상적 진행을 나타내는 그래프이다.
도 9는 넉아웃 (TCCR -/-) 및 야생형 (TCCR +/+) 마우스에서 MBP 유도된 EAE의 임상적 진행을 나타내는 그래프이다.
도 10은 EAE 모델에서 넉아웃 (TCCR -/-) 및 야생형 (TCCR +/+) 마우스에 대한 뇌 및 척수 섹션에 대한 평균 조직학적 염증 점수를 나타내는 그래프이다.
도 11은 EAE 모델에서 넉아웃 (TCCR -/-) 및 야생형 (TCCR +/+) 마우스에 대한 뇌 및 척수 섹션에 대한 평균 조직학적 탈수초 점수를 나타내는 그래프이다.
도 12는 EAE 모델에서 넉아웃 (TCCR -/-) 및 야생형 (TCCR +/+) 마우스에 대 한 뇌 및 척수 섹션에 대한 최대 조직학적 염증 점수를 나타내는 그래프이다.
도 13은 EAE 모델에서 넉아웃 (TCCR -/-) 및 야생형 (TCCR +/+) 마우스에 대한 뇌 및 척수 섹션에 대한 최대 조직학적 탈수초 점수를 나타내는 그래프이다.
도 14는 CFSE 표지화 분석에서 TCCR을 발현하지 않는 CD4+ T 세포의 증식에 비해 항-CD3 자극에 반응하여 TCCR을 발현하는 CD4+ T 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 15는 CFSE 표지화 분석에서 TCCR을 발현하지 않는 CD8+ T 세포의 증식에 비해 항-CD3 자극에 반응하여 TCCR을 발현하는 CD8+ T 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 16A 내지 C는 중성 (16A), Th1 편향 (16B) 및 Th2 편향 (16C) 조건하에서 다양한 시점에서 IL-27를 사용한 처리에 반응하는 IL-2의 유도를 나타내는 그래프이다. 데이타는 배수 IL-27 의존성 유도로서 나타내어진다.
도 17A 내지 C는 중성 (17A), Th1 편향 (17B) 및 Th2 편향 (17C) 조건하에서 다양한 시점에서 IL-27을 사용한 처리에 반응하는 IL-10의 유도를 나타내는 그래프이다. 데이타는 배수 IL-27 의존성 유도로서 나타내어진다.
도 18A 내지 C는 중성 (18A), Th1 편향 (18B) 및 Th2 편향 (18C) 조건하에서 다양한 시점에서 IL-27을 사용한 처리에 반응하는 SOCS-3의 유도를 나타내는 그래프이다. 데이타는 배수 IL-27 의존성 유도로서 나타내어진다.
도 19는 중성, Th1 편향 및 Th2 편향 조건하에서 IL-27 처리에 반응하는 CD4+ 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 20A 내지 B는 항-IL-2 항체의 부재 (20A) 또는 존재 (20B) 하에서 IL-27 및/또는 IL-6 처리에 반응하는 비세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 21은 IL-27 및 그의 수용체 IL-27R (TCCR)의 도해이다.
도 22는 IL-12 사이토킨 군 내에서 사이토킨의 IL-6 클러스터에 대한 IL-27의 관계를 나타내는 도해이다.
도 23은 헬퍼 T-세포의 분화를 나타내는 도해이다.
도 24는 IL-27R 결핍 마우스에서의 EAE에 대한 과민성을 나타내는 그래프이다.
도 25는 야생형 및 IL-27R 넉아웃 마우스에서의 EAE 표현형의 조직학적 분석을 나타낸다.
도 26은 T-세포에서 IL-27의 관계를 시험하는 프로토콜의 개략도이다.
도 27은 T-세포 발생에 대한 IL-27의 효과의 시험 결과를 나타낸다. IL-27에 대해 반응하는 사이토킨 감소를 하기 사이토킨에 대한 야생형 대조군과 비교한다: IFN-감마, IL-2, TFN, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF 및 IL-17.
도 28은 IL-10, IL-27, 및 IL-10 및 IL-27의 조합물에 반응하는 IL-2 및 GM-CSF 생성의 결과를 그래프적으로 나타낸다.
도 29는 IL-27에 반응하는 IL-10의 강한 유도, IL-10 넉아웃 마우스에서 EAE 의 중증도를 그래프적으로 나타낸다.
도 30은 EAE에서 TH-17의 역할을 묘사하는 도해이다.
도 31은 EAE 질환에 대한 IL-23 및 TH-IL-17 세포의 요건을 그래프적으로 나타낸다.
도 32는 IL-27에 의한 TH-IL-17 사이토킨의 억제를 그래프적으로 나타낸다.
도 33은 IL-27에 의한 IL-17의 억제를 그래프적으로 나타낸다.
도 34는 IL-27에 의해 매개된 IL-17의 억제가 IFNg 독립성임을 그래프적으로 나타낸다.
도 35는 IL-27에 의한 IL-17의 억제가 STAT-1에 의해 매개됨을 그래프적으로 나타낸다.
도 36은 IL-17-R 넉아웃 마우스의 재자극된 림프구로부터의 IL-17-R 넉아웃 마우스로부터의 TH-IL-17 사이토킨의 분비를 그래프적으로 나타낸다.
도 37은 IL-27-R 결핍 마우스에서 MOG 또는 KLH를 유도하는 질환에 반응하는 IL-17 생성을 나타낸다.
도 38은 CNS에 침투하는 CD4T 세포에 의한 IL-17 발현을 그래프적으로 나타낸다.
도 39는 T 헬퍼 분화에 대한 다양한 사이토킨의 관계를 입증하는 도해이다.
도 40은 IL-6 넉아웃 마우스에서 EAE 저항성을 입증하는 그래프이다.
도 41은 TH-IL-17 사이토킨의 유도 및 IL-6에 의한 반응을 그래프적으로 입증한다.
도 42는 IL-27에 의한 IL-6 증식 효과의 길항작용을 입증하는 그래프이다.
도 43은 IL-27 및 IL-6 및 TH-IL-17 발생의 역할을 입증하는 도해이다.
도 44는 IL-27의 다중 수준의 작용을 입증하는 도해이다.
도 45는 사이토킨 발현의 변화를 유도하는데 있어서 IL-27의 역할을 그래프적으로 설명한다.
서열의 간단한 설명
Figure 112007051140237-PCT00001
T-림프구의 과다-증식 또는 Th1 또는 Th2 세포에 의해 생성된 사이토킨의 과다-생성은 다수의 의학적 장애를 초래한다. 예를 들어, Th1 반응과 관련된 사이토킨의 과다-생성 또는 CD8+ 세포독성 T-림프구의 과다-증식은 동종이식 거부반응, 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브스병 및 하시모또 갑상선염), 자가면역 포도막염, 거대세포 동맥염, 염증성 장 질환 (크론병, 궤양성 결장염, 국소성 장염, 육아종성 장염, 원위 회장염, 국소성 회장염 및 말단성 회장염 포함), 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 악성 빈혈, 건선, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 공피증 및 전신성 홍반성 루푸스를 비롯한 자가면역 장애를 초래할 수 있다.
하기 실시예에 상세화된 연구는 TCCR을 발현하는 T 세포보다 TCCR이 없는 T 세포가 비-특이적 T 세포 자극에 반응하여 보다 크게 증식함을 입증하였다 (실시예 1 참조). 이전에, TCCR 및 그의 리간드 IL-27이 Th1 반응을 촉진하는 것으로 제시되었다 (문헌 [Chen et al., 2000, Nature, 407:916-920]; [Yoshida et al., 2001, Immunity, 15:569-578]; [Pflanz et al., 2002, Immunity, 16:779-790]). 그러나, 놀랍게도 TCCR을 발현하는 마우스는 TCCR이 없는 마우스보다, 다발성 경화증에 대한 동물 모델인 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)과 같은 Th1 반응을 부분적으로 특징으로 하는 자가면역 질환에 덜 감수성인 것으로 밝혀졌다 (실시예 2 참조).
하기 실시예에서 나타난 바와 같이, T 림프구의 증식은 TCCR 효능제를 세포에 투여함으로써 억제된다. 또한 나타난 바와 같이, 자가면역 염증성 질환의 감소된 임상적 진행 및 덜 중증의 증상은 TCCR-/- 동물에서보다는 TCCR을 발현하는 동물 (TCCR+/+)에 존재한다.
상기 데이타는 TCCR의 효능제가 T-세포 증식을 감소시키는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 특히, 상기 데이타는 TCCR의 효능제가 다발성 경화증 (MS) 및 류마티스성 관절염 (RA)과 같은 자가면역 매개된 장애의 치료에 유용함을 나타낸다.
정의
"자가면역"이라는 용어는 항체 또는 림프구와 같은 면역계 성분이 이를 생성하는 유기체의 분자, 세포 또는 조직을 공격하거나 유해하게 하는 과정을 지칭한다.
"자가면역 장애"라는 용어는 조직 손상과 같은 손상 또는 발병기전이 적어도 부분적으로 자가면역 과정의 결과인 질환을 지칭한다. 예로서, "자가면역 질환"이라는 용어는 Th1 반응 또는 CD8+ 세포독성 T-림프구에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환을 포함한다. 자가면역 질환으로는 동종이식 거부반응, 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브스병 및 하시모또 갑상선염), 자가면역 포도막염, 거대세포 동맥염, 염증성 장 질환 (크론병, 궤양성 결장염, 국소성 장염, 육아종성 장염, 원위 회장염, 국소성 회장염 및 말단성 회장염 포함), 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 악성 빈혈, 건선, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 공피증 및 전신성 홍반성 루푸스를 들 수 있다.
"Th1 반응"이라는 용어는 전구체로부터 Th1 효과기 세포의 별개의 집단으로의 T 헬퍼 세포의 분화를 지칭하며, IFN-감마, IL-2 및 TNF-베타와 같은 Th1 세포로부터의 사이토킨의 분비를 포함한다. "Th1 편향 조건"이라는 용어는 전구체로부터 Th1 효과기 세포의 별개의 집단으로의 T 헬퍼 세포의 분화를 선호하는 조건을 지칭한다.
"Th1 사이토킨"이라는 용어는 IFN-감마, IL-2 및 TNF-베타를 비롯한 Th1 반응에서 발현되는 사이토킨을 지칭한다 (문헌 [Powrie et al., 1993, Immunol. Today, 14:270])
"Th1 매개된 장애"라는 용어는 Th1 사이토킨의 과다생성에 의해 우세하게 또는 부분적으로 매개되는 장애를 지칭한다. "Th1 매개된 장애"라는 용어는 T-세포의 Th1 아형으로의 분화에서 과다생성 또는 편향으로부터 초래될 수 있는 장애를 포함한다. 이러한 장애로는 자가면역 장애, 예를 들어, RA 및 MS를 들 수 있다.
"Th2 반응"이라는 용어는 전구체로부터 Th2 효과기 세포의 별개의 집단으로의 T 헬퍼 세포의 분화를 지칭하며, IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13과 같은 Th2 세포로부터의 사이토킨의 분비를 포함한다 (문헌 [Powrie et al., 1993, Immunol. Today, 14:270]). "Th2 편향 조건"이라는 용어는 전구체로부터 Th2 효과기 세포의 별개의 집단으로의 T 헬퍼 세포의 분화를 선호하는 조건을 지칭한다.
본원에 사용될 경우 "TCCR 펩티드", "TCCR 단백질" 및 "TCCR"이라는 용어는 천연 서열 TCCR 및 TCCR 펩티드 변이체를 포함한다. TCCR 펩티드는 인간 조직 또는 또다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 및/또는 합성적 방법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 TCCR"은 천연으로부터 유래된 TCCR 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 이러한 천연 서열 TCCR은 천연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 및/또는 합성적 수단에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 TCCR"이라는 용어는 구체적으로 천연-발생 말단절단된 및 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연-발생 말단절단된 형태 (예를 들어, 별법으로 스플라이싱된 형태) 및 TCCR의 천연-발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 일 실시양태에서, 천연 서열 인간 TCCR은 서열 1의 아미노산 1 내지 636을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 TCCR이다. 유사하게, 천연 서열 뮤린 TCCR은 서열 2의 아미노산 1 내지 623을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 TCCR이다. 서열 1 및 서열 2는 아미노산 위치 1로서 본원에 표시된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타나지만, 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 또다른 메티오닌 잔기가 TCCR 펩티드에 대한 출발 아미노산 잔기로서 사용될 수 있음이 고려될 수 있으며 가능하다.
"TCCR 펩티드 세포외 도메인" 또는 "TCCR ECD"는 막관통 및 세포질 도메인이 본질적으로 없는 TCCR 펩티드의 형태를 지칭한다. 통상적으로, TCCR 펩티드 ECD는 이러한 막관통 및/또는 세포질 도메인의 약 1％ 미만을 가질 것이며, 바람직하게는 이러한 도메인의 약 0.5％ 미만을 가질 것이다. 본 발명의 TCCR 펩티드에 대해 확인된 임의의 막관통 도메인(들)은 소수성 도메인의 상기 유형을 확인하는데 통상적으로 사용되는 범주에 따라 확인된다. 막관통 도메인의 정확한 경계는 다양할 수 있지만, 대부분 초기에 확인된 바와 같은 도메인의 양 말단에 약 5개 이하의 아미노산일 것이다. 따라서, 일 실시양태에서, 인간 TCCR 펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 1 또는 대략 33 내지 X1 (여기서, X1은 서열 1의 잔기 512 내지 잔기 522의 임의의 아미노산 잔기임)을 포함한다. 유사하게, 뮤린 TCCR 펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 1 또는 대략 25 내지 X2 (여기서, X2은 서열 2의 잔기 509 내지 잔기 519의 임의의 아미노산임)를 포함한다.
"TCCR 변이체 펩티드"라는 용어는 TCCR 펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖고 하기 아미노산 서열과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 펩티드를 의미한다.
(a1) 서열 1의 인간 TCCR 펩티드의 잔기 1 또는 대략 33 내지 636;
(a2) 서열 2의 뮤린 TCCR 펩티드의 잔기 1 또는 대략 25 내지 623;
(b1) 서열 1의 인간 TCCR 펩티드의 X3 내지 636 (여기서, X3은 서열 1의 임의의 아미노산 잔기 27 내지 37임);
(b2) 서열 2의 뮤린 TCCR 펩티드의 X4 내지 623 (여기서, X4는 서열 2의 임의의 아미노산 잔기 20 내지 30임);
(c1) 1 또는 대략 33 내지 X1 (여기서, X1은 서열 1의 잔기 512 내지 잔기 522의 임의의 아미노산 잔기임);
(c2) 1 또는 대략 25 내지 X2 (여기서, X2는 서열 2의 잔기 509 내지 519의 임의의 아미노산 잔기임);
(d1) X5 내지 636 (여기서, X5는 서열 1의 잔기 533 내지 543의 임의의 아미노산임);
(d2) X6 내지 623 (여기서, X6은 서열 2의 잔기 527 내지 537의 임의의 아미노산임); 또는
(e) 서열 1 및 서열 2의 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유래된 단편.
이러한 TCCR 변이체 펩티드는 예를 들어 서열 1 및 서열 2의 N- 및/또는 C-말단에서 뿐만 아니라 하나 이상의 내부 도메인 내에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가되거나 결실된 TCCR 펩티드를 포함한다. 통상적으로, TCCR 변이체 펩티드는 하기와 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이며, 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
(a1) 서열 1의 인간 TCCR 펩티드의 잔기 1 또는 대략 33 내지 636;
(a2) 서열 2의 뮤린 TCCR 펩티드의 잔기 1 또는 대략 25 내지 623;
(b1) 서열 1의 인간 TCCR 펩티드의 X3 내지 636 (여기서, X3은 서열 1의 임의의 아미노산 잔기 27 내지 37임);
(b2) 서열 2의 뮤린 TCCR 펩티드의 X4 내지 623 (여기서, X4는 서열 2의 임의의 아미노산 잔기 20 내지 30임);
(c1) 1 또는 대략 33 내지 X1 (여기서, X1은 서열 1의 잔기 512 내지 잔기 522의 임의의 아미노산 잔기임);
(c2) 1 또는 대략 25 내지 X2 (여기서, X2는 서열 2의 잔기 509 내지 519의 임의의 아미노산 잔기임);
(d1) X5 내지 636 (여기서, X5는 서열 1의 잔기 533 내지 543의 임의의 아미노산임);
(d2) X6 내지 623 (여기서, X6은 서열 2의 잔기 527 내지 537의 임의의 아미노산임); 또는
(e) 서열 1 및 서열 2의 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유래된 단편.
본원에 사용될 경우 "IL-27"이라는 용어는 천연 서열 IL-27 이종이량체, 천연 서열 IL-27 성분 EBI3 및 p28, IL-27 이종이량체 변이체 (본원에서 추가로 정의됨) 및 EBI3 및 p28의 변이체를 포함한다. IL-27 이종이량체 및 그의 성분은 인간 조직 유형 또는 또다른 공급원으로부터와 같은 다양한 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 및/또는 합성적 방법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 IL-27"은 천연으로부터 유래된 IL-27 이종이량체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 이종이량체를 포함한다. 이러한 천연 서열 IL-27 이종이량체는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 및/또는 합성적 수단에 의해 합성될 수 있다. "천연 서열 IL-27"이라는 용어는 구체적으로 IL-27 이종이량체의 천연-발생 말단절단된 및 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연-발생 말단절단된 형태 (예를 들어, 별법으로 스플라이싱된 형태) 및 천연-발생 대립유전자 변이체를 포함한다.
"IL-27 변이체"라는 용어는 TCCR을 활성화시킬 수 있는, 천연 서열 IL-27 성분 EBI3 및 p28을 비롯한 천연 서열 IL-27에 대한 상동성을 갖는 펩티드를 지칭한다. IL-27 변이체는 EBI3 변이체 및 p28 변이체로부터 형성된 것들을 포함할 수 있다. IL-27 변이체는 또한 TCCR 및 gp130 둘다에 관여할 수 있는 것들을 포함할 수 있다. IL-27 변이체는 TCCR 동종이량체를 형성할 수 있는 것들을 포함할 수 있다. IL-27 변이체는 PEG화된 IL-27을 포함한다.
본원에 사용될 경우 "p28"이라는 용어는 천연 서열 p28 및 p28 펩티드 변이체를 포함한다. p28은 인간 조직 유형 또는 또다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 및/또는 합성적 방법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 p28"은 천연으로부터 유래된 p28 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 p28은 천연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 및/또는 합성적 수단에 의해 합성될 수 있다. "천연 서열 p28"이라는 용어는 구체적으로 p28의 천연-발생 말단절단된 및 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연-발생 말단절단된 형태 (예를 들어, 별법으로 스플라이싱된 형태) 및 천연-발생 대립유전자 변이체를 포함한다.
"p28 펩티드 변이체"라는 용어는 천연 서열 인간 p28 (서열 3) 또는 뮤린 p28 (서열 4)과 73％, 75％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함한다. p28 펩티드 변이체는 TCCR 및 gp130에 결합할 수 있는 p28의 부분을 포함한다. p28 펩티드 변이체는 TCCR을 활성화시킬 수 있는 p28의 부분을 포함한다. p28 펩티드 변이체는 TCCR 상에서 발견된 사이토킨 수용체 상동성 도메인의 영역에서 TCCR에 결합하는 것으로 믿어지는 p28의 제1 및 제3 알파 나선으로부터의 잔기, 및 gp130 상에서 발견된 IG 도메인에 결합하는 것으로 믿어지는 제1 나선의 마지막 및 제4 나선의 처음의 잔기를 함유하는 펩티드를 포함한다.
본원에 사용될 경우 "EBI3"이라는 용어는 천연 서열 EBI3 및 EBI3 펩티드 변이체를 포함한다. EBI3 펩티드는 인간 조직 유형 또는 또다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 및/또는 합성적 방법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 EBI3"은 천연으로부터 유래된 EBI3 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 EBI3은 천연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 및/또는 합성적 수단에 의해 합성될 수 있다. "천연 서열 EBI3"이라는 용어는 구체적으로 EBI3의 천연-발생 말단절단된 및 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연-발생 말단절단된 형태 (예를 들어, 별법으로 스플라이싱된 형태) 및 천연-발생 대립유전자 변이체를 포함한다.
"융합 단백질"이라는 용어는 예로서 2가지 상이한 단백질을 코딩하는 2가지 유전자의 융합으로부터 초래된 발현 생성물을 지칭한다. 상기 용어는 또한 2가지 상이한 단백질의 일부분을 코딩하는 2가지 유전자의 일부분의 융합으로부터 초래된 발현 생성물을 포함한다. 상기 용어는 번역 후에 일어난 융합으로부터 초래된 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 상기 용어는 이종 펩티드에 융합된 IL-27, 그의 성분 (EBI3 및 p28) 또는 그의 일부분을 포함할 것이다. 상기 용어는 또한 이종 펩티드에 융합된 TCCR 또는 그의 일부분을 포함할 것이다. 상기 용어는 또한 p28에 융합되어 기능적 1쇄 사이토킨을 형성하는 EBI3을 포함할 것이다 (문헌 [Pflanz et al., 2002, Immunity, 16:779-790]). 상기 용어는 인간 Fc 태그에 컨쥬게이션된 IL-27을 포함한다.
본원에 사용된 주어진 펩티드에 관한 "이종 펩티드"는 기원에 무관하게 상이한 서열을 갖는 펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 천연 서열 TCCR에 관해, 이종 펩티드는 천연 서열 TCCR 이외의 서열을 갖는 펩티드를 지칭한다. 천연 서열 IL-27에 관해, 이종 펩티드는 천연 서열 IL-27 이외의 서열을 갖는 펩티드를 지칭한다.
"효능제"라는 용어는 천연 서열 펩티드의 생물학적 활성을 증진시키거나 자극하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효능제 분자로는 구체적으로 본 발명의 효능제 펩티드, 효능제 항체 또는 항체 단편, 천연 펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체 등을 들 수 있다. TCCR의 효능제의 확인 방법은 예를 들어 TCCR 펩티드 또는 TCCR 펩티드-발현 세포를 후보 효능제 분자와 접촉시키고, 하나 이상의 TCCR 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "TCCR 생물학적 활성"은 T-세포 증식을 감소시키거나 억제하는 것과 같은 TCCR 매개된 반응을 지칭한다. TCCR 생물학적 활성은 Th1 반응 또는 Th1 매개된 장애를 감소시키거나 억제하는 것을 포함한다. TCCR 생물학적 활성은 IL-10 및 SOCS-3의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. TCCR 생물학적 활성은 또한 TCCR의 활성화와 관련된 신호전달, 예를 들어 Stat1, Stat3, Stat4 및 Stat5와 같은 신호 변환 및 전사 인자의 인산화를 포함한다 (문헌 [Lucas et al., 2003, PNAS, 100(25): 15047-52]).
"항체" 및 "이뮤노글로불린"이라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (효능제 및 길항제 항체 포함), 다가 항체 (예를 들어 이가 항체), 다중특이적 항체 (예를 들어 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 이중특이적 항체), 다중에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 친화도 성숙 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항원 결합 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2, scFv 및 Fv)을 들 수 있다. 천연 발생 항체는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 4가지 펩티드 쇄, 즉 2가지 동일한 중 (H) 쇄 및 2가지 동일한 경 (L) 쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 도메인 (VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3가지 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 도메인 (VL) 및 경쇄 불변 영역 도메인을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1가지 도메인, 즉 CL을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 보다 보존된, 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 영역으로 산재된, 서열에 의해 정의된 바와 같은 상보성 결정 영역 (CDR) (문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md] 참조) 또는 3차원 구조에 의해 정의된 바와 같은 초가변 루프 (HVL) (문헌 [Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol, 196:901-917])로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 하기 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR (또는 HVL) 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1 (HVL1), FR2, CDR2 (HVL2), FR3, CDR3 (HVL3), FR4.
항체 (이뮤노글로불린)는 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류로 할당된다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 부류가 있으며, 이들 중 몇몇은 IgG1, IgG2, IgA1, IgA2 등과 같은 하위부류 (이소형)으로 추가로 나누어진다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 예를 들어 문헌 [Abbas et al., 2000, Cellular and Mol. Immunology, 4th ed.]에 기재되어 있다. 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 항체의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부분일 수 있다.
"전장 항체"라는 용어는 하기 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 그의 실질적으로 비손상 형태의 항체를 지칭한다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 전장 항체는 천연 서열 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 전장 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙일 수 있다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단에 포함되는 개별 항체는 항체의 생성 동안 발생할 수 있는 변이체를 제외하고는 본질적으로 동일하다.
본원에 기재된 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., 1984, PNAS, 81:6851-6855]).
비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 루프 (HVL)로부터의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 하나 이상의 CDR 또는 HVL로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수여자 항체)이다. 일부의 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 특이적 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 도입된 CDR (또는 HVL) 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형이 이루어져 항체 성능을 추가로 개량하고 최대화한다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 또는 HVL이 비-인간 이뮤노글로불린의 그것과 상응하거나, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것인, 실질적으로 모든 하나 이상의, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다.
경쇄 및 중쇄 둘다의 인간 가변 도메인의 선택은 인간화 항체의 제조에 사용될 수 있다. "최적" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 예를 들어 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 서열과 가장 가까운 인간 서열은 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 사용된다 (문헌 [Sims et al., 1993, J. Immunol., 151:2296]). 별법으로, 수여자 프레임워크 영역은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군에 대한 인간 항체 컨센서스 서열로부터 유래될 수 있다. 동일한 프레임워크가 사용되거나 변형될 수 있으며, 몇몇 상이한 인간화 항체를 생성하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al., 1993, J. Immunol., 151:2623]). 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부분을 임의로 포함한다. 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525]; [Reichmann et al., 1988, Nature, 332:323-329]; 및 [Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596]을 참조한다. 인간화 항체는 또한 항체의 항원-결합 영역이 마카쿠 원숭이를 당해 항원으로 면역화시킴으로써 생성된 항체로부터 유래된 프리마티지드(PRIMATIZED)(등록상표) 항체일 수 있다.
면역화시 내인성 이뮤노글로불린 생성의 부재하에서 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스)가 생성될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식-계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 초래한다. 이러한 생식-계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식-계열 이뮤노글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 챌린지시 인간 항체의 생성을 초래한다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551]; [Jakobovits et al., 1993, Nature, 362:255-258]; [Bruggermann et al., 1993, Year in Immuno., 7:33]을 참조한다. 인간 항체는 또한 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol, 227:381]; 또는 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222:581-597]에 기재된 바와 같이 파지-제시 라이브러리로부터 유래될 수 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하는 임의의 기술을 이용하여 제조된 것이다.
"친화도 성숙" 항체는 상기 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해, 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 초래하는 하나 이상의 초가변 영역에서의 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성된다. 예를 들어, VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있는 문헌 [Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783]을 참조한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813]; [Schier et al., 1995, Gene 169:147-155]; [Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004]; [Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9]; 및 [Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226:889-896]에 기재되어 있다.
"항체 단편"은 일반적으로 비손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하며 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유하는 비손상 항체의 일부분만을 포함한다. 본 정의에 의해 포함되는 항체 단편의 예는 하기를 포함한다.
(i) 중쇄 및 경쇄 사이에 1개의 쇄간 디술피드 결합을 갖는 VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편;
(ii) CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편;
(iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편;
(iv) VH 및 CH1 도메인, 및 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편;
(v) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편;
(vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편;
(vii) 적어도 VL, VH, CL, CH1 도메인을 포함하며 힌지 영역이 없는 무힌지 항체;
(viii) 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편;
(ix) 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, 단일쇄 Fv; scFv);
(x) 동일한 펩티드 쇄에 경쇄 가면 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디(diabody)";
(xi) 경쇄, 중쇄, 및 단일 암 항원 결합 도메인의 반감기를 증가시킬 수 있는 Fc 영역을 형성하는데 충분한 N-말단 말단절단된 중쇄 불변 영역을 포함하는 단일 암 항원 결합 분자;
(xii) 상보성 경쇄 펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체".
본원에 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 천연 과정을 변화시키려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상적 병리증상의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 목적하는 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 장애의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다.
TCCR
TCCR (WSX-1)은 IL-12 β-2 수용체, G-CSFR 및 IL-6 수용체와 상동성을 갖는 사이토킨 수용체의 WS(G)XWS 부류이다. 가장 높은 상동성은 IL-12 β-2 수용체에 대해서이다 (26％ 동일성). 상기 수용체는 세포, 특히 혈액 세포 성장 및 분화에 관여하는 세포의 성장 및 분화를 제어하는 신호를 변환한다. 하기 실시예에 제시된 데이타는 TCCR 활성화가 CD8+ T-림프구의 증식 또는 Th1 반응을 비롯한 자가면역 과정의 억제를 직접적으로 또는 간접적으로 유도함을 암시한다.
자가면역 과정의 억제는 T-세포를 다른 유사분열 자극에 비-반응성이 되게 할 수 있는 사이토킨 신호전달 (SOCS) 단백질 족 구성원의 억제자의 유도를 통해 일어날 수 있다 (문헌 [Alexander et al., 2004, Ann. Rev. Immunol., 22:503]). 특히, SOCS-3은 키나제 활성을 억제함으로써 사이토킨 신호전달을 억제하는 야누스 키나제의 활성화 루프에 결합하는 단백질이다 (문헌 [Masuhara et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 239: 439-446]). 퍼옥시좀 증식제-활성화된 수용체 (PPAR)-감마 효능제와 같은 일부 작용제의 항염증성 효과는 SOCS1 및 SOCS3의 전사를 유도함으로써 기능한다고 보고되었다 (문헌 [Park et al., 2003, J. Biol. Chem., 278: 14747-14752]). 하기 실시예에 제시된 데이타는 TCCR 활성화가 SOCS3의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도함을 나타낸다.
자가면역 과정의 억제는 또한 IL-10의 유도를 통해서도 일어난다. IL-10은 활성화된 T 세포, B 세포, 단핵구 및 각질세포에 의해 생성되는 사이토킨이다. IL-10은 IL-2, IL-3, IFN-γ, GM-CSF 및 TNF를 비롯한 다수의 사이토킨의 생성을 억제한다. IL-10은 염증성 반응을 제한하고 종식시키는데 있어서 주요한 역할을 한다 (문헌 [Moore et al., 2001, Ann. Rev. Immunol., 19: 683]). 하기 실시예에 제시된 데이타는 TCCR 활성화가 IL-10의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도함을 나타낸다.
인간 TCCR의 아미노산 서열은 공개되었으며 (1996년 5월 23일자로 출원된 WO97/44455), 젠뱅크(GenBank)로부터 수탁 번호 4759327로 이용가능하다. 상기 서열은 또한 문헌 [Sprecher et al., 1998, Biochem. Biophys, Res. Commun. 246(1):82-90]에 기재되어 있다. 인간 TCCR (hTCCR)의 서열은 636 아미노산 길이이며, 하기 표 1에 나타나 있다 (서열 1). 신호 펩티드는 아미노산 잔기 1 내지 32로 확인되었으며, 막관통 도메인은 서열 1의 아미노산 잔기 517 내지 538로 확인되었다. N-글리코실화 부위는 잔기 51 내지 54, 76 내지 79, 302 내지 305, 311 내지 314, 374 내지 377, 382 내지 385, 467 내지 470, 563 내지 566에서 확인되었으며, N-미리스토일화 부위는 잔기 107 내지 112, 240 내지 245, 244 내지 249, 281 내지 286, 292 내지 297, 373 내지 378, 400 내지 405, 459 내지 464, 470 내지 475, 531 내지 536 및 533 내지 538에서 확인되었다. 원핵세포 막 지단백질 지질 부착 부위는 잔기 522 내지 532에 존재하며, 성장 인자 및 사이토킨 수용체 족 기호 1은 잔기 41 내지 54에 존재한다. 또한, 잔기 183 내지 191에는 인간 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)에 대한 수용체의 제2 서브유닛과 유의한 상동성의 영역이 있다. TCCR은 서열 1의 잔기 41 내지 230에서 TCCR 상의 사이토킨 수용체 상동성 도메인에 있는 IL-27 서브유닛 p28과 결합한다. 기재된 모든 hTCCR 잔기는 서열 1의 서열에 따라 넘버링된다.
성인에서, hTCCR은 흉선에서 가장 높게 발현되지만, 또한 말초 혈액 백혈구 (PBL), 비장에서도 발현이 나타나며, 폐에서도 약하게 발현된다. 태아 조직은 폐 및 신장에서 약한 TCCR 발현을 나타낸다.
뮤린 TCCR (mTCCR)의 아미노산 서열은 공개되었으며 (1996년 5월 23일자로 출원된 WO97/44455), 젠뱅크로부터 수탁 번호 7710109로 이용가능하다. 상기 서열은 또한 문헌 [Sprecher et al., 1998, Biochem. Biophys, Res. Commun. 246(1):82-90]에 기재되어 있다. mTCCR에 대한 서열은 623 아미노산 길이이며, 하기 표 1에 나타나 있다 (서열 2). 신호 펩티드는 아미노산 잔기 1 내지 24에서 확인되었으며, 막관통 도메인은 서열 2의 아미노산 잔기 514 내지 532에서 확인되었다. N-글리코실화 부위는 서열 2의 잔기 46 내지 49, 296 내지 299, 305 내지 308, 360 내지 361, 368 내지 371 및 461 내지 464에서 확인되었다. 카세인 키나제 II 인산화 부위는 잔기 10 내지 13, 93 내지 96, 130 내지 133, 172 내지 175, 184 내지 187, 235 내지 238, 271 내지 274, 272 내지 275, 323 내지 326, 606 내지 609 및 615 내지 618에서 확인되었다. 티로신 키나제 인산화 부위는 대략 잔기 202 내지 209에서 발견되었다. N-미리스토일화 부위는 대략 잔기 43 내지 48, 102 내지 107, 295 내지 300, 321 내지 326, 330 내지 335, 367 내지 342, 393 내지 398, 525 내지 530 및 527 내지 532에서 확인되었으며, 아미드화 부위는 대략 잔기 240 내지 243에서 확인되었다. 원핵세포 막 지단백질 지질 부착부는 대략 잔기 516 내지 526에 존재하며, 성장 인자 및 사이토킨 수용체 족 기호 1은 대략 잔기 36 내지 49에 존재한다. 인간 에리트로포이에틴과 유의한 상동성의 영역은 대략 잔기 14 내지 51에 존재하며, 뮤린 인터루킨-5 수용체와 유의한 상동성의 영역은 잔기 211 내지 219에 존재한다. 기재된 모든 mTCCR 잔기는 서열 2의 서열에 따라 넘버링된다.
Figure 112007051140237-PCT00002
Figure 112007051140237-PCT00003
IL-27
IL-27은 TCCR에 대한 리간드이다 (문헌 [Pflanz et al., 2002 Immunity 16(6):779-790]). IL-27은 EBI3 (엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 유도된 유전자 3) 및 p28 단백질 서브유닛으로 이루어진 이종이량체성 사이토킨이다. p28은 3개의 접촉 표면을 갖는 4 나선 다발 사이토킨이다. 제1 접촉 표면은 EBI3에 결합하며, 제2 및 제4 알파 나선의 잔기를 포함한다. 제2 접촉 표면은 사이토킨 수용체 상동성 도메인의 영역에서 TCCR에 결합하며, 제1 및 제3 알파 나선의 잔기를 포함한다. 제3 접촉 표면은 gp130에서 발견되는 IG 도메인과 같은 IG 도메인에 결합하며, 제1 나선의 마지막 및 제4 나선의 처음의 잔기를 포함한다.
인간 p28의 펩티드 서열 (서열 3)은 243 아미노산 길이인 반면, 뮤린 p28의 펩티드 서열 (서열 4)은 234 아미노산 길이이다 (Pflanz, NCBI 수탁 번호 AAM34499). 하기 표 2에 나타난 상기 서열은 73％ 서열 동일성을 공유한다.
Figure 112007051140237-PCT00004
EBI3은 가용성 사이토킨 수용체의 구조를 가지며, p28 상의 특이적 결합 부위에 결합한다. 인간 EBI3은 229 아미노산 길이이며 (문헌 [Devergne et al., 1996, J. of Virology 70(2): 1143-1153]), 하기 표 3에 나타난 펩티드 서열 (서열 5)을 갖는다.
Figure 112007051140237-PCT00005
TCCR/IL-27 수용체 복합체
도 1은 TCCR/IL-27 수용체 복합체의 구조를 나타낸다. IL-27에 대한 완전한 수용체는 gp130 및 TCCR 서브유닛을 함유한다. 사이토킨 수용체 상동성 도메인은 gp130에서 서열 6의 대략 잔기 126 내지 323에 존재한다. gp130 상에 존재하는 다른 상동성 도메인은 서열 6의 대략 잔기 324 내지 423, 424 내지 518 및 519 내지 614에 위치된 3개의 피브로넥틴 제III형 도메인, 및 대략 잔기 22 내지 122에 이뮤노글로불린 도메인을 포함한다. gp130은 또한 IL-6, IL-11, CNTF, LIF, CT1 및 CLC에 대한 수용체의 성분인 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Hibi et al., 1990, Cell, 63(6):1149-1157]). gp130의 아미노산 서열 (서열 6)은 하기 표 4에 나타나 있다.
Figure 112007051140237-PCT00006
Figure 112007051140237-PCT00007
TCCR의 IL-27 활성화는 주요 Th1-특이적 전사 인자인 T-bet의 발현을 유도한다 (문헌 [Lucas et al., 2003, PNAS, 100:15047-52]). TCCR 활성화의 효과는 Stat (신호 변환제 및 전사의 활성화제)에 의해 매개된다. 구체적으로, TCCR 활성화는 Stat1, Stat3, Stat4 및 Stat5의 인산화를 초래한다 ([Lucas et al., 2003], 상기 문헌). 하기 실시예에 제시된 데이타는 TCCR 활성화가 CD8+ T-림프구의 증식 또는 Th1 반응을 비롯한 자가면역 과정의 억제를 직접적으로 또는 간접적으로 유도함을 암시한다.
TCCR 및 T-림프구 아형
상기 기재된 바와 같이, 4개의 나선 다발 사이토킨 족의 구성원 (문헌 [Bazan, J. F., 1990, Proc Natl Acad Sci USA, 87:6934-8])은 공통적인 전구체로부터 Th1 및 Th2 효과기 세포의 별개의 집단으로의 T 헬퍼 세포의 팽창 및 말단 분화에 있어서 역할을 한다 (문헌 [O'Garra., 1998, Immunity, 8:275-83]). IL-4는 Th2 세포의 발생에 우세하게 영향을 주는 반면, IL-12는 Th1 세포의 분화에 있어서 주요한 인자이다 (문헌 [Hsieh et al., 1993, Science, 260:547-9]; [Seder et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA, 90:10188-92]; [Le Gros et al., 1990, J Exp Med, 172:921-9]; [Swain et al., 1991, Immunol Rev, 123: 115-44]). 따라서, IL-4 (문헌 [Kuhn et al., 1991, Science, 254:707-10]), IL-4 수용체 α 쇄 (문헌 [Noben-Trauth et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA, 94:10838-43]) 또는 IL-4 특이적 전사 인자 STAT6 (문헌 [Shimoda et al., 1996, Nature, 380:630-3]) 결핍 마우스는 Th2 반응에 결함이 있는 반면, IL-12 (문헌 [Magram et al., 1996, Immunity, 4:471-81]), IL-12 수용체 (IL-12R) β1 쇄 (문헌 [Wu et al., 1997, J Immunol, 159:1658-65]) 또는 IL-12 특이적 전사 인자 STAT4 (문헌 [Kaplan et al., 1996, Nature, 382:174-7]) 결핍 마우스는 Th1 반응이 손상된다.
Th1 및 Th2 세포 아형은 공통적인 전구체인 TH-O 세포로부터 유래된다. Th1 및 Th2 세포로부터의 사이토킨 방출 프로파일은 효과기 메카니즘 및 세포독성 세포의 선택에 영향을 준다. Th1 세포에 의해 분비된 IL-2 및 인터페론-감마는 대식세포 및 세포독성 세포를 활성화시키는 반면, Th2 세포에 의해 분비된 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10은 호산구 및 비만 세포의 생성을 증가시킬 뿐만 아니라 IgE를 비롯한 항체의 생성을 증진시키고, 세포독성 세포의 기능을 감소시키는 경향이 있다 (문헌 [Powrie et al., 1993, Immunol. Today, 14:270]). 일단 수립되면, Th1 또는 Th2 반응 패턴은 다른 하위집단의 세포에 의한 사이토킨 생성을 일반적으로 억제하는 사이토킨의 생성에 의해 유지된다. 예를 들어, IL-4는 Th1 클론으로부터의 인터페론-감마의 생성을 억제하는 반면, 인터페론-감마는 Th2 클론으로부터의 IL-4의 생성을 억제한다 (문헌 [Mosmann et al., 1989, Adv. Immunol., 46:111-147]; [Mosmann et al., 1989, Annu. Rev. Immunol, 7:145-173]). 상기 음성 피드백 루프에서는 많은 면역 반응 동안 극성화된 사이토킨 프로파일의 생성이 두드러지진다.
세포독성 T-림프구 (CD8+)는 다른 세포를 급속하게 파괴할 수 있다. 세포독성 T-림프구는 2가지 주요한 세포용해 경로를 이용한다: 퍼포린-의존성 세포외유출 경로 및 Fas 리간드/Fas 경로. 세포독성 T-림프구는 또한 인터페론-감마와 같은 프로-염증성 사이토킨의 생성제이다.
Th1 반응과 관련된 사이토킨의 과다생성 또는 CD8+ 세포독성 T-림프구의 과다증식은 동종이식 거부반응, 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브스병 및 하시모또 갑상선염), 자가면역 포도막염, 거대세포 동맥염, 염증성 장 질환 (크론병, 궤양성 결장염, 국소성 장염, 육아종성 장염, 원위 회장염, 국소성 회장염 및 말단성 회장염 포함), 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 악성 빈혈, 건선, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 공피증 및 전신성 홍반성 루푸스를 비롯한 자가면역 장애를 초래할 수 있다.
하기 실시예에 상세화된 연구는 TCCR을 발현하는 T-림프구에 비해 TCCR이 없는 T-림프구가 비-특이적 T-림프구 자극에 반응하여 보다 크게 증식함을 입증한다 (실시예 1 참조). 또한, 놀랍게도 TCCR을 발현하는 마우스는 TCCR이 없는 마우스보다 다발성 경화증에 대한 동물 모델인 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)과 같은 자가면역 장애에 덜 감수성임이 밝혀졌다 (실시예 2 참조).
상기 데이타는 T-림프구 증식 및 Th1 매개된 생물학적 활성의 TCCR-매개된 직접적 또는 간접적 억제를 암시한다. 따라서, TCCR의 효능제는 T-세포 증식을 억제하고/거나 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염을 비롯한 자가면역 장애의 치료에 사용될 수 있다.
자가면역 장애
상기 논의된 바와 같이, T-림프구의 과다-증식 또는 Th1 또는 Th2 세포에 의해 생성된 사이토킨의 과다-생성은 다수의 의학적 장애를 초래한다. 예를 들어, Th1 반응과 관련된 사이토킨의 과다-생성 또는 CD8+ 세포독성 T-림프구의 과다-증식은 동종이식 거부반응, 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브스병 및 하시모또 갑상선염), 자가면역 포도막염, 거대세포 동맥염, 염증성 장 질환 (크론병, 궤양성 결장염, 국소성 장염, 육아종성 장염, 원위 회장염, 국소성 회장염 및 말단성 회장염 포함), 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 악성 빈혈, 건선, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 공피증 및 전신성 홍반성 루푸스를 비롯한 자가면역 장애를 초래할 수 있다.
다발성 경화증은 T 림프구 의존성인 것으로 믿어지는 자가면역 탈수초 장애이다. MS는 일반적으로 재발-완화 과정 또는 만성 진행 과정을 나타낸다. MS의 병인은 공지되어 있지 않지만, 바이러스 감염, 유전적 경향, 환경 및 자가면역성은 모두 장애에 기여하는 것으로 보인다. MS 환자의 병변은 우세하게 T 림프구 매개된 미세아교 세포 및 침윤성 대식세포의 침윤물을 함유한다. CD4+ T 림프구는 상기 병변에 존재하는 우세한 세포 유형이다. MS 병변의 특징은 MRI 주사에서 나타나는 통상적인 백색 물질로부터 현저하게 구별되는 탈수초의 영역인 플라크이다. MS 플라크의 조직학적 외관은 질환의 상이한 단계에 따라 다양하다. 활성 병변에서, 혈액-뇌 경계가 손상되므로, 혈청 단백질이 세포외 공간으로 분출된다. 염증성 세포는 혈관주위 커프에서 및 백색 물질 도처에 나타날 수 있다. CD4+ T-세포, 특히 Th1은 플라크의 연부에서 모세관후 세정맥 주위에 축적되며, 또한 백색 물질에 산재된다. 활성 병변에서, 부착 분자의 상향-조절 및 IL2-R 및 CD26과 같은 림프구 및 단핵구 활성화의 마커가 또한 관찰되었다. 활성 병변에서의 탈수초는 희소돌기아교세포의 파괴에 수반되지 않는다. 반대로, 질환의 만성 단계 동안, 병변은 희소돌기아교세포의 소실과, 따라서 혈액 내의 수초 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 항체의 존재를 특징으로 한다.
자가면역 장애에 대해 다양한 널리-수용된 동물 모델이 존재한다. 예로서, EAE (실험적 알레르기성 뇌척수염)는 T 세포 및 단핵 세포 염증 및 후속의 중추 신경계의 액손의 탈수초를 특징으로 하는 T 세포 매개된 자가면역 장애이다. EAE는 일반적으로 인간에서 MS에 대한 관련된 동물 모델인 것으로 간주된다 (예를 들어, 문헌 [Bolton, C., 1995, Multiple Sclerosis, 143] 참조). 후보 TCCR 효능제와 같은 작용제는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, units 15.1 and 15.2; edited by Coligan et al., National Institutes of Health, Published by John Wiley & Sons, Inc.]에 기재된 프로토콜을 이용하여 면역 매개된 탈수초 장애에 대한 T 세포 자극 또는 억제 활성에 대해 분석될 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Duncan et al., 1997, Molec. Med. Today, 554-561]에 기재된 바와 같이 희소돌기아교세포 또는 슈반(Schwann) 세포가 중추 신경계 내로 이식된 수초 질환에 대한 모델을 참조한다.
관절염에 대한 동물 모델은 콜라겐-유도된 관절염이다. 예를 들어, 문헌 [McIndoe et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2210-2214]을 참조한다. 상기 모델은 인간 자가면역 류마티스성 관절염의 임상적, 조직학적 및 면역학적 특징을 공유하며, 인간 자가면역 관절염에 대한 수용가능한 모델이다. 마우스 및 래트 모델은 윤활막염, 연골 및 연골하골의 진무름을 특징으로 한다. 콜라겐-유도된 관절염은 림프구 침윤 및 윤활막 막 비대증을 비롯한, 인간에서의 류마티스성 관절염과 많은 특징을 공유한다. 예를 들어, 문헌 [McIndoe et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2210-2214]을 참조한다. TCCR의 잠재적인 효능제는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, units 15.5; edited by Coligan et al., National Institutes of Health, Published by John Wiley & Sons, Inc.]에 기재된 프로토콜을 이용하여, 상기 모델을 이용하여 자가면역 관절염에 대한 활성에 대해 분석될 수 있다. 또한, 문헌 [Issekutz, A. C. et al., Immunology (1996) 88:569]에 기재된 CD 18 및 VLA-4 인테그린에 대한 모노클로날 항체를 이용한 모델을 참조한다.
피부 동종이식 거부반응에 대한 동물 모델은 항-바이러스 및 종양 면역성에서의 그의 역할의 지표 및 척도인 생체내 조직 파괴를 매개하는 T 세포의 능력을 시험하는 수단이다. 가장 통상적이고 수용되는 모델은 마우스 꼬리-피부 이식을 이용한다. 반복된 실험은 피부 동종이식 거부반응이 항체에 의해서가 아니라 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 킬러-효과기 T 세포에 의해 매개됨을 나타내었다. 예를 들어, 문헌 [Auchincloss and Sachs, 1998, In: Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, at pages 889-992]을 참조한다. 적합한 절차는 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.4; edited by Coligan et al., 1995, National Institutes of Health, Published by John Wiley & Sons, Inc.]에 상세히 기재되어 있다. 후보 TCCR 효능제를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 다른 이식 거부반응 모델로는 예를 들어 문헌 [Tanabe et al., 1994, Transplantation, 58:23] 및 [Tinubu et al., 1994, J. Immunol, 4330-4338]에 기재된 동종이식 심장 이식 모델을 들 수 있다.
TCCR의 효능제
TCCR의 효능제는 본원에 개시된 천연 서열 TCCR 펩티드의 생물학적 활성을 증진시키거나 자극하는 분자이다. 적합한 효능제 분자는 구체적으로, 인간화 항체 또는 Fab, Fab', Fd, Fd', Fv, dAb, 무힌지 항체, F(ab')2 단편, 단일쇄 항체 분자, 디아바디, 단일 암 항원 결합 분자 및 선형 항체를 비롯한 효능제 항체의 단편, 천연 폴리펩티드, 펩티드, 소분자의 아미노산 서열 변이체 등을 포함한다.
적합한 TCCR의 효능제는 또한 TCCR의 펩티드 단편, TCCR 세포외 도메인, 및 하기 아미노산 서열과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 TCCR 변이체를 포함한다.
(a1) 서열 1의 인간 TCCR 펩티드의 잔기 1 또는 대략 33 내지 636;
(a2) 서열 2의 뮤린 TCCR 펩티드의 잔기 1 또는 대략 25 내지 623;
(b1) 서열 1의 인간 TCCR 펩티드의 X3 내지 636 (여기서, X3은 서열 1의 임의의 아미노산 잔기 27 내지 37임);
(b2) 서열 2의 뮤린 TCCR 펩티드의 X4 내지 623 (여기서, X4는 서열 2의 임의의 아미노산 잔기 20 내지 30임);
(c1) 1 또는 대략 33 내지 X1 (여기서, X1은 서열 1의 잔기 512 내지 잔기 522의 임의의 아미노산 잔기임);
(c2) 1 또는 대략 25 내지 X2 (여기서, X2는 서열 2의 잔기 509 내지 519의 임의의 아미노산 잔기임);
(d1) X5 내지 636 (여기서, X5는 서열 1의 잔기 533 내지 543의 임의의 아미노산임);
(d2) X6 내지 623 (여기서, X6은 서열 2의 잔기 527 내지 537의 임의의 아미노산임); 또는
(e) 서열 1 및 서열 2의 아미노산 서열의 또다른 특이적으로 유래된 단편.
TCCR의 효능제는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 서열 1 및 서열 2의 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 또는 하나 이상의 내부 도메인 내에서 첨가되거나 결실된 TCCR 펩티드를 포함한다.
TCCR의 효능제는 천연 서열 IL-27, EBI3, p28, 통상적으로 IL-27 이종이량체와 관련된 생물학적 활성을 갖는 그의 변이체 및 단편을 포함한다. 예를 들어, TCCR의 효능제는 IL-27의 천연 서열 성분과 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 IL-27 변이체를 포함한다. TCCR의 효능제는 또한 천연 서열 인간 p28 (서열 3) 또는 뮤린 p28 (서열 4)과 73％, 75％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 p28 변이체를 포함한다. TCCR의 효능제는 TCCR 및 gp130에 결합할 수 있는 p28의 일부분을 포함한다. 예로서, TCCR의 효능제는 천연 서열 인간 p28 (서열 3) 또는 뮤린 p28 (서열 4)과 73％, 75％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 가지며, TCCR 및 gp130에 결합할 수 있는 p28 변이체를 포함한다. TCCR의 효능제는 TCCR 상에서 발견된 사이토킨 수용체 상동성 도메인의 영역에서 TCCR에 결합하는 것으로 믿어지는 p28의 제1 및 제3 알파 나선으로부터의 잔기, 및 gp130 상에서 발견된 IG 도메인에 결합하는 것으로 믿어지는 제1 나선의 마지막 및 제4 나선의 처음의 잔기를 함유하는 p28 펩티드 변이체를 포함한다.
TCCR의 효능제는 예를 들어 TCCR에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 분자를 포함한다. TCCR의 효능제는 또한 TCCR이 동종이량체를 형성하도록 할 수 있는 분자 및/또는 TCCR 및 gp130이 이종이량체를 형성하도록 할 수 있는 분자를 포함한다. 예를 들어, TCCR에 대한 항체는 TCCR이 동종이량체를 형성하도록 할 수 있다. 추가의 예로서, TCCR 및 gp130 둘다에 특이적인 이가 항체는 TCCR 및 gp130이 이종이량체를 형성하도록 할 수 있다.
TCCR 펩티드의 효능제 또는 길항제의 확인 방법은 TCCR 펩티드를 후보 효능제 또는 길항제 분자와 접촉시키고, TCCR 펩티드와 관련된 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 효능제는 TCCR 펩티드를 발현하는 세포를 후보제와 접촉시킨 후, 접촉된 세포를 웨스턴 블롯 또는 또다른 적합한 분석법을 이용하여 Stat1, Stat3, Stat4 또는 Stat5의 인산화와 같은 TCCR의 생물학적 활성에 대해 분석함으로써 확인된다. TCCR의 효능제는 또한 TCCR 펩티드를 발현하도록 유전자조작된 Ba/F3 세포와 같은 세포를 후보 효능제와 접촉시킨 후, 접촉된 세포를, 예를 들어 [3H] 표지된 티미딘 혼입을 측정함으로써 또는 또다른 적합한 분석법에 의해 증식에 대해 분석함으로써 확인될 수 있다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체를 제조하는 많은 기술이 공지되어 있다. 예를 들어 한 가지 방법에서, Balb/c와 같은 마우스를 면역원으로서 TCCR 또는 그의 일부분으로 면역화시키고, 완전 프로인트 아주반트에 유화시키고, 1 내지 100 ㎍의 양으로 피하로 또는 복막내로 주사한다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 아주반트 (몬타나주 해밀톤에 소재하는 리비 이뮤노케미칼 리서치(Ribi Immunochemical Research))에 유화시키고, 동물의 뒷발바닥 내로 주사한다. 그 후, 면역화된 마우스를 선택된 아주반트에 유화된 추가의 면역원으로 10 내지 12일 후에 부스팅한다. 그 후, 수 주 동안, 마우스를 또한 추가의 면역화 주사로 부스팅할 수 있다. 혈청 샘플을 ELISA 분석법으로 시험하기 위해 역-궤도 출혈에 의해 마우스로부터 정기적으로 수득하여 항-TCCR 항체를 검출할 수 있다.
적합한 항체 역가가 검출된 후, 항-TCCR 항체에 대해 "양성"인 동물을 면역원의 최종 정맥내 주사로 주사할 수 있다. 3 내지 4일 후, 마우스를 희생시키고, 비장 세포를 수거한다. 그 후, 비장 세포를 (35％ 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여) ATCC로부터 번호 CRL 1597로 이용가능한 P3X63AgU.1과 같은 선택된 뮤린 골수종 세포주와 융합시킨다. 융합은 하이브리도마 세포를 생성하며, 이를 그 후 HAT (히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하여 비-융합된 세포, 골수종 잡종 및 비장 세포 잡종의 증식을 억제할 수 있다.
선별된 하이브리도마 세포를 ELISA 또는 다른 적합한 분석법으로 TCCR에 대한 반응성에 대해 스크리닝할 수 있다. 양성 하이브리도마 세포를 예를 들어 동계 Balb/c 마우스 내로 복막내로 주사하여 항-TCCR 모노클로날 항체를 함유하는 복수를 생성할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 예를 들어 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 성장시킬 수 있다. 복수에서 생성된 모노클로날 항체의 정제는 황산암모늄 침전 후, 겔 배제 크로마토그래피 또는 다른 적합한 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G에의 결합을 기준으로 한 친화도 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
TCCR -/- 마우스
TCCR을 발현하지 않는 (TCCR -/-) "넉아웃" 마우스를 구축하였다. 이러한 마우스는 예를 들어 TCCR을 코딩하는 내인성 유전자 및 동물의 배아 세포 내로 도입된 동일한 펩티드를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 동종 재조합을 통해 제조될 수 있다.
예를 들어, 특정 펩티드를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라 상기 펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하는데 사용될 수 있다. 특정 펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부분을 결실시키거나, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또다른 유전자로 대체할 수 있다. 전형적으로, 몇몇 킬로베이스의 비변경된 플랭킹 DNA (둘다 5' 및 3' 말단에)가 벡터에 포함된다 (동종 재조합 벡터의 기재에 대해서는 문헌 [Thomas et al., 1987, Cell, 51:503] 참조). 벡터를 배아 줄기 세포주 내로 (예를 들어 전기천공에 의해) 도입하고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 동종으로 재조합된 세포를 선별한다. 예를 들어, 문헌 [Li et al., 1992, Cell, 69:915]을 참조한다. 그 후, 예를 들어 문헌 [Bradley et al., 1987, In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford), pp. 113-152]에 기재된 바와 같이, 선별된 세포를 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 포배 내로 주사하여 집합 키메라를 형성한다. 그 후, 키메라 배아를 적합한 의사임신 암컷 포스터 동물 내로 이식하고, 배아를 "넉아웃" 동물을 생성하는 것으로 명명할 수 있다. 그의 생식 세포에 동종으로 재조합된 DNA를 갖는 자손을 표준 기술에 의해 확인하고, 동물의 모든 세포가 동종으로 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 교배시키는데 사용할 수 있다.
하기 실시예에 사용된 TCCR -/- 마우스의 제조에 대한 기재는 WO0129070 (드 사우비지(de Sauvage) 등) 및 문헌 [Chen et al., 2000, Nature, 407:916] (이들의 내용은 본원에 참고로 도입됨)에서 발견된다.
조성물 및 치료
자가면역 장애의 치료에 유용한 TCCR의 효능제로는 면역 기능, 예를 들어 T 세포 증식/활성화, 림포킨 방출 또는 면역 세포 침윤을 조절하는 단백질, 항체, 단편 및 변이체, 소 유기 분자, 펩티드, 포스포펩티드 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 특히 본원에 기재된 TCCR의 효능제는 T-림프구 증식, T-림프구 사이토킨 방출 및 자가면역 장애를 억제하거나, 줄이거나, 감소시키는데 유용하다.
TCCR 효능제는 상기 논의된 임의의 스크리닝 분석법 및/또는 임의의 다른 공지된 스크리닝 기술에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 TCCR 효능제는, TCCR 효능제를 적합한 담체와 배합하는 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있다. 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 TCCR 효능제를 임의의 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장용으로 제조된다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th ed. Gennaro Ed. (2000)]을 참조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산과 같은 완충제; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린과 같은 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온; 및/또는 트윈(TWEEN)(등록상표), 플루로닉스(PLURONICS)(등록상표) 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균성이어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본원의 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 스토퍼를 갖는 정맥내 주입 용액 백 또는 바이알 내에 정치된다.
투여 경로는 주사 또는 정맥내, 복막내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주입, 국소 투여 또는 지연 방출 시스템에 의해서와 같은 공지된 방법에 따른다. 투여 경로는 또한 아데노바이러스 벡터와 같은 적합한 벡터를 사용한 형질감염의 결과로서의 생체내 발현을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 바람직한 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 다양할 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 통상적인 의사의 기술 내에 있다. 동물 실험은 인간 요법에 대한 유효 투여량의 결정에 대한 신뢰성 있는 지침을 제공한다. 유효 투여량의 종간 스케일링은 문헌 [Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" in Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96]에 개시된 원리에 따라 수행될 수 있다.
TCCR 효능제의 생체내 투여가 사용될 경우, 통상적인 투여량은 투여 경로에 따라, 약 10 ng/포유동물 체중 kg 내지 100 mg/포유동물 체중 kg 이하, 예를 들어 약 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일로 다양할 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌에 제공되며, 예를 들어 미국 특허 제4,657,760호; 제5,206,344호; 또는 제5,225,212호를 참조한다. 상이한 제제는 상이한 치료 및 상이한 장애에 유효할 것이며, 특정 기관 또는 조직을 치료하려고 의도되는 투여는 또다른 기관 또는 조직과 상이한 방식의 전달을 필요로 할 수 있음이 예상된다.
TCCR 효능제의 지연-방출 투여가 TCCR 효능제의 투여를 필요로 하는 임의의 질환 또는 장애의 치료에 적합한 방출 특징을 갖는 제제에 요구될 경우, TCCR 효능제의 미세캡슐화가 고려된다. 지연 방출용의 재조합 단백질의 미세캡슐화는 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론-알파, -베타, -감마, 인터루킨-2 및 MN rgp120으로 성공적으로 수행되었다. 예를 들어, 문헌 [Johnson et al., 1996, Nat. Med. 2:795-799]; [Yasuda, 1993, Biomed. Ther., 1221-1223]; [Hora et al., 1990, Bio/Technology, 755-758]; [Cleland, 1995, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York), pp. 439-462]; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 및 미국 특허 제5,654,010호를 참조한다.
TCCR 효능제의 지연-방출 제제는 강한 정도의 생체적합성 및 넓은 범위의 생체분해 특성을 나타내는 중합체인 폴리-락트산-코글리콜산 (PLGA)을 이용하여 개발될 수 있다. PLGA의 분해 생성물인 락트산 및 글리콜산은 인간 체내로부터 빠르게 청소된다. 더욱이, 상기 중합체의 분해성은 그의 분자량 및 조성에 따라 수 개월 내지 수 주로 조정될 수 있다. 추가의 정보에 대해서는, 문헌 [Lewis, "Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide polymer," in Biogradable Polymers as Drug Delivery Systems M. Chasin and R. Langeer, editors (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41]을 참조한다.
본 발명은 하기 실시예를 참고하여 보다 잘 이해될 것이다. 상기 실시예는 본 발명의 특정 실시양태의 대표적인 것으로 의도되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예 1
T-세포 반응의 TCCR-매개된 억제
T-세포 반응에 대한 TCCR 활성의 효과를 야생형 (TCCR +/+) 및 넉아웃 (TCCR -/-) 비세포의 유도된 T-세포 증식의 분석에 의해 시험하였다. T-세포 수용체는 CD3과 결합하여 T-세포 수용체 복합체를 형성한다. 충분한 투여량의 항-CD3 항체는 항원-제시 세포 (APC)의 T-세포 수용체 복합체와 MHC 부류 II 분자 (CD4)의 상 호작용과 통상적으로 관련된 T-세포의 증식을 비-특이적으로 자극한다.
야생형 (TCCR +/+) 및 넉아웃 (TCCR -/-) 혼합된 림프구, 단리된 CD4+ T 세포 및 단리된 CD8+ T 세포의 증식은 항-CD3 항체 (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐(BD Pharmingen), 클론 145-2c11)에 의해 자극되었다. 세포를 습화된 CO2 인큐베이터에서 3일 동안 성장시키고, 분석의 마지막 8 내지 16시간 동안 측정된 바와 같은 [3H]-티미딘 혼입에 의해 증식을 측정하였다. 놀랍게도, 넉아웃 마우스 (TCCR -/-)로부터 수득된 혼합된 림프구의 항-CD3 항체 유도된 증식은 표 5 및 도 5에 나타난 바와 같이, 항-CD3의 최대하 투여량에서 야생형 (TCCR +/+) 림프구로부터 수득된 림프구보다 유의하게 컸다. 상기 데이타는 예를 들어 자극된 T-세포의 증식을 억제하는 TCCR 활성의 보호 효과, 및 효능제를 사용한 TCCR의 자극이 T-세포 증식과 같은 T-세포 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는데 유용할 수 있음을 암시한다.
Figure 112007051140237-PCT00008
그러나, 단리된 CD4+ T 세포 및 단리된 CD8+ T 세포의 항-CD3 항체 유도된 증식은 도 6 (표 6) 및 도 7 (표 7)에 각각 나타난 바와 같이, 야생형 및 넉아웃 세포 사이에 유의하게 상이하지 않았다. 상기 데이타는 TCCR에 대한 리간드인 IL-27이 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 이외의 림프구에 의해 생성됨을 암시한다.
Figure 112007051140237-PCT00009
Figure 112007051140237-PCT00010
다음으로, 항-CD3 항체 자극에 반응하는 CD4+ 및 CD8+ 세포의 증식을 CFSE (카르복시플루오로세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르) 표지화 분석으로 측정하였다. CFSE 표지화는 표지된 세포가 각각의 세포 분열 후 그의 형광 강도의 50％를 소실하는 것으로서 모니터링된 세포 분열의 수를 허용한다. 야생형 (TCCR +/+) 및 넉아웃 (TCCR -/-) 혼합된 림프구 세포 현탁액을 CFSE로 표지하여 세포 현탁액 중 0.5 μM 농도의 CFSE (미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마(Sigma))를 수득하였다. 그 후, 세포 현탁액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 표지화 후, FCS를 5％ 최종 농도로 첨가하고, 세포를 즉시 원심분리하고, 빙냉 PBS로 세척하였다. 야생형 (TCCR +/+) 및 넉아웃 (TCCR -/-) 혼합된 림프구 세포의 증식은 2.5 ㎍/mL의 농도에서 항-CD3 항체 (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐, 클론 145-2c11)에 의해 자극되었다.
그 후, 세포를 37℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 상기 지점에서, 세포를 CD4+ 및 CD8+에 대한 마커 (CD4-시크롬 또는 CD8-시크롬)으로 표지하고, 유동 세포분석에 의해 분석하였다.
하기 데이타는 CD4+ 뿐만 아니라 CD8+ 양성 T 세포 둘다가 TCCR 넉아웃 세포에서 과다증식함을 나타낸다 (표 8 참조). 도 10 및 11은 인큐베이션 기간 동안 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 세포 분열을 겪은 세포의 수를 나타낸다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘다에 대해, 야생형보다 넉아웃에서 보다 많은 세포가 3, 4 및 5 분열을 겪었다 (즉, 넉아웃 세포에 대한 라인은 CD4+ 세포 (도 14) 및 CD8+ 세포 (도 15) 둘다에서 오른쪽으로 이동한다).
Figure 112007051140237-PCT00011
실시예 2
TCCR을 발현하는 마우스는 EAE에 덜 감수성이다
실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)은 다발성 경화증 (MS)에 대한 동물 모델로서 기능하는 CNS의 자가면역 장애이다. MS와 유사하게, EAE는 수초에 대한 면역-매개된 손상이 관찰가능한 증상을 초래하는 탈수초 장애이다. EAE는 CD4+ Th1 세포 (문헌 [Fife et al., 2001, J. of Immun., 166:7617-7624]) 및 CD8+ 세포독성 T-림프구 (CTL) (문헌 [Huseby et al., 2001, J. Exp. Med., 194(5):669-676]) 둘다에 의해 매개되는 것으로 믿어진다. EAE에 대한 TCCR의 효과를 조사하기 위해, EAE의 임상적 진행을 TCCR을 발현하는 야생형 마우스 (TCCR +/+) 및 TCCR이 없는 넉아웃 마우스 (TCCR -/-)에서 조사하였다. 하기 나타난 바와 같이, TCCR을 발현하는 마우스는 TCCR이 없는 마우스보다 CD4+ Th1 및 CD8+ 매개된 장애 EAE에 덜 감수성이었다.
넉아웃 TCCR -/- 마우스를 WO O129070 (드 사우비지 등)에 기재된 바와 같이 생성하고, C57BL/6 배경 상으로 역교배하고, N12 파운더로부터 번식시켰다. 야생형 TCCR +/+ 대조군은 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory) (메인주 바 하버에 소재)로부터 구입된 C57BL/6 마우스였다.
MOG 유도된 EAE
MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (서열 7)의 아미노산 서열을 갖는 MOG 35-55 펩티드를 레이닌 콰테트(Rainin Quartet) 자동화 펩티드 합성기 (캘리포니아주 오크랜드에 소재하는 레이닌(Rainin)) 상에서 9-플루오레닐메톡시카르보닐 화학을 이용하여 합성하였다. 펩티드를 수지로부터 절단하고, 이동상에서 물/아세토니트릴/0.1％ TEA 구배를 갖는 정제용 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 펩티드의 동일성을 전기분사 질량 분광법에 의해 확인하였다.
야생형 TCCR +/+ 및 넉아웃 TCCR -/- 마우스를 PBS 100 ㎕ 및 CFA (완전 프로인트 아주반트) 100 ㎕ 중 MOG 35-55 펩티드 200 ㎍을 함유하는 에멀젼 200 ㎕로 진피내로 면역화시켜 제0일에 EAE를 유도하였다. IFA (불완전 프로인트 아주반트) (메릴랜드주, 스파크스에 소재하는 디프코-비디 다이아그노스틱 시스템스(Difco-BD Diagnostic Systems))를 죽어서 무기력화된 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37A (메릴랜드주, 스파크스에 소재하는 디프코-비디 다이아그노스틱 시스템스)와 8 mg/mL 엠. 투베르쿨로시스의 농도로 혼합함으로써 CFA를 제조하였다 (각각의 마우스는 CFA의 성분으로서 죽은 엠. 투베르쿨로시스 800 ㎍을 투여받음). 제0일 및 다시 제2일에, 각각의 마우스에게 PBS 100 ㎕ 중 페르투시스(Pertussis) 독소 (캘리포니아주 캠벨에 소재하는 리스트 바이올로지칼 래버러토리스(List Biological Laboratories) 200 ng을 복막내 주사하여 혈액 뇌 장벽을 침투하는 것을 보조하였다. 투여된 성분의 투여량은 하기 표 9에 요약되어 있다.
제0일 PBS 100 ㎕ 및 CFA 100 ㎕ 중 MOG 35-55 200 ㎍ 진피내 PBS 100 ㎕ 중 페르투시스 독소 200 ng 복막내
제1일 없음
제2일 PBS 100 ㎕ 중 페르투시스 독소 200 ng 복막내
MBP 유도된 EAE
ASQKRPSQRHG (서열 8)의 아미노산 서열을 갖는 Ac 1-11 펩티드를 레이닌 콰테트 자동화 펩티드 합성기 (캘리포니아주 오크랜드에 소재하는 레이닌) 상에서 9-플루오레닐메톡시카르보닐 화학을 이용하여 합성하였다. 펩티드를 수지로부터 절단하고, 이동상에서 물/아세토니트릴/0.1％ TEA 구배를 갖는 정제용 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 펩티드의 동일성을 전기분사 질량 분광법에 의해 확인하였다.
야생형 TCCR +/+ 및 넉아웃 TCCR -/- 마우스를 CFA (완전 프로인트 아주반트) 100 ㎕ 중 수초 염기성 단백질의 성분인 Ac 1-11 펩티드 (ASQKRPSQRHG) 10 ㎍으로 진피내로 면역화시켜 제0일에 EAE를 유도하였다. MOB-유도된 EAE에 대해 상기 논의된 바와 같이, IFA (불완전 프로인트 아주반트)를 엠. 투베르쿨로시스 H37A (죽어서 무기력화된)와 8 mg/mL 엠. 투베르쿨로시스의 농도로 혼합함으로써 CFA를 제조하였다 (각각의 마우스는 CFA의 성분으로서 죽은 엠. 투베르쿨로시스 800 ㎍을 투여받음). 제2일 및 다시 제3일에, 각각의 마우스에게 PBS 100 ㎕ 중 페르투시스 독소 200 ng을 복막내 주사하여 혈액 뇌 장벽을 침투하는 것을 보조하였다. 투여된 성분의 투여량은 하기 표 10에 요약되어 있다.
제1일 CFA 100 ㎕ 중 Ac 1-11 펩티드 10 ㎍ 피하
제2일 PBS 100 ㎕ 중 페르투시스 독소 200 ng 복막내
제3일 PBS 100 ㎕ 중 페르투시스 독소 200 ng 복막내
모든 마우스를 제1일에 출발하여 주당 3회 임상적 질환에 대해 평가하였다. 질환 등급 4에 도달한 마우스를 매일 평가하였다. 등급 5의 임의의 동물을 안락사시켰다. 5일 내에 등급 3 이하로 개선되지 못한 것들을 안락사시켰다. 이용된 임상적 등급화 시스템은 하기 표 11에 나타나 있다.
임상적 등급화 시스템
등급 0 정상적인 마우스, 질환의 명백한 징후 없음
등급 1 맥빠진 꼬리 (꼬리의 완전한 무기력, 및 마우스를 집었을 때 꼬리의 말단이 감기지 않음), 또는 뒷다리 약화 (오리걸음으로서 관찰됨, 걸음에서 마우스 뒷다리가 우리 상부를 통해 떨어지는 객관적인 징후), 둘다는 아님
등급 2 맥빠진 꼬리 및 뒷다리 약화
등급 3 부분적인 뒷다리 마비 (마우스는 엉덩이 모양을 유지하거나 걷는데 뒷다리를 사용할 수 없지만, 여전히 어느 정도로는 다리 중 하나 또는 둘다를 이동할 수 있다)
등급 4 완전한 뒷다리 마비 (뒷다리의 이동의 완전한 소실; 마우스는 앞다리로만 몸을 끈다)
등급 5 빈사 상태, EAE에 의해 사망, 인도적인 이유로 희생시킴
제40일에, 모든 남아 있는 동물을 희생시키고, 뇌 및 척수를 조직학적 분석을 위해 해부하였다. 각각의 뇌에 대한 각각의 4가지 수준으로부터의 하나의 섹션으로 뇌를 절개하고, 염증을 평가하기 위해 H&E (헤마톡실린 및 에오신 염색, 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마)로 염색하였다. 각각의 척수에 대해 각각의 3가지 상이한 수준으로부터의 4가지 섹션으로 척수를 절개하고, 염증을 평가하기 위해 H&E로 염색하고, 탈수초를 평가하기 위해 룩솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue) (미네소타주 세인트 폴에 소재하는 브이더블유알 사이언티픽(VWR Scientific))로 염색하였다. 각각의 슬라이드에 대해, 염증 및 탈수초 둘다에 대한 가장 높은 점수 및 평균 점수 (각각의 슬라이드 상의 모든 섹션의 평균)를 기록하였다. 이용된 염증 등급화 시스템은 하기 표 12에 나타나 있다.
염증 등급화 시스템
등급 0 유의한 발견 없음
등급 1 최소 내지 약한 혈관주변 염증
등급 2 혈관 위로 확장된 약한 내지 중간 염증
등급 3 혈관 매우 위로 확장된 중간 내지 현저한 염증
등급 4 많은 신경망과 관련된 중증 염증
이용된 탈수초 등급화 시스템은 하기 표 13에 나타나 있다.
탈수초 등급화 시스템
등급 0 유의한 발견 없음
등급 1 최소
등급 2 약함
등급 3 중간
등급 4 현저함
야생형 (TCCR +/+)에서의 MOG (수초 희소돌기아교세포 당단백질) 유도된 EAE (실험적 알레르기성 뇌척수염)의 임상적 진행은 넉아웃 (TCCR -/-) 마우스에서의 유도된 EAE보다 덜 중증이었다 (도 8 참조). 유사하게, 야생형 (TCCR +/+) 마우스에서의 MBP (수초 염기성 단백질) 유도된 EAE의 임상적 진행은 넉아웃 (TCCR -/-) 마우스에서의 유도된 EAE보다 덜 중증이었다 (도 9 참조).
도 8 및 9에 나타난 바와 같이, TCCR이 없는 동물 (TCCR -/-)은 EAE의 보다 중증의 임상적 증상을 나타낸 반면, TCCR을 발현하는 마우스 (WT)는 덜 중증의 증상 및 진행을 나타내었으며, 이는 EAE와 같은 자가면역 장애에 대한 TCCR 활성의 보호 효과를 암시한다.
임상적 데이타는 도 10 내지 13에 나타난 바와 같은 조직학적 분석에 의해 추가로 지지되었다. TCCR -/- 마우스는 WT 마우스보다 높은 염증 및 높은 탈수초 점수를 가졌으며, 이는 TCCR을 발현하는 마우스 (WT)는 TCCR이 없는 마우스 (-/-)보다 CD4+ Th1 및 CD8+ 매개된 장애 EAE에 덜 감수성이었음을 나타낸다.
요약하면, 데이타는 EAE와 같은 자가면역 장애에 대한 TCCR 활성의 보호, 감소 또는 억제 효과를 암시한다.
실시예 3
TCCR 효능제를 사용한 자가면역 장애의 치료
실시예 2에 대해 기재된 바와 같이, 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)은 다발성 경화증 (MS)에 대한 동물 모델로서 기능하는 CNS의 CD4+ Th1 또는 CD8+ 매개된 자가면역 장애이다. 자가면역 장애의 진행 및 과정에 대한 투여된 TCCR 효능제의 효과를 조사하기 위해, IL-27과 같은 TCCR 효능제를 유도된 EAE와 같은 MS의 실험적 모델 시스템에 투여하였다. EAE는 예를 들어 실시예 2에 대해 상기 기재된 바와 같이 마우스에서 개시되었다. EAE의 임상적 진행을 TCCR을 발현하는 마우스 (TCCR +/+) 및 IL-27과 같은 TCCR 효능제를 투여받은 마우스에서 평가하였다. IL-27과 같은 TCCR 효능제로 처리된 마우스는 비처리된 TCCR +/+ 대조군에 비해 질환의 감소된 임상적 증상 또는 진행을 나타내고/거나 자가면역 장애에 덜 감수성일 것으로 예상된다.
실시예 4
TCCR 효능제를 사용한 동물 모델에서의 관절염의 치료
자가면역 장애에 대한 TCCR 효능제의 억제 및/또는 보호 효과는 몇몇 이용가능한 동물 모델 시스템 중 하나에서 시험할 수 있다. 마우스에서의 콜라겐-유도된 관절염은 자가면역 장애인 류마티스성 관절염에 대한 하나의 모델이다. 상기 모델은 예를 들어 문헌 [McIndoe et al., 1999, PNAS USA 96:2210-2214]에 기재되어 있다. 마우스에서의 콜라겐-유도된 관절염은 림프구 침윤 및 윤활막 막 비대증을 비롯하여 인간 류마티스성 관절염과 많은 특징을 공유한다.
콜라겐-유도된 관절염의 임상적 진행을 마우스, 예를 들어 C57BL/6 마우스 또는 기타 적합한 실험실 동물에서 조사하였다. 관절염을 예를 들어 [McIndoe et al., 상기 문헌]에 인용된 방법 또는 기타 공지된 방법에 의해 시험 동물에서 유도하였다. 일반적으로, 모델 동물은 상이한 동물 종으로부터 유래된 제II형 콜라겐을 시험 동물에 주사함으로써, 예를 들어 소 제II형 콜라겐을 마우스에 주사함으로써 생성되었다. 콜라겐을 완전 프로인트 아주반트와 같은 아주반트와 배합할 수 있다.
TCCR 리간드 IL-27과 같은 TCCR 효능제를 예를 들어 관절염-유도제의 투여 전, 동안 및/또는 후에, 또는 관절염 증상의 개시 전, 동안 및/또는 후에, 시험 동물에게 투여하였다. 투여 방법 및 투여량은 다양할 수 있으며, 예를 들어 담체 중 IL-27과 같은 펩티드 리간드를 예를 들어 하나의 예비 및/또는 후 투여량으로, 1일당 다중 투여량으로, 2 이상의 예비 및/또는 후 투여량 기간에 걸쳐 매일, 또는 TCCR 수용체를 발현하는 세포에 펩티드 작용제를 투여하는데 공지된 다른 적합한 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 별법은 예를 들어 IL-27의 서브유닛 또는 연결된 IL-27 사이토킨 둘다를 발현하는 재조합 아데노바이러스로부터의 펩티드의 발현에 의한, IL-27과 같은 펩티드 리간드의 전달을 포함한다.
임상적 질환의 진행을 예를 들어 [McIndoe et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 시험 및 대조군 동물에서 모니터링하였다. 예를 들어, 질환의 물리적 및 화학적 특징을 모니터링하고, 시간에 걸쳐 점수화하였다. 동물을 주요 관절의 림프구 침윤, 윤활막 막 비대증, 윤활막 액의 사이토킨 함량 등에 대해 분석할 수 있다. 상기 파라미터를 시험 동물 및 대조군 사이에 비교하였다. 실시예 1 및 2에서 입증된 TCCR의 보호/억제 효과를 유지하는데 있어서, TCCR 효능제를 사용한 동물에서의 유도된 관절염의 치료는 비처리 대조군과 비교시 덜 중증의 임상적 증상, 결과 및/또는 물리적 또는 화학적 특징에서 입증된 억제 및/또는 보호 효과를 제공할 것으로 예상된다.
실시예 5
TCCR에 대한 모노클로날 항체의 제조
hTCCR에 대한 모노클로날 항체를 hTCCR의 세포외 도메인을 사용하여 제조하였다. 면역원은 정제 절차를 위해 카르복시-말단에 첨가된 8개의 히스티딘 잔기를 갖는 막관통 부분 (서열 1의 잔기 517 내지 538)이 없는 hTCCR (서열 1)이었다. hTCCR(ECD)-(His)8 펩티드를 니켈 NTA 친화도 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
hTCCR(ECD)-(His)8 펩티드 (1 내지 2 ㎍)를 MPL-TDM 아주반트 (몬타나주, 해밀톤에 소재하는 리비 이뮤노케미칼 리서치(Ribi Immunochemical Research)) 25 ㎕와 배합하고, 야생형 balb/c 마우스 (메사추세츠주 윌밍톤에 소재하는 찰스 리버 래버러토리스(Charles River Laboratories))의 발바닥 내로 주 2회 총 12번의 주사 동안 주사하였다.
제42일에 마우스를 희생시키고, 비장 세포를 수거하였다. 비장 세포를 뮤린 골수종 세포 (P3X63AgU.1, ATCC로부터 이용가능함, 번호 CRL 1597)에 (35％ 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여) 융합시켰다. 융합은 하이브리도마 세포를 생성하였고, 이를 HAT (히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하여 비-융합된 세포, 골수종 잡종 및 비장 세포 잡종의 증식을 억제하였다.
그 후, 하이브리도마 세포를 TCCR에의 항체 결합에 대해 ELISA 분석으로 스크리닝하였다. TCCR에 대한 반응성을 갖는 확인된 하이브리도마 배양물은 클러스터 2685, 2686 및 2688을 포함한다. 하이브리도마 배양물 2686 (항체 2686)은 2004년 12월 15일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC) (버지니아주 마나사스에 소재)에 기탁되었고, 수탁 번호 ATCC PTA-6447을 갖는다.
실시예 6
모노클로날 Ab 2686은 인간 TCCR을 활성화시킨다
재조합 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포를 사용하여 항-TCCR 항체가 TCCR을 활성화시키는 능력을 분석하였다. Ba/F3 세포는 뮤린 IL-3 의존성 세포주이다. TCCR의 후보 효능제를, 후보 효능제에 반응하여 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포의 증식을 측정함으로써 평가하였다. 세포 증식은 폴리뉴클레오티드의 증가된 합성 때문에 [3H]-티미딘의 혼입을 증가시켰다. 세포 증식을 예를 들어 [3H]-티미딘 흡수를 측정함으로써 모니터링하였다. 하기 나타난 바와 같이, 모노클로날 AB 2686은 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포의 증식을 유도함으로써 TCCR 효능제 활성을 입증하였다.
Ba/F3 세포 (문헌 [Palacios et al., 1985, Cell, 41:727-734])는 성장 및 생존 둘다에 IL-3을 필요로 하는 뮤린 조혈 인자-의존성 세포주이다. Ba/F3 세포를 10％ 우태아 혈청 (캘리포니아주 칼스버드에 소재하는 지브코(GIBCO)) 및 100 pg/mL 마우스 IL-3 (미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 알앤디 시스템스(R&D Systems))이 보충된 RPMI-1640 배지 (캘리포니아주 칼스버드에 소재하는 지브코)에서 배양하였다.
네오마이신 저항성 유전자를 가지며 인간 또는 뮤린 TCCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 pMSCV 벡터 (캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 클론텍(Clontech))을 전기천공에 의해 Ba/F3 세포 내로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 G418 (캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 클론텍) 1 mg/mL로 처리하여 안정한 진핵 세포주를 선별하고, 이를 네오마이신 저항성에 대한 유전자를 함유하는 벡터로 형질감염시켰다. 그 후, 세포를 TCCR을 인식하는 피코-에리트린 표지된 모노클로날 항체로 처리하였다. TCCR을 발현하는 표지된 클론을 FACS에 의해 선별하였다.
TCCR 발현 세포를 IL-3이 첨가되지 않은 10％ 우태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지로 세척하였다. 그 후, 세포를 10％ 우태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지 100 ㎕에 웰당 5 x 103 세포로 2벌로 플레이팅하였다. 정제된 재조합 뮤린 IL-3 (양성 대조군) 또는 정제된 항-TCCR (인간) 모노클로날 항체: 2685-IgG2a, 2686-IgG1, 2688-IgG1, 대조군 이소형 IgG2a (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐) 또는 대조군 이소형 IgG1 (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐)을 4:1 희석 계열로서 하기 표 14에 지시된 농도로 첨가하였다.
48시간 후, [3H]-티미딘 (뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 아머샴-파마시아(Amersham-Pharmacia)) 1 μCi를 각각의 웰에 첨가하였다. 추가의 6시간 후, [3H]-티미딘의 세포 내로의 혼입을 β-카운터 (패커드 탑카운트(Packard Topcount), 메사추세츠주 보스턴에 소재하는 퍼킨엘머 라이프 앤드 아날리티칼 사이언시즈(PerkinElmer Life and Analytical Sciences))에서 측정하였다.
결과는 도 2 내지 4에 나타나 있다. 모노클로날 항체 2685-IgG2a, 2686-IgG1, 2688-IgG1 및 대조군 이소형 IgG2a 및 이소형 IgG1에 반응하여 인간 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포의 증식은 도 2에 나타나 있다. 항체 2686은 시험된 임의의 다른 항체보다 유의하게 보다 큰 [3H]-티미딘의 혼입을 유도하였으며, 이는 항체 2686이 Ba/F3 세포에서 발현되는 인간 TCCR의 효과적인 효능제임을 입증한다.
뮤린 IL-3 (양성 대조군) 또는 항체 2686에 반응하여 인간 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포의 증식은 도 3에 나타나 있다. 나타난 바와 같이, 항체 2686은 양성 대조군 IL-3보다는 적지만, 인간 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포에서 TCCR 반응을 생성하는데 효과적이었다.
인간 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포는 도 4에 나타난 바와 같이, 뮤린 TCCR을 발현하는 Ba/F3 세포보다 항체 2686을 사용한 처리에 반응하여 유의하게 보다 많은 양의 [3H]-티미딘을 혼입시켰다. 상기 데이타는 항체 2686이 인간 TCCR의 특이적 효능제이며, 뮤린 TCCR과 교차-반응성을 나타내지 않음을 입증한다.
상기 연구는 입증된 효능제 항체와 같은 TCCR의 효능제가 TCCR 수용체에 결합하고 이를 자극하여 TCCR-매개된 생물학적 활성, 따라서 Ba/F3 세포의 증식을 유도함을 입증한다. 따라서, 데이타는 TCCR 효능제가 생체내에서 TCCR-매개된 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 유도하는데 유용함을 암시한다.
실시예 7
다른 TCCR 효능제의 확인
TCCR 효능제 활성을 갖는 작용제를 확인 및 확증하기 위해, IL-27의 단편 및 TCCR의 변이체를 비롯한 추정의 TCCR 효능제를 TCCR 수용체에의 결합에 대해 분석하였다. TCCR 결합은 시험관내 또는 생체내에서 분석할 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 효능제를 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 재조합 TCCR을 발현하도록 유전자조작된 COS 세포 또는 Ba/F3 세포와 같은 TCCR을 발현하는 세포에 투여하고, 잠재적 효능제에 대한 세포 반응을 측정하였다.
수용체 결합을 또한 융합 단백질로서 잠재적인 펩티드 효능제, 예를 들어 인간 IgG의 Fc 도메인을 함유하는 이뮤노어드헤신을 발현시킴으로써 분석할 수 있다. 수용체-리간드 결합을 예를 들어 이뮤노어드헤신과 TCCR 발현 세포를 상호작용시킴으로써 검출하였다. 결합된 이뮤노어드헤신을 Fc 융합 도메인을 인식하는 형광 시약을 사용하여 현미경적으로 볼 수 있다. 결합을 형광 분석에 의해 또는 다른 공지된 방법에 의해 정량화할 수 있다.
TCCR의 효능제를 IL-10 또는 SOCS-3의 발현과 같은 TCCR 매개된 활성을 자극하는 후보 효능제의 능력을 분석함으로써 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, TCCR을 발현하는 T-림프구를 후보 효능제와 접촉시킬 수 있다. IL-10 및/또는 SOCS-3의 발현을 예를 들어 ELISA, 정량적 PCR 등의 방법에 의해 측정할 수 있다. 대조군, 예를 들어 기저 IL-10 및/또는 SOCS-3 수준에 비한 IL-10 및/또는 SOCS-3의 발현의 증가는 TCCR 자극과 상관되며, 유용한 TCCR 효능제임을 지시한다.
실시예 8
IL-27 매개된 세포 증식 및 사이토킨의 유도 및 억제
야생형 (TCCR +/+) 및 넉아웃 (TCCR -/-) CD4+ 세포 둘다에 있어서의 IL-27의 사이토킨 유도에 대한 효과를 중성, Th1 또는 Th2 유도 조건하에서 조사하였다. 야생형 (TCCR +/+) 및 넉아웃 (TCCR -/-) CD4+ 세포 둘다에 있어서의 IL-27의 세포 회수 증식에 대한 효과를 중성, Th1 또는 Th2 유도 조건하에서 조사하였다.
제0일에, 야생형 CD4+ 또는 TCCR 넉아웃 CD4+ 세포를 효능제 항-CD3 모노클로날 항체 (145-2C11, 캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐, PBS o/n 중 5 ㎍/mL)와 미리 접촉시킨 24 웰 플레이트에 웰당 2 x 105 세포로 플레이팅하였다. 그 후, 개별 웰에서의 증식을 중성, Th1 편향 또는 Th2 편향 조건하에서 유도하였다. 중성 조건은 IL-2 (미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 알앤디 시스템스), 항-IL-12 항체 (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐), 항-IFN-γ 항체 (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐), 항-IL-4 항체 (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐) 및 CD-28 (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐)의 첨가에 의해 생성되었다. Th1 편향 조건은 IL-2, IL-12 (미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 알앤디 시스템스), 항-IL-4 항체 및 CD-28의 첨가에 의해 생성되었다. Th2 편향 조건은 IL-2, IL-4 (미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 알앤디 시스템스), 항-IL-12 항체, 항-IFN-γ 항체 및 CD28의 첨가에 의해 생성되었다. 상기 개별 웰에서의 처리는 하기 표 15에 나타나 있다.
Figure 112007051140237-PCT00013
Figure 112007051140237-PCT00014
세포를 37℃에서 배양하였다. 상청액의 샘플을 24시간, 48시간 및/또는 72시간에 취하였다. ELISA를 상청액 샘플 상에서 TNF-α, IL-5, IL-2, IFN-γ, IL-10, IL-6, IL-4, GM-CSF (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐으로부터 구입한 키트)에 대한 프로브로 수행하였다. 하기 표 16은 배수 IL-27 의존성 유도로서의 ELISA 데이타를 나타낸다. 도 16A 내지 C는 중성 (16A), Th1 편향 (16B) 및 Th2 편향 조건 (16C) 하에서의 IL-2의 IL-27 의존성 유도를 나타낸다. 도 17A 내지 C는 중성 (17A), Th1 편향 (17B) 및 Th2 편향 조건 (17C) 하에서의 IL-10의 IL-27 의존성 유도를 나타낸다.
데이타는 IL-27에 반응하는 TNF-α, IFN-γ 및 IL-4의 유도를 나타낸다. 데이타는 또한 IL-27에 반응하는 IL-2, IL-6 및 GM-CSF의 억제를 나타낸다. 데이타는 IL-10이 중성, Th1 편향 및 Th2 편향 조건하에서 IL-27에 의해 유도됨을 나타낸다. 상기 언급된 바와 같이, IL-10은 염증성 반응을 제한하고 종식시키는데 주요한 역할을 한다. IL-10이 IL-27에 의해 유도되는 바와 같이, 데이타는 IL-27이 면역-매개된 질환의 치료에 사용될 수 있음을 암시한다.
Figure 112007051140237-PCT00015
RNA를 24시간, 48시간 및/또는 72시간에 취해진 세포 샘플로부터 추출한 후, 하기 표 17에 나타낸 바와 같이 정량적 PCR (태크맨(TAQMAN)(등록상표))을 SOCS-1, SOCS-3, PIAS-1 및 PIAS-3에 특이적인 프로브로 수행하였다.
Figure 112007051140237-PCT00016
하기 표 18은 배수 IL-27 의존성 유도로서의 정량적 PCR 데이타를 나타낸다. 도 18A 내지 C는 중성 (18A), Th1 편향 (18B) 및 Th2 편향 조건 (18C) 하에서의 SOCS-3의 IL-27 의존성 유도를 나타낸다.
데이타는 SOCS-3이 중성, Th1 편향 및 Th2 편향 조건하에서 IL-27에 의해 유도됨을 나타낸다. 상기 언급된 바와 같이, SOCS-3은 사이토킨 신호전달을 억제하는 것으로 공지되어 있으며, 일부 작용제의 항염증성 효과의 매개제인 것으로 보고되었다. SOCS-3이 IL-27에 의해 유도되는 바와 같이, 데이타는 IL-27이 면역-매개된 질환의 치료에 사용될 수 있음을 암시한다.
Figure 112007051140237-PCT00017
중성 조건하에서 처리된 상기 세포의 샘플을 72시간에 취하고, RNA를 추출하였다. 그 후, RNA를 젠칩(GENECHIP)(등록상표) (캘리포니아주 산타 클라라에 소재하는 아피메트릭스(Affymetrix))을 사용하여 유도된 발현에 대해 분석하였다. 하기 표 19는 선택된 유전자에 대한 비처리 대조군에 비한 배수 유도 (억제)로서의 젠칩(등록상표) 데이타를 나타낸다.
데이타는 여기서 다시 IL-10이 중성 조건하에서 IL-27에 의해 유도됨을 나타낸다. 상기 언급된 바와 같이, IL-10은 염증성 반응을 제한하고 종식시키는데 주요한 역할을 한다. IL-10이 IL-27에 의해 유도되는 바와 같이, 데이타는 IL-27이 면역-매개된 질환의 치료에 사용될 수 있음을 암시한다.
Figure 112007051140237-PCT00018
제3일에, 세포를 IL-2의 존재하에서, 및 IL-27의 존재 또는 부재하에서 팽창시켰다. 구체적으로, IL-27에 미리 노출된 24 웰 플레이트로부터의 세포를 배지 1 mL에 취한 후, 2 x 1O-4 mg/mL IL-27 및 1 x 10-5 mg/mL IL-2를 함유하는 배지 3 mL과 함께 6 웰 플레이트 내에 침적시켰다. IL-27에 미리 노출되지 않은 세포를 배지 1 mL에 취한 후, 1 x 10-5 mg/mL IL-2를 함유하는 배지 3 mL와 함께 6 웰 플레이트 내에 침적시켰다.
제5일에, 2 x 1O-4 mg/mL IL-27 및 1 x 1O-5 mg/mL IL-2의 농도를 갖는 배지 (IMDM (캘리포니아주 칼스버드에 소재하는 인비트로젠(Invitrogen)) w/10％ 하이클론(HyClone) 혈청) 4 mL을 IL-27에 미리 노출된 세포를 함유하는 상기 웰에 첨가하였다. 1 x 10-5 mg/mL IL-2의 농도를 갖는 배지 4 mL을 IL-27에 미리 노출되지 않은 세포를 함유하는 상기 웰에 첨가하였다.
제6일에, 세포를 원심분리한 후, 펠릿을 배지 (상기와 동일한 배지)에 재현탁시키고, 계수하였다. 다양한 웰로부터의 세포 계수는 하기 표 20에 나타나 있으며, 도 19에 반영되어 있다.
데이타는 Th1 또는 Th2 편향 조건 동안 첨가된 IL-27이 CD4+ 세포의 증식을 감소시킴을 나타내며, IL-27이 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환을 비롯한 CD4+ 세포의 증식을 특징으로 하는 질환의 치료에 유용함을 암시한다.
Figure 112007051140237-PCT00019
실시예 9
IL-6 유도된 증식의 IL-27 억제
야생형 (TCCR +/+) 및 넉아웃 (TCCR -/-) CD4+ 세포의 IL-6 유도된 증식에 대한 IL-27의 효과를 항-IL-2 항체 (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 비디 파밍겐)의 존재 및 부재하에서 조사하였다.
야생형 마우스로부터의 혼합된 비세포 (4 x 105)를 96-웰 플레이트 상의 웰 내로 플레이팅하였다. 넉아웃 마우스로부터의 혼합된 비세포 (4 x 105)를 플레이트 상의 별개의 웰 내로 플레이팅하였다. 모든 웰을 PBS o/n 중 2 ㎍/mL 항-CD3 100 ㎕로 코팅하였다. 웰을 하기 표 21에 나타난 실험적 군에 따라 처리하였다.
Figure 112007051140237-PCT00020
세포를 37℃에서 배양하였다. 48시간 후, [3H]-티미딘을 또다른 밤 동안 첨가하고, 증식을 [3H]-티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 각각의 군에 대한 평균 CPM은 하기 표 22에 나타나 있다. IL-2 중성화가 없는 증식은 도 2OA에 나타나 있다. IL-2 중성화가 있는 증식은 도 2OB에 나타나 있다.
Figure 112007051140237-PCT00021
데이타는 IL-27이 항-IL-2 항체가 존재하는지 여부와 무관하게, 항-CD3 항체에 의해 자극되고 IL-6에 의해 증진된 증식을 억제함을 나타낸다. 항-IL-2 항체가 존재하지 않을 경우, IL-27은 항-CD3 항체에 의해 자극된 증식을 억제한다. 항-IL-2 항체는 항-CD3 항체에 의해 자극된 증식을 감소시킨다. 그러나, IL-27의 첨가는 상기 효과를 부분적으로 완화시킨다.
실시예 10
IL-27 수용체 (TCCR) 결핍 마우스는 EAE 과민성이다
IL-27은 활성화된 항원 제시 세포 (APC)에 의해 생성되는 리간드이다. IL-27은 IL-6R을 비롯한 다수의 다른 수용체에 의해 공유되는 특정 서브유닛, IL-27 및 gp130으로 이루어진 이종이량체성 수용체를 통해 신호전달된다. 본원에 논의된 바와 같이, IL-27은 다양한 STAT 및 Jak-1를 통해 신호를 활성화시키지만, 우세한 신호전달 사건은 STAT-1의 활성화인 것으로 보인다. STAT-1의 활성화 및 TH-1 특이적 전사 인자 T-bet의 하류 유도를 통해, IL-12RB2 쇄 및 IFN-감마의 발현이 촉진된다. IL-27 리간드 및 수용체는 도 21에 도해적으로 나타나 있다.
IL-27은 IL-12 족의 구성원이며, 사이토킨의 IL-6 클러스터에 속한다. 도 22를 참조한다. IL-27의 2가지 성분인 EBI3 및 p28은 IL-12 서브유닛과 밀접한 상동성을 공유한다. TCCR로도 지칭되는 IL-27 수용체 (IL-27R)의 서브유닛 둘다는 다양한 백혈구 상에 대등하게 발현된다. 가장 높은 발현은 T 세포 및 NK 세포 상에서인 것으로 보인다.
천연의 비분화된 T 세포 (Th-O)는 천연 Th-O 세포의 성숙 T-헬퍼 세포로의 분화를 유도하는 상이한 신호에 반응한다. 일반적으로, Th-1 및 Th-2 세포라는 2가지 종류의 T-헬퍼 세포가 공지되어 있다. 도 23에 도해된 바와 같이, IL-4에 의한 Th-0 세포의 자극은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 생성하는 Th-2 세포의 발생을 초래한다. Th-2 세포 및 사이토킨 생성물은 체액성 면역 및 항-연충 반응에 영향을 준다. IL-27 및/또는 IFN-감마에 의한 Th-O 세포의 자극은 T-세포에서의 IL-12 무반응 상태를 유도하므로, 이들은 IL-12의 제어하에서 성숙 TH-1 세포로 분화되고 IFN-감마, IL-2 및 림포톡신 (LT)을 생성할 수 있다. Th-1 세포 및 그의 사이토킨 생성물은 세포-매개된 면역 및 대식세포 활성화에 관여한다.
Th-0 세포의 Th-1 및 Th-2 헬퍼 세포로의 분화에 있어서 IL-27의 역할에 대한 추가의 이해를 위해, IL-27R 결핍 마우스 (TCCR 넉아웃)를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 제조하였다. 자가면역 질환 동안 IL-27에 대한 잠재적인 역할을 다발성 경화증에 대한 마우스 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)을 이용하여 조사하였다. EAE는 EAE를 갖는 마우스로부터의 CD4+ 세포만의 전달이 천연 수여자 마우스에서 EAE를 유발할 수 있기 때문에, T 세포 매개된다.
실험적 EAE를 유도하기 위해, 마우스를 완전 프로인트 아주반트 중 수초 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 35-55 펩티드로 면역화시켰다. 야생형 (WT) 및 IL-27 수용체 (TCCR) 넉아웃 마우스를 MOG로 면역화시키고, 상기 실시예에 기재된 바와 같이 EAE의 증거에 대해 조사하였다. 임상적 EAE 점수를 처리후 25일에 걸쳐 평가하였다.
도 24에 나타난 데이타는 IL-27 자극을 제거함으로써 유발된 EAE 질환의 가설적인 감소 대신, EAE가 IL-27R 결핍 마우스에서 악화됨을 입증한다. 마우스는 EAE 과민성인 것으로 보였으며, 중증 EAE 질환을 발달시켰다. EAE 표현형을 발현하는 수용체 결핍 마우스로부터 취해진 척수 조직의 조직학적 분석은 도 25에 나타나 있으며, EAE를 갖는 IL-27 수용체 넉아웃 마우스에서의 증진된 염증 및 탈수초를 입증한다.
상기 발견에 추가로, 다양한 병리증상을 갖는 IL-27 수용체 결핍 마우스, 뿐만 아니라 유도된 천식 및 간염 모델의 자극은 Th-1 및 Th-2 매개된 반응 둘다를 악화시켰다. 상기 데이타는 IL-27이 중요한 면역억제 기능을 가짐을 나타낸다.
Figure 112007051140237-PCT00022
IL-27 및 T-세포의 분화에서의 그의 가능한 역할을 추가로 연구하기 위해, 천연 CD4+ 세포를 MACS-정제하고, 도 27에 도해된 절차에 따라 IL-27의 첨가가 있거나 없는 항-CD3+ 항체로 처리하였다. IL-27을 사용한 T 세포의 자극은 Th-O, Th-1 또는 Th-2에 대한 T 세포 극성화를 촉진하는 조건하에서 수행되었다.
간략히, 24 웰 디쉬를 5 ㎍/mL 항-CD3 (비디 파밍겐)으로 밤새 코팅하였다. 1.8 x 106 부피의 CD4+ T-세포를 IL-2 (10 ng/mL) 및 항-CD28 (1 ㎍/mL)의 존재하에서 웰당 씨딩하였다. 분화를 위해, 하기 사이토킨 및 항체를 첨가하였다: TH-O (항-IL-12, 항-IFN-감마, 항-IL-4, 각각 5 ㎍/mL로), TH-1 (IL-12, 3.5 ng/mL로, 항-IL-4, 5 ㎍/mL로), TH-2 (IL-4, 3.5 ng/mL로, 항-IFNg 및 항-IL-12, 5 ㎍/mL로). IL-27을 200 ng/mL의 농도로 일부 배양물에 첨가하였다. 72시간 후, 상청액 뿐만 아니라 RNA를 단리하고, 칩, RT-PCT 및/또는 ELISA 분석에 의해 특정 사이토킨의 생성에 대해 분석하였다. 결과 데이타는 도 28에 나타나 있으며, IL-27이 T-세포 발생에 현저한 효과를 가짐을 입증한다.
IL-27은 조사된 대부분의 사이토킨에 대해 현저한 효과를 가지며, 상기 효과는 일반적으로 세포가 분화되는 조건에 독립적이다. IL-27은 Th-2 유도 조건하에서 TNFα 및 IL-10 뿐만 아니라 IL-4를 유도하였다. 동시에, IL-2, IL-5, IL-6, GM-CSF 및 IL-17의 생성은 IL-27에 의해 현저히 억제되었다.
임의의 상기 효과가 널리 공지되고 강력한 면역억제성 사이토킨 IL-10의 유도에 부차적인지 여부를 결정하기 위해, IL-27의 효과를 또한 IL-10 결핍 T-세포에서 조사하였다. 도 29에 나타난 바와 같이, 사이토킨 생성의 IL-27 유도된 조절은 IL-10에 독립적이었으며, WT 및 IL-10 결핍 T-세포에 비해 IL-2 또는 GM-CSF 생성에서 거의 차이가 나타나지 않았다.
시험관내에서 나타난 IL-27에 의한 면역억제성 IL-10의 강한 유도에도 불구하고 (도 28), 적은 IL-10의 감소만이 EAE를 갖는 IL-27R -/- 마우스로부터의 T-세포에서 나타났다 (도 30). 그러나, 상기 인위적인 시험관내 관찰은 IL-27 매개된 IL-10 유도가 EAE 동안 중요한 생물학적 과정이라는 해석을 어떤 식으로든 배제하지 않는다. 반대로, 이는 생체내 IL-27 유도된 IL-10 유도를 연구하는 본 발명자들의 실험적 기술의 한계를 반영할 것이다.
실시예 11
EAE는 TH-17 의존성이다
최근의 증거는 헬퍼 T-세포의 새로운 아형, 소위 TH-17 세포가 EAE를 비롯한 많은 프로-염증성 과정의 중요한 매개제임을 암시한다. 상기 Th-17 세포는 IL-17A, IL-17F, IL-6, TNF 및 GM-CSF를 생성하는 것으로 보고되었다. 도 31에 제공된 도해를 참조한다. TH-17 세포의 발생은 거의 이해되어 있지 않지만, 이는 IL-12와 유사성을 갖는 또다른 이종이량체성 사이토킨인 IL-23에 의존하는 것으로 여겨진다. IL-23 결핍 동물은 상기 T-세포 표현형을 효과적으로 발달시킬 수 없으며, EAE 및 CIA에 저항성이다. 그러나, IL-23은 필요한 것으로 보이지만, 이는 시험관내에서의 TH-17 세포 분화에는 충분하지 않다.
상기 논의된 바와 같이, IL-27R 결핍 마우스는 WT 한배새끼에 비해 보다 중증 EAE 질환을 발달시켰다. IL-27 신호전달에 대해 하류인 사건을 EAE의 중증도에 대한 상기 제한 효과에서 중요한 인자를 결정하기 위해 분석하였다. IL-27에 반응하는 다양한 사이토킨의 발현을 활성화 동안 조사하였다.
IL-27은 IFN-감마 생성을 촉진하며, IFN-감마는 IL-17을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 데이타는 IL-27이 IL-17 및 다른 Th-17 사이토킨 IL-6 및 GM-CSF의 생성을 IFN-감마보다 효과적으로 억제함을 입증한다 (도 33 및 34 참조). 또한, EAE를 갖는 TCCR-/- 마우스로부터의 림프절 세포는 WT보다 시험관내에서 재자극시 보다 많은 Th-17 사이토킨을 분비하였다 (도 37).
IL-17 생성의 IL-27 매개된 억제는, IFN-감마에 비-반응성인 T-세포가 여전히 IL-27의 자극시 IL-17 생성을 억제하기 때문에, IFN-감마에 독립적이었다 (도 35). IFN-감마 신호전달의 부재하에서, 기저 IL-17 생성은 보다 높았다. 상기 이유는 심지어 WT 클러스터에서도 IFN-감마 신호전달이 IFN-감마 중성화 항체의 첨가에 의해 차단되기 때문에 불명확하다. 따라서, IFN-감마R 결핍 마우스에서의 높은 IL-17 발현은 발생적 변경을 반영할 수 있거나 (즉, IFNgR 결핍 T-세포는 IFNgR의 발현 이상으로 WT-세포와 상이함), 또는 별법으로, 세포내 IFNg 루프를 반영할 수 있다. 리간드 및 수용체가 공동-발현된 세포에서, 신호전달은 후기 분비 경로 내에서 발생할 수 있으며, 이러한 신호전달은 세포내이며 중성화 항체에 의해 차단되지 않을 것이다.
Th-17 세포가 IL-27R 결핍 마우스에 의해 조절이상되었는지 확인하기 위해, IL-27R 결핍 마우스를 CFA 중 MOG로 면역화시켰다. 유출하는 림프절을 14일에 제거하고, 생체외에서 MOG로 재자극시켰다. 발현된 IL-27R 결핍 T 세포를 함유하는 림프절 상청액은 IL-17의 수준을 유의하게 증가시켰다 (도 37 및 38).
또한, 뇌 및 척수 (EAE에서 사실상의 염증 부위)의 면역 침윤물의 분석은 보다 많은 세포가 IL-27R 결핍 마우스에서 침윤되었음을 밝혔다. 또한, 보다 높은 퍼센트의 상기 세포는 세포내 염색에 의해 분석할 경우 IL-17 양성이었다. 이와 함께, 상기 2가지 관찰은 척수에서 대략적으로 IL-17의 2-배수 발현으로 해석된다 (도 39 참조).
IFN-감마 및 IL-27 둘다는 STAT-1을 활성화시키며, STAT-1 넉아웃은 증가된 IL-17을 생성한다. 따라서, IL-27은 STAT-1을 활성화시킴으로써 IL-17을 억제할 수 있다. 상기 관계는 STAT-1 넉아웃 모델로부터 수득된 세포에서 IL-17의 IL-27 매개된 억제를 분석함으로써 조사되었다. STAT-1의 부재하에서, IL-27은 IL-17을 억제하지 않았으며, 이는 억제가 STAT-1에 의해 매개됨을 나타낸다. STAT-1의 부재하에서, IL-27은 IL-17의 유도제가 되었다. 상기 역전에 대한 메카니즘적 근거는 알려지지 않았지만, 다른 IL-17 유도 사이토킨 (현저하게는 IL-23)이 STAT-1을 활성화시키지 않으면서 STAT-3을 통해 신호전달되기 때문에, IL-27에 의한 STAT-3의 활성화가 상기 효과에 역할을 하였다고 생각하는 것이 타당하다 (도 36 참조).
요약하면, IL-27 수용체 (TCCR) 결핍 마우스는 EAE-과민성이다. IL-27은 시험관내에서 Th-17 사이토킨 IL-17, IL-6 및 GM-CSF를 효과적으로 억제하였다. 또한, EAE를 갖는 IL-27 수용체 결핍 마우스는 야생형보다 많은 Th-17 사이토킨을 생성한다. IL-27은 Th-17로부터 벗어난 면역 반응을 왜곡함으로써 EAE를 억제할 수 있다.
실시예 12
IL-6은 Th-17 세포를 유도한다
도 41에 도해적으로 나타난 바와 같이, IL-23은 Th-0 세포의 사이토킨 IL-17, IL-6, GM-CSF 및 TNF를 생성하는 Th-17 세포로의 분화에 필요하지만 충분하지는 않다. IL-23이 충분하지 않은 한 가지 그럴듯한 이유는 Th-O 세포가 IL-23 수용체를 발현하지 않으며, 따라서, IL-23 비-반응성이라는 것이다. 따라서, Th-O 세포에서 IL-23R을 유도할 수 있는 인자는 Th-17 분화 경로의 필수 성분이다.
TH-1 (IFN-g) 및 TH-2 (IL-4) 세포의 효과기 사이토킨이 또한 상기 세포의 발생에 참여하고 따라서 안정화 피드백 루프를 제공하기 때문에, 본 발명자들은 유추에 의해 TH-17 효과기 사이토킨 중 하나가 Th-17 발생에 참여함이 틀림없다고 추론하였다. TH-17 효과기 사이토킨 중에서, IL-6은 그의 수용체가 천연 T-세포 상에서 발현되고 말단 분화된 T-세포보다 IL-6의 다른 공급원 (가장 현저하게는 항원 제시 세포)가 있기 때문에 가장 두드러져 보인다. 또한, IL-6 넉아웃 마우스는 EAE 저항성이다 (도 42 참조).
야생형 및 IL-27 수용체 넉아웃 마우스를 IL-6 단독으로, 또는 IL-27 및 IL-23과 조합으로 반응에 대해 조사하였다. 도 43에 나타난 바와 같이, IL-6은 Th-17 중추를 유도하였다. IL-6 단독으로의 처리는 IL-23 수용체를 자극하였으며 또한 IL-17A 및 IL-17F 생성을 자극하였다. 흥미롭게도, 공동-투여된 IL-27은 IL-23 수용체 및 IL-17 생성의 IL-6 자극된 증가를 감소시키거나 제거하였다 (도 43 참조). IL-23은 IL-6 단독에 대해 입증된 큰 자극에 추가적인 것으로 보이는 IL-23 수용체 및 IL-17 생성의 자극에 대한 약한 효과를 가졌다. 상기 조합물에의 IL-27의 첨가는 또한 반응을 감소시키거나 제거하였다. 재자극된 림프절 세포로부터 취해진 mRNA는 야생형 대조군과 비교시 IL-23 수용체 넉아웃에서 IL-23 수용체의 유도를 나타내었다 (도 43 참조).
증식 분석에서 IL-6의 효과를 추가로 비교할 때, IL-6은 야생형 및 TCCR 넉아웃 마우스 둘다에서 정제된 T-세포의 증진된 증식을 크게 자극하였다. IL-27의 첨가는 야생형 세포에서 IL-6 유도된 증식을 완전히 중성화시켰다. 상기 감소는 나타내지 않았지만, TCCR 넉아웃 마우스에서 이는 IL-27이 IL-6의 강력한 증식 효과를 길항함을 입증한다 (도 44 참조). 따라서, IL-27은 IL-6 유도된 Th-17 분화를 비롯한 몇몇 수준에서 IL-6 길항제인 것으로 보인다.
실시예 13
IL-27의 역할
도 46에 나타난 바와 같이, IL-27은 T 세포의 분화, 특히 다중 수준에서의 Th-17 세포의 발생에 영향을 준다. IL-27이 IL-10, IL-4의 생성 및 Th-1 세포의 발생을 자극하지만, 이는 또한 Th-17 세포의 생성, Th-17 세포 사이토킨 IL-17 및 GM-CSF의 생성을 억제한다.
본 상세한 설명에서 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 수준을 지시한다. 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.
본 발명은 다양한 특정 및 바람직한 실시양태 및 기술에 관해 기재되었다. 그러나, 많은 변화 및 변형이 본 발명의 개념 및 범위 내를 유지하면서 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
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Claims (48)

  1. TCCR 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애의 치료 방법.
  2. 자가면역 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, TCCR 효능제의 용도.
  3. TCCR 효능제를 림프구에 투여하는 것을 포함하는, 림프구에서의 IL-10 발현을 증가시키는 방법.
  4. TCCR 효능제를 림프구에 투여하는 것을 포함하는, 림프구에서의 SOCS3 발현을 증가시키는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCCR 효능제가 항체인 방법 또는 용도.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCCR 효능제가 모노클로날 항체인 방법 또는 용도.
  7. 제6항에 있어서, 모노클로날 항체가 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 수탁 번호 ATCC PTA-6447로 기탁된 하이브리도마 세포 주에 의해 생산된 것인 방법 또는 용도.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCCR 효능제가 인간화 항체인 방법 또는 용도.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCCR 효능제가 TH1 반응을 감소시키거나 억제시킬 수 있는 TCCR 변이체인 방법 또는 용도.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCCR 효능제가 항체 단편 또는 단일쇄 항체인 방법 또는 용도.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 TCCR 세포외 도메인인 방법 또는 용도.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 IL-27 또는 그의 일부분을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 IL-27 변이체를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 TCCR 및 gp130에 결합할 수 있는 p28의 일부분을 포함하는 IL-27 변이체를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 TH1 반응 및 이종 펩티드를 감소시키거나 억제시킬 수 있는 IL-27의 일부분을 포함하는 융합 단백질인 방법 또는 용도.
  16. 제15항에 있어서, 이종 펩티드가 항체의 Fc 부분을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 동종이식 거부반응인 방법 또는 용도.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 자가면역 갑상선 질환인 방법 또는 용도.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 자가면역 포도막염인 방법 또는 용도.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 거대세포 동맥염인 방법 또는 용도.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 염증성 장 질환인 방법 또는 용도.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 인슐린-의존성 당뇨병인 방법 또는 용도.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 다발성 경화증인 방법 또는 용도.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 악성 빈혈인 방법 또는 용도.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 건선인 방법 또는 용도.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 류마티스성 관절염인 방법 또는 용도.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 사르코이드증인 방법 또는 용 도.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 공피증인 방법 또는 용도.
  29. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 전신성 홍반성 루푸스인 방법 또는 용도.
  30. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 Th1 반응에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것인 방법 또는 용도.
  31. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애가 CD8+ T-세포 증식에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것인 방법 또는 용도.
  32. TCCR을 발현하는 세포를 후보 TCCR 효능제와 접촉시키고;
    후보 TCCR 효능제에 반응하는 TCCR-활성화된 유전자의 발현을 분석하고;
    TCCR-활성화된 유전자의 발현 증가를 후보 TCCR 효능제의 활성과 상관시키는 것
    을 포함하는, TCCR 효능제의 스크리닝 방법.
  33. 제32항에 있어서, TCCR-활성화된 유전자가 IL-10, SOCS-3, 또는 둘다를 포함하는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, TCCR-활성화된 유전자가 SOCS-3을 포함하는 것인 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 세포가 T-림프구인 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 분석이 정량적 PCR 분석을 포함하는 것인 방법.
  37. 제32항에 있어서, 상기 분석이 면역검정 분석을 포함하는 것인 방법.
  38. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 수탁 번호 ATCC PTA-6447로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체.
  39. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 수탁 번호 ATCC PTA-6447로 기탁된 하이브리도마 세포주.
  40. IL-27 또는 그의 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응의 치료 또는 억제 방법.
  41. 제1항에 있어서, 면역 반응이 Th-17 세포에 의해 매개되는 것인 방법.
  42. 제1항에 있어서, 면역 반응이 Th-1 또는 Th2 매개된 반응인 방법.
  43. 제1항에 있어서, 면역 반응이 과다염증성 반응인 방법.
  44. 제1항에 있어서, 면역 반응이 자가면역 반응인 방법.
  45. 제1항에 있어서, IL-27이 IL-17 생성을 억제하는 것인 방법.
  46. IL-27 또는 그의 효능제를 투여하는 것을 포함하는, IL-17, IL-6 또는 GM-CSF 생성의 억제 방법.
  47. IL-6 또는 그의 수용체의 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응의 치료 또는 억제 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 길항제가 IL-6의 그의 수용체와의 활성화를 차단하는 항체, 압토머 또는 소분자 길항제인 방법.
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