MXPA03006100A - Metodos para tratar enfermedades auto inmunes en un sujeto y examenes de diagnostico en tubo de ensayo. - Google Patents

Metodos para tratar enfermedades auto inmunes en un sujeto y examenes de diagnostico en tubo de ensayo.

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Abstract

La invencion proporciona un metodo para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto mediante el administrar un antagonista interferon y un antagonista ligando Flt3 ligando (FLt3L). La invencion tambien proporciona composiciones que comprenden uno o mas antagonistas de interferon, y uno o mas antagonistas Flt3L en un ensayo in vitro para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar una enfermedad autoinmune y estuches para usarse entre otros con el ensayo.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR ENFERMEDADES AUTO INMUNES EN UN SUJETO Y EXAMENES DE DIAGNOSTICO EN TUBO DE ENSAYO REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América serie número 60/260,541, presentada el 9 de enero de 2001, todo el contenido de la cual es aqui incorporada como referencia .
CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona a tratar enfermedades auto inmunes y los exámenes de diagnóstico relacionados a las enfermedades auto inmunes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las enfermedades auto inmunes son enfermedades devastadoras y paralizantes y ocurren cuando el propio sistema inmunológico de un paciente se vuelve en contra de si mismo atacando el propio cuerpo del paciente o los tejidos. Un ejemplo de una enfermedad auto inmune es el lupus erythematosus sistémico (SLE) , que se caracteriza por el involucrarse múltiples órganos y anormalidades inmunológicas que incluyen la presencia de células T y células B auto reactivas. Los auto anticuerpos en contra del nucleosoma parecen ser una característica tipo del lupus erythematosus sistémico (SLE) y sugiere que el inapropiado manejo de las células que mueren (apoptóticas) puede representar un evento patógeno clave en el desarrollo del lupus erythematosus sistémico (SLE) . El lupus erythematosus sistémico (SLE) resulta de la desregulación de ambos el limbo humoral y el celular del sistema inmune indicando que la alteración inicial puede ser al nivel de las células que enrollan y controlan los efectores inmunes, a saber las células dendriticas (DC) .
Las células dendriticas (DC) son antígenos especializados que presentan células que provocan a las células T mediante respuestas inmunes (Steinman, R.M. (1991) Ann. Rev. Inmunología, volumen 9, páginas 271-296 y Banchereau y otros, (2000) ???. Rev. Inmunología, 18:767). Las células dendriticas (DC) inducen y sostienen respuestas inmunes y han sido mostradas para capturar células que mueren y el presentar ¦ -sus antígenos a las células T CD4+, que entonces activan otros efectores inmunes incluyendo a las células B. Los progenitores de células dendriticas (DC) en la médula ósea dan aumento a los precursores circulantes que albergan al tejido donde residen como células inmaduras con alta capacidad fagocítica. Con el daño del tejido, las células dendriticas (DC) capturan antígeno (Ag) y subsecuentemente migran a los órganos linfoides donde seleccionan raras células T específicas de antígeno (Ag) , en donde inician las respuestas inmunes. Las células dendriticas (DC) presentan antígeno a las células T CD4+ que a su vez regulan a los efectores inmunes incluyendo a los específicos antígenos tales como células T CD8+ y células B así como unas no específicas tales como células macrofagas, eosinofilis, y NK. Las células dendríticas (DC) también pueden directamente activar las células B e inducir sus diferenciaciones en las células plasma en tubos de ensayo.
Tres subjuegos de precursores de células dendríticas (DC) (Dcpre) circulan en la sangre: 1) monocitos mononuclear CD14+, 2) precursores de células dendríticas mieloides CDllc+ y 3) precursores de células dendríticas plasmacitoide CDllc-t- (linfoide) . Los monocitos pueden diferenciar en las células que muestran características de células dendríticas inmaduras o macrofagas (?f) . Las células dendríticas inmaduras se hacen células dendríticas maduras con el tratamiento con CD40L y/o LPS o cuando se cultivan con una combinación de citoquinas incluyendo TNF, 'IL-l, e IL-6. Los precursores de células dendríticas mieloides CDllc+ levantan las células dendríticas intersitiales (intDC) , las células Langerhans (LC) o ?f dependiendo del ambiente local de la citoquina .
Los precursores de células dendríticas linfoides CDllcIL-3Ra+ son una mayor fuente de interferón alfa (IFN-a) . Altos niveles de IFN- son con frecuencia encontrados en el suero de lupus (Kim y otros, Clin. Exp. Immunol. 70:562-269, 1987) . Además, el tratamiento IFN-« con frecuencia induce la apariencia de auto anticuerpos y eventualmente el desarrollo de las enfermedades auto inmunes incluyendo el lupus erythematosus sistémico (SLE) (Ronnblum y otros, J. Intern, Med. 227:207-210,1990). El anticuerpo anti IFN-a ha sido reportado en pacientes de lupus erythematosus sistémico (SLE) (Suit y otros, Clin. Exp. Rheumatol. 1:133-135).
Las células dendriticas plasmacitoides han sido reportadas que producen IFN-<x que a su vez afecta la diferenciación de las células dendriticas mieloides y el crecimiento y la activación de las células B. Spits y otros (J Exp Med 192 (12) :1775-84, 2000) y Blom y otros (J Exp Med 192 (12) : 1785-96. 2000) reportan que las células dendriticas plasmacitoides CDllct son de origen linfoide en los humanos. Siegal y otros (Science 284:1835, 1999) reportan que las células dendriticas linfoides (células dendriticas plasmacitoides) producen grandes cantidades de IFN-a cuando se exponen al virus simple de herpes inactivo. Celia y otros (Medicina Natural, 5 (8) : 868-70, 1999) reportan que las células dendriticas linfoides (células dendriticas plasmacitoide) producen grandes cantidades de IFN- en respuesta al virus de la influenza asi como ligación CD40.
Los auto anticuerpos (autoAbs) en el lupus erythematosus sistémico (SLE) puede caracterizarse en tres principales categorías: 1) anticuerpos antinucleares y anti dobles DNA trenzado; 2) auto anticuerpos (autoAbs) dirigidos en contra de la superficie de las células endoteliales y plaquetas (anti-fosfolípidos/p2 glicoproteina) ; y 3) auto anticuerpos dirigidos en contra de moléculas en la superficie de las células hematopoyéticas (véase, por ejemplo, revista de Cabral y Alarcón-Segovia (1998) Curr . Opin . Rheumatol .10 : 09) . Además del daño directo causado por las interacciones antígeno/anticuerpo celular y/o del tejido, muchos de los síntomas de la enfermedad resultan del daño indirecto a través de la deposición de los complejos inmunes en los tejidos. Este mecanismo ha sido mostrado ser responsable para algunas formas de nefritis de lupus erythematosus sistémico (SLE) , artritis, y vasculítis (Lahita, R.G. 1999, Lupus Erythematosus Sistémico, Academic Press; Kammer, G.M., y G.C.Tsocos, 1999, Lupus, Humana Press) . Defectos en el espacio del complejo inmune, incluyendo la disfunción del receptor Fe (FcR) y del receptor C3b (C3b-R) , así como defectos genéticos en las proteínas complemento y en las proteínas reactivas C (todas las cuales son jugadores esenciales en la remoción de los complejos anti DNA / nucleosoma) pueden contribuir al desarrollo de las células dendríticas (Lahita, R.G., 1999, Academic Press, Kammer, G.M., y G.C. Tsocos, 1999 Humana Press). Las células B juegan un papel principal en la patogénesis del lupus erythematosus sistémico (SLE) , como son responsables por la producción de auto anticuerpos y de hipergamaglobulinemia .
Hooks y otros ( .engl. J.Med. 301:5,1979) describen la presencia de interferón inmune circulante en los pacientes con enfermedades auto inmunes incluyendo lupus erythematosus sistémico (SLE) . Kim y otros describen que los niveles de IFN-oc están correlacionados con el índice de actividad clínica. Preble y otros (J.Exp.Med. 157:214, 1983) y von Wussow y otros (Artritis Rheum. 32:914, 1989) describen que los altos niveles de sintetasa 2-5A y proteína MX, dos proteínas específicamente inducidas por IFN-a, se encuentran en las células mononucleares de ambos sueros IFN positivo e IFN negativo en los pacientes de lupus erythematosus sistémico (SLE) . Vallin y otros (J.Immunol. 163:5306, 1999) describen que el factor inducido de IFN-a actúa en leucocitos con características de células dendríticas (DC) inmaduras. Batteux y otros (Eur Cytokine Netw. 10:509, 1999) describen que la inducción de producción de IFN-a por el suero de lupus erythematosus sistémico (SLE) es dependiente del FcyRII (CD32 ) .
Una complicación de la terapia de IFN-a es la inducción de trastornos auto inmunes (en alrededor de 4% a 19% de los casos) , los más comunes siendo trastornos de la tiroides (Ehrenstein y otros, Arthritis Rheum. 36:279, 1993); Okanoue y otros, Qjm. 91:393, 1998). En efecto, Schilling y otros (Cáncer 68:1536, 1991) describen que la terapia de IFN-a también puede inducir al lupus erythematosus sistémico (SLE) con una frecuencia de 0.15% a 0.7%. Cada caso está asociado con la inducción o marcado aumento en dosis de anticuerpos anti nucleares y de anticuerpos anti DNA.
La diabetes Tipo I es otra enfermedad auto inmune en la cual el IFN-Q, juega un papel importante etiopatogénico . Foulis y otros (Lancet 2:1423, 1987) y Huang y otros (Diabetes 44:658, 1995) describen una fuerte correlación entre la expresión de IFN-a por los islotes pancreáticos y el desarrollo de la diabetes auto inmune en los humanos. Además, C akrabarti y otros (J. Immunol. 157:522,1996) describen que la expresión de IFN-a por las células B en los islotes Langerhans del páncreas causan diabetes en un modelo de ratón transgénico. Adicionalmente, Fabris y otros, (Lancet 340:548, 1992) y Guerci y otros (Lancet 343:1167, 1994) describen que la terapia de IFN-a puede inducir la diabetes del Tipo I en los humanos.
La quinasa tirosina del tipo de F S (Flt3) es un miembro de la familia receptora de la quinasa tirosina tipo III que también incluye KIT /c-kit RTK) , FMS ( -CSF RTK) y receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) . Similar a los ligandos para los receptores KIT y FMS, el factor de célula de vástago y M-CSF, respectivamente, el receptor Flt3 es activado por una molécula cognada , denominada ligando Flt3 (Flt3L) . El F13 es una forma variante de un receptor de quinasa tirosina que está relacionada a los receptores c-fms y c-kit (Rosnet y otros, Oncogene, 6:1641-1650, 1991). El Flt3L, es una citoquina hematopoyética que se ha mostrado que facilita la expansión de las células dendriticas y la generación de las respuestas inmunes anti tumor (véase la patente de los Estados Unidos de América número 5,554,512, "Ligandos para Receptores Flt3". El Flt3 se ha encontrado que regula el crecimiento y la diferenciación de las células progenitoras y de vástago (Blazar y otros, (2001) Biología de Transplantes de Sangre y de Médula Ósea 7:197-207 y véase la patente de los Estados Unidos de América número 5,843,423). El tratamiento Flt3 de cultivos de células monocitas fue mostrado que resulta en una expansión marcada en número absoluto de las células dendriticas relacionadas mieloides y linfoides y una reducción en la proporción de donadores de células T esplénicas (Blazar y otros) .
Todas las descripciones de las publicaciones que son referidas dentro de esta solicitud (incluyendo patentes de los Estados Unidos de América, solicitudes publicadas PCT, referencias científicas, libros, manuales, etc.) son aquí incorporados como referencia en su totalidad en esta solicitud.
SINTESIS DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a métodos para tratar una enfermedad auto inmune en un sujeto que incluye el administrar al sujeto una cantidad efectiva de a) al menos un interferón antagónico que reduce la actividad de un interferón del tipo I, y b) al menos un antagonista ligando Flt3 (Flt3L) que reduce la actividad del Flt3L, para por ello reducir la diferenciación de los monocitos en células dendriticas en el sujeto y tratan la enfermedad auto inmune.
La invención está también dirigida a una composición terapéutica para inhibir la diferenciación de monocitos mononucleares en las células dendriticas capaces de la presentación de antigeno que consta de: a) al menos un interferón antagónico que reduce la actividad de un interferón de tipo I, y b) al menos un ligando antagónico Flt3 (Flt3L) que reduce la actividad del Flt3L. Tales composiciones constituyen las composiciones terapéuticas para el tratamiento de las enfermedades auto inmunes incluyendo pero no limitadas a, lupus erythematosus sistémico (SLE) y otras enfermedades auto inmunes mediante IFN-Q, incluyendo pero no limitadas a diabetes, artritis, SIDA, psoriasis y tiroiditis.
La invención también está dirigida a exámenes de diagnóstico en tubo de ensayo para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune que consta de a) obtener una muestra de suero del sujeto; b) cuantificar el IFN-a y el ligando Flt3 (Flt3L) en la muestra del suero; y c) comparar la cantidad del IFN-Q, y del Flt3L con las cantidades de IFN-oc y de Flt3L en el suero de los sujetos con una enfermedad auto inmune, por lo tanto determinando el riesgo del sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune.
La invención también está dirigida a un botiquín para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar enfermedades auto inmunes o para monitorear el estado de una enfermedad auto inmune en un sujeto que consta de una cantidad de una composición que específicamente ata al Flt3L y al IFN-Q, efectivos para detectar el Flt3L y el IFN-a en una muestra biológica de un sujeto. El botiquín contiene una composición que incluye a) un anticuerpo monoclonal que une al Flt3L y b) un anticuerpo monoclonal que une el IFN-a· Además, la composición es detectable. El botiquín puede incluir uno o más reagentes para detectar cantidades de la composición que se unen a una o más de las muestras.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática de interacciones entre subjuegos de células dendríticas en el lupus erythematosus sistémico (SLE) que muestra la relación entre células dendríticas linfoides (plasmacitoide) y/o sus productos, por ejemplo, interferones del tipo I y la diferenciación de las células dendríticas mieloides . La diferenciación de las células dendriticas mileoides inicia la cascada de presentación de antigeno que lleva a la diferenciación de células T auto reactivas y de células B contribuyendo a la patogénesis del lupus erythematosus sistémico (SLE) .
Las Figuras 2?-2? son ilustraciones fotográficas que muestran monocitos purificados de donantes normales que se agrupan y adquieren morfología de las células dendriticas cuando se cultivan con suero de los pacientes con lupus erythematosus sistémico (SLE) pero no cuando son cultivados con suero autólogo (AS) . Los monocitos son cultivados con suero autólogo (AS) (Figura 2c) o suero de lupus erythematosus sistémico (SLE) (Figuras 2A-2B) . La Figura 2D muestra un agrupamiento de células veladas inducidas por los sueros de lupus erythematosus sistémico. En la Figura 2E, la coloración de Giemsa de los monocitos citogiros cultivados por 24 horas con el suero de lupus erythematosus sistémico (SLE) revela células con morfología típica de células dendriticas maduras (SLE-DC = suero de lupus erythematosus sistémico (SLE) inducido de células dendriticas) .
La Figura 3 es una ilustración gráfica que muestra resultados de un análisis citométrico de flujo de monocitos cultivados con suero de lupus erythematosus sistémico que adquiere la fenotipia de las células dendriticas maduras. Cada gráfica muestra un aumento en la detección de un anticuerpo etiquetado que es especifico para los marcadores de la superficie de la célula listados bajo cada gráfica. Los monocitos cultivados con el suero de lupus erythematosus sistémico (panel inferior) pero no aquellos cultivados con suero autólogo (panel superior) expresión regulatoria hacia abajo CD14, regulan la expresión de HLA-DR y moléculas co estimulatorias tales como CD86, CD80 y CD40 y la expresión adquirida de CD83, un marcador de células dendriticas maduras. El eje horizontal representa la intensidad fluorescente en una escala de anotación para un control isotipo (lineas punteadas) y un especifico anticuerpo (lineas sólidas) . El eje vertical representa relativa frecuencia de células, Las Figuras 4A-4E son ilustraciones gráficas de resultados de citometria de flujo mostrando que los monocitos cultivados con el suero de lupus erythematosus sistémico captura antigenos solubles. Monocitos enriquecidos fueron cultivados con suero de lupus erythematosus sistémico (Figuras 4D y 4E) /SLEl y SLE2 denotan suero de dos diferentes pacientes con lupus erythematosus sistémico) o con suero autólogo (Figura 4C) y su actividad endocítica fue determinada usando toma vertical de FITC-dextran (FITC-DX) a 4 grados centígrados (línea delgada) y a 37 grados centígrados (línea gruesa) . Los monocitos cultivados con GSM-CFS y IFN-QC (GM- IFN-A) (Figura 4B) así como aquellas cultivadas con GM-CSF y con IL-4 (GM/IL4) (Figura 4A) (que es un estándar para los cultivos en tubo de ensayo de células dendríticas) exhiben comparables niveles de toma vertical de FITC-DX. Monocitos cultivados con suero autólogo no toman FITC-DX.
La Figura 5 es un histograma que muestra los monocitos cultivados con suero de lupus erythematosus sistémico, pero no aquellos cultivados con suero autólogo que inducen proliferación de células T CD4+ alogénicas Cándidas.
Los monocitos cultivados con GM/IFN-a, GM/IL4, .SLEl, SLE2, y suero autólogo fueron lavados y cultivados a dosis graduadas (1000 células y 5000 células) con 1x10s Cándidas, CD4+CD45RA+ linfocitos T alogénicos por 5 dias. La proliferación de células T fue determinada por la incorporación de thymidine (cpmxlO3, eje vertical) . - La Figura 6 es una ilustración gráfica del nivel de citoquinas de célula T producidas .por las células T inducidas por ya sea células dendriticas-lupus erythematosus sistémico o células dendríticas cultivadas en suero autólogo. La liberación de citoquina fue mostrada por un examen de ELISA y un IL-10 y un IFN-? que son mostrados en pgxlO3 mililitros en el eje vertical.
Las Figuras 7A, 7B y 7C son ilustraciones fotográficas que muestran la captura de células apoptóticas autólogas por células dendriticas-lupus erythematosus sistémico. Las citogiros coloreados de Giemsa de cultivos de monocito de una noche con suero de lupus erythematosus sistémico (Figuras 7A y 7B) y con suero autólogo (Figura 7C) . Las flechas indican la captura de fragmentos de células con suero de lupus erythematosus sistémico (SLE) .
Las Figuras 8A y 8B son ilustraciones gráficas que muestran la captura de células apoptoticas alogénicas y presentaciones de sus antigenos a células T CD4+ autólogas. La Figura 8A muestra los resultados de flujo citométrico que muestra la captura de las células dendriticas-lupus erythematosus sistémico del DNA que contiene cuerpos apoptóticos como se indica por un aumento en los niveles de 7AAD. Células dendriticas cargadas son usadas como estimuladores de la proliferación de células T CD4+ (medidas por la incorporación de thymidine, eje vertical) (Figura 8B) .
Las Figuras 9A-9B son ilustraciones gráficas que muestran la relación de la actividad de la enfermedad de lupus erythematosus sistémico (SLE) a la IF -Q induciendo actividad de las células dendriticas-lupus erythematosus sistémico. La Figura 9A muestra la correlación entre la actividad inducida y el SLEDAI. La Figura 9B muestra la correlación entre la capacidad inducida y los niveles de IFN-a en el suero. Cada punto en cada gráfica representa el suero tomado de un paciente .
La Figura 10 es una ilustración gráfica mostrando el bloqueo del IFN-a en suero obtenido de los pacientes de lupus erythematosus sistémico. El antigeno que presenta células es generado con suero de lupus erythematosus sistémico sin o con añadido de un control isotipo o un anticuerpo que neutraliza el IFK-a como se indica en la gráfica. Las células son lavadas y cultivadas como células estimulatorias, a dosis indicadas, con alogénicos purificados de células T CD4+ (lxlO5) por cinco días . La proliferación de células T fue determinada por la incorporación de thymidine (cpmxlO3, eje vertical) .
La Figura 11 muestra que los pacientes con lupus erythematosus sistémico (SLE) tienen altos niveles de suero de IFN-o Las muestras de suero fueron tomadas de 45 pacientes con lupus erythematosus sistémico (SLE) y 28 pacientes normales .
La Figura 12 es una ilustración gráfica mostrando que las células periféricas mononucleares de sangre (PBMC) del paciente con lupus erythematosus sistémico (SLE) secretan IFN- en el tubo de ensayo en respuesta a disparo viral. El total de las células periféricas mononucleares de sangre (PBMC) fue cultivada en 96 placas con o sin virus de influenza (10 µgramos/mililitro) . Los sobre nadantes fueron cosechados después de cultivar por 24 horas y examinar por los IFN-a liberados por la ELISA. "Todos" representan los niveles en los cultivos de control sin virus. "+" denota los cultivos con virus . "ND" denotan al donante normal .
Las Figuras 13A y 13B son una ilustración gráfica que muestra que el IFN-oc induce en tubo de ensayo la expresión BAFF/Blys (célula B factor activo de la familia TNF) / Blys (estimulador linfocito B) en monocitcs y la expresión BCMA (antigeno de maduración de célula B) en las células periféricas mononucleares de sangre (PBMC) . La Figura 13A muestra la expresión relativa BAFF (ng/ng 18S RNA mensajero) en monocitos cultivados por 72 horas bajo condiciones indicadas (IFN-a U/mL) . NI denota monocitos no cultivados de control del mismo donante. La Figura 13B muestra la expresión relativa BCMA (ng/ng 18S) en las células periféricas mononucleares de sangre (PBMC), no cultivada (NI) o cultivada con 1000 U/mL IFN-a para el número indicado de horas. La expresión relativa RNA fue evaluada por el tiempo real PCR usando el sistema de Detectación de Secuencia ABI PRISM 7700 (ABI) . La proporción de la expresión objetivo (BAFF o BCMA) en contra de una referencia (18S RNA mensajero) da niveles de expresión normalizados.
Las Figuras 14A-14C son ilustraciones gráficas que muestran la regulación TNF de la IFN-a secreción por las células dendriticas plasmacitoides (pDC) . La Figura 14A muestra esa neutralización de resultados TNF endógenos en la liberación sostenida IFN-a por CD123+pDC. El eje vertical muestra niveles de IFN-a en ng/nL de cultivo sobre nadante generado bajo las condiciones indicadas. Las Figuras 14B-14C muestran que añadiendo TNF a las células dendriticas plasmacitoide inhiben la liberación inducida de virus IFN- · La Figura 14B muestra en el eje vertical el porcentaje de inhibición del IFN-a secretado en el cultivo sobre nadante. La Figura 14C muestra en el eje vertical niveles de IFN- en ng/mL del cultivo sobre nadante.
La Figura 15 es una ilustración gráfica de un experimento de citometria de flujo que muestra que el TNF bloquea el plasmacitoide de las células dendriticas de diferenciación a favor de las células dendriticas mieloides. La figura muestra la inhibición TNF de la generación de pDC de las células del progenitor nematopoyético CD34+. Los progenitores hematopoyéticos CD34+CD45RA- fueron cultivados en presencia del Flt3L (100 ng/mL), TPO (30ng/mL) y ya sea IL-6(25 ng/mL) ó TNF 100 ng/mL en la primera semana de cultivo. Después de esto, las células fueron lavadas y cultivadas por 3 semanas adicionales con Flt3L solamente (100 ng/mL) , la diferenciación pDC fue determinada por el análisis de citometria de flujo de la expresión de marcado de la superficie de la célula con pDC siendo identificado por la coloración del CDllc negativo CD123 positivo .
La Figura 16 es una ilustración esquemática que muestra vias eri la ontogenia de las células dendriticas plamacitoides que pueden inhibirse por el TNF exógeno que funciona como un antagónico interferón.
La Figura 17 es una ilustración gráfica mostrando aumentados niveles de Flt3L (en pg/mL) en suero de pacientes con lupues erythematosus sistémico (SLE) .
La Figura 18 es una ilustración gráfica que muestra la correlación de los niveles de suero del Flt3L en los pacientes de lupus erythematosus sistémico y la actividad de la enfermedad como se mide por el SLEDAI . El significado estadístico fue determinado por la regresión lineal y el análisis de Pearson.
Las Figuras 19A-19D son ilustraciones fotográficas que muestran monocitos cultivados con medios suplementados con Flt3L diferenciado en células con morfología de células dendriticas, La Figura 20 es una ilustración gráfica que muestra que los monocitos cultivados con medios suplementados con Flt3L (100 ng/mL) son capaces de preparar la células Cándidas T CD4+. La Figura 21 es una ilustración esquemática que muestra varias vías en el desarrollo y diferenciación de los sub juegos de las células dendríticas que pueden alterarse al bloquear la actividad de Flt3L y de IFN-QC.
La Figura 22 es una ilustración esquemática que muestra el entre juego entre las citoquinas y las células dendriticas en el lupus erythematosus sistémico y en la identificación de las citoquinas y/o los objetivos celulares que son intencionados para composiciones terapéuticas de la invención aqui.
DESCRIPCION DETALLADA La presente invención está dirigida a métodos para tratar una enfermedad auto inmune en un sujeto que consta de administrar al sujeto una cantidad efectiva de a) uno o más interferones antagónicos que reducen la actividad de un interferón tipo I, y b) uno o más ligandoes Flt3 (Flt3L) antagónicos que reducen la actividad de un Flt3L, para por ende reducir la diferenciación de los monocitos en las células dendriticas en el sujeto y tratar la enfermedad auto inmune. Adicionalmente, la presente invención proporciona una composición útil para inhibir la diferenciación del monocito en las células dendríticas (DC) que son capaces de la presentación de antígeno, que consta de: a) al menos un interferón antagónico que reduce la actividad del interferón, y b) al menos un ligando Flt3 antagónico que reduce la actividad de un Flt3 ligando. Por ejemplo, un componente de la composición puede ser un antagónico que reduce o inhibe el pegado o la interacción entre el interferón del tipo I (por ejemplo, IFN-ct) y su receptor. Esta composición también incluye un antagonista que reduce o inhibe el pegado o la interacción entre un Flt3L y su receptor.
Como se usa aquí, "células dendriticas-lupus erythematosus sistémico" se refiere a las células dendriticas que son obtenidas por el cultivo de monocitos con suero obtenido de un paciente con lupus erythematosus sistémico (suero SLE) .
Como se usa aquí, un "interferón antagónico" incluye un anticuerpo, un antigeno que une un fragmento de un anticuerpo, un polipéptido, un peptidomimético, un ácido nucleico que codifica un polipéptido, una molécula orgánica o cualquier combinación de los mismos que son capaces de reducir la actividad o función de un interferón del tipo I en una célula dentro de un sujeto o una célula en tubo de ensayo.
Como se usa aqui, el "polipéptido" incluye péptidos y proteínas de cualquier longitud sin importar la función.
Como se usa aquí, un "interferón del tipo I" incluye IFN-a, IFN-ß, IFN-varpi, y IFN-tau. Oritani y otros, ((2001) Citoquina Factor de Crecimiento Rev., 12 (4) : 337-48) proporciona una descripción de otros ejemplos de un interferón del tipo I .
El interferón antagónico interfiere con la interacción entre un interferón del tipo I (tal como un IFN-a) y sus receptores lo que resulta en una reducción en la generación de las células que presentan antigeno al reducir la diferenciación de los monocitos en las células ' dendriticas que se convierten en células que presentan antigeno. La reducción en la generación de las células que presentan antigeno pueden ser logradas por uno o más mecanismos diferentes, pero el mecanismo exacto por el cual esto ocurre no es crucial para la invención. Por ejemplo, los receptores de anticuerpos TNF y/o agonísticos anti TNF pueden reducir la secreción del interferón del tipo I al acelerar la diferenciación de pDC en las células no productoras del tipo I IFN.
Hay numerosos exámenes que pueden realizarse para identificar si un compuesto es un interferón antagónico útil en la presente invención. Estos exámenes son conocidos para aquellos con habilidad en el arte. Un examen es un examen de diferenciación de la célula dendrítica donde un compuesto a probarse es añadido a un cultivo de monocitos bajo condiciones adecuadas para la diferenciación del monocito en las células dendriticas . Las condiciones incluyen la adición de ya sea suero de lupus erythematosus sistémico (SLE) o de interferón como para que los monocitos sean inducidos a diferenciarse en las células dendriticas. Por tanto, si el compuesto causa una inhibición del interferón y/o el suero de lupus erythematosus sistémico impulsado a la diferenciación del monocito en las células dendriticas en comparación a la diferenciación de los monocitos en los cultivos que no tienen el compuesto añadido, entonces el compuesto- es un interferón antagónico.
Otro examen para identificar los compuestos que son interferón antagónicos es un examen de pegado en donde la inhibición del pegado para etiquetar al interferón a un receptor en una célula es medido. Si un compuesto es capaz de inhibir el pegado del interferón a sus receptores o a las células que tienen receptores de interferón, el compuesto es un interferón antagónico.
Además un examen para determinar si un compuesto es un interferón antagónico es un examen para medir la inhibición del interferón producido por las células en respuesta a disparadores que normalmente inducen la producción y/o la secreción de interferón, por ejemplo virus. Por tanto, si la presencia del compuesto y del disparador (por ejemplo, un virus) , una célula que puede normalmente producir interferón no produce interferón, o produce interferón a un nivel reducido, entonces el compuesto es un interferón inhibidor.
Otro examen para determinar si un compuesto es un interferón antagónico es un examen de sobrevivencia de la célula de un tumor. El interferón tiene actividad anti tumor por .la directa inhibición de crecimiento y/o de inducción de muerte de la célula del tumor. Los ejemplos de tales células de tumor susceptibles de interferón incluyen a lineas de célula de melanoma. Este examen de sobrevivencia de la célula del tumor mide la sobrevivencia de células de melanoma de otra forma susceptibles que son cultivadas en presencia del interferón y de un interferón antagónico. Por tanto, si las células del tumor sobreviven en el cultivo que contiene el compuesto a probarse como se compara a un cultivo idéntico que no tiene el compuesto a probarse, entonces el compuesto es un interferón antagónico.
Otro examen para identificar si un compuesto es un interferón antagónico es un examen para cuantificar la expresión (al nivel de proteina y/o de RNA) de proteínas de interferón inducibles incluyendo la proteína MXA, y de factores reguladores de interferón, como ejemplos. Por tanto, un compuesto a probarse es añadido al cultivo y los niveles de la proteína y de RNA de las proteínas inducibles de interferón especificadas son medidas. Si la adición del compuesto disminuye los niveles de la proteína y/o de la expresión mRNA, entonces el compuesto es un interferón antagónico.
Otro examen para determinar si un compuesto es un interferon antagónico es un examen de protección en tubo de ensayo. Normalmente, el añadir interferon a un cultivo de células protege a las células de la actividad citolitica de un virus el cual es introducido en el cultivo de célula, por tanto aumentando la sobrevivencia de la célula en el cultivo. Por tanto, el añadir un interferon antagónico que al abolir la protección y la sobrevivencia de la célula no aumentará. Por tanto, si la inhibición de la actividad antiviral del interferon es medida, entonces el compuesto es un interferon antagónico. La medición de la inhibición está basada en la determinación de la muerte de las células susceptibles al virus . ün ejemplo de un interferon antagónico incluye, pero no está limitado a, un anticuerpo monoclonal que específicamente ata a un IFN-Q,. Otro ejemplo de un interferon antagónico es un receptor de IFN-<x soluble. El receptor soluble es útil para atar al interferon circulante del tipo I y por tanto prohibirle de pegarse con su receptor natural y causar la progresión de la diferenciación del monocito en las células dendriticas. En otra incorporación de la invención, el interferon antagónico puede ser una molécula orgánica que ata al receptor IFN-a, pero que no causa efectos hacia debajo de tal pegado, por ejemplo, una mímica de ligando del receptor no funcional. Tal molécula orgánica puede específicamente pegar al IFN-Qt bolsas de atado del receptor sin causar la activación del receptor, como para desplazar cualquier IFN- que puede atar y por ende rendir al receptor ineficaz. En otra incorporación de la invención, el interferón antagónico incluye un péptido que consta déla región complementaria determinante (CDR) del anticuerpo monoclonal el cual específicamente ata al interferón o al Flt3L o a ambos. Aún en otra incorporación de la invención, el interferón antagónico es un péptido de fusión.
Los interferones antagónicos útiles en la presente invención pueden reducir la actividad del interferón del tipo I por muchos mecanismos diferentes y la invención no depende de cualquier mecanismo particular. Un interferón antagónico de la presente invención incluye pero no está limitada a, un IFN-Q, modificado que tiene reducida o ninguna actividad en vivo. Con respecto a interrumpir la generación de las células de presentación del antígeno por el interferón del tipo I, el interferón antagónico puede afectar la actividad del interferón del tipo I en muchas diferentes juntas en el conducto de señalización del interferón. Como algunos ejemplos, el antagónico puede bloquear la actividad de la proteina del interferón misma; la actividad de bloqueo del receptor del interferón del tipo I; inhibir el atado del interferón al receptor; el bloquear el señalamiento y/o los conductos de transducción del interferón del tipo I; el bloqueo de liberación del interferón del tipo I de las células que normalmente lo producen; bloquear la generación de las células que normalmente hacen al interferon del tipo I; y bloquear la secreción del interferon del tipo I de las células que normalmente las secretan. La inhibición de la diferenciación o la generación de las células que normalmente producen el interferon puede resultar de la administración de los receptores de TNF y/o agonísticos anti TNF de anticuerpos y/o de moléculas que proporcionan señalamiento del tipo de TNF a las células. Estos tipos de compuestos son ejemplos de interferon antagónicos proporcionados por la presente invención. Además, la inactivación de los co factores del interferon del tipo I necesarios para la diferenciación y crecimiento de las células que presentan antígeno es otro posible mecanismo de un interferon antagónico de la invención.
Como se usa aquí, un "Flt3L antagonista" incluye un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo de pegar el antígeno, un polipéptido, un peptidomimético, un ácido nucleico que codifica a un polipéptido, una molécula orgánica o cualquier combinación de los mismos que es capaz de reducir la actividad del Flt3L. Por ejemplo, el Flt3L antagónico puede interferir con la interacción entre el ligando Flt3 (Flt3L) y su receptor como para inhibir la diferenciación de las células progenitoras en las células dendríticas. la reducción en la generación de las células que presentan antígeno puede ser logrado por uno o más diferentes mecanismos. Por ejemplo, el Flt3L puede contribuir a desabolir la activación de las células dendríticas que pueden a su vez impulsar a la presentación del auto antígeno en el lupus erythematosus sistémico (SLE) , por lo tanto, el Flt3L es un objetivo para la intervención terapéutica. El Flt3L probablemente juega un papel en el desarrollo o el sostenimiento de la enfermedad auto inmune del lupus erythematosus sistémico haciendo un antagonista de la función del Flt3L útil para el tratamiento de las enfermedades auto inmunes .
En una incorporación, un examen para identificar una cantidad efectiva terapéuticamente de un interferon antagónico es el determinar la cantidad del interferon antagónico necesario para reducir al interferon receptor que se ata en el tubo de ensayo al suero tomado de un sujeto a tratarse. En este ejemplo, la concentración necesaria para reducir el atado por 50% en tubo de ensayo será efectivo terapéuticamente en el tubo de ensayo. Un examen similar para el Flt3L puede realizarse para determinar la cantidad efectiva del Flt3L antagónico para un sujeto en particular o un paciente .
Hay numerosos exámenes que pueden realizarse para identificar si un compuesto es un Flt3L antagónico útil en la presente invención. Un examen es un examen de diferenciación de una célula dendritica donde un compuesto a probarse es añadido a un cultivo de monocitos bajo condiciones adecuadas para la diferenciación del monocito en las células dendriticas. Las condiciones incluyen la adición del Flt3L al cultivo de monocito como para que los monocitos sean inducidos a diferenciar en las células dendriticas. Por tanto, si el compuesto causa al menos un 50% de inhibición de la diferenciación del monocito en las células dendriticas en comparación a los cultivos de monocitos que no tienen el compuesto añadido, el compuesto es un Flt3L antagónico.
Otro examen para determinar si un compuesto es un Flt3L antagónico es un examen para determinar la inhibición del atado del etiquetado Flt3L a su receptor. En este examen, una etiqueta detectable es pegada al Flt3L y la Flt3L etiquetada es permitida de pegarse a su receptor en la presencia y en la ausencia del compuesto. Si la presencia del compuesto causa una disminución en el pegado del Flt3L a su receptor, que el compuesto es un Flt3L antagónico.
Otro examen útil para determinar si un compuesto es un Flt3L antagónico es un examen de proliferación en tubo de ensayo. Las células progenitoras humanas hematopoyéticas son cultivadas con Flt3L a fin de inducir su diferenciación y/o proliferación. El compuesto para ser probado es añadido a algunos cultivos y otros son libres del compuesto. Una comparación es hecha entre los cultivos con el compuesto y aquellos sin ellos para determinar la cantidad de proliferación y diferenciación. Si hay inhibición del Flt3L impulsada la proliferación y/o la diferenciación de las células progenitoras humanas hematopoyéticas, entonces el compuesto es un Flt3L antagonista.
Otro examen útil para determinar si un compuesto es un Flt3L antagonista es un examen de proliferación en tubo de ensayo. La lineas de células B dependientes del factor humano son cultivadas con y sin el compuesto añadido al cultivo. Un ejemplo de tal linea de células es una linea de células construida para expresar el Flt3. Si los cultivos con el compuesto añadido muestran al menos 50% de inhibición del Flt3L impulsada la proliferación de las lineas de células B dependientes del factor humano, entonces el compuesto es un Flt3L antagónico.
Otro examen útil para determinar si un compuesto para probarse es un Flt3L antagónico es un examen en tubo de ensayo. Ratones han sido administrados con Flt3L y sus células hematopoyéticas, , incluyendo las células dendriticas son expandidas en tubo de ensayo. Estos ratones son ya sea administrados con el compuesto a probarse o no y los niveles de células hematopoyéticas en los ratones son medidos. Por tanto, la inhibición de las células hematopoyéticas de la expansión mediata por Flt3L, incluyendo las células dendriticas, en tubos de ensayo en ratones indica que el compuesto es un Flt3L antagónico .
Un ejemplo de un Flt3L antagónico es un anticuerpo monoclonal que específicamente ata al Flt3L. Otro ejemplo de un Flt3L antagónico es un receptor soluble de Flt3L. El receptor soluble es útil para atar al Flt3L circulante para prohibir al Flt3L el atarse con su receptor natural y causar la progresión de la diferenciación del monocito en las células dendriticas. En una incorporación de la invención, el Flt3L antagónico puede ser una molécula orgánica que ata al receptor del Flt3L, pero que no causa los efectos hacia debajo de tales atados, por ejemplo, un receptor de ligando mímico. Tal molécula orgánica puede específicamente atar la bolsa de atar del Flt3L del receptor para desplazar cualquiera Flt3L que puede de otra forma atarse así . El Flt3L antagónico de la invención también incluye un polipéptido que consta de la región determinante complementaria (CDR) del antes mencionado anticuerpo monoclonal, o la fusión de péptidos con ellos.
El término "anticuerpo monoclonal humano" (HuMAb) como se usa aquí, significa que el anticuerpo monoclonal humano obtenido de las células B humanas (por ejemplo, si el anticuerpo es preparado por cultivo de las células B humanas activadas y/o inmortalizadas o recombinadas de la célula B humana cDNAs que codifica tales anticuerpos monoclonales humanos y si o no el anticuerpo es atado a una molécula que puede alterar su actividad biológica, por ejemplo, un receptor o ligando, una enzima, una toxina, un transportador, etc.) y los anticuerpos que son hechos por la recombinación de partes variables de un anticuerpo monoclonal humano de la presente invención de un isotipo (por ejemplo, un IgG ) con la constante región de un anticuerpo humano de otro isotipo (por ejemplo, un humano IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, o IgE) . Métodos de recombinación para hacer estos anticuerpos monoclonales humanos son conocidos en el arte (véase la patente de los Estados Unidos de América número 5,959,085) .
El uso de una combinación de un interferón antagónico y de un Flt3L antagónico puede lograr la ventaja de usar mucho menos de cada molécula para reducir la generación de las células dendriticas. Tal sinergia es ventajosa en permitir la reducción de las cantidades efectivas terapéuticamente de cada antagónico en los métodos y las composiciones de la invención.
En una incorporación de la invención, ya sea el interferón antagónico o el Flt3L antagónico o ambos pueden ser un polipéptido. El polipéptido puede ser un peptidomimético, un polipéptido sintético, un derivado de un polipéptido natural, un polipéptido modificado, un polpéptido etiquetado, o un polipéptido que incluye péptidos no naturales. El polipéptido puede ser completamente o parcialmente un polpéptido no natural que tiene una quiralidad no encontrada en la naturaleza, por ejemplo, amino ácidos D o amino ácidos L. El uso de un enlace no natural en tal péptido puede prolongar la mitad de la vida y proteger al péptido de la degradación por enzimas ocurrentes naturales .
En otra incorporación de la invención, la enfermedad auto inmune es seleccionada del grupo que consiste de: síndrome de inmuno deficiencia adquirida (SIDA), espondilitis anquilosada, artritis, anemia aplástia, enfermedad de Behcet, diabetes, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad de Graves, anemia hemolítica, hipogamaglobulinemia, síndrome hiper IgE, púrpura trombocitopenia idiopática (ITP), esclerosis múltiple (MS) , Miastenia grave, psoriasis, lupus, y cualquier combinación de las mismas.
La diabetes puede ser, pero no limitarse a, diabetes melitus, diabetes Tipo I, diabetes Tipo II, diabetes juvenil o cualquier combinación de las mismas. La artritis puede ser, pero no limitarse a, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis psoriatica, o cualquier combinación de las mismas. El lupus puede ser lupus erythematosus sistémico (SLE) o lupus inducido por drogas.
En una incorporación de la invención, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un humano o un primate. El sujeto puede ser un paciente humano, o un animal que exhibe síntomas de una enfermedad humana inmune y es por tanto un animal modelo de una enfermedad humana, tal como un modelo de enfermedad transgénica en murino o un modelo de enfermedad de primate o un modelo de enfermedad humana establecida en un ratón SCID reconstituido con el sistema inmune humano. El mamífero puede ser, pero no limitarse a, un humano, un primate, una rata, un perro, un gato, un puerco. En otro aspecto de la invención, el sujeto es un sujeto murino, un sujeto bovino, un sujeto primate, un sujeto equino, un sujeto porcino, o un sujeto canino. El sujeto en otro aspecto de la invención sufre de lupus erythematosus sistémico (SLE) .
En una incorporación de la invención, el interferón antagónico consta de un anticuerpo de anti IFN-Q O un fragmento de atar antígeno del mismo. En otra incorporación de la invención, el interferón antagónico es TNF. En aún otra incorporación de la invención, el Flt3L antagónico consta de un anticuerpo de anti Flt3L o un fragmento de atar del antígeno del mismo.
En una incorporación de la invención, el anticuerpo puede ser un elemento de la composición que consta de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo anti-idiotípico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo primatizado, y cualquier combinación de los mismos.
En otra incorporación de la invención, el interferón antagónico y el Flt3L antagónico son parte de una molécula. En una incorporación de la invención, la cantidad efectiva del interferón antagónico está en un rango de exceso molar veces de alrededor de 1 a alrededor de 10, sobre la cantidad de interferón en el suero del sujeto. En otro aspecto de la invención, la cantidad efectiva del Flt3L antagónico está en un rango de exceso molar veces de alrededor de 1 a alrededor de 10 sobre la cantidad de Flt3L en el suero del sujeto.
El método de la invención incluye el administrar una composición a un sujeto en donde la composición inhibe la induceión por el IF -Q^ por la maduración de las células dendríticas mieloides en las células dendríticas que tienen actividades de presentación del antígeno. La administración de la composición puede ser intravenosa, por vía de inyección subdural, oral, tópica, cutánea, subcutánea, parental o por aerosol. La administración de la composición de la invención a un sujeto incluye la inyección intralesión, intraperitoneal, intramuscular, o intravenosa; por infusión; suministro mediante por liposoma; o tópica, nasal, ocular, u ótica. En otra incorporación, la administración incluye la administración intrabronquial, anal, o la administración intratecal. La composición de la invención puede suministrarse cada hora, diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente (por ejemplo en una forma de liberación de tiempo) o como un suministro de una vez. El suministro puede ser de suministro continuo por un período de tiempo, por ejemplo, suministro intravenoso. La ruta preferible y el tiempo de suministro puede ser prontamente determinado por aquellos con habilidad en el arte.
En una incorporación de la invención, el interferón antagónico reduce el pegado de un interferón del tipo I con su receptor. En otra incorporación, el interferón antagónico interfiere con la señal de transducción que sigue al interferón que se pega al receptor en las células en el sujeto. En otra incorporación, el interferón antagónico reduce la producción de interferón por células en el sujeto. En otra incorporación, el interferón antagónico reduce la secreción de interferón por células en el sujeto. En aún otra incorporación, el interferón antagónico reduce la biodisponibilidad del interferón en el sujeto. En otra incorporación, el interferón antagónico es TNF.
En otra incorporación de la invención, la composición además consta de un transportador. En otra incorporación de la invención, el transportador consta de un transportador acuoso, un transportador liposoma, o un transportador de lípido.
Los compuestos que constan de la composición de la presente invención pueden ser un compuesto (s) peptidomimético que puede ser al menos parcialmente no natural. El compuesto peptidomimético puede ser una pequeña molécula mímica de una parte del amino ácido de secuencia de Flt3L o de Flt3L receptor o un interferón de tipo I o un receptor de interferón de tipo I. El compuesto puede tener aumentada estabilidad, eficacia, potencia y biodisponibilidad por virtud de la mímica. Además, el compuesto puede tener disminuida toxicidad. El compuesto peptidomimético puede tener mejorada permeabilidad intestinal mucosa. El compuesto puede ser preparado sintéticamente. El compuesto de la presente invención puede incluir L-,D- o amino ácidos no naturales, amino ácidos disustituidos a, a, amino ácidos N-alquilo, ácido láctico (un isoelectrónico análogo de alanina) . La columna de péptido del compuesto puede tener al menos una unión reemplazada con PSI- [CH=CH] . El compuesto puede además incluir trifluorotirosina, p-Cl-fenilanina, p-Br-fenilanina, poli-L-propargilglicina, poli-D, L-alil glicina, ó poli-L-alil glicina.
Una incorporación de la presente invención es un compuesto de peptidomimético en donde el compuesto tiene una unión, una columna de péptido o un componente de amino ácido reemplazado con un adecuado mímico. Ejemplos de amino ácidos no naturales que pueden ser adecuados amino ácidos mímicos incluyen a ß-alanina, L-a-amino butírico ácido, L-y-amino butírico ácido, L-a-amino isobutirico ácido, L-g-amino caproico ácido, 7-amino heptanoico ácido, L-aspartico ácido, L-ácido glutámico, cisteina (acetamindometilo) , N-s-Boc-N- -CBZ L-lisina, N-s-Boc-N-a-Fmoc-L-lisina, L-metionina sulfona, L-norleucina, L-norvalina, N-a-Boc-N-5CB2-L-ornitina, N-g-Boc-N-a-CBZ-L-ornitina, Boc-p-nitro-L-fenilanina, Boc-hidroxiprolina, Boc-L-tioprolina .
En una incorporación, el compuesto es un péptido en donde los grupos libres de amino han sido inactivados por la derivitización. Por ejemplo, el péptido puede ser un derivado arilo, un derivado alquilo, o un derivado anhídrido. El péptido puede ser acetilado. El péptido es derivado como para neutralizar su carga neta.
Una incorporación de la composición de la invención es una ribozima que es capaz de separar mRA codificado por ya sea el interferón del tipo I o el Flt3L. Véase Cech y otros, patente de los Estados Unidos de América número 4,987,071; Altman y otros, patente de los Estados Unidos de América número 5,168,053; Haseloff y otros, patente de los Estados Unidos de América número 5,254,678, la publicada solicitud europea otorgada a Hampel y otros número EP 360,257. La composición terapéutica de la invención, en una incorporación, es una ribozima que es recombinada y que ha sido producida para separar el interferón del tipo I mRNA y/o el Flt3L mRNA. En otro aspecto de esta invención, la composición puede constar de un ácido nucleico recombinado que es una ribozima capaz de separar a ambos el codificado mRNA para el IFN-a y el codificado mRNA para el Flt3L. Además, la invención proporciona un ácido nucleico antisentido que es capaz de unirse al mRNA código para ya sea el Flt3L o el interferón del tipo I y para inhibir el traslado de tal mRNA en la proteína.
La invención provee que las células dendríticas son factores clave en la etiopatogénesis del lupus erythematosus sistémico (SLE) y otras enfermedades auto inmunes, y como tal, las células dendríticas y/o sus productos son objetivos clave para la terapia del lupus erythematosus sistémico y otras enfermedades auto inmunes. Como un ejemplo de una enfermedad auto inmune, el lupus erythematosus sistémico es una enfermedad en donde el linfoide de las células dentriticas libera grandes cantidades de citoquinas, incluyendo IFN-a, la cual subsecuentemente activa las células dendríticas mieloides para disparar y sostener las reacciones auto inmunes. Esta interacción entre los subjuegos de las células dendríticas proporciona una explicación para el 1) profundas alteraciones de la célula B con un amplio espectro de anticuerpos, principalmente en contra de antígenos nucleares, 2) autoreactivas células T CD4+, y 3) altos niveles de interferón del tipo I que se encuentra en el suero de los pacientes con lupus erythematosus sistémico (SLE) . Estas observaciones soportan el significativo involucrado de las células dendríticas en la etiopatogénesis del lupus erythematosus sistémico (SLE) y de otras enfermedades auto inmunes.
La Figura 1 ilustra las consecuencias de una liberación no controlada de IFN-a y su papel en la patogénesis del lupus erythematosus sistémico (SLE) como se describe aquí. La herida inicial del lupus erythematosus sistémico (SLE) es un elemento que dispara la plasmacitoide (linfoide) de las células dendríticas para segregar IFN-a de una manera no controlada. Los elementos disparados incluyen virus, bacteria, hongos y sus productos tales como CpG DNA así como drogas. La liberación no controlada de IFN-a se origina con un permenente plasmacitoide (linfoide) del activador de las células dentríticas tal como infección viral crónica, o con un complejo inmune que no es aclarado adecuadamente de la circulación, por ejemplo, a través del polimofismo FcR o la ausencia de componentes complementarios. El plasmacitoide de las células dendríticas diferencian en células dendríticas maduras capaces de presentar el elemento de disparo a las células T. El liberado IFN-a (posiblemente con otras citoquinas) induce la activación de los precursores de circulación de las células dendríticas mieloides, incluyendo monocitos, que capturan las células apoptóticas presentes en aumentadas cantidades en la sangre del lupus erythematosus sistémico. Las células dendríticas mieloides procesan las células apoptóticas y presentan sus antígenos a auto reactivas células T y/o a células B. Las células T auto reactivas, junto con las células dendríticas cargadas con células apoptóticas ahora además activan las células B auto reactivas. Estas se diferencian en células de plasma con ayuda de las células dendríticas. El IFN-a también directamente contribuye a la generación de células B auto reactivas debido a que puede voltear en una característica de un fenotipo de centro germinal parcial (inducción de CD38) de las células B de la sangre circulante en el lupus erythematosus sistémico (SLE) .
Usando monocitos, los precursores más abundantes de las células dendriticas mieloides, de sangre de donantes sanos, un método ha sido desarrollado para inducir a células dendriticas inmunogénicas usando suero de los pacientes con lupus erythematosus sistémico. Tales células dendriticas son antígenos activos que presentan células que pueden capturar células apoptóticas y presentar sus antígenos a las células T +CD4 autólogas, por tanto impulsando su activación y proliferación. Tal secuencia de eventos explica los eventos patogénicos en el lupus erythematosus sistémico. La formación de tales células dendriticas pueden prevenirse por el bloque del interferón del tipo I en el suero de lupus y que puede reproducirse por el cultivo de los precursores de las células dendriticas con el interferón del tipo I. Los productos de plasmacitoide (linfoide) de las células dendriticas inducen a diferenciación de las células dendriticas mieloides, por tanto soportando la presentación del antígeno, y, consecuentemente impulsando el proceso patogénico.
En una incorporación de la invención, la composición terapéutica de la invención incluye dos elementos 1) un FlteL antagónico y 2) un interferón antagónico. En otra incorporación de la invención, estos elementos pueden fusionarse juntos en un compuesto o molécula tal como una proteína de fusión que consta de un péptido antagonistico o competitivo en contra de cada Flt3L y del IFN-a u otro tipo de interferón del tipo I. Esto es, el péptido de fusión puede incluir una parte que es un péptido que es un inhibidor competitivo de la actividad de Flt3L y un péptido que es inhibidor competitivo de la actividad del IFN-a. En otro aspecto de la invención, la composición puede incluir anticuerpos monoclonales en contra de cada Flt3L y del IFN-a, fragmentos de unión del antígeno de cada anticuerpo (tal como un fragmento CDR) , o una proteína de fusión que incluye fragmentos activos (unión de antígeno) de los anticuerpos. En otro aspecto de la invención, la composición puede constar de una pequeña molécula orgánica que es capaz de interferir con la interacción entre el Flt3L, y su receptor y la cual es capaz de interferir con la actividad del IFN-a. En un aspecto de la invención, la composición puede incluir las regiones determinantes complementariamente (CDR) de los anticuerpos monoclonales que específicamente unen al Flt3L y al IFN-a.
Los polipéptidos útiles como antagónicos de un interferón del tipo I tal como IFN- y Flt3L pueden ser polipéptidos que son derivados del sitio de unión del respectivo receptor. Además, el IFN-a o el Flt3L no funcional (polipéptidos que compiten por la unión del receptor, pero que no disparan una respuesta en la célula de soporte y receptora) pueden sintetizarse. Un ejemplo de tal péptido no funcional es un péptido con completa capacidad para unir al receptor, pero sin cualquier capacidad para activar a la célula de soporte receptor. Puede haber sustituciones o adiciones o supresiones a la secuencia que normalmente se da de amino ácido de los polipéptidos . Sustituciones conservadoras de amino ácido pueden incluir: valina sustituida por alanina; lisina por arginina; glutamina por asparagina; glut mato por aspartato; serina por cisteina; asparagina por glutamina; aspartato por glutamato; prolina por glicina; arginina por istidina; leucina por isoleucina; arginina por lisina; leucina por metionina; leucina por fenilanina; glicina por prolina; treonina por serina; serina por treonina; tirosina por triptofan; fenilanina por tirosina; y leucina por valina.
La invención proporciona un nuevo método para tratar enfermedades auto inmunes, que consta de el bloqueo de la habilidad del interferón del tipo I de promover la generación de las célula que presentan antígeno. Además, la invención también proporciona un examen de diagnostico en tubo de ensayo para evaluar el riesgo relativo de un paciente para desarrollas una enfermedad auto inmune y/o para monitorear el progreso de la enfermedad en un paciente. La invención proporciona por el uso de a) un interferón antagónico que reduce la actividad de un interferón del tipo I (tal como el reducir la unión entre un interferón del tipo I y su receptor) , y b) un ligando Flt3L (Flt3L) antagónico que reduce la actividad del Flt3L (tal como el reducir la unión entre un Flt3L y su receptor) en la preparación de una composición útil para tratar una enfermedad auto inmune en un sujeto.
En una incorporación de la invención, al menos un interferón antagónico y al menos un Flt3L antagónico son administrados a tiempos separados al sujeto. En otra incorporación, son administrados simultáneamente. Por ejemplo, un antagónico puede administrarse en la mañana y el otro en la tarde. El tiempo o la frecuencia de la administración de los antagónicos no tienen que ser equivalentes .
Como se muestra aquí, el interferón de tipo I o el suero que contiene el interferón del tipo I es un factor necesario para la generación de las células que presentan antígeno, incluyendo pero no limitadas a, células dendríticas. Tales células que presentan antígeno son mostradas en la presente invención para impulsar la proliferación de las células T CD4+ autólogas al presentar antígenos de las células apoptóticas capturadas. En la presente invención, este proceso de diferenciación, captura de antígeno, y presentación del antígeno es reducido por el bloqueo de la actividad del interferón del tipo I. Este método de tratamiento puede usarse para tratar enfermedades auto inmunes al inhibir el progreso de la enfermedad (aplicación terapéutica) así como el desarrollo de la enfermedad en pacientes con un adecuado antecedente genético y alto riesgo de desarrollo de la enfermedad (aplicación preventiva) .
El bloqueo de la proteína del interferón del tipo I y/o del Flt3L incluye pero no está limitada a usar anticuerpos que neutralizan su habilidad para generar las células de presentación del antígeno. El bloqueo del receptor del interferón del tipo I o el receptor de Flt3L incluye pero no está limitada al uso de anticuerpos, péptidos o químicos específicamente interrumpiendo la interacción entre el ligando y su receptor que lleva a la generación de las células de presentación del antígeno. Los métodos para suministrar los antagónicos que son inhibidores (pro ejemplo, la composición de la presente invención) útil en la invención incluye pero no está limitada a proteínas y vectores que codifican las proteínas .
En una incorporación de la invención, los ácidos nucleicos que codifican los péptidos que bloquean la función de un interferón del tipo I y/o de un Flt3L son administrados a un sujeto. Por ejemplo, los vectores con base de virus (un ejemplo de un vector de transferencia de gen) puede usarse para suministrar estos ácidos nucleicos en el sujeto como para que el traslado de los péptidos ocurra en vivo. El vector de transferencia del gen puede ser cualquier construido que es capaz de replicar dentro de una célula huésped e incluyen pero no está limitada a, plasmidas, virus DNA, retrovirus, así como moléculas nucleótidas aisladas. Los vectores con base de retrovirus o de adenovirus pueden usarse, por ejemplo. Los adenovirus han atraído aumentada atención como vectores de expresión, especialmente para la terapia del gen humano (Berkner, Curr. Top. Microbiol . Immunol . , 158:39-66 (1992). Tales vectores contienen todo o parte de un genoma viral, tal como repetidos a largo plaza (LTR) , promotores (por ejemplo, promotores CMV, promotores SV40, promotor RSV) , mejoradores, y así sucesivamente. En cualquier caso, el vector puede constar de elementos de más de un virus. Ejemplos de adenovirus que pueden emplearse en la presente invención son bien conocidos en el arte e incluyen a más de 40 diferentes adenovirus humanos, por ejemplo, Adl2 (subgen A) , Ad3 y Ad7 (sub gen B) , Ad2 y Ad5 (Sub gen C) , Ad8 (sub gen D) , Ad4 (Sub gen E) , Ad40 (sub gen F) , (Wigand y otros, In: Adenovirus DNA, Doerfler, Ed. Martinus Nijhoff Publishing, Boston, páginas 408-441, (1986)). Los métodos para producir vectores adenovirus son bien conocidos en el arte (Berkner y otros, Nucleic Acids Res., 11:6003-6020 (1983) ; van Doren y otros, Mol. Cell . Biol .. , 4:1653-1656 (1984) ; Ghosh-Choudhury y otros, Biochem, Biophys. Res. Commun., 147:964-973 (1987); McGrory y otros, Virol . , 163:614- 617 (1988); y Gluzman y otros, In: Eurkarotic Viral Vectors, Ed. Gluzman, Y., páginas 187-192, cold Spring Harbor Laboratory (1982) ) . Los vectores resultantes son introducidos en (por ejemplo, por la transfección o por la transformación, o por la infección, o por la inyección, etc.) de una célula huésped, que puede ser en vivo en el sujeto o en tubo de ensayo. La transferencia mediante liposoma del vector de transferencia del gen también puede realizarse en la presente invención.
Otros ejemplos de vectores de virus que pueden usarse para la transferencia de gen en las células para realizar el presente método para tratar una enfermedad auto inmune en un sujeto incluyen, pero no están limitados a, retrovirus tal como el virus de la leucemia murino de oloney (MoMulV) ,- papovavirus tal como JC,SV40, polioma, adenovirus, virus Epstein-Barr (EBV) ; papiloma virus; por ejemplo, virus papiloma bovino del tipo I (BVP) ; vaccinia y poliovirus; vectores lentivirales , y otros virus humanos y animales.
El bloqueo del interferón del tipo I y la señalización del Flt3L y/o vías de transducción útiles en la invención incluyen, pero no están limitadas a, usar agentes químicos específicamente vías de transducción y/o de señalización relevante de objetivos.
El bloqueo de la liberación y/o la producción del interferón del tipo I útil en la presente invención incluye, pero no está limitada a, 1) el bloqueo de la síntesis del interferón del tipo I por células que usan específicos agentes químicos; 2) hacer objetivo de las células que producen al interferón del tipo I como para reducir su habilidad para producir el interferón del tipo I, y 3) hacer objetivo de los receptores necesarios para señalar la producción y/o la liberación del interferón del tipo I por células como para reducir o inhibir esa producción o liberación. En un aspecto de la invención, estas células son células dendríticas plasmacitoides . En otro aspecto de la invención, las células que producen al interferón del tipo I que son hechas objetivo por la composición de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, fibro estallidos, células endoteliales , y células dendríticas plasmacitoides en varias etapas de diferenciación (por ejemplo, progenitores de médula ósea y precursores de sangre) . El hacer objetivo una célula por una composición para reducir su función como se señaló antes incluye pero no está limitada a suministrar agentes químicos específicamente el bloqueo de la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides de los progenitores hematopoyéticos en cualquier momento que tal diferenciación pueda tener lugar.
El señalar un receptor necesario para señalizar la producción y/o la liberación del interferón del tipo I por una composición de la invención, incluye, pero no está limitada a, usar una composición para bloquear la función del receptor de mañosa y/o en las células CD32.
En un aspecto, la invención proporciona por un examen de diagnóstico en tubo de ensayo que es útil para monitorear el estado de una enfermedad auto inmune en un sujeto o para identificar si un sujeto está en riesgo para desarrollar una enfermedad auto inmune. El examen de diagnóstico incluye los pasos de: 1) obtener una cantidad de suero del sujeto para ser probado; 2) determinar el nivel de Flt3L y el nivel de IF -a en la muestra del suero del sujeto usando cualquier conocido método (por ejemplo, el usar un ELISA con anticuerpos específicos para Flt3L y para IFN-a) ; 3) comparar el nivel de Flt3L y el nivel de IFN-a medidos en el suero del sujeto con el nivel de cada factor determinado para existir en una muestra de suero tomada de un sujeto sano, de igual edad, y de igual género; 4) identificar si los niveles medidos del sujeto a probarse son mayores o menores que aquellos del sujeto sano por tanto monitoreando el estado de la enfermedad auto inmune en el sujeto o evaluando el riesgo del sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune .
La invención también está dirigida a un examen en tubo de ensayo para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune que consta de: a) obtener una muestra de suero del sujeto; b) cuantificar el IF -a y el ligando Flt3 (Flt3L) en la muestra de suero; y c) comparar la cantidad de IFN-a y de Flt3L medidos en el paso b) con las cantidades de IFN-a y de Flt3L medidos en el suero tomado de un sujeto sana y del suero tomado de un sujeto con una enfermedad auto inmune, por tanto determinando el riesgo del sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune. Un alto riesgo para desarrollar una enfermedad auto inmune es indicado por las cantidades en el paso b) anterior que está dentro del rango de 30% de las cantidades medidas para el sujeto con una enfermedad auto inmune. Este riesgo aumenta cuando las cantidades son de 20%. En otro aspecto de la invención, los sujetos pueden ser igualados en edad.
La invención también está dirigida a un botiquín para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune o para monitorear el estado de una enfermedad auto inmune en un sujeto que consta de una composición que específicamente une al Flt3L y al IFN-a en una muestra biológica del sujeto, y en donde la composición es detectable. El marcador detectable incluye pero no está limitado a un marcador fluorescente, un marcador radioactivo, un marcador enzimático, un marcador calorimétrico, un marcador quemiluminicente o cualquier combinación de los mismos.
En una incorporación de la invención, la muestra biológica es una muestra de sangre o una muestra de suero. En otra incorporación de la invención, la composición consta de una mezcla de a) un anticuerpo monoclonal que une al Flt3L y b) un anticuerpo monoclonal que une al IFN-a. En un ulterior aspecto de la invención, el botiquín además consta de uno o más reagentes para detectar y comparar cantidades de la composición destinados a uno o más de las muestras. En otra incorporación de la invención, el botiquín además consta de los componentes para correlacionar la cantidad de la composición destinada a la muestra biológica para un riesgo relativo de desarrollar una enfermedad auto inmune o un estado relativo de una enfermedad auto inmune. En otra incorporación de la invención, la composición esta etiquetada con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser, pero no está limitado a, un marcador fluorescente, un marcador radioactivo, un marcador enzimático, un marcador colorimétrico, un marcador quemiliminicente y cualquier combinación de los mismos. El botiquín también puede incluir componentes para estandarizar o normalizar las muestras para asegurar que los exámenes de diagnóstico están comparando números relativamente equivalentes de células o de volúmenes de suero.
La invención proporciona por un examen en tubo de ensayo para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune que consta de : a) obtener una muestra de suero del sujeto; b) cuantificar - el IFN-a y el ligando Flt3 (Flt3L) en la muestra del suero; y c) compara la cantidad de IFN-a y de Flt3L con las cantidades de IFN-a y de Flt3L en el suero de los sujetos con una enfermedad auto inmune, por tanto determinando el riesgo del sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune.
Además, la invención también proporciona por un examen en tubo de ensayo para determinar el riesgo del sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune que consta de: a) obtener una muestra de suero del sujeto; b) mezclar añadiendo el suero con monocitos en el tubo de ensayo bajo condiciones adecuadas para la diferenciación del monocito c) medir la habilidad del suero del sujeto para inducir la diferenciación de los monocitos en las células dendríticas que son capaces de presentar antígeno; y d) comparar la habilidad para medir en el paso c) con i) la habilidad del suero tomado de un sujeto sano y con ii) la habilidad del suero tomado de un sujeto que sufre de una enfermedad auto inmune, por tanto determinando el riesgo del sujeto para desarrollar una enfermedad auto inmune.
En otro aspecto, la presente invención es un examen de diagnóstico en tubo de ensayo por el cual el riesgo de un paciente para desarrollar una enfermedad auto inmune puede determinarse y monitorearse . Este examen de diagnóstico mide la habilidad del suero del paciente para inducir la diferenciación del monocito en las células dendríticas en el tubo de ensayo para evaluar el riesgo que el paciente tiene para desarrollar una enfermedad auto inmune. A este respecto, si el suero del paciente induce la diferenciación de los monocitos a las células dendríticas más efectivamente que el conocido estándar normal (que puede determinarse al usar el suero de varios individuos sanos , iguales de edad e iguales de género) , el examen predice una enfermedad declarada en pacientes con una enfermedad auto inmune y/o indicativa de la necesidad por una evaluación de diagnóstico detallado sin importar si el paciente está en riesgo de desarrollar una enfermedad auto inmune. Además, el examen de diagnóstico es útil para monitorear una condición de enfermedad en un paciente, si el paciente ya ha sido diagnosticado con una enfermedad auto inmune, el paciente puede utilizar el examen de diagnóstico de la presente invención en casa, o en otras ubicaciones convenientes, a fin de monitorear el progreso o la mejoría de la enfermedad auto inmune y ajustar su régimen de tratamiento de conformidad.
La cantidad efectiva de la composición dependerá con la actual composición que es usada. La actual cantidad efectiva está basada con el tamaño del compuesto, la biodegradabilidad del compuesto, la bioactividad del compuesto y la biodisponibilidad del compuesto. Si el compuesto no se degrada rápidamente, es biodisponxble y altamente activo, una más pequeña cantidad es requerida para ser efectiva. La cantidad efectiva puede ser determinada por uno con habilidad en el arte; también dependerá con la forma del compuesto, el tamaño del compuesto y la bioactividad del compuesto. Uno con habilidad en el arte puede de rutina desempeñar las pruebas de actividad empírica para un compuesto para determinar la bioactividad en los bio exámenes y por tanto determinar las cantidades efectivas.
Esta invención proporciona las composiciones farmacéuticas incluyendo las cantidades efectivas terapéuticas de las composiciones y los compuestos de polipéptidos , junto con los adecuados diluyentes, preservativos, solubilizadores , emulsificadores , accesorios y/o transportadores. Tales composiciones pueden ser líquidas o liofilizadas o de otra forma fórmulas secadas e incluyen diluyentes de varios contenidos de regulador (por ejemplo, Tris-HCL, acetato, fosfato) , resistencia del ph e iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción a las superficies, detergentes (por ejemplo, TWEENTM 20, TWEENTM 80, Pluronic F68, sales de ácido de bilis), agentes solubles (por ejemplo, glicerol, glicerol polietileno) , antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) , preservativos (por ejemplo, Timerosal, alcohol bencilo, parabenes) , sustancias de volumen o modificadores de tonicidad (por ejemplo, lactosa, manitol) , pegado covalente de los polímeros tal como glicol de polietileno al compuesto, acomplejado con iones de metal, o la incorporación del compuesto en o dentro de las preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogels, etc., o en liposomas, micro emulsiones, micelas, vesículas uni lamelares o Multi Lamelares, eritrocitos fantasmas, o esferoplastas . Tales composiciones influenciarán el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la tasa de liberación en vivo, y la tasa de despegue en vivo del compuesto o de la composición. La selección de composiciones dependerá de las propiedades físicas y químicas de la composición.
Controladas o sostenidas composiciones de liberación incluyen la formulación en depósitos lipofílicos (por ejemplo, ácidos grasos, ceras, aceites).
También comprendidas por la invención son las composiciones en partículas recubiertas con polímeros (por ejemplo, poloxameros o poloxaminas) y la composición terapéutica acopladas a los anticuerpos dirigida en contra de los receptores específicos de tejido, ligandos o antígenos o acoplados a ligandos de receptores específicos de tejido o a cualquier otro péptido de objetivo de célula o de tejido. Otras incorporaciones de las composiciones terapéuticas de la invención incorporan formas de partículas de recubrimientos de protección, inhibidores de proteasa o mejoradores de permeacion para varias vías de administración, incluyendo la parenteral, pulmonar, nasal u oral.
Cuando se administran, los compuestos son con frecuencia liberados rápidamente de la circulación y pueden por ende obtener relativamente corta vida de actividad farmacológica. Consecuentemente, las inyecciones frecuentes de relativamente grandes dosis de compuestos bioactivos pueden requerirse para sostener la eficacia terapéutica. Los compuestos modificados por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como glicol de polietileno (PEG) , copolímeros de glicol de polietileno y glicol polipropileno, carboximetilcelulosa, dextran, alcohol poli vinílico, poli vinilico pirolidone o poliprolina son conocidos por exhibir sustancialmente largas medias vidas en la sangre seguido de inyecciones intravenosas que los correspondientes compuestos no modificados. Tales modificaciones también pueden aumentar la solubilidad del compuesto en solución acuosa, eliminar el agregado, mejorar la estabilidad física y química del compuesto, y grandemente reducir la inmunogenicidad y reactividad del compuesto. Como resultado, la deseada actividad biológica en vivo puede lograrse por la administración de tal compuesto de polímero efectúa la aducción menos frecuentemente o en menores dosis que con el compuesto no modificado.
La unión del glicol de polietileno (PEG) a los compuestos es particularmente útil debido a que el glicol de polietileno (PEG) tiene muy baja toxicidad en los mamíferos (Carpenter y otros, 1971) . Por ejemplo, un glicol de polietileno (PEG) que efectúa la aducción de la adenosina deaminasa fue aprobado en los Estados Unidos de América para uso en los humanos para el tratamiento de severas combinaciones del síndrome de inmuno deficiencia. Una segunda ventaja posible por la conjugación del glicol de polietileno (PEG) es que efectivamente reduce la inmunogenicidad y antigenicidad de los compuestos heterologos. Por ejemplo, el glicol de polietileno (PEG) que efectúa la aducción de un péptido humano puede ser útil para el tratamiento de la enfermedad en otras especies mamíferas sin el riesgo de disparar una severa respuesta inmune. El polipéptido o composición de la presente invención puede suministrarse en un dispositivo de microencapsulado como para reducir o prevenir una respuesta inmune del huésped en contra del polipéptido o en contra de las células que pueden producir al polipéptido. El polipéptido o la composición de la presente invención también puede suministrarse en microencapsulado en una membrana, tal como una liposoma.
Como un ejemplo, los polímeros tal como el glicol de polietileno (PEG) puede convenientemente unirse a uno o más de los residuos de amino ácido reactivo en un péptido de la composición terapéutica tal como el grupo de alfa amino del amino terminal amino ácido, los grupos de amino epsilón de las cadenas laterales lisina, los grupos sulfhidrilo de cadenas laterales cisteina, los grupos carboxilos de aspartilo y de cadenas laterales de glutamilo, el grupo alfa carboxilo del carboxi terminal amino ácido, cadenas laterales tirosina, o a activados derivados de cadenas glicosil unidas a ciertos residuos de asparginas, serina o treonina.
Numerosas formas activadas de glicol de polietileno (PEG) adecuadas para la reacción directa con proteínas han sido descritas. Útiles reagentes glicol de polietileno (PEG) para reacción con grupos de proteína amino incluyen ésteres activos de ácido carboxílico o derivados de carbonato, particularmente aquellos en los cuales los grupos de dejado son N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol, imidazol, o 1-hidroxi-2-nitrobenceno-4-sulfonato, derivados de glicol de polietileno (PEG) que contienen grupos de maleimido o de haloacetilo son útiles reagentes para la modificación de los grupos de sulfidrilo de proteína libre. De igual forma, los reagentes del glicol de polietileno (PEG) son útiles para la reacción con aldehidos generados por la oxidación periodata de grupos de carbohidrato en proteínas.
En una incorporación preferible el transportador farmacéutico puede ser un líquido y la composición farmacéutica puede ser en forma de una solución. En otra incorporación igualmente preferible, el transportador farmacéuticamente aceptable es un sólido y la composición está en forma de un polvo o una tableta. En otra incorporación, el transportador farmacéutico es un gel y la composición es en forma de un supositorio o crema. En una otra incorporación, el ingrediente activo puede formularse como una parte de un parche transdérmico farmacéuticamente aceptable.
Un transportador sólido puede incluir una o más sustancias que pueden también actuar como agentes de sabor, lubricantes, solubilizadores , agentes de suspensión, rellenos, glidantes, ayudas de compresión, aglutinadores, o agentes desintegradores de tableta; también pueden ser un material de eneapsular. En polvos, el transportador es un sólido finamente dividido que es una mezcla añadida con el ingrediente activo finamente dividido. En tabletas, el ingrediente activo es mezclado con un transportador que tiene las necesarias propiedades de compresión en adecuadas proporciones y compactadas en la forma y el tamaño deseados . Los polvos y las tabletas preferiblemente contienen hasta 99% del ingrediente activo. Adecuados transportadores sólidos incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirolidina, ceras de bajo fundido y resinas de intercambio de ió .
Los transportadores líquidos son usados en la preparación de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires, y composiciones presurizadas . El ingrediente activo puede disolverse o suspenderse en un transportador líquido aceptable farmacéuticamente tal como agua, un solvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El transportador líquido puede contener otros adecuados aditivos farmacéuticos tales como solubilizantes , emulsificadores, reguladores, preservativos, endulzantes, agentes de sabor, agentes de suspensión, agentes de engrosar, colores, reguladores de viscosidad, estabilizadores o reguladores osmo. Adecuados ejemplos de transportadores líquidos para administración parenteral y oral incluyen agua (parcialmente conteniendo aditivos como anteriormente, por ejemplo, derivados de celulosa, solución de carboximetilcelulosa de sodio preferiblemente) , alcoholes (incluyendo alcoholes monohidricos y alcoholes polihidricos , por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuate) . Para administración parenteral, el transportador también puede ser un éster aceitoso tal como etilo oleato y el isopropilo miristato. Transportadores líquidos estériles son útiles en composiciones de forma líquida estéril para administración parenteral. El transportador líquido para las composiciones presurizadas puede ser hidrocarbono halogenado u otro propelente aceptable farmacéuticamente.
Las composiciones farmacéuticas líquidas que son soluciones o suspensiones estériles pueden utilizarse por ejemplo, por inyección intramuscular, intratecal, epidurea, intraperitoneal , o subcutánea. Las soluciones estériles también pueden administrarse intravenosas. El ingrediente activo puede prepararse como una composición sólida estéril, que puede disolverse o suspenderse al tiempo de la administración usando agua estéril, salina, u otro apropiado medio inyectable estéril . Los transportadores son intencionados para incluir glutinizantes necesarios e inertes, agentes de suspensión, lubricantes, saborizantes, endulzadores , preservativos, tintes, y recubrimientos.
El ingrediente activo de la composición terapéutica de la presente invención (por ejemplo el Flt3L antagónico y el interferón antagónico) pueden administrarse oralmente en forma de una solución o suspensión estéril que contiene otos agentes solubles o de suspensión, por ejemplo, suficiente salina o glucosa para hacer la solución isotónica, sales de bilis, acacia, gelatina, sorbitan monoleato, polisorbato 80 (esteres oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido etileno) y similares.
El ingrediente activo también puede administrarse oralmente ya sea en forma de composición líquida o sólida. Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas sólidas, tales como pildoras, cápsulas, granulados, tabletas, y polvos, y en formas líquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires, y suspensiones. Las formas útiles para la administración parenteral incluyen soluciones estériles, emulsiones y suspensiones.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que de otra forma se indique, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología de DNA recombinada, e inmunología, que están dentro de la habilidad del arte. Tales técnicas son explicadas en la literatura: Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsh & aniatis, Clonado Molecular; Un Manual de Laboratorio, Segunda Edición (1989) ; Clonado de DNA, volúmenes I y II (D.N. Glover ed. , 1985); Síntesis Oligonucleotida (M.J. Gait ed. , 1984); Hibridización del Ácido Nucleico (B.D. Hames & S.J, Higgins eds . 1984); Cultivo de Célula Animal (R.K. Freshney ed. 1986) ; Células y Enzimas Inmovilizadas (IRL Prensa, 1986); Perbal, B., Una Guía Práctica para el Clonado Molecular (1984) ; las series, Métodos de Enzimología (S. Colowick y N. Kaplan eds . , Academic Press, Inc.); y Manual de Inmunología Experimental, volúmenes I-IV (D.M. Weir & C.C. Blackwell eds., 1986, Blackweel Scientific Publications) .
Como se usa aquí, la palabra "o" significa cualquier miembro de una lista particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista.
Como se usa aquí, las formas singulares de "un", "una" y "el" incluyen las referencias plurales a menos que el contenido claramente dicte de otra forma.
La invención además se describirá con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, deberá entenderse que la invención no está limitada a tales ejemplos. Más bien, en vista de la presente descripción que describe el actual mejor modo de practicar la invención, muchas modificaciones y variaciones pueden presentarse a sí mismas para aquellos con habilidad en el arte sin apartarse del alcance y del espíritu de esta invención. Todos los cambios, modificaciones, y variaciones que vienen dentro del significado y del rango de equivalencia de las reivindicaciones serán consideradas dentro de su alcance .
Ejemplo 1: Sueros de Lupus Erythematosus Sistémico (SLE) inducen a monocitos para diferenciar en las células con propiedades como las células dendríticas Los monocitos normales fueron expuestos a sueros de lupus erythematosus sistémico en tubo de ensayo: dentro de 12 a 24 horas, fue notado el agrupado de leucocitos; y dentro de 24 a 48 horas, el agrupado de células exhibieron finas proyecciones citoplásmicas reminiscentes de cultivos de células dendriticas (Figuras 2A y 2B) . Solamente el suero de lupus erythematosus sistémico induce a los monocitos a agruparse con 12-24 horas y a adquirir morfología de célula velada (Figuras 2A-2B comparada como AS en la Figura 2C) .
El suero del lupus erythematosus sistémico (SLE) : después del consentimiento informado, sangre fue obtenida del paciente que satisfizo los criterios de diagnóstico del Colegio Americano de Reumatología (ACR) para el lupus erythematosus sistémico (SLE) . Sangre completa fue recolectada en tubos que contienen EDTA o heparin, y fue separada inmediatamente por centrifugado a lOOxg a 4 grados centígrados. El plasma fue cultivado, tratado con trombina (Jones Pharma Incorporated, Missouri) y almacenada a -80 grados centígrados hasta su uso. La actividad de la enfermedad fue evaluada al usar la nota del índice de Actividad de Enfermedad del Lupus Erythematosus Sistémico (SLE) (SLEDAI) (Lahita, R.G. 1999, Lupus Erythematosus Sistémico, Academic Press 3a edición), determinada el mismo día que fue obtenida la muestra de sangre.
Cultivo de célula y análisis fenotípico: Los monocitos fueron aislados de las células mononucleares de la sangre, después del gradiente Ficoll-PaqueTM, por agotamiento de las células T, células B, y células NK usando anticuerpos purificados anti-CD3, anti-CD19, anti-CD56, y anti glicoforin A seguido por el agotamiento inmunomagnético (Dynabeads) . Monocitos enriquecidos CD14+* fueron cultivados en 6 láminas de placas de (lxl06/líquido) por 3 días en presencia de GM-CSF a 100 ng/mL, y el IF -a a lOOOUl/mL; ó GM-CSF a 100 ng/mL y IL-4 a 20 ng/mL; o suero de lupus o suero autólogo. El día 3, las células fuéron cosechadas y teñidas con anticuerpo anti-CD14-PE, anti-CD83-PE, anti-HLA-DR-PrCP (proteína peridina clorofila) anticuerpo, anticuerpo anti-manosa-receptora-PE, anticuerpo anti-CD80PE (ficoeritrina) , anticuerpo anti-CD86-PE, anticuerpo anti-CD40-PE, anticuerpo anti-CD16-PE, anticuerpo anti-CD32-PE, anticuerpo anti-CD64-PE y anticuerpo anti-CD!a-FITC.
Los leucocitos enriquecidos CD14++ del donante normal fueron cultivados {lxl06/líq ido) con 20% de suero de lupus o suero autólogo. Los monocitos fueron cultivados con células dendríticas de lupus erythematosus sistémico y en el día 3 las células fueron cosechadas y evaluadas por el flujo de citometría para la expresión de ciertas moléculas de superficie de la célula. El análisis de citometría de flujo demuestra la regulación abajo del CD14, expresión aumentada de MHC clase II, moléculas costimulatorias : CD40, CD86, y CD80, CD83, así como receptor mañosa, CD32, y CD36 (Figura 3). La inducción de la diferenciación del monocito a las células con la morfología y el fenotipo de las células dendríticas, más que macrofagas (?f) , fue restringida a aquellas células dendríticas crecidas en el suero del lupus erythematosus sistémico. Efectivamente, ninguno del suero autólogo o alogénico induce tal fenotipo (Figura 2C) .
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) a los siguientes antígenos fueron utilizados: CD14, HLA-DR (Becton-Dickinson) ; CD86; CD40; HLA-ABC, CDla(Dako, Carpintería, California) ; CD80; CD83 (Beckman Coulter/Immunotech, Nueva York) .
Dado que las células inducidas del suero de lupus erythematosus sistémico exhiben receptores capturados de antígeno y dado que la habilidad para capturar antígenos es una propiedad importante de las células dendríticas, fue determinado sea que las células diferenciadas en cultivo pueden capturar a los antígenos solubles. A este fin, los monocitos cultivos del suero de lupus erythematosus sistémico fueron incubados con FITC-Dextran. Como se muestra en las Figuras 4A-4E, las células inducidas de lupus erythematosus sistémico fueron tan eficientes como las células dendríticas inducidas de GM -CSF/IL-4 en la toma de FITC-Dextran.
La actividad endocítica de las células diferenciadas en cultivo fue determinada por la incubación de las células con 100 µ /?t?_? FITC-Dextran por 1 hora a 37 grados centígrados. Como un control, algunas células fueron incubadas con FITC-Dextran en hielo. Las células lavadas con PBS/FCS frío y analizadas por citometría de flujo.
Por tanto, la morfología, fenotipia y captura de antxgeno indicaron que los leucocitos directos del suero de lupus erythematosus sistémico para diferenciar en las células capaces de capturar antígenos, por ejemplo, expresando las moléculas de captura de antígeno tal como CD14 , receptor de mañosa y CD36 (característica de las células dendríticas inmaduras y de ?f) , y expresando moléculas importantes para la presentación del antígeno incluyendo HLA-DR, moléculas co estimulantes y CD83 , una marca de células dendríticas maduras.
En seguida fue determinado si los monocitos cultivados con el suero del lupus erythematosus sistémico fueron capaces de inducir la proliferación de Cándidas células T CD4+, una propiedad única a las células dendríticas entre todas las células de presentación de antígeno. Como se muestra en la Figura 5, los leucocitos cultivados con suero autólogo indujeron una proliferación limitada de linfocitos alogénicos T CD4+ en tanto que los leucocitos cultivados con el suero del lupus erythematosus sistémico que induce una fuerte proliferación de célula T similar a aquella del GM-CDF/IL-4 de las células dendríticas, que es una característica estándar de las células dendríticas en tubo de ensayo. La Figura 6 ilustra el nivel de citoquinas de la célula T producida por las células T inducidas ya sea por las células dentriticas del lupus erythematosus sistémico o las células dendríticas cultivadas en suero AS. Las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico induce a las células T a producir IFN-? y no IL-10 (excepto a niveles insignificantes, por tanto demostrando una polarización del tipo I (Thl) . Los leucocitos cultivados con ya sea suero lupus erythematosus sistémico, suero AS, GM-CSF/IFN-a ó GM-CSF/IL-4 fueron lavados y plateados con células alogénicas T CD4+ . Los sobre nadantes fueron cosechadas 5 días después del cultivo, y la reestimulación por toda la noche con ???. La liberación de citoquina fue examinada por un examen de ELISA y de IL-10 y de IFN-? son mostrados en pgxl03/mL en el eje vertical. Por tanto, los linfocitos activados de T CD4+ secretaron altos niveles de interferón ?, bajos niveles de IL-10 y ninguna IL-4 consistente con la polarización del tipo I.
Proliferación de célula T y examen de citoquina: Las células dendríticas fueron cultivadas con lxlO5 recientemente aisladas células T alogénicas CD4+ a dosis graduadas por 5 días en cRPMI más 10% de suero AB humano o con linfocitos T alogénicos candidos CD4+CD45RA. Para examinar la proliferación de células T autóloga, los GM-CSF/ IFN-a ó GM-CSF/IL4 o células de lupus fueron pulsadas con cuerpos DNA por 4 horas y cultivadas con lxlO5 células T autólogas en dosis graduadas. Las células fueron pulsadas por al menos 16 horas con 0.5 µ??[3?] timidina por depósito (New England Nuclear, Boston, Massachussets) . Para el análisis de citoquina, los sobre nadantes fueron cosechados 5 días después del cultivo, y las células fueron reestimuladas con PHA en un medio fresco por 24 horas. La liberación de citoquinas fue examinada por juegos de ELISA (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) .
Ejemplo 2: Células dendríticas de Sueros de Lupus Erythematosus Sistémico (SLE) presentan antígenos de células apoptóticas capturadas El procesamiento no normal e inapropiado de las células apopópticas por el sistema inmune es considerado como uno de los eventos patogénicos en el lupus erythematosus sistémico. Por tanto, fue en seguida determinado si las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico puede presentar antígenos de las células apoptóticas capturadas. Para este fin, las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico fueron mostradas por ser capaces de capturar fragmentos de células apoptoticas en el cultivo (Figuras 7A-7B) .
Las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico también puede capturar el DNA que contiene los cuerpos apoptóticos derivados de las células melanoma. Las Figuras 8? y 8B muestran la captura de las células apoptoticas alogénicas y la presentación de sus antígenos a las células T +CD4 autólogas . Las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico capturó DNA que contiene cuerpos apoptóticos (Figura 8A) y presentaron sus antígenos a las células autólogas T CD4+ como se indica por la inducción de la proliferación de la célula T CD4+ (Figura 8B) , HLA-DR+ leucocitos inducidos por el suero AS, el suero del lupus erythematosus sistémico (SLE) y GM-CSF/lL-4 capturado de 7AAD etiquetado de cuerpos de DNA (la línea de célula melanoma muerta por radicación gamma (150 Gy) ) . Para permitir la captura de los cuerpos apoptóticos, las células que presentan el antígeno son mezcladas añadidas con células muertas e incubadas por 1 hora a 37 grados centígrados. Después de esto, estas células dendríticas de lupus erythematosus sistémico cargadas fueron seleccionadas por flujo de citometría y cultivadas con células autólogas T CD4+. La proliferación de la célula T es determinada después de 5 días.
Estas cargadas células dendríticas de lupus erythematosus sistémico fueron entonces cultivadas con células autólogas T CD4+. Como se muestra en la Figura 8B, las cargadas células dendríticas de lupus erythematosus sistémico son leucocitos inducidos para diferenciar en las células dendríticas funcionales que son capaces de capturar y presentar antígenos procesados de células apóptoticas.
Ejemplo 3: Solamente IFN-a que contiene los sueros de lupus erythematosus sistémico activos que inducen a monocitos para hacerse células dendríticas del lupus erythematosus sistémico Los experimentos fueron realizados para determinar si todos los sueros del lupus erythematosus sistémico fueron capaces de dirigir la diferenciación de monocitos en las células dendríticas . Los monocitos fueron cultivados con 19 diferentes sueros de lupus erythematosus sistémico para ser probados por su habilidad para estimular una respuesta de un mezclado leucocito o la reacción del mezclado linfocito (MLR) . Como se muestra en la Tabla 1, los monocitos cultivados con suero autólogo fueron solamente capaces de inducir muy baja proliferación de célula T (control negativo) , y los monocitos cultivados con GM-CSF/IL-4 para producir las células dendríticas sacadas a 100% de MLR (control positivo) , el medio de proliferación fue de 7.5% (+6.4%, n=5) . Cuando los monocitos cultivados con los sueros de lupus erythematosus sistémico fueron evaluados en la misma forma, considerando 20% de proliferación como un punto de corte (medio +2SD de leucocitos cultivados en suero autólogo) 11 de los 19 sueros indujeron monocitos para ser células dendríticas aloestimulantes con proliferación media de 41% ±15%. Como los sueros de los pacientes con dermatomiositis fueron incapaces de reproducir este tergiversado y dado que los pacientes con dermatomiositis fueron tratados con el mismo régimen de esteroide como los pacientes de lupus erythematosus sistémico, se concluyó que los efectos de los sueros de lupus fueron independientes de los esteroides. Además, los sueros de dos nuevos pacientes diagnosticados no tratados eficientemente diferencian monocitos en las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico. Importantemente, de esos 11 sueros que indujeron a las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico, 7 sueros que fueron probados por los niveles de IFN-a contenían más de 190 pg/mL IFN-a, mientras que la mayoría de los sueros que fueron incapaces de inducir a las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico contenían menos IFN-a que podía detectarse en el examen (12pg/mL) (Tabla 1) . Además, las células dendríticas que indujeron la capacidad de los sueros del lupus erythematosus sistémico fue relacionado a la actividad de la enfermedad. En las Figuras 9A-9B, una gráfica muestra la relación de la actividad de la enfermedad de lupus erythematosus sistémico a la actividad inducida de las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico. Los monocitos fueron cultivados con 11 diferentes sueros del lupus erythematosus sistémico tomados de ya sea pacientes con lupus activo (índice de la Actividad de la Enfermedad del Lupus Erythematosus Sistémico (SLEDAI) >6) o lupus inactivo (SLEDAI <6) , y las células generadas fueron probadas por su habilidad para inducir la proliferación de células T. Como controles, los monocitos fueron cultivados con GM-CSF y con IL-4. El eje vertical muestra el porcentaje de la capacidad inducida aloestimulatoria. Por lo tanto, la habilidad de los sueros de lupus erythematosus sistémico para tergiversar la diferenciación del monocito hacia las células dendriticas fue específico a la enfermedad y correlacionado con los niveles de IFN-a.
Tabla 1 : IFN-a que contiene los sueros del lupus erythematosus sistémico (SLE) inducidos monocitos para adquirir la capacidad para estimular la reacción del linfocito mezclado.
Los monocitos fueron cultivados con diferentes sueros de lupus erythematosus sistémico (Tabla 1, columna 1) y las células generadas fueron probadas por su habilidad para inducir la proliferación de la célula T alogeneica (reacción linfocito mezclado (columna2, Tabla 1, MLR). Como controles, los monocitos fueron cultivados con GM-CSF y con IL-4 y usados como un 100% estándar. La actividad aloestimulatoria de los monocitos cultivados con suero de lupus erythematosus sistémico es expresado como un porcentaje de la proliferación de la célula t en comparación al GM-CSF y IL-4 y relacionado a los niveles de IFN-a en el suero (columna 3, Tabla 1) y la actividad de la enfermedad (SLEDAI, columna 4, Tabla 1), el SLEDAI consiste de 9 grupos de criterios clínicos y de laboratorio que incluyen evaluación de los sistemas de órgano: CNS, vascular, renal, musculoesquelético, serosal, dérmico, inmunológico, y hematológico . El ND denota el no hecho, AS denota el suero autólogo de los donantes sanos, el SLE denota el suero de los pacientes con lupus erythematosus sistémico.
Ejemplo 4: La habilidad de los sueros del lupus erythematosus sistémico para inducir a las células dendríticas del lupus erythematosus sistémico para abolir por bloqueo el IFN-a La habilidad de las células dendríticas para tergiversar la diferenciación de los monocitos hacia la generación de las células que presentan antígeno fue relacionado al nivel de IFN-a en el suero del lupus erythematosus sistémico. El fenotipo de las células dentriticas del lupus erythematosus sistémico fue reminiscencia de aquella inducida por GM-CSF y de IFN-a y por ende, los sueros de lupus erythematosus sistémico fueron previamente incubados con un anticuerpo neutralizador anti-IFN-a. Las células cultivadas con tales sueros fueron probadas por su habilidad para inducir la diferenciación de los monocitos en las células dendríticas como se miden por su habilidad para inducir MLR: La habilidad de los sueros de lupus erythematosus sistémico para inducir las células dendríticas funcionales fue inhibido por la neutralización del IFN-a, pero no por el control isotipo (como se muestra en la Figura 10) u otro bloqueo de anticuerpos a IL-4, CD40L, y IL-10, lo cual indica que el IFN-a es necesario para la inducción de las células dendríticas del lupus erythematosus sistemico. La Figura 10 ilustra el bloqueo del IFN-a en el suero de la célula monocito cultivada obtendida de los pacientes con lupus erythematosus sistémico. La adición de un anticuerpo de bloqueo de xnterferón resultó en una mucho más disminuida habilidad para inducir la proliferación de las células alogeneicas T CD4+ . El resultado muestra que las células dendríticas que inducen actividad del suero de lupus erythematosus sistémico depende del IFN-a y es abolido por el bloqueo del IFN-a en el suero de lupus erythematosus sistémico usado para cultivar los monocitos. Los monocitos purificados fueron cultivados con suero de lupus erythematosus sistémico, o el suero previamente incubado por 30 minutos a concentraciones de saturación del IFN-a que bloquea al AB(SLEab) (biofuente) o con la correspondiente concentración de control de isotipo (SLEctrl) . Después de tres días, las células fueron evaluadas por su habilidad para inducir la proliferación de las células alogeneicas T CD4+ .
Ejemplo 5: Pacientes con lupus erythematosus sistémico tienen altos niveles de suero de IFN-a Los niveles de suero de IFN-a en pacientes pediátricos de lupus erythematosus sistémico fueron determinados. Como se muestra en la Figura 11, el suero tomado de pacientes con lupus erythematosus sistémico tienen mucho más altos niveles de IFM-a que el suero obtenido de sujetos sanos (controles) . El suero fue obtenido de pacientes con lupus erythematosus sistémico. El suero fue examinado por IFN-a usando un juego de ELISA (BioSource, de conformidad con las recomendaciones del fabricante) el cual está basado en la referencia estándar internacional para el interferón humano (aprobado por los Institutos Nacionales de Salud) . La reacción colorimétrica fue desarrollada usando HRP y TNB. Las absorbencias a 450 nm fueron determinadas con un lector de microplaca. El protocolo del rango extendido del examen fue usado que permite la determinación de los niveles de suero en el rango desde 10 a 5000 pg/ml.
Ejemplo 6: Pacientes con lupus erythematosus sistémico PB C pueden secretar IFN-a en respuesta al disparo viral.
Cuando se expone al virus de la influenza, el PBMC de los pacientes con lupus erythematosus sistémico liberó altos niveles de IFN-a cuando se compara a los niveles de IFN- a liberados del PBMC de adultos sanos que fueron expuestos al virus de la influenza (véase la Figura 12) .
Ejemplo 7: IFN-a induce la expresión de BAFF/Blys en monocitos y la expresión BCMA en PBMC Un nuevo miembro de la familia TNF, designada BAFF/Blys (por el factor de activación de la célula B que pertenece a la familia TNF) , se encuentra en las células dendríticas y las células T y unidas a dos receptores en las células B, a saber, BCMA y TACI, e induce su proliferación y la secreción de inmunoglobulina. Por lo tanto, fue determinado si IFN-a puede regular la expresión de ambas moléculas (por ejemplo, BCMA y TACI) en los respectivos tipos de células. Como se muestra en las Figuras 13A-13B, el IFN-a,pero no otros factores, inducen altos niveles de BAFF/Blys en los monocitos como se determina por el tiempo real PCR. Además, el IFN-a induce la expresión BCMA en PBMC normal .
Ejemplo 8: Examen de Diagnóstico del Suero del Paciente de Investigación para la Inducción de la Diferenciación del Monocito en Tubo de Ensayo El suero de un paciente es investigado por su habilidad para inducir la diferenciación del monocito para las células dendríticas cuya diferenciación puede entonces ser bloqueada por el neutralizado del interferón del tipo I Siguiendo los procedimientos delineados en detalle en el Ejemplo 1, una alícuota del suero del paciente es añadido a una alícuota de los monocitos purificados de los pacientes normales. Después de cerca de tres días, el grado de diferenciación de los monocitos a las células dendríticas es evaluado por cualquier medio conocido en el arte. Métodos de examen ejemplares incluyen el análisis morfológico directo, el análisis fenotxpico por el flujo de citometría, el antígeno capturado susceptible de medir por la toma de FITC-Dextran, y la inducción de células alogeneicas cómodas de T CD4+ puede medirse por la incorporación de timidina. Este examen de diagnóstico en tubo de ensayo incluye un conocido juego de estándares a fin de clasificar los resultados obtenidos con la muestra del suero obtenido del paciente. Brevemente, el suero de un paciente normal, por ejemplo, un paciente conocido que no sufre de una enfermedad auto inmune es corrido a través del examen y los resultados obtenidos son usados como el estándar indicativo de bajo riesgo para desarrollar una enfermedad auto inmune. De forma similar, el suero de un paciente conocido que tiene una enfermedad auto inmune, tal como lupus erythematosus sistémico, es tomado y usado en el examen y los resultados obtenidos son usados como el estándar indicativo de alto riesgo para desarrollar una enfermedad auto inmune. El suero del paciente que soporta un alto grado de diferenciación de monocito a las células dendríticas que pueden bloquearse por el interferón del tipo I, es considerado que coloca al paciente en alto riesgo para desarrollar una enfermedad auto inmune. El "alto grado" de diferenciación del monocito es determinado por la comparación de la cantidad de diferenciación del monocito en el examen usando el suero del paciente con los estándares previamente establecidos para el alto riesgo, el bajo riesgo, y cualquier otro valor de riesgo medio. Cada nivel de riesgo para desarrollar una enfermedad auto inmune es asociada con un nivel de diferenciación del monocito observado en el examen. Si el suero del paciente no soporta un alto grado de diferenciación del monocito para las células dendríticas que pueden bloquearse por el interferón del tipo I, entonces el nivel de riesgo del paciente para desarrollar una enfermedad auto inmune es pequeña o de no riesgo. Para un paciente que ha sido diagnosticado con una enfermedad auto inmune, la evaluación periódica del suero del paciente en este examen proporciona un método para monitorear por el destello de la enfermedad o su progresión.
Ejemplo 9: el TNF inhibe la secreción del interferón tipo I por pDC Kado aki y otros (J.Exp.Med.2000, 192:1785-96) describe que el auto crine del IFN- soporta la sobrevivencia del pDC mientras que el auto crine del TNF-a induce a su maduración en las pDC maduras, que son incapaces de producir IFN-a. Por tanto, estudios fueron realizaos para determinar si el añadir o no anticuerpos neutralizantes TNF a los cultivos de pDC normales sostenía su producción de IFN-a en respuesta al disparo viral.
Para estos estudios, las pDC fueron aisladas de cultivos de progenitores hematopoyéticos CD34+ por el ordenado de citometría de flujo de células del CDllc negativo y de CD123 positivo. Las pDC aisladas fueron cultivadas a una concentración de 50,000 células po recipiente/200 µL con virus de influenza purificados (5 µL) y ya sea un anticuerpo de control o un anticuerpo anti TNF neutralizante (cultivo primario) . Después de 24 horas de cultivo primario, las placas fueron centrifugadas, los sobre nadantes fueron cosechados, y las células fueron vueltas a cultivar en medio fresco con una dosis fresca (5 µL) de virus de la influenza (cultivo secundario) . Después de 24 horas de cultivo secundario, los sobre nadantes fueron cosechados y evaluados por la presencia de los niveles de IFN-a.
Las Figuras 14A-14C muestran la regulación TNF de la secreción de IFN-a por las células dendrxticas plasmacitoides (pDC) . Las células dendrxticas purificadas generadas en tubo de ensayo por el cultivo de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ con Flt3L (100 ng/mL) y trombopoyéticas (TPO) (30ng/ml) , son cultivadas a una concentración de 50,000 células por recipiente con virus de influenza purificado (5 µL) con ya sea un anticuerpo de control (5 µg/mL) o con anticuerpo anti-TNF neutralizante (5 µg/mL) o con TNF exógeno (100ng/mL) (cultivo primario) . Después de 24 horas de cultivo, las placas fueron centrifugadas, los sobre nadantes fueron cosechados y las células fueron vueltas a cultivar en medio fresco con la dosis fresca del virus de influenza (cultivo secundario) . Después de 24 horas adicionales del cultivo, los sobre nadantes fueron cosechados para la evaluación de los niveles de IFN-a. Como se muestra en la Figura 14A, el añadir el anticuerpo neutralizante anti-TNF resultó en una liberación aumentada de 3 veces de IFN-a en cultivos secundarios. Contrariamente, el añadir el TNF resultó en hasta el 70% de inhibición del IF -a liberado en los cultivos primarios de pDC (véase la Figura 14B) . Como se ilustra en la Figura 14C, la concentración de IFN-a en el cultivo primario de sobre nadantes disminuyó de 100 ng/mL a 40 ng/mL.
Este estudio proporciona la teoría no limitante sintetizada en la Figura 16 de cómo las pDC inmaduras pueden bloquearse de secretar IF -a por la incubación en TNF (o un agente de unión receptor antiTNF agonístico) . Las pDC incubadas con TNF son por tanto promovidas para hacerse maduras pDC, que no secretan IFN-a.
Ejemplo 10: TNF inhibe la ontogenia de la pDC Estudios fueron enseguida realizados para determinar si el efecto del TNF en las pDC es restringido a su maduración y producción del IFN-a o si el TNF, una citoquina pro-inflamatoria principal involucrada en la regulación de la diferenciación de las células dendríticas mieloides, también afecta la diferenciación de las pDC de los progenitores hematopoyeticos . Para estos . estudios, los progenitores hematopoyeticos CD34+CD45Ra- fueron clasificados por sobre 90% de pureza por el flujo citometrico y subsecuentemente cultivados en presencia de Flt3L (100 ng/ml, R&D) , trombopoyétina (TPO, 30 ng/ml, R&D), y ya sea interleuquína-6(IL-6, 25 ng/ml, R&D), o factor de necrosis de tumor (TNF, 100 ng/ml, R&D) , en la primera semana de cultivo a una densidad de entre 2/5xl05 a 5xl0s/recipiente . Después de esto, las células fueron lavadas y cultivadas por alrededor de unas adicionales 3 semanas con Flt3L (100 ng/ml), solamente.
La Figura 15 muestra resultados de un experimento de flujo de citometría que muestra que el TNF bloquea la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides a favor de las células dendríticas mieloides. La diferenciación de la pDC fue determinada por el análisis del flujo de citometría de la expresión marcada de la superficie de la célula con pDc siendo identificada por el coloreado de CDllc negativo CD123 positivo. Por tanto, añadiendo TNF en la primera semana resulta en una completa inhibición de la diferenciación de la célula progenitora en CD123+CDllc-pDC y tergiversa la diferenciación hacia CD123-CDllc+ células dendríticas mieloides. Por tanto, el TNF y/o los anticuerpos receptores anti TNF agonísticos, ambos de los cuales estimulan al receptor TNF en las células progenitoras , bloquean la diferenciación de la pDC y redirigen las células progenitoras hacia la diferenciación de las células dendríticas mieloides.
Este estudio proporciona la teoría no limitante mostrada en la Figura 16 de cómo la producción y secreción del IFN-a puede bloquearse al exponer las células progenitoras al TNF (o un agente aglutinizante receptor anti TNF agonístico) . Tal exposición lleva a la inhibición del desarrollo de las pDC que pueden hacer al interferón y por ende bloquear la producción y secreción del interferón.
Ejemplo 11: el nivel del Flt3L es aumentado en el suero de los sujetos que sufren de lupus erythematosus sistémico Como se describió en los ejemplos anteriores, la inducción no abolida de las células dendríticas se cree que impulsa la respuesta auto inmune devastadora en el lupus erythematosus sistémico y, como se describe aquí, puede controlarse al disparar IFN-a y Flt3L juntos. Sin embargo, otras citoquinas, que son denominadas aquí, como "células dendríticas poyetinas" pueden movilizar y/o activar las células dendríticas para diferenciar en las células que presentan antígeno en vivo. Esta movilización o activación de las células dendríticas puede ocurrir en muchas diferentes formas. Por ejemplo, tales células dendríticas poyetinas pueden aumentar la diferenciación de las células pDC en células dendríticas maduras que pueden ir a un aumento de respuesta inmunogeneica y empeorar las respuestas auto inmunes. Gomo otro ejemplo, las células dendríticas poyétinas pueden aumentar la actual generación de nuevamente maduras células dendríticas que contribuyen a las respuestas auto inmunes en el sujeto, o las células dendríticas poyétinas pueden aumentar la actividad de las células dendríticas maduras.
Una célula dendrítica poyetina no limitante es el Flt3L, que ha sido mostrada para movilizar grandes números de células dendríticas, ambas mieloides y plasamcitoides, en vivo en modelos humanos y ratones (Maraskovsky y otros (1997) Adv.Exp.Med.Biol.. 417:33-40; (1996) J. Exp .Med.184 (5) : 1953-62 ; (2000) Sangre 96 (3) : 878-84) . Además, como se muestra en la presente invención, el cultivar células de vastago hemotopoyéticas CD34+ con Flt3L produce no solo células dendríticas plasmacitoides pero también CDllc+ células dendríticas mieloides así como monocitos .
Los niveles de suero de Flt3L en pacientes con lupus erythematosus sistémico (83 muestras de sangre) así como en controles sanos (35 muestras de sangre) fue determinada usando el comercialmente disponible ELISA (R&D) . Como se muestra en la Figura 17, los pacientes de lupus erythematosus sistémico tienen significativamente más altos niveles de suero de Flt3L (p<0.002) en el rango desde <12.5 a 582 pg/ml de suero, que - aquellos medidos en el suero tomado de sujetos sanos. Las 83 muestras de sangre de los pacientes de lupus erythematosus sistémico y las 35 muestras de sangre de pacientes sanos (controles sanos) fueron probadas usando un comercialmente disponible ELISA. Las diferencias en los niveles de Flt3L en las muestras de suero son estadísticamente significativas usando ambos análisis paramétrico y no paramétrico.
Ejemplo 12: Los niveles de suero de Flt3L se correlacionan con la actividad de la enfermedad auto inmune ' Fue determinado que los niveles de suero del Flt3L se correlacionan con la actividad de la enfermedad como se mide por el Indice de Actividad de la Enfermedad del lupus erythematosus sistémico (SLEDAI) . Como se muestra en la figura 18, hubo una correlación positiva significativa (p=0.02), indicando que aquellos individuos con altos niveles de suero de Flt3L también han exhibido alta actividad de la enfermedad de lupus erythematosus sistémico. Por tanto, la ocurrencia de los elevados niveles de Flt3L en el suero es un indicador del riesgo auto inmune o la enfermedad auto inmune activa en un sujeto.
Ejemplo 13: El Flt3L permite la diferenciación del monocito en las células dendríticas Los monocitos aislados de células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos (PBMC) fueron ya sea aislados por la selección positiva usando gotas de CD14 o enriquecidos por la adherencia y subsecuentemente cultivo por dos días en un completo medio de cultivo (RPM11640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal no activada por calor) con Flt3L (TOOng/mL) y IL-3 (10ng/mL) y/o IFN-a (1000 U/mL) . Los cultivos de control fueron realizados con GM-CSF y IL-4. La Figura 19A muestra células cultivadas con Flt3L/lFN-a (1000 u/mL) . La Figura 19B muestra células cultivadas con GM-CSF(100 ng/mL) /IL-4 (5 ng/mL) . La Figura 19C muestra células cultivadas con IFN-a (1000 u/mL) /IL-3 (10 ng/mL). La Figura 19D muestra células cultivads con Flt3L/IFN-a (1000 u/mL) /IL-3 (10 ng/mL): Después de 2 días de cultivo, los monocitos citogiros fueron coloreados con Giemsa. Por tanto, los monocitos cultivados con Flt3L y IFN-a diferencian en las células que exhiben características de las células dendríticas como se determina por la morfología (Figuras 19A-19D) , el fenotipo (CD14 bajo, DC-SIGN+, CD40+, HLA-DR+, CD11C+) y la función, por ejemplo, la capacidad de inducir la proliferación de las células T alogénicas CD4+ que son una marca de la función de la célula dendrítica (Figura 20) . En la Figura 20, las células T alogénicas CD4+ purificadas 105 fueron cultivadas por cinco días con números graduados de células que presentan antígeno (eje horizontal) . La proliferación de célula T fue medida por la incorporación de timidina (eje vertical, cpm x.103) seguido de cultivo con medios suplementados con Flt3L. La Figura 21 muestra un diagrama que sintetiza varias vías en el desarrollo y la diferenciación de los sub juegos de células dendríticas que pueden alterarse por el bloqueo de la actividad del Flt3L y del IFN-a. Estos objetivos terapéuticos incluyen 1) vía de diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas en la pDC, que puede ser bloqueada ya sea por TNF o por Flt3L antagónico o por una combinación de ambos el TNF y el Flt3L antagónico con el resultado final siendo inhibida la producción de interferón a través de la inhibición de la diferenciación de células que pueden hacer al interferón, 2) la via de maduración del pDC, que puede acelerarse por TNF con el resultado final siendo que la pDC se vuelve células no productoras de interferón por tanto disminuyendo los niveles del interferón, 3) la vía de diferenciación de los monocitos a las células dendríticas , que pueden bloquearse por un interferón antagónico o por un Flt3L antagónico o por una combinación de interferón antagónico y un Flt3L antagónico, con el resultado final siendo inhibida la diferenciación de células dendríticas que son de otra forma capaces de capturar y presentar células apoptoticas e impulsar la enfermedad auto inmune al inducir la diferenciación de las células auto reactivas B y de las células autorectivas T.
Ejemplo 14: Neutralizando el Flt3L en el suero del lupus erythematosus sistémico inhibe la d ferenciación del monocito inducido del suero de lupus erythematosus sistémico en las células dendríticas Los monocitos son cultivados con suero obtenido de un paciente con lupus erythematosus sistémico. Una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal que específicamente une al Flt3L (anticuerpo monoclonal anti Flt3L) es añadido, a la concentración de saturación, por ejemplo, una concentración en el rango entre alrededor del exceso molar de veces 1-10, al cultivo de célula de monocito bajo condiciones adecuadas de cultivo para la diferenciación de monocito. Después de tres días de incubación, un menor número de monocitos se han diferenciado en las células dendríticas que en un cultivo de monocito idéntico que no ha recibido al anticuerpo monoclonal. Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal al Flt3L, que neutraliza la actividad del Flt3L en el cultivo inhibe la diferenciación del monocito inducido del lupus erythematosus sistémico en las células dendríticas.
Ejemplo 15: La adición de una composición de un Flt3L antagónico y de un interferón antagónico al crecimiento de monocitos en el suero de lupus erythematosus sistémico inhibe la diferenciación del monocito en el antxgeno que presentan las células dendríticas Un método para tratar una enfermedad auto inmune en un sujeto es ejemplificado aquí donde una composición terapéutica de la invención es administrada al sujeto a fin de reducir o inhibir la generación de las células que presentan antígeno que causa la estimulación de las células autoreactivas T y de las células autoreactivas B que producen auto anticuerpos en el sujeto.
Una composición terapéutica es preparada con una cantidad de a) un anticuerpo monoclonal anti-Flt3L y b) una cantidad de un anticuerpo monoclonal anti-IFN-a que es igual a alrededor de veces 1-10 del nivel del Flt3L y de IFN-a, respectivamente, en el suero del paciente a tratarse. Los métodos para preparar los anticuerpos monoclonales al Flt3L, son conocidos, por ejemplo uno de tales métodos está en el Ej emplo 6 de la patente de los Estados Unidos de América número 5,843,423, "Métodos para Estimular células hematopoyéticas con Flt3L ligando" . Los métodos para preparar anticuerpos monoclonales al IFN-a son conocidos y, por ejemplo, algunos de tales métodos son señalados en la patente de los Estados Unidos de América número 5,919,453.
El suero puede obtenerse del sujeto con la enfermedad auto inmune y probado para asegurar que suficientes niveles de Flt3L y de IFN-a están presentes en el suero para garantizar la administración de la composición terapéutica.
La composición es administrada diariamente por vía de una inyección o por vía de un método de suministro intravenoso para asegurar un nivel de suero de los dos elementos de la composición dentro de un rango desde alrededor de exceso molar veces de 1 a alrededor de 10 de Flt3L y/o de IFN-a. El monitoreo de la condición del sujeto puede realizarse a través del período de tratamiento como para determinar el nivel de generación del APC. La existencia de células dendríticas en el suero del sujeto es monitoreada a través del tratamiento. El tratamiento es terminado cuando los síntomas de la enfermedad auto inmune disminuyen y se toma de nuevo cuando los niveles de Flt3L y/o de IFN-a muestran una tendencia al aumento por dos análisis de sangre consecutivos y/o cuando los síntomas de la enfermedad auto inmune empeoran.

Claims (1)

  1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Un método para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto el cual comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de (a) por lo menos un antagonista interferon que reduce la actividad del interferon tipo I y (b) por lo menos un antagonista ligando Flt3 (Flt3L) que reduce la actividad del ligando Flt3L para por tanto tratar la enfermedad autoinmune . 2. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es seleccionada del grupo que consiste de síndrome de deficiencia de inmunidad adquirida (SIDA) , espondilitis anquilosante, artritis, anemia aplástica, enfermedad de Behcet's, diabetes, enfermedad de injerto-contra anfitrión, enfermedad de Graves, anemia hemolítica, hipogamaglobulinemia, síndrome de hiper IgE, púrpura idiopática trmbocitopenia (ITP) , esclerosis múltiple, ( S) , miastenia gravis, psioriasis, lupus y cualquier combinación de las mismas. 3. El método tal y como se reivindica en la cláusula 2, caracterizado porque el lupus es lupus es sistémico eritematoso (SLE) o un lupus inducido por drogas. . El método tal y como se reivindica en la cláusula 2, caracterizado porque la diabetes es diabetes mellitus, diabetes tipo I, diabetes tipo II, diabetes juvenil, o cualquier combinación de los mismos. 5. El método tal y como se reivindica en la cláusula 2, caracterizado porque la artritis es artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis soriática o cualquier combinaciones de las mismas. 6. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es SLC. 7. El método tal y como se reivindica en cláusula 1, caracterizado porque el sujeto es un mamífero. 8. El método tal y como se reivindica en cláusula 1, caracterizado porque el mamífero es un humano, primate, una rata, un perro, un gato o un ratón. 9. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista interferon es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento aglutinante-antígeno de un anticuerpo, un polipéptido, un péptido mimético, un ácido nucleico codificando un péptido, una molécula orgánica y cualquier combinación de los mismos . 10. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista interferon comprende un receptor soluble para I.FN-». 11. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista inferferon comprende un anticuerpo anti-IFN-» o un fragmento de antígeno-aglutinante del mismo. 12. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista Flt3L es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de antígeno-aglutinante de un anticuerpo, un polipéptido, un péptido mimético, un ácido nucleico codificando un polipéptido, una molécula orgánica o cualquier combinación de los mismos . 13. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista Flt3L comprende un receptor Flt3L soluble. 14. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista Flt3L comprende un anticuerpo anti-Flt3 o un fragmento de antígeno-aglutinante del mismo. 15. El método tal y como se reivindica en cualesquiera de las cláusulas 9, 11, 12 o 14, caracterizado porque el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo anti-idiotípico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo primatizado o cualquier combinación de los mismos. 16. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista interferon y el antagonista Flt3L son parte de una molécula. 17. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista la cantidad efectiva de antagonista interferon comprende de desde alrededor de 1 a alrededor de 1 veces exceso molar de interferon. 18. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista la cantidad efectiva del antagonista Flt3L comprende de desde alrededor de 1 a alrededor de 10 peso molar de Flt3L. 19. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la administración de la composición es intralesional , intraperitonial , intramuscular o inyección intravenosa; infusión, entrega mediada por liposoma o entrega tópica nasal, oral, ocular u ótica. método tal y como se reivindica cláusula 1, caracterizado porque el interferon de tipo I es un interferon-» (IFN-*) o un IFN-ß . 21. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista interferon reduce el aglutinamiento del interferon tipo I con su receptor. 22. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista interferon reduce la transduccion de señal dependiente de interferon. 23. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista interferon reduce los niveles de suero interferon. 24. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista interferon reduce la secreción de interferon de las células como se midieron por un ensayo aglutinante de receptor de interferon. 25. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista interferon reduce la viabilidad del interferon en suero como se midió por un ensayo aglutinante receptor interferon. 26. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el antagonista interferon reduce el desarrollo de células las cuales reducen el interferon tipo I en el sujeto como se midió por un ensayo de diferenciación de monocito. 27. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1 o 11, caracterizado porque el antagonista interferon es TNF. 28. Una composición terapéutica para inhibir la diferenciación de monocito en células dendriticas capaces de presentación de antigeno que comprende: (a) por lo menos un antagonista interferon que reduce la actividad del interferon tipo I; y (b) por lo menos un antagonista de ligando Flt3 (Flt3L) que reduce la actividad del Flt3L. 29. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque el tipo de interferon I es un interferon a(IFN-a) o un IFN-ß. 30. La composición tal y como se reivindica en la cláusula. 28, caracterizada porque la composición además comprende un portador. 31. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque el antagonista interferon es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento aglutinante de antígeno de un anticuerpo, polipéptido, un péptido mimético, un ácido nucleico codificando un polipéptido, una molécula orgánica o cualesquier combinación de los mismos. 32. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque el interferon antagonista comprende un receptor soluble para el IFN-a. 33. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque el antagonista interferon comprende un anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de aglutinante-antigeno del mismo. 34. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque el antagonista interferon es TNF . 35. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque el antagonista Flt3L es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de aglutinante-antigeno-anticuerpo, un péptido mimético, un ácido nucleico codificando un péptido, una molécula orgánica y cualesquier combinación de los mismos. 36. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque el antagonista Flt3L comprende un receptor Flt3 soluble . 37. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque el antagonista Flt3L comprende un anticuerpo-anti-Flt3L o un fragmento aglutinante de antígeno del mismo. 38. La composición tal y como se reivindica en cualesquiera de las cláusulas 31,33 35 y 37, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo anti-idiotípico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo primatizado. 39. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque el antagonista interferon u el antagonista Flt3L son parte de una molécula. 40. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizada porque la composición comprende dos o más antagonistas de interferon y un antagonista de Flt3L. 41. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 40, caracterizada porque el antagonista interferon es TNF. 42. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 40, caracterizada porque la composición comprende un anticuerpo anti-IFN-a, un anticuerpo anti-Flt3L y TNF. 43. Un ensayo in vitro para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar una enfermedad autoinmune que comprende : (a) obtener una muestra de suero del sujeto (b) cuantificar el IFN-a y el ligando Flt3L (Flt3L) en la muestra de suero; y (c) comparar la cantidad del IFN-a y del Flt3L con las cantidades del IFN-a y Flt3L en sueros de sujetos con una enfermedad autoinmune, determinando por tanto el riesgo del sujeto para desarrollar una enfermedad autoinmune. 44. El método tal y como se reivindica en la cláusula 43, caracterizado porque un riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune ocurre cuando las cantidades de IFN-a y Flt3L están dentro de alrededor de 30% del rango de dos cantidades para los sujetos con una enfermedad autoinmune. 45. El método tal y como se reivindica en la cláusula 44, caracterizado porque el riesgo aumenta cuando dicho rango es de alrededor de 20%. 46. El método tal y como se reivindica en la cláusula 43, caracterizado porque dicha comparación se hace para los sujetos de edad-casada. 47. Un estuche para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar una enfermedad autoinmune o para vigilar el estado autoinmune en un sujeto el cual comprende una composición la cual aglutina específicamente a el Flt3L y a IFN-a en una cantidad efectiva para detectar el Flt3L y el IFN-a en una muestra biológica de un sujeto. 48. El estuche tal y como se reivindica en la cláusula 47, caracterizado porque biológica es una muestra de sangre o una muestra de suero. 49. El estuche tal y como se reivindica en la cláusula 47, caracterizado porque la composición comprende un anticuerpo monoclonal que aglutina el Flt3L y un anticuerpo monoclonal que aglutina el IFN-a· 50. El estuche tal y como se reivindica en la cláusula 47, caracterizado porque el estuche además comprende uno o más reactivos para determinar las cantidades de la composición unida a una o más muestras. 51. El estuche tal y como se reivindica en la cláusula 47, caracterizado porque la composición es marcada con un marcador detectable . 52. El estuche tal y como se reivindica en la cláusula 51, caracterizado porque el marcador detectable es seleccionado del grupo que consiste de un marcador fluorescente, un marcador radioactivo, una marcador enzimático, un marcador colorimétrico, un marcador quimoluminiscente y cualquier combinaciones de los mismos. R E S UM E N La invención proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto mediante el administrar un antagonista interferon y un antagonista ligando Flt3 ligando (FLt3L) . La invención también proporciona composiciones que comprenden uno o más antagonistas de interferon, y uno o más antagonistas Flt3L en un ensayo in vitro para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar una enfermedad autoinmune y estuches para usarse entre otros con el ensayo.
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