JPS60500864A - 近縁関係にあるが別個のタンパク質間に存在する共通決定基に対して特異的なハイブリド−マ抗体の製造および特性づけ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 近縁関保（であるが別個のタンパク質問に存在する共通決定基に対して特異的な ハイシリρ−マ抗体の製造および特性づけ 技術分野 不発明にＨ’ｌ工ＦＮ−α（ヒトインターフェロン−α）系に属する、天然に生 産（生庫内または試候管内）されたものにせよ、組替えＤＮＡ−技術（遺伝子工 学）により生産されたものにせよ、ま１こペプチ団合成によって生成されたもの にせよ、近縁関係にあるタンパク質の間の共通抗原決定基を認識する新規な特異 性ハイブリドーマ／モノクローナル抗体の記述、製造および特注づけ（キャラク タリゼーンヨン）にｉｌ　ｆる。

背景技術 インターフェロンは現在、細胞または全生物体にウィルスの攻撃に対する１耐性 を与える重要な一部の生物学的タンパク質として広く認められている〔いわゆる 抗ウィルス活性、スチュワード（１９８０年）参照〕。

さらにインターフェロンは生体内および試験管内の免疫系の調節、ならびにその 旧のいわゆる非つィルス註活性、例えば変換されたａ抱の再変美、腫瘍則砲の成 長１訂止等に重要な仮割を禾てことが証明された〔例えばビルセフら（１９８０ 年）参照〕。これらの理歯によりインターフェロン系（（ついては過去１０手間 種々研究が軍ねられ多数の発見が＠告されている〔スチュワード（１９８１］年 ）、ベルブ（１９８２年）参照〕。

インターフェロン研究の初期に認められた主な困難の一つはインターフェロンタ ンパク質の稽羨および特性づけＫおける困鑵性であった。ヒト系のものには准一 つのタンパク質・（が存在するものとほじられていたが、後ンて数人の研究者、 囲えばベルブら（１９７５年上スチュワード（１９８０手）、ベルブ（１９８２ 手）によってヒト系には三種の主要な型のインターフェロン、スナわちヒト白血 球インターフェロン（ＨｕＩＦＮ　−α）、ヒトー維芽＃Ｉ砲インターフェロン （ＨｕＩＦＮ−β）およびヒト免疫インターフェロン（ＨｕテＦＮ−γ）カ実際 には存在する二とが示された。

Ｈ岨ＦＮ−αは現在は完全（（櫂視されている。これ（工最初は唯一１固のもの のみから成ると考えられたか、後になって精製が進むにつれ、ＨｕＩＦＮ−αは 少くとも６−７糧の典ったインターフェロンタンパク質種かう収る二とがわかり 、最後・では少くとも１６棟が存在する二とか示された〔ベルブら（１９８０年 ）、（１９８２年ａ、ｂ）、］。こｎらの慣（・工、従来の投前（例えばグ゛ル 濾過悸）と、家兎からの瓦体を使用する尻体アフイニテイクロマトグラフイとの 組合ゼによって同時に楕裂された。次に、精製された孤を、１倶次兇疫凛として 使用することにより、単一のインターフェロン糧（列えば２０．００口種）を免 疫原として使用してインターフェロンタンパク質に対する単−特異注家兎抗体が 製造された。かくして、単−特異性、ポリクローナルの家兎抗体ビ抗体アフイニ テイ力ラムに使用することにより、Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−αの全ての種を同時（・て 梢礪する二とが可能となった。この方法Ｋｉいて旧の人（・エハイプリ団−マか ら自生された免疫グロブリンを使用、た〔例えばゼソヒエルら（１９８０年）コ 。Ｌかにこの方法（Ｃは、インターフェロンタンパク質の一部しか）・イブリド ーマ力ラム（Ｃ倍合しないとｂ５重大な欠点があった〔ベルブら（１９８２年、 ｂ）参照］。通有インターフェロン活性の手分が洗液中に見いだされ、残りの半 分が力２ムに結合した（そして％異的に直離可能であった）。

従って一般的に云って、ＨｕＩＦＮ−αは、少くともマウスバイブＩＪ　Ｆ−マ 系による測定では、共通抗原決定基を含有しないのではないρ１との印象であっ た。

発明の要約 本発明Ｙユニの問題を屏決せんとするものである。以下の記載により、今や実際 に、ＨｕＩＦＮ−αの全部の種（１２までの具なる種）またはその一部に結合す る能力のあるハイグリＦｍマ椴生抗体（兄侵グロブリン）を生理することが可能 である二と娶示すこととする。

不発明、よ従来の元誠と比較して新税であり鴬くべきものである。不発明の意味 する所は次の通りである。

ＨｕＩＦＮ−α、軸菌から導かれるすべてのＨｕＩＦＮ−α種（遺云子工字技術 によって得られる）に属するすべてのタンパク質か二の免疫グロブリン（これは 抗体アフイニテ・イクロマトグラフィによって示される通りＨｕＩＦＮ−αのす べての種と結合することを特徴としている）と結合１−るので、これＬτよって ＨｕＩＦＩむαのすべての種−自、憾のものにせよ細笛臼Ｌ・τ（）０ラスミド ）導かれたものにせよ−を構製する１こめの万能市な方法が初めて発明され１こ 二とＫなる。また、上：で定義した特典ヰを写するハイプリに一マ瓦体（票た： ；その本質的な部分）ぞ主する。ｆＱ　＠　（マウス系以外の）ハイプリドーマ 系を使用することも本発明の範囲不足ある。例えば将来ラット系を使用すること も予見される。

前記免疫グロブリンは現在周知の遺伝子工学技術によつ°ても、例えば前記免疫 グロブリンを産生ずるハイグリドーマ細胞を使用して、先ず適正なｍ７ＲＮＡ　 にの特異性は非常に良（知られている標準的方法例えばメンドインエンずイモロ ジ−（免疫学における方法）、ｇ６８＠（１９８１年）、「組替え技術」に示さ れているような方法によつ−で研究、測定、単離することができる〕を単離する ことによっても製造することができるであろ５゜４＃ざＣたｚ−ＲＮＡ−に、卵 母細姻においてその荷典註の正しさを（翻訳された生Ｔｙ、吻の手固体結合測定 法によって一本明ａ筈の「材料および方法」の項参照）試験することができるが 、これを次に逆ＲＮＡ転写酵素によってｃ−ＤＮＡに形質転換する二とができ、 前ｉＱ　ｃ−ＤＮＡを適切なシラスミドに組込む二とによってゲラスミ１ンライ ブラリーを作った後、正しいｎｉ　−ＲＮＡからプローブを作製し借ることを考 慮（Ｃ入れて、正しくクローンされたものをスクリーニング（でよって見いたす （前記したように同定、単離、記載する）ことができる〔ワイスマン（１９８２ 年）参照〕。所望の％異性を示す兜役グロブリンの一部のみ、を生産する二とも 本発明の範胡１′こ属する。

前記児フ量グロゾリンｌ工、前記の荷典注を有するモノクローナルの尻不分子（ またはその一部）の存在が必須である、列えばＥ、ｂｉｓＡ−（酵素免疫改定） またはＲＩＡ（放射線免疫検定）法を使用する種々の免疫学的検定法において極 めて有用であろう。かくして、前記免疫グロブｌ）ンは通常の技法〔例えばメン ドインエンずイモｏジー、第７０巻、パートＡ、（１９８１］年）参照〕による インターフェロンタンパク質（またはその一部）の検出用の免疫検定に極めて有 用であり得る。

またインターフェロン受容体（あらかじめインターフェロンタンパク質またはそ の一部を受答したもの）等も上記抗体によってｇ　Ｒし得るので、こてしらの存 在を（定量的またｉ；足囲的に）検出することも可能であろう。

発明を実施するだめの最良の形態 顕著な結合性を示す前記バイブＩＪ　Ｉｓ−マ仇体を得るのに成功する理由の− っ・：工、ＳＤＳで安定化した高度に悄製したインターフェロンタンパク質から 成る抗原稠襄物を製造する方法にあると考えられる〔ベルブら、（１９８０年） 、（１９８２年ａ）参照〕。対象のタンパク質（例えばインターフェロン種）が ＳＤＳの存在において（タンパク質は免疫能細胞と対決させる前にＳＤＳによっ て予備処理することもできる）　ＳＤＳの変性症のため：ｒＬがなければ隠され ている決定因子が完全に曝露されることにより、その抗原決定基の丁べてを４拝 しているという点で、ＳＤＳの存在はタンパク質を免疫能細、抱に提供する場合 の重要な因子であると考えられる。一般に、免疫化を行う前に（または同時Ｋ） タンパク質をＳＤＳで処理することも本発明の範囲に属し、二の操作の目的は、 さもなければ認識されない、隠された抗原決定基を４得することである。免疫化 に際してこの「ＳＤＳ法」を使用することによって、最も多く存在する決定基（ すなわち、類嫌の、しかじ別個のタンパク質から成るタンパク貞混合物に属する すべてのタンパク質内で最も普通であると判明したもの）に対する・・イブＩＪ 　１．”−マ抗体は、適切な免疫原（タンパク質、例えば純粋なＨｕＩＦＮ−α の種から成る）の調製に際してこのような変成法を使用する場合に、より頻繁に 見いだされるであろうということを期愕し得る。

二の一般的原理はマウス系以外の池のノ・イブリドーマ系にもあてはまる。

上記の発見は、ＨｕＸＦＮ−αの遺伝子情報を指示する遺伝子に対して遺伝子レ ベルにおいて存在する二とが判明している周知の相同関係ときわめてよく相、関 する〔ワイスマンら（１９８２年）参照〕。いくつかの領域は一定であることが 知られているので〔ワイスマンら（１９８２年）参照〕、ＨｕＩＦＮ−αのすべ ての種を認識する能力のみにより定義されている二のハイプリドーマは恐らく、 かかる領ばに位置する、Ｈｕ、！　ＦＮｉ−αに属するすべてのインターフェロ ンの種に共通な特典的央足基を認識するものと考えられる。また罰記従坏もまた 、この抗体の別記特典−に含まれるものと同じ決定基？吾するＭｕＩＦＮ−αを 認識し得るであろうと考えらねる。現時点では、この決定基がどの程度に広くイ ンターフェロン系に分布しているか（・工知られていない（研究進行中）。

免疫化、肺臓リンパ球混合物の単離、融合および雑種形成ハイブリッドの培養お よび選択、所望の抗体を産生ずるハイゾリノｒのサブクローニング、およびこれ らのハイブリッドまたに対応する抗体の単離については多数の既発状の記述、例 えばコーレルら（１９７５年）、（１９７６年）、ロプボルグ（１９８２年）、 メン団イン二ノずイモロシー、第７０を（１９８０年）、ゼノヒエルら（１９８ ０平）、セルラーイムノロジー（細胞免疫学）、爾１−３＠（１９７８年）、ケ ンネット、マクカーンおよびベクトル（１９８０年）を参照さイｔたい。

ハイプリドーマ製造に使用する形質細胞、腫細胞系の大部分および抗体を産生ず る若干のバイブＩＪ　Ｆ−マは公的細胞配布センター例えばデノークインスチチ ュート、細、＠配布センター、郵声私誉箱１８０９（サンディエゴ、カリホルニ ア９２１１２、米国）または池の同様な所から入手することができる。不発明′ Ｌ使用した本細胞系、エニュージャージーのデヒューマンジエネチノクミニータ ントセルレボジトリ−（人選伝子芙然夏典ｄ砲保管所）から入手した（後出Ｉ１ １の項ト矩二の輔＠は一般にグルコース濃度の高いＣ４−５９，７１）ダルベツ コの改変イーグル層地（Ｄｋ’：Ｍ　）てたはＲＰＭＩ　１６４０中で培養され る。ＲＰＭＩ　１６４０にグルコースを４−５ｇ／１１まで添卯すると高密度に おけるＦｉｙ、長が促進される。細胞は静置懸１濁培養において濃度を１０５− １０’細＠　／　ｍｌに保つ。融合に使用する培養最適条件は３−８ｘ１０５細 胞／　ｍｌで高い生存能力（すなわち９０％以上）である。実験的のさらに詳細 については例えばロブボルグ（１９８２年）およびケンネットら（１９８０年） を参照されたい。

マイコプラズマの存在によって雑信形成り成功が唾めて肋げられ易い二とが既に 他の研究者：（より示されているので、マイコプラズマに対する試験をにに実施 した。すべ℃の骨髄腫紬岨・ｌ求心ず使用の１−３日前に検査した。横置結末が 完全に陰性であると判明したときのみその細胞をｒａ会用として受入れた。

マイコプラズマの試験を雑種杉成実験足きまりとじて組入れたことにより融合実 験Ｊ（おいて得られろ１場注ハイブリドーマの数は大福に改善され、これによっ ていくつかの研元グループによって得られた同様の覗察が確められた〔ロプボル グ（１９８２年）参照〕。

実験の部 インターフェロン滴定 ガえばＶＦＲＯ細＠およびＶＳｖを対抗ウィルスとして使用して先に運べｔよう ’ＩＬ　して実施したＣ　ｉｉＪえばベルレグら（１９８０年）参照〕。単位は 丁べて国県単立で辰ゎした（６９／１９Ｂ、きｌ？、ｃ　、、英国）。非常に少 量のインターフェロンの検出が必要な場合（（は、ＢＭＤＫ細、泡およびびＶＳ ｖを含有して成るいわゆるボビン／ステム（ウシの系）が極めて信唄注か高く極 めて感度が良い二とが判明したのでこれを使用した。０．１単位という低いイン ターフェロン活性が容易に咲出できた。従ってこの系をハイシリドーマ上澄液の 半中和ニ広く使用した。

免疫原の調製 粗ヒト白血球インターフェロンをゲルａξ過とそれに続いて抗体アフイニテイク ロマトグラフイによって精製して比活性度１０８単位／タンパク質ｊ号を有する ほとんど純粋なインターフェロンタンパク質を得た。回収率−・工約７５係であ った。代表幻な英１挾からの全流出液は５Ｘ１０６単位を含有していたが、これ を１０［１，０００単位づつを含有するアリコート（ＳＤＳ　０．１％を含む溶 離緩衝９０．１ｍｌ中の）に分け、使用する迄−２０℃疋保った（少くとも５ケ 月間安定）〔ベルブら（１９８０年）＃烈〕。ときにはよりｎ製度の低い白血球 インターフェロン製品をも使用した（　ＳＤＳ含有）。

免疫化 バルブ（Ｂａ１ｂ　）　／　Ｃマウス−優先的疋雌マウス−を次のようにして免 疫化した。最初の庄訂（１０口、０００単位）はフロインｒアジュバント（Ｆ。

Ａ−、）と混合して腹腔内に（Ｉ−Ｐ、）　ｍ与した。その後の５〜８回の注射 は一週間毎に行い、３０，０００単位のみでＦ、Ａ、は加えなかった。５−８回 つ注射後マウスは２００〜２０００００〜２０００中和単囲のＨｕＩＦＮ−αに 対する抗体を発現した〔Ｉ従来の」甲和試験乙よって検出（後出中ｆＩ］試峡参 黒）］〔ペベルブ１９８２年）参照〕。この推定法は、これよりはるかに高感度 であることが判明した半面不中和法（後記参照）に比して相当低い櫃を与えるこ とが多かった。融合の２〜５日前マウスには促進剤として全部でｉ　ｏ　ｏ、ｏ 　ｏ　ｏ単位を、半分は１．Ｐ、注射として他の半分は皮下（Ｓ、Ｃ，）注射と してＦ、Ａ、なしで投与した。

ＨｕＩＦＮ−αに河する抗体の〒和 インクー７エロン中祁の間車な（「従来の」）方法は、所定量のインターフェロ ン単位を含むインターフェロンタンパク質と対象とする抗体試料を数段：４つ希 釈度で等容積ずつ混合することである〔例えばベルブ（１９８２年）参照〕。し かしこの方法では、インターフェロン分子上の生物学的決定基に近い抗原決足基 と反応する抗体のみが認識される。従ってベルブ（１９８２年）が指摘した如＜ 、「従来の」中和法のみを使用すると大量の抗体が同定されずに終る可能性が犬 ぎい。

この難点？：見服するため、例えばｐＨＩＦＮ−αに対するヒツジ抗体〔部分的 疋樗襄したＨｕＬｔｒＮ−αからエタノール沈殿法により製造、スチュワード（ １９８０手）＃照〕がＨｕＩＦＮ−αのすべての種瓦結合することを考蕉に入れ てい（つかのＥＬＩＳＡ試験を使用した。すなわち免疫板〔ヌンク（ＮＵＮＣ） 　、デンマーク〕を先ずヒツジ抗インターフェロン血清からのＩｇ（）ｉｆで、 次で純インターフェロンタンパク質でコートし、適当なインキュベーション後ハ イブリドーマからの試料を加え最後に家兎抗マウスＩｇＧ−ガラクトソダーゼ複 合体を添η口した（例えばメンドオブエンヂイモロジー、第７０巻、Ａ部、（１ ９８０年）に詳記されている９口くにして）。

しかしこの方法は、ＥＬＩＳＡＩＩ性の上げ液が半固体中和試験法（下記参凪） では４件とならなかったという意味で、過大な偽の陽在昭釆を与えることが判明 した。

半固体中和試験 この方法Ｇ工ＥＬＩＳＡＩ場性の試料を試験するために開発された。この試験は 、ＨｕＩＦＮ−αに河する「可能な」抗体分子がインターフェロン分子に結合す るという極めて間車な事実を利用している。従って、もし正確な、しかし極めて 少量の、好ましくは全部で０．１単位という少量のインターフェロンを添加する 前に「可能な」抗体を先ず固定化するならば（これはこの「可能な」抗体に対す る別の抗体によって行う二とができる）（インターフェロンの同定の項参照）、 インターフェロン力１面（含有量）田ｆ）越小１゛周も容易；で「ボビン」／ス テムを使用して恢出する二とかで・きる。・二のシステムｉ１　ａＬ　Ｉ　５　 ｆ￥／ステムよりも優れている二とが証明された。次のような方法を使用した。

１　家兎抗マウス免疫グロブリン（ダコーパソト社、デンマーク）をアゾ化ナト リウム（Ｓ、Ａ、）　０．０５　％を含むｒｓｓ中３００　ｐｇ／ｍｌ使用して ３７°Ｃで１時１１１１コートする。次に４℃に震え、少くとも２４時間（また は数週間）保つ。

２、トウイーン（Ｔｗｅｅｎ　）　８０（Ｄ、［］　５％）を含む、０．０５％ Ｓ、Ａ、含有ＰＢＳ−いわゆる洗浄緩衝液−で６回洗浄する。

６　免疫板の未結合部位をＰＢＳ中２％卵アルブミン（シグマ社）で、室温で２ 時間成和する。

４　洗０緩衝欣で６回洗浄する。

５　試験すべきノ・イブリビーマからの上ａｔ　ｆｊ、１０口μｌをウェル（凹 み）にカロえ、里謡で２４時間インキコーベートする（　０．０５％Ｓ、Ａ、含 有）。

６　洗浄緩衝液で２回洗甲する。

７　洗伊緩衝夜（Ｓ、Ａ、なし）で２回洗浄する。

８　全部で肌１単位を含有するインターフェロンｍ液（例えば天然インターフェ ロン）１０口μｌを室部で２時間力口える（インターフェロン訓電の項参黒）。

９　この混合物（１０１］μｌりを、マイクロウェル内で、インターフェロン【 同定に使用するのと同様Ｄマイクロトレー（ヌンク、デンマーク）を使用してあ ら７１）しめ全面改長まで培養しておいたＭＤＢＫ細姻に移し、６７°Ｃで２０ 時間インキュベートする（５％Ｃ０２）。

１０　インターフェロンを加えない７寸照用老女７ｄ’ｅにおいて２４時間後明 瞭なＣＰＥを生ずるような所定濃度のＶＳＶをカロえる。

１１８　あるウェルにおいて細胞が破痰されていれば原ハイブリドーマクローン （培養）中′ＬはＨｕＩＦＮ−αを結合（除去）し得る抗体が含まれているとい うことを４慝して、マイクロトレーを常法により読取る（インターフェロン訓電 の項、および引用又臥参煕）。この給米は陽性クローンを辰わす。

クローニングおよびｉ″ａ注ハイシリドーマの追加生長前３己のようにして１勇 足した１褐注クローンＱ工、ロブボルグ（１９８２年）が詳細屹述べているよう な、培養液と供＠細旭％（バルブ／Ｃマウスρ・らの僕摸マクロファージ）を使 用する「制眠布沢法」によっていくつかのサブクローンに分けた。サブクローン 化したノ・イブリドーマはすべて、定められた通り結合活性を検食し、依然とし て１湯荘であれば、この細胞をさらに生長させた後あらかじめ免疫刺戟剤を投与 した（例えばプリスタン、４−６日前）バルブＣマウスに注射（工、Ｐ、）した 。５−１５日後（注射したクローン比細胞の量による）正しい荷具注乞督する新 しいハイプリドーマ細眠が、所１の抗不を井筒な高、農産に百有するｊ水と共に 収遺される（存在する全免疫グロブリンのｖ′Ｊ９５％以上が所望の特異法を有 する）。遠心分離の後・・イブリドーマ細根を１水から分離し、今夏はこれを新 しいマウス（バルブ／Ｃマウス）に注射するの′Ｌ使用でき、これによってさら に復水とハイブリドーマとが得られる。−匹のマウスから収獲したハイブリドー マを使用して、第一回とほぼ同数のハイプリドーマ細痙をそれぞれ与える２０匹 の新しいマウスが鍔られることを考、、祇に入れて、これを続ける。ハイシリド ーマ細胞リエまたログボルグ（１９８２年）が既に詳述しているような適切な柴 件を使用する回・伝−フラスコ内で、インビトロで生長させることかでき、原理 約定マウス系７ａ：′使用する（生庫内）前述のものと同じ細強および８ｆＬ坏 が得られる。

仇インターフェロン免疫グロブリンの単離虚水田に産生される仇不は、俊水甲に 存在するタンパク貞カ日水分解酵素によるタンパク貨ｎロ水号屏的、俄戎を・幌 めて受け易い二とがよく知られているので、収穫した復水Ｉｌｌ矢先＋４°ＯＫ 冷却して遠心分離（）・イブリビーマ細胞およびその他の挫滅岨蛾片除去のため ）を行った後硫酸アンモニウムで処理し免疫グロブリンを沈殿した。この単離（ 工復水の収穫直後に行った。硫酸アンモニウム沈殿免疫グロブリンは一２０°Ｃ に保持した。滴定前、少量のアリコートを例えば５　ｍｌの培地に浴解しＰＢＳ 　１　ｉ　ｖｃより透析した後半固不中ｒｏ試験法で倹食し１こ。免疫グロブリ ンに疋禾法列えばケゞルＪシ過、イオン又喚りロマトグラフィ号）Ｃよってざら に渭裂シた。

細　、泡 不発明に使用したマウス骨髄該Ｍ側系の特性（１次の通りである。マウス骨髄僚 、系統Ｐ　３　Ｘ　６３　ＮＳ　ｉ、ＨＰＲＴ欠損、刀ソバ−を雄牛、非免疫グ ロブリン分躬注。培地（・ニゲルコース４，５００・ｌｌ　／　ｌ含有。

前記の系統はヒューマンジエイ・テイソクミュータントセルレボジトリ−（コー ク０ウツド　アノに　デービスストリート、カムデノ、ニューシャーシー、０８ １０６、米国）から得た。カタログ番号ｃ　ｊｖｉ　３５７３゜（ＮＩＨ元刊元 号番号８１０口１１．１９８１年１０月改訂）。

培地 骨髄５憬ｉ強（工多くの旧の研死者が記載していると同様の〔ロブ〆ルグ（１９ ８２手）参黒〕、例えばロブボルグ（１９８２手）の述べたＲＰＭＩ　１６４０ ．１０％仔牛皿渭（新生児）を戻用し、ピルピノ酸ナトＩＪウム等と共にペニシ リン、スト、レノトマインン、ケゞンタマイ／ンを含有する培地中で培養した。

ハイブリに一マ細晧の貯蔵 所望の特異性のハイブリド−マを含む復水を数匹のマウスから遠心分離ニよって 収穫しく「クローニングおよび細胞の生長」の項参照Ｌ　ＲＰＭＩ　１６４０で １回洗０し、融合する。〔硬水の洩りＶ；別に記すように処理する（「免役グロ ブリンの単離」の項参照）〕。細もｆ１４０Ｘ１０６１面を新呻ｔイーグル士で （仔千血清２０係含Ｗ）５ｍｌＶＣ再憾蜀し、これに咎量の、Ｐ、ＰＭｌｌ　６ ４０　ｌ：ＰＤＭｔＥＣ１９−２０係の各ｒｉ、（ゾメテルスルホキシド、メル ク社）を局部加黙（ハイブリドーマ細胞に有否のおそれがある）を避けるため懸 、補液をかきまぜなから制別（１０７４／分）する。混合後、・・イブリドーマ 細胞を含む前記懸濁液をｉ　ｍｔアンプルに分注し、ミールして４”Ｃ・足２４ 時間床つ。その後窒素容器！Ｌ移し、（いわゆる「リンデ容器」の製作業者の使 用説明誉に従って）１°Ｃ／分の握り合で冷即する。アンプル内の剣眠は最後に 液坏窒素中で貯蔵する。ロブボルグ（１９８２年）参照。

細胞の解凍 アンプル１面を３７°Ｃの温水浴足浸して解凍する。

遠心分離後細側を新しい培地に可避、濁し、計数しｍ７百り１０’−１０５１面 のｒ４１飽を含むよ５に調節する。培地は２４時間後、また細胞が付着してしま った場合はできるだけ早く、交換する。それ以後の生長はロブボルグ（，１９８ ２年）に詳、＠　ｆｃ紀載されている。別の方法として、解凍した細・＠を（ア ンプルから）直接：Ｃバルブ／Ｃマウスに注射Ｃ１，Ｐ、）する、二と（Ｃより 、新しい創１＠および腹水（所望の反体を含有）を６−７日で（注射した細暇の 量による）収穫する二とかで・きる。

マイコツ０ラズマ試験 ヒトの一久手摸細韻（婦人科部から人手）ケ小哉カバーグラス上り接厘すると、 可看麦カバーグラスは頁ち：（使用で・きる（細部が多過ぎると酸度が低下する お−Ｃれがあるので、紬飽イエ不目互・足接して、ｊ、ならない）。

骨雌纏細泄かも成る試料をバスノールピペノトを使用してカバーグラスの表面上 ［／Ｊｌ］え（試料約１０−１５層）、試料を含むカバーグラスを注意深くプラ スチックフィルムに包んで蒸発を防ぐ。もし骨随僅細胞から成る原状料がマイコ プラズマに感染していれば、二の同じマイコプラズマは羊膜細＠をも感染させる であろう。通常、羊膜畑砲１工析廃（（採戚すれはマイコプラズマに感染してい ない（後述の対照培養参照）。翌日培養吻を「ヘキスト染色剤」により製造業者 （ヘキスト社、西ドイツ）の示す染色法（染料１−２グレーンをｐＨ５，５の暖 衝孜５　ｍｌ　Ｋ俗解）に従って２時間染色する。

このｐＨ（５，５）は生理学釣範囲＜　７．２　）より低いので実際の染色には 僅がユニを闇のみを使用すべきである。

染料と細胞とを２時間インキュベートした後、細晒をメタノールで固定し乾燥す る。もし羊ａ細眠が（原状＃＋に由来する）マイコプラズマに感染していれば、 マイコプラズマ感染のしるしとしてけい光頴倣鏡内でけい光を発する小粒子が明 随に認められる。もしけい光を発する粒子が見いだされなければ感染（・工生じ ていなかったのである。対ぷ培養（すなわち手僕綱砲のみ）も実施する（これ（ 工陰注でな・すればならない）。骨髄、菫細胞中、Ｃマイコプラズマが含まれる ことが判例した場合は廃棄して、新鮮な、マイコプラズマ不含の骨髄筺細＠を細 胞今凍草（ｇ体窒素容器）ρ・ら唄出し二。

列　１ 一匹の雌バルブ／Ｃマウスを免疫化の項に記したようにして免疫した。Ｎｕ工Ｆ Ｎ−α（ＳＤＳで安定化したもの）１００．０００年位（Ｆ、Ａ、を含む）を使 用して免疫化（「免疫原の調製」の項をも参照のこと）した後、常法により週毎 に３０−４０，０００単位を注射（ｒ、ｐ、）し、最後に＃１合の６日前、先に 記したよ５に促進剤ｉ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ単位をマウスに投与する。免疫化の 期間中足「従来の」中和力１曲（中和の項参照）を測定した。

第　１　表 免疫マウスで一逓ｊした中和カニ曲 週　干独単立／血／′Ｗｍ１ １−６　０ ３−５　５０−８０ ７　１５００ 免疫した動物がら得た肺臓祷岨とＮＳ　１細Ｉ＠（細抱っ項参照）とによって融 合を行った後、顕敵税演査により６２個の生存クローンの存在が確認された〔コ スタ−トレイ（Ｃｏ５ｔａｒ　Ｔｒａｙ　）　（ヌンク、デンマーク）甲、ロゾ ボルグ（１９８２年）参９（〕。上清全部（６２）を半固体中和法（該当項参？ ！り）によって・演ｌしたところ二つのクローンのみが４丘（部分的）であった 。二の二つのクローンをさら：・Ｃ笠長２よびブブクローンし、この操作子：（ （「クローニングおよび１携（三ハイブリドーマの退刀口生長」の項参照）一つ の褐旺クローン、工りローニング操て乍甲の失敗によって失い、旧り一つ（Ｌ〇 −２２）を先に運べたようにしてバルブ／Ｃマウス中で１埴し、復水５．５ｍｌ と大量のハイブリドーマ細胞とを得た（全部で約１００口個と推定される一次の ブプクローン化ハイブリドーマ細泡をｅＥ’ｆｆ　（！、Ｐ、）　してから４週 、間段）。単席後金慟した＃（暇をさらに、既述のようにし”Ｃ１０匹の新しい バルジ／Ｃマウスに注射し、７日後に復水６５ｍｔと多数のハイブリドーマ細胞 とを収穫した。これらのうち若干）工凍結して貯蔵用老養とし、残りは新しいマ ウスに後端した。＃ｉ企を含まない復水は丁べて沈殿し、１尻’ＩＱ　ｆ　ｐ訃 α兄役グログリンの町Ｅの項ｌこ記載のようにして単心したつ　（この段層で数 グラムが単離された）。

以上の実験の際に手固坏中ｆ口・演定乞同時に実施した。

しかし、−次ハイグリドーマ培養からの上ａ　ｅ　ｉ工終点に達する二となく１ ００倍以上にも希釈できたが、最初の二つの１場性クローンは天然ヒト白血球イ ンターフェロン（ビルス誘導軟俟からの）を部分的足しが中和しなかった。ＬＯ −２２を顔水柿として生長させた場合は、同様の４向がさらにはるかに高い水準 で認められた。すなわち１０７以上の希釈度においてなお部分的：Ｐ和／結合が 認められた。（半面不中和法参照）。

これらの実験の初期の段：４において、半固体結合損１」定法ておいて得られた 上述の結合結末からＬＯ−２２はＨｕＩ　ＦＮ−αの１の一部のみを認繊できる との印象が得られ、これし他の針元グループからの始末〔ゼノヒエルら（１９８ ０年）、アランら（１９８０年）、ベルブ（１９８２年）参照〕と一致し、一般 に科学的に一致した見解であると認められた。

ＬＯ−２２ハイブリド一マ抗体の結合能力に関し、さらに詳細で正確な知見を得 るため、加えた白Ｉｆ１１琢インターフェロンの半分またはそれ以下しか結合し ないと予想される（不明細誉、前の段洛でみられる部分的中和参照）ことを考、 イに入れて抗体アフイニテイクロマトグラフイを実施することに決定した。

原マウス（予め約１００口個のみの細歪を１．ｐ、投与したもの）ρ・らの１水 ３　ｍｉからの免役グロブリンを単離しく「抗工ＦＮ−α免疫グロブリンの単離 」の項参照）、既述のようにしてＣＮＢｒ　−ｇ　ａ化セファロース〔ベルブ（ １９７７年）、ベルブら（１９８０年）参照〕に結合した。平衡化したカラムを 徂天然ヒト白血球インターフェロン９Ｑｍｌによって負荷し、十分洗伊後カラム をＰＨを下げて溶離した。次のような属くべき、予期しなかった結果が得られた （第２表参照）゛原インターフェロン調＃液（投入量）の９６％のインターフェ ロンが除かれた。半固体中和試験で侍られた結果（第１辰参蝋）を酉とすればほ とんど反対り結末が予想されたであろう（−ｆなゎちＬＯ−２２カラムによって 一部のみ（列えは３０％）が蒲洟ざｎると予期された）。

第　２　表 ＬＯ−２２カラムによる抗体アフィニティクロマト役人４？　９０　４．１ｘ１ ６６４．８ｘ１０６１００洗　＋　１００　２Ｘ１０５　９．５ｘｌＯ’　４’ ｆｆＪ　出ａ　１６２．８ｘｉＯ’　６．５ｘ１０６７０ＬＯ−２２カラムの結 合性能をさらに解析するため、洗ｑ、（ヒトインターフェロン２．ＯＸ　１０５ 単位から成る。第２表参照）をＤ　４　ｍｌ　）乞濃縮〔スクロースおよび透析 ｇによる。ベルブら（１９８０年）参照〕しだ後ＬＯ−２２カラムに再負荷した 。Ｍ２回っ洗液をヒト系およびクシ系の両系において滴定し次の結果を得た：ウ シの場合は１００単位以下しか検出されなかったのに、ヒトの場合は約５０，０ ００華泣が検出された。さらに第２回の洗液（約５０．Ｏロ０ヒト単立から成る ）は、従来の中和試躾法（中和の項参照）によって抗ＨｕＩＦＮ−βを完全に甲 Ｔ口することができた。第２辰からの精製塔出液（２，８Ｘ　１０６単位（ヒト ）含有）は同様の中和試験において前記汎ＨｕＩＦＮ−βを全く中和できなかっ た。すなわち第二の洗液に見られるｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ単位（ヒト）は別の慣、 すなわちＨｕＩＦＮ−βから成っている。以上ｆ）＠釆は例えばビルセフら（１ ９７７手）およびベルブ（１９８２年）と完全；（一致している。

ＬＯ−２２カラムからの流出数（剣２辰）は分析用薄ｆｉ　ＳＤＳ　−ＰＭ）Ｅ （ポリアクリルアミドデル電気泳動）〔長さ２５ｃｍ、１２％−２４％の勾配ケ ゞル使用、ベルブら（１９８０年）、（１９８２年ａ）、（１９８２年ｂ）参照 〕によって分析し、既′Ｌ発辰されている報又と比較してＨｕＩＦＮ−α様の同 一のパターンが認められた。すなわちＨｕＩＦＮ−αのすべての頂が見られた〔 二の実験１（使用した荷足のパンチには「ウシ」の、自（・工存在しなかった。

ベルブら（１９８２年Ｌ　（１９８２年ｂ）参照〕。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥはベル ブら（１９８０年）、（１９８２年ａ）、（１９８２年Ｏ）の既述のアミにより 、染色して切載り、？両足して＠雛して次のよ５な結末′？：得た（第３辰）： 第　３　辰 ＳＤＳ　−ＰＡＧＥＫヨツ”’Ｕ４ｆ、ニーＬ　Ｏ−２２１＠出液の生物学的プ ロフィル インターフェロン単位　インターフェロン卓立切片番号（ＷＩ　ＳＨａ＠！　） 　（ＢＤＶＫ　ａ＠　）ヒト単位　ウシ単位 ２　１５．０００　１４０，００口 ３　２０．０口０　４５，０１０ ４　５、口００　１５．口Ｏ０ ５５，０００１５，００口 ６　１５．０００　４５，０００ ７　３．０００　１５，０００ ８　１．３００　７．０００ ９　５００　４．０００ １０　１５．０００　１３，０００ １１　３００　５．０００ １２　３００　１３．０００ １３　７．０００　１５．０００ １２の種全部が１６．０００−２５，０００の通常の分子量範囲内に位置するこ とが認められたが、これはＨ’ａＩＦＮ−α調製品甲：（存在する慣の数および 位置に）関する従来の報又〔ベルブら（１９８２年ａ）、（１９８２年ｂ））と 完全に一致する。インターフェロン活性を有する画すが分子量３０，０ＤＯＲ近 にも見いたされた（フラクション１４．１５および１６；それぞれ６００ヒト単 泣／１０ロロウン蛍位、１４０口／１８０口および６０／１８０）ので、ＬＯ− ２２カラムは恐らく、これまで検出されていない、より高分子量の種のＩ’（ｕ Ｉ昇丁−αをも認識する能力を有している。これらの両分については現在ざらに 詳７刑に研゛死中である。

以上の（仇不アフイニテイクロマトグラフイからの）結末は、半固体中和１去・ 足よって得られた（第１表）、Ｅｔ＞工ＦＮ−αの種がＬＯ−２２免疫グロブリ ンに一部のみ結合することを示す結末と多少矛盾している。現在の所、この矛盾 の原因は免疫板のコーティングに使用した家兎抗マウス免疫グロブリンの品質に 基づくものと考えられる（「半固体中和法」の項参照）。

ＬＯ−２２ハイプリドーマ細暇によって虚生きれた免疫グロブリンは、復水（お よび＠養されたＬＯ−２２細眠からの上溌液）の数イ固の何分２家兎抗マウス免 疫グロブリン〔ダコーパノト（デンマーク）、ベーリングウエルケ（西ドイツ） 〕または山山羊抗マウヌＩｇＧＦ（ａｂ）２（カッ（ル）または山羊抗１ｇＭ（ 重鎖）（カッベル）に対して検萱するオフテルロ二−試験法により、ＩｇＧ類瓦 檎すると特注づけられた。いくつρ・の対照試験も笑弛した（ＮＳ１細１市のみ では、予期のＲＯく、例えばＩｇＧに対して１場註反応（・工生じなかった）。

特に・・イブリビーマ抗体ＬＯ−２２と山羊抗マウス■ρＦ（ａｂ）ｚ抗血清（ カッベル）との間に多量の沈殿が認められた。

例１に対する所見 以上に詳記した実験により次の二とが証明された。

Ｉ　ＬＯ−２２ハイブリドーマ抗木７／カラム′工、Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−α系Ｊ′ ｒｃ属する特注￥督するＨｕＩＦＮ−αのすべての種を認識（結合）する。〔ベ ルブも（１９８０年）、（１９８２年ａ）、（１９８２手ｂ）参照〕。

２　粗製のヒト白！Ｉｉ１球インターフェロン調製物中に少量存在する二とが元 られていると１・額維芽細砲インターフェロンＴ−１・１７　ＦＮ−β〔全イン ターフェロン活性の約１−２％がＭｕ　Ｉ　ＰＮ−β棟：ｃ属する二とが示され ている。

ベルブら（１９７５年）参照〕はＬＯ−２２ハイプリド一マ抗体／カラムによっ て認識されない。

産業上の利用可能性 抗原田にヒト白面球インターフェロン系（ＨｕＩＦＮ−α）ニ属スるタンパク質 （またはその一部）を認識することのできるモノクローナルの乳体／／・イブリ ドーマ（および、誘導されたバイブリソ１細胞を含む対応するハイシリドーマ細 胞）は、Ｈｕ、ＩＦＮ−α系に＠する上述のタンパク質のすべての４１および特 １生づけのための「万龍円」抗体とし″Ｃ使用する二とかできる。

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図面の簡単な説明 昭和６０年３月１３日 特許庁　長　官　殿 １、事件の表示　Ｐ　ＯＴ　／　Ｕ　Ｓ　８４　／　００１６１キンエンカンケ イ　ベツコ　〃カン ２、　Ｒ１ａＯ名称　近縁関係にあるが別個のタンパク質問に３　補正をする者 　事件との関係　特許出願人ワドリ、インステイテユーテズ、アヴ、モレキュ久 メダスン４　代　理　人　東京都港区赤坂１丁目１番１４号・溜池東急ピル〔電 話　（５８４）０７８２） ６　補正により増加する発明の数 国際調査報告 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒト白血球インターフェロン系−ＨｕＩＦＮ−α−に属する別個ではあ るが近録関ＩＪ４．にあるタンパク質またはその一部の群中に存在する共通抗原 決定基を結合または認識し得る、マウスハイブリドーマ／モノクローナル抗体、 または適切な結合性能を示すその一部。 （２）　前項（１）に記載の、ラットハイブリドーマ抗体／モノクローナル汎体 。 １３１　Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−α系に属し共通抗原決定基ソ何するタンパク質または その一部を０．１多−５％のＳＤＳ　（ドブフル硫酸ナトリウム）で処理するこ とから成る、免疫化に際し適当な抗原提供を行うための免ブ交原調製品の製造方 法。 （Ｊａ）　マウスを前項（３）に記載の変性されたＨｕＩＦＮ−αの種またはそ の一部によって免疫し、 ｂ）免疫されたマウスからリンパ球を単離し、ｃ）　Ｂ−リンパ球とマウス−Ｂ −骨Ｕ朦細宿との融合を行い、 ｄ）生成した雑徨細砲と非雑種細梱との混合物を選ＪＩＪ媒体に移して雑種と非 ８４棟との選別を行って４種＃］泡を得、 ｅ）″ｆ！−固坏結合演定試験系にお′ハて１褐旺（部分り）結末を与えるハイ ゾリノ団についてクローニングおよびサブクローニングを行い、 ｆ）少数の雑４細胞をマウスに腹・腔内注射することによってもクローニングを 行いこれによって前記（ｅｌと同じ雑種＠胞を得る ことによる、前項（１）および（２）に記載の抗体を生ずるハイブリドーマ／雑 種細胞の製造方、去。 ＋５１　前項１．１１−　ｆ４Ｊのいずｎかに記載の、ラットハイブリドーマ／ 維橿剣胞の製造方法。 （６）前項（１）に記載の特異性を示￥仇体を前項・ｊ）　−：５）のいずれか ：（記載の鑵４輔痕から凰駈される特異的ｍ−ＲＮ、ａ＝により遺云子工学仮箭 疋よって製造する方法。 ［：　ｍ−ＲＮＡの特異キＣ工卵母細個系＝！たは小茨胚系を使用する公冗の標 準的方法によって測定／単離する。出−ＲＮＡは逆転写醪累によってＣ−ＤＮＡ に形質転換し、プラスミドライブラリーを既矧の方法・足よって補説する。 正しいクローンは単離／四足されたｍ−ＲＮＡからつくったプローブによって検 出することかでき、１場性クローンは次に、前項（１）に記載の特性的結合性能 を示す所望の抗体またはその一部を生ずる適正な既九の発現型ノラスミ団に挿入 することができる。〕 ［７Ｊ　ＨｕＩＦＮ−α系に属するタンパク質またはその一部を精製するため駒 項ｉ１）　、　’　＋２１　’ｆ＝Ｅよび１６）に記載の部体？使用する方法。 （８）酵素または放射嵌・ぶ誠トレーチーの使用を含む公知の免疫学的／免役化 学的方法（による足註的または定量的な同足／恢出のために前項＋Ｉ）、ｔ２＋ および（６）に記載の抗体を使用する方法。 （９）標識された抗体を使用する前記免疫グロブリンによる前項０）Ｋ記載の共 通決定基の同定方法。 １１０）　前項（１）、（２）、（６）および（９）に記載の抗体によって規定 されるＨｕＩＰ”Ｎ−αに属する共通決定基っ