JPH02150277A - アトラジンおよびアトラジン誘導体の免疫学的検出 - Google Patents
アトラジンおよびアトラジン誘導体の免疫学的検出Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体
および／または不活性のアトラジン代謝物に対する高度
の選択性と親和性が顕著であり、そのため、アトラジン
および／ｌ之はアトラジン誘導体および不活性のアトラ
ジン代謝物を迅速に効果的に検出するためのイムノアッ
セイにおける使用にきわだって好適々単クローン抗体に
関する。
および／または不活性のアトラジン代謝物に対する高度
の選択性と親和性が顕著であり、そのため、アトラジン
および／ｌ之はアトラジン誘導体および不活性のアトラ
ジン代謝物を迅速に効果的に検出するためのイムノアッ
セイにおける使用にきわだって好適々単クローン抗体に
関する。
本発明のもうひとつの観点は、上記単クローン抗体をつ
くり出し、またアトラジンおよび／またはアトラジン誘
導体、更に不活性のアトラジン代謝物の上記単クローン
抗体を使り九免疫学的検出法をつくり出すハイブリドー
マ細胞、並びにこの検出法の範囲内で使用可能な試験キ
ットに関する。
くり出し、またアトラジンおよび／またはアトラジン誘
導体、更に不活性のアトラジン代謝物の上記単クローン
抗体を使り九免疫学的検出法をつくり出すハイブリドー
マ細胞、並びにこの検出法の範囲内で使用可能な試験キ
ットに関する。
作物保護の目的で合成除草剤を使用することと、それに
よる環境汚染は、最近、社会の論議の中心になることが
多くなってき之。
よる環境汚染は、最近、社会の論議の中心になることが
多くなってき之。
アトラジン、シマジンまたはプロパジンのようなＳ−）
リアジンおよびＳ−）リアジン誘導体は、 １９５０
年代に除草剤として使用できることがわかって以来、作
物の保護、特に−年生広葉雑草およびトウモロコシにお
ける種々の野草を除く定めに大量に使用されてき次。
リアジンおよびＳ−）リアジン誘導体は、 １９５０
年代に除草剤として使用できることがわかって以来、作
物の保護、特に−年生広葉雑草およびトウモロコシにお
ける種々の野草を除く定めに大量に使用されてき次。
少く見積っテ現在Ｖｉａｓ、ｏｏａ、ｏｏｏ カラ１０
Ｑ、０００，０００ヘクタールのトウモロコシ畑にＳ−
トリアジンまたＶｉ、ｓ−トリアジン誘導体が撒かれて
いる。
Ｑ、０００，０００ヘクタールのトウモロコシ畑にＳ−
トリアジンまたＶｉ、ｓ−トリアジン誘導体が撒かれて
いる。
例えばアトラジン、シマジン”！ｆｃｉ’ｉプロパジン
のようなｓ−トリアジンは土壌や他の生活圏で比較的ゆ
るやかに分解されることが長い間にわ九って知られて＾
之。
のようなｓ−トリアジンは土壌や他の生活圏で比較的ゆ
るやかに分解されることが長い間にわ九って知られて＾
之。
土壌中での３− ）、 ＩＪアジンの持続性も廃業者に
とって非常に重要である。例えはトウモロコシに必要量
アトラジンを与える時、アトラジン感受性の問題が１回
の作物ローチーシラン中にでも起る可能性があり、ある
場合には農家が手間のかかる土壌分析を行わせなければ
ならない。
とって非常に重要である。例えはトウモロコシに必要量
アトラジンを与える時、アトラジン感受性の問題が１回
の作物ローチーシラン中にでも起る可能性があり、ある
場合には農家が手間のかかる土壌分析を行わせなければ
ならない。
こｎに使用される分析法は高度に尋問的で複雑な装置を
必要とするので時間がかかシ費用がかかる。
必要とするので時間がかかシ費用がかかる。
このような理由から、合成除草剤、特にｓ−トリアジン
およびＳ−）リアジン誘導体およびその分解産物の従来
からの検出法の改良、すなわち、安価で、より効果的で
操作しやすく、実験室外の野外条件下で使用でさ、例え
は土壌や水に活性成分ｌｆｃは代謝物があるのか、ＬＬ
その濃度についての信頼できる情報を農家に速かに与え
ることがでさる方法の開発は緊急の課題といわなけｎば
ならない。
およびＳ−）リアジン誘導体およびその分解産物の従来
からの検出法の改良、すなわち、安価で、より効果的で
操作しやすく、実験室外の野外条件下で使用でさ、例え
は土壌や水に活性成分ｌｆｃは代謝物があるのか、ＬＬ
その濃度についての信頼できる情報を農家に速かに与え
ることがでさる方法の開発は緊急の課題といわなけｎば
ならない。
この点で特に重要なことは活性成分と不活性な分解物を
分別できることで、それによってのみ、土壌中に活性成
分の真の量を定量分析できるのである。
分別できることで、それによってのみ、土壌中に活性成
分の真の量を定量分析できるのである。
アトラジンとその主要分解産物のヒドロキシアトラジン
は以前に土壌および水試料中に、主にティーエルシー（
ＴＩ、ｅ） （薄層クロマトグラフィー）により、１ｆ
ｃ分光法の助けを借りて検出された。今日では、主とし
てエイチピーエルシー（ＨＰＬＣ）（高圧液体クロマト
グラフィー）（ラムスタイナー アンド ヘルマンＦｔ
ａｍｓｔｅｉｎｅｒａｎｄ Ｈｏｒｍａｎｎ 、 １
９７９年）およびジーシー（ＧＣ）（ガスクロマトグラ
フィー）（ラムスタイナーケールａｍｓＬｅｉｎｅｒ
Ｋ、 １９８５年）の方法が使用されている。
は以前に土壌および水試料中に、主にティーエルシー（
ＴＩ、ｅ） （薄層クロマトグラフィー）により、１ｆ
ｃ分光法の助けを借りて検出された。今日では、主とし
てエイチピーエルシー（ＨＰＬＣ）（高圧液体クロマト
グラフィー）（ラムスタイナー アンド ヘルマンＦｔ
ａｍｓｔｅｉｎｅｒａｎｄ Ｈｏｒｍａｎｎ 、 １
９７９年）およびジーシー（ＧＣ）（ガスクロマトグラ
フィー）（ラムスタイナーケールａｍｓＬｅｉｎｅｒ
Ｋ、 １９８５年）の方法が使用されている。
上記の合成除草剤検出法はすべて多くの不利な点を持つ
ている０例えばエイチピーエルシー（ＨＰＬＣ）による
土壌試料中のアトラジンまたはヒドロキシ７トラジンの
分析では、実際にクロマトグラフィー分析を行う前に複
雑な精製と濃縮工程を入れる必要がある。
ている０例えばエイチピーエルシー（ＨＰＬＣ）による
土壌試料中のアトラジンまたはヒドロキシ７トラジンの
分析では、実際にクロマトグラフィー分析を行う前に複
雑な精製と濃縮工程を入れる必要がある。
エイチピーエルシー（）ｉＰｌ、ｅ ）法のもうひとつ
の不利な点は相対的に見て非特異的な光度検出器を使用
する点にある。
の不利な点は相対的に見て非特異的な光度検出器を使用
する点にある。
質量分光未検出以外は、クロマトグラフィー分析は特定
の系における保持時間の測定を基礎としている。しかし
、この値は相対的で構造に特異的ではない。
の系における保持時間の測定を基礎としている。しかし
、この値は相対的で構造に特異的ではない。
質量分光法測定と組合せ几ガスクロマトグラフィーによ
るヒドロキシアトラジンの分析は、この化合物の揮発性
が低いために相当の労力を使った場合にのみ可能である
。
るヒドロキシアトラジンの分析は、この化合物の揮発性
が低いために相当の労力を使った場合にのみ可能である
。
上記のような従来の分析法の不利な点を除くために、す
でに臨床診断における広範囲な抗原を検出する几めに日
常的に採用されているような免疫学的方法の開発が、農
業の分野においても特に土壌、水または突気試料中の漬
薬の定量および定性分析のために、近時試みられてきた
。
でに臨床診断における広範囲な抗原を検出する几めに日
常的に採用されているような免疫学的方法の開発が、農
業の分野においても特に土壌、水または突気試料中の漬
薬の定量および定性分析のために、近時試みられてきた
。
例えば、２．４−ジンΩ０７ ｘノキシ酢酸（フリーカ
ーＦｌｅｅＫｅｒ、 １９８６年）ｌｔはクロルスＡ
／ ７ Ｅ１） ：／ （ケリー等Ｋｅ１）ｅｙ ｅＬ
ａｌ、、 １９８５年）のようないくつかの除草剤お
よびジフルベンズロン（ワイトアンドハンモックＷｉｄ
ｅ ａｎｄＨａｒｒｍｏｃｋ、 １９８２年）、メタ
ラキシ／ｌ／ （二ｚ −サムＮｅｗｓｏｍｅ、 ｊ
９８５年）またけバラチオン（エルセゴピッチ等Ｅｒ
ｃｅｇｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ、、 ｔ ９８ ｆ年）
のような種の殺鼠剤の免疫学的検出法の開発が始った。
ーＦｌｅｅＫｅｒ、 １９８６年）ｌｔはクロルスＡ
／ ７ Ｅ１） ：／ （ケリー等Ｋｅ１）ｅｙ ｅＬ
ａｌ、、 １９８５年）のようないくつかの除草剤お
よびジフルベンズロン（ワイトアンドハンモックＷｉｄ
ｅ ａｎｄＨａｒｒｍｏｃｋ、 １９８２年）、メタ
ラキシ／ｌ／ （二ｚ −サムＮｅｗｓｏｍｅ、 ｊ
９８５年）またけバラチオン（エルセゴピッチ等Ｅｒ
ｃｅｇｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ、、 ｔ ９８ ｆ年）
のような種の殺鼠剤の免疫学的検出法の開発が始った。
アトラジンｑ免疫学的検出法がすでに公になりているが
（アメリカ特許第４，５５Ｃ１，７８６号明細書）、上
記の方法と同様に、適当な抗原で予じめ感作した動物か
ら得られるポリクローン抗血清を使用している。
（アメリカ特許第４，５５Ｃ１，７８６号明細書）、上
記の方法と同様に、適当な抗原で予じめ感作した動物か
ら得られるポリクローン抗血清を使用している。
ポリクローン抗血清は非常に不均一な成分を持っていて
、すなわち、特定の抗原のいくつかの抗原決定基と反応
する多くの異った抗体を含んでいる。ポリクローン抗血
清の不均一性は、実験動物を特定の抗原で感作した時、
抗原分子上の異る抗原決定基をそれぞれ認識するいくつ
かの抗体産生細胞クローンが常に同時に刺激さｎｌその
刺激され几細胞クローンによって異り九抗体が産生され
るために起る。
、すなわち、特定の抗原のいくつかの抗原決定基と反応
する多くの異った抗体を含んでいる。ポリクローン抗血
清の不均一性は、実験動物を特定の抗原で感作した時、
抗原分子上の異る抗原決定基をそれぞれ認識するいくつ
かの抗体産生細胞クローンが常に同時に刺激さｎｌその
刺激され几細胞クローンによって異り九抗体が産生され
るために起る。
こ扛が感作動物の免疫血清が常にポリクローン性になり
、このためその特異性と免疫グロブリンの個々のクラス
分類について不均一になる理由である。
、このためその特異性と免疫グロブリンの個々のクラス
分類について不均一になる理由である。
ポリクローン抗血清がこのように不均一であることから
、例えばアトラジンとその主要分解物のヒドロキシアト
ラジンのように構造的に密接な関係を持つ化合物は、ポ
リクローン抗体をイムノアッセイに使用すると十分に分
別することができない。
、例えばアトラジンとその主要分解物のヒドロキシアト
ラジンのように構造的に密接な関係を持つ化合物は、ポ
リクローン抗体をイムノアッセイに使用すると十分に分
別することができない。
こｎに対し、本発明が実施を意図している目的は、第一
にアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体および不
活性なアトラジン分解物、特にヒドロキシアトラジンお
よび／またはヒドロキシアトラジン誘導体の操作が簡単
で効果的な、迅速で信頼性ある検出を行う高度に選択的
なイムノアッセイを提供することで、この方法ではアト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体をその分解物か
ら分別できるものである。
にアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体および不
活性なアトラジン分解物、特にヒドロキシアトラジンお
よび／またはヒドロキシアトラジン誘導体の操作が簡単
で効果的な、迅速で信頼性ある検出を行う高度に選択的
なイムノアッセイを提供することで、この方法ではアト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体をその分解物か
ら分別できるものである。
驚くべきことに、それ自体公知のハイブリドーマ／単ク
ローン抗体手法を使うことにょシ、特にアトラジンおよ
び／ｘｙｔ：、はアトラジン誘導体に高い特異性と親和
性を持つ単クローン抗体を得、またアトラジンおよび／
またはアトラジン誘導体の分解物、特に例えばヒドロキ
シアトラジン、ヒドロキシシマジン、ヒドロキシプロパ
ジン等のようなアトラジンおよび／ｌ几はアトラジン誘
導体のヒドロキシル類似体に高い特異性と親和性を持つ
単クローン抗体を得ることにより、本発明の意図する目
的を実現することが可能となった。
ローン抗体手法を使うことにょシ、特にアトラジンおよ
び／ｘｙｔ：、はアトラジン誘導体に高い特異性と親和
性を持つ単クローン抗体を得、またアトラジンおよび／
またはアトラジン誘導体の分解物、特に例えばヒドロキ
シアトラジン、ヒドロキシシマジン、ヒドロキシプロパ
ジン等のようなアトラジンおよび／ｌ几はアトラジン誘
導体のヒドロキシル類似体に高い特異性と親和性を持つ
単クローン抗体を得ることにより、本発明の意図する目
的を実現することが可能となった。
非常に特定の抗原に対する抗体を得る源としての雑橿体
細胞株（ハイブリドーマ）を使用することはケーラー
アンド ミルスタイン（Ｋ６ｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌ
ｓｌｅｉｎ） （ネイチャー ２５６巻４９５−９７頁
１９７５年Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７゜１９
７５）の研究から出ている。
細胞株（ハイブリドーマ）を使用することはケーラー
アンド ミルスタイン（Ｋ６ｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌ
ｓｌｅｉｎ） （ネイチャー ２５６巻４９５−９７頁
１９７５年Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７゜１９
７５）の研究から出ている。
ここに記載されている方法で得られる抗体は従来の感作
動物の抗血清から得られるものと非常に異っている。
動物の抗血清から得られるものと非常に異っている。
ハイブリドーマ／単クローン抗体技術の本質は、二つの
体細胞を融合し定時、得られた雑種細胞は両親の型の性
質を両方持つという観察に基いている。
体細胞を融合し定時、得られた雑種細胞は両親の型の性
質を両方持つという観察に基いている。
単クローン抗体産生の場合、特異的抗体の合成能は予じ
め感作した供与体動物から採った急疫性Ｂ細胞（通常肺
臓細胞）から、一方、培義によシ連続的に細胞分裂する
能力はもう一方の融合相手の腫瘍細胞株（しばしばミエ
ローマ）から来る。
め感作した供与体動物から採った急疫性Ｂ細胞（通常肺
臓細胞）から、一方、培義によシ連続的に細胞分裂する
能力はもう一方の融合相手の腫瘍細胞株（しばしばミエ
ローマ）から来る。
これらの雑種細胞株の各々は、抗原に反応して動物によ
り生体内で合成され得る多数の抗体の単一の代表のみを
表わす均一な免疫グロブリンを合成する。
り生体内で合成され得る多数の抗体の単一の代表のみを
表わす均一な免疫グロブリンを合成する。
免疫グロブリン産生クローンはすべてそれぞれ単一の型
の抗体で特徴付けられる友めに、単クローン抗体という
名前が出来た。
の抗体で特徴付けられる友めに、単クローン抗体という
名前が出来た。
単クローン抗体はポリクローン抗体に対して多くの有利
な点を持つ： ａ）単クローン抗体は多数、ｌた高純度で得られ、 ｂ）単クローン標品は抗原反応性の点で均質であり、反
応時間経過で変化することなく、Ｃ）単クローン抗体産
生ハイブリドーマはその特異な性質、すなわち特異釣車
クローン抗体産生能を失うこなしに数年または数１０年
間貯蔵可能で、 ｄ）ポリクローン抗血清が例えば α）抗血清を得るために感作動物から採血し、β）追加
感作のために常に物質を必要とし、γ）供与体動物の寿
命が限られている 等の点から種々の悪影響を受けるため、単クローン抗体
はポリクローン抗体より標準試薬として使用するのに好
適である。
な点を持つ： ａ）単クローン抗体は多数、ｌた高純度で得られ、 ｂ）単クローン標品は抗原反応性の点で均質であり、反
応時間経過で変化することなく、Ｃ）単クローン抗体産
生ハイブリドーマはその特異な性質、すなわち特異釣車
クローン抗体産生能を失うこなしに数年または数１０年
間貯蔵可能で、 ｄ）ポリクローン抗血清が例えば α）抗血清を得るために感作動物から採血し、β）追加
感作のために常に物質を必要とし、γ）供与体動物の寿
命が限られている 等の点から種々の悪影響を受けるため、単クローン抗体
はポリクローン抗体より標準試薬として使用するのに好
適である。
単クローン抗体は今や多数の抗原に対して調製されてお
り、最初は医学診断において確立さｎ、現在では診断は
こ才１なしでは成立たない。
り、最初は医学診断において確立さｎ、現在では診断は
こ才１なしでは成立たない。
これに反して、実業分野における単クローン抗体の使用
は、現在ｌでの所、主として植物病のスクリーニングお
よび生産家畜のワクチン開発に限られている。
は、現在ｌでの所、主として植物病のスクリーニングお
よび生産家畜のワクチン開発に限られている。
植物病に関しては、例えばツー エイチ、ティー等Ｔｓ
ｕ、 Ｈ，Ｔ、 ｅｌ ａｌ （ｘイ Ｘ、スエムニｚ
−ズ５０巻３号： ９１−１０１頁、１９８４年ＡＳＭ
Ｎｅｗｓ、 ５０ （３１： ９ｌ−ｆｏｌ、 １９８
４）が単クローン抗体をつくった全部で１８種の植物ウ
ィルスを挙げており、それにはカーネーシーン輪腐病（
ｅｔｃｈｅｄ ｒｉｎｇ）ウィルス、ジャガイモ葉捲病
ウィルス、サザーンビーンモザイクウイルス、タバコモ
ザイクウィルス、トマト輪斑病（ｒｉｎｇ ５ｐｏｔ）
ウィルスおよびチューリップブレーキング（ｂｒｅａｋ
ｉｎｇ）ウィルスが含ｌれる。
ｕ、 Ｈ，Ｔ、 ｅｌ ａｌ （ｘイ Ｘ、スエムニｚ
−ズ５０巻３号： ９１−１０１頁、１９８４年ＡＳＭ
Ｎｅｗｓ、 ５０ （３１： ９ｌ−ｆｏｌ、 １９８
４）が単クローン抗体をつくった全部で１８種の植物ウ
ィルスを挙げており、それにはカーネーシーン輪腐病（
ｅｔｃｈｅｄ ｒｉｎｇ）ウィルス、ジャガイモ葉捲病
ウィルス、サザーンビーンモザイクウイルス、タバコモ
ザイクウィルス、トマト輪斑病（ｒｉｎｇ ５ｐｏｔ）
ウィルスおよびチューリップブレーキング（ｂｒｅａｋ
ｉｎｇ）ウィルスが含ｌれる。
本発明は始めて、それ自体公知で簡単に前述し几ハイブ
リドーマ／単クローン抗体技術を使うことにより、アト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体に高い特異性と
親和性を持つ単クローン抗体と７トラジンおよび／また
はアトラジン誘導体の不活性な分解物に高い特異性と親
和性を持つ単クローン抗体の両方を使用できるようにし
、こｎらはその特異性と、従って低い相互の交差反応性
の理由から、一方ではアトラジンおよび／ｌ几はアトラ
ジン誘導体の、他方ではそれらの不活性な分解物の迅速
で信頼性ある検出の友めのイムノアッセイに優れて使用
でき、’Ｅ友、アトラジンおよび／またはアトラジン誘
導体をそｎらの不活性代謝物から分別するためにも使用
できる。
リドーマ／単クローン抗体技術を使うことにより、アト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体に高い特異性と
親和性を持つ単クローン抗体と７トラジンおよび／また
はアトラジン誘導体の不活性な分解物に高い特異性と親
和性を持つ単クローン抗体の両方を使用できるようにし
、こｎらはその特異性と、従って低い相互の交差反応性
の理由から、一方ではアトラジンおよび／ｌ几はアトラ
ジン誘導体の、他方ではそれらの不活性な分解物の迅速
で信頼性ある検出の友めのイムノアッセイに優れて使用
でき、’Ｅ友、アトラジンおよび／またはアトラジン誘
導体をそｎらの不活性代謝物から分別するためにも使用
できる。
したがって、本発明は第一に、アトラジンおよび／また
はアトラジン誘導体に高い特異性と親和性を持ち、アト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体の代謝物と基本
的に交差反応性を示さず、特にアトラジンおよび／また
はアトラジン誘導体の不活性なヒドロキシル類似体と交
差反応性を示さない単クローン抗体およびその誘導体に
関する。
はアトラジン誘導体に高い特異性と親和性を持ち、アト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体の代謝物と基本
的に交差反応性を示さず、特にアトラジンおよび／また
はアトラジン誘導体の不活性なヒドロキシル類似体と交
差反応性を示さない単クローン抗体およびその誘導体に
関する。
更にこの出願は、アトラジンおよび／’Ｅ７’ｔはアト
ラジン誘導体の不活性な分解産物、特にアトラジンおよ
び／またはアトラジン誘導体のヒドキシル類似体に高い
特異性と親和性を持ち、アトラジンおよび／またはアト
ラジン誘導体と基本的に交差反応性を示さない単クロー
ン抗体およびその誘導体に関する。
ラジン誘導体の不活性な分解産物、特にアトラジンおよ
び／またはアトラジン誘導体のヒドキシル類似体に高い
特異性と親和性を持ち、アトラジンおよび／またはアト
ラジン誘導体と基本的に交差反応性を示さない単クロー
ン抗体およびその誘導体に関する。
本発明において特に望ましいのは、アトラジンに高い特
異性と親和性を持ち、ヒドロキシアトラジンｌ几はヒド
ロキシシマジン、ヒドロキシプロパジンのようなアトラ
ジン誘導体のヒドロキシ類似体と基本的に交差反応性を
示さない単クローン抗体およびその誘導体である。
異性と親和性を持ち、ヒドロキシアトラジンｌ几はヒド
ロキシシマジン、ヒドロキシプロパジンのようなアトラ
ジン誘導体のヒドロキシ類似体と基本的に交差反応性を
示さない単クローン抗体およびその誘導体である。
同様に本発明において望了しいものは、ヒドロキシアト
ラジンに高い特異性を持ち、アトラジンまたは例えはプ
ロパジン、シマジン、アメトリン、アトラドン等のよう
なアトラジン誘導体と基本的に交差反応性を示さない単
クローン抗体およびその誘導体である。
ラジンに高い特異性を持ち、アトラジンまたは例えはプ
ロパジン、シマジン、アメトリン、アトラドン等のよう
なアトラジン誘導体と基本的に交差反応性を示さない単
クローン抗体およびその誘導体である。
本発明に更に包含されるのは、アトラジンに高い特異性
と親和性を持ち、はっきりした交差反応性を示すが、類
似の構造を持ついくつかのアトラジン誘導体、特にプロ
パ・ジン、グロメトリンおよびプロメトンからなる群か
ら選ばれたものと特に５０チ以上の、望’ＥＬ＜は８０
％以上の交差反応性を示すが、他のアトラジン誘導体ま
たはアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体のヒド
ロキシル類似体と基本的に交差反応性を示さない単クロ
ーン抗体およびその誘導体である。
と親和性を持ち、はっきりした交差反応性を示すが、類
似の構造を持ついくつかのアトラジン誘導体、特にプロ
パ・ジン、グロメトリンおよびプロメトンからなる群か
ら選ばれたものと特に５０チ以上の、望’ＥＬ＜は８０
％以上の交差反応性を示すが、他のアトラジン誘導体ま
たはアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体のヒド
ロキシル類似体と基本的に交差反応性を示さない単クロ
ーン抗体およびその誘導体である。
更に、本出願はヒドロキシアトラジンに高い特異性と親
和性を持ち、交差反応性、特にアトラジン誘導体の種々
のヒドロキシル類似体と少くとも４０チの交差反応性を
示すが、アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体と
基本的に交差反応性を示さない単クローン抗体およびそ
の誘導体に関する。
和性を持ち、交差反応性、特にアトラジン誘導体の種々
のヒドロキシル類似体と少くとも４０チの交差反応性を
示すが、アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体と
基本的に交差反応性を示さない単クローン抗体およびそ
の誘導体に関する。
本発明において特別に望ｌしいのは、ヒドロキシアトラ
ジンに高い特異性を持ち、前述の交差反応性を示し、特
に構造的に非常に類似したヒドロキシプロパジンと１０
０％ｌでの交差反応性を示すが、アトラジンｌ几は例え
ばプロパ・ジン。
ジンに高い特異性を持ち、前述の交差反応性を示し、特
に構造的に非常に類似したヒドロキシプロパジンと１０
０％ｌでの交差反応性を示すが、アトラジンｌ几は例え
ばプロパ・ジン。
シマジン、アメトリン、アトラドン等のようなアトラジ
ン誘導体並びにヒドロキシシマジン、ヒドロキシデスメ
トリノ、ヒドロキシターブチラジン等のようなアトラジ
ン誘導体のヒドロキシル類似体と基本的に交差反応性を
示さない単クローン抗体およびその誘導体である。
ン誘導体並びにヒドロキシシマジン、ヒドロキシデスメ
トリノ、ヒドロキシターブチラジン等のようなアトラジ
ン誘導体のヒドロキシル類似体と基本的に交差反応性を
示さない単クローン抗体およびその誘導体である。
本発明において単クローン抗体の誘導体が意味するもの
は、例えば、アトラジンおよび／１几はアトラジン誘導
体またはヒドロキシアトラジンおよび／またはアトラジ
ン誘導体のヒドロキシル類似体の抗原決定基に１だ高い
特異性と親和性を持つ抗体７ラグメント、更に、例えば
放射性ノヨ−）” （”Ｌ ””Ｉ） ％ 炭素（”Ｃ
）、硫黄＜”８＞、 トリチウム（”）１）等で標識
された放射性標識単クローン抗体、ビオチ／またはアビ
ジンと、ｌたワサとペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ！ｆｃはグルコース−６−ホス７
エートデヒドロゲナーゼのような酵素と単クローン抗体
との複合体、更に生物冷光物質（例えばルシフェラーゼ
）、化学冷光物質（例えばアクリジニウムエステル）ま
たは蛍光物質（例えばフィコビリプロティン）と単クロ
ーン抗体との複合体である。更に、本出願は二特異性（
パイスペシフィック）およびいわゆる交差結合（クロス
リンク）抗体を含む。ここに挙げ次可能性ある抗体酵導
体は本発明の説明のためだけで、本発明の主題を制限す
るものではない。
は、例えば、アトラジンおよび／１几はアトラジン誘導
体またはヒドロキシアトラジンおよび／またはアトラジ
ン誘導体のヒドロキシル類似体の抗原決定基に１だ高い
特異性と親和性を持つ抗体７ラグメント、更に、例えば
放射性ノヨ−）” （”Ｌ ””Ｉ） ％ 炭素（”Ｃ
）、硫黄＜”８＞、 トリチウム（”）１）等で標識
された放射性標識単クローン抗体、ビオチ／またはアビ
ジンと、ｌたワサとペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ！ｆｃはグルコース−６−ホス７
エートデヒドロゲナーゼのような酵素と単クローン抗体
との複合体、更に生物冷光物質（例えばルシフェラーゼ
）、化学冷光物質（例えばアクリジニウムエステル）ま
たは蛍光物質（例えばフィコビリプロティン）と単クロ
ーン抗体との複合体である。更に、本出願は二特異性（
パイスペシフィック）およびいわゆる交差結合（クロス
リンク）抗体を含む。ここに挙げ次可能性ある抗体酵導
体は本発明の説明のためだけで、本発明の主題を制限す
るものではない。
本発明における「基本的に交差反応性を示さない」とい
う用語は、アトラジ／ｌ之はヒドロキシアトラジン特異
率クローン抗体と他の化合物、特に構造的に関係ある化
合物の非特異的抗原決定基との反応が２０−以下、望Ｉ
ｔ、＜は５チ以下、特別に望ｌしくは１チ以下であるこ
とを意味する。
う用語は、アトラジ／ｌ之はヒドロキシアトラジン特異
率クローン抗体と他の化合物、特に構造的に関係ある化
合物の非特異的抗原決定基との反応が２０−以下、望Ｉ
ｔ、＜は５チ以下、特別に望ｌしくは１チ以下であるこ
とを意味する。
本発明における交差反応パーセントの定義は以下のよう
にして与えられる： ５０チ阻害は例えば拮抗ＥＬ Ｉ ＳＡ分析（実施例８
参照）によつて決定できる。したがって後者は、例えば
、支持体結合抗原に結合している抗体の５０チ阻害をも
几らす抗原濃度に相当する。
にして与えられる： ５０チ阻害は例えば拮抗ＥＬ Ｉ ＳＡ分析（実施例８
参照）によつて決定できる。したがって後者は、例えば
、支持体結合抗原に結合している抗体の５０チ阻害をも
几らす抗原濃度に相当する。
本発明は更に、前に詳細に性質を述べた単クローン抗体
を合成し、望ＩＬ＜は周囲の培地に分泌するハイブリド
ーマ細胞株に関する。
を合成し、望ＩＬ＜は周囲の培地に分泌するハイブリド
ーマ細胞株に関する。
本発明は特に、アトラジンおよび／またはアトラジン誘
導体に高い特異性と親和性を持ち、アトラジンおよび／
またはアトラジン誘導体の不活性なヒドロキシル類似体
と基本的に交差反応性を示さない単クローン抗体を産生
ずるハイブリドーマ細胞株に関する。
導体に高い特異性と親和性を持ち、アトラジンおよび／
またはアトラジン誘導体の不活性なヒドロキシル類似体
と基本的に交差反応性を示さない単クローン抗体を産生
ずるハイブリドーマ細胞株に関する。
同様に、アトラジンおよび／ｌｔはアトラジン誘導体の
ヒドロキシル類似体に高い特異性と親和性を持ち、アト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体と基本的に交差
反応性を示さない単クローン抗体を産生ずるハイブリド
ーマ細胞株も含ｌれる。
ヒドロキシル類似体に高い特異性と親和性を持ち、アト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体と基本的に交差
反応性を示さない単クローン抗体を産生ずるハイブリド
ーマ細胞株も含ｌれる。
更に本発明は、アトラジンに高い特異性と親和性を持ち
、ヒドロキシアトラジンｌたけアトラジン誘導体の他の
ヒドロキシル類似体と基本的に交差反応性を示さない単
クローン抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞株に関する
。
、ヒドロキシアトラジンｌたけアトラジン誘導体の他の
ヒドロキシル類似体と基本的に交差反応性を示さない単
クローン抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞株に関する
。
特に望ｌしいハイブリドーマ細胞株は、アトラジ／に高
い特異性と親和性を持ち、類似の構造を持つアトラジン
誘導体、特にプロパジン、グロメトリン、プロメトンか
らなる群から選ばれ友ものと非常にはりきすした交差反
応性を示すが、特に５０％以上、望’ＪＬ＜は８ｏチ以
上の交差反応性を示すが、他の７トラジン誘導体並びに
ヒドロキシアトラジンまたはアトラジン誘導体のヒドロ
キシル類似体と基本的に交差反応性を示さない単クロー
ン抗体を合成し、周囲の培地中に分泌する。
い特異性と親和性を持ち、類似の構造を持つアトラジン
誘導体、特にプロパジン、グロメトリン、プロメトンか
らなる群から選ばれ友ものと非常にはりきすした交差反
応性を示すが、特に５０％以上、望’ＪＬ＜は８ｏチ以
上の交差反応性を示すが、他の７トラジン誘導体並びに
ヒドロキシアトラジンまたはアトラジン誘導体のヒドロ
キシル類似体と基本的に交差反応性を示さない単クロー
ン抗体を合成し、周囲の培地中に分泌する。
イージー エイシー シー （ＥＣＡ（、’ｅ） ８８
０８／２５０１の同定的性質を持つハイブリドーマ細胞
株およびそのクローンとサブクローンは非常に望ｌしい
− 更に本発明は、ヒドロキシアトラジンに高い特異性と親
和性を持ち、アト２ジンおよび／アトラジン誘導体と基
本的に交差反応性を水式ない単クローン抗体を産生ずる
ハイブリドーマ細胞株に関する。
０８／２５０１の同定的性質を持つハイブリドーマ細胞
株およびそのクローンとサブクローンは非常に望ｌしい
− 更に本発明は、ヒドロキシアトラジンに高い特異性と親
和性を持ち、アト２ジンおよび／アトラジン誘導体と基
本的に交差反応性を水式ない単クローン抗体を産生ずる
ハイブリドーマ細胞株に関する。
本発明において同様に特に型子しいものは、ヒドロキシ
アトラジンに高い特異性と親和性を持ち、ヒドロキシシ
マジン、ヒドロキシプロパジンおよびヒドロキシデスメ
トリンのような類似の構造を持つ化合物と交差反応性を
示し、特に４０％以上の交差反応性を示すが、アトラジ
ンおよび／またはアトラジン誘導体と基本的に交差反応
性を示さない単クローン抗体を合成する・ハイブリドー
マ細胞株である。
アトラジンに高い特異性と親和性を持ち、ヒドロキシシ
マジン、ヒドロキシプロパジンおよびヒドロキシデスメ
トリンのような類似の構造を持つ化合物と交差反応性を
示し、特に４０％以上の交差反応性を示すが、アトラジ
ンおよび／またはアトラジン誘導体と基本的に交差反応
性を示さない単クローン抗体を合成する・ハイブリドー
マ細胞株である。
イージーエイシー（ＥＣＡＣ） ８８０８／２５０２の
同定的性質を持つハイブリドーマ細胞株およびそのクロ
ーンとサブクローンは特別に望フしい。
同定的性質を持つハイブリドーマ細胞株およびそのクロ
ーンとサブクローンは特別に望フしい。
同様に本発明において望ましいものは、ヒドロキシアト
ラジンに高い特異性と親和性を持ち、構造的に非常に類
似し次ヒドロキシプロパジンとはつきりした交差反応性
、特に１００チｌでの交差反応性を示すが、例えばヒド
ロキシシマジン、ヒドロキシデスメトリンまたはヒドロ
キシタープチラジンのようなアトラジン誘導体の他のヒ
ドロキシル類似体並びにアトラジンおよび／またはアト
ラジン誘導体と基本的に交差反応性を示さない単クロー
ン抗体を合成し、周囲の培地中に分泌するハイブリドー
マ細胞株である。
ラジンに高い特異性と親和性を持ち、構造的に非常に類
似し次ヒドロキシプロパジンとはつきりした交差反応性
、特に１００チｌでの交差反応性を示すが、例えばヒド
ロキシシマジン、ヒドロキシデスメトリンまたはヒドロ
キシタープチラジンのようなアトラジン誘導体の他のヒ
ドロキシル類似体並びにアトラジンおよび／またはアト
ラジン誘導体と基本的に交差反応性を示さない単クロー
ン抗体を合成し、周囲の培地中に分泌するハイブリドー
マ細胞株である。
イージーエイシーシ（ＥＣＡＣＣ）８８０８／２５０３
の同定的性質を持つハイブリドーマ細胞株およびそのク
ローンとサブクローンは特別に望ｌしい。
の同定的性質を持つハイブリドーマ細胞株およびそのク
ローンとサブクローンは特別に望ｌしい。
更に本発明には上記のＩ・イブリドーマ細胞株のｖ４製
法並びに上記の単クローン抗体のｐ４製法が含ｌれる。
法並びに上記の単クローン抗体のｐ４製法が含ｌれる。
ハイブリドーマ細胞株のクローンとサブクローンとは、
出発のクローンからクローニングを繰返すことにより得
られ、本発明に必須の出発のクローンの性質を１だ持っ
ているハイブリドーマを意味する。
出発のクローンからクローニングを繰返すことにより得
られ、本発明に必須の出発のクローンの性質を１だ持っ
ているハイブリドーマを意味する。
更に本発明は、本発明の単クローン抗体を使用すること
Ｋよる、例えば土壌、水または交気試料並びに例えば植
物ｌ几は動物抽出物のような生体試料中のアトラジンお
よび／またはアトラジン誘導体の免疫学的検出法に関す
る。
Ｋよる、例えば土壌、水または交気試料並びに例えば植
物ｌ几は動物抽出物のような生体試料中のアトラジンお
よび／またはアトラジン誘導体の免疫学的検出法に関す
る。
更に本発明は、本発明の単クローン抗体を使用すること
による、例えば土壌、水または空気試料並びに植物また
は動物抽出物のような生体試料中のヒドロキシアトラジ
ンおよび／またはアトラジン誘導体のヒドロキシル類似
体の免疫学的検出法に関する。
による、例えば土壌、水または空気試料並びに植物また
は動物抽出物のような生体試料中のヒドロキシアトラジ
ンおよび／またはアトラジン誘導体のヒドロキシル類似
体の免疫学的検出法に関する。
ヒドロキシアトラジンの検出法は特別に望ましい・
更に本発明の一部は、アトラジンおよび／１友はアトラ
ジン誘導体の、またはアトラジンおよび／またはアトラ
ジン誘導体の分解物、特に、例えばヒドロキシアトラジ
ン、ヒドロキシプロパジン、ヒドロキシシマジン等のよ
うなアトラジンおよび／Ｘｆｃはアトラジン誘導体のヒ
ドロキシル類似体の定性的および定量的分析の友めの組
成物であり、そｎ＃′ｉ試薬として本発明の単クローン
抗体の少くともひとつを含み、アトラジンおよび／また
はアトラジン誘導体並ひに７トラジンおよび／またはア
トラジン誘導体の分屑物、特にヒドロキシアトラジンお
よび／またはアトラジン誘導体のヒドロキシル類似体ノ
迅速で信頼性ある検出のために野外条件下で使用するに
好適な即使用（レディー トウ ユース）テストキット
の形である。
ジン誘導体の、またはアトラジンおよび／またはアトラ
ジン誘導体の分解物、特に、例えばヒドロキシアトラジ
ン、ヒドロキシプロパジン、ヒドロキシシマジン等のよ
うなアトラジンおよび／Ｘｆｃはアトラジン誘導体のヒ
ドロキシル類似体の定性的および定量的分析の友めの組
成物であり、そｎ＃′ｉ試薬として本発明の単クローン
抗体の少くともひとつを含み、アトラジンおよび／また
はアトラジン誘導体並ひに７トラジンおよび／またはア
トラジン誘導体の分屑物、特にヒドロキシアトラジンお
よび／またはアトラジン誘導体のヒドロキシル類似体ノ
迅速で信頼性ある検出のために野外条件下で使用するに
好適な即使用（レディー トウ ユース）テストキット
の形である。
本発明の単クローン抗体は、それ自体公知で、ケーラー
アンド ミルスタイン（Ｋ；ｈｌｅｒ ａｎｄＭｉｌ
ｓｔｅｉｎ）（ネイチャー ２５６巻４９５−４９７頁
１９７５年Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７．１
９７５）Ｋよって開発され友方法に本質的に基く方法に
よつて調製される。
アンド ミルスタイン（Ｋ；ｈｌｅｒ ａｎｄＭｉｌ
ｓｔｅｉｎ）（ネイチャー ２５６巻４９５−４９７頁
１９７５年Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７．１
９７５）Ｋよって開発され友方法に本質的に基く方法に
よつて調製される。
分析し、ｌたセれに対して特異的抗体をつくろうとして
いる目標物質アトラジンおよびヒドロキシアトラジンは
比較的小さくて簡単な分子で、実験動物に投与してもそ
れ自体で適当な免疫反応を誘導できないため、実際に感
作する前に＋備的手段を講する必要がある。
いる目標物質アトラジンおよびヒドロキシアトラジンは
比較的小さくて簡単な分子で、実験動物に投与してもそ
れ自体で適当な免疫反応を誘導できないため、実際に感
作する前に＋備的手段を講する必要がある。
大きさと簡単な構造のために免疫反応を誘導できないこ
の型の化合物をノーブテンまたは不完全抗原と呼び、抗
原として作用し免疫反応を誘導できる完全抗原（免疫原
）と対比する。この型のハゲテン分子を高分子量化合物
（キャリアー分子）と結合てせることにより、完全抗原
と性質的に匹敵するようになシ、すなわち、免疫反応を
誘導する能力を持つ。
の型の化合物をノーブテンまたは不完全抗原と呼び、抗
原として作用し免疫反応を誘導できる完全抗原（免疫原
）と対比する。この型のハゲテン分子を高分子量化合物
（キャリアー分子）と結合てせることにより、完全抗原
と性質的に匹敵するようになシ、すなわち、免疫反応を
誘導する能力を持つ。
感作反応中に生じる抗体のいくつかは、へブテン分子が
そｎだけで存在しても、またはキャリアー分子と結合し
ていても、いずれの場合にもハプテン分子上の特異的抗
原決定基と反応する。
そｎだけで存在しても、またはキャリアー分子と結合し
ていても、いずれの場合にもハプテン分子上の特異的抗
原決定基と反応する。
今後、しばしば使用するハプテンという語は、本発明に
おいては、主として感作に使用するアトラジンおよび／
ｌ几はヒドロキシアトラジン分子を意味する。
おいては、主として感作に使用するアトラジンおよび／
ｌ几はヒドロキシアトラジン分子を意味する。
したがって、本発明においては、ハプテンとして作用す
るアトラジンおよびヒドロキシアトラジンは実験動物の
感作前に、アトラジンおよびヒドロキシアトラジン分子
に完全な抗原活性を与えるに好適な高分子量キャリアー
に結合させる。
るアトラジンおよびヒドロキシアトラジンは実験動物の
感作前に、アトラジンおよびヒドロキシアトラジン分子
に完全な抗原活性を与えるに好適な高分子量キャリアー
に結合させる。
本発明における好適なキャリアー分子とは、ハプテンと
結合反応の几めの容易に使用できる反応基を持ち、それ
と結合することによってハゲテンに抗原能を与え、また
はすでに存在している抗原性を強める高分子化合物を主
として意味する。
結合反応の几めの容易に使用できる反応基を持ち、それ
と結合することによってハゲテンに抗原能を与え、また
はすでに存在している抗原性を強める高分子化合物を主
として意味する。
本発明において特に望Ｉしいものは、容易に使用できる
反応性アミン基を含む高分子化合物である。
反応性アミン基を含む高分子化合物である。
キャリアーとして本発明により使用するに特別に望まし
いものは、例えばウシ血清アルブミン（ビーニスエイＢ
ＡＡ ：分子量６へ２００ ）、ヒト血清アルブミン（
エイチエスエイＨＳＡ１−ｉｓＡ：分子量５ａＯｏＯ）
’！友はキーホールリムペット蛋白質（Ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ケイエルエイチＫ
Ｌ、Ｕ ：分子量１．ｏｏｏ、ｏｏｏ ） ｔｖ ヨ５
１ｋ、分子量ＩＱ０００４Ａら１，５００，０００（７
）間のりジンに富む蛋白質で、これらは市販されておシ
、望みの量を入手できる。
いものは、例えばウシ血清アルブミン（ビーニスエイＢ
ＡＡ ：分子量６へ２００ ）、ヒト血清アルブミン（
エイチエスエイＨＳＡ１−ｉｓＡ：分子量５ａＯｏＯ）
’！友はキーホールリムペット蛋白質（Ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ケイエルエイチＫ
Ｌ、Ｕ ：分子量１．ｏｏｏ、ｏｏｏ ） ｔｖ ヨ５
１ｋ、分子量ＩＱ０００４Ａら１，５００，０００（７
）間のりジンに富む蛋白質で、これらは市販されておシ
、望みの量を入手できる。
もちろん、本発明において、上記の要求に合致する限り
、キャリアー分子として他の高分子化合物を使用してよ
く、例えばブタサイログロア’ ＩＪン、鳥ミクログロ
ブリン、ヘモシアニン、イムノグロブリン、ＩＩ！素（
コレラ、破傷風、ジフテリアトキシン等）、多糖、リボ
多糖、天然および合成のポリアデニルおよびポリウリジ
ル酸、ポリアラニルおよびポリリジンポリペプチド、Ｉ
几は例えばホルマリン−またけグルタルアルデヒド−処
理赤血球膜のような細胞膜成分である。
、キャリアー分子として他の高分子化合物を使用してよ
く、例えばブタサイログロア’ ＩＪン、鳥ミクログロ
ブリン、ヘモシアニン、イムノグロブリン、ＩＩ！素（
コレラ、破傷風、ジフテリアトキシン等）、多糖、リボ
多糖、天然および合成のポリアデニルおよびポリウリジ
ル酸、ポリアラニルおよびポリリジンポリペプチド、Ｉ
几は例えばホルマリン−またけグルタルアルデヒド−処
理赤血球膜のような細胞膜成分である。
同様に本発明の方法においてキャリアー分子として使用
するのに好適なものは、例えばエイチ、カワムラ アン
ドジェイ エイ ペルシフスキー ）Ｌ Ｋａｗａｍｕ
ｒａ ａｎｄ Ｊ、 Ａ、 Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ（ジャ
ーナルオプイムノロジー１３６巻５８頁１９８６年Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １５６ ： ５８．１９８６ ）
により記載されている方法によるウサギのマウスアイジ
ージーＩｇＧ（）ｉＴｉ、）に対する精製アイジージー
ＩｇＧ画分である。
するのに好適なものは、例えばエイチ、カワムラ アン
ドジェイ エイ ペルシフスキー ）Ｌ Ｋａｗａｍｕ
ｒａ ａｎｄ Ｊ、 Ａ、 Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ（ジャ
ーナルオプイムノロジー１３６巻５８頁１９８６年Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １５６ ： ５８．１９８６ ）
により記載されている方法によるウサギのマウスアイジ
ージーＩｇＧ（）ｉＴｉ、）に対する精製アイジージー
ＩｇＧ画分である。
ハプテンのキャリアー分子への結合は、直接１几は、望
ｌしくに、適当で最初にハプテン分子に結合したスペー
サーを介して行ってより。
ｌしくに、適当で最初にハプテン分子に結合したスペー
サーを介して行ってより。
この関係で、キャリアー分子への分析すべき物質のカッ
プリングは、目的物質の適切な構造要素が自由に使用で
き、したがって特異的免疫反応を誘導でき、すなわち、
特異的抗体の形成を誘導できるように行わなければなら
ない。
プリングは、目的物質の適切な構造要素が自由に使用で
き、したがって特異的免疫反応を誘導でき、すなわち、
特異的抗体の形成を誘導できるように行わなければなら
ない。
・・ブテン（アトラジンおよび／またはアトラジン誘導
体並びにアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体の
ヒドロキシル類似体）のキャリアー分子への結合（コン
ジェゲイシ曹ン）のためのスペーサーとして第一に好適
なものは、キャリアー分子の自由に使用できる反応性基
と相互反応できる少くとも１個または数個の反応性基を
含む化合物である。
体並びにアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体の
ヒドロキシル類似体）のキャリアー分子への結合（コン
ジェゲイシ曹ン）のためのスペーサーとして第一に好適
なものは、キャリアー分子の自由に使用できる反応性基
と相互反応できる少くとも１個または数個の反応性基を
含む化合物である。
本発明において特に望ｌしいのは、３個乃至１０個のブ
リッジ炭素原子を含み、例えばアミノ、カルボキシルｌ
’１ｔ−Ｆｉ８Ｈ基のような１個以上の反応性基を反応
性基として持つスペーサー分子を使用することである。
リッジ炭素原子を含み、例えばアミノ、カルボキシルｌ
’１ｔ−Ｆｉ８Ｈ基のような１個以上の反応性基を反応
性基として持つスペーサー分子を使用することである。
これらの反応性基を、それ自体公知の方法によシ、ハプ
テンおよびキャリアー分子の反応性基と反応させてノ・
ブテン−キャリアー複合体（コンジ為ゲート）ｔ−形成
させるようにする。
テンおよびキャリアー分子の反応性基と反応させてノ・
ブテン−キャリアー複合体（コンジ為ゲート）ｔ−形成
させるようにする。
例えば、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）を使
ってスペーサー分子を反応性アミン基を介してキャリア
ー分子の遊離アミノ基の１個に結合させてよい。
ってスペーサー分子を反応性アミン基を介してキャリア
ー分子の遊離アミノ基の１個に結合させてよい。
スペーサー分子が反応性Ｓ）１基を持りていたら、ハプ
テンのキャリアー分子への結合をキャリアーの遊離ＳＨ
基と酸化によって行うことができる。
テンのキャリアー分子への結合をキャリアーの遊離ＳＨ
基と酸化によって行うことができる。
本発明において特に望ましいのは、例えば、カルボジイ
ミド、望ＩＬ＜はＮ、 Ｎ’−ジシクロへキシルカルボ
ジイミドのような水結合剤を使ってキャリアー分子の遊
離アミン基に連結され得るカルボキシル基を持つスペー
サー分子全使用することである。
ミド、望ＩＬ＜はＮ、 Ｎ’−ジシクロへキシルカルボ
ジイミドのような水結合剤を使ってキャリアー分子の遊
離アミン基に連結され得るカルボキシル基を持つスペー
サー分子全使用することである。
本発明の実施態様のひとつは、アトラジン、ヒドロキシ
アトラジンまたはそれらの誘導体のひとつ、望Ｉしくは
２．６−ジ−クロロ−４−（インプロビルアミノ）−Ｓ
−）リアジンから出発し、これはδ−７ミノノ（レリア
ン醸と反応して２−クロロ−４−（イソプロ、ピルアミ
ノ）−６−（δ−アミノバレリル醗） −ｓ −ト１）
７ジンとなる。この化合物は公知の方法、例えば鉱酸
水の添加により、速かに次の灰石段階で相当するヒドロ
キシル類似体に変換される。
アトラジンまたはそれらの誘導体のひとつ、望Ｉしくは
２．６−ジ−クロロ−４−（インプロビルアミノ）−Ｓ
−）リアジンから出発し、これはδ−７ミノノ（レリア
ン醸と反応して２−クロロ−４−（イソプロ、ピルアミ
ノ）−６−（δ−アミノバレリル醗） −ｓ −ト１）
７ジンとなる。この化合物は公知の方法、例えば鉱酸
水の添加により、速かに次の灰石段階で相当するヒドロ
キシル類似体に変換される。
実際のカップリング反応は活性エステル法で行うことが
望フしい。これにはアトラジンまたはヒドロキシアトラ
ジンの誘導体を先ず適当な溶媒に溶解する必要がある０
％に望ｌしい溶媒は、例えばＮ、 Ｎ−ジメチルホルム
アミド（デイ−エムエフＤＭＦ）またはジメチルスルホ
キシド（デイ−エムニスオーＤＭＳＯ）のような蒸散度
の低い中性溶媒である。
望フしい。これにはアトラジンまたはヒドロキシアトラ
ジンの誘導体を先ず適当な溶媒に溶解する必要がある０
％に望ｌしい溶媒は、例えばＮ、 Ｎ−ジメチルホルム
アミド（デイ−エムエフＤＭＦ）またはジメチルスルホ
キシド（デイ−エムニスオーＤＭＳＯ）のような蒸散度
の低い中性溶媒である。
次いで、この予じめ可溶化したアトラジンおよび／また
はヒドロキシアトラジンの誘導体を、例えばＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイ
ミド、Ｎ、Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミドＩ九
はＮ、 Ｎ’−カルボニルジイミダゾールまたはこ扛ら
の誘導体と反応場せることにより、そのカルボキシル基
を活性エステルに誘導する。
はヒドロキシアトラジンの誘導体を、例えばＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイ
ミド、Ｎ、Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミドＩ九
はＮ、 Ｎ’−カルボニルジイミダゾールまたはこ扛ら
の誘導体と反応場せることにより、そのカルボキシル基
を活性エステルに誘導する。
活性エステルを反応混液から分離してＢＳＡ −Ｅ次は
ＫＬＨに加える。α１乃至１２時間、望ｌしくｉｊ４乃
至５時間反応させて沈殿を除去する。
ＫＬＨに加える。α１乃至１２時間、望ｌしくｉｊ４乃
至５時間反応させて沈殿を除去する。
次いで適当にこれ以上の精製過程を加えて、この上澄を
実際の感作灰石に使用できる。
実際の感作灰石に使用できる。
本発明において望ｌ（い活性エステル法以外にも、例え
ば混合無水物法のような他のキャリアー分子への・・ブ
テン結合法を使用できる。Ｏｎは無水酢酸１友はカルボ
ジイミド誘導体、１−エチル−３−（３’−ジメチルア
ミノプロビル）カルボジイミドを使りてキャリアー分子
に連結されているブリッジ構成体のカルボキシル基を必
要とする。
ば混合無水物法のような他のキャリアー分子への・・ブ
テン結合法を使用できる。Ｏｎは無水酢酸１友はカルボ
ジイミド誘導体、１−エチル−３−（３’−ジメチルア
ミノプロビル）カルボジイミドを使りてキャリアー分子
に連結されているブリッジ構成体のカルボキシル基を必
要とする。
供与体動物に高分子量キャリアー分子に結合されたハプ
テンを１回以上投与する。７乃至５０日間、望ｌしくは
１３乃至１５日間の間隔を置いて２または５回の投与が
特に望ｌしい。
テンを１回以上投与する。７乃至５０日間、望ｌしくは
１３乃至１５日間の間隔を置いて２または５回の投与が
特に望ｌしい。
本発明において望ましい投与は注射で、これは静脈内、
腹腔内または皮下でよい。
腹腔内または皮下でよい。
皮下と腹腔内注射の組合せが型子しい。
α５乃至４ケ月の休止の後にもう−ｆ へブテン複合体
を１００μＶ乃至１０００μ？の投与量で１回投与する
。
を１００μＶ乃至１０００μ？の投与量で１回投与する
。
最後の投与後１乃至６日後の間に供与体動物を殺し、肺
臓細胞懸濁液を調製する。
臓細胞懸濁液を調製する。
このため分離した肺臓細胞を適当な緩１）１（（例えば
ビーニスニスＢＳＳ緩衝液）に懸濁し、好適なミエロー
マ細胞と融合する１で細胞懸濁液の形で保存する。
ビーニスニスＢＳＳ緩衝液）に懸濁し、好適なミエロー
マ細胞と融合する１で細胞懸濁液の形で保存する。
この融合は、ミエローマ細胞株も単クローン抗体を合成
し、そのためバイブリドはミエローマ細胞に起源を持つ
ものと、免疫細胞の遺伝情報で規定される第２のものと
の２種の単クローン抗体を合成するために、最初は複雑
であり几。
し、そのためバイブリドはミエローマ細胞に起源を持つ
ものと、免疫細胞の遺伝情報で規定される第２のものと
の２種の単クローン抗体を合成するために、最初は複雑
であり几。
したがって、本発明においては、例えばエスピー２１０
−！ イジ−１４（ＳＰ２１０−Ａｇ１４）（ンエルマ
ン等８ｈｕｌｒｎａｎ ｅＬ ａｌ、 １９７８年）１
友ハｘ ７ ジス６５−エイ’） −＆６５３（Ｘ６３
−Ａｇａ６５３）のようなそれ自身はいかなる単クロー
ン抗体をも産生できない腫瘍細胞を使うことが望１しく
、こ扛らは得られた融合産物の解析が非常に簡単である
。肺臓細胞がミエローマ細胞に対して２乃至２０倍過剰
に存在すると融合に有利である。
−！ イジ−１４（ＳＰ２１０−Ａｇ１４）（ンエルマ
ン等８ｈｕｌｒｎａｎ ｅＬ ａｌ、 １９７８年）１
友ハｘ ７ ジス６５−エイ’） −＆６５３（Ｘ６３
−Ａｇａ６５３）のようなそれ自身はいかなる単クロー
ン抗体をも産生できない腫瘍細胞を使うことが望１しく
、こ扛らは得られた融合産物の解析が非常に簡単である
。肺臓細胞がミエローマ細胞に対して２乃至２０倍過剰
に存在すると融合に有利である。
肺臓細胞とミエローマ細胞の融合は、目的の細胞融合に
最適の条件を与える組成を持つ特別の融合培地で行う。
最適の条件を与える組成を持つ特別の融合培地で行う。
上記の融合培地は、例えばセンダイウィルス１友は他の
バラミキソウイルスで適当に紫外線−不活性化されたも
の、カルシウムイオン、例えばリソレシチンｌ几はポリ
エチレングリコールのような界面活性剤のような、細胞
融合に通常使用される融合ブロモ−ターのひとつを含む
緩衝液が望ましい。本発明において特に望了しいものは
、ポリエチレングリコール、特に６００乃至６０００の
平均分子量を持つポリエチレングリコール（ビーイージ
ーＰＥＧ）を５０％乃至６０％の濃度で使用するもので
ある。４０％乃至５０％のＰＥＧ濃度が特に望ｌしい、
最適融合温度は１８℃と３９℃の間で、３７℃の温度が
特に望ｌしい。
バラミキソウイルスで適当に紫外線−不活性化されたも
の、カルシウムイオン、例えばリソレシチンｌ几はポリ
エチレングリコールのような界面活性剤のような、細胞
融合に通常使用される融合ブロモ−ターのひとつを含む
緩衝液が望ましい。本発明において特に望了しいものは
、ポリエチレングリコール、特に６００乃至６０００の
平均分子量を持つポリエチレングリコール（ビーイージ
ーＰＥＧ）を５０％乃至６０％の濃度で使用するもので
ある。４０％乃至５０％のＰＥＧ濃度が特に望ｌしい、
最適融合温度は１８℃と３９℃の間で、３７℃の温度が
特に望ｌしい。
免疫膵臓細胞とミエローマ細胞の融合を行った後、融合
され几抗体産生雑種細胞をそれ自体公知の方法で選択す
る。
され几抗体産生雑種細胞をそれ自体公知の方法で選択す
る。
両親細胞二つの型から得られた融合物（雑珈細胞ンの選
択には檀々の可能性が存在する。通常は、各親の型の細
胞１００万以上を融合計画に使用する。融合Ｆｉ１００
％の頻度では起らないので、大過剰の未融合または自己
融合親細胞から融合物を分離することは困難な仕事であ
る。
択には檀々の可能性が存在する。通常は、各親の型の細
胞１００万以上を融合計画に使用する。融合Ｆｉ１００
％の頻度では起らないので、大過剰の未融合または自己
融合親細胞から融合物を分離することは困難な仕事であ
る。
前に述べ友ように、ハイブリドーマ細胞は短時間生存す
る抗体産生（膵臓）Ｂ細胞と長時間生存するミエローマ
細胞の融合によってつくられる。
る抗体産生（膵臓）Ｂ細胞と長時間生存するミエローマ
細胞の融合によってつくられる。
望ｌれる結果は抗体を産生ずる長時間生存する細胞株で
ある。肺臓細旭は培養すると限られた生存期間しか持た
ないので、原理的には、すべての未融合細胞および自己
融合膵臓細胞が死ぬｌで単純に待つことも可能である。
ある。肺臓細旭は培養すると限られた生存期間しか持た
ないので、原理的には、すべての未融合細胞および自己
融合膵臓細胞が死ぬｌで単純に待つことも可能である。
しかし、その時も長時間生存する抗体産生細胞を長時間
生存する抗体非産生細胞から分離する仕事が残る。
生存する抗体非産生細胞から分離する仕事が残る。
従来の選択系は酵素しホキサンチン−グアニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（エイチジーピーアールティ
ー）ｉＧＰＲＴ）の利用性’Ｅ７ｔは非利用性に基礎を
置いている。この酵素は哺乳動物細胞のプリンサルベー
ジ合成経路の構成成分である。
ボシルトランスフェラーゼ（エイチジーピーアールティ
ー）ｉＧＰＲＴ）の利用性’Ｅ７ｔは非利用性に基礎を
置いている。この酵素は哺乳動物細胞のプリンサルベー
ジ合成経路の構成成分である。
これらの細胞は更にプリンのドノボ（ｄａ ｎｏｖｏ）
合成を行うことができる。
合成を行うことができる。
正常な条件下でこｎらの二つの合成経路はある程度併行
して働いているらしい。
して働いているらしい。
しかし、もし細胞がエイチジーピーアールティー（ＨＧ
Ｐ几Ｔ）’に持友ないと、サルベージ合成経路は止めら
れ、プリンは非プリン物質から調製されなければならな
い。
Ｐ几Ｔ）’に持友ないと、サルベージ合成経路は止めら
れ、プリンは非プリン物質から調製されなければならな
い。
）１０ＰＲＴ−陰性ミエローマ細胞の選択のために、一
般に、例えば８−アザグアニンのようないわゆるプリン
抗代謝物を使う。こｎはプリンのグアニンの構造に非常
に類似し九構造を持ち、その几め正常め反応いくつかで
グアニンを置換することができる。
般に、例えば８−アザグアニンのようないわゆるプリン
抗代謝物を使う。こｎはプリンのグアニンの構造に非常
に類似し九構造を持ち、その几め正常め反応いくつかで
グアニンを置換することができる。
アザグアニンがヂイーエヌエイ（ＤＮＡ）に取込１れ、
それにより正常の生育挙動の障害につながシ最終的に細
胞の死になる。アザグアニンはサルベージ合成経路によ
って置換されなければならないので、エイチジーピーア
ールティー（）ＩＧＰＲＴ ）活性を持友ない細胞はア
ザグアニンを利用できず、その存在下で生育できない。
それにより正常の生育挙動の障害につながシ最終的に細
胞の死になる。アザグアニンはサルベージ合成経路によ
って置換されなければならないので、エイチジーピーア
ールティー（）ＩＧＰＲＴ ）活性を持友ない細胞はア
ザグアニンを利用できず、その存在下で生育できない。
同じ酵Ｘを使うが反対の信号によシ行う選択系はジェイ
、ダブリニー、リトルフィールドＪ、 Ｗ、 Ｌｉｔｔ
ｌｅｆｉｅｌｄ （１９６４年）によりテ記載され、こ
れでは）ＩＧＰＲＴ−陽性の細胞が選択される。
、ダブリニー、リトルフィールドＪ、 Ｗ、 Ｌｉｔｔ
ｌｅｆｉｅｌｄ （１９６４年）によりテ記載され、こ
れでは）ＩＧＰＲＴ−陽性の細胞が選択される。
この選択系は、成分として、なかんずくヒボキサンチン
、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）
いわゆるエイチェイティ−（ＨＡＴ）培地の使用に基く
。アミノプテリンはドノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）プリン合
成並びにデオキシウリジレートのチミジレートへのメチ
ル化反応を阻害する抗代謝物である。
、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）
いわゆるエイチェイティ−（ＨＡＴ）培地の使用に基く
。アミノプテリンはドノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）プリン合
成並びにデオキシウリジレートのチミジレートへのメチ
ル化反応を阻害する抗代謝物である。
ヒボキサンチンはアミノプテリンがドノボ（ｄｅ ｎｏ
ｖｏ）プリン合成を止め友場合に副成分プリンとして働
くことができ、一方、チミジンはデオキシウリジレート
のメチル化の必要性を不必要にする。
ｖｏ）プリン合成を止め友場合に副成分プリンとして働
くことができ、一方、チミジンはデオキシウリジレート
のメチル化の必要性を不必要にする。
これが、アミノプテリンの存在下ですべての）ｉＧＰＲ
Ｔ−陽性細胞は増殖し、エイチジーピーアールティー（
）ＩＧＰＲＴ）−陰性細胞は死ぬ理由である。
Ｔ−陽性細胞は増殖し、エイチジーピーアールティー（
）ＩＧＰＲＴ）−陰性細胞は死ぬ理由である。
本発明において選択のために使用さｎ ；Ｅ）／・イブ
リッド系において、ミエローマ細胞はアザグアニンに耐
性で７ミノプテリンに感受性、すなわち１−１０ＰＲＴ
陰性であることが望Ｉしい。逆に抗体産生細胞はＨＵＰ
ルＴ陽性である。
リッド系において、ミエローマ細胞はアザグアニンに耐
性で７ミノプテリンに感受性、すなわち１−１０ＰＲＴ
陰性であることが望Ｉしい。逆に抗体産生細胞はＨＵＰ
ルＴ陽性である。
増殖を受は持つミエローマ細胞はエイチジーピーアール
ティー（）ｉＧＰＲ，Ｔ ）活性の存在下でのみ生育可
能であり、この活性はエイチジーピーアールティー（）
ｉＧＰｌ（、Ｔ）−陽性細胞株によ、て与えらｎている
ことから、細胞を融合させ、エイチェイティー（）ＩＡ
Ｔ ）培地で培養することにより融合が成功した細胞を
選択できる。
ティー（）ｉＧＰＲ，Ｔ ）活性の存在下でのみ生育可
能であり、この活性はエイチジーピーアールティー（）
ｉＧＰｌ（、Ｔ）−陽性細胞株によ、て与えらｎている
ことから、細胞を融合させ、エイチェイティー（）ＩＡ
Ｔ ）培地で培養することにより融合が成功した細胞を
選択できる。
エイチジーピーアールティー（ｈＧＰＲＴ ）−陽性抗
体産生細胞株は実際にこの培地で殺されるではない。し
ばらくの間のみ生残し、増殖できないのである。
体産生細胞株は実際にこの培地で殺されるではない。し
ばらくの間のみ生残し、増殖できないのである。
したがって、エイチェイティー（）ｉＡＴ ）培地にお
いて細胞を融合させた結果、ミエローマ細胞と抗体産生
細胞は雑種細胞が形成されるに十分な期間は生育できる
が、雑種細胞のみが生き残り、増殖できるような系とな
る。
いて細胞を融合させた結果、ミエローマ細胞と抗体産生
細胞は雑種細胞が形成されるに十分な期間は生育できる
が、雑種細胞のみが生き残り、増殖できるような系とな
る。
本発明の望ｌしい実施態様において、融合した雑種細胞
を、未処理、非感作の実験動物の腹水から予じめ分離さ
れたマクロファージである、いわゆるフィーダー細胞の
存在下で培養する。
を、未処理、非感作の実験動物の腹水から予じめ分離さ
れたマクロファージである、いわゆるフィーダー細胞の
存在下で培養する。
融合した雑種細胞を培養し、選択するために、細胞懸濁
液をいくつかに分け、そのそれぞれについて雑種細胞培
養の生育と抗体の産生を連続的に調べる。
液をいくつかに分け、そのそれぞれについて雑種細胞培
養の生育と抗体の産生を連続的に調べる。
マイクロタイタープレートでの融合雑種細胞の培養は本
発明において特に望ｌしい。
発明において特に望ｌしい。
これには、融合で得られた細胞懸濁液をマイクロタイタ
ープレートの各ウェル（穴）に分注し、融合雑種細胞の
生育を促進する好適な条件下で（例えば）ｉＡＴ／）Ｉ
Ｔ培地）７乃至５０日間培養する。
ープレートの各ウェル（穴）に分注し、融合雑種細胞の
生育を促進する好適な条件下で（例えば）ｉＡＴ／）Ｉ
Ｔ培地）７乃至５０日間培養する。
生育した雑種細胞培養物の上澄液について抗体の産生を
連続的に調べる。
連続的に調べる。
次いで陽性の雑種細胞を公知の方法、望１しくけ制限希
釈法で一個にし、好適な培地でクローン化する。
釈法で一個にし、好適な培地でクローン化する。
同様にして、生育した細胞クローンの上澄液について抗
体の産生を調べる。
体の産生を調べる。
上述のようにして調製し九本発明のハイブリドーマ細胞
株の好適な単クローン抗体産生に関するスクリーニング
を、例えば酵素イムノアッセイまたは放射性イムノアッ
セイのような通常この目的に使用されるイムノアッセイ
のひとつを使りて行５ことが望ましい。
株の好適な単クローン抗体産生に関するスクリーニング
を、例えば酵素イムノアッセイまたは放射性イムノアッ
セイのような通常この目的に使用されるイムノアッセイ
のひとつを使りて行５ことが望ましい。
酵素イムノアッセイにおいて、前に詳細に性質を示した
ハプテン複合体を最初に固体支持体に吸着させる。残っ
た遊離の結合部位を次いでキャリアー分子で飽和し、ブ
ロックする。
ハプテン複合体を最初に固体支持体に吸着させる。残っ
た遊離の結合部位を次いでキャリアー分子で飽和し、ブ
ロックする。
単クローン抗体を検出するには、上記のハイブリドーマ
細胞株の上澄液一定量をキャリアーに結合したハプテン
複合体と反応させる。
細胞株の上澄液一定量をキャリアーに結合したハプテン
複合体と反応させる。
本発明は更に、前に詳細に性質を述べた本発明のハイブ
リドーマ細胞株またはそのクローンとサブクローンで、
本発明の単クローン抗体を合成し、周囲の培地中に分泌
するものを公知の方法で試験管内！ｆｃＨ生体内で培養
することを特徴とする、単クローン抗体のそれ自体公知
の方法による調製に関する。
リドーマ細胞株またはそのクローンとサブクローンで、
本発明の単クローン抗体を合成し、周囲の培地中に分泌
するものを公知の方法で試験管内！ｆｃＨ生体内で培養
することを特徴とする、単クローン抗体のそれ自体公知
の方法による調製に関する。
本発明のハイブリドーマ細胞の試験管内培養は好適な培
養基、特に例えばダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改良
イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（ＤＭＥＭ）１友はアール
ピーエムアイ（）ｌ、ＰＭＩ ） １６４０培地のよう
な通常使用される標準培地で行い、これを適当に、例え
ば胎仔コウシ典清のよ５な哺乳動物の血清や生育促進添
加物や微量成分で補りてもよい。
養基、特に例えばダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改良
イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（ＤＭＥＭ）１友はアール
ピーエムアイ（）ｌ、ＰＭＩ ） １６４０培地のよう
な通常使用される標準培地で行い、これを適当に、例え
ば胎仔コウシ典清のよ５な哺乳動物の血清や生育促進添
加物や微量成分で補りてもよい。
単クローン抗体の分離は、例えば硫酸アンモニウムを使
用することによｐ１適当なハイブリドーマ培養物の上澄
液から免疫グロブリン画分全沈殿させることから始める
のが望ましい。
用することによｐ１適当なハイブリドーマ培養物の上澄
液から免疫グロブリン画分全沈殿させることから始める
のが望ましい。
次いでこの分野で公知の技術で更に精製に進むが、こｎ
には例えばゲル濾過、イオン交換クロマドグ、５フイー
、デイ−イーエイイー（ＤＥＡＲ）−セルロースクロマ
トグラフィー プロティンエイ（５）または免疫親和ク
ロマトグラフィーのようなりロマトグラフィーの方法が
含１れる。
には例えばゲル濾過、イオン交換クロマドグ、５フイー
、デイ−イーエイイー（ＤＥＡＲ）−セルロースクロマ
トグラフィー プロティンエイ（５）または免疫親和ク
ロマトグラフィーのようなりロマトグラフィーの方法が
含１れる。
しかし、本発明の単クローン抗体は生体内の方法を使う
ことによって大量に得ることができる。
ことによって大量に得ることができる。
例えば、抗体産生ハイブリドーマ細胞クローンを好適な
動物に注射し、その動物で抗体産生＠瘍の生育を誘導す
ることができる。
動物に注射し、その動物で抗体産生＠瘍の生育を誘導す
ることができる。
本発明のひとつの実施態様において、場合により、例え
ばグリスタンのような炭化水素で前処置した雌Ｂａ１ｂ
／ｃマクスに本発明のハイブリドーマ細胞クローンを腹
腔内注射する。
ばグリスタンのような炭化水素で前処置した雌Ｂａ１ｂ
／ｃマクスに本発明のハイブリドーマ細胞クローンを腹
腔内注射する。
ハイブリドーマ細胞クローンの注射後１．乃至３週間し
て腹水を集め、次の処理１で貯蔵する。
て腹水を集め、次の処理１で貯蔵する。
単クローン抗体を前述の試験管内培養した上澄液からの
分離と全く同様にして分離する。
分離と全く同様にして分離する。
本発明は、土壌、空気および水試料並びに、場合により
植物Ｉ之は他の生体付抽出物中の７トラジンおよび／ま
たはアトラジン誘導体および／またはアトラジンおよび
７１食はアトラジン誘導体の不活性な分解産物の検出、
並びに７トラジンおよび／またはアトラジン誘導体をそ
れらの不活性な分解物から分別する従来のイムノアッセ
イのひとつに本発明の抗体を使用することに関する。
植物Ｉ之は他の生体付抽出物中の７トラジンおよび／ま
たはアトラジン誘導体および／またはアトラジンおよび
７１食はアトラジン誘導体の不活性な分解産物の検出、
並びに７トラジンおよび／またはアトラジン誘導体をそ
れらの不活性な分解物から分別する従来のイムノアッセ
イのひとつに本発明の抗体を使用することに関する。
本発明の単クローン抗体を、抗原と相当する単クローン
抗体の特異的結合に基くすべての公知のイムノアッセイ
、例えばラジオイムノアッセイ（アールアイエイＲＩＡ
） 、酵素イムノアッセイ（イーエルアイニスエイＥＬ
ＩＳＡ）、 免疫蛍光試験等に使用することができる
。
抗体の特異的結合に基くすべての公知のイムノアッセイ
、例えばラジオイムノアッセイ（アールアイエイＲＩＡ
） 、酵素イムノアッセイ（イーエルアイニスエイＥＬ
ＩＳＡ）、 免疫蛍光試験等に使用することができる
。
アールアイエイ（ＲＩＡ）試験の場合には、本発明の単
クローン抗体をその１１、または放射性標識誘導体の形
で使用してよい。この関係では、本発明における目的物
質検出に使用されるルＩＡ試験について現在ｌで知られ
ているすべての変法に使用できる。例えば均質または固
相でのアールアイエイ（ＲＩＡ）試験、異質アールアイ
エイ（ＲＩ Ａ ）試験、並びに抗原の直接または間接
（拮抗）検出する単純または二重（サンドイッチ）アー
ルアイエイ（ＲＩＡ）試験等である。
クローン抗体をその１１、または放射性標識誘導体の形
で使用してよい。この関係では、本発明における目的物
質検出に使用されるルＩＡ試験について現在ｌで知られ
ているすべての変法に使用できる。例えば均質または固
相でのアールアイエイ（ＲＩＡ）試験、異質アールアイ
エイ（ＲＩ Ａ ）試験、並びに抗原の直接または間接
（拮抗）検出する単純または二重（サンドイッチ）アー
ルアイエイ（ＲＩＡ）試験等である。
本発明において望ましいのは、アト２ジンおよび／又は
アトラジン誘導体またはそれらのヒドロキシル類似体検
出の拮抗イムノアッセイに本発明の単クローン抗体を使
用することである。
アトラジン誘導体またはそれらのヒドロキシル類似体検
出の拮抗イムノアッセイに本発明の単クローン抗体を使
用することである。
拮抗イムノアッセイの原理は遊離抗原と標識抗原または
固体支持体に結合しているものとの間の、抗体分子の関
係する結合部位に対する競合拮抗に基いている。
固体支持体に結合しているものとの間の、抗体分子の関
係する結合部位に対する競合拮抗に基いている。
この拮抗イムノアッセイを行う二つの可能な方法の間に
原理的に差がある。
原理的に差がある。
ａ）第一の方法は遊離抗原と固体支持体に結合されてい
る抗原との間におけるマーカーを付けた抗体上の遊離結
合部位に対する競合に基づく。この場合、抗原の固体支
持体への結合は直接、またはキャリアー分子を介して起
る。
る抗原との間におけるマーカーを付けた抗体上の遊離結
合部位に対する競合に基づく。この場合、抗原の固体支
持体への結合は直接、またはキャリアー分子を介して起
る。
遊離抗原の濃度は支持体上に固定化された抗原に結合さ
れた標識抗体の減少によシ決定される。
れた標識抗体の減少によシ決定される。
この減少は試料中に含まれる遊離抗原′ＩｋＫ比例する
。
。
ｂ）もうひとつの方法は、この場合は固体支持体に結合
された抗体の関係する結合部位圧対する遊離抗原と標識
抗原間の競合である。
された抗体の関係する結合部位圧対する遊離抗原と標識
抗原間の競合である。
遊離抗原の濃度は標識抗原の減少で決定される。この減
少は遊離抗原濃度の関数として変化する。
少は遊離抗原濃度の関数として変化する。
抗原または抗体を結合するための好適な固体支持体材の
例はマイクロタイタープレートまたは試験管のグラスチ
ック表面、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビ
ニル、ガラスまたはプラスチックでつくられたビーズ表
面、またはｐ紙、デキストラン−セルロースまたはニト
ロセルロース片の、または類似の物質の表面である。支
持体表面を本発明の単クローン抗体または抗原で覆うが
、これは単に吸着、または必要によシ例えばグルタルア
ルデヒドまたは臭化シアノゲンで予じめ支持体材を活性
化した後に支持体へ結合させることができる。
例はマイクロタイタープレートまたは試験管のグラスチ
ック表面、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビ
ニル、ガラスまたはプラスチックでつくられたビーズ表
面、またはｐ紙、デキストラン−セルロースまたはニト
ロセルロース片の、または類似の物質の表面である。支
持体表面を本発明の単クローン抗体または抗原で覆うが
、これは単に吸着、または必要によシ例えばグルタルア
ルデヒドまたは臭化シアノゲンで予じめ支持体材を活性
化した後に支持体へ結合させることができる。
本発明において％に望ましいのは本発明の単クローン抗
体を酵素イムノアッセイ〔イーエルアイニスエイＥＬＩ
ＳＡ （エンザイム リンクド イムノ ンルベント
アッセイｅ ｎ ｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎ
ｏ ５ｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ） ：ｌに使用する
ことである。
体を酵素イムノアッセイ〔イーエルアイニスエイＥＬＩ
ＳＡ （エンザイム リンクド イムノ ンルベント
アッセイｅ ｎ ｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎ
ｏ ５ｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ） ：ｌに使用する
ことである。
この場合、本発明の単クローン抗体をそのまま、または
酵素結合誘導体の形で使用してよい。
酵素結合誘導体の形で使用してよい。
イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析は、本発明の
抗体の酵素結合誘導体の使用、またはそれ自体公知で、
本発明の抗体の抗原決定基を認識して結合する酵素結合
抗体の使用いずれもに基づいている。
抗体の酵素結合誘導体の使用、またはそれ自体公知で、
本発明の抗体の抗原決定基を認識して結合する酵素結合
抗体の使用いずれもに基づいている。
本発明において特に望ましいのは、前述の支持体材のひ
とつが予じめ抗原で被覆されたイーエルアイニスエイ（
ＥＬＩＳＡ）分析を使用することである。次いで、この
支持体と結合した抗原を検出されるべき抗原と本発明の
抗体のひとつを含む試験溶液と反応させる。この場合、
検出されるべき抗原は遊離型であっても、または水また
は土壌試料の成分として存在してもよい。
とつが予じめ抗原で被覆されたイーエルアイニスエイ（
ＥＬＩＳＡ）分析を使用することである。次いで、この
支持体と結合した抗原を検出されるべき抗原と本発明の
抗体のひとつを含む試験溶液と反応させる。この場合、
検出されるべき抗原は遊離型であっても、または水また
は土壌試料の成分として存在してもよい。
１０分間乃至２時間反応させた後、その完全な反応混合
物を本発明の単クローン抗体を認識して結合する酵素標
識抗体と反応させる。この型の酵素標識抗体のひとつの
例はホスファターゼ標識ヤギ抗ヒツジ免疫グロブリン、
または相当するヤギ抗マクス抗体で、いずれも市販され
ている。
物を本発明の単クローン抗体を認識して結合する酵素標
識抗体と反応させる。この型の酵素標識抗体のひとつの
例はホスファターゼ標識ヤギ抗ヒツジ免疫グロブリン、
または相当するヤギ抗マクス抗体で、いずれも市販され
ている。
結合した抗体蛋白質の量は例えば分光法を使って酵素−
基質反応によシ分析する。
基質反応によシ分析する。
同様に本発明において望ましいものは、前述の支持体材
のひとつに結合した抗体に対する標識抗原と遊離抗原の
間の競合に基づくイーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）
分析である。
のひとつに結合した抗体に対する標識抗原と遊離抗原の
間の競合に基づくイーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）
分析である。
この場合、特定の試料中に存在する遊離抗原の量は標識
抗原の減少で決定される。この減少の正確さは試料中に
含れる遊離抗原量の増加と共に高まる。
抗原の減少で決定される。この減少の正確さは試料中に
含れる遊離抗原量の増加と共に高まる。
イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析を行うもうひ
とつの可能な方法は次の方法論的測定を含む： 本発明の抗体のひとつで被覆された前述の支特休のひと
つを検出されるべき抗原を含む被験溶液と反応させる。
とつの可能な方法は次の方法論的測定を含む： 本発明の抗体のひとつで被覆された前述の支特休のひと
つを検出されるべき抗原を含む被験溶液と反応させる。
この後、すべての反応混合物をこの抗原に対するポリク
ローン免疫血清、例えばヒツジ免疫血清と反応させ、ポ
リクローン免疫血清中の結合抗体をこれを認識して結合
する酵素標識抗体を使って明らかにする。結合蛋白質の
量は酵素−基質反応で測定する。
ローン免疫血清、例えばヒツジ免疫血清と反応させ、ポ
リクローン免疫血清中の結合抗体をこれを認識して結合
する酵素標識抗体を使って明らかにする。結合蛋白質の
量は酵素−基質反応で測定する。
この型の勝素標識抗体のひとつの例はホスファターゼ標
識ヤギ抗ヒツジ免疫グロブリンで市販されている。
識ヤギ抗ヒツジ免疫グロブリンで市販されている。
イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析を行うもうひ
とつの可能な方法には１本発明の単クローン抗体で被覆
された前述の支持体材のひとつを被験液と反応させ、次
いで酵素結合率クローン抗体を含む溶液と反応させるこ
とが含まれる。
とつの可能な方法には１本発明の単クローン抗体で被覆
された前述の支持体材のひとつを被験液と反応させ、次
いで酵素結合率クローン抗体を含む溶液と反応させるこ
とが含まれる。
これには酵素結合抗体と異る抗原上の抗原決定基を認識
する遊離の単クローン抗体を必要とする。結合酵素の量
を、例えば目で検出できる色の変化の形で酵素−基質反
応によシ決定できる。この色の変化は被験液中の抗原量
に比例する。
する遊離の単クローン抗体を必要とする。結合酵素の量
を、例えば目で検出できる色の変化の形で酵素−基質反
応によシ決定できる。この色の変化は被験液中の抗原量
に比例する。
更に１本発明の抗体を、その抗体が酵素で標識され、支
持体が本発明の単クローン抗体と異る抗原決定基を認識
する単クローン抗抗原抗体で被覆されているイーエルア
イニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析にも使用できる。
持体が本発明の単クローン抗体と異る抗原決定基を認識
する単クローン抗抗原抗体で被覆されているイーエルア
イニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析にも使用できる。
更に本発明は、アトラジンおよび／またはアトラジン誘
導体の、および／またはアトラジンおよび／またはアト
ラジン誘導体の分解物、特にアトラジンおよび／または
アトラジン誘導体のヒドロキシ類似体、例えばヒドロキ
シアトラジン、ヒドロキシプロパジン、ヒドロキシシマ
ジン等の分析キットの形での定性的および定量的分析の
組成物に関し、この組成物は本発明の単クローン抗体お
よび／またはその誘導体の外に、場合により他の単クロ
ーンまたはポリクローン抗体、特に標識率クローンまた
はポリクローン抗体、並びに他の添加物を含んでいてよ
い。
導体の、および／またはアトラジンおよび／またはアト
ラジン誘導体の分解物、特にアトラジンおよび／または
アトラジン誘導体のヒドロキシ類似体、例えばヒドロキ
シアトラジン、ヒドロキシプロパジン、ヒドロキシシマ
ジン等の分析キットの形での定性的および定量的分析の
組成物に関し、この組成物は本発明の単クローン抗体お
よび／またはその誘導体の外に、場合により他の単クロ
ーンまたはポリクローン抗体、特に標識率クローンまた
はポリクローン抗体、並びに他の添加物を含んでいてよ
い。
本発明において％に望ましいのは、ラジオイムノアッセ
イ、酵素イムノアッセイおよびケミルミネッセンスアッ
セイから成る群から選ばれた通常使用されるイムノアッ
セイのひとつに基づく分析キットである。
イ、酵素イムノアッセイおよびケミルミネッセンスアッ
セイから成る群から選ばれた通常使用されるイムノアッ
セイのひとつに基づく分析キットである。
特別に望ましい分析キットは、アトラジンおよび／また
はアト２ジン誘導体の、および／またはアトラジンおよ
び／またはアトラジン誘導体の分解物、特に例えばヒド
ロキシアトラジン、ヒドロキシプロパジン、ヒドロキシ
シマジン等のようなアトラジンおよび／またはアトラジ
ン誘導体のヒドロキシル類似体の検出が拮抗イムノアッ
セイ、特に酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づい
ているものである。
はアト２ジン誘導体の、および／またはアトラジンおよ
び／またはアトラジン誘導体の分解物、特に例えばヒド
ロキシアトラジン、ヒドロキシプロパジン、ヒドロキシ
シマジン等のようなアトラジンおよび／またはアトラジ
ン誘導体のヒドロキシル類似体の検出が拮抗イムノアッ
セイ、特に酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づい
ているものである。
アトラジンおよび／またはアト２ジン誘導体の、および
／またはアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体の
分解物、特に例えばヒドロキシアトラジン、ヒドロキシ
プロパジン、ヒドロキシジアジン等のようなアトラジン
および／またはアトラジン誘導体のヒドロキシル類似体
の放射性免疫（ラジオイムノ）検出の分析キットには次
の構成物を含む： （ａ） 被覆されていなくて本よいし、また本発明の
抗体のひとつまたは抗原複合体で被覆されていてもよい
好適な支持体材； （ｂ） 本発明の抗体のひとつおよび／またはそれの
放射性標識誘導体の適当な凍結乾燥または濃厚溶液また
は放射性標識抗原または抗原の標識溶液； （ｃ） 緩衝液および （ｄ） 適当なポリペプチド、界面活性剤および例え
ば非特異的吸着および凝集形成を防止する他の添加物、
並びに （ｅ） ピペット、反応容器、計算プロット、パック
挿入物等である。
／またはアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体の
分解物、特に例えばヒドロキシアトラジン、ヒドロキシ
プロパジン、ヒドロキシジアジン等のようなアトラジン
および／またはアトラジン誘導体のヒドロキシル類似体
の放射性免疫（ラジオイムノ）検出の分析キットには次
の構成物を含む： （ａ） 被覆されていなくて本よいし、また本発明の
抗体のひとつまたは抗原複合体で被覆されていてもよい
好適な支持体材； （ｂ） 本発明の抗体のひとつおよび／またはそれの
放射性標識誘導体の適当な凍結乾燥または濃厚溶液また
は放射性標識抗原または抗原の標識溶液； （ｃ） 緩衝液および （ｄ） 適当なポリペプチド、界面活性剤および例え
ば非特異的吸着および凝集形成を防止する他の添加物、
並びに （ｅ） ピペット、反応容器、計算プロット、パック
挿入物等である。
アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体の、および
／またはアト２ジンおよび／ま九はアトラジン誘導体の
分解物、特に例えばヒドロキシアトラジン、ヒドロキシ
プロパジン、ヒドロキシシマジン等のようなアトラジン
および／またはアトラジン誘導体のヒドロキシル類似体
の免疫学的検出で、酵素イムノアッセイイーエルアイエ
スエイ（ＥＬＩＳＡ）Ｋ基づいている分析キットＫＶｉ
、例えば次の構成物が含まれる： （ａ） 被扱されていなくてもよいし、また本発明の
抗体のひとつ、または抗原複合体によって被覆されてい
てもよい好適な支持体材；（ｂ） 本発明の抗体のひ
とつの、および／または、分析すべき抗原または抗原を
認識する抗体に対する第二の酵素標識率クローンまたは
ポリクローン抗体の適当な凍結乾燥または濃厚溶液； （ｃ） 固体または溶解された形Ｏ酵素の基質；（ｅ
） 抗原または抗原の標準溶液；（ｆ） 緩衝液； （ｇ） 適当なポリペプチド、界面活性剤および例え
ば非特異的吸着および凝集形成を防止する他の添加物、
並びＫ （ｈ） ピペット、反応容器、計算プロット、色彩表
、バック挿入物等である。
／またはアト２ジンおよび／ま九はアトラジン誘導体の
分解物、特に例えばヒドロキシアトラジン、ヒドロキシ
プロパジン、ヒドロキシシマジン等のようなアトラジン
および／またはアトラジン誘導体のヒドロキシル類似体
の免疫学的検出で、酵素イムノアッセイイーエルアイエ
スエイ（ＥＬＩＳＡ）Ｋ基づいている分析キットＫＶｉ
、例えば次の構成物が含まれる： （ａ） 被扱されていなくてもよいし、また本発明の
抗体のひとつ、または抗原複合体によって被覆されてい
てもよい好適な支持体材；（ｂ） 本発明の抗体のひ
とつの、および／または、分析すべき抗原または抗原を
認識する抗体に対する第二の酵素標識率クローンまたは
ポリクローン抗体の適当な凍結乾燥または濃厚溶液； （ｃ） 固体または溶解された形Ｏ酵素の基質；（ｅ
） 抗原または抗原の標準溶液；（ｆ） 緩衝液； （ｇ） 適当なポリペプチド、界面活性剤および例え
ば非特異的吸着および凝集形成を防止する他の添加物、
並びＫ （ｈ） ピペット、反応容器、計算プロット、色彩表
、バック挿入物等である。
アト２ジンおよび／またはアトラジン誘導体の、および
／またはアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体の
分解物、！＃に例えばヒドロキシアトラジン、ヒドロキ
シプロパジン、ヒドロキシシマジン等のよりなアトラジ
ンおよび／１７’ｃはアトラジン誘導体のヒドロキシル
類似体の検出で、ケミルミネッセンス（化学冷光）試験
に基づく分析キットにけ、例えば次の構成物が含まれる
： （ａ） 被覆されていなくてもよいし、また本発明の
抗体のひとつまたは抗原複合体で被覆されていてもよい
好適な支持体材； （ｂ） 本発明の抗体のひとつの、および／または本
発明の第一の抗体を認識し、ケミルミネッセンスマーカ
ーに連結される第二のポリクローン抗体の適当な凍結乾
燥または濃厚溶液；（ｅ） 例えばＨ３Ｏ宜およびＮ
ａＯＨのように発光を誘導する成分を含む溶液； （ω 緩衝液； （ｅ） 適当なポリペプチド、界面活性剤および非特
異的吸着および凝集形成を防止する他の添加物、並びＫ （ｆ） ピペット、反応容器、バック挿入物等である
。
／またはアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体の
分解物、！＃に例えばヒドロキシアトラジン、ヒドロキ
シプロパジン、ヒドロキシシマジン等のよりなアトラジ
ンおよび／１７’ｃはアトラジン誘導体のヒドロキシル
類似体の検出で、ケミルミネッセンス（化学冷光）試験
に基づく分析キットにけ、例えば次の構成物が含まれる
： （ａ） 被覆されていなくてもよいし、また本発明の
抗体のひとつまたは抗原複合体で被覆されていてもよい
好適な支持体材； （ｂ） 本発明の抗体のひとつの、および／または本
発明の第一の抗体を認識し、ケミルミネッセンスマーカ
ーに連結される第二のポリクローン抗体の適当な凍結乾
燥または濃厚溶液；（ｅ） 例えばＨ３Ｏ宜およびＮ
ａＯＨのように発光を誘導する成分を含む溶液； （ω 緩衝液； （ｅ） 適当なポリペプチド、界面活性剤および非特
異的吸着および凝集形成を防止する他の添加物、並びＫ （ｆ） ピペット、反応容器、バック挿入物等である
。
本発明において使用できる支持体材は主として、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル
、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリアクリ
ルアミド、ニトロセルロース、架橋デキストラン、フッ
素化樹脂、アガロース、架橋アガロース、多糖等から成
る群から選ばれた不溶性重合体性材を含む。この外に、
例えば、ガラス、金属、ナイロンの網等のような他の材
料も考えられる。
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル
、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリアクリ
ルアミド、ニトロセルロース、架橋デキストラン、フッ
素化樹脂、アガロース、架橋アガロース、多糖等から成
る群から選ばれた不溶性重合体性材を含む。この外に、
例えば、ガラス、金属、ナイロンの網等のような他の材
料も考えられる。
分析キットの製造にしばしば用いられるものは、例えば
ポリ塩化ビニルまたはポリスチレンのような透明なプラ
スチックでつくつ九マイクロタイタープレートで、これ
は被覆されていなくてもよいし、まえ本発明の抗体のひ
とつ、遊離抗原または抗原複合体によシ被覆されていて
もよい。同様に、ポリスチレンおよびポリスチレンラテ
ックスでつくったビーズ、管または棒が使用され、この
場合、周辺のラテックス材は遠心分離によってポリスチ
レン粒子から除き得る。
ポリ塩化ビニルまたはポリスチレンのような透明なプラ
スチックでつくつ九マイクロタイタープレートで、これ
は被覆されていなくてもよいし、まえ本発明の抗体のひ
とつ、遊離抗原または抗原複合体によシ被覆されていて
もよい。同様に、ポリスチレンおよびポリスチレンラテ
ックスでつくったビーズ、管または棒が使用され、この
場合、周辺のラテックス材は遠心分離によってポリスチ
レン粒子から除き得る。
本発明の分析キットのもうひとつの成分は、複合体形成
反応、％に抗原−抗体複合体まｆｃ、はりガント−受容
体複合体を形成するのが望ましい免疫反応の存在を検出
するために使用され得るマーカーまたは指示薬で、検出
すべき抗原について定性的のみならず定量的法論を出し
得るものである。好適なマーカーまたは指示薬は検出さ
れる信号の発生に直接または間接に関与する単一原子お
よび分子である。これらのマーカーまたは指示薬は検出
すべき抗原に、または本発明の単クローン抗体に直接連
結され得るか、または取込まれ得る。また、これらは、
それ自身検出されるべき抗原でもなく本発明の単クロー
ン抗体のひとつでも々く、例えば複合体形成の形で受容
体分子と反応することができるような、単一の物質また
は別の化合物の成分として存在してもよい。
反応、％に抗原−抗体複合体まｆｃ、はりガント−受容
体複合体を形成するのが望ましい免疫反応の存在を検出
するために使用され得るマーカーまたは指示薬で、検出
すべき抗原について定性的のみならず定量的法論を出し
得るものである。好適なマーカーまたは指示薬は検出さ
れる信号の発生に直接または間接に関与する単一原子お
よび分子である。これらのマーカーまたは指示薬は検出
すべき抗原に、または本発明の単クローン抗体に直接連
結され得るか、または取込まれ得る。また、これらは、
それ自身検出されるべき抗原でもなく本発明の単クロー
ン抗体のひとつでも々く、例えば複合体形成の形で受容
体分子と反応することができるような、単一の物質また
は別の化合物の成分として存在してもよい。
別に存在するこれら化合物は単クローンおよびボリク目
−ン起源いずれの第二抗体分子、補体蛋白質またはその
フラグメント、スフフィロコツカス オーレウス プロ
ティンＡ等が望ましい。これらの別の化合物は例えば検
出すべき抗原または本発明の単クローン抗体のような受
容体分子、望ましくは複合体の形で存在する受容体分子
を認識し、特異的にそれに結合する。
−ン起源いずれの第二抗体分子、補体蛋白質またはその
フラグメント、スフフィロコツカス オーレウス プロ
ティンＡ等が望ましい。これらの別の化合物は例えば検
出すべき抗原または本発明の単クローン抗体のような受
容体分子、望ましくは複合体の形で存在する受容体分子
を認識し、特異的にそれに結合する。
多くの場合、更に他の試薬が必要で、その結果、マーカ
ーとの協力罠よってのみ検出できる信号になる。これは
酵素が含まれる場合に％圧そうである。。
ーとの協力罠よってのみ検出できる信号になる。これは
酵素が含まれる場合に％圧そうである。。
本発明において使用できるマーカーまたは指示薬は免疫
学および免疫化学の分野で公知の技術でちる。これらは
、例えば放射性標識元素または物質、Ｓ素または化学発
光物質である。可能性あるマーカーまたは指示薬の下記
の列挙は単に使用できる広範囲の物質や試薬を例示して
いるものでいかなる意味においても本発明の主題を制限
しない。
学および免疫化学の分野で公知の技術でちる。これらは
、例えば放射性標識元素または物質、Ｓ素または化学発
光物質である。可能性あるマーカーまたは指示薬の下記
の列挙は単に使用できる広範囲の物質や試薬を例示して
いるものでいかなる意味においても本発明の主題を制限
しない。
好適なマーカーまたは指示薬の例は放射性元素の群の中
に見い出される。この関係で、特に望ましいこの型の元
素は、例えば１鵞４ Ｉ 、１２８１ 、１！ｌ １ｌ
Ｈｉ 、 ＄ＩＣｒのようなそれ自身でｒ線を出すもの
、あるいは例えば１” Ｃ，ｌ” Ｆ ＃”ＮＯように
ｒ！Ｉ発生を誘導するものである。同様罠、１ｌＪｎ、
１４（：および３Ｈのよう々いわゆるβ線放射物も好適
である。
に見い出される。この関係で、特に望ましいこの型の元
素は、例えば１鵞４ Ｉ 、１２８１ 、１！ｌ １ｌ
Ｈｉ 、 ＄ＩＣｒのようなそれ自身でｒ線を出すもの
、あるいは例えば１” Ｃ，ｌ” Ｆ ＃”ＮＯように
ｒ！Ｉ発生を誘導するものである。同様罠、１ｌＪｎ、
１４（：および３Ｈのよう々いわゆるβ線放射物も好適
である。
他の好適なマーカーには化学発光物質、特に螢光物質が
含まれ、抗原に対し、また変性なしに抗体に非常に容易
に化学的に結合させることができる。得られた螢光色素
体は螢光分光法によシ非常に簡単に検出できる。この点
で特に挙げられる螢光色素体はフルオレセイン イソシ
アネート、フルオレセイン イソチオシアネート、５−
ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル クロリド
、テトラメテルロダミンインテオシアネート、リサミン
、ロダミン８２００スルホニル クロリド等からなる群
から選ばれたものである。
含まれ、抗原に対し、また変性なしに抗体に非常に容易
に化学的に結合させることができる。得られた螢光色素
体は螢光分光法によシ非常に簡単に検出できる。この点
で特に挙げられる螢光色素体はフルオレセイン イソシ
アネート、フルオレセイン イソチオシアネート、５−
ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル クロリド
、テトラメテルロダミンインテオシアネート、リサミン
、ロダミン８２００スルホニル クロリド等からなる群
から選ばれたものである。
それ以上の螢光剤並びに分析法の記載はトルカ「免疫螢
光分析」：道具としての抗体、力−カロニス等、ジ１ン
ワイリー アンド サンズ リミテッド １８９−２
５１頁（１９８２年）（ＤｅＬｕｅａ ＠Ｉｍｎｕｎｏ
ｆｌｑｏｒｅｓｅｅｎｅｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”ｌｎ：
Ａｎｔ１ｂｏｄ７ Ａｓ ａ Ｔｏｏｌ、Ｍａｒｅｈａ
ｌｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ、 。
光分析」：道具としての抗体、力−カロニス等、ジ１ン
ワイリー アンド サンズ リミテッド １８９−２
５１頁（１９８２年）（ＤｅＬｕｅａ ＠Ｉｍｎｕｎｏ
ｆｌｑｏｒｅｓｅｅｎｅｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”ｌｎ：
Ａｎｔ１ｂｏｄ７ Ａｓ ａ Ｔｏｏｌ、Ｍａｒｅｈａ
ｌｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ、 。
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ、Ｌｔｄ、 、ｐ
ｐ １８９−２３Ｄ Ｉ ９８２））に見られる。
ｐ １８９−２３Ｄ Ｉ ９８２））に見られる。
本発明において特に望ましいものは、例えばワサビ ペ
ルオキシダーゼ、アルカリ ホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、グルコース オキシダーゼ、グルコ
アミラーゼ、カルボニック アンヒトラーゼ、アセチル
コリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルコース−６−ホス７エートテヒドロゲナー
ゼ等のような酵素を、マーカーまたは指示薬物質として
使用することである。酵素をマーカー物質として使用す
る時には、酵素活性によシ追跡されるべき免疫複合体の
形成を行わせる別な試薬、並びに、適歯に酵素反応を停
止できる停止薬を加える必要がある。
ルオキシダーゼ、アルカリ ホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、グルコース オキシダーゼ、グルコ
アミラーゼ、カルボニック アンヒトラーゼ、アセチル
コリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルコース−６−ホス７エートテヒドロゲナー
ゼ等のような酵素を、マーカーまたは指示薬物質として
使用することである。酵素をマーカー物質として使用す
る時には、酵素活性によシ追跡されるべき免疫複合体の
形成を行わせる別な試薬、並びに、適歯に酵素反応を停
止できる停止薬を加える必要がある。
この関係で特に望ましいものは、色素反応となる試薬で
ある。ワサビ ペルオキシダーゼの場合には、この点で
挙げられるのは、例えば過酸化水素で、これは例えばジ
アミノベンゼンまたはローフェニレンジアミンのような
酸化され九染料前駆体と組合せると褐色または黄色を示
す。グルコース オキシダーゼをマーカー物質として使
用する場合ＫＦｉ、例えば２．２′−アジノージ（Ｓ−
エチル−ベンゾテアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴ
Ｓ）を基質として使う。
ある。ワサビ ペルオキシダーゼの場合には、この点で
挙げられるのは、例えば過酸化水素で、これは例えばジ
アミノベンゼンまたはローフェニレンジアミンのような
酸化され九染料前駆体と組合せると褐色または黄色を示
す。グルコース オキシダーゼをマーカー物質として使
用する場合ＫＦｉ、例えば２．２′−アジノージ（Ｓ−
エチル−ベンゾテアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴ
Ｓ）を基質として使う。
したがって、本発明は更に、アトラジンおよび／または
アトラジン誘導体の、および／またはアトラジンおよび
／またはアトラジン誘導体の分解物、特に例えばヒドロ
キシアトラジン、ヒドロキシプロパジン、ヒドロキシシ
マジン等のようなアト２ジンおよび／またはアトラジン
誘導体のヒドロキシル類似体の迅速で効率的、定性的訃
よび／または定量的検出、並びにアトラジンおよび／ま
たはアト２ジン誘導体をそれらの分解物から分別するた
めの試薬として本発明の単クローン抗体の少くともひと
つを含む分析キットの使用に関する。
アトラジン誘導体の、および／またはアトラジンおよび
／またはアトラジン誘導体の分解物、特に例えばヒドロ
キシアトラジン、ヒドロキシプロパジン、ヒドロキシシ
マジン等のようなアト２ジンおよび／またはアトラジン
誘導体のヒドロキシル類似体の迅速で効率的、定性的訃
よび／または定量的検出、並びにアトラジンおよび／ま
たはアト２ジン誘導体をそれらの分解物から分別するた
めの試薬として本発明の単クローン抗体の少くともひと
つを含む分析キットの使用に関する。
■、非制限的実施例
実施例１
アトラジン／ヒドロキシアトラジン複合体の合成
１．１トリアジニル一バレリアン酸カツプリング成分
ａ）２−クロロ−４−インプロピルアミノ−６−（１−
カルボキシブチル−４−アミン）１−トリアジン ジアゾビシクロｃ ａ４ｏ ）ウンデク−５−工：ｙ１
５．６６ｄをムロ−ジクロロ−４−イソプロピルアミノ
−ｇ−）リアジン１α５Ｓ１ｐと５−アミノハレリアン
酸＆１５Ｆの乾燥クロロホルＡ１５０ｄ中の混合物に加
え、反応溶液をリフラックス温度で１時間攪拌し、真空
乾燥する（室温）。
カルボキシブチル−４−アミン）１−トリアジン ジアゾビシクロｃ ａ４ｏ ）ウンデク−５−工：ｙ１
５．６６ｄをムロ−ジクロロ−４−イソプロピルアミノ
−ｇ−）リアジン１α５Ｓ１ｐと５−アミノハレリアン
酸＆１５Ｆの乾燥クロロホルＡ１５０ｄ中の混合物に加
え、反応溶液をリフラックス温度で１時間攪拌し、真空
乾燥する（室温）。
油状残渣を２Ｎ塩酸６０ｄと０℃で攪拌し、２時間放置
後、沈殿を戸別して水およびジエチルエーテルで洗い、
乾燥する。目的物質の２−クロロ−４−イソプロピルア
ミ／−６−（１−カルボキシブチル−４−アミン）−Ｓ
−）リアジン（融点１９１−１９２℃）４５Ｆを得た。
後、沈殿を戸別して水およびジエチルエーテルで洗い、
乾燥する。目的物質の２−クロロ−４−イソプロピルア
ミ／−６−（１−カルボキシブチル−４−アミン）−Ｓ
−）リアジン（融点１９１−１９２℃）４５Ｆを得た。
ｂ）２−ヒドロキシ−４−イソプロピルアミノ−６−（
１−カルボキシブチル−４−アミン）−Ｂ−トリアジン
・塩酸 ２−クロロ−４−イソプロピルアミノ−６−（１−カル
ボキシブチル−４−アミン）−Ｓ−トリアジン１Ｐを６
Ｎ塩酸７ｄ中、室温で４時間攪拌し、４５℃で減圧濃縮
する。結晶を戸別して乾燥する。目的物質２−ヒドロキ
シ−４−イノプロピルアミノ−６−（１−カルボキシブ
チル−４−７ミノ）−Ｓ−）リアジン（融点［４９−，
１５１℃）（１５）８ｙを得た。
１−カルボキシブチル−４−アミン）−Ｂ−トリアジン
・塩酸 ２−クロロ−４−イソプロピルアミノ−６−（１−カル
ボキシブチル−４−アミン）−Ｓ−トリアジン１Ｐを６
Ｎ塩酸７ｄ中、室温で４時間攪拌し、４５℃で減圧濃縮
する。結晶を戸別して乾燥する。目的物質２−ヒドロキ
シ−４−イノプロピルアミノ−６−（１−カルボキシブ
チル−４−７ミノ）−Ｓ−）リアジン（融点［４９−，
１５１℃）（１５）８ｙを得た。
１．２ ）リアジン−蛋白質複合体
トリアジンおよびヒドロキシトリアジン誘導体ｔウシ血
清アルブミン（ビーニスエイＢＳＡ；フルカＦ１ｕｋ＆
社）ｔたはキーホールリムペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌ
ｉｍｐｅｔ ）ヘモシアニン（ケイエルエイテＫＬＨｉ
カルビオケムＣａｌｂｉｏｅｈｅｍ社）のいずれへも活
性化エステル法（カルカルニ等Ｋｕｌｋａｒ−ｎｉ ｅ
ｔ、ａｌ、、１９８１年）を使ッテ結合すセル。
清アルブミン（ビーニスエイＢＳＡ；フルカＦ１ｕｋ＆
社）ｔたはキーホールリムペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌ
ｉｍｐｅｔ ）ヘモシアニン（ケイエルエイテＫＬＨｉ
カルビオケムＣａｌｂｉｏｅｈｅｍ社）のいずれへも活
性化エステル法（カルカルニ等Ｋｕｌｋａｒ−ｎｉ ｅ
ｔ、ａｌ、、１９８１年）を使ッテ結合すセル。
これＫは室温でＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（デイ−
エムエフＤＭＦ）に可溶化しく４ｖ／２００μｌ）、次
いで４モル過剰のα−ヒドロキシスクシンイミド（９，
１９／２０ＧμりおよびＮ、ｖ−ジシクロへキシルカル
ボジイミド（１６ツ／２００μｌ）を加えて誘導体のカ
ルボキシル基を特異的に行う。
エムエフＤＭＦ）に可溶化しく４ｖ／２００μｌ）、次
いで４モル過剰のα−ヒドロキシスクシンイミド（９，
１９／２０ＧμりおよびＮ、ｖ−ジシクロへキシルカル
ボジイミド（１６ツ／２００μｌ）を加えて誘導体のカ
ルボキシル基を特異的に行う。
反応で形成した沈殿を１２，０００Ｆ、室温で３分間の
遠心分離で除き、この活性化されたエステルを予じめリ
ン酸緩衝化食塩溶液（ビービーニスＰＢＳ緩衝液）Ｋ溶
解したビーニスエイ（ＢＳＡ）またはケイエルエイチ（
ＫＬＨ）Ｋ加える。〔誘導体〕／〔ビーニスエイＢＳＡ
’）のモル比は、この場合約５５／１（誘導体２４グ／
ビーニスエイ（ＢＳＡ）翫４ｄ）である。
遠心分離で除き、この活性化されたエステルを予じめリ
ン酸緩衝化食塩溶液（ビービーニスＰＢＳ緩衝液）Ｋ溶
解したビーニスエイ（ＢＳＡ）またはケイエルエイチ（
ＫＬＨ）Ｋ加える。〔誘導体〕／〔ビーニスエイＢＳＡ
’）のモル比は、この場合約５５／１（誘導体２４グ／
ビーニスエイ（ＢＳＡ）翫４ｄ）である。
４℃の温度で４時間放置した後、°生じた沈殿をｚｏｏ
ｏＰ、４℃で１０分間の遠心分離で除く。
ｏＰ、４℃で１０分間の遠心分離で除く。
残った上澄液を次の感作実験に使用する前に十分にビー
ビーニス（ＰＢＳ）緩衝液に対して透析する。
ビーニス（ＰＢＳ）緩衝液に対して透析する。
カップリング反応の程度をニスデイ−ニス（ＳＤＳ）ゲ
ル電気泳動と吸収分光法で測定する。ヒドロキシアトラ
ジンまたはアトラジンのビーニスエイ（ＢＳＡ）Ｋ対す
るモル比は約１１：１である。
ル電気泳動と吸収分光法で測定する。ヒドロキシアトラ
ジンまたはアトラジンのビーニスエイ（ＢＳＡ）Ｋ対す
るモル比は約１１：１である。
実施例２
感作
１群５匹の雌、４から６週令のＢＡＬＢ／ｅ マクス（
シセルン アニマル ファーム、スイス５ｌｓｓｅｌｎ
ａｎｉｍａｌ ｆａｒｍ、５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ
） Ｋ ＫＬＨ結合アトラジンまたはヒドロキシアトラ
ジン（５０μＰ／注射）を腹腔内または皮下注射の５シ
リーズで投与する。
シセルン アニマル ファーム、スイス５ｌｓｓｅｌｎ
ａｎｉｍａｌ ｆａｒｍ、５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ
） Ｋ ＫＬＨ結合アトラジンまたはヒドロキシアトラ
ジン（５０μＰ／注射）を腹腔内または皮下注射の５シ
リーズで投与する。
最初の注射は完全フロイント アジユバント（Ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ！ ａｄｊｕｖａｎｔ ） １
）ｄと１：１の比で混合したＰＢＳ溶解複合体（Ｌｌｄ
を含む。
ｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ！ ａｄｊｕｖａｎｔ ） １
）ｄと１：１の比で混合したＰＢＳ溶解複合体（Ｌｌｄ
を含む。
この注射溶液の５０μ）を腹腔内に、残シの１５０μノ
を皮下に注射する。
を皮下に注射する。
第二および第三の注射のシリーズは最初の投与後１４お
よび３０日和それぞれ行い、完全フロイント アジユバ
ントを不完全に代える。
よび３０日和それぞれ行い、完全フロイント アジユバ
ントを不完全に代える。
最後の注射から１週間後罠、実験動物から血清を採シ、
イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析によシ血中タ
イターを測定する。この際、マイクロタイタープレート
は予じめＢＳＡ結合ハブテンで被覆した（実施例６参照
）。
イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析によシ血中タ
イターを測定する。この際、マイクロタイタープレート
は予じめＢＳＡ結合ハブテンで被覆した（実施例６参照
）。
２月間の休止の後、ケイエルエイチ（ＫＬＨ）複合体を
５００μＰ／２００μ！ビービーニス（ＰＢＳ）の用量
で１回腹腔内注射する。
５００μＰ／２００μ！ビービーニス（ＰＢＳ）の用量
で１回腹腔内注射する。
実施例５
融合手順
の獲得
約６乃至８退会の未処理ビーエイエルビー／シー（Ｂａ
１ｂ／ｅ）マウスを融合予定日の前日圧殺し、７０％ア
ルコールに浸漬して殺菌する。
１ｂ／ｅ）マウスを融合予定日の前日圧殺し、７０％ア
ルコールに浸漬して殺菌する。
次いで無菌的に毛皮および上部腹部皮ふを腹膜に傷付け
ないよう圧して切開する。殺菌した５ｄプラスチツク注
射器と殺菌した１８ゲージの注射針な使ってビーニスニ
ス（ＢＳＳ）４ｍｌ（Ｃａ およびＭｇ！＋を含まな
い）と空気１ｄを腹腔内に注射する。
ないよう圧して切開する。殺菌した５ｄプラスチツク注
射器と殺菌した１８ゲージの注射針な使ってビーニスニ
ス（ＢＳＳ）４ｍｌ（Ｃａ およびＭｇ！＋を含まな
い）と空気１ｄを腹腔内に注射する。
腹部をやさしくマツサージしく注射器と針は腹腔に残し
てオく）、次いで先に注射したビーニスニス（ＢＳＳ）
緩衝液を腹膜から吸上げ、殺菌ファルコン（Ｆａｌｃｏ
ｎ ）管に入れる。この手順を２回以上繰返す。このよ
うにして得たマクロファージｔ 水冷し、ビーニスニス
（ＢＳＳ）２０ｄで２回洗う。
てオく）、次いで先に注射したビーニスニス（ＢＳＳ）
緩衝液を腹膜から吸上げ、殺菌ファルコン（Ｆａｌｃｏ
ｎ ）管に入れる。この手順を２回以上繰返す。このよ
うにして得たマクロファージｔ 水冷し、ビーニスニス
（ＢＳＳ）２０ｄで２回洗う。
マクロ７アージを３００ｐ、５℃の温度で１０分間遠心
分離する。ベレットを５０−のエイチェイティー（ＨＡ
Ｔ）培地に再懸濁し、この細胞懸濁液を全部で２４穴持
つ４個のコスタ−（Ｃｏｓ−ｔａｒ ）プレートに分注
する（（Ｌｅａｄ／穴）にのよう圧して調製したマクロ
ファージを５７℃の温度６ＳのＣＯ鵞濃度で保存する。
分離する。ベレットを５０−のエイチェイティー（ＨＡ
Ｔ）培地に再懸濁し、この細胞懸濁液を全部で２４穴持
つ４個のコスタ−（Ｃｏｓ−ｔａｒ ）プレートに分注
する（（Ｌｅａｄ／穴）にのよう圧して調製したマクロ
ファージを５７℃の温度６ＳのＣＯ鵞濃度で保存する。
約４ｘ１０’マクロフアージを各融段階で必要とする。
このミエローマ細１株エスピー２１０−エイジ” ”
（Ｓｐ２１０−Ａｇ １４ ）はそれ自体いかなる抗体
も分泌しないミエローマ細胞株でエム、シェルマン等Ｍ
−Ｓｈｕｌｍａｎ ｅｔ、 ａｔ、 （１９７８年）ニ
ヨッて記載されている。このミエローマ細胞株ハロツク
ビルメリーランドのアメリカン タイプ カルチャーコ
レクシ目ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｉｎ Ｒｏｅｋｖｉ１）ｅ
、Ｍａｒ７１ａｎｄ ）から入手出来る。
（Ｓｐ２１０−Ａｇ １４ ）はそれ自体いかなる抗体
も分泌しないミエローマ細胞株でエム、シェルマン等Ｍ
−Ｓｈｕｌｍａｎ ｅｔ、 ａｔ、 （１９７８年）ニ
ヨッて記載されている。このミエローマ細胞株ハロツク
ビルメリーランドのアメリカン タイプ カルチャーコ
レクシ目ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｉｎ Ｒｏｅｋｖｉ１）ｅ
、Ｍａｒ７１ａｎｄ ）から入手出来る。
少くとも１０００万細胸を含むよく生育した培養５０７
が各融合に必要である。ミエローマ細抱ヲＴ１７５７ア
ルコン フラスコ（ベクトンアンド ディッキンソン社
Ｂｅｅｋｔｏｎ ＆ Ｄｉｅｋｅｎｓｏｎ）で培養する
ことが望ましい。
が各融合に必要である。ミエローマ細抱ヲＴ１７５７ア
ルコン フラスコ（ベクトンアンド ディッキンソン社
Ｂｅｅｋｔｏｎ ＆ Ｄｉｅｋｅｎｓｏｎ）で培養する
ことが望ましい。
融合の一日前Ｋ、培養培地（アールビーエムアイＲＰＭ
Ｉ １６４Ｇ）を新鮮なアールビーエムアイ（ＲｐＭ
Ｉ）１ｉ４ｏ培地で交換する。〜融合の日にエスピー２
１０−エイジ−１４０ＳＰ２１０−Ａｇ１４）細胞を集
め、殺菌したＳｏｄプラスチック管に入れて３００７．
５℃の温度で１０分間遠心分離する（エムニスイーＭＳ
Ｅ遠心分離器、モデルテｋ１．ビン、英国、ｍｏｄｅｌ
Ｃｈｉｌｓｐｉｎ 、 ＵＫ）。
Ｉ １６４Ｇ）を新鮮なアールビーエムアイ（ＲｐＭ
Ｉ）１ｉ４ｏ培地で交換する。〜融合の日にエスピー２
１０−エイジ−１４０ＳＰ２１０−Ａｇ１４）細胞を集
め、殺菌したＳｏｄプラスチック管に入れて３００７．
５℃の温度で１０分間遠心分離する（エムニスイーＭＳ
Ｅ遠心分離器、モデルテｋ１．ビン、英国、ｍｏｄｅｌ
Ｃｈｉｌｓｐｉｎ 、 ＵＫ）。
遠心分離後、上澄液を捨てる。細胞を各回約５０ｒｄビ
ーニスニス（ＢＳＳ）緩衝液（Ｃａ”＋およびＭｇ”＋
を含まない）で２回洗い（５℃、５００りで１０分間）
、Ｓｄのビーニスニス（ＢＳＳ）Ｋ再懸濁する。
ーニスニス（ＢＳＳ）緩衝液（Ｃａ”＋およびＭｇ”＋
を含まない）で２回洗い（５℃、５００りで１０分間）
、Ｓｄのビーニスニス（ＢＳＳ）Ｋ再懸濁する。
この細胞懸濁液の一部を細胞数測定のために取り、フル
オレセイン ジアセテート（エフデイ−エイＦＤＡ）で
染色する。ミエローマ細胞を使用するまで水中で保存す
る。
オレセイン ジアセテート（エフデイ−エイＦＤＡ）で
染色する。ミエローマ細胞を使用するまで水中で保存す
る。
五５ 膵臓細胞懸濁液の調製
実施例２におけるよう圧して予じめ感作したＢａ１ｂ／
ｃマウスから膵臓を無菌条件下、氷で冷却しながら取り
出す。
ｃマウスから膵臓を無菌条件下、氷で冷却しながら取り
出す。
予じめ感作したビーエイエルビー／シー（Ｂａ１ｂ／ｅ
）マウスを断頭して殺し、無菌条件下で膵臓を取シ出す
。このため、マウスを短時間７０チエタノールに浸漬し
、殺菌した器具で解剖する。膵臓を注意して取）出し、
細かいナイロン メッシュ上に置く、そこでハサミを使
って細かく刻み、５ｄ注射器のプランジャーを使って注
意しながら、細胞に多くの障害を与えないようにしてメ
ツシュを押し通す。この操作中、メッシユはＢＳＳです
すぐ。
）マウスを断頭して殺し、無菌条件下で膵臓を取シ出す
。このため、マウスを短時間７０チエタノールに浸漬し
、殺菌した器具で解剖する。膵臓を注意して取）出し、
細かいナイロン メッシュ上に置く、そこでハサミを使
って細かく刻み、５ｄ注射器のプランジャーを使って注
意しながら、細胞に多くの障害を与えないようにしてメ
ツシュを押し通す。この操作中、メッシユはＢＳＳです
すぐ。
このようにして得た細胞懸濁液を５０１Ｌｌプラスチツ
ク管に入れ、５００Ｆ、５℃の温度で１０分関連心分離
するエムイーニス（ＭＥＳ）遠心分離器モデル チルス
ピンＣｈｉｌｓｐｉｎ ：英国ＵＫ）。
ク管に入れ、５００Ｆ、５℃の温度で１０分関連心分離
するエムイーニス（ＭＥＳ）遠心分離器モデル チルス
ピンＣｈｉｌｓｐｉｎ ：英国ＵＫ）。
次いで細胞を各回２０ｄのＢＳＳで２回洗い（１０分間
； ！１００ＰＨ５℃；エムイーニス（ＭＥＳ）チルス
ピン）、遠心分離後、細胞ベレットを１０ｄのビーニス
ニス（ＢＳＳ）Ｋ再懸濁する。
； ！１００ＰＨ５℃；エムイーニス（ＭＥＳ）チルス
ピン）、遠心分離後、細胞ベレットを１０ｄのビーニス
ニス（ＢＳＳ）Ｋ再懸濁する。
エスピー２１０−エイジ−１４（Ｓｐ ２１０−Ａｇ
１４ ）ミエローマ細胞との融合まで膵臓細胞を氷上に
置いておく。
１４ ）ミエローマ細胞との融合まで膵臓細胞を氷上に
置いておく。
融合のための肺臓細胞九対するミエローマ細胞の比は１
：１０にしなければならない。
：１０にしなければならない。
膵臓細胞（ビーニスニスＢＳＳ緩衝液中）とエスピーｚ
７ａ−ｘイジー１４ （ＳＰ２１０−Ａｇ１４）ミエロ
ーマ細胞（ビーニスニスＢＳＳ緩衝液中）を上記の比で
混合し、５００Ｆ、５℃の温度で１０分間、遠心分離す
るエムイーニス（ＭＳＥ遠心分離器、モデル チルスピ
ンＣｈｉｌｓｐｉｎ ）。
７ａ−ｘイジー１４ （ＳＰ２１０−Ａｇ１４）ミエロ
ーマ細胞（ビーニスニスＢＳＳ緩衝液中）を上記の比で
混合し、５００Ｆ、５℃の温度で１０分間、遠心分離す
るエムイーニス（ＭＳＥ遠心分離器、モデル チルスピ
ンＣｈｉｌｓｐｉｎ ）。
ベレットをビーニスニス（ＢＳＳ） 緩１ｉ液にもう一
度再懸濁し、懸濁液を再度遠心分離する。
度再懸濁し、懸濁液を再度遠心分離する。
ペレットを注意して攪拌し、５７℃の温浴中に置く。次
、いで予じめ温め、殺菌したビーイージー（ＰＥＧ）４
００（メルク社Ｍ Ｅ ＲＣＫ ） １ ａｔを６０
秒かけて滴下しながら細胞に加える。この間、混合物全
体を常に、Ｌかしやさしく攪拌する。次いで細胞を更［
３０秒間攪拌し、予じめ温めたビーニスニス（ＢＳＳ）
緩衝液（Ｃａ とＭｇ を含まず）５ｄを同様に攪
拌しつづけながら約５分間かけて滴下して加える。
、いで予じめ温め、殺菌したビーイージー（ＰＥＧ）４
００（メルク社Ｍ Ｅ ＲＣＫ ） １ ａｔを６０
秒かけて滴下しながら細胞に加える。この間、混合物全
体を常に、Ｌかしやさしく攪拌する。次いで細胞を更［
３０秒間攪拌し、予じめ温めたビーニスニス（ＢＳＳ）
緩衝液（Ｃａ とＭｇ を含まず）５ｄを同様に攪
拌しつづけながら約５分間かけて滴下して加える。
このよう圧して融合した細胞を遠心分離しく１０分間；
５００ｙ；２０ ℃、エムイーニスＭＥＳ 遠心分離
器、モデル チルスピン）、上澄液を捨て去る。細胞ベ
レットを５０ｄのエイテエイティー（ＨＡＴ）培地に再
懸濁し、このようにして得られ九細胸懸濁液を４枚の準
備したコスタ−プレートに分注する（２４大のマイクロ
タイター プレート、各人（ウェル）の直径２４ ｓｓ
；細胞生育のための総面積ｚｏ、４）（（Ｌ５ｓｕ／
穴）。
５００ｙ；２０ ℃、エムイーニスＭＥＳ 遠心分離
器、モデル チルスピン）、上澄液を捨て去る。細胞ベ
レットを５０ｄのエイテエイティー（ＨＡＴ）培地に再
懸濁し、このようにして得られ九細胸懸濁液を４枚の準
備したコスタ−プレートに分注する（２４大のマイクロ
タイター プレート、各人（ウェル）の直径２４ ｓｓ
；細胞生育のための総面積ｚｏ、４）（（Ｌ５ｓｕ／
穴）。
コスタ−プレートを５７℃の温度、６％のＣＯ意濃度に
置く。
置く。
実施例４
雑種細胞の培養
細胞融合１日後Ｋ、１１Ｌｌのエイテエイティ−（ＨＡ
Ｔ）培地を培養プレートの各人に加える。
Ｔ）培地を培養プレートの各人に加える。
細胞融合から３乃至４日後に融合した細胞を顕微鏡下で
調べる。同様に使用した培地を吸い取り出し、新鮮なエ
イテエイティー（ＨＡＴ）培地１ｄＫ代える。更に５日
後（細胞融合から６−７日後）、培地を再び交換する。
調べる。同様に使用した培地を吸い取り出し、新鮮なエ
イテエイティー（ＨＡＴ）培地１ｄＫ代える。更に５日
後（細胞融合から６−７日後）、培地を再び交換する。
細胞培養後７乃至１０日にわたって各人について雑種細
胞を顕微鏡下に走査する。培地を２乃至３×週で更新す
る。
胞を顕微鏡下に走査する。培地を２乃至３×週で更新す
る。
大中で雑種細胞が生育すると直ちＫ、そのエイテエイテ
ィ−（ＡＨＴ）培地をエイチティー（ＨＴ）培地に置換
する。洗浄した雌株細胞培養の上澄液を殺菌したバスト
ラール ピペットで取シ出しく少くとも穴の１０％）、
抗体の存在を調べる。
ィ−（ＡＨＴ）培地をエイチティー（ＨＴ）培地に置換
する。洗浄した雌株細胞培養の上澄液を殺菌したバスト
ラール ピペットで取シ出しく少くとも穴の１０％）、
抗体の存在を調べる。
穴に陽性の雑種細胞コロニーが完全に生育し九ら直ちに
新しいコスタ−プレートのアールビーエムアイ（ＲＰＭ
Ｉ）１６４０培地中に移してよいが、完全に生育してい
る穴の内容物を２乃至３の新しい穴に分注するようにす
る。
新しいコスタ−プレートのアールビーエムアイ（ＲＰＭ
Ｉ）１６４０培地中に移してよいが、完全に生育してい
る穴の内容物を２乃至３の新しい穴に分注するようにす
る。
実施例５
陽性であった穴の細胞をピペットを使ってはがし、試験
管のＩＩＩｊの培地中に移す。細胸数を計測するために
一部を取ってエフデイエイ（ＦＤＡ ）（エフデイ−エ
イＦＤＡで１ ：２の希釈：細、＠５０μ！＋染料液５
ｏｊ１ｊ）で染色する。望ましい細胞数は１０１乃至ｔ
ＯＳ細胞／ｄである。
管のＩＩＩｊの培地中に移す。細胸数を計測するために
一部を取ってエフデイエイ（ＦＤＡ ）（エフデイ−エ
イＦＤＡで１ ：２の希釈：細、＠５０μ！＋染料液５
ｏｊ１ｊ）で染色する。望ましい細胞数は１０１乃至ｔ
ＯＳ細胞／ｄである。
次いで雑種細胞をエイチティ＝（ＨＴ）培地で１ 二１
００Ｃ）比で希釈する（例えば細胞１００μ！＋エイチ
テイー（ＨＴ）培地９．９ｄ）。
００Ｃ）比で希釈する（例えば細胞１００μ！＋エイチ
テイー（ＨＴ）培地９．９ｄ）。
２本の５０ｍ１フアルコン チェープの各々に２５ｄの
エイテティー（ＨＴ）培地を入れ、５ ｍｌのマクロフ
ァージ懸濁液を加えて全量３０ｄにする。マクロファー
ジは予じめマウスから分離し、１０ｄのエイチティー（
ＨＴ）培地に再懸濁する（実施例五１参照）。
エイテティー（ＨＴ）培地を入れ、５ ｍｌのマクロフ
ァージ懸濁液を加えて全量３０ｄにする。マクロファー
ジは予じめマウスから分離し、１０ｄのエイチティー（
ＨＴ）培地に再懸濁する（実施例五１参照）。
雑楓細胞をこのマクロファージを含むファルコン チュ
ーブ中で（１） ２７０細胞／３０−または（ＩＩ）９
０細胞７ｓｏｔｔの細胞濃度になるように希釈する。こ
れらの混合液をコスヌー プレート（９６大のマイクロ
タイター プレート）に各氏に２００μ！加えるより圧
して分注する。これは（１） ｔ ８細胞／穴またｔｉ
１））α６細胞／穴の細胞数に相当する。したがって各
希釈Ｋｔ５マイクロタイター プレートが必要になる。
ーブ中で（１） ２７０細胞／３０−または（ＩＩ）９
０細胞７ｓｏｔｔの細胞濃度になるように希釈する。こ
れらの混合液をコスヌー プレート（９６大のマイクロ
タイター プレート）に各氏に２００μ！加えるより圧
して分注する。これは（１） ｔ ８細胞／穴またｔｉ
１））α６細胞／穴の細胞数に相当する。したがって各
希釈Ｋｔ５マイクロタイター プレートが必要になる。
７日後に、各氏を顕微鏡下で調べ、細胞クローンを含む
穴を明らかにする。イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ
）分析には約５０−の穴が細胞クローンを含むような希
釈を行う。このためには一般にα６細胞／穴の希釈をす
べきである。
穴を明らかにする。イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ
）分析には約５０−の穴が細胞クローンを含むような希
釈を行う。このためには一般にα６細胞／穴の希釈をす
べきである。
約７−１０日後に、陽性の穴（クローンを含む）の上澄
液について単クローン抗体が存在するかどうかをイーエ
ルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析で調べる。そして、
陽性のクローンをコスタ−プレート（２４穴のもの）を
使いアールビーエムアイ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中で
生育させる。
液について単クローン抗体が存在するかどうかをイーエ
ルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析で調べる。そして、
陽性のクローンをコスタ−プレート（２４穴のもの）を
使いアールビーエムアイ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中で
生育させる。
これらの陽性のクローンの一部を液体窒素中で保存する
。
。
実施例６
ｊ［１１）Ｋ、ビーニスエイ（ＢＳＡ）結合ノ翫ブテン
の炭酸緩衝液（５０ｍＭ 、 ｐＨ９，６）溶液ｔｏｏ
μｚをマイクロタイター プレートの各氏に入れて、こ
れを４℃で湿度を与えた槽内に１夜置く。次いで、穴を
（Ｌ１％ ＰＢＳ−）會イーン（Ｔｗｅｅｎ）緩衝液で
５回洗浄する。
の炭酸緩衝液（５０ｍＭ 、 ｐＨ９，６）溶液ｔｏｏ
μｚをマイクロタイター プレートの各氏に入れて、こ
れを４℃で湿度を与えた槽内に１夜置く。次いで、穴を
（Ｌ１％ ＰＢＳ−）會イーン（Ｔｗｅｅｎ）緩衝液で
５回洗浄する。
マイクロタイタープレートの使用されていない結合部位
をふさぐために、２００μノのビービーニス（ＰＢＳ）
−ビーニスエイ（ＢＳＡ）溶液（１％）を各氏に入れる
。これを室温に１〜２時間！キ、次いでＣＬ１ｔｓピー
ビーニス（ＰＢＳ）−） ？イーン（Ｔｗｅｅｎ ）緩
衝液で洗浄する。
をふさぐために、２００μノのビービーニス（ＰＢＳ）
−ビーニスエイ（ＢＳＡ）溶液（１％）を各氏に入れる
。これを室温に１〜２時間！キ、次いでＣＬ１ｔｓピー
ビーニス（ＰＢＳ）−） ？イーン（Ｔｗｅｅｎ ）緩
衝液で洗浄する。
ビービーニス（ＰＢＳ）−トｔイーン（Ｔｗｅｅｎ ）
（α１チ）で１：２の比で希釈したハイブリドーマ上澄
液２００μＩを各氏に加え、完全に混合して室温で２時
間置く。次いで、穴を１１ｓのビービーニス（ＰＢＳ）
−）クイーン（Ｔｗｅｓｎ ）緩衝液で５回洗浄する。
（α１チ）で１：２の比で希釈したハイブリドーマ上澄
液２００μＩを各氏に加え、完全に混合して室温で２時
間置く。次いで、穴を１１ｓのビービーニス（ＰＢＳ）
−）クイーン（Ｔｗｅｓｎ ）緩衝液で５回洗浄する。
次にホスファターゼ結合抗マウス抗体（力−ケガード
アンド ベリー ラボラド リーズＫｌｒｋｅｇａａｒ
ｄ ＆ Ｐａｒｒｙ Ｌａｂ−）と反応させる。最初に
、マウスアイジージー（ＩｇＧ）Ｋ対するヤギ抗体１０
０μ！を各氏に入れる。この抗体は予じめ親和クロマト
グラフィーで精製され、ビービーニス（ＰＢＳ）−１？
イーン（Ｔｗｅｅｎ）（［１１％）で１：１５０Ｇ希釈
された形であり（セーケガード アンド ベリー ラボ
ラトリーズ Ｋｉｒ−ｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）、アルカリホスファタ
ーゼで標識されたものである。
アンド ベリー ラボラド リーズＫｌｒｋｅｇａａｒ
ｄ ＆ Ｐａｒｒｙ Ｌａｂ−）と反応させる。最初に
、マウスアイジージー（ＩｇＧ）Ｋ対するヤギ抗体１０
０μ！を各氏に入れる。この抗体は予じめ親和クロマト
グラフィーで精製され、ビービーニス（ＰＢＳ）−１？
イーン（Ｔｗｅｅｎ）（［１１％）で１：１５０Ｇ希釈
された形であり（セーケガード アンド ベリー ラボ
ラトリーズ Ｋｉｒ−ｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）、アルカリホスファタ
ーゼで標識されたものである。
反応時間は室温でｔ５時間である。次いで、各氏をビー
ビーニス（ＰＢＳ）−）クイーン（Ｔｗｅｅｎ ） （
α１％）で洗浄する（５回）。
ビーニス（ＰＢＳ）−）クイーン（Ｔｗｅｅｎ ） （
α１％）で洗浄する（５回）。
基質を含む溶液（１ツ／ｄ ｐ−ニトロフェニルホス
フェ−））１５０μノを各氏に加える。暗黒下に２時間
置いた後、４０５ｎｍで分光法により分析する。特異的
抗体を分泌する陽性のハイブリドーマ細胞はこの選んだ
波長で強い陽性の信号を与える。
フェ−））１５０μノを各氏に加える。暗黒下に２時間
置いた後、４０５ｎｍで分光法により分析する。特異的
抗体を分泌する陽性のハイブリドーマ細胞はこの選んだ
波長で強い陽性の信号を与える。
実施例７
マウスにおけるハイブリドーマ細胞の増加腹水の産生を
刺激するため、雌ビーエイエルビ／シー（Ｂａ１ｂ／ｃ
）−ｒウス（２０−２５ｙ）（シセルン アニマル
ファーム、シーエイテ）５ｉｓｓｅｌｎ ａｎｉｍａｌ
ｆａｒｍ、 ＣＨ）を腹腔内にブリスタン油（ｐｒｉ
ｓｔａｎｅ ｏｉｌ ） （アルドリッチ ケミ力ｙ
Ａｌｄｒｉｅｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ） ｌ）、 Ｓ
ｄを注射して前処理する。
刺激するため、雌ビーエイエルビ／シー（Ｂａ１ｂ／ｃ
）−ｒウス（２０−２５ｙ）（シセルン アニマル
ファーム、シーエイテ）５ｉｓｓｅｌｎ ａｎｉｍａｌ
ｆａｒｍ、 ＣＨ）を腹腔内にブリスタン油（ｐｒｉ
ｓｔａｎｅ ｏｉｌ ） （アルドリッチ ケミ力ｙ
Ａｌｄｒｉｅｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ） ｌ）、 Ｓ
ｄを注射して前処理する。
プリスタン投与後１乃至３週間して、マウスに第二回目
の注射を行う（プリスタン油（１２） ｄ。
の注射を行う（プリスタン油（１２） ｄ。
腹腔内）にの第二回目の注射と同時に、動物にビービー
ニス（ＰＢＳ）１２ ａｔに入れた２×１０６のハイブ
リドーマ細胞を与える。
ニス（ＰＢＳ）１２ ａｔに入れた２×１０６のハイブ
リドーマ細胞を与える。
こ■処理で得られた腹水を集め、ａｏｏｐで遠心分離し
、−２００で保存する。腹水を融解し、ｓ ａ、ｏ ｏ
ａｙで１時間、遠心分離する。主として脂質を含む最
上層を除く。次いで蛋白質濃度を測定し、ビービーニス
（ＰＢＳ）を加えて１０９／ｄに調節する。
、−２００で保存する。腹水を融解し、ｓ ａ、ｏ ｏ
ａｙで１時間、遠心分離する。主として脂質を含む最
上層を除く。次いで蛋白質濃度を測定し、ビービーニス
（ＰＢＳ）を加えて１０９／ｄに調節する。
免疫グロブリンＧ画分（アイジージーＩｇＧ）を飽和硫
酸アンモニウム溶液を１９容量部、０℃で滴下して加え
ることＫより沈殿させる。１時間後、アイジージー（Ｉ
ｇＧ）ｉＭ分を２２，０００ノで１時間遠心分離するこ
とによってペレットとする。次いで、このベレットｔ
５０ ｍＭ ＮａＣＡ！を含む２０ｒｎＭ）リス−Ｈ（
Ｊ緩衝液、ｐＨ７，９に溶解し、同じ緩衝液に対し４℃
で一夜、透析する。
酸アンモニウム溶液を１９容量部、０℃で滴下して加え
ることＫより沈殿させる。１時間後、アイジージー（Ｉ
ｇＧ）ｉＭ分を２２，０００ノで１時間遠心分離するこ
とによってペレットとする。次いで、このベレットｔ
５０ ｍＭ ＮａＣＡ！を含む２０ｒｎＭ）リス−Ｈ（
Ｊ緩衝液、ｐＨ７，９に溶解し、同じ緩衝液に対し４℃
で一夜、透析する。
アイジージー（ＩｇＧ）画分を更にデイ−イー（ＤＥ）
−５２ジエチルアミンエチルセルロース（ワットマンｗ
ｈａｔｒｎａｎ ）カラムでの陰イオン交換クロマトグ
ラフィーによって処理する。試料をＮＪＬＣＪの終濃度
が２５ｍＭになるまで、２０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ、ｐ）
Ｉ７．９で１ ： ２ （ｖ／ｖ）Ｋ希釈し、蛋白１０
ツ／ゲルＩｌｔをカラムに流す。溶出はＮ＆Ｃｌ濃度を
２５ｍＭから２００ｍＦＪｔで上昇させて（直線濃度勾
配）行う。単クローン抗体は一般に８０ｍＭＮａＣＡ！
付近で溶出される。
−５２ジエチルアミンエチルセルロース（ワットマンｗ
ｈａｔｒｎａｎ ）カラムでの陰イオン交換クロマトグ
ラフィーによって処理する。試料をＮＪＬＣＪの終濃度
が２５ｍＭになるまで、２０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ、ｐ）
Ｉ７．９で１ ： ２ （ｖ／ｖ）Ｋ希釈し、蛋白１０
ツ／ゲルＩｌｔをカラムに流す。溶出はＮ＆Ｃｌ濃度を
２５ｍＭから２００ｍＦＪｔで上昇させて（直線濃度勾
配）行う。単クローン抗体は一般に８０ｍＭＮａＣＡ！
付近で溶出される。
その画分をビービーニス（ＰＢＳ）に対し、４℃の温度
で一夜透析し、−７０℃で保存する。純度をドデシル硫
酸ナトリウム ポリアクリルアミド ゲル 電気泳動（
ニスデイ−ニス−ビーエイジ−イー ５ＤＳ−ＰＡＧＥ
）と等電点焦点電気泳動によって決定する。
で一夜透析し、−７０℃で保存する。純度をドデシル硫
酸ナトリウム ポリアクリルアミド ゲル 電気泳動（
ニスデイ−ニス−ビーエイジ−イー ５ＤＳ−ＰＡＧＥ
）と等電点焦点電気泳動によって決定する。
この場合の純度＃１９（１以上である。
実施例８
アトラジンおよびヒドロキシアトラジンの検出
アトラジンおよびヒドロキシアトラジンを二段階拮抗イ
ーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析を使って検出す
る。
ーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析を使って検出す
る。
先ず、ビーニスエイ（ＢＳＡ）結合ハブテンを炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９，６）中でマイクロタイター プ
レートに吸着させ（（１２）μｍ／穴）、４℃温度で一
装置く。次いで固体支持体材の残存する遊離結合部位を
１％溶液の形でビーニスエイ（ＢＳＡ）を加えてふさぐ
。プレートを１１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０で補
強したビービーニス（ＰＢＳ）（ビービーニス（ＰＢＳ
）−トｔイーン（Ｔｖｒｅｅｎ））で洗浄する。
リウム緩衝液（ｐＨ９，６）中でマイクロタイター プ
レートに吸着させ（（１２）μｍ／穴）、４℃温度で一
装置く。次いで固体支持体材の残存する遊離結合部位を
１％溶液の形でビーニスエイ（ＢＳＡ）を加えてふさぐ
。プレートを１１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０で補
強したビービーニス（ＰＢＳ）（ビービーニス（ＰＢＳ
）−トｔイーン（Ｔｖｒｅｅｎ））で洗浄する。
予じめ精製した単クローン抗体（２μＰ／１））または
細胸クローンの上澄液（１：５乃至１：２１５に希釈し
て）５０μノを ＆）トリアジンまたはトリアジン類似
体の量を増加するように変えた標準溶液９５０μ７．ｂ
））リアジンを含む水試料、またはｅ））’ｊアジンを
含む土壌抽出物（すべて希釈はビービーニス（ＰＢＳ）
−） クイーン（Ｔｗｅｅｎ ）で行う）と反応させる
。
細胸クローンの上澄液（１：５乃至１：２１５に希釈し
て）５０μノを ＆）トリアジンまたはトリアジン類似
体の量を増加するように変えた標準溶液９５０μ７．ｂ
））リアジンを含む水試料、またはｅ））’ｊアジンを
含む土壌抽出物（すべて希釈はビービーニス（ＰＢＳ）
−） クイーン（Ｔｗｅｅｎ ）で行う）と反応させる
。
室温で１時間反応させた後、混液２００μノをマイクロ
タイター プレートの各人に加え、完全に混合して更に
１時間反応させる。
タイター プレートの各人に加え、完全に混合して更に
１時間反応させる。
次イで穴を５回洗浄し、アルカリホス゛７アターゼに結
合したヤギ抗マウス アイジージー（ＩｇＧ）抗体（希
釈１：１５００）を１００μ！／穴加え、ｔ５時間反応
させる。
合したヤギ抗マウス アイジージー（ＩｇＧ）抗体（希
釈１：１５００）を１００μ！／穴加え、ｔ５時間反応
させる。
洗浄した後、１１ｖ／１１１で ジェタノールアミン緩
衝液（１ｒｎＭ、ｐＨ９，８）Ｋ溶解した基質のｐ−二
トロフェニホスフエートを１５０μノ／穴で各人に加え
る。
衝液（１ｒｎＭ、ｐＨ９，８）Ｋ溶解した基質のｐ−二
トロフェニホスフエートを１５０μノ／穴で各人に加え
る。
固相に結合した抗原と反応した抗体の量に比例する色の
変化を４０５鵬の波長で記碌する。各試料の希釈を阻害
剤の添加なしくＢｏ）でα５とＣｔＳＯ間の吸収が得ら
れるように選ぶ。対照（抗体なしで検出不能な量の抗原
を持つ）で得られるアール■値は≦α００５である。す
べての試料を三重で分析。
変化を４０５鵬の波長で記碌する。各試料の希釈を阻害
剤の添加なしくＢｏ）でα５とＣｔＳＯ間の吸収が得ら
れるように選ぶ。対照（抗体なしで検出不能な量の抗原
を持つ）で得られるアール■値は≦α００５である。す
べての試料を三重で分析。
試料中に含まれるアトラジン／ヒドロキシアトラジンの
量を測定するため、先ず計算プロットを阻害剤の濃度に
対してプロットするＢ／Ｂｏｘ１００によシつくる（第
１図）。（Ｂｏは抗体に対するＳ−）リアジン阻害剤を
添加しないで測定した吸収であシ、Ｂは８−）リアジン
阻害剤の種々の濃度で測定した吸収を表わす、 ） ｌ
１ｌＯｉｔ固相への抗体の結合ＯＳＯ％を阻害する抗原
の濃度を示す。Ｉｓｏを４パラメーター ロジスティッ
ク カーブ（ラーゾ ジーエム Ｒａａｂ ＧＭ 。
量を測定するため、先ず計算プロットを阻害剤の濃度に
対してプロットするＢ／Ｂｏｘ１００によシつくる（第
１図）。（Ｂｏは抗体に対するＳ−）リアジン阻害剤を
添加しないで測定した吸収であシ、Ｂは８−）リアジン
阻害剤の種々の濃度で測定した吸収を表わす、 ） ｌ
１ｌＯｉｔ固相への抗体の結合ＯＳＯ％を阻害する抗原
の濃度を示す。Ｉｓｏを４パラメーター ロジスティッ
ク カーブ（ラーゾ ジーエム Ｒａａｂ ＧＭ 。
１９８３年）に基づく曲線適合プログラムの工ンズ７
イｙ ｆｉ−（ＥＮＺＦＩＴＴＥＲ）（レザーパローエ
ルゼビアーバイオソ７ ） Ｌｅａｔｈｅｒｂｅｒｒ
ｏｖｒ。
イｙ ｆｉ−（ＥＮＺＦＩＴＴＥＲ）（レザーパローエ
ルゼビアーバイオソ７ ） Ｌｅａｔｈｅｒｂｅｒｒ
ｏｖｒ。
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｂｉｏｓｏｆｔ ）を利用して計算
する。イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）における土
壌オたは水試料中のアトラジンおよびヒドロキシアトラ
ジンの定量分析もエンズフイツター（ＥＮＺＦＩＴＴＥ
Ｒ）プログラム・を使って計算し、各マイクロタイター
プレートに含まれる標準に基づいて曲線を適合させる
。
する。イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）における土
壌オたは水試料中のアトラジンおよびヒドロキシアトラ
ジンの定量分析もエンズフイツター（ＥＮＺＦＩＴＴＥ
Ｒ）プログラム・を使って計算し、各マイクロタイター
プレートに含まれる標準に基づいて曲線を適合させる
。
実施例ａ１
土壌試料の分析
種々の起源（第２表）の標準化土壌試料の一定量（２ｙ
）をメタノール／水Ｃ８０／２０（マ／マ）〕混液２０
ｄを使い、抽出機で４時間抽出する。
）をメタノール／水Ｃ８０／２０（マ／マ）〕混液２０
ｄを使い、抽出機で４時間抽出する。
拮抗イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）のため、単ク
ローン抗体のメタノールによる起シ得る変性を防ぐため
に土壌抽出物を、通常、ビービーニス（ＰＢＳ）−ト＋
イーン（Ｔｖｅｅｎ ） （α１俤）により１ ：４０
の比で希釈する。次いで希釈した土壌試料（９５０μｌ
）を前述のようにして特異的抗体（５０μ））と反応さ
せる。
ローン抗体のメタノールによる起シ得る変性を防ぐため
に土壌抽出物を、通常、ビービーニス（ＰＢＳ）−ト＋
イーン（Ｔｖｅｅｎ ） （α１俤）により１ ：４０
の比で希釈する。次いで希釈した土壌試料（９５０μｌ
）を前述のようにして特異的抗体（５０μ））と反応さ
せる。
ヒドロキシルアト２ジンのエイチビーエルシ−（ＨＰＬ
Ｃ）分析のため、メタノール抽出物を更に陽イオン交換
クロマトグラフィーで精製する（例えば、ダウエックス
（Ｄｏｗｅｘ ） ５０ Ｗ−Ｘ４カラム、次いでアン
バー２イト（Ａｍｂ＠ｒｌｉｔｅ ）ＸＡＤ−２ポリス
チレン−ジビニルベンゼン交換樹肪に吸着）。次いでゲ
ルー過、例えばバイオゲル（Ｂｉ ｏ−Ｇｅ１）Ｐ−２
力２ムで行う。次いで試料をエイテビーエルシー（ＨＰ
ＬＣ）Ｋかけ。
Ｃ）分析のため、メタノール抽出物を更に陽イオン交換
クロマトグラフィーで精製する（例えば、ダウエックス
（Ｄｏｗｅｘ ） ５０ Ｗ−Ｘ４カラム、次いでアン
バー２イト（Ａｍｂ＠ｒｌｉｔｅ ）ＸＡＤ−２ポリス
チレン−ジビニルベンゼン交換樹肪に吸着）。次いでゲ
ルー過、例えばバイオゲル（Ｂｉ ｏ−Ｇｅ１）Ｐ−２
力２ムで行う。次いで試料をエイテビーエルシー（ＨＰ
ＬＣ）Ｋかけ。
ヒドロキシアトラジンを２４０ｎｍの波長で測定する。
比較のアトラジン分析を熱イオン検出器および／または
質量分光法を使ったガスクロマトグラフィーによって行
う。
質量分光法を使ったガスクロマトグラフィーによって行
う。
実施例ａ２
水試料の分析
拮抗イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）のため、１０
倍濃縮したビービーニス（ＰＢＳ）−） クイーン（Ｔ
ｖｅｅｎ ）緩衝液１００μ７を水試料ａｓｏμｒＫ加
える。最後に混合物を抗アトラジン抗体エムエイビ（Ｍ
Ａｂ）４０６３−２１−１の５０μノと反応させる。
倍濃縮したビービーニス（ＰＢＳ）−） クイーン（Ｔ
ｖｅｅｎ ）緩衝液１００μ７を水試料ａｓｏμｒＫ加
える。最後に混合物を抗アトラジン抗体エムエイビ（Ｍ
Ａｂ）４０６３−２１−１の５０μノと反応させる。
エイチビーエルシー（ＨＰＬＣ）分析のため、水試料（
２０ｄ）ＪＫ−含まれるＳ−）リアジンを先ずアールビ
ー（ＲＰ）−ｔｓブレカ２ムで濃縮し、更に分析用アー
ルビー（ＲＰ）−１８カラムで分画する。アトラジン分
析を２５０．ｍで行う。
２０ｄ）ＪＫ−含まれるＳ−）リアジンを先ずアールビ
ー（ＲＰ）−ｔｓブレカ２ムで濃縮し、更に分析用アー
ルビー（ＲＰ）−１８カラムで分画する。アトラジン分
析を２５０．ｍで行う。
■、結果
ミエローマ細胞と、実施例１に記載したヒドロキシル複
合体で予じめ感作したマウスの膵臓細胞の間で細胞融合
が起って数日経ただけで、マイクロタイタープレート全
９６穴の内９５穴に細胞集落の増殖を認めることができ
る。これは融合効率９７１％に相当する。これらの細胞
集落の１０がイーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析
で非常に強い反応を示す単クローン抗体を産生ずる。こ
れらを限界希釈法によりクローン化する（実施例５と比
較せよ）。
合体で予じめ感作したマウスの膵臓細胞の間で細胞融合
が起って数日経ただけで、マイクロタイタープレート全
９６穴の内９５穴に細胞集落の増殖を認めることができ
る。これは融合効率９７１％に相当する。これらの細胞
集落の１０がイーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析
で非常に強い反応を示す単クローン抗体を産生ずる。こ
れらを限界希釈法によりクローン化する（実施例５と比
較せよ）。
産生された単クローン抗体の内の９種はアイジージー（
ＩｇＧ）サブクラスｉ／（、１種はアイジ−ジ−２ビー
（ＩｇＧ２ｂ）サブクラスに属している。
ＩｇＧ）サブクラスｉ／（、１種はアイジ−ジ−２ビー
（ＩｇＧ２ｂ）サブクラスに属している。
上述のようＫして得られた単クローン抗体はイーエルア
イニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析での交差反応性に基づき
２グループに分けられる。
イニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析での交差反応性に基づき
２グループに分けられる。
第一のグループ（エムエイビー（ＭＡｂ ）４００９−
８５−４で代表される）では、交差反応性は主としてヒ
ドロキシプロパジンに限られているのに反し、第二のグ
ループ（エムエイビー（ＭＡｂ）４００９−７７−２０
で代表される）では、交差反応性は例えばヒドロキシ
シマジン、ヒドロキシデスメトリン等のような他の３−
トリアジンとも起る（第１表参照）。
８５−４で代表される）では、交差反応性は主としてヒ
ドロキシプロパジンに限られているのに反し、第二のグ
ループ（エムエイビー（ＭＡｂ）４００９−７７−２０
で代表される）では、交差反応性は例えばヒドロキシ
シマジン、ヒドロキシデスメトリン等のような他の３−
トリアジンとも起る（第１表参照）。
これに反し、例えばアトラジンのような活性トリアジン
との交差反応性はいずれのグループでも起らない。した
がって単クローン抗体の結合はトリアジン環の２位にヒ
ドロキシル基を持つ化合物に限られている。
との交差反応性はいずれのグループでも起らない。した
がって単クローン抗体の結合はトリアジン環の２位にヒ
ドロキシル基を持つ化合物に限られている。
ヒドロキシルアト２ジンの下方検出限界はエムエイビー
（ＭＡｂ）４ｏｏ９−ａｓ−ｓでα１ｎり／緩衝液ｍｌ
（Ｄ領域にあり、エムエイビー（ＭＡｂ）４００９−
７７−２０でＩＩＬｏ５ｎｇ／緩衝液ｗｅである。相当
する工、値＃ｉ（１５）５ ｎｇ ／ｄと０．５ ｎｇ
／ｄＣｊ＞ ル。
（ＭＡｂ）４ｏｏ９−ａｓ−ｓでα１ｎり／緩衝液ｍｌ
（Ｄ領域にあり、エムエイビー（ＭＡｂ）４００９−
７７−２０でＩＩＬｏ５ｎｇ／緩衝液ｗｅである。相当
する工、値＃ｉ（１５）５ ｎｇ ／ｄと０．５ ｎｇ
／ｄＣｊ＞ ル。
アトラジン複合体を使用する時にＦｉ（エムエイビ（Ｍ
Ａｂ）４０６！Ｓ−１１−１に代表される）、全部で５
種の単クローン抗体が得られ、そのすべては大体におい
て相当の交差反応性を示す。
Ａｂ）４０６！Ｓ−１１−１に代表される）、全部で５
種の単クローン抗体が得られ、そのすべては大体におい
て相当の交差反応性を示す。
この場合には種々の活性Ｓ−トリアジンとの交差反応性
が認められる。
が認められる。
これに反して、ヒドロキシル代射物との交差反応性は無
視できる程少い（第１表と比較）。
視できる程少い（第１表と比較）。
エムエイビー（ＭＡｂ）４０６３−２１−１についての
アトラジンの検出限界はα０５ｎｇ／緩衝液ｄで１綽（
５０−阻害）はα４５ｎｇ／ｄである。
アトラジンの検出限界はα０５ｎｇ／緩衝液ｄで１綽（
５０−阻害）はα４５ｎｇ／ｄである。
ｂ）回収率検討
これらの回収率検討はメタノール／水土壌抽出物に既知
量のヒドロキシルアトラジンまたはアトラジンを加えて
行う。これは主としてイムノアッセイ中の有機物による
妨害効果Ｋｌべろものである。
量のヒドロキシルアトラジンまたはアトラジンを加えて
行う。これは主としてイムノアッセイ中の有機物による
妨害効果Ｋｌべろものである。
第ｆ１表に見られるように、使用した土壌試料の組成に
関係なく実質的に完全に回収される。
関係なく実質的に完全に回収される。
腐植含量が１０チ近い時でも、回収率は９７チである。
Ｃ）水試料中のアトラジンの検出
２１の異る水試料についてエイテビーエルシー（ＨＰＬ
Ｃ）とエムエイビー（ＭＡｂ）４Ｑ！ｉ％−２１−１を
使ったイーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）によシ分析
する。
Ｃ）とエムエイビー（ＭＡｂ）４Ｑ！ｉ％−２１−１を
使ったイーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）によシ分析
する。
エイテビーエルシー（ＨＰＬＣ）分析のためには濃縮段
階を必要とするが、本発明の単クローン抗体をイーエル
アイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析に使用する場合には省
く。
階を必要とするが、本発明の単クローン抗体をイーエル
アイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析に使用する場合には省
く。
第逼表に示すように、イムノアツセイを使った時の検出
限界は約α０５ ｐｐｌ）である。イーエルアイニスエ
イ（ＥＬＩＳＡ） とエイテビーエルシ−（ＨＰＬＣ）
分析の相関はアトラジン含有試料（〉α０５ ｐｐｂ
）について回帰分析で調べる。この結果、両方性間で良
好な一致がみられ（γ＝ＣＬ９１ 、ｐ＜（１０００５
）、イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析でのわず
かに高い値に有意差はない。
限界は約α０５ ｐｐｌ）である。イーエルアイニスエ
イ（ＥＬＩＳＡ） とエイテビーエルシ−（ＨＰＬＣ）
分析の相関はアトラジン含有試料（〉α０５ ｐｐｂ
）について回帰分析で調べる。この結果、両方性間で良
好な一致がみられ（γ＝ＣＬ９１ 、ｐ＜（１０００５
）、イーエルアイニスエイ（ＥＬＩＳＡ）分析でのわず
かに高い値に有意差はない。
更に微量のヒドロキシルアトクジンを水試料について調
べた。この代謝物は２ｆｉの方法（工ィチヒーエルシー
（ＨＰＬＣ）！：イーｚルア４ｚ、ｚｘイ（ＥＬＩＳＡ
））いずれにおいても検出されなかった。
べた。この代謝物は２ｆｉの方法（工ィチヒーエルシー
（ＨＰＬＣ）！：イーｚルア４ｚ、ｚｘイ（ＥＬＩＳＡ
））いずれにおいても検出されなかった。
寄託
本発明において調製し、使用したハイブリドーマ細胞株
を国際寄託機関として認められているサリスパリー、英
国のヨーロッピアン コレクシラン オブ アニアル
セル カルテヤーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕｌ −
Ｈｕｒｅｓ ｉｎ ５ａｌｉｓｂｕｒｙ、 ＵＫ） （
イーシーエイシーシーＥＣＡＣＣ）に、特許手続のため
の微生物寄託の国際的承認についてのブダペスト条約に
従って寄託した。上記の国際寄託機関は寄託試料の生存
報告ｆを提供する。
を国際寄託機関として認められているサリスパリー、英
国のヨーロッピアン コレクシラン オブ アニアル
セル カルテヤーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕｌ −
Ｈｕｒｅｓ ｉｎ ５ａｌｉｓｂｕｒｙ、 ＵＫ） （
イーシーエイシーシーＥＣＡＣＣ）に、特許手続のため
の微生物寄託の国際的承認についてのブダペスト条約に
従って寄託した。上記の国際寄託機関は寄託試料の生存
報告ｆを提供する。
ハイブリドーマ ２＆ ＯＮ
クローン ４０６５−２１−１
ハイブリドーマ ２−〇＆
クローン ４００９−７７−２０
ハイブリドーマ ２５． ＯＮ
クローン ４００９−８５−３
１９８８ ８８０８／２５０１
１９８８ ８８０８／２５０２
８８０８／２５０５
２５、０ＩＩＬ １９８８
２＆ ０１１１９８８
２五〇＆１９８８
木上記の国際寄託機関で与えられた寄託番号使用培地と
緩衝液 添加物を含むＲＰＭＩ ｔ４４０（セロメトＳｅｒｏ
−ｍａｄ社）： コック血ｆｆ １５ ％Ｌ−グル
タミン ４ ｍＭゲンタマイシン
１１０１ ％ピルビン酸ナトリウム
１ ｍＭ２−メルカプトエタノール ５０ μＭイン
シュリン ５ μＭトジンスフェリン
５ μＭセレン（ＩＴＳ）
ｓ μＭＢ）ＨＡＴ培地 ベーリンガ−（Ｂｏｅｈｒ［ｎｇｅｒ ）社の５０倍濃
度ＨＡＴ（ヒボキサンチン６ＢαＳｖ／にアミノブチリ
）へ８グ／！；チミジン１９工８ツ／ｌ ） ２ ｒＪ
ａｌをＲＰＭＩ １６４０培地１ノに含む。
緩衝液 添加物を含むＲＰＭＩ ｔ４４０（セロメトＳｅｒｏ
−ｍａｄ社）： コック血ｆｆ １５ ％Ｌ−グル
タミン ４ ｍＭゲンタマイシン
１１０１ ％ピルビン酸ナトリウム
１ ｍＭ２−メルカプトエタノール ５０ μＭイン
シュリン ５ μＭトジンスフェリン
５ μＭセレン（ＩＴＳ）
ｓ μＭＢ）ＨＡＴ培地 ベーリンガ−（Ｂｏｅｈｒ［ｎｇｅｒ ）社の５０倍濃
度ＨＡＴ（ヒボキサンチン６ＢαＳｖ／にアミノブチリ
）へ８グ／！；チミジン１９工８ツ／ｌ ） ２ ｒＪ
ａｌをＲＰＭＩ １６４０培地１ノに含む。
Ｃ）ＨＴ培地
ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ）社ＯＳａ倍濃
度ＨＡＴ（ヒボキサンチン６＆α５ツ／Ｉｔ；チミジン
１９４６雫／ｌ）’４ｒＪｄをＲＰＭＩ １４４０培
地１ｊに含む。
度ＨＡＴ（ヒボキサンチン６＆α５ツ／Ｉｔ；チミジン
１９４６雫／ｌ）’４ｒＪｄをＲＰＭＩ １４４０培
地１ｊに含む。
の食塩液、ｐＨ７，４）
Ｋ（Ｊ ７．５ ｍＭＮａＣＡｉ
１１６ ｍＭＮａＨＣＯｓ
２６ ｍＭＮａＨ鵞ＰＯ＊ −２Ｈ！０
１ ｍＭグルフース
ａ５ｍＭ フェノール レッド ４８ μＭ ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（セロメトＳｅｒ
ｏｍｅｄ社）（ペニシリンＩＱＯＯＯＵ、ストレプトマ
イシン１０雫／ｄ）を１％（ｖ／ｖ）添加Ｅ） Ｒ酸
ｆ ） ＋） ウムｔｌ衝ｆｌｉｔ （ｐＨ９，６）Ｎ
ａ＊ＣＯｓ ４７７＃Ｐ ＮａＨＣＯ３８７９ｖ ＮａＮｓ （［ｌｓＭ） ｔ、ａ＊ＨｔＯを加え
て５００ｄ Ｆ）ＰＢＳ 緩衝液（ｐＨ７，０） ＮａＣｊ ａ５ｊ’ Ｎ幻ＨＰＯ４・２ＩＩ意Ｑ １２８ ｙ
ＮａＨｘＰＯａ ・２＆Ｏ［Ｌ４３６ＦＨｔＯを加えて
１０００ＩＬｔ Ｇ） ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２（１（＋１１％）１ゴ
のＴｖｅｅｎ ２０ （セル式５ｅｒｖａ社）−ｔ−ｔ
ｏｏ。
１１６ ｍＭＮａＨＣＯｓ
２６ ｍＭＮａＨ鵞ＰＯ＊ −２Ｈ！０
１ ｍＭグルフース
ａ５ｍＭ フェノール レッド ４８ μＭ ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（セロメトＳｅｒ
ｏｍｅｄ社）（ペニシリンＩＱＯＯＯＵ、ストレプトマ
イシン１０雫／ｄ）を１％（ｖ／ｖ）添加Ｅ） Ｒ酸
ｆ ） ＋） ウムｔｌ衝ｆｌｉｔ （ｐＨ９，６）Ｎ
ａ＊ＣＯｓ ４７７＃Ｐ ＮａＨＣＯ３８７９ｖ ＮａＮｓ （［ｌｓＭ） ｔ、ａ＊ＨｔＯを加え
て５００ｄ Ｆ）ＰＢＳ 緩衝液（ｐＨ７，０） ＮａＣｊ ａ５ｊ’ Ｎ幻ＨＰＯ４・２ＩＩ意Ｑ １２８ ｙ
ＮａＨｘＰＯａ ・２＆Ｏ［Ｌ４３６ＦＨｔＯを加えて
１０００ＩＬｔ Ｇ） ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２（１（＋１１％）１ゴ
のＴｖｅｅｎ ２０ （セル式５ｅｒｖａ社）−ｔ−ｔ
ｏｏ。
ｄのＰＢＳ
Ｈ） ＰＢＳ−ＢＳＡ（ｊ％）
ＢＳＡ Ｓ ｊｌＮａＮ
ｓ （（１５Ｍ） ５ ｍ１ＰＢ
Ｓを加えてＳＯＯ＊ｇ ■）基質緩衝液（ジェタノールアミン緩衝液。
ｓ （（１５Ｍ） ５ ｍ１ＰＢ
Ｓを加えてＳＯＯ＊ｇ ■）基質緩衝液（ジェタノールアミン緩衝液。
ＰＨ９，８）
ジェタノールアミン ９７ 、／
ＮａＮ５ （ｃＬ５Ｍ） ６ ｄＭ ｇ Ｃ
ｌ鵞・６市Ｑ １００９迅Ｏを加えて１０００
履１．ｐＨを濃ＨＣＩでｐＨ９，８に調節 基質の調製二側用直前にｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト基質（シグマｓ ｔ ｇｍａ社）の基質１錠（５ツ）
を基質緩衝液５ｄに溶解する。
ｌ鵞・６市Ｑ １００９迅Ｏを加えて１０００
履１．ｐＨを濃ＨＣＩでｐＨ９，８に調節 基質の調製二側用直前にｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト基質（シグマｓ ｔ ｇｍａ社）の基質１錠（５ツ）
を基質緩衝液５ｄに溶解する。
参考文献 １３
６：５ａ １９８６）エルセゴビッテ シーデー等、
ジャーナルオブ ケリー エム等、ジャーナル オブ
アグリカルアグリカルチエラル アンド フッド ケミ
ス チュラル アンド フッド ケミストリ−５５ト
リー２９巻 ５５９−５６５頁、１９８１年（Ｅｒｅｅ
ｇｏｖｉｃｈ ＣＤ ｅｔ ａｌ、Ｊ、Ａｇｒｉｃ、
Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ、。
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シ冒ン オブ オフィシャル アナリティカル ケミス
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ツエイチティー等、エイニスエム ニュース５０巻５号
９１−１０１頁、 １９８４年（ＨａｕＨＴ ｅｔ ａ
ｌ、ＡｓＭＮｅｗｓ、５Ｑ（３）： ９１−１０１゜
カワムラ エイチ、ベルゾエスキー ジエイエイ２ジャ
ーナル オブ イムノロジー １３６巻。
９１−１０１頁、 １９８４年（ＨａｕＨＴ ｅｔ ａ
ｌ、ＡｓＭＮｅｗｓ、５Ｑ（３）： ９１−１０１゜
カワムラ エイチ、ベルゾエスキー ジエイエイ２ジャ
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５８頁、ｊ９８６年
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、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、。
、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、。
巻９６２−９６５頁、１９８５年
（Ｋｅ１）ｅｙ Ｍ ｅｔ ａｌ、Ｊ、 Ａｇｒｉｃ、
Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ、、 Ｓ ５ ：９６２−９６５．
１９８５） ケーラー ジー、ミルスタイン、ネイチャー２５６巻
４９５−４９７頁、１９７５年４９７．１９７５） カルカルニ エヌビー等、キャンプ−リサーチ ４１巻
２７００−２７０６頁、１９８１年（Ｋｕｌｋａｒｎ
ｉ ＮＰ ｅｔ ａｔ、Ｃａｎｅｅｒ Ｒｅｓ、、 ４
１ ：２７００−２７０６．１９８１） リトルフィールド ジエイ ダブリュー、サイエンス
１４５ニア０９，１９６４） （Ｌｌｔｔｌｅｆｉｅｌｄ Ｊｗ 、 ５ｅｉｅｎｅｅ
、里： ７０９．１９６４）ニエーサム ダブリ具−エ
イテ、シャーナルオプ アグリカルチユラル アンド
フッドケミストリー５３巻５２Ｂ−５５０頁、ｊ９８５
年（Ｎｅｗｓｏｍｅ ＷＨ，Ｊ 、Ａｇｒｉｅ、Ｆｏｏ
ｄ Ｃｈｓｍ、、Ｓ３ ：５２８−５３０，１９８５） ラーゾ ジーエム、クリニカル ケミストリー２９巻１
７５７−１７４１頁、１９８３年リューデイ−、ジャー
ナル オブ アグリカルテ）ラル アンド アンド ケ
ミスト、ソー２フ巻９５４−９５８頁、１９７９年 （Ｒａｍ５ｔ＋５ｉｎｅｒ ＫＡ ＋ Ｈ’ｏ” ｒｍ
ａｎ ＷＤ 、 Ｊ、 Ａｇｒｉｃ。
Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ、、 Ｓ ５ ：９６２−９６５．
１９８５） ケーラー ジー、ミルスタイン、ネイチャー２５６巻
４９５−４９７頁、１９７５年４９７．１９７５） カルカルニ エヌビー等、キャンプ−リサーチ ４１巻
２７００−２７０６頁、１９８１年（Ｋｕｌｋａｒｎ
ｉ ＮＰ ｅｔ ａｔ、Ｃａｎｅｅｒ Ｒｅｓ、、 ４
１ ：２７００−２７０６．１９８１） リトルフィールド ジエイ ダブリュー、サイエンス
１４５ニア０９，１９６４） （Ｌｌｔｔｌｅｆｉｅｌｄ Ｊｗ 、 ５ｅｉｅｎｅｅ
、里： ７０９．１９６４）ニエーサム ダブリ具−エ
イテ、シャーナルオプ アグリカルチユラル アンド
フッドケミストリー５３巻５２Ｂ−５５０頁、ｊ９８５
年（Ｎｅｗｓｏｍｅ ＷＨ，Ｊ 、Ａｇｒｉｅ、Ｆｏｏ
ｄ Ｃｈｓｍ、、Ｓ３ ：５２８−５３０，１９８５） ラーゾ ジーエム、クリニカル ケミストリー２９巻１
７５７−１７４１頁、１９８３年リューデイ−、ジャー
ナル オブ アグリカルテ）ラル アンド アンド ケ
ミスト、ソー２フ巻９５４−９５８頁、１９７９年 （Ｒａｍ５ｔ＋５ｉｎｅｒ ＫＡ ＋ Ｈ’ｏ” ｒｍ
ａｎ ＷＤ 、 Ｊ、 Ａｇｒｉｃ。
Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ、、２７： ９５４−？ Ｓ＠
１９７９ ）ラムスタイナー ケイ、 「アトラジン
」メトーデンスアムルング ツール リュクスタンツア
ナリティーク フォノ ブフランツエンシエツツミッテ
ルン（コレクシ曹ン オブメソーヅフォアアナリシス
オブ レシデューズ オブクロップ プロテクタ１ン
エイジェント）；ドイッテユ ７オルミ工ングスゲマイ
ンシヤフト編；７エアラーク シミー １９８５年；メ
ソード ６−Ｄ） （Ｒａｍｓｔｅｉｎｅｒ Ｋ、、 ＠Ａｔｒａｚｉｎ
’、Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ−ｓａｍｍｌｕｎｇ ｓｕ
ｒ Ｒ’Ｍｃｋａｔａｎｄｓａｎａｌ）’ｔｉｋ ｖｏ
ｎ Ｐｆｌａｎ−ｚｅｎｓｅｈｕｔｚｍｉｔｔｅｌｎ
（Ｃｏ１）ｅｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓｆ
ｏｒ Ａｎａｌｙ＋ｓｉａ ｏｆ Ｒｅａｌｄｕｅｓ
ｏｆ Ｃｒｏｐ ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｇ＠ｎｔ
）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｆｏｒｓｅｈｕｎｇａｇｅｍ
ｅｉｎｓｃｈａｆｔＥｄ、；Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉ
ｅ 、ｔ ９８５ ；Ｍｅｔｈｏｄ ６−Ｄ）シェル
ｉン エム等、＊（チャー２７６巻 ２６９−２７０頁
、１９７８年 （ＳｈｕｌｍａｎＭｅｔ ａｌ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２
７６：２６９−２７０１１９７ａ） ビー ニスアイ、ハンモック ビープイー、ジャーナル
オブ アグリカルチユラル アンドフッド ケミスト
リー３０巻 ９４９−９５７頁。
１９７９ ）ラムスタイナー ケイ、 「アトラジン
」メトーデンスアムルング ツール リュクスタンツア
ナリティーク フォノ ブフランツエンシエツツミッテ
ルン（コレクシ曹ン オブメソーヅフォアアナリシス
オブ レシデューズ オブクロップ プロテクタ１ン
エイジェント）；ドイッテユ ７オルミ工ングスゲマイ
ンシヤフト編；７エアラーク シミー １９８５年；メ
ソード ６−Ｄ） （Ｒａｍｓｔｅｉｎｅｒ Ｋ、、 ＠Ａｔｒａｚｉｎ
’、Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ−ｓａｍｍｌｕｎｇ ｓｕ
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ｎ Ｐｆｌａｎ−ｚｅｎｓｅｈｕｔｚｍｉｔｔｅｌｎ
（Ｃｏ１）ｅｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓｆ
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ｅ 、ｔ ９８５ ；Ｍｅｔｈｏｄ ６−Ｄ）シェル
ｉン エム等、＊（チャー２７６巻 ２６９−２７０頁
、１９７８年 （ＳｈｕｌｍａｎＭｅｔ ａｌ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２
７６：２６９−２７０１１９７ａ） ビー ニスアイ、ハンモック ビープイー、ジャーナル
オブ アグリカルチユラル アンドフッド ケミスト
リー３０巻 ９４９−９５７頁。
１９８２年
（ＷｉｅＳＩ 、 Ｈａｍｍｏｅｋ ＢＤ ＊ Ｊ 、
Ａｇｒｉｅ、 Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ−＋ＳＯ：９４９
−９５７．１９８２） 特許文献 アメリカ特許鋼４，５５０，７８６号明細書（ＵＳ−Ｐ
４５３Ｑ７Ｂり
Ａｇｒｉｅ、 Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ−＋ＳＯ：９４９
−９５７．１９８２） 特許文献 アメリカ特許鋼４，５５０，７８６号明細書（ＵＳ−Ｐ
４５３Ｑ７Ｂり
Claims (63)
- （１）アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体に高
い特異性と親和性を持ち、アトラジンおよび／またはア
トラジン誘導体の不活性なヒドロキシル類似体と基本的
に交差反応性を示さない単クローン抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞株。 - （２）アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体のヒ
ドロキシル類似体に高い特異性と親和性を持ち、アトラ
ジンおよび／またはアトラジン誘導体と基本的に交差反
応性を示さない単クローン抗体を産生するハイブリドー
マ細胞株。 - （３）アトラジンに高い特異性と親和性を持ち、ヒドロ
キシアトラジンまたはアトラジン誘導体の他のヒドロキ
シル類似体と基本的に交差反応性を示さない単クローン
抗体を産生する請求項１記載のハイブリドーマ細胞株。 - （４）アトラジンに高い特異性と親和性を持ち、プロパ
ジン、プロメトリンおよびプロメトンからなる群から選
ばれた構造的に類似したアトラジン誘導体とはっきりし
た交差反応性を示すが、他のアトラジン誘導体またはア
トラジンおよび／またはアトラジン誘導体のヒドロキシ
ル類似体と基本的に交差反応性を示さない単クローン抗
体を産生する請求項３記載のハイブリドーマ細胞株。 - （５）イーシーエイシーシー（ＥＣＡＣＣ）８８０８／
２５０１の同定的性質を持つ請求項４記載のハイブリド
ーマ細胞株。 - （６）ヒドロキシアトラジンに高い特異性と親和性を持
ち、アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体と基本
的に交差反応性を示さない単クローン抗体を産生する請
求項２記載のハイブリドーマ細胞株。 - （７）ヒドロキシアトラジンに高い特異性と親和性を持
ち、ヒドロキシプロパジンと非常にはっきりした交差反
応性を示すが、他のアトラジン誘導体のヒドロキシル類
似体またはアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体
と基本的に交差反応性を示さない単クローン抗体を産生
する請求項６記載のハイブリドーマ細胞株。 - （８）ヒドロキシアトラジンに高い特異性と親和性を持
ち、アトラジン誘導体のヒドロキシル類似体と交差反応
性を示すが、アトラジンおよび／またはアトラジン誘導
体と基本的に交差反応性を示さない単クローン抗体を産
生する請求項６記載のハイブリドーマ細胞株。 - （９）イーシーエイシーシー（ＥＣＡＣＣ）８８０８／
２５０２の同定的性質を持つ請求項７記載のハイブリド
ーマ細胞株。 - （１０）イーシーエイシーシー（ＥＣＡＣＣ）８８０８
／２５０２の同定的性質を持つ請求項８記載のハイブリ
ドーマ細胞株。 - （１１）出発物質の性質をまだ持つており、すなわち、
まだ本発明の抗体を合成し周囲の培地中に分泌すること
ができる請求項１ないし１０のいずれか一項に記載のハ
イブリドーマ細胞株の変異株および変種株。 - （１２）アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体に
高い特異性と親和性を持ち、アトラジンおよび／または
アトラジン誘導体の不活性なヒドロキシル類似体と基本
的に交差反応性を示さない単クローン抗体およびその誘
導体。 - （１３）アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体の
不活性なヒドロキシル類似体に高い特異性と親和性を持
ち、アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体と基本
的に交差反応性を示さない単クローン抗体およびその誘
導体。 - （１４）アトラジンに高い特異性と親和性を持ち、ヒド
ロキシアトラジンまたはアトラジン誘導体のヒドロキシ
ル類似体と基本的に交差反応性を示さない請求項１２記
載の単クローン抗体およびその誘導体。 - （１５）アトラジンに高い特異性と親和性を持ち、プロ
パジン、プロメトリンおよびプロメトンからなる群から
選ばれた構造的に類似したアトラジン誘導体と非常には
っきりした交差反応性を示すが他のアトラジン誘導体ま
たはアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体のヒド
ロキシル類似体と基本的に交差反応性を示さない請求項
１２記載の単クローン抗体およびその誘導体。 - （１６）プロパジンとの交差反応性が８０％以上である
ことを特徴とする請求項１５記載の単クローン抗体およ
びその誘導体。 - （１７）ヒドロキシアトラジンに高い特異性と親和性を
持ち、アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体と基
本的に交差反応性を示さない請求項１３記載の単クロー
ン抗体およびその誘導体。 - （１８）ヒドロキシアトラジンに高い特異性と親和性を
持ち、アトラジン誘導体のヒドロキシル類似体と交差反
応性を示すが、アトラジンおよび／またはアトラジン誘
導体と基本的に交差反応性を示さない請求項１７記載の
単クローン抗体およびその誘導体。 - （１９）アトラジン誘導体のヒドロキシル類似体との交
差反応性が少くとも４０％であることを特徴とする請求
項１８記載の単クローン抗体およびその誘導体。 - （２０）ヒドロキシアトラジンに高い特異性と親和性を
持ち、ヒドロキシプロパジンと非常にはっきりした交差
反応性を示すが、他のアトラジン誘導体のヒドロキシル
類似体またはアトラジンおよび／またはアトラジン誘導
体と基本的に交差反応性を示さない請求項１７記載の単
クローン抗体およびその誘導体。 - （２１）ヒドロキシルプロパジンとの交差反応性が１０
０％までであることを特徴とする請求項２０記載の単ク
ローン抗体およびその誘導体。 - （２２）請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のハ
イブリドーマ細胞株によって産生される単クローン抗体
およびその誘導体。 - （２３）イーシーエイシーシー（ＥＣＡＣＣ）８８０８
／２５０１の同定的性質を持つハイブリドーマ細胞株に
よって産生される請求項１５記載の単クローン抗体およ
びその誘導体。 - （２４）イーシーエイシーシー（ＥＣＡＣＣ）８８０８
／２５０２の同定的性質を持つハイブリドーマ細胞株に
よって産生される請求項１８記載の単クローン抗体およ
びその誘導体。 - （２５）イーシーエイシーシー（ＥＣＡＣＣ）８８０８
／２５０３の同定的性質を持つハイブリドーマ細胞株に
より産生される請求項２１記載の単クローン抗体および
その誘導体。 - （２６）ａ）アトラジンおよび／またはアトラジン誘導
体またはヒドロキシアトラジンおよび／ またはアトラジン誘導体のヒドロキシル類似体をキャリ
アー分子と結合させ、 ｂ）上記結合物で供与体動物を感作し、 ｃ）免疫Ｂ細胞を感作された供与体動物から分離し、 ｄ）上記免疫Ｂ細胞を連続的に細胞分裂可能な腫瘍細胞
株と融合し、 ｅ）得られた融合生成物を分離し、好適な培養培地で培
養し、次いでクローン化し、 ｆ）クローン化した雑種細胞について単クローン抗体の
形成を調べる ことを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記
載のハイブリドーマ細胞の調製法。 - （２７）アトラジンおよび／またはアトラジン誘導体ま
たはヒドロキシアトラジンおよび／またはアトラジン誘
導体のヒドロキシル類似体とカップリング反応するため
の自由に使用できる反応性基を持ち、上記化合物類に免
疫原性能力を与えることができる高分子化合物をキャリ
アー分子として使用することを特徴とする請求項２６記
載の方法。 - （２８）分子量１０，０００乃至１，５００，０００の
リジンを多く含む蛋白質を使用することを特徴とする請
求項２７記載の方法。 - （２９）ウシ血清アルブミン（ビーエスエイＢＳＡ）、
キーホールリムペット蛋白質（ケイエルピーＫＬＰ）、
ヒト血清アルブミン（エイチエスエイＨＳＡ）、ブタサ
イログロブリン、Ｂ＿２ミクログロブリン、ヘモシアニ
ン、免疫グロブリン；毒素；多糖；リボ多糖；天然およ
び合成のポリアデニル酸およびポリウリジル酸；ポリア
ラニルポリペプチドおよびポリリジンポリペプチド；ま
たは細胞膜成分からなる群から選ばれた蛋白質を使用す
ることを特徴とする請求項２７記載の方法。 - （３０）キャリアー分子への結合を直接行うことを特徴
とする請求項２６記載の方法。 - （３１）キャリアー分子への結合をスペーサー分子を介
して行うことを特徴とする請求項２６記載の方法。 - （３２）スペーサー分子がキャリアー分子の反応性基と
の相互反応にあずかることができる１個以上の反応性基
を持つことを特徴とする請求項３１記載の方法。 - （３３）反応性基がカルボキシル基、アミノ基、または
ＳＨ基の形をとることを特徴とする請求項３２記載の方
法。 - （３４）カップリング反応を活性エステル法によって行
うことを特徴とする請求項２６記載の方法。 - （３５）供与体動物の感作をキャリアーに結合したアト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体の一回以上の投
与によって行うことを特徴とする請求項２６記載の方法
。 - （３６）供与体動物の感作をキャリアーに結合したヒド
ロキシアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体のヒ
ドロキシル類似体の一回以上上の投与によって行うこと
を特徴とする請求項２６記載の方法。 - （３７）投与を静脈内注射、腹腔内注射または皮下注射
の形で行うことを特徴とする請求項３５または３６のい
ずれか１項に記載の方法。 - （３８）供与体動物からの免疫細胞の融合のためにそれ
自身では単クローン抗体を産生しない腫瘍細胞株を使用
することを特徴とする請求項２６記載の方法。 - （３９）エスピー２／０−エイジー１４（Ｓｐ２／０−
Ａｇ１４）またはエックス６３−エイジー８，６５３（
Ｘ６３−Ａｇ８，６５３）の同定的性質を持つミエロー
マ細胞株を使用することを特徴とする請求項３８記載の
方法。 - （４０）細胞融合のために通常使用され、センダイウイ
ルスまたは他のパラミクソウィルス、カルシウムイオン
、界面活性脂質またはポリエチレングリコールからなる
群から選ばれた融合促進物のひとつを含む緩衝液を融合
培地として使用することを特徴とする請求項２６記載の
方法。 - （４１）融合促進物が平均分子量６００乃至６，０００
のポリエチレングリコールの形をとることを特徴とする
請求項４０記載の方法。 - （４２）融合培地中のポリエチレングリコール濃度が３
０％−６０％であることを特徴とする請求項４１記載の
方法。 - （４３）融合された雑種細胞の選択のためにエイチエイ
ティー（ＨＡＴ）選択培地を使用することを特徴とする
請求項２６記載の方法。 - （４４）雑種細胞を分離したマクロファージ（「フィー
ダー細胞」）の存在下で培養することを特徴とする請求
項２６記載の方法。 - （４５）単クローン抗体を産生する陽性雑種細胞培養を
限界希釈法を使って単一に取り出し、次いで好適な培養
培地でクローンニングすることを特徴とする請求項２６
記載の方法。 - （４６）請求項４５記載のクローニングされたハイブリ
ドーマ細胞クローンについて好適な単クローン抗体を産
生しているかどうかをイムノアッセイを使って調べるこ
とを特徴とする請求項２６記載の方法。 - （４７）酵素イムノアッセイまたはラジオイムノアッセ
イを使用することを特徴とする請求項 ４６記載の方法。 - （４８）請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のハ
イブリドーマ細胞株を公知の方法で生体内または生体外
で培養し、産生された単クローン抗体を分離することを
特徴とする単クローン抗体の調製法。 - （４９）好適な培地中で生体外の培養を行うことを特徴
とする請求項４８記載の方法。 - （５０）ダルベッコ改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ′ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）
（ディーエムイーエムＤＭＥＭ）またはアールピーエム
アイ１６４０（ＲＰＭＩ１６４０）からなる群から選ら
ばれた標準培養培地で、哺乳動物血清の添加、生育促進
添加物または微量元素により適当に補強されていてよい
ものを使用することを特徴とする請求項４９記載の方法
。 - （５１）単クローン抗体を供与体動物において生体内拡
張により調製することを特徴とする請求項４８記載の方
法。 - （５２）請求項１２または１４ないし１６のいずれか１
項に記載された単クローン抗体を公知のイムノアッセイ
のひとつに使用することを特徴とするアトラジンおよび
／またはアトラジン誘導体の免疫学的検出法。 - （５３）イーシーエイシーシー８８１０８／２５０１（
ＥＣＡＣＣ８８１０８／２５０１）またはそのクローン
またはサブクローンの同定的特徴を持つハイブリドーマ
細胞株によって産生された単クローン抗体を公知のイム
ノアッセイのひとつに使用することを特徴とする請求項
５２記載のアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体
の免疫学的検出法。 - （５４）請求項１３ないし１７のいずれか１項に記載の
単クローン抗体を公知のイムノアッセイのひとつに使用
することを特徴とするヒドロキシアトラジンおよび／ま
たはヒドロキシアトラジン誘導体の免疫学的検出法。 - （５５）イーシーエイシーシー８８０８／２５０２（Ｅ
ＣＡＣＣ８８０８／２５０２）またはそのクローンまた
はサブクローンの同定的特徴を持つハイブリドーマ細胞
株によって産生された単クローン抗体を公知のイムノア
ッセイのひとつに使用することを特徴とする請求項５４
記載のヒドロキシアトラジンおよび／またはヒドロキシ
アトラジン誘導体の免疫学的検出法。 - （５６）イーシーエイシーシー８８０８／２５０３（Ｅ
ＣＡＣＣ８８０８／２５０３）またはそのクローンまた
はサブクローンの同定的特徴を持つハイブリドーマ細胞
株によって産生された単クローン抗体を公知のイムノア
ッセイのひとつに使用することを特徴とする請求項５４
記載のヒドロキシアトラジンおよび／またはヒドロキシ
アトラジン誘導体の免疫学的検出法。 - （５７）それが拮抗イムノアッセイの形をとることを特
徴とする請求項５２ないし５６のいずれか１項に記載の
方法。 - （５８）イムノアッセイがラジオイムノアッセイ（アー
ルアイエイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（イーエル
アイエスエイ（ＥＬＩＳＡ））または化学発光アッセイ
の形をとることを特徴とする請求項５２ないし５７のい
ずれか１項に記載の方法。 - （５９）分析キットが通常使用される支持体材、試薬お
よび他の添加物以外に、請求項１２または１４ないし１
６のいずれか１項に記載の少くともひとつの単クローン
抗体を試薬として含むことを特徴とする、即使用（レデ
ィートウユース）分析キットの形をとるアトラジンおよ
び／またはアトラジン誘導体の免疫学的検出のための組
成物。 - （６０）分析キットが通常使用される支持体材、試薬お
よび他の添加物以外に、請求項１３または１７ないし２
１のいずれか１項に記載の少くともひとつの単クローン
抗体を試薬として含むことを特徴とする、即使用（レデ
ィートウユース）分析キットの形をとるヒドロキシアト
ラジンおよび／またはアトラジン誘導体のヒドロキシル
類似体の免疫学的検出のための組成物。 - （６１）分析キットが通常使用されて支持体材、試薬お
よび他の添加物以外に、イーシーエイシーシー８８０８
／２５０１（ＥＣＡＣＣ８８０８／２５０１）またはそ
のクローンまたはサブクローンの同定的特徴を持つハイ
ブリドーマ細胞株によって産生された少くともひとつの
単クローン抗体を含むことを特徴とする、請求項５９記
載の即使用（レディートウーユース）分析キットの形を
とるアトラジンおよび／またはアトラジン誘導体の免疫
学的検出のための組成物。 - （６２）分析キットが通常使用される支持体材、試薬お
よび他の添加物以外に、イーシーエイシーシー８８０８
／２５０２（ＥＣＡＣＣ８８０８／２５０２）またはそ
のクローンまたはサブクローンの同定的特徴を持つハイ
ブリドーマ細胞株によって産生された少くともひとつの
単クローン抗体を含むことを特徴とする、請求項６０記
載の即使用（レディートウーユース）分析キットの形を
とるヒドロキシアトラジンおよび／またはアトラジン誘
導体のヒドロキシル類似体の免疫学的検出のための組成
物。 - （６３）分析キットが通常使用される支持体材、試薬お
よび他の添加物以外に、イーシーエイシーシー８８０８
／２５０３（ＥＣＡＣＣ８８０８／２５０３）またはそ
のクローンまたはサブクローンの同定的特徴を持つハイ
ブリドーマ細胞株によって産生された少くともひとつの
単クローン抗体を含むことを特徴とする請求項６０記載
の即使用（レディートウーユース）分析キットの形をと
るヒドロキシアトラジンおよび／またはアトラジン誘導
体のヒドロキシル類似体の免疫学的検出のための組成物
。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| AU (1) | AU633843B2 (ja) |
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| KR101515020B1 (ko) | 2013-11-13 | 2015-04-24 | 에스케이텔레콤 주식회사 | 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하는 면역학적 측정 방법 및 상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정장치 |
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| BR8904681A (pt) | 1990-05-01 |
| EP0365818A1 (de) | 1990-05-02 |
| EP0365818B1 (de) | 1995-02-15 |
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