KR19980026589A - 메탐페타민(methamphetamine)에 대한 특이항체 분비세포주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메탐페타민에 대한 특이항체 분비세포주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 활성화된 메탐페타민-소혈청 알부민(MA-NH₂-BSA)을 면역원으로 사용하여 쥐의 비장에 직접 면역한 후 세포융합을 통하여 수립된 새로운 하이브리도마 세포주 NK-1과 이 세포주로부터 분비되는 메탐페타민과 특이적으로 반응할 수 있는 단일클론항체(monoclonal antibody)에 관한 것이다.

Description

메탐페타민(methamphetamine)에 대한 특이항체 분비세포주

본 발명은 메탐페타민에 대한 특이항체 분비세포주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 활성화된 메탐페타민-소혈청 알부민(MA-NH₂-BSA)을 면역원으로 사용하여 쥐의 비장에 직접 면역한 후 세포융합을 통하여 수립된 새로운 하이브리도마 세포주 NK-1과 이 세포주로부터 분비되는 메탐페타민과 특이적으로 반응할 수 있는 단일클론항체(monoclonal antibody)에 관한 것이다.

다음 화학식1로 표시되는 메탐페타민(methamphetamine)은 중추신경계를 자극하는 가장 강력한 교감 신경 흥분성 아민으로 호흡 중추수질을 자극하며, 여러 종류의 약물에 의하여 야기되는 중추성 억제(central depression)의 정도를 감소시키고 중추신경계가 자극될 때 나타나는 여러 가지 징후를 나타낸다.

최근들어 향정신성 의약품, 즉 마약류의 오용과 그로 인한 중독현상들로 인하여 일어나는 각종 사회적 문제점들을 고려해 볼 때 마약 복용자들에 대한 빠르고 정확한 검색법의 개발이 절실히 요구되고 있는 상태이다.

일반적인 향정신성 의약품의 복용을 검색하기 위한 방법에서는 가스 크로마토그래피 방법 또는 적외선 분광분석법을 이용하여 혈액 또는 소변중에 함유되어 있는 미량의 화학물질을 검출하고 있다. 그러나, 이 방법을 적용하기 위해서는 용매추출을 통한 시료의 조제 및 농축 등 여러 가지 번거로운 과정이 뒤따라야 한다. 따라서 근래에는 빠른 시간내에 간편한 방법으로 객관적인 결과를 얻기 위하여 항원 항체 반응을 이용한 면역학적 측정법을 많이 이용하고 있다.

항원 항체 반응을 이용한 면역측정법이라 함은 측정하고자 하는 물질을 항원으로 하여 이에 대한 특정항체를 만들어서 항원에 결합할 수 있도록 하고, 항원 항체의 결합여부와 결합정도를 여러 종류의 표지를 사용하여 측정함으로써 생체물질을 정성·정량하는 방법이다. 따라서 이러한 면역측정법을 이용하여 체내의 메탐페타민을 인지할 수 있는 방법을 개발한다면 종래 크로마토그래프법의 번거로움을 생략할 수 있으며 예민도와 정확도를 높일 수 있게 된다.

면역측정법에 의한 메탐페타민의 검색을 위해서는 절대적으로 메탐페타민 특이항체가 필요하다. 다시말하면 체액, 특히 소변중에 존재하는 메탐페타민 또는 그의 대사체와는 특이적으로 반응하면서도 이와 유사한 구조를 가지는 구조 유사체 예를들면 기침약으로 쓰이는 에피네프린 등과 반응하지 않는 특이항체가 필요하다. 그러나, 메탐페타민은 분자량이 작고 면역원성이 낮기 때문에 보통 널리 쓰이는 면역화 방법으로는 원하는 항체를 얻기 어렵다.

본 발명자들은 면역측정법에 의한 메탐페타민의 검색시 절대적으로 필요한 항체를 얻기 위해 노력하였다. 그 결과 소혈청 알부민 그 자신은 면역원성이 낮지만, 항원으로 사용하고자하는 저분자 물질과 결합체를 이루게되면 저분자 물질이 좋은 면역원으로 작용하도록하는 특성이 있음을 알게 되었다.

본 발명에서는 아민기가 활성화된 메탐페타민을 소혈청 알부민과 결합시켜 메탐페타민-소혈청알부민(MA-NH₂-BSA)를 얻었고, 이 결합체를 면역원으로 사용하되 기존의 복강투여 면역화 방법 대신에 비장 면역화 방법을 적용하여 새로운 하이브리도마 세포주 NK-1을 얻었으며, 이 세포주로부터 메타페타민과 이의 주대사물을 동시에 인지할 수 있는 특이항체를 얻게됨으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 메탐페타민에 특이 반응성을 나타내는 새로운 하이브리도마 세포주 NK-1과, 이로부터 분비되는 메탐페타민 면역측정법에 이용 가능한 단일클론항체를 제공하는데 목적이 있다.

도 1은 하이브리도마 세포주 NK-1로부터 생산되는 단일클론항체가 메탐페타민에 대한 특이 반응성을 나타내는 결과로서,

-●- :메탐페타민-소혈청 알부민(MA-BSA)에 대한 NK-1 항체의 반응성을 나타낸 것이고,

-■- :소혈청 알부민(BSA)에 대한 NK-1 항체의 반응성을 나타낸 것이다.

도 2는 단일클론항체의 반응성에 대한 메탐페타민,p-하이드록시메탐페타민, 암페타민의 반응 저해효과를 ELISA 방법으로 측정한 결과로서,

-●- :메탐페타민(methamphetamin)

-▲- :p-하이드록시메탐페타민(parahydroxymetamphetamine)

-■- :암페타민(amphetamin)이다.

본 발명은 메탐페타민에 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 NK-1를 그 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 하이브로도마 세포주 NK-1에 의해 생산된 단일클론항체를 포함한다.

본 발명에 따른 하이브리도마 세포주 NK-1을 얻는 과정을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

메탐페타민의 아민기를N-(4-브로모부틸)프탈이미드와 히드라진 수화물(hydrazine hydrate)을 사용하는 이와사키법(lwasaki, M. Nippon Hoigaku Zasshi, 41, 217(1987))에 의해 활성화된 메탐페타민(MA-NH₂)을 얻는다.

활성화된 메탐페타민(MA-NH₂)을 소혈청 알부민(BSA)과 결합시키는 바, 이때 결합물질로는 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)를 사용하였다. 그리고 소혈청 알부민과 결합되어 있는 메탐페타민을 쥐(Balb/c 종)의 비장에 직접 주사하여 면역화한 후, 세포융합을 통하여 본 발명에서 목적으로 하는 하이브리도마 세포주 NK-1을 얻는다. 본 발명에서 이용된 세포융합법은 종래의 방법(Kohler, G and Milstein, C (1975) Eur. J. Immunology, 6, 511)에 의해 시행하였다.

본 발명에서 수립된 하이브리도마 세포주 NK-1은 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자원센타에 1996년 7월 31일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 0269 BP를 부여받았다.

본 발명에서 수립된 세포주는 β-림포마(β-lymphoma)로부터 유래된 신규한 것으로서, 이는 계속적으로 분열하면서 메탐페타민에 대한 특이항체인 면역글로불린 G1형(lgG₁type)의 항체를 분비하는 쥐 하이브리도마 세포주이다. 하이브리도마 세포주 NK-1은 배양 플라스크의 바닥에 붙지않고 배양배지에 떠서 자라는 세포(anchorage-dependent cell type)이며, 크기는 직경이 15 ~ 20 ㎛로 둥근 형태를 하고 있다. 배양조건은 소태아혈청을 10% 함유한 RPMI 1640 배지를 가하며, 37 ℃에서 배양하고, 5% CO₂와 습도를 제공할 수 있는 CO₂배양기를 사용한다. 세포수가 두배가 되는 시간(doubling time)은 12 ~ 14시간이다.

이렇게 하여 수립된 하이브리도마 세포주 NK-1로부터 분비되는 단일클론항체는 메탐페타민 그리고 이의 주대사물과 반응하는 것으로 나타났다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1.면역원의 제조

메탐페타민(5.39 mmol)에 N-(4-브로모부틸)프탈이미드(6.46 mmol)와 메탐페타민과 동량의 히드라진 수화물을 사용하여 이와사키법(lwasaki, M. Nippon Hoigaku Zasshi, 41, 217(1987))에 의해 메탐페타민의 아민기가 활성화된N-(4-아미노부틸)메탐페타민을 얻었다.

소혈청 알부민(4 mg)을 피리딘/H₂O(2/10 부피비) 혼합액(0.6 ㎖)에 녹인 후, 상기에서 얻은 활성화된 메탐페타민(MA-NH₂; 5 mg)을 가하고, 여기에 동일 용량의 EDAC용액(16.6 mg/0.5 ㎖)을 첨가하였다. 이 혼합액을 실온에서 하룻밤 섞어줌으로써 메탐페타민-소혈청 알부민(MA-BSA) 면역원을 제조하였다. 결합이 되지 않은 화합물들은 PBS(Phosphate buffered saline; 0.14 M NaCl, 2.8 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 8.1 mM Na₂HPO₄)에 투석시켜 제거함으로써 결합된 메탐페타민-소혈청 알부민만을 분리하여 사용하였다. 이때 메탐페타민과 소혈청 알부민은 50 : 1 몰비로 결합되어 있었다.

실시예 2.생쥐의 면역화

상기 실시예 1에서 얻은 메탐페타민-소혈청 알부민(10 ㎍)과 살모넬라 미네소타(Salmonella MinesotaR595; 50 ㎍)를 PBS(0.2 ㎖)에 잘 혼합한 다음, 이를 쥐(Balb/c 종)의 비장내로 직접 주사하였다. 2주 후에 같은 방법으로 두번째 비장내 면역화를 실시하고 3일 후에 쥐를 죽여서 면역화된 비장세포를 얻었다.

실시예 3.세포융합

상기 실시예 2에서 얻은 비장세포(1 × 10⁸개)와 골수종 세포(myeloma cell)인 SP2/0-AG 14 세포(1.5 × 10⁷개)를 50 ㎖의 침전관에 모았다. 원심분리하여 세포침전물을 모은 후, 50% 폴리에틸렌 글리콜(분자량 4,000, merck; 0.5 ㎖)을 1분간 처리하여 세포융합한 다음, 곧이어 배양배지(RPM; 1 ㎖)로 1분간 서서히 희석시키고, 곧이어 배지 20 ㎖로 계속 희석시켰다. 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포를 분리 배지(HAT)로 옮겨 약 2주일간 배양하였으며 하이브리도마 세포군이 명확히 성장하기 시작할 때 HT 배지로 바꾸어 증식이 촉진되도록 하였다.

실시예 4.항체 생산 하이브리도마의 선별

폴리비닐 클로라이드 재질로 만들어진 96공 용기(Immulon 2 : Dynatech. Lab Inc.)의 각 공에 부착 완충용액(carbonate buffer, pH 9.5)에 녹인 메탐페타민-소혈청 알부민(2 ㎍/㎖)을 50 ㎕씩 넣어 4 ℃에서 하룻밤 방치하였다. 각 공에 부착되지 않은 면역원을 제거하고 PBST(Tween 20 0.05%가 포함된 PBS)로 세척한 후, 소혈청 알부민(30 mg/㎖) 100 ㎕를 넣고 상온에서 1시간 반응시켜 비특이적 결합을 억제하도록 하였다. 다시 PBS로 세척하고, 하이브리도마 배양액(50 ㎕)을 각 공에 넣어주어 상온에서 2시간 반응시켰다. 부착되지 않은 배양액을 제거하기 위해 PBS로 세척한 후, 결합한 항체를 인식해 내기 위해서 비오틴이 결합된 생쥐 면역글로불린 항체(biotinylated-anti-mouse lgs; ZYMED Lab, San Francisco, CA)와 과산화효소-스트렙토아비딘을 연속적으로 반응시킨 후, 기질인o-페닐렌디아민으로 발색시켜서 490 nm 흡광도에서 엘리자판독기(ELISA reader; Titertek Multiskan MCL/340, Labsystems)로 판독하여 항체 양성 여부를 결정하였다.

흡광도가 높은 상등액은 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 함유하므로 제한 희석법으로 2차 클로닝하여 특이성이 높은 단일클론항체를 분비하는 세포주 NK-1을 선별 확립하였다. 이 새로운 세포주의 반복생산 및 배양을 가능케하는 배양조건과 배양방법은 다음과 같다.

1.배지

가.조성

3차 증류수(1ℓ)에 RPMI 1640(10.4 g), NaHCO₃(3.7 g), N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES; 2.83 g), 항생제-항진균제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco; 10 ㎖)가 함유됨.

나.제조방법

멸균배지 제조용 플라스크를 이용하여 상기의 배지용액(0.25 ㎛)을 멸균여과지를 통과시켜 멸균한 다음, 소태아혈청(FBS : fetal bovine serum)을 10%가 되도록 첨가하였다(이것을 완전 배지라 부른다). 소량의 완전배지는 37 ℃의 CO₂배양기에서 1일 정도 넣어두고 오염 여부를 확인한 후 사용하였다.

2.복원조건

질소탱크에서 바이알(vial)을 꺼내어 37 ℃에 담가 바로 녹인 후, 70% 알코올을 바이알에 뿌리고 알코올 램프불로 바이알 뚜껑을 멸균한 후 세포주를 꺼내어 멸균 원심분리관에 넣고 완전배지(10 ㎖)를 넣어 1000 rpm으로 원심분리하였다. 가라앉은 세포주를 신선한 완전배지에 녹여 배양 플라스크에 넣어 배양하였다.

3.예상 생존율

95% 이상

4.배양조건

가.배지첨가

복원시킨 세포주를 배양 후 신선한 완전배지를 첨가하여 세포의 활성을 높인다.

나.계대 배양조건

2 ∼ 3일 배양하여 5 × 10⁶/㎖ 정도 키운 다음, 원심분리하여 신선한 완전배지에 5 × 10⁴/㎖ 정도로 배양시킨다.

5.동결 보존조건

가.배지

디메틸술폭사이드(DMSO) 10%

소태아혈청(FBS) 30%

RPMI 60%

나.동결온도 및 조건

세포를 1 ∼ 5 × 10⁶/㎖ 키운 다음 원심분리하여 동결배지 약 0.5 ∼ 1 ㎖를 첨가한 후, 동결 바이알에 넣고 솜으로 여러번 잘 포장한 후 -70 ℃ 냉동실(deep freezer)에 하루 또는 이틀동안 보관한 후 질소탱크에 넣어 보존하였다. 항체 대량 생산을 위해 복수촉진제로 생쥐(Balb/c strain)에 불완전 보조항원(Incomplete Freund Adjuvant)을 주사한 후, 며칠 후 다시 이들 하이브리도마 세포주를 각각 주사하여 복수액을 얻었을 때 복수액에 함유된 단백질 총량에 대한 면역항체의 비율과 면역확산법(double immunodiffusion)(Seppala, I., Sarvas, H., Peterfy, F. Makela, O. The Four Subclasses of IgG can be Isolated from Mouse Serum by using Protein A-Sepharose, Scand. J. Immunol. 14, 337-344, 1981)으로 결정한 항체의 소단위형(subtype)은 다음 표 1과 같다.

구 분	복 수
클 론	소단위형	총단백질	총 면역항체	면역항체 비율
NK-1Gl33.0mg/㎖12.4mg/㎖37.6%

실시예 5.단일클론항체의 교차 반응성

상기 실시예들에 따라 얻은 단일클론항체의 교차 반응성을 조사하기 위하여 메탐페타민 유사체들에 의한 단일클론항체와 메탐페타민의 결합 저해효과를 상기 실시예 4에서 설명한 엘리자 방법으로 측정하였다.

즉, 단일클론항체와 PBS에 녹인 여러종류의 유도체를 1 : 1 부피비로 섞은 혼합액(50 ㎕)을 1시간동안 실온에서 미리 반응시킨 후 이 혼합액을 이용하여 엘리자 방법으로 단일클론항체의 결합하는 정도 즉, 유도체가 결합을 저해하는 정도를 측정하였다. 아브라함 방법(Abrahan, G. E.(1969) Solid-Phase Radioimmunoassay for Estradiol-17 β. J. Clin, Endocrinol. Metab. 29, 866)에 의해 단일클론항체 0269BP와 최대 결합력의 50% 반응성을 나타내는 메탐페타민 농도를 다른 메탐페타민 유도체를 사용했을 때 50% 반응을 나타내는 농도와 비교하여 계산하였다. 교차반응성은 다음 수학식1에 의해 측정하였으며, 그 결과는 다음 표2에 나타내었다.

화합물	R1R2R3R4R5R6R7교차반응성
메탐페타민메톡시펜아민p-하이드록시메탐페타민p-하이드록시에페드린에피네프린암페타민노레페드린에페드린dl-메틸에페드린에틸에페드린	HHHHCH3HCH3100%CH3OHHHCH3HCH3100%HOHHOHCH3HCH385.8%HOHHHCH3HCH39.5%HOHOHOHHHCH320.0%HHHHCH3HH2.2%HHHOHCH3HH9%HHHOHCH3HCH326.0%HHHOHCH3CH3CH352.2%HHHOHCH3CH3CH2CH315.4%

첨부한 도 1은 하이브리도마 세포주 NK-1로부터 생산되는 단일클론항체가 메탐페타민에 대한 특이 반응성을 나타내는 결과로서 담체(carrier)로 사용한 소혈청 알부민에 대해서는 반응성이 없고 메탐페타민에 대하여만 특이적으로 반응함을 보여주고 있다.

또한, 메탐페타민이 체내에 흡수되어 간에서 분해되고 이때 거의 대부분이p-하이드록시메탐페타민으로 전환되는 것을 고려한다면, 단일클론항체는 메탐페타민에 대한 특이반응성과 더불어p-하이드록시메탐페타민에 대한 특이반응성이 요구된다.

도2는 단일클론항체에 의한 메탐페타민(methamphetamine),p-하이드록시메탐페타민(p-hydroxymethamphetamine), 암페타민(amphetamine)의 반응 저해효과를 ELISA 방법으로 측정한 결과이다. 단일클론항체에 의한 메탐페타민의 반응 저해율이 100%일 때,p-하이드록시메탐페타민은 85%이상이었으나 암페타민은 매우 낮은 반응 저해율을 보인다. 따라서, 하이브리도마 세포주 NK-1로부터 분비된 단일클론항체은 소변이나 혈액중에 함유된 메탐페타민과p-하이드록시메탐페타민을 검출하기 위한 면역측정용 특이항체로 매우 적합하다.

신규 하이브리도마 세포주 NK-1로부터 분비된 단일클론항체은 향정신성 의약품으로 알려진 메탐페타민 그리고 그 주대사체와 특이적으로 반응하므로 메탐페타민 면역측정용 특이항체로 사용되어 예민도와 정확도를 높이는 효과를 가진다.

Claims (2)

1. 메탐페타민에 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 NK-1(기탁번호 KCTC 0269BP).
2. 하이브리도마 세포주 NK-1(기탁번호 KCTC 0269BP)에 의해 생산된 단일클론항체.