JPH1189568A - ピリミカーブのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ピリミカーブのハプテン化合物、
抗体および測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、ピリミカー
ブまたはその部分にスペーサーアームおよび結合のため
の官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２−ジメチルアミ
ノ−５,６−ジメチルピリミジン−４−イルジメチルカ
ルバマート（以下、本明細書中「ピリミカーブ」と言
う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフラグメン
トに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】ピリミカーブは、以下の式（４）：

【化３】 で表される構造を有する、カ−バメート系殺虫剤であ
る。カーバメート系殺虫剤は、化合物の構成元素として
ＣｌやＰを含まず、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎからなる、殺虫作用
を有する一群の化合物である。主なカ−バメート系殺虫
剤は、構造的に大きく三つに分類される。第一に、ナフ
チルまたは置換フェニル−Ｎ−メチル型、第二に複素環
Ｎ,Ｎ−二置換基型、そして第三にオキシム（−Ｃ＝Ｎ
−Ｏ−）結合を分子内に持つオキシム型である。

【０００４】ピリミカーブはこれらのうちＮ,Ｎ−二置
換基型のカ−バメート系殺虫剤であり、アブラムシ防除
剤として使用されている。アブラムシに速効的に効き、
接触効果とくん蒸効果を有し、散布面より裏面へも浸透
する。有機リン殺虫剤に抵抗性のアブラムシにも有効で
ある。天敵、有益昆虫にもほとんど影響はないと考えら
れる。

【０００５】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。ピリミカーブについては、食品衛生法に基づき残留
基準値が、穀類（０．０５ｐｐｍ）、豆類（０．０２ｐ
ｐｍ）、いも類（０．０５−０．１ｐｐｍ）、果実
（０．０５−１．０ｐｐｍ）、野菜（０．０５−２．０
ｐｐｍ）、種子、ナッツ、種実（０．０５−１．０ｐｐ
ｍ）、ホップ（０．５ｐｐｍ）等、定められている
（「最新農薬の残留分析法」、前述）。環境や食品に関
する安全確保のためには、これらに含有される、ピリミ
カーブの量を迅速、かつ正確に測定することが必要であ
る。

【０００６】従来、ピリミカーブは、穀類、豆類、果
実、野菜、いも類等の試料から抽出し、精製した後ガス
クロマトグラフィー、高速液体カラムクロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）等により分析されてきた。例えば、試料
をアセトンで抽出して、ジクロロメタンに転溶、ヘキサ
ン／アセトニトリルの液々分配及びＣ₁₈ミニカラムで精
製後、ＨＰＬＣで測定する方法が採用されている。これ
らの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手間と時間を必
要とし、分析に熟練を有すること、並びに、測定装置や
設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。ピ
リミカーブの測定は、特に輸入農産物等の残留農薬の分
析においては、短時間で膨大な数の試料の分析結果を出
す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び
経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきてい
る。

【０００７】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００８】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【０００９】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、ピリミカーブのような低分
子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出す
ことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分
子化合物に結合させることによって初めて一団のエピト
ープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を
起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生
される。このように高分子化合物と結合させて初めて免
疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」という。

【００１０】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１１】このように、ピリミカーブについては、そ
の必要性が非常に高かったにもかかわらず、抗体のみな
らず、抗体を得るために必要なハプテンも本発明前には
得られていなかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ピリミカー
ブに反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を
構成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘導体を
提供することを目的とする。

【００１３】本発明は、また、前記ピリミカーブ誘導体
と高分子化合物又は標識物質との結合体を提供すること
を目的とする。当該結合体はピリミカーブに反応性を有
する抗体を作製するための抗原となる。

【００１４】本発明は、さらに、ピリミカーブに反応性
を有する新規な抗体もしくはそのフラグメント、及びそ
の作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書
において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能
な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１５】本発明はその一態様において、ピリミカー
ブに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１６】本発明は、さらにまた、前記抗体またはそ
のフラグメントを産生するハイブリドーマを提供するこ
とを目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体またはそのフ
ラグメントを使用することを含む、ピリミカーブの免疫
学的測定方法を提供することを目的とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ピリミカーブにスペーサーアーム及び高
分子との結合に利用できる官能基を導入した、ピリミカ
ーブの誘導体をハプテンとして使用することにより、前
記化合物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本
発明の完成に至った。

【００１９】本発明の対象となるピリミカーブは、以下
の式（４）：

【化４】 で表される化合物である。

【００２０】抗体作製のためのハプテンとして使用され
る誘導体は、以下の式（１）−（３）：

【化５】 ［式（１）−（３）中、Ｘは、Ｈまたはメチル基であ
り；そしてｎは、１−１０の整数、好ましくは、３−５
の整数である］からなる群から選択される構造を有する
化合物である。

【００２１】本発明のピリミカーブ（またはその部分）
にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を結合
させた誘導体（１）−（３）をハプテンとして適当な高
分子化合物と結合させたものを抗原として用いることに
よって、ピリミカーブに反応性を有する抗体を得ること
ができる。

【００２２】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、ピリミカーブに反応
する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物
又は該抗体を用いるピリミカーブの免疫学的測定方法に
関する。

【００２３】ピリミカーブの誘導体の作製 式（１）ないし（３）のいずれかで表されるピリミカー
ブ誘導体は、公知の方法に従って作製することができ
る。例えば、以下に記載するような方法がある。

【００２４】式（1）ないし（３）のいずれかで表され
るピリミカーブ誘導体は、各式の化合物のカルボキシル
末端にカルボキシル保護基が共有結合したエステル化合
物から、公知の方法によりカルボキシル保護基を除去す
ることにより作製することができる。

【００２５】カルボキシル保護基は公知のものでよく，
その具体例として，たとえばメチル基、エチル基、ベン
ジル基、４-メトキシベンジル基、３，４-ジメトキシベ
ンジル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、フェニル基、ｔｅｒｔ-
ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェニル
シリル基、トリイソプロピルシリル基、２-トリメチル
シリルエトキシ基等を挙げることができる。

【００２６】カルボキシル基の保護基は酸あるいはアル
カリ存在下で脱保護することができる。メチル基、エチ
ル基等の低級アルキル基、及びベンジル基、フェニル基
などは水とメタノール、エタノール、ＴＨＦ等の有機溶
媒との混合溶液中で、水酸化リチウム、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等のアルカリ存在下、０℃から６０
℃、好ましくは０℃から１０℃、５分から２０時間、好
ましくは５分から１時間撹拌することによって除去でき
る。メチル基、ベンジル基、４-メトキシベンジル基、
３，４-メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、ｔｅ
ｒｔ-ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェ
ニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、２-トリメ
チルシリルエトキシ基などはジクロロメタン、１，２-
ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、ア
セトニトリル、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の適当な有
機溶媒中で、塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸、あるいは酢
酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸
等の有機酸存在下、マイナス１０℃から６０℃、好まし
くは０℃から２５℃、１時間から２０時間、好ましくは
２時間から５時間撹拌することにより除去できる。また
ベンジル基、４-メトキシベンジル基、３，４-メトキシ
ベンジル基は加水素分解、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシ
リル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェニルシリル基、トリイ
ソプロピルシリル基、２-トリメチルシリルエトキシ基
等のシリル基はフッ化ピリジニウム、テトラブチルアン
モニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）等によって除去するこ
とができる。

【００２７】Ｉ．式（１）に記載された化合物の製造方
法の例 式（１）に記載された化合物は、例えば、以下の式（Ｘ
１）：

【化６】 ［式（Ｘ１）中、Ｒは、カルボキシル保護基であり；そ
してｎは、式（１）−（３）で先に定義した通りであ
る］で表されるエステル化合物からＲで表されるカルボ
キシル基の保護基を除去することにより製造できる。

【００２８】一般式（Ｘ１）で表わされるエステル化合
物は、例えば、式（Ｘ２）：

【化７】 で表される２−ジメチルアミノ−５,６−ジメチル−４
−ピリミジノンに、以下の式（Ｘ３）：

【化８】 ［式（Ｘ３）中、Ｌは脱離基であり、そして、Ｒおよび
ｎは先に定義した通りである］で表される、保護基で保
護されたカルボキシル基を有する化合物を反応させるこ
とにより得られる。脱離基Ｌは、例えば、Ｂｒ、Ｃｌ等
のハロゲン原子、メトキシ基、エトキシ基等のアルコキ
シ基等である。なお、２−ジメチルアミノ−５,６−ジ
メチル−４−ピリミジノンは市販のピリミカーブをアル
カリで加水分解することにより容易に得ることができ
る。

【００２９】反応は、例えば、アセトニトリル、ジクロ
ロメタン、１，２-ジクロロエタン、酢酸エチル、ベン
ゼン、トルエン、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の適当な
有機溶媒中で、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等の無機
塩基、あるいはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチ
ルアミン等の有機塩基存在下、マイナス１０℃から１３
０℃、好ましくは２０℃から８０℃、１時間から４８時
間、好ましくは２時間から２０時間撹拌することにより
得ることができる。

【００３０】II．式（２）に記載された化合物の製造方
法の例 式（２）に記載された化合物は、例えば、以下の式（Ｘ
４）：

【化９】 ［式（Ｘ４）中、Ｒ、Ｘおよびｎは先に定義した通りで
ある］で表されるエステル化合物からＲで表されるカル
ボキシル基の保護基を除去することにより製造できる。

【００３１】式（Ｘ４）の化合物は、例えば、式（１）
においてｎ＝１である化合物を出発物質として合成する
ことができる。具体的には、式（１）においてｎ＝１で
ある化合物に、以下の式（Ｘ５）：

【化１０】 ［式（Ｘ５）において、Ｒ，Ｘおよびｎは先に定義した
通りである。］で表される、保護基で保護されたカルボ
キシル基を有するエステルと反応させることにより、式
（Ｘ４）の化合物を得ることができる。

【００３２】反応は、例えば、アセトニトリル、ジクロ
ロメタン、１，２-ジクロロエタン、酢酸エチル、ベン
ゼン、トルエン、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の適当な
有機溶媒中で、Ｎ，Ｎ-ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルカルボジイミド
（ＤＩＰＣ）、１-（３-ジメチルアミノプロピル）-３-
エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）等のカルボジイミド系
縮合剤を用いて、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド、１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール、３,４−ジヒドロ−３
−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジ
ン等のアシル尿素を生成する副反応抑制剤の存在下で行
う。反応は、０℃から８０℃、好ましくは２０℃から４
０℃、１時間から５０時間、好ましくは５時間から２５
時間撹拌することにより得ることができる。

【００３３】式（Ｘ５）で表されるエステルは、例え
ば、Ｘが水素原子の場合、以下の式（Ｘ６）：

【化１１】 ［式（Ｘ６）中、ｎは先に定義した通りである］で表さ
れる遊離アミノ酸のカルボキシル基に、保護基Ｒを導入
することにより得ることができ、その合成法としては既
知の方法が多く知られている。例えば、アミノ酸と対応
するアルコールの溶液あるいは懸濁液に塩化水素、ｐ-
トルエンスルホン酸等の酸触媒を加え脱水縮合する方法
があげられる。また，アミノ酸のアミノ基を適当な保護
基で保護したのちジクロロメタン、１，２-ジクロロエ
タン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテ
ル、ベンゼン、トルエン、キシレン、Ｎ，Ｎ-ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）等の適当な溶媒存在下で、Ｎ，
Ｎ-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，
Ｎ-ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１-
（３-ジメチルアミノプロピル）-３-エチルカルボジイ
ミド（ＥＤＣ）等のカルボジイミド系縮合剤、あるいは
トリフェニルホスフィンとアゾジカルボン酸ジエチル等
のアゾジカルボン酸エステルを用いアルコールと脱水縮
合する方法、あるいはトリフェニルホスフィンと２,
２’−ジピリジルジスルフィドを用い脱水縮合する方
法、あるいはＢＯＰ試薬、ＤＰＰＡ試薬等の他の縮合剤
を用いてエステルを合成する方法等（実験化学講座２
２、４３頁−５１頁、日本化学会編、丸善株式会社）に
より得られたアミノ酸誘導体の保護基を除去することに
よりアミノ酸エステルを得る方法もあげられる。あるい
は、塩基存在下アルキルハライドを反応させる方法等に
より得られたアミノ酸誘導体の保護基を除去する方法も
あげられる。アミノ酸のｔｅｒｔ-ブチルエステルにつ
いてはジクロロメタン、１，２-ジクロロエタン、ベン
ゼン、トルエン、ＴＨＦ等の適当な溶媒中、リン酸、硫
酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体等の存在下、
アミノ基を保護したアミノ酸とイソブテンを撹拌して得
られたアミノ酸誘導体の保護基を除去することにより得
る方法もあげられる。

【００３４】アミノ基の保護基としては、例えば、ベン
ジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、ｔｅｒｔ-ブトキシ
カルボニル基（Ｂｏｃ基）、９-フルオレニルメトキシ
カルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等があげられる。保護基を
除去する方法としては加水素分解による方法、塩酸、硫
酸等の鉱酸、あるいはトリフルオロ酢酸等の有機酸を用
いる方法、ピリジンやピペリジン等の塩基を用いる方法
等があげられる。

【００３５】III．式（３）に記載された化合物の製造
方法の例 式（３）に記載された化合物は、例えば、以下の式（Ｘ
７）：

【化１２】 ［式（Ｘ７）中、Ｒはおよびｎは先に定義した通りであ
る］で表されるエステル化合物からＲで表されるカルボ
キシル基の保護基を除去することにより製造できる。

【００３６】式（Ｘ７）の化合物は、式（Ｘ２）で表さ
れる２−ジメチルアミノ−５,６−ジメチル−４−ピリ
ミジノンに、以下の式（Ｘ８）：

【化１３】 ［式（Ｘ８）中、Ｙは、Ｂｒ、Ｃｌ等のハロゲン原子で
あり；そしてＲおよびｎは先に定義した通りである］で
表されるジカルボン酸誘導体を反応させることにより得
られる。

【００３７】反応は、例えばアセトニトリル、ジクロロ
メタン、１,２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼ
ン、トルエン、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の適当な有
機溶媒中で、トリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロ
ピルエチルアミン等の有機塩基存在下、マイナス２０℃
から８０℃、好ましくは０℃から２５℃、０．５時間か
ら２０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌すること
により得ることができる。

【００３８】式（Ｘ８）のジカルボン酸モノエステルモ
ノ酸クロリドは、アセトニトリル、ジクロロメタン、
１,２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼン、トル
エン、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の適当な有機溶媒中
で、以下の式（Ｘ９）：

【化１４】 ［式（Ｘ９）中、Ｙ及びｎは先に定義した通りである］
で表されるジカルボン酸誘導体とＲ−ＯＨで表されるア
ルコールをトリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピ
ルエチルアミン等の有機塩基存在下、マイナス２０℃か
ら８０℃、好ましくは０℃から２５℃、０．５時間から
２０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌することに
より得ることができる。

【００３９】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶
操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とする
ことができる。

【００４０】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００４１】ピリミカーブ誘導体と高分子化合物との結
合体の作製 上述のように合成されたピリミカーブ誘導体を適当な高
分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用す
る。

【００４２】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ］と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがあるが、ＫＬＨ
及びＢＳＡが好ましい。

【００４３】ピリミカーブ誘導体と高分子化合物との結
合は、例えば、活性化エステル法（A.E. KARU et al.:
J. Agric. Food Chem. 42 301-309 (1994)）、又は混合
酸無水物法（B.F.Erlanger et al.:J.Biol.Chem. 234 1
090-1094 (1954)）等の公知の方法によって行うことが
できる。

【００４４】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ドエステルを生成させる。

【００４５】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」という）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハ
プテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比
は好ましくは１：１０−１０：１、より好ましくは、
１：１−１：１０、最も好ましくは１：１である。反応
温度は、０−１００℃、好ましくは５−５０℃、より好
ましくは２２−２７℃で、反応時間は５分−２４時間、
好ましくは３０分−６時間、より好ましくは１−２時間
である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行
うことができる。

【００４６】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０−６０℃、好ましくは５−４
０℃、より好ましくは２２−２７℃で、反応時間は５分
−２４時間、好ましくは１−１６時間、より好ましくは
１−２時間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によ
って精製して、ピリミカーブ誘導体と高分子化合物との
結合体を得ることができる。

【００４７】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、通常のショッテン−バウマン反応によ
り得られ、これを高分子化合物と反応させることにより
目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造され
る。ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下
に行われる。塩基性化合物としてはショッテン−バウマ
ン反応において慣用されている化合物を使用することが
できる。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミ
ン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジ
ン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡ
ＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等
が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃−１００
℃、好ましくは０℃−５０℃において行われ、反応時間
は５分−１０時間、好ましくは５分−２時間である。得
られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マ
イナス２０℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃に
おいて行われ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは
５分−５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で
行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されて
いるいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキ
サン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメト
キシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベン
ゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸
メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリ
ン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられ
る。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステ
ルとしては、例えばクロロ蟻酸イソブチル、クロロ蟻酸
メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ
蟻酸エチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテン
とハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い
範囲から適宜選択され得る。

【００４８】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をピリミカーブ誘導体に結合させたものを、免
疫学測定方法において使用することができる。標識物質
としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲ
Ｐ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フ
ルオレセインイソチオシアネート、ローダミン等の発色
物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質など
がある。

【００４９】ポリクローナル抗体の作製 ピリミカーブ誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗
体を作製することができる。例えば、ピリミカーブ誘導
体−ＫＬＨ結合体をリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と
言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完
全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合
したものを、免疫用抗原として動物に免疫することによ
って行う。免疫される動物としては当該分野で常用され
るものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。

【００５０】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。投与は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間
隔で複数回行うことができる。

【００５１】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、ピリミカーブと反応するポリクロ
ーナル抗体の存在を評価することができる。

【００５２】本発明において、後述するピリミカーブ誘
導体−１，２または３と高分子化合物との結合体を免疫
用抗原として得られた抗血清は、間接競合ＥＬＩＳＡ法
において約０．１−１００ｎｇ／ｍｌの濃度でピリミカ
ーブと反応した。同様に、ピリミカーブ誘導体−４また
は５と高分子化合物との結合体を免疫用抗原として得ら
れた抗血清は約１−１００ｎｇ／ｍｌの濃度でピリミカ
ーブと反応した（実施例１０、図１）。

【００５３】モノクローナル抗体の作製 ピリミカーブ誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作
製することができる。

【００５４】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００５５】（ａ）免疫用抗原として使用するピリミカ
ーブ誘導体と高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００５６】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学（山
下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６
年）に記載されている。

【００５７】以下、上述の本発明のピリミカーブに対す
るモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに
制限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００５８】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５９】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００６０】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【００６１】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日
に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００６２】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法に
ついては、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）
に記載されている。別の融合方法としては、電気処理
（電気融合）による方法を採用することもできる（大河
内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８
７）。その他の方法を適宜採用することもできる。ま
た、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えば
ミエローマ細胞に対して脾細胞を３−１０倍程度用いれ
ばよい。

【００６３】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
産生能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００６４】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、ピリミカーブに対する抗体活性を測
定する。

【００６５】さらに、測定によりピリミカーブに反応す
る抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞
クローニングを行う。この細胞クローニング法として
は、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培
地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレー
ターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーター
によって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」
等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いら
れる。

【００６６】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗ピリミカーブ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用
いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素
濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度中の恒温器
中）で培養するのが好ましい。

【００６７】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６８】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗ピリミカーブモノクローナル抗体として使用
することができるが、さらに透析、硫酸アンモニウムに
よる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集
め精製することにより抗ピリミカーブモノクローナル抗
体を得ることができる。さらに高度な精製が必要な場合
には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせる
ことにより実施できる。

【００６９】以上のようにして得られた抗ピリミカーブ
モノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法な
どの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決
定することができる。

【００７０】抗体によるピリミカーブの測定 本発明で使用する抗体によるピリミカーブの測定方法と
しては、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ法）、Ｅ
ＬＩＳＡ法（Engvall,E., Methods in Enzymol., 70,
419-439 (1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット
法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）
法等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法
（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会
社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５
７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点か
らＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【００７１】ピリミカーブの測定は各種ＥＬＩＳＡ法の
うち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下の
ような手順により行うことができる。（ａ）まず、抗原
であるピリミカーブ誘導体と高分子化合物との結合体を
担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表
面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキ
ングする。（ｃ）これに各種濃度のピリミカーブを含む
試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びピリ
ミカーブに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合
体及びピリミカーブ−抗体複合体を生成させる。（ｄ）
固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予
め作成した検量線から試料中のピリミカーブの量を決定
することができる。

【００７２】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００７３】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、ダルベッコのリン酸緩衝液を挙げることができ
る。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは
０.０５−５μｇ／ｍｌが適している。また、担体とし
て９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場
合には、３００μｌ／ウェル以下で２０−１５０μｌ／
ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条
件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュ
ベーションが適している。

【００７４】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体作製に使用したピリミカーブ誘導体と高分子化合物
との結合体のみならず、式（１）ないし（３）のいずれ
かで表される他の誘導体と高分子化合物との結合体を用
いることもできる。例えば、式（１）の化合物と高分子
化合物との結合体を抗原として抗体を作製した場合、式
（１）以外の化合物を固相化抗原として用いることもで
きる。また、式（１）−（３）の化合物で、ｎの数が相
違する抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いることも
できる。さらに、式（１）−（３）に含まれない他のピ
リミカーブ類似化合物も、固相化抗原として使用するこ
とも可能である。

【００７５】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（ピリ
ミカーブ誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化し
た担体において、ピリミカーブ誘導体部分以外に後で添
加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、
もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤と
して、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用でき
る。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃ
ｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等
のブロッキング剤として市販されているものを使用する
こともできる。具体的には、限定されるわけではない
が、例えば抗原を固相化した部分に、ブロッキング剤を
含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭＮａＣｌを
添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適
量加え、約４℃−室温で、１時間−５時間インキュベー
ションした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。
洗浄液としては特に制限はないが、例えば、６０ｍＭ
ＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液を用いることができ
る。

【００７６】次いで（ｃ）工程において、ピリミカーブ
を含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相
化抗原及びピリミカーブと反応させることにより、固相
化抗原−抗体複合体及びピリミカーブ−抗体複合体が生
成する。

【００７７】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のピリミカーブに対する抗体を加え、更に第二抗
体として標識物質を結合した第一抗体に対する抗体を順
次加えて反応させる。

【００７８】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、室温で約１時間行え
ばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗
原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液として
は、例えば、６０ｍＭ ＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝
液を用いることができる。

【００７９】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約５００−１０
０００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好まし
くは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反
応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体
が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用い
てもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【００８０】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からピリミカーブの
量を算出することができる。

【００８１】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば過酸化水素、並びに
３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フ
ェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む発
色基質溶液を使用する。限定されるわけではないが、発
色基質溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎ
の硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３,
３',５,５'−テトラメチルベンジジンを使用する場合、
４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場
合、４９０ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に
結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する
場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とし
て発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、
４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。

【００８２】ピリミカーブを添加しない反応溶液の吸光
度に対して、ピリミカーブを添加して抗体と反応させた
溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の
濃度のピリミカーブを添加した反応液の阻害率により予
め作成しておいた検量線を用いて、試料中のピリミカー
ブの濃度を算出できる。

【００８３】本発明のモノクローナル抗体ＰＭＣ２７−
２９は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によってピリミカー
ブを約１０−約１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０−
５００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することができる（実施
例１２、図２）。

【００８４】あるいは、ピリミカーブの測定は、例えば
以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用い
た直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。

【００８５】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を担体に固相化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。 （ｃ）各種濃度のピリミカーブを含む試料及び、ピリミ
カーブ誘導体と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを、
担体に固相化した抗体と反応させる。 （ｄ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のピリミカーブの量を決定する。

【００８６】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【００８７】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のピリミカー
ブ及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に吸
着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目
的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００８８】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、ピリミカーブ誘導体を酵素に結合する方法
であれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよい。
例えば、前述した活性化エステル法を採用することがで
きる。調製した酵素結合ハプテンは、ピリミカーブを含
む試料と混合する。

【００８９】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したピリミカー
ブ誘導体自体のみならず、式（１）ないし（３）で表さ
れる他の誘導体、さらに、式（１）ないし（３）に含ま
れない他のピリミカーブ類似化合物も使用可能である。
（ｃ）工程においてピリミカーブを含む試料及び酵素結
合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、ピリミカーブ
と酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと
固相化抗体との複合体が生成する。ピリミカーブを含む
試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわ
けではないが、反応は例えば室温でおよそ１時間行う。
反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合
しなかった酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例
えば６０ｍＭ ＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液を使用
することができる。

【００９０】さらに、（ｄ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からピリミカーブの量を算出することができ
る。

【００９１】本発明のモノクローナル抗体ＰＭＣ２７−
２９は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によってピリミカー
ブを約１．５−１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１．５−
５０ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することができる（実施例
１５、図３）。

【００９２】本発明の抗体のメタノール耐性 本発明の一態様であるモノクローナル抗体ＰＭＣ２７−
２９はさらに、上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
れば約０−２０％の濃度のメタノール存在下においてピ
リミカーブを濃度依存的に認識できる。ピリミカーブは
有機溶媒に易溶性であり、一般に分析はメタノール等の
有機溶媒中で行われることを考慮すると、本発明のモノ
クローナル抗体のこのような特性は非常に有効である。

【００９３】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法または間接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交
差反応性を調べることができる。ＰＭＣ２７−２９は、
直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法および間接競合阻害ＥＬＩＳ
Ａ法のいずれにおいてもピリミカーブの類縁化合物とは
約０.２５％以下しか交差反応しない。（実施例１６、
表１）。

【００９４】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００９５】

【実施例】実施例１ ピリミカーブ誘導体−１の合成

【化１５】

【００９６】（２）の合成 ２−ジメチルアミノ−５,６−ジメチル−４−ピリミジ
ノン（１）１．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）とブロモ酢酸エチ
ル１．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）、それに炭酸カリウム４．
２ｇ（３０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのアセトニトリルに
加えて、８５℃で還流させながら３時間撹拌した。反応
液をセライトで濾過し、濾液を濃縮後、シリカゲルクロ
マトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル＝４：１）で精
製すると、白色結晶として２．２ｇ（収率８５％）の
（２）を得た。

【００９７】ピリミカーブ誘導体−１（３）の合成 （２）２．２ｇ（８．７ｍｍｏｌ）をエタノール-水
（２：１）混合液５０ｍｌに溶解して、水酸化ナトリウ
ム１．０ｇ（２５ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で１．５
時間撹拌した。塩酸水溶液でｐＨを中性にして、析出し
てきた塩を濾別後、濾液を濃縮してシリカゲルクロマト
グラフィー（クロロホルム−メタノール＝２０：１そし
てＴＨＦ）で精製すると、白色結晶として０．９ｇ（収
率４６％）のピリミカーブ誘導体−１（３）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） ２．０１ （ｓ，３Ｈ）， ２．２５ （ｓ，３
Ｈ），３．０５ （ｓ，６Ｈ）， ４．８９ （ｓ，
２Ｈ），１１．６４ （ｓ，１Ｈ）

【００９８】実施例２ ピリミカーブ誘導体−２の合成

【化１６】

【００９９】（４）の合成 実施例１で作製したピリミカーブ誘導体−１（３）６．
８ｇ（３０ｍｍｏｌ）、４−アミノ酪酸ｔｅｒｔ−ブチ
ル４．８ｇ（３０ｍｍｏｌ）、及び５．１ｇ（４４ｍｍ
ｏｌ）のＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのＴＨＦ溶液３
０ｍｌを氷冷して、ジシクロヘキシルカルボジイミド
７．２ｇ（３５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液５０ｍｌを滴下
した。滴下終了後、室温で一晩撹拌した。析出してきた
ジシクロヘキシル尿素を濾過で除いた後、ろ液を濃縮し
てシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチ
ル＝２：１）で精製すると、白色結晶として７．４ｇ
（収率６７％）の（４）を得た。

【０１００】ピリミカーブ誘導体−２（５）の合成 ハプテンのエステル（４）１．５ｇ（４．１ｍｍｏｌ）
を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ
酢酸５ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。反応溶液を
濃縮し、濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロ
ロホルム−メタノール＝４：１）で精製すると、潮解性
の強い白色結晶として１．０ｇ（収率７９％）のピリミ
カーブ誘導体−２（５）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ） １．５１〜１．９０（ｍ，２Ｈ），２．０４（ｓ，３
Ｈ）、２．１１〜２．４６(overlap,５Ｈ)，３．００〜
３．２９(overlap,８Ｈ)，４．８０（ｓ，２Ｈ），８．
０２〜８．２９（ｂｒ，１Ｈ）

【０１０１】実施例３ ピリミカーブ誘導体−３の合成

【化１７】

【０１０２】（４）の合成 実施例１で作製したピリミカーブ誘導体−１（３）２．
３ｇ（１０ｍｍｏｌ）、６−アミノヘキサン酸ｔｅｒｔ
−ブチル１．９ｇ（１０ｍｍｏｌ）、及び１．７ｇ（１
５ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのジクロ
ロメタン溶液１５０ｍｌを氷冷して、ジシクロヘキシル
カルボジイミド２．３ｇ（１１ｍｍｏｌ）のジクロロメ
タン溶液５０ｍｌを滴下した。滴下終了後、室温で一日
撹拌した。析出してきたジシクロヘキシル尿素を濾過で
除いた後、ろ液を濃縮してシリカゲルクロマトグラフィ
ー（ヘキサン−酢酸エチル＝２：１）で精製すると、透
明液体として２．５７ｇ（収率６４％）の（４）を得
た。

【０１０３】ピリミカーブ誘導体−３（５）の合成 ハプテンのエステル（４）２．５７ｇ（６．５ｍｍｏ
ｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフル
オロ酢酸１０ｍｌを加えて室温で２時間撹拌した。反応
溶液を濃縮し、濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィー
（酢酸エチル、そしてクロロホルム−メタノール＝４：
１）で精製すると、２．２ｇ（収率１００％）のピリミ
カーブ誘導体−３（５）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．０４〜１．２１（ｍ，２Ｈ），１．３５〜１．５７（ｍ，４Ｈ）， ２．１０（ｓ，３Ｈ）， ２．１３〜２．３０（ｔ，２Ｈ）， ２．５２（ｓ，３Ｈ）， ３．１７〜３．４１（overlap，８Ｈ）， ４．８７（ｓ，２Ｈ）， ６．００〜６．１９（ｂｒ，１Ｈ）

【０１０４】実施例４ ピリミカーブ誘導体−４の合成

【化１８】

【０１０５】（２）の合成 ２−ジメチルアミノ−５,６−ジメチル−４−ピリミジ
ノン（１）０．９６ｇ（５．８ｍｍｏｌ）、６−ブロモ
ヘキサン酸エチル１．６ｇ（７．２ｍｍｏｌ）、それに
炭酸カリウム３．０ｇ（２２ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの
アセトニトリルに加えて、８０℃で還流させながら３時
間撹拌した。反応液をセライトで濾過し、濾液を濃縮
後、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エ
チル＝９：１）で精製すると、透明液体として１．６７
ｇ（収率９４％）の（２）を得た。

【０１０６】ピリミカーブ誘導体−４（３）の合成 エチルエステル（２）１．６７ｇ（５．４ｍｍｏｌ）を
エタノール-水（５：１）混合液１２０ｍｌに溶解し
て、水酸化ナトリウム１．０ｇ（２５ｍｍｏｌ）を加え
た後、室温で３時間撹拌した。トリフルオロ酢酸を数滴
加えて濃縮すると、白色固形物が析出してきたので、そ
れをクロロホルム−メタノール溶液に溶解してシリカゲ
ルクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝
９：１）で精製すると、１．４２ｇ（収率９３％）のピ
リミカーブ誘導体−４（３）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．４１〜１．５６（ｍ，２Ｈ）， １．６４〜１．８
１（ｍ，４Ｈ），１．９５ （ｓ，３Ｈ），２．２８
（ｓ，３Ｈ），２．３１〜２．４２（ｔ，２Ｈ），
３．１２ （ｓ，６Ｈ），４．２３〜４．３２（ｔ，２
Ｈ）

【０１０７】実施例５ ピリミカーブ誘導体−５の合成

【化１９】

【０１０８】（４）の合成 実施例１で作製したピリミカーブ誘導体−１（３）２．
０ｇ（８．９ｍｍｏｌ）、４−（Ｎ−メチルアミノ）酪
酸ｔｅｒｔ−ブチル１．７ｇ（９．８ｍｍｏｌ）、及び
１．５４ｇ（１３．４ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシこは
く酸イミドのジクロロメタン溶液１００ｍｌを氷冷し
て、ジシクロヘキシルカルボジイミド２．０ｇ（９．７
ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液２０ｍｌを滴下した。
滴下終了後、室温で一日撹拌した。析出してきたジシク
ロヘキシル尿素を濾過で除いた後、ろ液を濃縮してシリ
カゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル＝
２：１）で精製すると、２．６ｇ（収率７７％）の
（４）を得た。

【０１０９】ピリミカーブ誘導体−５（５）の合成 ハプテンのエステル（４）２．６ｇ（６．８ｍｍｏｌ）
を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオ
ロ酢酸２０ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。反応溶
液を濃縮し、濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィー
（酢酸エチル、そしてクロロホルム−メタノール＝４：
１）で精製すると、２．２ｇ（収率１００％）のピリミ
カーブ誘導体−５（５）を２つの異性体混合物として得
た。尚、この異性体はアミド結合回転障害に起因する立
体異性体である。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）（２つの立体異性体混合物） １．７０〜１．９２（ｍ，２Ｈ）， ２．０７（ｓ，３
Ｈ），２．０８〜２．１８ と ２．２８〜２．３０
（ｔ，２Ｈ），２．４７（ｓ，３Ｈ）， ３．９５と
３．０４（ｓ，３Ｈ），３．２３と３．２５ （ｓ，６
Ｈ），３．２５〜３．３５ と ３．３５〜３．４７
（ｔ，２Ｈ）,５．０４と５．１５ （ｓ，２Ｈ）

【０１１０】実施例６ ピリミカーブ誘導体−６の合成

【化２０】

【０１１１】（２）の合成 アジピン酸クロリド１．８３ｇ（１０ｍｍｏｌ）をジク
ロロメタン１００ｍｌに溶解して、ベンジルアルコール
１．０８ｇ（１０ｍｍｏｌ）そしてトリエチルアミン
１．０ｇ（１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１０ｍ
ｌをそれぞれ氷冷下で滴下した。３０分撹拌後に、２−
ジメチルアミノ−５,６−ジメチル−４−ピリミジノン
（１）１．６７ｇ（１０ｍｍｏｌ）そしてトリエチルア
ミン１．０ｇ（１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１
０ｍｌをそれぞれ氷冷下で滴下した。氷冷下で３０分、
室温で２時間撹拌後に、シリカゲルクロマトグラフィー
（ヘキサン−酢酸エチル＝９：１）で精製すると、１．
０ｇ（収率２６％）の（２）を得た。

【０１１２】ピリミカーブ誘導体−６（３）の合成 ベンジルエステル（２）１．０ｇ（２．６ｍｍｏｌ）を
エタノール１５０ｍｌに溶解して、５％パラジウムカー
ボン２８０ｍｇを加えて水素存在下、室温で３０分撹拌
した。パラジウムカーボンを濾別後、濾液を濃縮してシ
リカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル＝
１：１）で精製すると、０．５ｇ（収率６５％）のピリ
ミカーブ誘導体−６（３）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．５６〜１．８５（ｍ，４Ｈ）， １．９２（ｓ，
３Ｈ），２．２８〜２．４３（overlap，５Ｈ），２．
５５〜２．６６（ｔ，２Ｈ） ３．１１（ｓ，６Ｈ）

【０１１３】実施例７ 免疫用抗原の作製 上記実施例１−５において作製したピリミカーブ誘導体
−１ないし−５をハプテンとして免疫用抗原を作製し
た。まずピリミカーブ誘導体をハプテンとして、各々
３．５μｍｏｌをＤＭＳＯ ５０μｌに溶解した。次に
これらの溶液にＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（５μｍ
ｏｌ）をＤＭＳＯ １０μｌに溶解し添加後、さらに１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩（４μｍｏｌ）をＤＭＳＯ ２０μｌに
溶解し添加した。室温にて１．５時間反応させた後、こ
の反応溶液に８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５
００μｌに溶解したＫＬＨまたはＢＳＡ各々１０ｍｇを
さらに添加し、再び室温にて１．５時間反応させた。反
応終了後、ダルベコのリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ
（−）」という）に対して透析し、ピリミカ−ブ誘導体
−ＫＬＨ結合体、ピリミカーブ誘導体−ＢＳＡ結合体を
各々調製した。

【０１１４】実施例８ 免疫感作 免疫には、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例７で調
製したピリミカーブ誘導体とＫＬＨとの結合体１００μ
ｇをＰＢＳ（−）５０μｌに溶解し、等量のフロイント
完全アジュバントと乳化混合した後、マウスの腹腔内に
接種した。１カ月後に初回免疫の１／４量を追加免疫
し、その一週間後マウスの尾静脈から採血し、抗血清を
調製した。さらにその１０日後に同量を最終免疫した。

【０１１５】実施例９ 抗血清の採取及び抗体活性の測
定 実施例８で調製した抗血清の活性を実施例７で調製した
ピリミカーブ誘導体−ＢＳＡ結合体を用いたＥＬＩＳＡ
法にて測定した。

【０１１６】各免疫原に対応するＢＳＡとの結合体（４
μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（−）に溶解し、９６ウェルのマ
イクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルで添加
し、４℃で一晩静置することにより、固相化した。次に
３００μｌ／ウェルでブロッキング緩衝液｛１％ＢＳＡ
と６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．０）｝に置き換え、室温で１時間ブロッキン
グした。このウェルを洗浄液（６０ｍＭ ＮａＣｌを添
加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄し
た後、抗体希釈液｛０．３％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣ
ｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝で
段階希釈した抗血清を１００μｌ／ウェルで加え、室温
で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄した後、再び抗体
希釈液で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マ
ウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を１００μｌ／ウェルで
添加し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄した
後、ペルオキシダーゼの基質溶液｛３，３’５，５’−
テトラメチルベンチジン（１００μｇ／ｍｌ）、０．０
０６％過酸化水素を添加した０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）｝で１０分間発色し、１Ｎ硫酸で反
応停止後４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１１７】実施例１０ 間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
よる抗血清のピリミカーブとの反応性 実施例９で活性の確認できた抗血清について、ピリミカ
ーブに対する反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により
評価した。

【０１１８】まず実施例９と同様に固相化し、ブロッキ
ングしたマイクロタイタープレートへ、希釈液｛１５０
ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．０）｝で適当な濃度に希釈したピリミカーブ溶液を
５０μｌ／ウェルで加えた。その後、直ちに同じ希釈液
を用いて、先の実施例９のＥＬＩＳＡ法で抗体過剰域の
吸光度の７０％程度となるように希釈した抗体溶液を５
０μｌ／ウェルで加えて混合し、室温で１時間反応し
た。３回洗浄した後、実施例９に示したＥＬＩＳＡ法と
同様にペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体と反応
させ、発色後４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１１９】結果は、図１に示すように、 ピリミカー
ブ誘導体−１、−２及び−３から作製した抗血清が約
０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、ピリミカーブ
誘導体−４および−５から作製した抗血清が約１〜１０
０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でピリミカーブと反応した。

【０１２０】実施例１１ モノクローナル抗体の作製 細胞融合には、ピリミカーブ誘導体−１または−２をハ
プテンとする抗原で免疫したマウスを用いた。最終免疫
後３日目のマウスの脾臓細胞をＤＭＥＭ中に取り出し、
ＤＭＥＭにて３回洗浄した。洗浄後、同様に洗浄したマ
ウスのミエロ−マ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と
細胞数の比で５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）とな
るように混合し、遠心（１，２００ｒｐｍ、５分間）し
て細胞沈さを集めた。この細胞沈さに予め３７℃に加温
しておいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１，
５００）１ｍｌを加え、細胞を融合した。次いで、ＤＭ
ＥＭ１０ｍｌを徐々に添加し、牛胎児血清（以下、「Ｆ
ＢＳ」という）１ｍｌを更に添加することにより、融合
を停止した。ＤＭＥＭにて１回洗浄後、１０％ＦＢＳを
添加したＤＭＥＭにヒポキサンチン（１００μＭ）、ア
ミノプテリン（０．４μＭ）、およびチミジン（１６μ
Ｍ）を添加したＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウェルのポリ
スチレンプレートに２×１０⁵細胞／ウェルで分注し、
３７℃、５％二酸化炭素存在下で１０日間−１４日間培
養した。培養後、各ウェル中の抗体活性の有無をスクリ
ーニングした。抗体の反応性は、実施例７で作製したピ
リミカーブ誘導体−ＢＳＡ結合体を用いて実施例９に示
したＥＬＩＳＡ法および実施例１０に示した間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様の方法で測定した。

【０１２１】ピリミカーブ誘導体−ＢＳＡ結合体に反応
性を示したウェル中のハイブリドーマを、限界希釈法に
よって細胞クローニングし、モノクローナル抗体産生細
胞とした。これらのうち、ピリミカーブ誘導体−ＢＳＡ
結合体に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマを３株（ ＰＭＣ２６−２２、ＰＭＣ２７−２
２、ＰＭＣ２７−２９）分離した。ＰＭＣ２６−２２は
ピリミカーブ誘導体−２をハプテンとする免疫原から得
られ、ＰＭＣ２７−２２およびＰＭＣ２７−２９は、ピ
リミカーブ誘導体−１をハプテンとする免疫原から得ら
れた。これらの産生するモノクローナル抗体は、すべて
ＩｇＧ１だった。このうち、ＰＭＣ２７−２９を平成９
年９月１２日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４２０で
工業技術院生命工学工業研究所（〒３０５ 茨城県つく
ば市東１丁目１番３号）に寄託した。

【０１２２】実施例１２ 間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
よるモノクローナル抗体のピリミカーブとの反応性 実施例１１において分離した３株のハイブリドーマが産
生するモノクローナル抗体（以後モノクローナル抗体
は、これらを産生するハイブリドーマと同一名称を用い
る）とピリミカーブとの反応性を競合反応時に１０％メ
タノールを加えた条件下で、実施例１０と同様の間接競
合阻害ＥＬＩＳＡ法によって検討した。

【０１２３】その結果、図２に示したように、いずれの
抗体もピリミカーブとの反応性は変わらず、１０〜１０
００ｎｇ／ｍｌの測定範囲で、ピリミカーブと反応し
た。

【０１２４】実施例１３ モノクローナル抗体の精製 ３種類のモノクローナル抗体のうちＰＭＣ２７ー２９に
ついて抗体精製を行った。まず、ハイブリドーマを１０
％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて培養し、培養
上清を得た。これに５０％飽和となるように硫安を加
え、４℃で１時間撹拌した。生じた沈殿物をＰＢＳ
（−）によって可溶化し、透析した。透析によって得ら
れた蛋白画分は、さらにＤＥＡＥセルロースカラムクロ
マトグラフィーによって精製した。

【０１２５】実施例１４ ピリミカーブ誘導体とＨＲＰ
との結合体の作製 まずピリミカーブ誘導体−１及び−２の１．２５μｍｏ
ｌをＤＭＳＯ ５０μｌに溶解した。この溶液へＤＭＳ
Ｏに溶解したＮ-ヒドロキシこはく酸イミド（５．５μ
ｍｏｌ）３μｌ、および１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３．５μｍ
ｏｌ）７μｌを加え、室温にて１時間反応させた。この
反応液に１Ｍ炭酸水素ナトリウム４０μｌを加え、更に
ＨＲＰ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌを加えて混合
し、室温にて３時間反応した。得られた反応液をゲル濾
過カラム（Ｇ−２５）に通して、ペルオキシダーゼ画分
を得ることにより、ピリミカーブ誘導体−ＨＲＰ結合体
を得た。

【０１２６】これらの結合体とＰＭＣ２７−２９との反
応性をＥＬＩＳＡ法で比較した。ＰＭＣ２７−２９を固
相化し、ブロッキングした９６ウェルのマイクロタイタ
ープレートに段階希釈したピリミカーブ誘導体−ＨＲＰ
結合体を加え、反応させた。洗浄後、発色させ、生じた
吸光度を測定した。その結果、ピリミカーブ誘導体-２
−ＨＲＰ結合体は、誘導体-１−ＨＲＰ結合体と比較し
て２０倍反応性が高かった。

【０１２７】実施例１５ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で
のモノクローナル抗体ＰＭＣ２７ー２９のピリミカーブ
との反応性、並びにメタノール耐性 実施例１３で精製したモノクローナル抗体ＰＭＣ２７−
２９と実施例１４で調製したピリミカーブ誘導体−ＨＲ
Ｐ結合体を用いて、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるピ
リミカーブの測定系を検討した。

【０１２８】まず実施例１３で精製したＰＭＣ２７−２
９を４μｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９．６）に溶解し、９６ウェルのマイクロタイ
タープレートに１００μｌ／ウェルで加えた後、４℃で
一晩静置することにより固相化した。つぎに３００μｌ
／ウェルでブロッキング緩衝液に置き換え、室温で１時
間ブロッキングした。一方、最終濃度が０から３０％の
メタノールを添加した希釈液でピリミカーブの希釈列を
調製した後、ピリミカーブ誘導体−ＨＲＰ結合体を等量
混合した。これらの混合液をブロッキング処理後のプレ
ートに１００μｌ／ウェルで加え、室温にて１時間反応
させた。洗浄液で５回洗浄した後、実施例９に示したＥ
ＬＩＳＡ法と同様の方法で発色させ、４５０ｎｍの吸光
度を測定した。

【０１２９】その結果、ピリミカーブ誘導体-２−ＨＲ
Ｐ結合体は、誘導体-１−ＨＲＰ結合体の１／２０の濃
度で、ＰＭＣ２７−２９に対して同程度の競合反応性を
示すことが明らかになった。そこで、以降はピリミカー
ブ誘導体-２−ＨＲＰ結合体を用いて実験を行った。図
３にピリミカーブの標準曲線を示すが、本発明の抗体Ｐ
ＭＣ２７−２９は、メタノール未添加の場合１．５−１
５ｎｇ／ｍｌの測定範囲でピリミカーブと反応し、５−
１５％メタノールでは、５−１００ｎｇ／ｍｌの測定範
囲でピリミカーブを測定することが可能であった。

【０１３０】実施例１６ モノクローナル抗体ＰＭＣ２
７−２９のピリミカーブ類縁化合物との交差反応性 メタノール未添加の条件で、ＰＭＣ２７−２９の類縁化
合物との交差反応性をピリミカーブ誘導体-２−ＨＲＰ
結合体を用いて、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により調べ
た。結果は、これらの化合物未添加時の反応を５０％阻
害する化合物の濃度を各々ＩＣ₅₀値として、表１に示し
た。

【０１３１】

【表１】

【０１３２】表１からわかるように、ＰＭＣ２７−２９
は表１に示されるいずれの類縁化合物とも、ほとんども
しくは全く反応しなかった。従って、ＰＭＣ２７−２９
は、ピリミカーブと特異的に反応することが明らかとな
った。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のピリミカーブ誘導体を用いて
得られた抗血清の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるピリ
ミカーブとの反応性を示す。

【図２】図２は、本発明の３種類のモノクローナル抗体
の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるピリミカーブとの反
応性を示す。

【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体ＰＭＣ２
７−２９の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるピリミカー
ブとの反応性、およびメタノール耐性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 33/563 33/563 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 三宅 司郎 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 山口 優樹 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 別府 佳紀 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）−（３） 【化１】 ［式（１）−（３）中、 Ｘは、Ｈまたはメチル基であり；そしてｎは、１−１０
   の整数である］からなる群から選択される構造を有する
   化合物。
2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物と高分子化合物又
   は標識物質との結合体。
3. 【請求項３】請求項１に記載の化合物と高分子化合物を
   結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いる
   ことにより、以下の式（４）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（４）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
4. 【請求項４】請求項３に記載の方法により製造された、
   式（４）の化合物と反応性を示す抗体又はそのフラグメ
   ント。
5. 【請求項５】モノクローナル抗体である、請求項４に記
   載の抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】ＰＭＣ２７−２９である、請求項４ないし
   ５のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
7. 【請求項７】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体又はそのフラグメントを産生するハイブリドーマ。
8. 【請求項８】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４２０で寄託
   されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
9. 【請求項９】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体又はそのフラグメントを用いることを特徴とする、
   式（４）で表される化合物の免疫学的測定方法。
10. 【請求項１０】さらに、式（１）−（３）のいずれかで
    表される化合物と高分子化合物または標識化合物との結
    合体を使用することを含む、請求項９に記載の免疫学的
    測定方法。