JPH03503003A

JPH03503003A - 分子認識ユニット

Info

Publication number: JPH03503003A
Application number: JP50192990A
Authority: JP
Inventors: ロッドウェル，ジョン，ディー; マッカーン，トーマス，ジェー
Original assignee: サイトジェン　コーポレーション
Priority date: 1988-12-29
Filing date: 1989-12-28
Publication date: 1991-07-11
Also published as: AU4831590A; EP0376851A3; EP0376851A2; CA2006878A1; WO1990007713A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】分子認識ユニット１、発明の分野本発明は、小分子、または大分子の小領域を認識し、かつ特異的に結合する、天然に存在する多数の巨大分子の結合特異性を模したペプチドおよびポリペプチドを同定および／または設計するためのシステムまたは方法に関する。本発明はさらに、天然に存在する巨大分子に認識されこれと特異的に結合するリガンドとして機能する小分子、または大分子の小領域の、分子の構造的特徴を模したペプチドまたはポリペプチドを設計する方法に関する。

より詳細には、本発明は巨大分子の分子認識部位およびそれによる結合特異性を模したアミノ酸配列を有してなる新規ペプチドおよびポリペプチドを同定および／または設計する方法を包含する。この巨大分子は、イムノグロブリンまたは抗体、酵素、レセプタータンパク質、レクチン、および例えばアビジンやストレプトアビジンなどのような他の結合タンパク質を包含するがそれらに限定されない。さらに本発明は、天然に存在する広範な巨大分子に認識されこれと特異的に結合するリガンドとして機能する小分子、または大分子の小領域の、分子認識部位を模したアミノ酸配列を育してなる新規ペプチドおよびポリペプチドを設計する方法を包含する。リガンドとして機能する分子の例は、抗原、ホルモン、フェロモン、神経伝達物質、シグナルタンパク質およびペプチド、プロスタグランジン、などを包含するがそれらに限定されない。

本発明はさらにここに記載された方法またはシステムにしたがって調製された新規ペプチドおよびポリペプチドを包含する。また本発明は、本発明のペプチドまたはポリペプチドが、直接にまたはリンカ一部分を介してのいずれかによって別の化合物と結合した新規複合体も包含する。この複合体は、新規ペプチドまたはポリペプチドを含育する融合タンパク質を包含するがそれに限定されない。

さらに本発明は、記載の方法によって調製された新規ペプチドおよびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。

本発明の新規ペプチド、ポリペプチドおよび複合体は、生物医学分野での利用、生物学的制御および害虫調整、農業、化粧品、環境制御および廃棄物処理、化学、触媒作用、栄養および食品工業、軍事利用、および気候制御を包含する広範囲の応用に有利に用いられる。

２、発明の背景分子認識、すなわち他の分子をリガンドまたは基質として特異的に認識し結合する能力は、生物学的および／または生化学的システムにとってきわめて重要な、天然に存在する多数の巨大分子の重要な機能的性質である。巨大分子／リガンド複合体の形成は、特定の巨大分子の性質、および場合によってはその複合体が形成される環境に依存するさらに他のプロセスに通ずる。

例えば、酵素による基質の認識および結合により、その基質の化学的変化をもたらす；抗体または免疫グロブリンによる抗原の認識および結合は、かかる抗原の固定化および／または不活性化をもたらす；キャリアーまたは輸送タンパク質によるリガンドの認識および結合は、ある部位から別の部位へのリガンドの輸送をもたらす：ホルモンレセプターによるホルモンの認識および結合は細胞活性の変化をもたらす：収縮性タンパク質によるリガンドの認識および結合は、機械的作用をもたらす等である。従って、これらの天然に存在する巨大分子およびそのリガンドは、生体系の重要な構成要素であり、標的部位への薬剤の輸送のために、診断、治療、生物制御、分離および調製などのために生物学および医学分野においてとりわけ有用である。

さらに、巨大分子およびそのリガンドの用途は、化学物質やその他の物質の分離、調製、触媒作用およびモニタリングのような数多くの医学以外、生物学以外の工業的応用にも見いだされる。

均一な巨大分子および／またはかかる巨大分子に対するリガンドを大量に調製するための有効で安価な方法がまさに求められている。モノクローナル抗体技法の発展によれ、巨大分子の−カテゴリーである抗体または免疫グロブリンの均一な供給を得るための非常に有効な方法が与えられた。組換えＤＮＡ技法もまた、タンパク質性巨大分子およびリガンドの均一供給を得るための方法を提供している。化学合成法はある種の巨大分子およびリガンドを調製するための方法を与えることができるが、それはかかる物質の構造および化学的組成に関する知識が利用可能な場合である。

上記のような技法にも関わらず、生物医学および工業的応用のための大量で均一の巨大分子およびそのリガンドを、それらがタンパク質性であるとないとに関わらず、調製するための有効で安価な方法がなお現実に必要である。さらに、ある種の例に於ては、かかる分子のそのほかのエフェクター活性を有しない天然に存在する巨大分子の分子認識および結合特異性を有する物質の調製が求められる。

例を挙げて説明すると、特定抗体の特異的結合活性を有するがかかる抗体の他の活性、例えば補体を介した細胞溶解または抗体Ｆｃ領域の細胞表面レセプターとの結合を介した過敏性反応またはアレルギー反応、を有しない分子を得ることが所望されよう。従って天然に存在する巨大分子または天然に存在する巨大分子により認識されるリガンドのいずれかの結合特異性を模することのできる分子を調製する有用な方法が必要である。

抗体の抗原結合領域の特徴および結合特異性を有するとされる大きな単一のポリペプチド鎖の調製方法は、Ｌａｄｎｅｒによって記述される（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２２０８号、１９８８年３月１０日公告；米国特許第４７０４６９２号、１９８７年１１月３日発行、も参照）。この方法によれば、−またはそれ以上のペプチドリンカ−がコンピューターに基づくシステムによって発明され、そして抗的構造上の特徴を示す約２１５−２５０アミノ酸残基からなる単一のポリペプチド鎖を形成するために使用される。かかる大きなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、推定し、合成し、そして組換えＤＮＡ技法を用いて所望のポリペプチドを発現する好適な宿主細胞に挿入する。

約２１５−２５０アミノ酸残基の大きなポリペプチド分子を提供するＬａｄｎｅｒ記載の方法とは異なり、この請求の範囲に記載された方法は、巨大分子及びリガンドの結合特異性を模した４０−４５アミノ酸残基より小さな小ペプチド及びポリペプチドを提供する。さらに、本方法は、Ｌａｄｎｅｒの方法によると大きなポリペプチド鎖が抗体分子の結合を模することができるようにするために必要なリンカ−の調製および合成を必要としない。さらに、この請求の範囲に記載されたペプチド、ポリペプチドおよび接合体を調製するために組換えＤＮＡ技法を用いることができるが、ｔ、ａｃｔｎｅｔの方法とは異なり、本方法はかかる技法を必要としない。それほど高価でなく有効な化学合成法を、この請求の範囲に記載された組成物の調製に好都合に使用できる。

Ｂｒｕｃｋら（１９８６，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８３：６５７８−８２）は、レトロウィルスタイプ３血球凝集素（ＨＡ）のレセプター結合構造を抗原性と機能性の面から模したとされる抗−イディオタイプモノクローナル抗体、８７、９２．６の重可変領域および軽可変領域（ＶＨ’；’よびＶＬ）の分子クローニングおよび核酸配列を記載している。Ｂｒｕｃｋらはこれらの結果は、抗イデイオタイプ抗体によるウィルスＨＡ糖タンパク質の分子的模倣は抗体■、の相同なアミノ酸配列の伸長によって生じうることを示唆すると述べている。この著者らは抗体によるタンパク質性の抗原の模倣は共通する一次構造すなわち抗原および抗体に見いだされる相同なアミノ酸配列によって達成されると結論付けている。

Ｂｒｕｃｋらの発表とは異なり、本発明の方法は、模倣しようとする巨大分子やリガンドの一次構造に関する知識がなくてもその巨大分子やリガンドの結合特異性を育する小さなペプチドおよびポリペプチドを生成させることができる。さらに、ペプチド性またはタンパク質性リガンドのみならずペプチドでないリガンドの結合活性を模したペプチドおよびポリペプチドを調製するためにこの方法を用いることができる。

３、発明の要約本発明は、天然に存在する巨大分子の、または天然に存在する巨大分子に対してリガンドとして機能する小分子または大分子の小領域の、分子認識部位およびそれによる結合特異性を模したアミノ酸配列を有してなる新規ペプチドおよびポリペプチドを同定および／または設計するための新規でかつ有効な方法またはシステムを包含する。本発明はまた、その方法またはシステムにしたがって設計された新規ペプチドおよびポリペプチド、並びにこれらのペプチドおよびポリペプチドを含有する接合体を包含する。さらに、本発明は記載の方法またはシステムにしたがって設計された新規ペプチドおよびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。

新規分子認識ユニットを同定および／または設計し、そして調製するための本発明の方法は以下を含んでなる：（１）所望の分子認識ユニットの認識部位と相補的な分子認識部位である分子、またはそれを含有する分子と特異的に結合する１ｇＭ免疫グロブリンを発現するＢ細胞を免疫選択すること；（２）初期Ｂ細胞、すなわち生殖細胞遺伝子と比較した場合、発現されたデオキシリボヌクレオチド配列が単一の相補性決定領域に於て再配列されているＢ細胞を同定するために、工程（１）から選択されたＢ細胞をスクリーニングすること；（３）工程（２）で同定された再配列された相補性決定領域のヌクレオチド配列またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること；および（４）上記工程（３）で同定された配列によってコードされる所望の分子認識ユニットを合成すること。

ある実施態様に於ては、Ｂ細胞リンパ球は（ａ）模倣したい部位に対して相補的な分子認識部位であるか、あるいはそれを含有する抗原またはハブテンに特異的なり細胞リンパ球生産を刺激し；（ｂ）刺激を受けたＢ細胞リンパ球を不死化し：そじて（Ｃ）所望の分子認識ユニットの認識部位と相補的な分子認識部位である分子、またはそれを含有する分子と特異的に結合する所望の１ｇＭ免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を同定するために、不死化された細胞をスクリーニングすること、によって免疫選択される。

別の実施態様によれば、所望の分子認識ユニットに対して相補的な分子認識部位であるか、またはそれを含有する抗原またはハブテンと特異的に反応するものを同定するための１ｇＭイソタイプのモノクローナル抗体を生産する既知のおよび／または利用可能な不死化細胞系統をスクリーニングすることによってＢ細胞リンパ球が「免疫選択」される。

分子認識部位を含有する非常に多数の分子の結合特異性を模した約４０−４５アミノ酸残基未溝の新規ペプチドおよびポリペプチドを設計するために本発明の方法を使用できるため、本発明の方法は特に有利である。

実際、その方法を用いて、その分子がハブテンや抗原として機能することができる限りは、分子認識部位を含有するあらゆる分子の結合特異性を模することができる。従って、本発明のペプチドまたはポリペプチドによって模倣されることのできる分子はペプチドやポリペプチドである必要はない。さらに、その結合特異性を模倣したい分子の一次構造や配列の知識は本方法に関しては必要ない。

さらに、本発明の方法は、所望の分子認識部位を認識しこれと特異的に結合する能力を有する低分子量ペプチドおよびポリペプチドの均一供給を行うので、有利である。特にインビボで利用しようとする場合、ペプチドおよびポリペプチドが低い免疫原性を育するようにそれらを設計することができる。一方、そのほかに、ワクチンのようなインビボ用途に用いようとする場合、ペプチドおよびポリペプチドが増強された免疫原性を有するように設計することができる。

最後に、本発明は、新規ペプチド、ポリペプチド、および接合体を広範な分野の無数の応用に使用するための方法を提供する。このような応用は、生物医学、生物学的制御および害虫調整、農業、化粧品、環境制御および廃棄物処理、化学、触媒作用、栄養および食品工学、軍事利用および気候制御を包含する。

４、定　義この明細書を通じて用いられる「分子認識ユニット」（以下“ＭＲＵ″）なる用語は、分子認識部位を模したアミノ酸配列を存してなるペプチドまたはポリペプチドを包含するものとする。

「分子認識部位」なる用語は、小分子を、または大分子の小領域を認識し、これと特異的に結合する巨大分子のドメインまたは領域を包含するものとする。かかる分子認識部位の例は、免疫グロブリンの重鎮および軽鎖の高頻度可変領域によって形成される抗原結合部位（相補性決定領域（“ＣＤＲ″）としても知られる）、基質またはコファクター結合部位のような酵素のリガンド結合部位、レセプタータンパク質またはその他の結合タンパク質のリガンド結合部位などを包含するがそれらに限定されない。「分子認識部位」という用語はさらに、天然に存在する巨大分子に特異的に結合するリガンドとして機能する小分子または分子の小ドメインを包含するものとする。かかるリガンドの例は、ホ／ｌｚモン；フェロモン；神経伝達物質、シグナルタンパク質およびペプチドなどのシグナル物質等；酵素基質およびコファクター；レセプタータンパク質のリガンド；抗原等；を包含するがそれらに限定されない。

「リガンド」なる用語は、巨体分子上の分子認識部位と特異的に結合するか、またはこれに「ぴったりはまる」物質を包含するものとする。

「模（倣）する」なる用語は、きわめて類似するかまたは模倣する意味を有する。

［初期Ｂ細胞Ｊなる用語は、生殖細胞遺伝子と比較した場合に、発現されたデオキシリボヌクレオチド配列中にコードされる遺伝情報が唯一の相補性決定領域（ “ＣＤＲ”）内で再配列されているＢ細胞リンパ球またはＢ細胞リンパ球由来不死化細胞系統を包含するものとする。本文で用いられるデオキシリボヌクレオチド配列の「再配列Ｊなる用語は、可変領域遺伝子のもともとの生殖細胞配列に由来するヌクレオチドの、突然変異、組換え、挿入および／または欠失を包含する様々な変化の一つまたはそれ以上を包含するものとする。

５、発明の詳細な説明本発明は、分子認識部位を模したアミノ酸配列を有してなる［分子認識ユニット（以下“Ｍｔ？Ｕ“）と称される新規ペプチドおよびポリペプチドを同定および／または設計するためのシステムまたは方法を提供する。

分子認識部位は（ａ）小分子を、または他の巨大分子の小領域を特異的に結合する、天然に存在する巨大分子上、または（ｂ）天然に存在する巨大分子と特異的に結合するリガンド上のいずれかで、見いだすことができる。従って本発明のＭＲＵは、免疫グロブリン；酵素；レセプタータンパク質；味覚、嗅覚などに関する感覚性レセプター−デオキシリボ核酸；リボ核酸；収縮性タンパク質；レクチンおよびその他の例えばアビジンやストレプトアビジンのような結合タンパク質；などを包含するがそれに限定されない天然に存在する様々な巨大分子、および抗原；酵素コファクターおよび基質；酵素活性化剤および阻害剤；ホルモン；プロスタグランジン、神経ホルモン、増殖因子；フェロモン；神経伝達物質、シグナルタンパク質およびペプチドのようなシグナル物質；ビオチン；レセプターまたはレセプタータンパク質と結合する薬剤；酵素の遷移状態類似体；などを包含するがそれらに限定されない様々なリガンドを包含する広範な物質の結合特異性を模倣する。

本発明のシステムが免疫選択法を必然的にともなうため、分子がハブテンまたは抗原として機能することが可能な限りは、その分子の結合特異性を模した新規ＭＲＵを設計するためにこの方法を有利に用いることができる。さらに、広い範囲の様々な物質の結合特異性を模倣することができる約４０−４５アミノ酸残基未溝の、大きさとしては最小の新規ペプチドまたはポリペプチドを迅速に設計し調製するための方法を提供するので、本発明のシステムは特に有利である。

５．１．　ＭＲＵを同定および／または設計するための方法本発明によれば、ＭＲＵを設計するための方法は以下の４段階を含んでなる：（１）所望するＭＲＵの分子認識部位に相補的な分子認識部位である分子、またはそれを含有する分子と特異的に結合する１ｇＭ免疫グロブリンを発現するＢ細胞を免疫選択すること；（２）生殖細胞遺伝子と比較して、発現されたデオキシリボヌクレオチドが単一のＣＤＲにおいて再配列されている初期Ｂ細胞を同定するために、工程（１）で選択されたＢ細胞をスクリーニングすること；（３）工程（２）で同定された再配列されたＯＣＲのヌクレオチド配列またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること；および（４）上記工程（３）で同定された配列によってコードされる所望のＭＲＵを合成すること。

これら４段階のそれぞれを以下に詳細に説明する。

５．１．１．　８細胞の免疫選択免疫選択工程は、Ｂ細胞リンパ球のすべてをスクリーニングして、その結合特異性が調製された所望のＭＲＵによって模倣されるような分子認識部位を含有する１ｇＭ免疫グロブリンを生産するＢ細胞リンパ球を同定するための方法を提供する。所望のＭＲＵが巨大分子の分子認識部位を模倣することを意図した場合、免疫選択段階で用いられる「抗原」はその巨大分子のリガンドであることに留意すべきである。例えば、ホルモンレセプターの結合特異性を模倣したＭＲＵを設計するためには、Ｂ細胞を免疫選択するための「抗原」としてホルモンを使用する。一方、所望のＭＲＵがリガンド上の分子認識部位を模倣することを意図した場合、免疫選択段階で用いられる「抗原」はそのリガンドのレセプターまたは結合タンパク質である。例えば、ホルモンの結合特異性を模したＭＲＵを設計するためには、Ｂ細胞を免疫選択するための「抗原」としてホルモンレセプターまたは抗−ホルモン抗体を使用する。以後、“Ａｇ”という用語は、抗体応答を誘導するために本方法の免疫選択工程で［抗原」として用いられる分子認識部位を含有するあらゆる分子または物質を包含するために用いられる。従ってＡｇは、リガンドとして機能する分子およびリガンドに対するレセプターとして機能する分子を包含し、抗体を包含するがこれに限定されない（下記５．３０項参照）。

Ａｇに特異的に結合し、したがってその結合特異性を模倣したいと思う分子認識部位を含有する１ｇＭ免疫グロブリンを発現するＢ細胞リンパ球を免疫選択するための当業上知られたあらゆる方法が、本発明のこの工程に存用である。

ある実施態様に於ては、Ｂ細胞リンパ球は（ａ）模倣したい部位に相補的な分子認識部位であるＡｇ、またはそれを含有するＡｇに対して特異的なり細胞リンパ球の生産を刺激し；（ｂ）刺激されたＢ細胞リンパ球を不死化し：そして（Ｃ）所望のＭＲＵの分子認識部位に相補的な分子認識部位である分子またはそれを含有する分子と特異的に結合する、所望の１ｇＭ免疫グロブリンを分泌する細胞を同定するために、不死化細胞をスクリーニングすることによって、免疫選択される。

インビボでの方法に於て、Ａｇを単独で、またはアジュバン１〜と組み合わせて動物に投与することによってＢ細胞リンパ球を刺激し、免疫された動物の牌臓、リンパ節または末梢血液から所望のＢ細胞を収集する。

Ｂ細胞収集の３−４日前に小量のＡｇを２−３日間だけ投与する、あるいは大量のＡｇを一回投与するといった免疫化のスケジュールを用いて、１ｇＭイソタイプの免疫グロブリンを発現するＢ細胞の濃厚な集団の生成を促進することができる。Ｂ細胞のインビボ免疫選択に要するＡｇの量は、用いた動物の種類およびＡｇの性質に依存し、それを通常の技術の一つによって容易に決定することができる。例えば、用いた動物がマウスかラットである場合、炭水化物Ａｇは約１から約１０μｇ；タンパク質Ａｇは約１０から約５０μｇ；細菌性またはウィルス性Ａｇは約１μｇ、そして不純物の混じったＡｇは概して１０００μｇは越えないが大量に用いられる。さらに、もしＡｇが低分子量、すなわち約１０００ダルトン未満の分子量しか有しない場合、あるいはなんらかの他の理由により免疫原性が弱い場合は、まず最初に投与に先立ってキャリアーと結合させることができる。好適なキャリアーは、キーホールリムペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、オバアルブミン、家禽免疫グロブリンまたは当業者に知られたその他のあらゆるキャリアーを包含する。Ｂ細胞を刺激するインビボでの方法は、舊歯類に限らない；他の種もＢ細胞リンパ球の起源として好都合に用いられる。

あるいはまた、Ｂ細胞リンパ球はインビトロ［免疫化Ｊ法によって刺激される。

インビボ免疫化法で通常用いられるマイクログラム量どころかナノグラム量のＡｇを用いてこの方法を行うことができるので、選択したＡｇの供給が限られている場合には、このインビトロ法は特に育利であるかも知れない。さらに、完了までに２．３日しかかからないので、Ａｇが不安定である場合には、インビトロ法は育毒である。最後に、Ａｇが特にインビボで有用である場合、または例えばヒトに対して、倫理的配慮のため投与できない場合、インビトロ法は有用である。

選ばれたＡｇを含有する細胞培養培地中で約３−５日の期間、牌臓細胞、リンパ節細胞、扁桃腺リンパ球または末梢血液リンパ球を培養することによって、Ｂ細胞リンパ球はインビトロで刺激される。培養細胞がヒト以外の動物種から得られる場合は、胸腺細胞−順化細胞培養培地の使用が好都合である。培養細胞がヒト志願者から得られる場合には、胸腺細胞−順化培地は一般に使用できないが、所望のＢ細胞の増殖を刺激するためにリンホカインを用いることができる。さらに、いくつかの例では、細菌リボ多糖のようなり細胞のポリクローナル活性化剤、またはアメリカヤマゴボウマイトジェン、フィトヘマグルチニンまたはコンカナバリンＡのようなマイトジェンを培養培地中に包含することができる。

上記の方法のいずれかによって刺激されたＢ細胞リンパ球を、当業者に知られた種々の方法のいずれかを用いて不死化することができる。例えば、もともとはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｎ（１９８０年の彼らによる総説、Ｓｃｉ、Ａｍｅｒ、　２４３：６６−７４）によって開発された融合またはハイブリドーマ法、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ　４ニア２−７９）により記載されたＥＢＶ形質転換法、Ｃｏ１ｅら［ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　Ａｌａｎ　Ｒ。

Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　ｐｐ、７７−９６（１９８５）］により記載されたＥＢＶ−ハイブリドーマ法を、選択されたＢ細胞を不死化するために利用することができる。

ひとたび不死化されると、その細胞はインビトロ細胞培養物中で、またはインビボでは適当な宿主動物に於て好ましくは腹水腫瘍としてまたは固形皮下腫瘍として、増殖させることができる。あるいは不死化された細胞を、例えば液体窒素下で凍結保存することができ、インビトロまたはインビボのいずれに於いても定期的に再クローン化することができる。

一般にマウス牌臓細胞を用いた場合、本方法の最初の免疫選択工程のこの段階で約１０”−１０”の細胞が得られる。

所望の［ｇＭ免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を同定するために、不死化ハイブリドーマ細胞または形質転換細胞を、数日から一週間くらいの間細胞培養培地を用いてインビトロで培養する。上溝を細胞から分離しＡｇに対する特異性および親和性をテストする。酵素免疫抗体法（ＥＬｒＳＡ）　、例えば蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣ３）を用いた免疫蛍光アッセイ、ラジオイムノアッセイなどのような、Ａｇを抗原として用いるあらゆる既知のスクリーニング法が、所望の特異性を有する免疫グロブリンを発現するＢ細胞またはハイブリドーマ細胞を選択するために用いられる。また、　１ｇＭクラスの免疫グロブリンを発現するＢ細胞またはハイブリドーマ細胞を同定するために、それらをスクリーニングしなければならない。生産された免疫グロブリンのクラスを決定するために、ＥＬＩＳＡ　、ラジオイムノアセイ、間接的免疫蛍光アッセイ、インビボで標識された抗体の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析、オフタロニーアッセイなどのような当業者に知られたあらゆる技法を用いることができるＥＧｏｄｉｎｒｌ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　Ｌｏｎｄｏｎ１０５− １０７（１９８６）；　　Ｃａｍｐｅｌｌ、　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　、第１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　１８７−９３（１９８４）参照１゜一般にマウス牌臓細胞を用いた場合、これは不死化されたＢ細胞の約１０−３０％に相当し、したがって約１００−３００のかかる細胞を本発明の第一工程で得ることができる。

別の実施態様に於いては、所望のＭＲＵに相補的な分子認識部位であるＡｇまたはそれを含有するＡｇと特異的に反応する細胞を同定するために、　１８Ｍイソタイプのモノクローナル抗体を生産する公知のおよび／または利用可能な細胞系統をスクリーニングすることによってＢ細胞リンパ球を免疫選択することができる。かかる不死化細胞系統は、ハイブリドーマ細胞系統、ＥＢＶ−形質転換Ｂリンパ球細胞系統、およびＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞と骨髄腫または形質細胞腫細胞との融合によって作成された細胞系統を包含する。刊行された参考文献照会および特許のデータベースをコンピューター検索することによるか、または少しだけ名前を挙げるとＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ；ｔｈｅ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＮＲＲＬ）、　Ｐｅｏｒｉａ、　ＩＬ；　ｔｈｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　１’Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ。

Ｐａｒｉｓ、　Ｆｒａｎｃｅ；などのような国立の寄託機関に寄託されそして入手可能な、モノクローナル抗体生産細胞のカタログを細かく調べることにより、このようなスクリーニングを行うことができる。

５．１．２．初期Ｂ細胞のスクリーニング選ばれたＡｇに特異的なＩｇＭ免疫グロブリンを発現する不死化Ｂ細胞リンパ球集団を同定した後、１ｇＭ免疫グロブリンをコードする発現デオキシリボヌクレオチド配列が、生殖細胞のデオキシリボヌクレオチド配列と比較したとき単一のＣＤＲに於いてのみ再配列されている集団を同定するために、すなわち初期Ｂ細胞を同定するために、その集団をさらにスクリーニングする。

本発明のこの第二工程の方法にしたがって、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８：５２９４−９９）によって記載されたような当業者に知られたあらゆる技法を用いて、工程（１）で選択された不死化Ｂ細胞から全ＲＮＡを単離または抽出する。Ａｖｉｖら（１９７９，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、６９：１４０８−１３）により記載されたようにカラムに結合したポリ−Ｕまたはポリ−Ｔのいずれかを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、他のＲＮＡがらｍＲＮＡを分離する。

この工程のある実施態様によれば、選ばれたＢ細胞から単離されたｍＲＮＡを、標識プローブのその後の非特異的結合を妨げるためにブロックされたニトロセルロースフィルター上にドツトプロットする。Ｂ細胞を得た起源の動物に由来する可変領域遺伝子の生殖細胞ＣＤＲに対応する一本ｔｉＪｉ　ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を、末端標識化、ニックトランスレーションなどを包含するがそれらに限定されない公知のあらゆる技法のいずれかを使用して標識する。ＣＤＲに対応するこれらの標識したＤＮＡオリゴヌクレオチドはプローブとしてとりわけ有用である。標識したＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブをフィルターに結合したｍＲＮＡにハイブリッド形成させた後、フィルターを厳密な条件（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記、ｐｐ３８２−８９、参考文献によってここに組み入れられた）下で充分洗浄し、シグナルを明らかに示すために処理する。標識が放射能であるときは、オートラジオグラフィーによって、生殖細胞プローブとはハイブリッド形成しない、従ってオートラジオグラフでシグナルを生じないｍＲＮＡの結合フラグメントが同定される。これらのハイブリッド形成しないｍＲＮＡフラグメントは生殖細胞の配列が再配列されたＣＤＲを表す。発現したＩｇＭをコードするヌクレオチド配列が単一のＣＤＲに於いて生殖細胞から再配列された不死化Ｂ細胞を、このスクリーニングステップを用いて選択することができる。

本方法のこの工程の他の代わりとなる実施態様によれば、相補性−木組ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製するために、工程（１）で選ばれた不死化Ｂ細胞から抽出されたｍＲＮＡを逆転写酵素と反応させる。ｃＤＮＡをｍＲＮＡから分離し、−またはそれ以上の制限酵素で消化し、さらにゲル電気泳動によってフラグメントに分離する。そのフラグメントを通常はプロッティングによりニトロセルロースやナイロンフィルターのような固体基質に移し、Ｂ細胞を得た動物から得られた特異的な標識された生殖細胞ＤＮＡ配列に曝す。生殖細胞ＤＮＡ配列とハイブリッド形成するｃＤＮＡフラグメントのフィルター上の局在を、シグナルが現われることによって検出する。標識が放射能である場合は、ハイブリッド形成ｃＤＮＡフラグメントのフィルター上の局在はオートラジオグラフィーによって明らかに示される。標識したＤＮＡプローブとハイブリッド形成しないｃＤＮＡフラグメントは、生殖細胞配列からＣＤＲ配列が再配列されているフラグメントを表す。発現１ｇＭをコードするヌクレオチド配列が単一のＣＤＲに於いて生殖細胞から再配列されている不死化Ｂ細胞を、このスクリーニングステップを用いて選択することができる。

この代わりの実施態様の実施に際しては、ポリ−ＡｍＲＮＡを、オリゴ−ｄＴブライマー、逆転写酵素、および４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とともにインキュベートする。反応液のｐＨを上昇させて、こうして形成されたＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを除去する。次にサザンプロット法を用いて特異的に再配列されたＤＮＡ配列を以下のようにして一本鎖ＤＮＡ中に検出する（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　１９７５．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８：５０８参照）　：　ｃＤＮＡを−またはそれ以上の制限酵素で消化し、マーカー位置を用いて、実験で得たｃＤＮＡフラグメントの長さを推定することができるように、長さの知られたマーカーＤＮＡフラグメントと混合する。次にＤＮＡ混合物をゲル電気泳動によって分離し、プロッティングによってニトロセルロースフィルターに移す。Ｂ細胞を採取した動物の可変領域遺伝子の生殖細胞配列に対応する一本＠ＤＮＡを放射性標識し、結合ｃＤＮＡとのハイブリッド形成を判定するためのプローブとして用いる。

オートラジオグラフィーによって、生殖細胞プローブとハイブリッド形成しないｃＤＮＡの結合フラグメントを同定する。これらのハイブリッド形成しないｃＤＮＡフラグメントは、生殖細胞の配列が配列されたＣＤＲを表す。

本発明のこの工程のさらに別の実施態様によれば、生殖細胞ＣＤＲＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列、またはこのような生殖細胞ＣＤＨによってコードされるアミノ酸配列をＢ細胞の起源とは異なる動物に於いて免疫原として用いて、工程（１）で選択された不死化Ｂ細胞を採取した動物の生殖細胞可変領域遺伝子に対する多価抗体（以下「抗−ＣＤＲ抗体」）を調製する。例えば、選ばれたＢ細胞がマウス由来であるならば、ウサギまたはヤギに於いて抗−ＣＤＲ抗体を得ることができる。必要ならば、免疫原として用いるＤＮＡ　、　ｍＲＮＡ、またはアミノ酸配列を、キャリアーと結合し、アジュバントとともに、またはアジュバント無しで投与することができる。次に、ＥＬＩＳＡ、ドツトプロットイムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイなどのようなイムノアッセイに於いて、工程（１）で選択された不死化Ｂ細胞から得られたｃＤＮＡＳｍＲＮＡまたはＩｇＭ免疫グロブリンのいずれかをスクリーニングするために、抗−ＣＤＲ抗体を捕捉抗体として使用する。

抗−ＤＮＡ、抗ｍＲＮＡまたは抗−ＩｇＭ抗−ＣＤＲ抗体と結合しない選択された細胞から得られたＤＮＡ、　ｍＲＮＡまたは１ｇＭフラグメントは再配列したＣＤＲを表す。このスクリーニング工程を使用し発現ＩｇＭをコードするヌクレオチド配列が単一のＣＤＲで生殖細胞から再配列された不死化Ｂ細胞を選択することができる。

５　、１．３．再配列されたＣＤＲの配列決定本発明の方法の第三工程によれば、生殖細胞から再配列され、本発明の方法の第二工程で同定された単一のＣＤＨの配列が決定される。ノーイブリッド形成しないか、または結合しないｍＲＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントのいずれか一方を用いてＣＤＲを同定する場合、ノ１イブリッド形成しないか、または結合しないｍＲＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを単離し、常法を用いて配列決定する。

生殖細胞とは異なるこの単一のＣＤＨのヌクレオチド配列を用いて、コードされたアミノ酸配列を予測する。

あるいは、唯一のＣＤＲに生殖細胞から再配列されたヌクレオチド配列を有する細胞が生産するＩｇＭのアミノ酸配列を、アミノ酸配列決定の常法、例えばエドマン分解、を用いて決定することができる。かかる単一のＣＤＲによってコードされるアミノ酸配列が、本発明の所望のＭＲＵである。

Ｇｅ１ｉｅｂｔｅｒら（１９８６，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８３　：３３７１−７５、その詳細は引例によりここに編入される）により記載された改変ジデオキシ−チェインターミネーション法によって、ｍＲＮＡを直接配列決定する。簡単に説明すると、Ｂ細胞が由来する動物の生殖細胞可変遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドブライマーを調製し、放射性標識し、そしてアニーリングバッファー中でポリ−Ａ−ｍＲＮＡとインキュベートする。ＲＮＡ −プライマーアニーリングバッファーを、逆転写酵素およびジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の一つ（すなわち、ｄｄＡＴＰ、　ｄｄＣＴＰ、　ｄｄＧＴＰまたはｄｄＴＴＰ）を含有する転写バッファーの一定分量に加える。反応を止め、エタノール沈澱物を配列決定用ゲルに供する。

ｃＤＮＡはＳａｎｇｅｒ（１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、　７４：５４６３−６７）のジデオキシチェインターミネーション法、またはＭａｘａｎ及びＧ１１ｂｅｒｔ（１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４：５６０−６４）の方法、あるいはこれらの方法の組合せといった既知方法によって配列決定される。当業者に知られるように、市販の自動化ＤＮＡシークエンサーは、さらに大きなりＮＡフラグメントであっても迅速かつ能率的にヌクレオチド配列を決定するという点で、特に有用である（例えばＫｎｉｇｈｔ、　１９８８゜Ｂｉｏｔｅｃｈ、　６：１０９５ −９６参照）。

もし選ばれたＢ細胞を得たその由来の動物の生殖細胞配列が公知ならば、単一のＣＤＲ配列を比較し、それかかかる配列とは異なることを証明することができる。

実際は、決定された特定のＤＮＡ配列を公的に入手可能な生殖細胞配列と比較するために適当なソフトウェアパフケージでコンピューターを用いて比較するのが好ましい。生殖細胞配列を含む公的に入手可能なデータベースの例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎ−ｄａ　ｔ　ｉ　ｏｎデータベースおよびＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐａｃｋａｇｅ（Ｓｍｉ　ｔｈら、１９８６．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１４：１７−２０；　Ｄａｙ−ｈｏｆｆら、１９７８．　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ；　Ｋａｂａｔら編、１９８７．５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、Ｕ、　Ｓ、Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、　８００ｐｐ参照）を包含するがそれらに限定されない。

抗−アミノ酸抗−ＣＤＲ抗体を用いてＣＤＲが同定される場合、エドマン分解のような常法（自動化シークエネーターの使用を包含する）を用いて、同定されたＣＤＲのアミノ酸配列を直接決定することができる。

５．１．３．１．　　ヌクレオチド配列本発明はさらに、ペプチドまたはポリペプチドＭＲＵをコードする、上記工程（１）　−（３）を用いて同定された単一のＣＤＲのｍＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチド配列を包含するものとする。これらヌクレオチド配列は、ＭＲＵのみならず、本発明の新規ポリペプチドおよびタンパク質接合体（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を調製するのに特に有用である（下記第５．１．４および５．４項参照）。

５．１．４．　ＭＲＵの合成所望のＭＲＵが、本発明の上記工程（１）　−（３）を用いて同定されると、かかるペプチドまたはポリペプチドを含んでなる特異的なアミノ酸配列を、当業者に知られた多くの慣用の合成法のいずれを用いても、合成することができる。例えば、Ｍｅｒｒ汀１ｅｌｄら（ｆ９６３．　Ｊ、　Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８５：２１４９；　１９８２．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２１：５０２０；　ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄによる総説、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ第２巻、ＧｒｏｓｓおよびＭｉｅｒｉｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、１−２８４）により開発された固相法や、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　ｐｌ）、　（１９８４）に記載の液相法のような、ペプチドまたはポリペプチドの化学合成のためのあらゆる常法を用いて、所望のＭＲＵを調製できる。

慣用の組換えＤＮＡ技法もＭＲＵ調製に使用できる。従って、所望のＭＲＵをコードするＤＮＡ配列をベクターに挿入し、適当な宿主内で複製する能力を有する組換えＤＮＡ分子またはウィルスを作成する。当業者に理解されているように、適正な複製、転写および翻訳シグナルがかかるＤＮＡ分子に正しく配置されているならば、形質転換細菌細胞を包含するあらゆる種類の発現ベクターにおいて、または真核生物の複製開始点を担持する組換えウィルスまたは組換えプラスミドによる感染を受けた許容しうる真核生物細胞において、所望のＭＲＵをコードするＤＮＡ配列を正確に発現させることができる。かかる周知の組換え技法は（Ｍａｎｉａｔｉｓらによって記述されている［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　５４５ｐｐ、　（１９８２）。

その詳細は引例によりここに編入される：　ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅ１編、　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｃｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５２巻、Ａｃａｄｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｉｎｃ、。

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ　８１２ｐｐ、　（１９８７））。

所望のＭＲＵが調製されると、巨大分子に対するか、またはＡｇとして用いられるリガンドに対する、ペプチドまたはポリペプチドの特異的結合を、第５．１．１項に記載したスクリーニング方法のいずれかを用いてテストすることができ、そのＭＲＵが実際にそのＡｇと特異的に結合し、目的とする分子認識部位の結合特異性を模していることを保証することができる。

本発明のさらに別の実施態様によれば、ＩｇＭイソタイプのモノクローナル抗体、またはかかる免疫グロブリンのアミノ酸配列データベースのモノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列を含んでなるデータベースを利用しコンピューターを用いて、本方法の上記工程を組み合わせて、実施することができる。実際、公的に入手可能なデータベースをスクリーニングし、所望のＭＲＵに対して相補的な分子認識部位を含有するＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体を同定する。従って、所望のＭＲＵがリガンド上の認識部位を模することを意図するならば、そのリガンドに対する抗体に特異的な１ｇＭ免疫グロブリンについてデータベースをスクリーニングする。そして、所望のＭＲＵがレセプターまたは結合タンパク質の認識部位を模することを意図するならば、そのリガンドに特異的な免疫グロブリンをスクリーニングする。抗体配列を包含する公的に入手可能なデータベースの例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎデータベースおよびＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐａｃｋａｇｅ（Ｓｍｉｔｈら、１９８６゜Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１４：１７−２０；　Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８゜Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ；　Ｋａｂａｔら編、１９８７．　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、Ｕ、　Ｓ、　Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｙ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ。

８００ｐｐ参照）を包含するがそれらに限定されない。選ばれたＡｇに対して特異的なＩｇＭのあるグループがこのコンピューターに基づく本発明の実施態様を用いて選択されると、かかるＩｇＭをコードするＤＮＡ配列を生殖細胞配列のそれと比較し、単一のＣＤＲが生殖細胞配列のそれとは異なっている可変領域を有する配列を同定する。上記のあらゆるスクリーニングアッセイを用いてかかるＭＲＵを合成および選抜し、かくして同定されたＭＲＵが実際にＡｇと特異的に結合し、意図する分子認識部位を模していることを立証する。

また本発明のＭＲＵは、変化したアミノ酸配列も包含するが、その場合機能的に同等なアミノ酸残基が配列内の残基と置換され、結果としてサイレントな変化を生じる、すなわちＭＲＵの結合特異性には不利な影響を与えない。例えば、配列内の−またはそれ以上のアミノ酸残基を、同様の極性を有する別のアミノ酸によって置換することができる。このような極性の等しいアミノ酸は機能的に等しく作用し、結果としてサイレントな変化を生じる。配列内のアミノ酸置換基を、そのアミノ酸の属するクラスの他の構成員から選択することができる。例えば非極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを包含する。極性中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システィン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを包含する。プラスに荷電した（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンを包含する。マイナスに荷電した（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。

さらに、上記第５．４項に詳細に説明するように、本発明のＭＲＵは、所望の分子認識部位の特異性および結合親和性を模した第一のドメイン、およびエフェクター活性を有する第二のドメインを有する接合体の構成成分として有用である。

この第ニドメインがペプチドまたはポリペプチド部分である場合、その接合体を融合タンパク質として、すなわち各々の解読枠が一致するように互いに結合した二つのタンパク質をコードする遺伝子の部分によって発現される産物として、調製することができる。上記のあらゆる化学的技法または組換え技法のそれぞれ一方、または組合せのいずれを用いても、かかる融合タンパク質を調製することができる。

５．２．増強された親和性を有するＭＲＵある特定の応用に於ては、ＭＲＵが模倣するよう設計された分子認識部位により認識されるＡｇに対する親和性が増強されたＭＲＵまたはＭＲＵ接合体を調製することが望ましいことがある。本発明のこの様式の一実施態様によれば、このシステムにしたがって調製されたＭＲＵを以下の方法にしたがって修飾することができる。簡単に説明すると、特定のＭＲＵをコードするＤＮＡ配列、「親ＭＲＵＪと称する、を化学的に合成することができる。

配列が合成されると、その配列のランダムな化学変化によって点突然変異をそのＤＮＡ配列内に導入する。こうして形成された突然変異ＤＮＡ配列のファミリーのそれぞれは常法の組換えＤＮＡ技法を用いて適当な発現ベクター中に導入されクローン化される。発現したＭＲＵファミリーを例えばニトロセルロースフィルター上でＡｇに対する結合についてスクリーニングする。親ＭＲＵに対する競合抗原結合アッセイを用いて、親ＭＲＬＩより強い親和性を有するＭＲＵを同定することができる（競合アッセイの記述については、概略はＣａｍｂｐｅｌｌ、上記、ｐｐ、　１９５−１９９参照）。

本発明のこの方法のさらに別の実施態様によれば、ＭＲＵが模倣するように設計されている分子認識部位により認識されるＡｇに対する親和性が増強されたＭＲＵ接合体は、そのＭＲＵの結合特異性及び／または親和性を実質的に損なうことなしに、多くのＭＲＵ結合部位を有する巨大分子に多コピーのＭＲＵを結合させることによっで、調製される。結果として、かかる接合体は、ｒｇＧ免疫グロブリン分子より強い親和性を有する多価ＩｇＭ免疫グロブリン分子とまったく同様に、分子認識部位に対する増強された機能的親和性を有する［Ｋａｒｕｓｈ。

Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、　ＬｉｔｍａｎおよびＧｏｏｄｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｖｒＹｏｒｋ　ｐｐ、８５−１１６（１９７８）］。

本発明のこの方法のさらに別の実施態様によれば、ＭＲＵが模倣するように設計されている分子認識部位により認識されるＡｇに対する親和性が増強されたＭＲＵ接合体は、多コピーのＭＲＵを縦列に共有結合することによって、すなわちポリマーＭＲＵ接合体を形成することによって、調製される。多数のＭＲＵを直接またはリンカ一部分を介して縦側に共有結合することによって、または代わりにＭＲＵをコードするヌクレオチド配列の多数コピーを縦列に結合し、適合する宿主細胞に於て融合タンパク質としてかかる配列を発現させることによって、かかるポリマーＭＲＵ接合体を調製することができる。いずれの場合も、接合体を形成する縦列にならんだＭＲＵは、そのＭＲＵの結合特異性を実質的に損なうことなしに、結合される。

５．３．　Ａｇ上記５．１．１項に示すように、Ａｇは、分子認識部位そのものであるまたはそれを含有する、あらゆる分子または物質であり、リガンドに対するレセプターとじて機能する分子および物質を包含する。このようなリガンドは、抗体、酵素、結合タンパク質など、およびリガンドとして機能するものを包含するがこれに限定されない。本発明にしたがって、あらゆる物質を、それが少なくともハブテンとして、すなわちそれが単独では抗体生産を引き起こすことができなくても、抗体に特異的に結合する分子として機能し得る限り、Ａｇとして用いることができる。選ばれたＡｇがハブテンである場合には、これを本発明のこの方法に使用する前にキャリア一部分に結合しなければならない。キャリア一部分とは、例えばキーホールリムペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、家禽免疫グロブリンまたは他の任意の知られたキャリアーなとである。抗体反応を誘導できるあらゆる抗原を、本発明のこの方法に用いることができる。

本発明の実施に際して用いられるＡｇは、意図する応用目的にしたがって、すなわち所望のＭＲＵが模倣することを意図された分子の結合特異性にしたがって、選択される。かかるＡｇは、細菌、真菌、ウィルス、マイコプラズマ、寄生虫、組織適合性、または分化抗原のような従来から「抗原」と称される部分；ホルモン；神経伝達物質；神経伝達物質および／または全身性ホルモンとして作用できるペプチド；神経ホルモン；フェロモン；ビオチン；シグナルペプチドおよびタンパク質を包含するシグナル物質；増殖因子；酸素基質およびコファクター；酵素活性化剤および阻害剤；触媒によって促進されるような化学反応に対する遷移状態類似体；収縮性タンパク質、　ＲＮＡ　；　ＤＮＡ　；輸送タンパク質；免疫グロブリン；酵素；レセプターおよびレセプタータンパク質；レクチン、およびアビジンやストレプトアビジンのような他の結合タンパク質などを包含するがそれらに限定されない。細菌、真菌、ウィルス、マイコプラズマ、寄生虫、組織適合性、または分化抗原のような従来から抗原と称される部分のほかに、本発明の方法にしたがってＡｇとして使用できるリガンドの非網羅的リストを第−表に示す。第二表は、本発明の方法にしたがってＡｇとして使用できる巨大分子種の非網羅的リストを示す。ある例に於ては、−以上の分子認識部位を含有する、− 以上のカテゴリーの分子の組合せを含んでなるＡｇの使用が有用である。別の例においては、複合巨大分子を含んでなるＡｇの使用が有用であろう。

この複合巨大分子は、空間的な関係によってコンフォメーション決定子を生じるサブユニットからなる。

第−表ＭＲＬＩ調製にＡｇとして作用に用いられるリガンドの例バソブレッシンアンギオテンシンメラニン細胞−刺激ホルモンソマトスタチン甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン性腺刺激ホルモン放出ホルモンテストステロンエストラジオールプロスタグランジンニューロテンシン血管作動注腸ペプチド心房性ナトリウム利尿ペプチド副腎皮質刺激ホルモン甲状腺刺激ホルモン卵胞刺激ホルモン黄体形成ホルモン成長ホルモンプロラクチン副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン成長ホルモン放出ホルモン副甲状腺ホルモンカルシトニン絨毛性性腺刺激ホルモン絨毛性ソマトマンモトロビンドーパミン　　　　　　エピネフリンノルエピネフリン　　　セロトニングルタミン酸　　　　　γ−アミノ酪酸アセチルコリン ■増殖因子上皮増殖因子神経成長因子血小板由来増殖因子血管形成因子繊維芽細胞増殖因子内皮細胞増殖因子顆粒球コロニー形成刺激因子顆粒球−マクロファージコロニー形成刺激因子インターロイキン３エリスロボエチン腫瘍増殖因子 ■植物ホルモンアブシシン酸　　　　　インドール酢酸ゼアチン　　　　　　　ジベレリン酸 ■フェロモン酵母ファクターａ酵母α因子昆虫フェロモンアンギオテンシノーゲン活性化剤阻害剤 ■酵素に関する遷移状態類似体加水分解に関する遷移状態類似体：エステル炭酸ブロモクリプチン　メシレートメカミルアミンイソプロテレノールおよびその誘導体（本頁以下余白）第二表ＭＲＵ調製にＡｇとして有用に用いられる巨大分子の例■　免疫グロブリンあらゆる「古典的」抗原に対して特異的な抗体環−表に挙げたようなリガンドに対する抗体に対して特異的な抗体 ■　レセプター／結合タンパク質第−表に挙げたようなリガンドに対する細胞レセプターウィルスに対する細胞レセプター味覚嗅覚レクチンフンカナバリンＡコムギ胚芽凝集素ダイズレクチンジャガイモレクチンハス種子レクチン結合タンパク質アビジンストレプトアビジンＺＰ３のような精子結合タンパク質卵結合タンパク質 ■酵素ヒ　　　　　タンパク質酵素ＲＮＡ酵素触媒抗体第二表に用いられる「酵素」なる用語は、触媒活性と特異性によって特徴付けられ、生物学的および／または生化学的システムの触媒として作用する無数の巨大分子を包含するものとする。［活性の一般的な記述および意図するこのような巨大分子の実例については、５ｔｒｙｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄＣｏ、、　ＮＹ、　ｐｐ、１７７−２５９（１９８８）；　Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｗｏｒｔｈ　Ｐｈｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ、、　ｐｐ、２０７−７６（１９８２）参照、その詳細は引例によりここに編入される］。

さらに、本発明の方法にしたがって使用する場合、Ａｇを精製物の形で使用する必要はない。従って、例えばウィルス粒子、細胞表面または細胞表面調製物または抽出物、あるいは組織や器官表面でさえより複雑な物質の部分として見いだされ、原位置でＢ細胞リンパ球に提示されて抗体反応を依然として誘導することのできるＡｇを、本発明にしたがって、原位置で利用することができる。例えば、Ａｇが細菌細胞表面抗原であるならば、これを精製された形でも、あるいはフラグメントや完全な細菌細胞に結合していても、いずれの場合であっても本発明の方法に於て使用できる。

５．４．接合体本発明のＭＲＵは、種々の物質の結合特異性を模した作用剤として、単独で有用であるのみならず、接合体の構成成分としても有用である。本発明の接合体は、所望の分子認識部位の結合特異性および結合親和性を模したＭＲＵである第一のドメインと、エフェクター活性を有する第二のドメインを含んでなる。ＭＲＵの結合特異性や結合する分子または分子フラグメント自身のエフェクター活性をいずれも損なうことなしにＭＲＵに結合できるあらゆる分子または分子フラグメントを、本発明の接合体の第ニドメインとして用いることができる。ある場合には、第ニドメインはエフェクター活性を有する第二のＭＲＵを含んでなることができる。例えば、当該のＤＮＡ配列に対するその特異性と結合に基づいてかかるＤＮＡ配列に調節作用をおよぼすＲＮＡを、エフェクタードメインとして別のＭＲＵに結合することができる。このＭＲＵは、当該の細胞、組織、または器官部位に特異性を有する。この場合、第一のＭＲＵは所望の部位へ接合体を標的輸送し、そして第二のＭＲＵはその所望の部位で第二のＭＲＵの調節活性をあられす。

接合体の二つのドメインは任意の共有結合手段を用いて直接結合するか、または中間リンカ一部分を二つのドメイン間に介して結合することができる。リンカ− は、一方は第一の結合ドメインと反応し、もう一方はエフェクター活性を存するドメインと反応する、少なくとも二つの反応グループを有する任意の適合性部分を包含するものとする。本発明の接合体の形成に好適なリンカ−は、米国特許出願第６３０．３７５号に記載された分枝リンカ−１切断可能リンカ−、スペーサーおよび切断可能エレメント、および非−切断リンカ−を包含するがそれらに限定されない。

ＭＲＬＩが接合体の構成成分として用いられる場合、ＭＲＵはそのＭＲＵが特異的に認識する分子認識部位を接合体の標的となし、エフェクタードメインはその標的部位で活性を働かせる。ＭＲＵが特異的に認識する分子認識部位が触媒酵素の遷移状態類似体である場合には、そのＭＲＵは結合特異性を有するのみならず、標的部位での触媒活性も有するであろう。エフェクター活性は生物学的、薬理学的、および酵素的活性並びに支持体としての機能を包含するものとする。

上記第５．２項に述べたように、エフェクタードメインは、多数のＭＲＵ結合部位を有する多価巨大分子であることができる。その結果得られる接合体は、ＭＲＵが特異的に認識する分子認識部位に対し増強された親和性を有する。ＭＲＵのポリマー型接合体も、本発明のＭＲＵ接合体に含まれる（上記第５．２項参照）。

本発明の接合体の第二の、またはエフェクタードメインとして使用することができる部分は、その接合体の意図する適用次第である。ある例に於ては、接合体をインビボでの診断またはこの治療目的に使用することが意図される。かかる場合には、エフェクタ一部分がＭＲＵと直接にせよりンカ一部分を介するにせよ結合した場合にその結果生じた接合体がインビボ使用に好適であるよう十分な水溶性を有するように、そのエフェクタ一部分が十分な水溶性を有していなければならない。他方、接合体がヒトや動物への投与を含まない用途に意図される場合は、その接合体は水溶液に可溶性または不溶性のいずれをも包含する。

接合体が診断目的に意図される場合には、ＭＲＵ　ドメインは、その接合体を所望の部位に標的輸送する能力を付与し、そしてエフェクタードメインは、接合体を所望の部位で検出できる「リポータ−」部分を供給する。あらゆるカテゴリーのリポータ一部分を本発明の診断用接合体調製に使用することができる。このリポータ一部分は、放射性同位体、放射線不透過性色素、蛍光発生化合物、化学発光性化合物、核磁気共鳴スペクトルによって検出可能な非放射性常磁性化合物、ポジトロン放射断層法を用いて検出できるポジトロン放射体、従来の分光法を用いて検出できる色素、などのようなものを包含する。当業者に容易に理解されるように、インビボまたはインビトロのいずれの応用にも使用できる診断用接合体は、水溶性および水不溶性成分の両方を包含する。

接合体が治療目的に意図される場合には、ＭＲＵドメインは、その接合体を所望の部位に標的輸送する能力を付与し、そしてエフェクタードメインは、その所望の部位で接合体にその治療活性を発揮させることができる生物学的にまたは薬学的に活性な部分を供給する。

非常に多くの生物学的に活性な部分を本発明の治療用接合体のエフェクタードメインとして使用することができるが、それらは、例えば、以下のような薬物、すなわち鎮痛剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗腫瘍剤および他の抗増殖剤、抗寄生虫剤、抗マイコプラズマ剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、抗うつ剤、抗凝血剤、抗血栓剤、膜透過性を変化させる薬剤など、および以下のような生物学的に活性な作用物質すなわちホルモン、神経伝達物質、神経ホルモン、ＤＮＡ　、毒物および毒物の活性フラグメント、酵素、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン、およびこれらの生物学的に活性な薬剤の活性フラグメントなどを包含する。当業者に容易に理解されるように、インビボまたはインビトロのいずれの応用にも使用できる治療用接合体は、水溶性および水不溶性成分の両方を包含する。

接合体を化学および／または触媒の目的を意図する場合には、その接合体をいくつかの異なる種類に分類することができる。このような目的のためのある種類の接合体に於ては、ＭＲＵ　ドメインは分子認識および／または触媒活性を付与し、そしてエフェクタードメインはＭＲＵ　ドメインのための支持体またはマトリクスを与える。これらの目的のための接合体を調製するために、非常に多くの固体またはマトリクス支持体を使用することができる。好適な支持体は、ラテックス球、アガロースビーズ、デキストランビーズ、活性化ガラスピーズ、ポリスチレン、ポリプロピレン、ゴム、ポリエステル、ポリアミド、メタクリル酸ポリマー、ポリ塩化ビニルのような塩化ビニルポリマー、セルロース、シリカゲル、およびそれらの誘導体などを包含するがそれらに限定されない。

化学および／または触媒目的のための別の種類の接合体においては、ＭＲＵ　ドメインは分子認識および／または触媒活性を付与し、そしてエフェクタードメインは、その接合体が十分に可溶性であってその結果溶液中で触媒として有用であるような支持機能を与える。

化学および／または触媒目的のためのさらに別の種類の接合体においては、ＭＲＵ　ドメインは認識および／または触媒活性を付与し、そしてエフェクタードメインはＭＲＵ　ドメインによって与えられるのと異なるかあるいは同一の触媒活性を与える。この例に於て、エフェクタードメインは、酵素またはその活性フラグメントであり、それは種々の化学反応のいずれを触媒するものであってもよい。またその接合体を溶液中で触媒として用いることができる。

５．５．　ＭＲＵおよびＭＲＵ接合体の応用ＭＲＵは、以下の要因が重要であるようなシステムに於て特に有用である、すなわち：分子認識および高度の結合特異性；低分子量およびインビボ投与時に免疫原となる可能性が低いこと；インビボ投与時のより速い血中からのクリアランスと、標的器官、組織および／または細胞へのより速い拡散；付加的なエフェクター機能と組み合わせることができること：結果的に増強された機能的親和性を有するより多価の接合体を生じることができること；費用効果：など。このように、本発明によれば、ＭＲＵおよびＭＲＵ接合体は広範な応用に用いられ、その応用は生物医学；生物学的制御および害虫制御：農業；化粧品；環境制御および廃棄物処理；化学；触媒作用；栄養および食品工業；軍事利用；気候制御；などの分野における使用を包含するがそれに限定されない。以下に簡単に説明する応用は、ＭＲｔＪおよびＭＲＵ接合体の使用を説明する例として意図されており、それらを限定するものとして考えているわけではまったくない。他の応用が当業者に容易に明らかとなるであろうが、この応用の範囲に包含されるものとする。

本発明のＭＲＵおよびＭＲＵ含有接合体は、生物医学および生物調節または制御の分野で、広範なインビトロおよびインビボの応用に使用される。これらの応用に於て、ＭＲＵおよびＭＲＬＩ接合体は、例えば、抗体または免疫グロブリンおよびそのフラグメント、ホルモンレセプター、神経伝達物質レセプター、シグナル物質またはタンパク質のレセプター、および酵素のような構成物に対する模擬的な代替物として、ならびに抗原または免疫原、ホルモン、シグナル物質、神経伝達物質およびアルコールのような物質に対する内在性脳レセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト、精神に変化を生じさせる薬剤、増殖因子、フェロモン、酵素活性のエフェクター、遺伝子制御タンパク質、局在細胞分裂のりギュレーター、などに対する模擬的な代替物として使用される。

目的に応じて、本発明のＭＲＵおよび接合体をインビボでヒトも含めた動物に、注射（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、心房内、乳腺内、尿道内、など）、局所適用（例えば、患者に）などを包含する多くの経路で、そして上皮または粘膜皮膚内膜（例えば、眼上皮、口腔粘膜、直腸および膣上皮内膜、呼吸管内膜、鼻咽頭粘膜、腸粘膜、など）を通した吸収によって、投与することができる。生物への直接適用、生物の生息地での散布、周囲の環境または水系へ加えること、などによって生物調節および／または制御のために植物、昆虫および原生生物に到達させることができる。

本発明のＭＲＵおよび接合体を、インビトロ細胞への投与によってインビトロの診断および治療上の応用に用いることもできる（例えば、ヒトを含む動物細胞、植物細胞、原生生物など）。

栄養および食品工業に於て、ＭＲＵおよびＭＲＵ含有接合体を、味覚または嗅覚センサーとして機能する感覚性レセプターが認識し特異的に結合するあらゆるリガンドに対する模擬的な代替物として使用することができる。例えば、甘味に関する味覚を媒介するレセプターと相互作用するようなリガンドを、本発明のペプチドまたはポリペプチドＭＲＵを模倣することができる。

（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ　ら、Ｔｈｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　Ｖｏｌ、　　ＩＶ、　Ｃｏｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、　ｐｐ、３１５ −７７参照）。したがって、かかるＭＲＵは甘味に関するこのようなリガンドに対する模倣的な代替物として作用することができるであろう。

化学工業に於て、免疫グロブリン、酵素、結合タンパク質、またはかかる巨大分子に対するリガンドの結合特異性を模倣することができる本発明のＭＲＵおよび接合体を、広く様々な分離、精製、および精製方法に使用することができる。

触媒作用の分野では、あらゆる種々の化学反応を触媒する酵素の遷移状態類似体に特異的な抗体を模倣するようＭＲＵを設計することができる。

あるいは、酵素の活性部位の結合特異性、または酵素阻害剤や酵素の活性化剤のような酵素エフェクターの結合特異性を模倣するようＭＲＵを設計することができる。かかるＭＲＵを、工業的応用に有用な種々の酵素反応を触媒し、またはその触媒作用を調節するために使用することができる。

さらに、ごく詳細には上記第５，４項に説明するように、多くの様々な種類のＭＲＵ接合体を、固体支持体上で、または溶液中でのいずれで行われる反応についても触媒として使用することができる。

廃棄物処理の分野に於て、本発明のＭＲＵおよび接合体を分離、精製、および分解工程で使用することができる。

軍事利用および生物学的制御の分野では、ＭＲＵはワクチンにおける新規免疫原として、毒性病原体および毒素のアッセイにおける抗原として、抗毒素または解毒薬として、放射線防護物質として、など、そしてそれらに対する模擬的な代替物として使用することができる。

気候制御の分野では、本発明のＭｌ？ＬＩおよび接合体を以下のように用いることができる、すなわちニオシン層を損ない、または破壊する汚染物質の捕捉剤として；降水を増やすために雪中に撒く雨の核となる粒子として作用するリガンドに対する模擬物として、など。

最後に、既に示したように、上記の応用は、本発明のＭＲＵおよび接合体について意図される無数の用途のうち、説明として示す単なる例に過ぎない。かかる説明的な例の列挙は、本発明のＭＲＵに関して、またＭＲＵの用途に関してのいずれも、限定する意図はまったくない。当業者に容易に理解されるように、本発明の方法は新規ＭＲＵを調製するための新規方法を与えるものであり、この新規ＭＲＵは、あらゆる分子の分子認識部位を、それがハブテンまたは抗原として機能することができる限り、模倣する。かかるあらゆるＭＲＵを使用するための方法は、明らか本発明の範囲に含まれる。

以下の実施例は、説明の目的で示されるもので、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。

６、実施例：　ＭＲＵの調製以下の実験は、本発明の一実施態様にしたがって、ヒト腺ガンに関連するムチン抗原と反応する抗体の結金持異性を模倣するＭＲＵの調製を説明する。

ムチン抗原は、モノクローナル抗体（ＩｇＧｌ）を用いて、ヒト乳ガンまたは結腸ガンの検体から精製された形で得られた。該モノクローナル抗体は、前記抗原と特異的に反応性であり、そしてＳｃｈ　ｌｏｍらの米国特許第４，５２２．９１８号に記載のハイプリドーマ細胞系統ＡＣＴＴＣ番号）ＩＢ８１０８　（以下ｒ　Ｂ７２．３抗体」）から得られた（Ｎｕｔｉら、１９８２、　　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　２９：５３９−４５参照）。あるいは、ムチン抗原を、ヒト乳ガンまたは結腸ガンの検体から得られた細胞表面膜抽出物の形で使用することができる。いずれの場合も、本発明のインビボの方法にしたがって、ムチン抗原は実験用Ｂａ１ｂ／ｃマウスに２〜３日間日間的腔内投与る。３日目に、その動物を殺し、牌臓を無菌的にとり出し、牌臓細胞をＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ　１ｓｔｅｉｎによって開発された通常の融合技法を用いて不死化する（これらの著者による総説、１９８０．　Ｓｃｉ。

Ａｍｅｒ、　２４３：６６−７４参照）。

不死化したハイブリドーマ細胞を低密度で、すなわち約６０％の増延比率で塗布し、ＨＡＴ培地で約１０−１４日間インビトロ細胞培養で増殖させる。

細胞培養で約１０−１４日で得られた不死化ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、ムチン抗原に結合特異性を有するものを同定し、そしてＥＬＩＳＡアッセイを用いて１ｇＭクラスの免疫グロブリンを発現するものを同定する。

ムチン抗原に特異的なＩｇＭ免疫グロブリンを発現する上記で同定された不死化細胞の一定分量を、次にインビトロでＲＰＭＩ　１６４０／１０％ウシ胎児血清中で培養し、細胞を集める。ＣｓＣｌクッションを用いた密度勾配遠心後、収集した細胞からすべてのＲＮＡを単離し、そしてＡｕｒｉａらによって記載されるオリゴ−ｄＴセルロースカラムを用いてポリ−Ａ−ｍＲＮＡを単離する（１９７２．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　６９：２６４−６８）。

次にｍＲＮＡをニトロセルロースフィルターにドツトプロットし、そのフィルターを非特異的結合を防ぐためにブロックし、続いて、標識した生殖細胞に特異的な一木組オリゴヌクレオチドブローブをフィルターに供する。−重鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブは、マウス可変領域遺伝子の既知の生殖細胞配列を用いて調製しくＫａｂａｔら、上記参照）、そして放射性Ｐ−３２を用いて末端標識する（Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記、ｐｐ、　１０９−１２４参照）。

洗浄したフィルターをオートラジオグラフフィルムにさらし、特異的な、放射性標識された生殖細胞ＤＮＡプローブとハイブリッド形成しない結合ｍＲＮＡ部分を同定する。ラジオオートグラフからのシグナルがまったく検出されない場合、生殖細胞配列が既に再配列されたＣＤＲを表すハイブリッド非形成ｍＲＮＡフラグメントが同定されている。発現１ｇＭをコードする配列が単一のＣＤＲに於てのみ再配列している不死化細胞系統を、本発明のこの方法を用いて選択する。

上記で同定された単一のＣＤＲ配列のヌクレオチド配列は、以下のように決定される。選ばれたＣＤＲをコードするｍＲＮＡを直接Ｇｅ１ｉｅｂｔｅｒら（１９８６，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８３：３３７１−７５）に記載のようにして配列決定する。

上記のようにして決定された単一のＣＤＲのヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列を、一般に受は入れられている情報である遺伝暗号を用いて予想し、所望のＭＲＵを含んでなるアミノ酸配列をＭｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄの固相合成法を用いて化学合成する（１９６３゜Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８５：２１４９）。

調製したＭＲＵの特異的結合活性を、競合的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて確認する。このアッセイに於て、ムチン抗原を抗原として使用し、ＭＲＵは免疫選択Ｂ細胞によって生産された抗体と競合する。

（本頁以下余白）国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）所望の分子認識ユニットに相補的な分子認識部位であるかまたはそれを含有する分子に特異的に結合するＩｇＭ免疫グロブリンを発現するＢ細胞を免疫選択すること；（ｂ）初期Ｂ細胞、すなわち発現されたデオキシリボヌクレオチド配列が生殖細胞遺伝子と比較して単一の相補性決定領域に於てのみ再配列されている初期Ｂ細胞を同定するために（ａ）から選択されたＢ細胞をスクリーニングすること：（ｃ）（ｂ）で同定された再配列した相補性決定領域のヌクレオチド配列またはそのコードするアミノ酸配列を決定すること；および（ｄ）上記（ｃ）で同定された配列によってコードされる所望の分子認識ユニットを合成すること；を含んでなる分子認識ユニットを設計し調製するための方法。
２．（ａ）模倣が所望される部位に相補的な分子認識部位であるか、またはそれを含有する抗原またはハプテンに特異的なＢ細胞リンパ球の生産を刺激すること；（ｂ）刺激を受けたＢ細胞リンパ球を不死化すること；および（Ｃ）所望の分子認識ユニットの分子認識部位に相補的な分子認識部位であるかまたはそれを含有する分子に特異的に結合する、所望のＩｇＭ免疫グロブリンを分泌する細胞を同定するために、不死化細胞をスクリーニングすること；を含んでなる方法によってＢ細胞を免疫選択する、請求の範囲第１項記載の方法。
３．所望の分子認識ユニットに相補的な分子認識部位であるかまたはそれを含有する抗原またはハプテンと特異的に反応するものを同定するために、ＩｇＭインタイプのモノクローナル抗体を生産する既知のおよび／または入手可能な不死化細胞をスクリーニングすること、を含んでなる方法によってＢ細胞を免疫選択する、請求の範囲第１項記載の方法。
４．分子認識部位であるかまたはそれを含有する分子が、免疫グロブリン；酵素；レセプタータンパク質；感覚性レセプター；レクチンおよび他の結合タンパク質；デオキシリボ核酸；リボ核酸；収縮性タンパク質；抗原；酵素コファクターおよび基質；酵素阻害剤および活性化剤；酵素の遷移状態類似体；ホルモン；プロスタグランジン、神経ホルモン、増殖因子；フェロモン：レセプターに結合する薬剤；ビオチン；神経伝達物質、シグナルタンパク質およびペプチドのようなシグナル物質からなる群から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。
５．（ｅ）分子認識ユニットが（ａ）で用いられた分子認識部位であるかまたはそれを含有する分子と実際に結合し、所望の分子認識部位の結合を模倣していることを確証するために、酵素免疫抗体法、免疫蛍光アッセイおよびラジオイムノアッセイからなる群から選択されたアッセイに於て、分子認識ユニットを使用すること、をさらに含んでなる請求の範囲第１項記載の方法。
６．（ａ）以下のような配列、すなわちそのモノクローナル抗体がクラスＩｇＭに属し、そして分子認識ユニットが模倣することが所望される部位に相補的な分子認識部位であるかまたはそれを含有する抗原またはハプテンに対して特異的であるような配列、を同定するために、（ｉ）モノクローナル抗体をコードするデオキシリボ核酸またはリボ核酸配列、または（ｉｉ）モノクロール抗体のアミノ酸配列、のいずれかのデータベースをスクリーニングすること；（ｂ）（ａ）で同定された配列を、選択されたモノクローナル抗体配列が由来する動物の生殖細胞デオキシリボヌクレオチド配列と比較して、以下のような可変領域、すなわち単一の相補性決定領域のみが生殖細胞配列とは異なっているような可変領域、を有する配列を同定すること；（ｃ）所望の分子認識ユニットを形成させるために、（ｂ）で同定された単一の相補性決定領域によってコードされるアミノ酸配列を合成すること；および、（ｄ）分子認識ユニットが（ａ）で述べられた相補的分子認識部位であるかまたはそれを含有する分子と実際に結合し、所望の分子認識部位の結合を模倣していることを確証するために、酵素免疫抗体法、免疫蛍光アッセイおよびラジオイムノアッセイからなる群から選択されたアッセイに於て、分子認識ユニットを使用すること、を含んでなる、分子認識ユニットを設計するための方法。
７．（ａ）巨大分子の、または（ｂ）小分子、または天然に存在する巨大分子に対するリガンドとして機能する大分子の小領域の分子認識部位を模倣する、従って結合特異性を模倣するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含んでなる、請求の範囲第１項の方法にしたがって調製される分子認識ユニット。
８．（ａ）巨大分子の、または（ｂ）小分子、または天然に存在する巨大分子に対するリガンドとして機能する大分子の小領域の分子認識部位を模倣する、従って結合特異性を模倣するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含んでなる、請求の範囲第２項の方法にしたがって調製された分子認識ユニット。
９．（ａ）巨大分子の、または（ｂ）小分子、または天然に存在する巨大分子に対するリガンドとして機能する大分子の小領域の分子認識部位を模倣する、従って結合特異性を模倣するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含んでなる、請求の範囲第３項の方法にしたがって調製された分子認識ユニット。
１０．（ａ）巨大分子の、または（ｂ）小分子、または天然に存在する巨大分子に対するリガンドとして機能する大分子の小領域の分子認識部位を模倣する、従って結合特異性を模倣するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含んでなる、請求の範囲第６項の方法にしたがって調製される分子認識ユニット。
１１．巨大分子が、免疫グロブリン、酵素、レセプタータンパク質、感覚性レセプター、デオキシリボ核酸、リボ核酸、収縮性タンパク質、レクチンおよび他の結合タンパク質からなる群から選択される、請求の範囲第７項記載の分子認識ユニット。
１２．リガンドとして機能する分子が、抗原、ホルモン、酵素コファクターおよび基質、酵素阻害剤および活性化剤、酵素の遷移状態類似体、プロスタグランジン、神経ホルモン、増殖因子、フェロモン、レセプターに結合する薬剤、ビオチン、神経伝達物質、シグナルタンパク質およびペプチドのようなシグナル物質からなる群から選択される、請求の範囲第７項記載の分子認識ユニット。
１３．巨大分子が、免疫グロブリン、酵素、レセプタータンパク質、感覚性レセプター、デオキシリボ核酸、リボ核酸、収縮性タンパク質、レクチンおよび他の結合タンパク費からなる群から選択される、請求の範囲第８項記載の分子認識ユニット。
１４．リガンドとして機能する分子が、抗原、ホルモン、酵素コファクターおよび基質、酵素阻害剤および活性化剤、酵素の遷移状態類似体、プロスタグランジン、神経ホルモン、増殖因子、フェロモン、レセプターに結合する薬剤、ビオチン、神経伝達物質、シグナルタンパク質およびペプチドのようなシグナル物質からなる群から選択される、請求の範囲第８項記載の分子認識ユニット。
１５．巨大分子が、免疫グロブリン、酵素、レセプタータンパク質、感覚性レセプター、デオキシリボ核酸、リボ核酸、収縮性タンパク質、レクチンおよび他の結合タンパク質からなる群から選択される、請求の範囲第９項記載の分子認識ユニット。
１６．リガンドとして機能する分子が、抗原、ホルモン、酵素コファクターおよび基質、酵素阻害剤および活性化剤、酵素の遷移状態類似体、プロスタグランジン、神経ホルモン、増殖因子、フェロモン、レセプターに結合する薬剤、ビオチン、神経伝達物質、シグナルタンパク質およびペプチドのようなシグナル物質からなる群から選択される、請求の範囲第９項記載の分子認識ユニット。
１７．巨大分子が、免疫グロブリン、酵素、レセプタータンパク質、感覚性レセプター、デオキシリボ核酸、リボ核酸、収縮性タンパク質、レクチンおよび他の結合タンパク質からなる群から選択される、請求の範囲第１０項記載の分子認識ユニット。
１８．リガンドとして機能する分子が、抗原、ホルモン、酵素コファクターおよび基質、酵素阻害剤および活性化剤、酵素の遷移状態類似体、プロスタグランジン、神経ホルモン、増殖因子、フェロモン、レセプターに結合する薬剤、ビオチン、神経伝達物質、シグナルタンパク質およびペプチドのようなシグナル物質からなる群から選択される、請求の範囲第１０項記載の分子認識ユニット。