CN116640222A - 抗2,4-二硝基苯酚的抗体、包含其的偶联物、试剂、试剂盒及其应用 - Google Patents

抗2,4-二硝基苯酚的抗体、包含其的偶联物、试剂、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗2,4‑二硝基苯酚的抗体、包含其的偶联物、试剂、试剂盒及其应用，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗2,4‑二硝基苯酚的抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区。为抗2,4‑二硝基苯酚的抗体的选择提供了重要的原料来源。

Description

抗2,4-二硝基苯酚的抗体、包含其的偶联物、试剂、试剂盒及 其应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗2,4-二硝基苯酚的抗体、包含其的偶联物、试剂、试剂盒及其应用。
背景技术
免疫层析技术是在20世纪60年代在发达国家兴起并被用于检测血清蛋白的一种结合了免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法，利用胶体金、胶体碳、磁性纳米材料、稀土纳米材料、量子点等着色标记物，在层析时，标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色于硝酸纤维素膜上的检测线，以纤维膜上显色条带的有无、颜色深浅和反射光线来定性或定量，在即时检测(POCT)中应用极为广泛。免疫层析试纸条由样品垫、标记物垫、硝酸纤维素(NC)膜、检测线(T线)、质控线(C线)、吸水垫、聚氯乙烯(PVC)底板等部分组成。
在POCT检测试剂中质控线(C线)的质量至关重要，它能够对检测试剂产品是否有效、批间一致性、稳定性、以及样本定量的准确性等方面及时、准确、直观的判断。目前在POCT检测试剂中质控体系(标记-包被)常见有兔IgG—羊抗兔IgG、鼠IgG—羊抗鼠IgG、鸡IgY—羊抗鸡IgY，以及独立质控DNP—羊抗DNP等。
2,4-二硝基苯酚(2,4-Dinitrophenol，简称DNP)，分子式C6H4N2O5，是一种分子量为184.11的小分子化合物，主要用于有机合成及用作染料中间体；也是一种半抗原，本身没有诱导免疫应答的能力，但将它与BSA偶联后免疫小鼠，所得到的抗体能特异性与DNP结合。DNP在人体代谢中不会产生，不与样本中的干扰物质如嗜异性抗体、人类抗动物抗体等产生非特异性反应，可避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果；抗DNP抗原抗体可在免疫层析法中作为独立质控系统使用，能明显提高C线特异性。在免疫荧光层析上表现为热稳定性良好，受样本浓度影响小，C线稳定性更高，能够克服“HOOK”效应。
目前国内用于检测试剂中质控线(C线)的单克隆抗体基本自外国采购，成本高，且活性、亲和力、灵敏度或特异性等性能存在缺陷，因此本领域对于抗DNP抗体存在着强烈需求。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对上述技术问题，本发明旨在提供一种抗2,4-二硝基苯酚的抗体、包含其的偶联物、试剂、试剂盒及其应用，该抗体与2,4-二硝基苯酚结合，对其具有高的亲和力及反应活性。本发明为抗2,4-二硝基苯酚的抗体的选择提供了重要的原料来源。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR3，其包含SEQ ID NO:6或21任一所示的氨基酸序列，或由其组成。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种抗2,4-二硝基苯酚的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种抗2,4-二硝基苯酚的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区和上述的重链恒定区；所述轻链包括上述的轻链可变区和上述的轻链恒定区。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种核酸、载体、重组细胞及一种制备上述抗体或其功能性片段的方法。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种偶联物、试剂或试剂盒，所述偶联物、试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段。
为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了上述的抗体或其功能性片段或上述的偶联物、试剂或试剂盒作为质控品中的应用。
为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种免疫层析试纸条，所述试纸条的质控线上包被有上述的抗体或其功能性片段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1自左向右分别为Anti-DNP-6G1mut1、Anti-DNP-6G1mut2及Anti-DNP-6G1mut3的还原性SDS-PAGE的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR3，其包含SEQ ID NO:6或21任一所示的氨基酸序列，或由其组成。
在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。
在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。
在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
在可选的实施方式中，所述抗体还或其功能性片段还具有氨基酸序列如SEQ IDNO:7-10所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4，和氨基酸序列如SEQ ID NO:11-14所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，或与所述各序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。
需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13或14)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段以KD≤10-8M的亲和力结合2,4-二硝基苯酚。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段以KD≤2.57×10-9M的亲和力结合2,4-二硝基苯酚。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段以KD≤10-10M或KD≤10-11M的亲和力结合2,4-二硝基苯酚。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段以KD≤2.87×10-10M的亲和力结合2,4-二硝基苯酚。
KD的检测参考本发明实施例中的方法进行。
另一方面，本发明实施例提供一种抗2,4-二硝基苯酚的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为上述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
在可选的实施方式中，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16或22所示。
在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、骆驼、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为小鼠。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列(CH)如SEQ ID NO:17所示，所述轻链恒定区(CL)序列如SEQ ID NO:18所示。
需要说明的是，在其他的实施例中，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ IDNO:17或18)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列(CH)如SEQ ID NO:24所示。
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的VHH、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
另一方面，本发明提供一种抗2,4-二硝基苯酚的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区和上述的重链恒定区；所述轻链包括上述的轻链可变区和上述的轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:19或25所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20或23所示。
另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。
另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。
另一方面，本发明提供含有上述载体的重组细胞。
另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供一种偶联物、试剂或试剂盒，所述偶联物、试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包被于固相或标记有标记物。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段通过BSA间接包被于固相或间接标记有标记物。通过生物大分子，例如BSA，可提供更多的功能基团与固相或标记物进行反应。
在可选的实施方式中，所述固相选自微球、板和膜。
在可选的实施方式中，所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，所述标记物包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
另一方面，本发明提供一种上述的抗体或其功能性片段或上述的偶联物、试剂或试剂盒作为质控品中的应用。
在可选的实施方式中，所述质控品为免疫层析检测中的质控品。
免疫层析试纸条由样品垫、标记物垫、硝酸纤维素(NC)膜、检测线(T线)、质控线(C线)、吸水垫、聚氯乙烯(PVC)底板等部分组成。在检测中，质控线(C线)的质量至关重要，它能够对检测试剂产品是否有效、批间一致性、稳定性、以及样本定量的准确性等方面及时、准确、直观的判断。
另一方面，本发明提供一种免疫层析试纸条，所述试纸条的质控线上包被有上述的抗体或其功能性片段。
在可选的实施方式中，所述试纸条的标记物垫上包被有DNP-BSA。
在可选的实施方式中，所述DNP-BSA标记有标记物。
在可选的实施方式中，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物选自纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述胶体选自胶体金、胶体金、胶体银、胶体硒和胶体碳。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1Anti-DNP 6G1单克隆抗体的制备
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。
1重组质粒的构建
(1)抗体基因制备
从分泌抗2,4-二硝基苯酚的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，各4个克隆送基因测序公司进行测序。
(2)Anti-DNP 6G1抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为327bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为354bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
(3)重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM 3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.70kb的Light Chain基因片段和1.41kb的Heavy Chain基因片段。
Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2稳定细胞株筛选
(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
包被液(主要成分NaHCO3)稀释DNP-BSA(购自Biosearch，货号D-5050-10)至3ug/ml，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μL/孔，含柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)，加入显色液B液(50μL/孔，含柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)，10min；加入终止液(50μL/孔，含EDTA·2Na+浓H2SO4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对DNP有活性。
(2)重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂：Buffer 50μL、DNA 100μg/管、PuvI酶10μL、无菌水补至500μL，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
3重组抗体生产
(1)细胞扩培
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
(2)摇瓶生产及纯化
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图所示，在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD，另一条Mr为28KD。
实施例2亲和力及活性优化
实施例1得到的Anti-DNP-6G1单克隆抗体虽然具备结合DNP的能力，但亲和力和抗体活性均不够理想，因而申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应，将PCR产物克隆至载体，再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。经筛选，得到亲和力和抗体活性显著提升的单克隆抗体，并命名为：Anti-DNP-6G1mut1、Anti-DNP-6G1mut2、Anti-DNP-6G1mut3。
Anti-DNP-6G1mut1单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19和20所示；
Anti-DNP-6G1mut2单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19和23所示；
Anti-DNP-6G1mut3单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25和23所示。
实施例3抗体的性能检测
(1)亲和力分析
利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释到10ug/ml，DNP-BSA(购自Biosearch，货号D-5050-10)用PBST进行梯度稀释：
运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3(PBST)进行传感器再生，输出数据。(KD表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。PBST主要成分Na2HPO4+NaCl+TW-20)。
表1亲和力数据
样品名称 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
对照 2.57E-09 2.14E+05 5.50E-04
Anti-DNP-6G1mut1 1.68E-10 2.50E+06 4.20E-04
Anti-DNP-6G1mut2 2.87E-10 1.36E+06 3.90E-04
Anti-DNP-6G1mut3 2.38E-10 1.89E+06 4.50E-04
(2)活性检测
包被液(主要成分NaHCO3)稀释DNP-BSA(购自Biosearch，货号D-5050-10)至3ug/ml，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的上述单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-60min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液(PBS)清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/孔，含1.05g/L柠檬酸、0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/LTMB和0.2ml/L浓HCl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H2SO4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果见下表2。通过同样的方法，包被液稀释BSA，验证上述单克隆抗体与BSA的反应OD值低于0.02，与BSA无交叉反应性。
表2活性数据
样品浓度(ng/ml) 125 62.5 31.25 15.625 7.813 0
对照 2.365 1.533 0.949 0.375 0.229 0.019
Anti-DNP-6G1mut1 2.252 1.947 1.694 0.96 0.504 0.032
Anti-DNP-6G1mut2 2.278 2.166 1.613 0.987 0.516 0.031
Anti-DNP-6G1mut3 2.266 2.121 1.312 0.81 0.465 0.051
(3)稳定性考核
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表3为Anti-DNP-6G1mut1抗体考核21天的酶免活性检测OD结果。
表3稳定性数据
样品浓度(ng/ml) 125 15.625 0
4℃，21天样品 2.212 0.991 0.042
-80℃，21天样品 2.237 0.977 0.052
37℃，21天样品 2.257 0.985 0.047
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本申请涉及的部分氨基酸序列如下所示：
编号 序列片段
SEQ ID NO:1 TGYWN
SEQ ID NO:2 YISYSGRTYYNPSLKS
SEQ ID NO:3 WTTAYFGI
SEQ ID NO:4 RSSTGAVTTSNNAN
SEQ ID NO:5 GTSNRAP
SEQ ID NO:6 AIWYSTHY
SEQ ID NO:21 ALWYSTHY
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市朋志生物科技有限公司
<120> 抗2,4-二硝基苯酚的抗体、包含其的偶联物、试剂、试剂盒及其应用
<130> P2022018CN01
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
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Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Ile Thr Gly
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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Phe Met
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Ser Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
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Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr
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<223> 人工合成
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Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Ile Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Asn Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Ser Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Val Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Asp Ala Met Tyr Phe Cys Ala Ile Trp Tyr Ser Thr
85 90 95
His Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 17
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 18
Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Glu Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asn
20 25 30
Phe Ser Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Thr Pro
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu Gly Asn Lys
50 55 60
Phe Met Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ser Asp Gln Trp Arg Ser
65 70 75 80
His Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asp Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu
100 105
<210> 19
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 19
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Ile Thr Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Phe Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Trp Thr Thr Ala Tyr Phe Gly Ile Asp Ser Trp Gly Gln Gly Ile
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Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135 140
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Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
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Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe
355 360 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385 390 395 400
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 20
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 20
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Ile Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Asn Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Ser Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Val Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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<210> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 21
Ala Leu Trp Tyr Ser Thr His Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 22
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Thr Val Ile Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Asn Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
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<220>
<223> 人工合成
<400> 23
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1 5 10 15
Thr Val Ile Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Leu Ile Gly Gly Thr Ser Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Val Arg Phe
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu Gly Asn Lys Phe Met Ala
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195 200 205
Ser Pro Ala Glu Cys Leu
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<211> 324
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 24
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1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
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145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
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210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
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290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
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<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Ile Thr Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Phe Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
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100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
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Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
260 265 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
290 295 300
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305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440

Claims (13)

1.一种抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR3，其包含SEQ ID NO:6或21任一所示的氨基酸序列，或由其组成。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还具有氨基酸序列如SEQ ID NO:7-10所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4，和氨基酸序列如SEQID NO:11-14所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，或与所述各序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；
可选地，所述抗体或其功能性片段以KD≤10-8M的亲和力结合2,4-二硝基苯酚。
3.一种抗2,4-二硝基苯酚的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为权利要求1所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为权利要求2所述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列；
可选地，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16或22所示。
4.根据权利要求1至3任一所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区；
可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；
可选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；
可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；
可选地，所述恒定区的种属来源为小鼠；
可选地，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:17或24所示或与其具有至少80％同源性，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:18所示或与其具有至少80％同源性。
5.根据权利要求1至4任一所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
6.一种抗2,4-二硝基苯酚的抗体，包括重链和/或轻链，其特征在于，所述重链包括权利要求3所述的重链可变区和权利要求4所述的重链恒定区；所述轻链包括权利要求3所述的轻链可变区和权利要求4所述的轻链恒定区；
可选地，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:19或25所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20或23所示。
7.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段。
8.一种载体，其特征在于，其含有编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段的核酸片段。
9.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求8所述的载体。
10.一种制备权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求10所述的重组细胞。
11.一种偶联物、试剂或试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段；可选地，所述抗体或其功能性片段包被于固相或标记有标记物；可选地，所述抗体或其功能性片段通过BSA间接包被于固相或间接标记有标记物。
12.权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求11所述的偶联物、试剂或试剂盒作为质控品中的应用；可选地，所述质控品为免疫层析检测中的质控品。
13.一种免疫层析试纸条，所述试纸条的质控线上包被有权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段；可选地，所述试纸条的标记物垫上包被有DNP-BSA；可选地，所述DNP-BSA标记有标记物；
可选地，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物；
可选地，所述纳米颗粒类标记物选自纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒；
可选地，所述胶体选自胶体金、胶体金、胶体银、胶体硒和胶体碳。
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