DE69936389T2

DE69936389T2 - Herstellung von motiv-spezifischen und kontextunabhängigen antikörpern unter verwendung von peptidbibliotheken als antigene

Info

Publication number: DE69936389T2
Application number: DE69936389T
Authority: DE
Inventors: Yi Lynnfield TAN; Michael J. Manchester COMB
Original assignee: Cell Signaling Technology Inc
Current assignee: Cell Signaling Technology Inc
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-08-26
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2019-08-27
Also published as: US20030068652A1; US6441140B1; JP3732408B2; EP1850131A1; EP1110086A4; JP2012162535A; JP2014132019A; CA2341143C; EP1110086A1; EP2325204B1; EP2325204A3; US7344714B2; US20020132988A1; EP2325204A2; US7259022B2; CA2341143A1; US20020168684A1; JP2016210783A; US6982318B1; EP1850131B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung motivspezifischer, kontextunabhängiger Antikörper, die für wenigstens einen fixierten Aminosäurerest im Kontext variabler umliegender Aminosäure- oder Peptidsequenzen spezifisch sind. Antikörper mit diesen Eigenschaften sind bei der Charakterisierung verschiedener Formen zellulärer Regulation nützlich und dienen der Profilierung genomweiter Veränderungen bei zellulären Proteinniveaus und Proteinmodifikation.
Die Identifizierung der Targets von intrazellulären Signalkaskaden ist für das Verständnis von Zellwachstum, Differenzierung und Zelltod sehr wichtig. Proteinkinasekaskaden leiten Informationen von der Zelloberfläche zu mehreren Zellkompartimenten, inklusive des Kerns und weiter entfernter Zellfortsätze wie Synapsen, weiter (Karin et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 6:415-424 (1994)). Zwar wurden ein paar Targets der Proteinphosphorylierung identifiziert, doch sind die meisten weiterhin unbekannt, vor allem solche, die Zellwachstum und -differenzierung regulieren. Zum Beispiel spielt die MAP-Kinasekaskade bekanntlich eine bedeutende Rolle bei der Regulierung des Zellwachstums (Lewis et al., Adv. Cancer Res. 74:49-139 (1998), Crowley et al., Cell 77:841-852 (1994)). Außer einer Handvoll Substrate wurden jedoch wenige Proteintargets identifiziert, die für die verschiedenen Aktionen der MAP-Kinasekaskade verantwortlich sind (Fukunaga and Hunter, EMBO 16(8):1921-1933 (1997), Stukenberg et al., Curr. Biol. 7:338-348 (1997)).
Ein weiteres Beispiel für Zellsignalproteine sind die 14-3-3 Proteine, die eine phylogenetisch konservierte Familie von Phosphoserinbindeproteinen repräsentieren, deren präzise Rolle in der Zellsignalisierung noch zu bestimmen ist (Burbelo and Hall, Curr. Biol. 5(2):95-96 (1995)). Diese Proteine repräsentieren einen großen Teil des gesamten Hirnproteins und binden bekanntlich eine große Vielfalt von Signalmolekülen, wie: ras, raf, bad, cdc25 und viele andere (Paffe et al., Cell 91:961-971 (1997)). Kürzlich wurde gezeigt, dass sich 14-3-3 Proteine spezifisch an phosphorylierte Orte auf Proteinen mit dem folgenden Motiv binden: RXRSXS*XP, wobei S* Phosphoserin ist und X jede beliebige Aminosäure repräsentiert (Muslin et al., Cell 84:889-897 (1996), Paffe et al., supra (1997)).
Ebenso ist seit langem bekannt, dass Histone durch Acetylierung an spezifischen Lysinresten modifiziert werden. Es wird angenommen, dass eine Acetylierung von Lysin in Histonen Protein-DNA-Interaktionen reduziert und dazu dient, Chromatin in Regionen zu öffnen, die eine Transkription erfahren (Struhl, Genes & Development, 12:599-606 (1998)). Kürzlich wurde gezeigt, dass andere mit Transkriptionskomplexen assoziierte Proteine an Lysin acetyliert werden, obschon die funktionelle Bedeutung unklar ist (Imhof et al., Curr. Biol. 7:689-692 (1997), Struhl supra (1998)).
Antikörper gegen Phosphotyrosin sind erwiesenermaßen von großem Wert bei der Identifizierung und Charakterisierung intrazellulärer Signalmechanismen (Ross et al., Nature 294:654 (1981)), Kozma et al., Method. Enzymol. 201:28 (1991), White and Racker, Method. Enzymol. 201:65 (1991), Kamps, Method. Enzymol. 201:101 (1991)). Ihr Wert rührt von zwei Eigenschaften her: 1) ihrer Fähigkeit zu unterscheiden, ob ein Protein tyrosinphosphoryliert ist oder nicht, und 2) ihrer Fähigkeit, mit einer großen Vielfalt verschiedener Proteine zu reagieren. Diese Eigenschaften haben sich beim Aufspüren intrazellulärer Signalpfade und Identifizieren neuer Targets aktivierter Tyrosinkinasen von unschätzbarem Wert erwiesen.
Im Idealfall sollten die nützlichsten Phosphotyrosinantikörper möglichst allgemein sein, d.h. sie sollten Phosphotyrosin unabhängig von den Proteinsequenzen erkennen, in denen es eingebettet ist (kontextunabhängig), um den Nachweis aller möglichen Phosphotyrosinreste zu ermöglichen. Die erfolgreichsten Ansätze zur Herstellung von Phosphotyrosinantikörpern haben Phosphotyrosin oder Phosphotyramin genutzt, gekoppelt über ihre freien Aminogruppen mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin unter Verwendung von hetero- oder bifunktionellen Vernetzungsmitteln (Frackelton et al., Method. Enzymol. 201:79 (1991), White and Racker supra (1991), Wang, Method. Enzymol. 201:53 (1991), Kamps supra (1991)). Zwar erkennen derzeit produzierte polyklonale und monoklonale Phosphotyrosinantikörper viele verschiedene Proteine, doch haben sie oft eine Kreuzreaktivität mit anderen phosphathaltigen Verbindungen, wie z.B. Mononucleotiden (Frackelton et al. supra (1991), Kamps supra (1991)). Noch wichtiger ist, dass die meisten auf diese Weise gewonnenen Phosphotyrosinantikörper eine variable Sequenzreaktivität aufweisen, was nicht nur von der phosphorylierten Aminosäure, sondern auch von den Aminosäuresequenzen, die das Phosphotyrosin umgeben, abhängig ist. Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben zum Beispiel beobachtet, dass die meisten Phosphotyrosinantikörper Phosphotyrosin, dem Prolin vorangeht, wie in der Aktivierungsschleife von JNK zu finden, nicht erkennen und folglich mit aktiviertem (tyrosinphosphoryliertem) JNK nicht wesentlich reagieren [(Tan et al. unveröffentlichte Beobachtungen)]. Der Grund für die variable Reaktivität liegt wahrscheinlich in der Tatsache, dass das Phosphotyrosinantigen nicht direkt dem Immunsystem im Kontext variabler umliegender Aminosäuren präsentiert wird, sondern stattdessen als ein Hapten präsentiert wird, das mit dem KLH-Täger über künstliche Verknüpfungen unangemessen gekoppelt ist. Mit diesem Ansatz werden gewöhnlich Antikörper produziert, die mit Phosphotyrosin gut reagieren, allerdings manchmal durch umliegende Aminosäuren blockiert werden, da sie im Antigen nicht vorliegen.
Im Rahmen anderer Ansätze wurden völlig zelluläre phosphotyrosinhaltige Proteine als Immunogene (Glenney, ) Method. Enzymol. 201:92 (1991), Wang supra (1991) mit erheblichem Erfolg verwendet, allerdings wurde die Kontextabhängigkeit der resultierenden Antikörperspezifitäten nicht sorgfältig bestimmt, obschon auf diese Weise angehobene Antikörper mit einer Mehrheit tyrosinphosphorylierter Proteine reagierten. Schätzungen bezüglich der Fraktion nachgewiesener tyrosinphosphorylierter Proteine reichen von 50 bis 94 (Kamps supra (1991)).
Versuche, die oben erwähnten Techniken für die Herstellung ähnlicher Antikörper für Phosphoserin und Phosphothreonin anzuwenden, waren begrenzt erfolgreich. Bisher produzierte Antikörper haben eine begrenzte Kreuzreaktivität und eine geringere Affinität in Bezug auf Phosphoserin oder Phosphothreonin, wahrscheinlich aufgrund der schlechten Immunogenität dieser Phospho-Aminosäuren im Vergleich zu Phosphotyrosin (Heffetz et al., Method. Enzymol. 201:44 (1991)). Kontextabhängigkeit und geringe Affinität haben die Nützlichkeit derzeit erhältlicher Phosphoserin- und Phosphothreoninantikörper begrenzt, vor allem im Vergleich zu Phosphotyrosinantikörpern.
Ortsspezifische Phosphoserin- und Phosphothreoninantikörper wurden zuerst von Nairn et al. 1982 beschrieben und haben sich als äußerst nützliche Werkzeuge zur Untersuchung der Proteinphosphorylierung erwiesen (Czernik et al., Method. Enzymol. 201:264 (1991), Czernik et al., Neuroprot. 6:56-61 (1995)). Ein Nachteil dieses Antikörpertyps ist, dass für jeden Ort von Interesse ein unterschiedlicher Antikörper produziert werden muss. Natürlich wäre die Entwicklung von Antikörpern, die Phosphoserin oder Phosphothreonin in einer kontextunabhängigen Weise nachweisen, für die Verwendung beim Aufspüren von Serin/Threoninkinasekaskaden und Definieren ihrer biologischen Reaktionen wünschenswert. ) Ebenso würden durch die Entwicklung kontextunabhängiger Phosphotyrosinantikörper die Beschränkungen derzeit erhältlicher Antikörper überwunden.
Motivspezifische, kontextunabhängige Antikörper wären auch zur Identifizierung neuer Targets von 14-3-3 Aktion (d.h. andere an diesem Motiv phosphorylierte Proteine) und Charakterisierung der Proteinkinasen nützlich, die diese Orte phosphorylieren. Ebenso würden gegen acetyliertes Lysin reaktive Antikörper als nützliche Instrumente für die Untersuchung der funktionellen Bedeutung der Acetylierung von Histonen fungieren.
Solche Antikörper können ferner als allgemeine Reagenzien für den Nachweis einer Phosphorylierung oder anderen enzymatischen Modifikation in vitro, wie z.B. in Kinaseassays mit hohem Durchsatz für Wirkstoff-Screening-Verfahren, eingesetzt werden, da ein einziger Antikörper zur Erkennung vieler verschiedener phosphorylierter Substrate verwendet werden kann. Phosphotyrosinantikörper werden derzeit in Kinaseassays mit hohem Durchsatz eingesetzt, um nach selektiven Tyrosinkinaseinhibitoren mit hoher Affinität zu screenen. Verbindungen oder Wirkstoffe, die Enzymaktivität blockieren, werden anhand ihrer Fähigkeit zur Hemmung der Kinaseaktivität erfasst, die durch eine Reduzierung der Phosphotyrosinantikörperbindung am phosphorylierten Substrat bestimmt wird. Ähnliche Assays können zum Screenen nach pharmazeutisch nützlichen Verbindungen unter Verwendung von Antikörpern, die wie oben beschrieben hergestellt werden, für Phosphoserin, Phosphothreonin oder Antikörpern aufgestellt werden, die andere Proteinmodifikationen erfassen.
Antikörper, die kurze Motive in einer kontextunabhängigen Weise erfassen, werden zum Profilieren genomweiter Veränderungen bei Proteinniveaus und Proteinmodifikation auch besonders nützlich sein. Die ) Verwendung von kontextunabhängigen Phosphothreoninantikörpern und 2D-Gelelektrophorese zum Profilieren genomweiter Veränderungen in der Proteinphosphorylierung (Patterson and Garrels, Cell Biology: A Laboratory Handbook 249-257 (1994), Academic Press) infolge einer Wirkstoffbehandlung oder Überexprimierung eines speziellen Proteins wird sich zum Beispiel bei der Identifizierung potentieller Wirkstoff-Protein-Interaktionen zweifellos als nützlich erweisen und neue Downstream-Targets für überexprimierte Proteine vorschlagen. Die WO 95/18823 beschreibt ein Verfahren zum Bestimmen eines Aminosäuresequenzmotivs für einen Phosphorylierungsort einer Proteinkinase. Eine Proteinkinase wird mit einer gerichteten degenerierten Peptidbibliothek in Kontakt gebracht, Peptide in der Bibliothek, die Substrate für die Kinase sind, werden in Phosphopeptide umgewandelt und die Phosphopeptide werden von nichtphosphorylierten Peptiden getrennt. Die isolierten Phosphopeptide werden sequenziert und ein Aminosäuresequenzmotiv für den Phosphorylierungsort wird auf der Basis der relativen Abundanz verschiedener Aminosäurereste an jeder degenerierten Position bestimmt.
Khachigian et al. (Journal of Immunological Methods, 140 (1991):249-258) beschreiben die Gewinnung eines kreuzreaktiven monoklonalen Antipeptid-Antikörpers mit Spezifität für Lysyl-Lysin.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines motivspezifischen Antikörpers bereitgestellt, der spezifisch ein Motiv bindet, das in einer Mehrzahl verschiedener Peptide oder Proteine im Kontext einer variablen Peptidsequenz auftritt, die das Motiv umgibt, wobei das genannte Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet:

(a) Konstruieren einer degenerierten Peptidbibliothek, die (i) ein fixiertes Motiv, das wenigstens eine modifizierte Aminosäure beinhaltet, und (ii) eine Mehrzahl degenerierter Aminosäuren umfasst, die das genannte fixierte Motiv umgeben;
(b) Immunisieren eines Wirts mit der genannten Peptidbibliothek; und
(c) Isolieren von Antiseren von dem genannten Wirt und Reinigen des genannten motivspezifischen, kontextunabhängigen Antikörpers von den genannten Antiseren; wobei der genannte Antikörper das genannte Motiv in einer Mehrzahl verschiedener Peptide oder Proteine, in denen es auftritt, spezifisch bindet.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern bereitgestellt, die selektiv spezifizierte Aminosäuremotive unabhängig von den umliegenden Aminosäure-, Peptid- oder Proteinsequenzen erkennen. Das Verfahren ermöglicht die Produktion von Antikörpern, die modifizierte einzelne Aminosäuren, zum Beispiel phosphoryliertes Serin, Threonin und Tyrosin oder acetyliertes Lysin, sowie andere unmodifizierte oder modifizierte Motive von einer oder mehreren Aminosäure(n) erkennen.
Das Verfahren beinhaltet die Produktion und Reinigung von stark kontextunabhängigen Antikörpern, die spezifische und hoch degenerierte Aminosäuremotive wie solche erkennen, die in Kinase-Konsensus-Sequenzen oder anderen Enzymbindungsorten zu finden sind. Ferner kann das Verfahren zur Herstellung stark kontextunabhängiger polyklonaler oder monoklonaler Antikörper angewendet werden.
Antikörper, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, können für praktisch jedes beliebige Proteinmotiv, ob modifiziert oder unmodifiziert, spezifisch sein. Das Verfahren kann zum Beispiel zum Herstellen von Antikörpern angewendet werden, die Phosphothreonin alleine oder Phosphothreonin im Kontext mehrerer fixierter Aminosäuren erkennen, wie in den MAPK, 14-3-3 oder cdk Konsensusorten zu finden ist. Es kann außerdem zum Herstellen von Antikörpern angewendet werden, die für andere modifizierte Aminosäuren, z.B. acetyliertes Lysin, spezifisch sind, oder für den Nachweis irgendeines kurzen Motivs von einer oder mehreren Aminosäur(en) in einer kontextunabhängigen Weise.
Erfindungsgemäß wird außerdem ein motivspezifischer Antikörper bereitgestellt, der spezifisch ein phosphoryliertes Kinase-Konsensus-Motiv im Kontext einer variablen Peptidsequenz bindet, die das Motiv umgibt, wobei der genannte Antikörper das genannte Motiv in einer Mehrzahl verschiedener Peptide oder Proteine, in denen es auftritt, spezifisch bindet.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Antikörper bereitgestellt, der selektiv eine einzelne modifizierte Aminosäure bindet, unabhängig von der umliegenden Aminosäure-, Peptid oder Proteinsequenz, wobei die genannte einzelne modifizierte Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem acetylierten und einem methylierten Rest.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Profilieren großer und vielfältiger Proteinpopulationen im Genommaßstab bereit, indem motivspezifische, kontextunabhängige Antikörper gegen Motive verwendet werden, die auf solchen Proteinen konserviert sind. Phosphorylierungsspezifische Antikörper ermöglichen z.B. eine genomweite Profilierung von Veränderungen bei der Proteinphosphorylierung infolge einer Wirkstoffbehandlung.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Identifizierung eines unbekannten Substrats eines bekannten Enzyms durch die Verwendung von motivspezifischen, kontextunabhängigen Antikörpern bereit, die gegen Motive gewonnen werden, die anderen Substraten des Enzyms zu eigen sind.
Die vorliegende Erfindung schließt außerdem die Verwendung solcher motivspezifischer, kontextunabhängiger Antikörper als Reagens für den Nachweis enzymatischer Modifikationen eines bestimmten Motivs innerhalb eines Substrats ein.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1a ist eine Tabelle, die die Spezifität der affinitätsgereinigten, polyklonalen Antikörper darstellt, die anhand einer phosphorylierten Threoninpeptidbibliothek in Beispiel I produziert wurden, wenn sie anhand spezifischer Peptide getestet werden.
1b ist eine Tabelle, die die Spezifität der Phosphothreoninantikörper aus Beispiel I darstellt, wenn sie anhand verschiedener Phosphopeptidbibliotheken getestet werden.
1c zeigt eine Western-Analyse, die die Reaktivität der Phosphothreoninantikörper aus Beispiel I gegen Zellextrakte von Zellen mit und ohne Behandlung mit Okadaic-Säure und gegen andere Phosphoproteine darstellt.
1d ist eine Tabelle, die die Kontextunabhängigkeit der Anti-Phosphothreoninantikörper aus Beispiel I zeigt, wie anhand eines immobilisierten Rasters dargestellt.
2a ist eine Tabelle, die die Spezifität der affinitätsgereinigten, polyklonalen Antikörper darstellt, die anhand einer phosphorylierten PXS*P-Peptidbibliothek im Beispiel II produziert wurden.
2b ist eine Western-Analyse, die die Reaktivität der Phospho-PXS*P-Antikörper aus Beispiel II gegen Zellextrakte von Zellen mit und ohne Behandlung mit Okadaic-Säure und gegen andere Phosphoproteine darstellt.
3a ist eine Tabelle, die den Mangel an Reaktivität der affinitätsgereinigten, polyklonalen 14-3-3 Antikörper aus Beispiel III beim Test anhand Nichtphosphopeptiden oder Phosphopeptiden ohne das Motiv darstellt.
3b zeigt eine Western-Analyse, die die Reaktivität der Phospho-14-3-3-Antikörper aus Beispiel III gegen Zellextrakte von Zellen darstellt, die mit GST-Bad und mit TPA tranfiziert wurden.
4a ist eine Tabelle, die die Spezifität der monoklonalen Antikörper darstellt, die anhand einer phosphorylierten PXT*PXR-Bibliothek in Beispiel IV produziert wurden.
4b zeigt eine Western-Analyse, die die Reaktivität der monoklonalen CDK-Konsensusort-Antikörper aus Beispiel IV gegen phosphoryliertes und nichtphosphoryliertes RB-Protein darstellt.
5a zeigt eine Western-Analyse, die die Spezifität der acetylierten Lysinantikörper aus Beispiel V gegen acetyliertes BSA darstellt.
5b zeigt eine Western-Analyse, die die Reaktivität der acetylierten Lysinantikörper aus Beispiel V gegen verschiedene Proteine darstellt, die in C6-Zellextrakten vorliegen, wenn die Antikörper mit einer nichtacetylierten Peptidbibliothek vorinkubiert werden.
5c zeigt eine Western-Analyse, die die Reaktivität der acetylierten Lysinantikörper aus Beispiel V gegen verschiedene Proteine darstellt, die in C6-Zellextrakten vorliegen, wenn die Antikörper mit einer acetylierten Peptidbibliothek vorinkubiert werden.
5d zeigt eine Western-Analyse, die die Reaktivität der acetylierten Lysinantikörper aus Beispiel V gegen das acetylierte Kontroll-BSA darstellt, wenn die Antikörper mit einer acetylierten Peptidbibliothek vorinkubiert werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Konzept, dass die Konzentration jeder beliebigen individuellen Sequenz in einer Peptidbibliothek, die als Antigen verwendet wird, extrem gering ist und folglich nicht ausreicht, um eine Immunantwort in einem Wirt anzutreiben. Die einzigen antigenen Determinanten mit ausreichend hoher Konzentration für den Antrieb der Immunantwort sind somit die fixierten Reste, die allen Sequenzen zu eigen sind, sowie das Peptidrückgrat selbst.
Durch das Immunisieren eines Wirts mit Peptidbibliotheken, die alle 20 Aminosäuren an jeder degenerierten Position repräsentieren, werden Antikörper produziert, die gegenüber vielen oder allen Aminosäuren an den variablen Positionen, die um einen oder mehrere fixierte Reste liegen, tolerant sind. Solche Antikörper reagieren dann mit der antigenen Determinante im Kontext des weitestmöglichen Bereichs umliegender Aminosäure-, Peptid- und Proteinsequenzen. Der/die fixierte(n) Rest(e) des Motivs kann/können eine einzelne unmodifizierte oder modifizierte Aminosäure, wie ein phosphorylierter oder nichtphosphorylierter Rest, oder mehrere unmodifizierte oder modifizierte Aminosäuren, wie ein Konsensus-Erkennungsort, sein.
Der hierin verwendete Begriff „Antikörper" bezieht sich auf polyklonale oder monoklonale Antikörper, einschließlich Fc-Fragmente, Fab-Fragmente, chimärer Antikörper oder anderer antigenspezifischer Antikörperfragmente.
Der hierin verwendete Ausdruck „motivspezifische, kontextunabhängige Antikörper" bezieht sich auf Antikörper, die gegenüber einem oder mehreren fixierten Aminosäureresten im Kontext variabler umliegender Peptid- oder Proteinsequenzen spezifisch sind; eine solche Antikörperspezifität ist von dem Kontext, in dem das Antigen auftritt, folglich sehr unabhängig.
Der hierin verwendete Begriff „Substrat" bezieht sich auf jedes beliebige Targetmolekül, einschließlich Peptide oder Proteine, das ein Enzym spezifisch erkennt und auf das es einwirkt.
Das allgemeine Verfahren, mit dem motivspezifische, kontextunabhängige Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden, ist wie folgt:

(1) Motivspezifische Antikörper, die mit jedem beliebigen Protein oder Peptid, das spezifische Targetreste enthält, unabhängig von den umliegenden Aminosäuren reagieren, können durch Synthetisieren einer hoch degenerierten Peptidbibliothek erzeugt werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Bibliothek XXXXXXJ*XXXXXXC, wobei X = alle 20 Aminosäuren, außer Cystein, und J* = eine modifizierte (*) Aminosäure (J), z.B. Phosphothreonin (T*) oder acetyliertes Lysin (K*). Es ist zu verstehen, dass der spezifische Targetrest unmodifiziert sein kann und dass eine kürzere oder längere Bibliothek erzeugt werden kann und weniger als alle der umliegenden Aminosäuren unterschiedlich sein können. In einer bevorzugten Ausgestaltung hat die Peptidbibliothek eine Länge von etwa 6 bis 14 Resten. In der bevorzugten Ausgestaltung wird zwar eine fixierte Aminosäure (entweder modifiziert oder unmodifiziert) in einem variierten Umgebungskontext verwendet, doch kann in anderen bevorzugten Ausgestaltungen ein Motiv verwendet werden, das mehrere fixierte Aminosäuren umfasst. Ebenso kann die umliegende Sequenz der Bibliothek an mehr als einer Position gleichzeitig variiert sein, oder, wie in der bevorzugten Ausgestaltung, an nur einer umliegenden Sequenzposition pro degeneriertem Molekül variiert sein, so dass eine Bibliothek erzeugt wird, die an jeder Position, außer dem/den fixierten Rest(en), völlig degeneriert ist. Die Peptidbibliothek kann durch standardmäßige F-Moc-Festphasenpeptidsynthese mit einem ABI Peptidsynthesizer und unter Verwendung von Gemischen der jeweiligen Aminosäuren im Laufe degenerierter Kopplungsreaktionen synthetisiert werden. Der Einbau modifizierter Aminosäuren an fixierten Positionen sollte nicht auf Phosphorylierungen oder Acetylierungen begrenzt sein, da auch andere modifizierte geschützte Aminosäuren eingebaut werden können, zum Beispiel mit Lipiden modifizierte Aminosäuren (z.B. farnesyliert, isoprenyliert) oder geschützte O-verknüpfte oder N-verknüpfte Zucker (z.B. glycosyliert), methylierte oder ribosylierte Aminosäuren oder Nucleotide, Polymere von Nucleotiden, Nucleoside oder Aminosäuren wie Ubiquitin oder Aminosäureanaloge. Der Einbau unmodifizierter Aminosäuren an fixierten Positionen kann so gewählt werden, dass konservierte Motive nachgeahmt werden, z.B. Zinkfinger oder wiederholende Argininreste.
(2) Zum Erzeugen einer möglichst gleichmäßigen Repräsentation der jeweiligen Aminosäuren an jeder degenerierten Position werden mehrere Zyklen bestehend aus Verändern der Aminosäurezusammensetzung, Synthetisieren und Peptidsequenzieren durchgeführt. Es erfolgt eine Aminosäuresequenzanalyse an mehreren verschiedenen Positionen entlang dem Peptid, um eine zufällige Aminsäurerepräsentation an jeder Position zu verifizieren und dass die Zufallsrepräsentation im Laufe der gesamten Synthese beibehalten wird. Für die Fachperson wird es verständlich sein, dass die Anzahl der Runden variieren kann, um eine gleichmäßige Verteilung aller Aminosäuren an jeder Position zu erreichen.
(3) Die äußerst vielfältige Peptidbibliothek wird als ein Antigen verwendet, vorzugsweise durch eine kovalente Kopplung an einen Träger. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), emulgiert in Freundschem Adjuvans, als Kopplungsmittel verwendet und die gekoppelte Peptidbibliothek wird intradermal in einen Wirt, wie z.B. weibliche weiße Neuseelandkaninchen, injiziert. Booster-Injektionen in inkomplettem Freundschem Adjuvans können bis zum Erreichen einer Immunantwort verabreicht werden. Der Antikörpertiter wird mit einem geeigneten Verfahren wie ELISA anhand der motivspezifischen Peptidbibliotheken gemessen. Auf diese Weise angehobene Antiseren können sowohl in rohen als auch in gereinigten Präparaten wie nachfolgend dargelegt verwendet werden.
(4) Antiseren von den vielversprechendsten Wirten werden zum Beispiel über Protein A gereinigt und an einer J-(nicht modifizierten)-Peptidbibliotheksäule adsorbiert. In der bevorzugten Ausgestaltung wird die nicht adsorbierte Fraktion (Durchfluss) dann auf eine J*-Säule aufgetragen, bei einem geeigneten pH-Wert eluiert, dialysiert und im Hinblick auf J*-Spezifität mit einem geeigneten Verfahren wie ELISA unter Verwendung von J* und J als Antigen getestet.
(5) Auf diese Weise affinitätsgereinigte Antikörper erkennen die J*-Peptidbibliothek, reagieren aber nicht mit der J-Bibliothek und weisen einen hohen Grad an Spezifität für J* auf. Diese Antikörper können weiter im Hinblick auf einen Mangel an Reaktivität gegen die unmodifizierte Form der targetmodifizierten Aminosäure, J* oder ein J*-Homolog mit einem geeigneten Verfahren wie ELISA getestet werden.
(6) Antikörper können ferner durch Western-Blotting oder ein anderes geeignetes Verfahren unter Verwendung von Zellextrakten getestet werden, die von Zellen mit und ohne Behandlung mit einem selektierten Proteinmodifikationsenzyminhibitor, wie der Proteinphosphataseinhibitor Okadaic-Säure, hergestellt werden. Behandlungen, die die Proteinmodifikation erhöhen, erhöhen die Zahl antikörperreaktiver Proteine sowie die Intensität der Reaktivität. Die J*-spezifischen Antikörper reagieren mit einer relativ geringen Anzahl von Proteinen von Kontrollextrakten, reagieren jedoch mit einer sehr großen Anzahl nach der Behandlung mit dem ausgewählten Inhibitor. Die Antikörper weisen keine Reaktivität mit den inaktiven, nicht modifizierten Versionen dieser Proteine auf, was einen hohen Grad an J*-Spezifität demonstriert und auf eine breite Kreuzreaktivität mit vielen verschiedenen Proteinen, die modifiziertes Target enthalten, hinweist.
(7) Der Grad an Kontextunabhängigkeit kann z.B. durch eine ELISA-Analyse anhand individueller J*-Peptide, die miteinander vermischt oder einzeln getestet werden, sorgfältiger untersucht werden. Eine solche Analyse kann aufzeigen, ob eine schlechte Reaktivität mit bestimmten Motiven auftritt, wenn z.B. auf J* Prolin folgt.
(8) Die Kontextabhängigkeit der J*-Antikörpererkennung kann wie in der bevorzugten Ausgestaltung mit einem immobilisierten Raster modifizierter Peptidbibliotheken weiter untersucht werden. Jede unterschiedliche Bibliothek wird so synthetisiert, dass sie zusätzlich zu einem fixierten Targetrest, J*, eine zusätzliche fixierte Aminosäure an verschiedenen Positionen relativ zu J* enthält, wobei jedoch alle anderen Positionen alle 20 Aminosäuren, außer Cystein, enthalten. Die jeweiligen Peptidbibliotheken werden zum Beispiel auf den Boden eines ELISA-Wells gestrichen und J*-Antikörpern ausgesetzt. Antikörper, die nicht mit einem speziellen Spot (Peptidbibliothek) auf dem Raster reagieren, binden nicht, wenn die spezifizierte Aminosäure an der spezifizierten Position anwesend ist. Mit dieser Analyse wird bestimmt, ob eine spezielle Aminosäure an einer speziellen Position relativ zu J* eine Bindung zulässt/blockiert oder nicht. Alternativ können gereinigte Antikörper mit Kügelchen verknüpft werden, die die modifizierte oder unmodifizierte Bibliothek binden können, ungebundene Sequenzen werden weggewaschen und gebundene Sequenzen wiedergewonnen und einer Aminosäuresequenzierung unterzogen, um die Menge jeder Aminosäure zu bestimmen, die an den jeweiligen Positionen in der Bibliothek anwesend sind. Diese Informationen zeigen, welche Aminosäuren an den jeweiligen Positionen toleriert werden.
(9) Monoklonale Antikörper können gemäß einer Form der bevorzugten Ausgestaltung durch Koppeln der J*-Peptidbibliothek an einen geeigneten Träger wie KLH hergestellt und in einen Wirt wie balbC-Mäuse injiziert werden. Das J*-Peptid-KLH-Konjugat kann in Freundschem Adjuvans emulgiert werden und Booster-Injektionen in inkomplettem Freundschen Adjuvans können alle zwei Wochen durchgeführt werden, bis eine Reaktion erhalten wird.
(10) Der Antikörpertiter wird mit einem geeigneten Verfahren wie ELISA anhand J*- und Nicht-J*-Peptidbibliotheken gemessen. Seren von Wirten mit hohen Titerreaktionen werden mit immobilisiertem Nicht-J*-Peptid adsorbiert und die nicht adsorbierte Fraktion wird zum Beispiel durch Western-Blotting getestet.
(11) Die Milz von Wirten mit J*-spezifischen Reaktionen wird mit Myelomzellen verschmolzen und Hybridomklone werden selektiert und gescreent. Supernatanten von individuellen Klonen werden zuerst im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Bindung der J*-Peptidbibliothek gescreent. Positive Klone werden dann im Hinblick auf ihre Kreuzreaktivität anhand der Nicht-J*-Bibliothek gescreent. Klone mit dem höchsten Grad an J*-Spezifität werden für weitere Analysen wie oben in den Schritten (5) bis (8) beschrieben gewählt.
(12) Eine Überproduktion monoklonaler Antikörper, die aus Schritt (11) oben resultieren, kann zum Beispiel durch Ernten von Ascites, Kultivieren selektierter Hybridomklone oder Klonieren in einen Wirtsorganismus wie E. coli erfolgen.

Die motivspezifischen, kontextunabhängigen Antikörper, die mit diesem Verfahren hergestellt werden, können zum Identifizieren eines unbekannten Substrats eines Enzyms verwendet werden. Solche Antikörper werden zuerst gegen ein Motiv erzeugt, das von dem Enzym von Interesse erkannt wird, z.B. ein Konsensusort. Diese Antikörper werden dann zum Screenen einer Probe im Hinblick auf die Anwesenheit anderer, unbekannter Substrate verwendet, die das gleiche Motiv enthalten. Dieses Verfahren ermöglicht einen schnellen Nachweis wichtiger neuer Substrate in einer Vielfalt von Kaskaden, die konservierte Substratmotive involvieren. Antikörper, die selektiv eine große Vielfalt von Proteinen nur dann erkennen, wenn sie am MAPK- Konsensus-Phosporylierungsort phosphoryliert sind, würden zum Beispiel den Nachweis neuer MAP-Kinasetargets stark vereinfachen. MAP-Kinase könnte in Zellkultur überexprimiert werden, durch Wachstumsfaktoren aktiviert, und Targetsubstratproteine könnten durch Western-Blotting mit Antikörpern identifiziert werden, die die phosphorylierten Substratproteine selektiv erkennen (Stukenberg et al., Curr. Biol. 7:338-348 (1997)). Alternativ könnte MAPK zum Phosphorylieren von cDNA-Expressionsbibliotheken in vitro verwendet werden und MAPK-Konsensusort-Antikörper zum Identifizieren von cDNA-Klonen verwendet werden, die MAPK-phosphorylierte Substrate exprimieren (Funkunaga and Hunter, EMBO 16(8):1921-1933 (1997).
Ebenso können Antikörper, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert werden, zum Identifizieren eines Enzyms verwendet werden, das ein bekanntes Substratmotiv modifiziert. Solche Antikörper, ob für modifizierte (z.B. phosphorylierte) oder unmodifizierte (z.B. Zinkfinger) Motive spezifisch, können für den Nachweis verwendet werden, ob ein bestimmtes Enzym von Interesse ein Substrat modifiziert hat, das ein Motiv enthält. Dieses Verfahren ermöglicht einen schnellen Nachweis wichtiger neuer Proteine, die auf bekannte Klassen von Substraten einwirken, die konservierte Motive enthalten, zum Beispiel den MAPK-Konsensusort.
Die motivspezifischen, kontextunabhängigen Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch in vitro als Reagenzien in Assays mit hohem Durchsatz, wie Wirkstoff-Screening-Verfahren, verwendet werden, um die enzymatische Modifikation bestimmter Substrate nachzuweisen, die ein konserviertes Motiv enthalten. Antikörper, die für ein bestimmtes phosphoryliertes Motiv spezifisch sind, ermöglichen zum Beispiel einen schnellen Nachweis von Inhibitoren des Enzyms, das auf dieses Motiv einwirkt. Bei einem Wirkstoff-Screening-Verfahren kann ein einzelner motivspezifischer Antikörper zum Prüfen der Aktivität einer großen Auswahl von Enzymen verwendet werden, die auf viele verschiedene Sequenzmotive einwirken. Phosphotyrosinantikörper werden derzeit in Kinaseassays mit hohem Durchsatz zum Screenen nach selektiven Tyrosinkinaseinhibitoren mit hoher Affinität eingesetzt. Verbindungen oder Wirkstoffe, die Enzymaktivität blockieren, werden anhand ihrer Fähigkeit zur Hemmung der Kinaseaktivität nachgewiesen, die durch eine Reduzierung der Phosphotyrosinantikörperbindung am phosphorylierten Substrat bestimmt wird. Ähnliche Assays können zum Screenen nach pharmazeutisch nützlichen Verbindungen unter Verwendung von Antikörpern, die wie oben beschrieben produziert werden, für Phosphoserin, Phosphothreonin oder Antikörpern aufgestellt werden, die andere Proteinmodifikationen erfassen.
Der antikörpergestützte Nachweis der Proteinkinaseaktivität hat mehrere Vorteile gegenüber radioaktiven Assays zur Verwendung in automatisierten Kinaseassays mit hohem Durchsatz. Zunächst einmal sind radioaktive Assays schwer zu automatisieren, da sie den Transfer von 32-P gamma-markiertem ATP zu einem Peptidsubstrat beinhalten. Das Phosphopeptid wird dann von markiertem ATP mit Phosphocellulosefiltern und mehreren Waschschritten getrennt, und schließlich wird die Phosphorylierung durch Flüssigszintillationsverfahren quantitativ bestimmt. Zusammen sind diese Schritte zeitaufwendig und schwer zu automatisieren. Der Antikörpernachweis lässt eine große Vielfalt von ELISA-Assays zu, die zur Automatisierung und für Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz gut geeignet sind.
Zum Zweiten setzen radioaktive Assays niedrige ATP-Konzentrationen voraus, um ein hohes Maß an 32-P-Einbau für eine maximale Empfindlichkeit zu gewährleisten. Niedrige ATP-Konzentrationen im Kinaseassay lenken die Suche nach Inhibitoren in Richtung auf Verbindungen, die mit der ATP-Bindung in der katalytischen Spalte der Proteinkinase konkurrieren. Solche Screening-Verfahren bringen ständig kompetitive Inhibitoren am ATP-Bindungsort hervor, was aufgrund der hoch konservierten Beschaffenheit dieses Bindungsortes in Inhibitoren mit schlechter Selektivität resultiert.
Derzeitige Kinaseassays mit hohem Durchsatz nutzen typischerweise biotinylierte Peptidsubstrate, die auf dem Boden einer 96- oder 386-Well-Platte immobilisiert werden, woraufhin eine Inkubation zusammen mit der gewünschten Proteinkinase, ATP und einem angemessenen Kinasepuffer folgt. Die Kinaseaktivität wird mit einem fluoreszierend markierten phosphospezifischen Antikörper gemessen, der nur mit dem phosphorylierten Peptidsubstrat reagiert. Diese Assays liegen in zwei Formaten vor: homogen (ohne Waschschritte) und heterogen (mit Waschschritten). Homogene Fluoreszenzassays setzen typischerweise einen Lanthanidmarkierten Phosphoantikörper ein, der sich an ein phosphoryliertes Peptidsubstrat bindet, das mit einem Energieakzeptor, z.B. Allophycocyanin, verknüpft ist. Durch die Bindung des Phosphoantikörpers an das phosphorylierte Peptidsubstrat werden die beiden Fluorophore nahe genug zusammengebracht, um einen Fluoreszenzresonanz-Energietransfer zu ermöglichen, der die Frequenz des ausgesendeten Signals verschiebt, was auf die Anwesenheit eines biomolekularen Komplexes hinweist. Verschiedene Verbindungen werden zu den jeweiligen Wells gegeben und die Fähigkeit der Verbindung zur Inhibition der Substratphosphorylierung wird anhand der Inhibition des Fluoreszenzenergietransfers bestimmt. Dieses Format ist dem Scintillation-Proximity-Assay ähnlich, der gewöhnlich in radioaktiven Assays zur Anwendung kommt. Andere homogene Assays beinhalten Fluoreszenzpolarisation zum Messen der Bindung des Phosphoantikörpers am phosphorylierten Substrat.
Das Hauptmerkmal der homogenen Assays ist die begrenzte Zahl der Schritte und die leichte Automatisierung. Derzeit findet auch eine große Vielfalt heterogener Kinaseassays auf der Basis von ELIZA-Formaten Anwendung. Diese Assays setzen typischerweise fluoreszierend markierte Phosphoantikörper ein, die phosphorylierte Peptidsubstrate binden, die in 96- oder 386-Well-Formaten immobilisiert sind. In diesem Fall sind Waschschritte nötig, um gebundenen Antikörper von ungebundenem zu trennen. Fluoreszierend markierter Antikörper, der im Well zurückgehalten wird, wird dann unter Verwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenz nachgewiesen.
Die zum Erzeugen von Antikörpern für solche Modifikationsscreeningassays verwendeten Motive können entweder modifizierte oder unmodifizierte Substratmotive sein. Antikörper, die anhand unmodifizierter Motive erzeugt werden, binden nicht, wenn das Substrat nachfolgend durch ein Enzym modifiziert wurde. Ebenso können anhand modifizierter Motive erzeugte Antikörper Zunahmen bei modifizierten Substratkonzentrationen aufgrund enzymatischer Aktivität nachweisen.
Ähnliche Methoden können angewendet werden, um eine Vielfalt anderer enzymatischer Modifikationen zu studieren, und sind nicht auf die im Folgenden erörterten Proteinkinase- oder Acetyltransferaseaktivitäten begrenzt. Die Methode könnte zum Beispiel zum Erzeugen von Antikörpern angewendet werden, die viele andere Arten der Proteinmodifikation erkennen, inklusive, aber nicht begrenzt auf, die Zugabe von Zucker, Methylgruppen, Carboxylgruppen, die Zugabe verschiedener Lipide oder die Zugabe von Nucleotiden oder Polymeren von Nucleotiden, Nucleosiden oder Aminosäuren wie Ubiquitin.
Ebenso können solche motivspezifischen, kontextunabhängigen Antikörper im genomweiten Maßstab verwendet werden, um simultan große und unterschiedliche Proteinpopulationen zu profilieren, die konservierte Motive enthalten. Ein spezifischer Zwei- oder Drei-Aminosäuren-Bindungsort, z.B. konsekutive Argininreste, müsste (auf der Basis einer zufälligen Verteilung der Aminosäuren) jeweils alle 400 oder 8000 Reste einmal auftreten (was jeweils etwa einmal pro Protein oder einmal alle 20 Proteine entspricht (wenn man davon ausgeht, dass das durchschnittliche Protein 400 Aminosäuren umfasst)). Folglich ermöglicht ein für ein solches Motiv spezifischer Antikörper unabhängig vom Kontext, in dem es auftritt, ein schnelles Screenen einer großen Zahl von Proteinen.
Phosphorylierungsspezifische Antikörper ermöglichen eine genomweite Profilierung von Veränderungen bei der Proteinphosphorylierung infolge einer Wirkstoffbehandlung oder Überexprimierung spezifischer Gene/Proteine infolge einer solchen Behandlung. Solche Antikörper erleichtern außerdem die Profilierung der Expression spezifischer Proteine in sequenzierten Genomen.
Nehmen wir einmal an, ein Wirkstoff wird entwickelt, der die Zellzyklus-abhängige Proteinkinase cdc2 inhibiert. Der Wirkstoff inhibiert nachweislich cdk2 mit hoher Affinität, allerdings muss die Spezifität der Verbindung weiter getestet werden, um zu untersuchen, ob andere Proteinkinasen inhibiert werden, und wenn ja, welche.
Als ein früher Schritt in diesem Prozess können Zelllinien mit dem Wirkstoff behandelt werden und die Effekte auf die Gesamtzellproteinphosphorylierung mit einer Gruppe motivspezifischer und allgemeiner Phosphoantikörper überwacht werden, um die Beschaffenheit der Phospho-Substrate zu untersuchen, die durch die Verbindung oder den Leitwirkstoff inhibiert werden.
Gesamtprotein von Zellextrakten, die von Kontroll- oder wirkstoffbehandelten Zellen präpariert wurden, kann zum Beispiel mit zweidimensionalen Gelen (isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension und standardmäßige SDS-Polyacrylamid-Molekülmassenfraktionierung in der zweiten Dimension) fraktioniert, zu Nitrocellulosemembranen übertragen und durch Western-Blotting unter Verwendung von, in diesem hypothetischen Fall, Kinase-Konsensusortsspezifischen Antikörpern analysiert werden.
In diesem Fall würde eine globale Analyse der Gesamtzellproteine unter Verwendung eines cdc2 Konsensusortsspezifischen Antikörpers Informationen über die Fähigkeit des Wirkstoffs liefern, die Phosphorylierung an allen potentiellen cdc2-Ort-Substraten zu blockieren. Das Inhibitionsmuster an anderen Nicht-cdc2-Substraten (d.h. der Spezifitätsgrad) könnte auch mit Antikörpern für unterschiedliche Kinase-Konsensusorte oder mit Antikörpern für Phosphotyrosin untersucht werden, um zu bestimmen, ob der Inhibitor auch Tyrosinkinasen blockiert.
Im Hinblick auf Säugetierzellen ist die Identität der Mehrzahl der auf 2D-Gelen visualisierten Protein-„Spots” derzeit unbekannt. Da aber alle humanen Gene identifiziert und sequenziert und die entsprechenden Proteine charakterisiert und „Spots" identifiziert sind, wird die Analyse durch Proteinprofilierung gemäß der vorliegenden Erfindung noch weitaus informativer werden. Die Identität der inhibierten Proteine wird nicht nur die Wirkstoffspezifität bestätigen, sondern die Identität zusätzlicher inhibierter „unspezifischer" Proteine wird auch auf mögliche Nebenwirkungen schließen lassen. Identische Analysen können in einfacheren, vollständig sequenzierten Organismen wie Hefe durchgeführt werden, bei denen viele der Protein-„Spots” auf 2D-Gelen bereits identifiziert wurden.
BEISPIEL I
Kontextunabhängige Phosphothreoninantikörper:
Synthese von Peptidbibliothekenantigenen:
Phosphospezifische Antikörper, die mit jedem Protein reagieren, das phosporylierte Threoninreste enthält, d.h. die Phosphothreonin unabhängig von den umliegenden Aminosäuren binden, wurden durch Synthetisieren einer hoch degenerierten Peptidbibliothek XXXXXXThr*XXXXXXC erhalten, wobei X = alle 20 Aminosäuren, außer Cystein, und Thr* = Phosphothreonin ist.
Die Phosphothreoninpeptidbibliothek wurde durch standardmäßige F-Moc-Festphasenpeptidsynthese mit einem ABI Peptidsynthesizer und unter Verwendung von Gemischen jeder Aminosäure im Laufe degenerierter Kopplungsreaktionen synthetisiert. Degenerierte Peptide wurden mit einem ABI Peptidsynthesizer Modell 433A unter Anwendung von FastMoc-Chemie (Fields et al., Pept. Res. 4:95-101 (1991), hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen) in einem Maßstab von 0,085 mmol synthetisiert. Fmoc/NMP-Chemie unter Verwendung von HBTU Aminosäureaktivierung (Dourtoglou et al., Synthesis 1984:572-574 (1984), Knorr et al., Tetra. Let. 30:1927-1930 (1989), Knorr et al., in Peptides 1988 37-129 (1989), Walter de Gruter & Co, hiermit alle durch Bezugnahme eingeschlossen) wurde für alle Zyklen angewendet. Vorbeladenes Fmoc-Cys(Trt) HMP (p-Hydroxymethylphenoxymethyl)polystyrolharz, funktionalisiert bei 0,5 mmol/g, wurde für jeden degenerierten Pool von Peptiden verwendet. Peptide wurden unter Verwendung einer einzigen Kopplung im Laufe jedes Zyklus synthetisiert, obschon die Kopplungszeiten an jeder Position, die eine phosphorylierte Aminosäure beinhaltete, verlängert wurden. Die letzte Fmoc wurde während der Synthese entfernt. Durch die Verwendung von vorbeladenem HMP-Harz zusammen mit der Entfernung der letzten Fmoc-Gruppe werden Peptide hervorgebracht, die freie Amino- wie auch Carboxy-Termini nach einer Spaltung und Schutzaufhebung haben.
Zum Erzeugen einer möglichst gleichmäßigen Repräsentation jeder Aminosäure an jeder degenerierten Position wurden mehrere Runden, die aus Verändern der Aminosäurezusammensetzung, Synthetisieren und Peptidsequenzieren bestanden, durchgeführt. Die gewünschten Peptidpools mussten ein äquimolares Gemisch aus 19 Aminosäuren (alle Standardaminosäuren, außer Cys) an jedem „degenerierten" Ort enthalten. Da die Reaktivitätsrate der jeweiligen geschützten Aminosäuren unterschiedlich ist, bringt das einfache Vermischen äquimolarer Mengen (jeweils etwa 5,26 % von der Gesamtmenge) keine Population von Peptiden hervor, die an jeder Position äquimolar ist. Zum Maximieren der Degeneriertheit an jedem Rest fand die Peptidsynthese zuerst unter Verwendung äquimolarer „Gemische" an jeder Position statt. Es wurde eine Phenylthiocarbamyl-Aminosäure-Analyse durchgeführt, die eine Bewertung des relativen Aminosäuregehalts an jeder Position gestattete. Anhand der Aminosäureanalyse wurden die Molmengen der jeweiligen Aminosäuren in dem „Gemisch" so eingestellt, dass unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeiten kompensiert wurden, um eine gleichmäßige Repräsentation der jeweiligen Aminosäuren an jeder degenerierten Position zu gewährleisten. Es waren mehrere Runden der Peptidsynthese, gefolgt von einer Aminosäureanalyse notwendig, um das Aminosäuregemisch zu optimieren, woraus sich ein völlig degeneriertes Peptid ergab. Das erhaltene optimierte Aminosäuregemisch war wie folgt: G (4,6 %); A (5,6 %); V (3,3 %); L (2,5 %); I (4,25 %); S (4,4 %); T (8,4 %); F (2,25 %); Y (6,0 %); W (6,8 %); M (2,9 %); P (2,5 %); D (5,8 %); N (9,5 %); E (6,2 %); Q (9,4 %); K (6,1 %); R (6,4 %); H (3,5 %).
Eine Spaltung der degenerierten Peptide vom Harz und die Entfernung von Seitenkettenschutzgruppen finden gleichzeitig nach der Behandlung mit TFA statt. Das Spaltungsgemisch (Perkin Elmer, Emerville, CA (1995)) besteht aus Folgendem: 0,75 g Phenol, 0,125 ml Methylsulfid, 0,25 ml 1,2-Ethandithiol, 0,5 ml milliQ H20, 0,5 ml Thioanisol, 10 ml TFA. Das gesamte Gemisch wurde zu Peptidharz gegeben (etwa 300 mg). Das Harz wurde mit Stickstoff gespült und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur vorsichtig gerührt. Das Harz wurde dann filtriert und das Peptid in kaltem (0°C) Methyl-t-butylether ausfällen gelassen. Die Etherfraktion wurde zentrifugiert, so dass das Präzipitat aufgefangen werden konnte. Das Peptidpräzipitat wurde vakuumgetrocknet, durch Massenspektroskopie analysiert und durch HPLC gereinigt.
Eine Probe des Peptids wurde in Acetonitril/Wasser (50:50, v/v) gelöst und auf einem Perceptive Biosystems (Framingham, MA) MALDI-TOF Massenspektrometer mit 2,4,6-Trihydroxyacetophenon plus Ammoniumcitrat als Matrix analysiert. Wie erwartet, wies das Peptidgemisch kein homogenes Produkt auf. Die MALDI-TOF-Analyse zeigte, dass der Peptidpool degeneriert war und eine durchschnittliche Masse und die erwartete statistisch normale Peptidmassenkurve aufwies.
Peptide wurden mit einem Waters HPLC-System gereinigt, das aus einem Lambda-Max Multiwellenlängendetektor Modell 481, 500 Reihenpumpen und einem automatisierten Gradientenkontroller bestand. Eine halbpräparative Vydac C18-Säule wurde zur Umkehrphasenreinigung verwendet. Ein 60 min. linearer Gradient, 10 %–100 % B, wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute verwendet. Puffer A bestand aus 0,1 % TFA/H₂O (v/v), während Puffer B aus 0,1 % TFA/60 % CH₃CN/40 % H₂O (v/v/v) bestand. Der Nachweis fand bei 214 nm statt.
Da der Peptidpool degeneriert war (wie anhand Massenspektroskopie demonstriert), ging man nicht davon aus, dass die HPLC-Reinigung ein homogenes Produkt hervorbringt. Dieses Verfahren erreichte keine Basislinientrennung von Peptidgemischen und war lediglich als ein Rohreinigungs-/Entsalzungsschritt vorgesehen. Es wurde eine Massenspektroskopie durchgeführt und alle Fraktionen, deren Masse innerhalb des theoretischen Bereichs lag, wurden gepoolt und lyophilisiert.
Eine Aminosäuresequenzanalyse an mehreren verschiedenen Positionen entlang dem Peptid zeigte, dass eine zufällige Aminosäurerepräsentation an jeder Position vorlag und dass die Zufallsrepräsentation über die gesamte Synthese beibehalten wurde. Die Ergebnisse wiesen auf die Produktion von äußerst vielfältigen Peptidbibliotheken hin, die als geeignete Antigene dienen würden.
Produktion polyklonaler Kaninchen-Antikörper:
Alle synthetisierten Peptide enthielten C-terminale Cysteinreste, die eine Konjugation mit dem Trägerprotein (KLH) unter Verwendung des heterobifunktionellen Vernetzungsreagens m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) ermöglichten. Als Konjugationsverfahren wurde das vom Hersteller (Pierce) beschriebene angewendet, allerdings wurde die Menge des mit KLH gekoppelten Peptids auf 10 mg erhöht, um mehr Material zum Immunisieren und Bonstern der Tiere bereitzustellen. Die Maßstabsvergrößerung erforderte die Verwendung einer größeren Entsalzungssäule (Bin-Rad 10 DG (Cambridge, MA)) voraus, um überschüssigen MBS nach der Reaktion zu N- Termini und die ε-Aminogruppe von KLH Lysinresten zu entfernen.[sic]
Die Phosphothreoninpeptidbibliothek wurde kovalent mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) (250 μg) gekoppelt, in Freundschem Adjuvans emulgiert und intradermal in weibliche weiße Neuseelandkaninchen injiziert. Booster-Injektionen (200 μg) in inkomplettem Freundschen Adjuvans wurden alle zwei Wochen durchgeführt, bis eine Reaktion erhalten wurde. Kaninchenseren wurden in dreiwöchigen Abständen im Hinblick auf die Anwesenheit einer Phosphopeptid-spezifischen Immunoreaktivität durch ELISA unter Verwendung der Phosphothreonin- wie auch der Nicht-Phosphothreoninbibliotheken gescreent. Als der Titer des Antikörpers gegen Phosphopeptid 10⁵ erreichte, wurden die Kaninchen in ein Produktionsblutentnahmeprogramm aufgenommen, wobei Blut alle zwei Woche entnommen wurde. Nachdem 40 ml Serum mit hohem Titer erhalten worden waren, wurde die Reinigung von phosphospezifischen Antikörpern wie nachfolgend beschrieben eingeleitet.
Antiseren vom viel versprechendsten Kaninchen wurden über Protein A gereinigt und über eine Nichtphospho-Thr/Ser-Peptidbibliothek-Säule geleitet. Die nicht adsorbierte Fraktion (Durchfluss) wurde auf eine Phosphothreoninsäule aufgetragen, bei niedrigem pH-Wert eluiert, dialysiert und im Hinblick auf Phosphospezifität durch ELISA unter Verwendung von Phospho- und Nicht-Phosphopeptiden getestet. Auf diese Weise affinitätsgereinigte Antikörper erkannten die phosphorylierte Threoninpeptidbibliothek, reagierten aber nicht mit der Nicht-Phosphothreonin/Serin-Bibliothek, was auf einen hohen Grad an Spezifität für Phosphothreonin hinwies (siehe 1a). Die ELISA-Ergebnisse zeigten auch, dass die Antikörper auch spezifisch mit einem Gemisch aus 18 verschiedenen Phosphothreoninpeptiden reagierten, jedoch keine Reaktivität mit irgendeinem der entsprechenden Nicht-Phosphopeptiden aufwiesen (1b). Die Antikörper wiesen außerdem eine strikte Präferenz für Phosphothreonin auf und zeigten keine Reaktivität mit einem Gemisch aus 38 verschiedenen Phosphoserinpeptiden (1b) oder Peptiden, die Phosphotyrosin enthielten.
Als nächstes testeten wir die Antikörper durch Western-Blotting unter Verwendung von Zellextrakten, die von Zellen mit und ohne Behandlung mit dem Proteinphosphataseinhibitor Okadaic-Säure hergestellt wurden. Wie in 1c zu sehen ist, reagieren die Phosphothreoninantikörper mit einer relativ kleinen Zahl von Proteinen von Kontrollextrakten, reagieren jedoch mit einer sehr großen Zahl nach der Behandlung mit Okadaic-Säure (siehe den Ausstrich von reaktiven Proteinen mit hoher relativer Molekülmasse in 1c, Bahn 2). Die Antikörper reagierten außerdem mit den aktiven Formen von MAPK (ERK1) und MKK3 nur dann spezifisch, wenn sie an Threoninresten an ihren jeweiligen Aktivierungsschleifen phosphoryliert waren. Die Antikörper zeigten keine Reaktivität mit den inaktiven nichtphosphorylierten Versionen dieser Proteine (1c, Bahnen 3-6). Diese Ergebnisse demonstrieren einen hohen Grad an Phosphothreoninspezifität und lassen auf eine breite Kreuzreaktivität mit vielen verschiedenen threoninphosphorylierten Proteinen und Peptiden schließen.
Für eine sorgfältigere Untersuchung des Grads an Kontextunabhängigkeit wurde eine ELISA-Analyse anhand individueller threoninphosphorylierter Peptide durchgeführt, die im vorherigen Experiment vermischt waren. Wie 1a zeigt, reagiert der Phosphothreoninantikörper gut mit allen Phosphopeptiden, mit Ausnahme von solchen, bei denen unmittelbar hinter Phosphothreonin Prolin folgt, z.B. die c-Myc und APP1 Phosphopeptide (2b). Diese Ergebnisse zeigen, dass gereinigte Kaninchenantikörper in einer phosphospezifischen Weise mit einer großen Vielfalt von Phosphothreonin reagierten, jedoch mit Phosphopeptiden, bei denen Prolin dem phosphorylierten Threonin folgt, nur schlecht reagierten.
Die Kontextabhängigkeit der Phosphothreoninantikörpererkennung wurde weiter mit einem immobilisierten Raster von Phosphopeptidbibliotheken untersucht. Jede unterschiedliche Bibliothek wird so synthetisiert, dass sie zusätzlich zu einem fixierten Phosphothreonin eine zusätzliche fixierte Aminosäure an den Positionen –4, –3, –2, –1, +1, +2, +3 relativ zu Phosphothreonin enthielt, wobei jedoch alle anderen Positionen alle 20 Aminosäuren, außer Cystein, enthielten. Die jeweiligen Peptidbibliotheken wurden auf den Boden eines ELISA-Wells gestrichen und den Phosphothreoninantikörpern ausgesetzt. Antikörper, die nicht mit einem speziellen Spot (Peptidbibliothek) auf dem Gitter reagieren, binden nicht, wenn die spezifizierte Aminosäure an der spezifizierten Position vorliegt. Anhand dieser Analyse wird bestimmt, ob eine spezielle Aminosäure an einer speziellen Position relativ zu Phosphothreonin die Bindung zulässt/blockiert oder nicht (1d).
Die Ergebnisse bestätigten, dass die Phosphothreoninantikörper alle Aminosäuren in den Positionen –1, –2, –3, –4 und +2, +3 tolerierten und sich gleichermaßen gut an jede Aminosäure, außer Prolin an der +1 Position, banden (siehe 1d, erste Reihe). Die anhand dieses Bindungsprofils definierte Reaktivität zeigt, dass die Antikörper alle Phosphothreonin-haltigen Sequenzen binden, mit Ausnahme von solchen, denen unmittelbar in der –1 Position Prolin folgt. Weitere Analysen unter Verwendung einer Vielfalt spezifischer Phosphothreonin-haltiger Peptide bestätigten diese Ergebnisse.
Phosphothreonin-spezifische Antikörper von verschiedenen anderen Kaninchen, die mit den gleichen Peptidbibliothekantigenen immunisiert wurden, wurden weiter gereinigt und charakterisiert. Antikörper, die von Seren gereinigt wurden, die von zwei anderen Kaninchen erhalten wurden, produzierten ebenfalls allgemein kreuzreagierende Phosphothreoninantikörper, wie anhand ELISA bestimmt. Ein Kaninchen produzierte Antikörper, die gleichermaßen gut mit Peptiden reagierten, die Prolin nach dem Phosphothreonin enthielten. Insgesamt demonstrieren diese Ergebnisse die allgemeine Kontextunabhängigkeit der Phosphothreoninreaktion, die erhalten wird, wenn kombinatorische Peptidbibliotheken als Immunogene verwendet werden.
BEISPIEL II
Proteinkinase-Konsensus-ortsspezifische Phosphoantikörper:
MAPK-Konsensus-Erkennungsorte: PXS*P
Eine Peptidbibliothek des bevorzugten Orts für MAPK-Phosphorylierung, PXS*P, wurde im Wesentlichen wie im Beispiel I beschrieben synthetisiert (2a). Zusätzlich zu einem äquimolaren Gemisch aus Phosphoserin und Threonin wurden auch Aminosäuren an zwei anderen Positionen fixiert: Prolin an –2 und Prolin an +1. Diese Bibliothek wurde mit KLH gekoppelt und in Kaninchen wie für Phosphothreonin beschrieben injiziert. IgG von dem viel versprechendsten Kaninchen wurde Protein-A-gereinigt und über eine Nicht-Phospho-Thr/Ser-Peptidbibliothek-Säule geleitet. Die nicht adsorbierte Fraktion (Durchfluss) wurde auf eine Phospho-PXS*P-Säule aufgetragen, bei niedrigem pH-Wert eluiert, dialysiert und im Hinblick auf Phosphospezifität durch ELISA unter Verwendung von Phospho- und Nicht-Phosphopeptiden getestet.
Auf diese Weise affinitätsgereinigte Antikörper reagierten stark mit der phoshorylierten PXS*P-Peptidbibliothek, reagierten aber nicht mit der Nicht-Phosphothreonin/Serin-Bibliothek (siehe 2a). ELISA-Ergebnisse zeigten außerdem, dass die Antikörper auch spezifisch mit einem Gemisch aus 18 verschiedenen Phosphothreoninpeptiden reagierten, aber keine Reaktivität mit irgendeinem der entsprechenden Nicht-Phosphopeptide aufwiesen (2a). Abgesehen davon, dass sie phosphospezifisch waren, wiesen die Antikörper eine Präferenz für Prolin an den Positionen –2 und +1 auf und zeigten keine Reaktivität mit phosphorylierten Peptiden, die kein Prolin an dieser Position hatten (2a). Die Antikörper reagierten stark mit den RB und cdk4 Phosphopeptiden, zeigten aber keine Reaktivität mit den MKK3, PKCalpha oder p70S6 Phosphopeptiden, denen Prolin an der +1 Position fehlte (2a). Diese Antikörper reagieren mit einigen Peptiden, denen Prolin an –2 fehlt, z.B. das cdk4 Phosphopeptid, was darauf schließen lässt, dass Prolin an dieser Position nicht absolut notwendig ist.
PXS*P Antikörper wurden weiter durch Western-Blotting unter Verwendung von Zellextrakten getestet, die von Zellen mit und ohne Behandlung mit dem Proteinphosphataseinhibitor Okadaic-Säure hergestellt wurden. Die Bindung der PXS*P Antikörper an Zellextrakten von RS 4;11 Zellen wurde nach einer Behandlung mit Okadaic-Säure stark erhöht (Ausstrich von Proteinen mit hoher relativer Molekülmasse in 2b, Bahn 2). Die Antikörper reagierten auch spezifisch mit ATF-2, phosphoryliert in vitro mit MAP-Kinase, aber nicht mit der nichtphosphorylierten Form dieses Proteins (2b, Bahnen 3 und 4), was einen hohen Grad an Phosphospezifität und allgemeiner Kreuzreaktivität mit vielen verschiedenen phosphorylierten Proteinen und Peptiden demonstriert.
Die Spezifität der PXS*P Antikörpererkennung wurde auch mit einem immobilisierten Raster von Phosphopeptidbibliotheken untersucht. Wie oben beschrieben, wurde jede unterschiedliche Bibliothek so synthetisiert, dass sie zusätzlich zu einem fixierten Phosphothreonin oder Phosphoserin eine zusätzliche fixierte Aminosäure an den Positionen –1, +1, +2 relativ zu Phosphothreonin enthielt, wobei jedoch alle anderen Positionen alle 20 Aminosäuren, außer Cystein, enthielten.
Der PXS*P-Antikörper reagierte schwach mit Peptidbibliotheken, in denen Prolin an der –1 Position fixiert war, und reagierte stark mit Bibliotheken, in denen Prolin sowohl an der Position –2 als auch +1 fixiert war. Die durch dieses Bindungsprofil definierte Reaktivität zeigt, dass die PXS*P-Antikörper wie erwartet nur Sequenzen stark binden, die das PXS*P-Motiv enthalten, dass aber die Antiseren noch immer eine gewisse Restaktivität mit S*P (infolge von Unreinheiten) aufweisen, die durch eine weitere Reinigung mit immobilisierter S*P-Peptidbibliothek entfernt werden könnte.
BEISPIEL III
Proteinkinase-Konsensus-ortsspezifische Phosphoantikörper:
14-3-3 Bindungsort: RSXS*XP
Antikörper, die 14-3-3 Targets identifizieren, wurden durch Synthetisieren der Peptidbibliothek XXXXRSXS*XPXXXXC erhalten, wobei S* Phosphoserin ist und X eine beliebige Aminosäure repräsentiert und C Cystein ist. Die obige 14-3-3 Phosphopeptidbibliothek wurde durch standardmäßige F-Moc-Festphasenpeptidsynthese mit einem ABI Peptidsynthesizer und Gemischen von jeder Aminosäure, außer Cystein, im Laufe degenerierter Kopplungsreaktionen wie im Beispiel I erörtert synthetisiert.
Die 14-3-3 Phosphopeptidbibliothek wurde mit KLH gekoppelt und in Kaninchen wie oben für Phosphothreonin und PXS*P beschrieben injiziert. Antiseren vom vielversprechendsten Kaninchen wurden über Protein A gereinigt und an einer Nicht-Phospho-14-3-3-Peptidbibliothek-Säule adsorbiert. Der Durchfluss dieser Säule wurde auf eine Phospho-14-3-3-Säule aufgetragen, bei niedrigem pH-Wert eluiert, dialysiert und im Hinblick auf Phosphospezifität durch ELISA unter Verwendung von Phospho- und Nicht-Phospho-14-3-3-Peptidbibliotheken getestet. Diese affinitätsgereinigten Phospho-14-3-3-Antikörper erkannten die phosphorylierte 14-3-3-Peptidbibliothek, aber nicht die Nicht-Phospho-14-3-3-Bibliothek, was auf einen hohen Grad an Spezifität für Phospho-14-3-3 hindeutete (siehe 3a). Die Antikörper reagierten auch stark mit mehreren verschiedenen Peptiden, die das 14-3-3 Motiv enthielten, wie: phospho-Bad-Ser136, cdc25-Ser216, und schwächer mit phospho-Bad-Ser112, das ein leicht abweichendes Motiv enthielt. Die Antikörper wiesen keine Reaktivität mit den entsprechenden Nicht-Phosphopeptiden (3a) oder mit vielen anderen Phosphopeptiden auf, die das Motiv nicht enthielten.
Phospho-14-3-3-Antikörper wurden weiter durch Western-Blotting unter Verwendung von Zellextrakten getestet, die von Zellen hergestellt wurden, die mit einem GST-Bad Fusionsprotein transfiziert und mit dem und ohne den Phorbolester TPA behandelt wurden. Die Antikörper reagierten mit einer geringen Zahl von Proteinen von Kontrollextrakten (siehe 3b). Bad wurde in Extrakten nachgewiesen, die von transfizierten Zellen, aber nicht von Kontrollzellen hergestellt wurden. Da das Grundniveau der Bad-Phosphorylierung hoch ist, war eine erhöhte Phosphorylierung mit TPA schwer erkennbar, obschon TPA die Phosphorylierung verschiedener Proteine mit höherer relativer Molekülmasse induzierte (Pfeil in 3b). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Phospho-14-3-3-Antikörper phosporylierte Bad- und andere TPA-stimulierte Phosphoproteine nachweisen können.
Außerdem wurde eine ELISA-Analyse anhand des zuvor beschriebenen Gitters von serin/threoninphosphorylierten Peptidbibliotheken durchgeführt. Wie erwartet, haben die Phospho-14-3-3-Antikörper einen absoluten Bedarf an Prolin an der +2 Position.
BEISPIEL IV
Produktion monoklonaler Mausantikörper: CDK-Konsensus- Phosphorylierungsort PXT*PXR:
Die PXT*/S*PXR-Sequenz stellt einen Konsensus-Phosphorylierungsort für viele der Zellzyklus-abhängigen Proteinkinasen (cdks) dar. Antikörper, die dieses phosphorylierte Motiv erkennen, wären zur Identifizierung neuer cdk-Substrate nützlich, die zur Steuerung des Zellzyklusfortschritts wichtig sind. Die in 4a dargestellte PXT*/S*PXR-Peptidbibliothek wurde mit KLH gekoppelt und in BALB/c-Mäuse injiziert. In Freundschem Adjuvans emulgiertes Phosphopeptid-KLH-Konjugat (50 μg) wurde ip injiziert. Booster-Injektionen (12,5 bis 25 μg) in inkomplettem Freundschen Adjuvans wurden alle drei Wochen durchgeführt, bis eine Reaktion erhalten wurde. Der Antikörpertiter wurde durch ELISA anhand der immunisierten Phosphopeptidbibliothek gemessen. Seren von Mäusen, die hohe Titerreaktionen aufwiesen, wurden mit immobilisiertem Nicht-Phospho-Thr/Ser-Peptid adsorbiert und die nicht adsorbierte Fraktion wurde durch Western-Blotting getestet (Daten nicht dargestellt).
Splenozyten von einer Maus mit phosphospezifischen Reaktionen wurden mit Myelom-X63Ag8.635-Zellen verschmolzen (Kearney et al., J. Immunol. 123:1548-1550 (1979)) und etwa 1100 Hybridomklone wurden selektiert und gescreent.
Supernatanten von individuellen Klonen wurden zuerst im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Bindung der immunisierten Phosphopeptidbibliothek und dann im Hinblick auf ihre Kreuzreaktivität gegen die Nicht-Phosphopeptidbibliothek gescreent. Zwei verschiedene Klone mit dem höchsten Grad an Phospo-Spezifität wurden zur weiteren Analyse ausgewählt. Die Spezifität der Klone 6B8 und 5A9 wurde weiter mit den Phosphopeptidbibliotheken und Phosphopeptiden aus 4a charakterisiert. Beide Klone reagierten spezifisch mit Phosphothreonin-haltigen Bibliotheken und individuellen Peptiden, reagierten aber nicht wesentlich mit Phosphoserin-haltigen Peptiden, was ein Hinweis darauf war, dass phosphothreoninselektive Klone identifiziert worden waren. Beide Klone reagierten stark mit Peptidbibliotheken, in denen Prolin in den Positionen –2 und +1 relativ zu Phosphothreonin fixiert war. Die Reaktivität gegen T*P- und PXT*P-Bibliotheken weist auf keine abgeschwächte Spezifität hin, da eines von 400 und eines von 20 Peptiden in den jeweiligen Bibliotheken die angemessenen Aminosäuren an den fixierten Positionen hat. Beide Klone reagierten stark mit einem einzelnen RB-Phosphothreoninpeptid, das jede der fixierten Positionen enthielt, die in der immunisierten Bibliothek vorlagen, reagierten aber nicht wesentlich mit dem entsprechenden Nicht-Phosphopeptid.
Die Western-Analyse zeigt, dass die Behandlung kultivierter Zellen mit Okadaic-Säure die Reaktivität mit den beiden Klonen 6B8 und 5A9 drastisch erhöht (4b). Es wurde außerdem gezeigt, dass der Klon 6B8 cdc2-phosphoryliertes RB durch Western-Blotting nachweist ( 4b), aber nicht mit nichtphosphoryliertem RB-Protein reagiert. Klon 5A9 wurde im Rahmen der Bedingungen des Budapester Vertrags am 4. September 1998 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung mit der ATCC Akzessionsnummer HB-12563 hinterlegt.
BEISPIEL V
Acetylierte lysinspezifische Antikörper:
Antikörper, die spezifisch gegen acetyliertes Lysin reaktiv, aber gegen nichtacetyliertes Lysin nicht reaktiv sind, wurden durch Synthetisieren der folgenden acetylierten Lysinpeptidbibliothek erhalten: XXXXXXK*XXXXXXC, wobei K* acetyliert ist und X jede beliebige Aminosäure, außer Cystein, repräsentiert und C Cystein ist. Die acetylierte Lysinpeptidbibliothek wurde wie zuvor beschrieben durch standardmäßige F-Moc-Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von handelsüblichem voll geschütztem, acetyliertem Lysin synthetisiert.
Die Peptidbibliothek wurde mit KLH gekoppelt und in Kaninchen injiziert. Das K*-Peptid-KLH-Konjugat (250 μg) wurde als Immunogen wie für die anderen Phosphopeptidbibliotheken beschrieben verwendet. Antiseren von dem vielversprechendsten Kaninchen wurden über Protein A gereinigt und an einer nichtacetylierten Lysinpeptidbibliothek-Säule adsorbiert. Der Durchfluss dieser Säule wurde auf eine acetylierte Lysinsäule aufgetragen, bei niedrigem pH-Wert eluiert, dialysiert und im Hinblick auf Phosphospezifität durch ELISA getestet.
Acetylierte Lysinantikörper, die wie oben beschrieben affinitätsgereinigt wurden, erkannten die acetylierte Lysinpeptidbibliothek, aber nicht die nichtacetylierte Bibliothek, was auf einen hohen Grad an Spezifität für acetyliertes Lysin hindeutete, wie anhand ELISA gemessen. Die Antikörper reagierten außerdem spezifisch mit nur 0,5 ng acetyliertem Rinderserumalbumin (BSA), zeigten jedoch keine Reaktivität mit bis zu 10 μg von nichtacetyliertem BSA (siehe 5a).
Die Antikörper wurden weiter durch Western-Blotting unter Verwendung von Zellextrakten untersucht, die von Zellen mit und ohne Behandlung mit Anisomycin hergestellt wurden. Die Antikörper reagierten mit einer Anzahl verschiedener Proteine, die in den C6-Zellextrakten anwesend waren (5b). In den Feldern b und c wurden die 5 Antikörper mit 1 μg einer nichtacetylierten Peptidbibliothek (5b) oder 1 μg einer acetylierten Peptidbibliothek (5c) vorinkubiert. Eine Vorinkubation mit einer nichtacetylierten Peptidbibliothek hatte einen geringen Effekt auf die Antikörperreaktivität mit acetyliertem Kontrollprotein oder in dem Zellextrakt visualisierte Banden (5c, Bahnen 5-8). Allerdings wurde durch eine Vorinkubation der Antikörper mit der acetylierten Lysinpeptidbibliothek die Antikörperbindung an acetyliertem Kontroll-BSA sowie die Bindung an viele Proteine, die in dem Zellextrakt vorlagen, vollständig blockiert (5d, Bahnen 9-12). Diese Ergebnisse demonstrieren einen hohen Grad an Spezifität für acetyliertes Lysin und zeigen, dass die Antikörper ein breites Spektrum unterschiedlich großer Proteine, die acetyliertes Lysin enthalten, in einer Vielfalt umliegender Sequenzkontexte erkennen (vergleiche 5c und d, Bahnen 1, 2). SEQUENZAUFLISTUNG
QUELLENANGABEN IN DER BESCHREIBUNG
Die von der Anmelderin angeführten Quellen werden lediglich zur Information gegeben. Sie stellen keinen Bestandteil des europäischen Patentdokuments dar. Obschon größte Sorgfalt bei der Zusammenstellung der Quellenangaben angewendet wurde, können Fehler oder Auslassungen nicht ausgeschlossen werden. Die EPO übernimmt diesbezüglich keine Haftung.
In der Beschreibung werden die folgenden Patentdokumente genannt:

• WO 9518823 A [0012]

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Claims

Verfahren zur Herstellung eines motivspezifischen Antikörpers, der spezifisch ein Motiv bindet, das in einer Mehrzahl verschiedener Peptide oder Proteine im Kontext einer variablen Peptidsequenz auftritt, die das Motiv umgibt, wobei das genannte Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet: (a) Konstruieren einer degenerierten Peptidbibliothek, die (i) ein fixiertes Motiv, das wenigstens eine modifizierte Aminosäure beinhaltet, und (ii) eine Mehrzahl degenerierter Aminosäuren umfasst, die das genannte fixierte Motiv umgeben; (b) Immunisieren eines Wirts mit der genannten Peptidbibliothek; und (c) Isolieren von Antiseren von dem genannten Wirt und Reinigen des genannten motivspezifischen, kontextunabhängigen Antikörpers von den genannten Antiseren; wobei der genannte Antikörper das genannte Motiv in einer Mehrzahl verschiedener Peptide oder Proteine, in denen es auftritt, spezifisch bindet.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner den Schritt der Verwendung von Milzzellen von dem Wirt aus Schritt (b) beinhaltet, um wenigstens einen monoklonalen, motivspezifischen Antikörper zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte fixierte Motiv ein phosphoryliertes Kinase-Konsensus-Motiv ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte fixierte Motiv aus einem einzelnen phosphorylierten Rest, einer acetylierten Aminosäure oder einer einzelnen modifizierten Aminosäure besteht.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das genannte fixierte Motiv ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem MAPK-Konsensus-Erkennungsort, einem 14-3-3 Bindungsort und einem CDK-Konsensus-Erkennungsort.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte modifizierte Aminosäure eine phosphorylierte Aminosäure oder eine acetylierte Aminosäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte Peptidbibliothek eine Länge von etwa 6 bis 14 Aminosäuren hat.
Motivspezifischer Antikörper, der ein phosphoryliertes Kinase-Konsensus-Motiv im Kontext einer variablen Peptidsequenz spezifisch bindet, die das Motiv umgibt, wobei der genannte Antikörper das genannte Motiv in einer Mehrzahl verschiedener Peptide oder Proteine, in denen es auftritt, spezifisch bindet.
Motivspezifischer Antikörper nach Anspruch 8, wobei das genannte Motiv ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem MAPK-Konsensus-Ort, einem 14-3-3 Bindungsort und einem CDK-Konsensus-Erkennungsort.
Antikörper, der selektiv eine einzelne modifizierte Aminosäure unabhängig von der umgebenden Aminosäure-, Peptid- oder Proteinsequenz bindet, wobei die genannte einzelne modifizierte Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem acetylierten Rest und einem methylierten Rest.
Verwendung eines motivspezifischen Antikörpers, der anhand eines modifizierten Motivs erzeugt wird, um ein unbekanntes Substrat eines Enzyms zu identifizieren, das das Motiv erkennt und modifiziert, wobei der Antikörper das modifizierte Motiv im Kontext einer variablen Peptidsequenz bindet, die das modifizierte Motiv umgibt.
Verwendung eines motivspezifischen Antikörpers als ein Reagens für den Nachweis enzymatischer Modifikation eines Motivs innerhalb eines Substrats, wobei der Antikörper das modifizierte Motiv im Kontext einer variablen Peptidsequenz bindet, die das modifizierte Motiv umgibt.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei das genannte Enzym eine Kinase ist.
Hybridomklon entsprechend Klon 5A9 mit der ATCC Akzessionsnummer HB-12563.
Antikörper, der von dem Hybridomklon aus Anspruch 14 erhältlich ist.