JPH05244987A - 抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法及び抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents
抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法及び抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマInfo
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- JPH05244987A JPH05244987A JP4078986A JP7898692A JPH05244987A JP H05244987 A JPH05244987 A JP H05244987A JP 4078986 A JP4078986 A JP 4078986A JP 7898692 A JP7898692 A JP 7898692A JP H05244987 A JPH05244987 A JP H05244987A
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 簡便，かつ短時間に硫酸化チロシンを定量す
るための抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法及び抗硫
酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを提供する。 【構成】 遊離の硫酸化チロシン又はペプチド鎖中の硫
酸化チロシンと結合し，かつ硫酸化されていないチロシ
ンとは結合しない抗硫酸化チロシン抗体。
るための抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法及び抗硫
酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを提供する。 【構成】 遊離の硫酸化チロシン又はペプチド鎖中の硫
酸化チロシンと結合し，かつ硫酸化されていないチロシ
ンとは結合しない抗硫酸化チロシン抗体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，硫酸化チロシンの免疫
学的測定に有用な抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法
及び抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマに関するものである。
学的測定に有用な抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法
及び抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生体中の多くのタンパク質が３’−フォ
スフォアデノシン５’−フォスフォサルフェイト（以
下，ＰＡＰＳと言う。）を硫酸基供与体として，下式の
ように硫酸基転移酵素により翻訳後に修飾を受ける。
スフォアデノシン５’−フォスフォサルフェイト（以
下，ＰＡＰＳと言う。）を硫酸基供与体として，下式の
ように硫酸基転移酵素により翻訳後に修飾を受ける。
【０００３】タンパク質（チロシン）＋ＰＡＰＳ→硫酸
化タンパク質（チロシン）＋ＰＡＰ （注）ＰＡＰ：３’−フォスフォアデノシン５’−フォ
スフェイト
化タンパク質（チロシン）＋ＰＡＰ （注）ＰＡＰ：３’−フォスフォアデノシン５’−フォ
スフェイト
【０００４】この硫酸化は，タンパク質のチロシン残基
で行われ，各種タンパク質の生理活性の調節，機能の多
様化，分解に対する安定性の変化などの役割が報告され
ている。
で行われ，各種タンパク質の生理活性の調節，機能の多
様化，分解に対する安定性の変化などの役割が報告され
ている。
【０００５】例えば，硫酸化ファイブロネクチンがマウ
ス黒色種の転移を抑制することが報告されている（サイ
エンス，２２６巻，９８２〜９８２頁）。その他，補
体，アルファフェトプロテイン，エンタクチン，サイロ
グロブリン，コラーゲンＶ，アルファ−２−アンチプラ
スミン，ヒルジン，ロイシンエンケファリン，ガストリ
ンなど多くのタンパク質中に硫酸化チロシン残基が存在
し，種々の生理活性調節を行っていると考えられてい
る。
ス黒色種の転移を抑制することが報告されている（サイ
エンス，２２６巻，９８２〜９８２頁）。その他，補
体，アルファフェトプロテイン，エンタクチン，サイロ
グロブリン，コラーゲンＶ，アルファ−２−アンチプラ
スミン，ヒルジン，ロイシンエンケファリン，ガストリ
ンなど多くのタンパク質中に硫酸化チロシン残基が存在
し，種々の生理活性調節を行っていると考えられてい
る。
【０００６】また，ＰＡＰＳは，そのチロシンへの硫酸
基供与体として注目され，医薬への応用も考えられてい
る。例えば，リュウらは癌化した細胞中のタンパク質の
硫酸化チロシン含量を測定し，正常細胞に比較して硫酸
化チロシン含量が激減していることを報告（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，３６９
５頁，１９８７年）しており，水光らはそれが，癌化し
た細胞ではＰＡＰＳの生成が抑制されるためであること
を解明した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４７巻，２１０
頁，１９８７年）。これらのＰＡＰＳや硫酸化チロシン
の研究開発を促進し，医薬への応用を図るためには硫酸
化チロシン残基を正確で簡便に測定する必要がある。
基供与体として注目され，医薬への応用も考えられてい
る。例えば，リュウらは癌化した細胞中のタンパク質の
硫酸化チロシン含量を測定し，正常細胞に比較して硫酸
化チロシン含量が激減していることを報告（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，３６９
５頁，１９８７年）しており，水光らはそれが，癌化し
た細胞ではＰＡＰＳの生成が抑制されるためであること
を解明した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４７巻，２１０
頁，１９８７年）。これらのＰＡＰＳや硫酸化チロシン
の研究開発を促進し，医薬への応用を図るためには硫酸
化チロシン残基を正確で簡便に測定する必要がある。
【０００７】その測定法としては，現在は放射性同位元
素を用いる方法，また，高速液体クロマトグラフィー
（以下，ＨＰＬＣと言う。）を用いる方法がある。前者
の放射性同位元素を用いる方法は［35Ｓ］硫酸化チロシ
ンを細胞に取り込ませ，［35Ｓ］硫酸が取り込まれたタ
ンパク質を加水分解し，薄層クロマトグラフィーなどで
分離後，その放射活性を測定して定量する方法である。
また，後者のＨＰＬＣを用いる方法はサンプル中のタン
パク質を加水分解してＨＰＬＣのカラムで分析する。
素を用いる方法，また，高速液体クロマトグラフィー
（以下，ＨＰＬＣと言う。）を用いる方法がある。前者
の放射性同位元素を用いる方法は［35Ｓ］硫酸化チロシ
ンを細胞に取り込ませ，［35Ｓ］硫酸が取り込まれたタ
ンパク質を加水分解し，薄層クロマトグラフィーなどで
分離後，その放射活性を測定して定量する方法である。
また，後者のＨＰＬＣを用いる方法はサンプル中のタン
パク質を加水分解してＨＰＬＣのカラムで分析する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかし，これらの方法
は加水分解が必要であり，煩雑で時間を要する。また，
放射性同位元素を用いる方法はその使用方法が限定さ
れ，ＨＰＬＣを用いる方法は感度的にも微量測定には不
適当という問題があった。本発明は，簡便，かつ短時間
に硫酸化チロシンを定量するための抗硫酸化チロシン抗
体，その製造方法及び抗硫酸化チロシンモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的と
するものである。
は加水分解が必要であり，煩雑で時間を要する。また，
放射性同位元素を用いる方法はその使用方法が限定さ
れ，ＨＰＬＣを用いる方法は感度的にも微量測定には不
適当という問題があった。本発明は，簡便，かつ短時間
に硫酸化チロシンを定量するための抗硫酸化チロシン抗
体，その製造方法及び抗硫酸化チロシンモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的と
するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は，このような
課題を解決するために鋭意研究の結果，硫酸化チロシン
の免疫測定法を可能にする抗硫酸化チロシン抗体を見出
し，本発明に到達したものである。
課題を解決するために鋭意研究の結果，硫酸化チロシン
の免疫測定法を可能にする抗硫酸化チロシン抗体を見出
し，本発明に到達したものである。
【００１０】すなわち，第一の発明は，遊離の硫酸化チ
ロシン又はペプチド鎖中の硫酸化チロシンと結合し，か
つ硫酸化されていないチロシンとは結合しないことを特
徴とする抗硫酸化チロシン抗体を要旨とするものであ
る。次に，第二の発明は，哺乳動物を硫酸化チロシン又
はそのタンパク質複合体で免疫して血清を得，得られた
血清をチロシン固定化担体で吸着操作を行うことを特徴
とする上記の抗硫酸化チロシン抗体の製造方法を要旨と
するものである。さらに，第三の発明は，遊離の硫酸化
チロシン又はペプチド鎖中の硫酸化チロシンと結合し，
かつ硫酸化されていないチロシンとは結合しないモノク
ローナル抗体を要旨とするものである。また，第四の発
明は，上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを，第五の発明は，このハイブリドーマを培養し，
その培養物から上記のモノクローナル抗体を採取するこ
とを特徴とする上記のモノクローナル抗体の製造方法を
要旨とするものである。
ロシン又はペプチド鎖中の硫酸化チロシンと結合し，か
つ硫酸化されていないチロシンとは結合しないことを特
徴とする抗硫酸化チロシン抗体を要旨とするものであ
る。次に，第二の発明は，哺乳動物を硫酸化チロシン又
はそのタンパク質複合体で免疫して血清を得，得られた
血清をチロシン固定化担体で吸着操作を行うことを特徴
とする上記の抗硫酸化チロシン抗体の製造方法を要旨と
するものである。さらに，第三の発明は，遊離の硫酸化
チロシン又はペプチド鎖中の硫酸化チロシンと結合し，
かつ硫酸化されていないチロシンとは結合しないモノク
ローナル抗体を要旨とするものである。また，第四の発
明は，上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを，第五の発明は，このハイブリドーマを培養し，
その培養物から上記のモノクローナル抗体を採取するこ
とを特徴とする上記のモノクローナル抗体の製造方法を
要旨とするものである。
【００１１】以下，本発明を詳細に説明する。本発明の
抗体は，ポリクローナル，モノクローナル抗体のいずれ
であってもよく，望ましくはモノクローナル抗体であ
る。また，ＩｇＧ，ＩｇＭなどのどのクラス，サブクラ
スの抗体でも用いることができるが，望ましくはＩｇＧ
が用いられる。本発明の抗体の反応特異性を以下に示
す。 （１）抗原抗体反応により，遊離の硫酸化チロシン又は
ペプチド鎖中の硫酸化チロシンと結合する。 （２）遊離の硫酸化されていないチロシン又はペプチド
鎖中の硫酸化されていないチロシンとは実質的には結合
しない。 （３）抗体の分子量など，理科学的性質は一般に知られ
ている性質〔例えば「医科免疫学」（改訂第３版）１９
９０年（医学書院）に記載〕と同様である。
抗体は，ポリクローナル，モノクローナル抗体のいずれ
であってもよく，望ましくはモノクローナル抗体であ
る。また，ＩｇＧ，ＩｇＭなどのどのクラス，サブクラ
スの抗体でも用いることができるが，望ましくはＩｇＧ
が用いられる。本発明の抗体の反応特異性を以下に示
す。 （１）抗原抗体反応により，遊離の硫酸化チロシン又は
ペプチド鎖中の硫酸化チロシンと結合する。 （２）遊離の硫酸化されていないチロシン又はペプチド
鎖中の硫酸化されていないチロシンとは実質的には結合
しない。 （３）抗体の分子量など，理科学的性質は一般に知られ
ている性質〔例えば「医科免疫学」（改訂第３版）１９
９０年（医学書院）に記載〕と同様である。
【００１２】このような性質のポリクローナル抗体を得
るには，例えば以下の方法で行えばよい。まず硫酸化チ
ロシンをハプテンとして，カブトガニヘモシアニン（以
下，ＫＬＨと略す。），牛血清アルブミン（以下，ＢＳ
Ａと略す。）などのキャリアタンパク質をカルボジイミ
ド法などで結合したもの，又はペプチド鎖中のチロシン
が硫酸化されたタンパク質（フィブリノーゲン，フィブ
ロネクチンなど）を抗原としてウサギ，ヒツジ，ヤギマ
ウス，ラット，ウマ等の哺乳動物に免疫する。このと
き，フロイントの完全アジュバント（以下，ＦＣＡと略
す。）などの免疫増強剤を用いると効果的である。さら
に，１〜８週間後に，望ましくは２〜４週間後に同じ抗
原で追加免疫する。このとき，フロイントの不完全アジ
ュバント（以下，ＦＩＡと略す。）などの免疫増強剤を
用いると効果的である。さらに硫酸化チロシンを用いて
最終免疫を行う。最終免疫から１〜１４日後，望ましく
は３〜７日後に免疫した動物から血清を採取する。この
血清を，例えば，硫酸化チロシンを固定化した担体（例
えば，セファロースなど）を充填したカラムに吸着さ
せ，溶出後チロシンを固定化した担体（例えば，セファ
ロースなど）を充填したカラムを通過させ，チロシンに
も結合する抗体を除去することにより，硫酸化チロシン
に特異的に結合する抗体を得ることができる。
るには，例えば以下の方法で行えばよい。まず硫酸化チ
ロシンをハプテンとして，カブトガニヘモシアニン（以
下，ＫＬＨと略す。），牛血清アルブミン（以下，ＢＳ
Ａと略す。）などのキャリアタンパク質をカルボジイミ
ド法などで結合したもの，又はペプチド鎖中のチロシン
が硫酸化されたタンパク質（フィブリノーゲン，フィブ
ロネクチンなど）を抗原としてウサギ，ヒツジ，ヤギマ
ウス，ラット，ウマ等の哺乳動物に免疫する。このと
き，フロイントの完全アジュバント（以下，ＦＣＡと略
す。）などの免疫増強剤を用いると効果的である。さら
に，１〜８週間後に，望ましくは２〜４週間後に同じ抗
原で追加免疫する。このとき，フロイントの不完全アジ
ュバント（以下，ＦＩＡと略す。）などの免疫増強剤を
用いると効果的である。さらに硫酸化チロシンを用いて
最終免疫を行う。最終免疫から１〜１４日後，望ましく
は３〜７日後に免疫した動物から血清を採取する。この
血清を，例えば，硫酸化チロシンを固定化した担体（例
えば，セファロースなど）を充填したカラムに吸着さ
せ，溶出後チロシンを固定化した担体（例えば，セファ
ロースなど）を充填したカラムを通過させ，チロシンに
も結合する抗体を除去することにより，硫酸化チロシン
に特異的に結合する抗体を得ることができる。
【００１３】また，硫酸化チロシンに特異的に結合する
モノクローナル抗体は，例えば，以下の方法により得る
ことができる。まず，以下のようにして，遊離の硫酸化
チロシン又はペプチド鎖中の硫酸化チロシンと結合し，
遊離の硫酸化されていないチロシン又はペプチド鎖中の
硫酸化されていないチロシンとは結合しないモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。そのた
めには，例えば，ポリクローナル抗体の場合と同様の抗
原をマウスに免疫して，最終免疫後，脾臓を摘出して，
例えば，「単クローン抗体（講談社サイエンチフィッ
ク：１９８３年）」に記載されている方法により，ミエ
ローマと脾臓細胞とを細胞融合させ，抗硫酸化チロシン
抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。そ
の抗硫酸化チロシン抗体産生ハイブリドーマを選択する
ためには，例えば，以下の方法で行えばよい。すなわ
ち，硫酸化チロシンを免疫の時に用いたのとは別のキャ
リアタンパク質を結合させた抗原を９６穴のマイクロタ
イタープレートに固定化する。そのプレートにハイブリ
ドーマの上清を加え，常法通り酵素免疫測定法やラジオ
イムノアッセイなどで硫酸化チロシンと結合するモノク
ローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択すれ
ばよい。さらに同様にチロシンを免疫の時に用いたのと
は別のキャリアタンパク質を結合させた抗原を固定化し
た９６穴のマイクロタイタープレートを用い，同様の酵
素免疫測定法やラジオイムノアッセイなどでチロシンと
は反応しないハイブリドーマを選択する。このようにし
て選択されたハイブリドーマは限界希釈法などによりク
ローニングすることができる。
モノクローナル抗体は，例えば，以下の方法により得る
ことができる。まず，以下のようにして，遊離の硫酸化
チロシン又はペプチド鎖中の硫酸化チロシンと結合し，
遊離の硫酸化されていないチロシン又はペプチド鎖中の
硫酸化されていないチロシンとは結合しないモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。そのた
めには，例えば，ポリクローナル抗体の場合と同様の抗
原をマウスに免疫して，最終免疫後，脾臓を摘出して，
例えば，「単クローン抗体（講談社サイエンチフィッ
ク：１９８３年）」に記載されている方法により，ミエ
ローマと脾臓細胞とを細胞融合させ，抗硫酸化チロシン
抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。そ
の抗硫酸化チロシン抗体産生ハイブリドーマを選択する
ためには，例えば，以下の方法で行えばよい。すなわ
ち，硫酸化チロシンを免疫の時に用いたのとは別のキャ
リアタンパク質を結合させた抗原を９６穴のマイクロタ
イタープレートに固定化する。そのプレートにハイブリ
ドーマの上清を加え，常法通り酵素免疫測定法やラジオ
イムノアッセイなどで硫酸化チロシンと結合するモノク
ローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択すれ
ばよい。さらに同様にチロシンを免疫の時に用いたのと
は別のキャリアタンパク質を結合させた抗原を固定化し
た９６穴のマイクロタイタープレートを用い，同様の酵
素免疫測定法やラジオイムノアッセイなどでチロシンと
は反応しないハイブリドーマを選択する。このようにし
て選択されたハイブリドーマは限界希釈法などによりク
ローニングすることができる。
【００１４】このようにして得られた抗硫酸化チロシン
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは「ＭＳＹ−
２」と命名し，通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託の手続を行い，平成３年（１９９１年）１０
月３０日受託された。その受託番号は微工研条寄第３６
４０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４０）である。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは「ＭＳＹ−
２」と命名し，通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託の手続を行い，平成３年（１９９１年）１０
月３０日受託された。その受託番号は微工研条寄第３６
４０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４０）である。
【００１５】次に，抗硫酸化チロシンモノクローナル抗
体を得るには，例えば，クローニングされた抗硫酸化チ
ロシンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをフラス
コ，ホローファイバー，撹拌培養槽などを用いて培養
し，その培養上清から硫安分画や，イオン交換，プロテ
インＡセファロースなどのクロマトグラフィーで分離精
製すればよい。
体を得るには，例えば，クローニングされた抗硫酸化チ
ロシンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをフラス
コ，ホローファイバー，撹拌培養槽などを用いて培養
し，その培養上清から硫安分画や，イオン交換，プロテ
インＡセファロースなどのクロマトグラフィーで分離精
製すればよい。
【００１６】
【実施例】次に，参考例及び実施例によって本発明を具
体的に説明する。 参考例１ ２０ｍｇのウシフィブリノーゲン（ナカライテスク社
製）を５０ｍＭの炭酸アンモニウム溶液４ｍｌに溶解し
てウシトロンビン（シグマ社製）を加えて３７℃で３時
間反応させ，反応物をｐＨ６. ０で平衡化したＣＭセフ
ァロース（ファルマシア社製）に通し，硫酸化されてい
ないペプチドを除去してフィブリノーゲンペプチドＢ
（以下，ＦＰＢと略す。）を６ｍｇ調製し，これを抗原
として用いた。
体的に説明する。 参考例１ ２０ｍｇのウシフィブリノーゲン（ナカライテスク社
製）を５０ｍＭの炭酸アンモニウム溶液４ｍｌに溶解し
てウシトロンビン（シグマ社製）を加えて３７℃で３時
間反応させ，反応物をｐＨ６. ０で平衡化したＣＭセフ
ァロース（ファルマシア社製）に通し，硫酸化されてい
ないペプチドを除去してフィブリノーゲンペプチドＢ
（以下，ＦＰＢと略す。）を６ｍｇ調製し，これを抗原
として用いた。
【００１７】参考例２ ２０ｍｇの硫酸化チロシンと１０ｍｇのＫＬＨ（シグマ
社製）を１. ２ｍｌの蒸留水に溶解してｐＨを７とし
た。この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−カルボジイミド塩酸水溶液１ｍｌ（０. ６
ｇ／ｍｌ）を，室温で撹拌しながら添加して４℃で７２
時間反応させ，透析後凍結乾燥して硫酸化チロシンとＫ
ＬＨの結合物２４ｍｇを得た。同様の方法で２０ｍｇの
硫酸化チロシンとＢＳＡ１２ｍｇから結合物（硫酸化チ
ロシン−ＢＳＡ）２５ｍｇを得た。また，同様にチロシ
ン２０ｍｇとＢＳＡ１２ｍｇから結合物（チロシン−Ｂ
ＳＡ）２４ｍｇを得た。これらは免疫及び酵素免疫測定
法の抗原として用いた。
社製）を１. ２ｍｌの蒸留水に溶解してｐＨを７とし
た。この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−カルボジイミド塩酸水溶液１ｍｌ（０. ６
ｇ／ｍｌ）を，室温で撹拌しながら添加して４℃で７２
時間反応させ，透析後凍結乾燥して硫酸化チロシンとＫ
ＬＨの結合物２４ｍｇを得た。同様の方法で２０ｍｇの
硫酸化チロシンとＢＳＡ１２ｍｇから結合物（硫酸化チ
ロシン−ＢＳＡ）２５ｍｇを得た。また，同様にチロシ
ン２０ｍｇとＢＳＡ１２ｍｇから結合物（チロシン−Ｂ
ＳＡ）２４ｍｇを得た。これらは免疫及び酵素免疫測定
法の抗原として用いた。
【００１８】実施例１ 参考例１で調製したＦＰＢ１ｍｇを生理食塩水リン酸緩
衝液（以下，ＰＢＳと略す。）１ｍｌに溶解して等量の
ＦＣＡ（ナカライテスク社製）と混合してエマルジョン
を作製し，ウサギに皮下注射して免疫した。３週間後に
同量のＦＰＢをＦＩＡ（ナカライテスク社製）とエマル
ジョン化して同様に追加免疫した。さらに３週間後，Ｆ
ＰＢ単独で最終免疫を行い，その５日後に採血し，血清
４９ｍｌを分離した。この血清から５０％飽和硫安分画
して沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.３）に透析
後，同じ緩衝液で平衡化したジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）セファロース（ファルマシア社製）に吸着さ
せ，食塩の濃度勾配により溶出して，精製（２３ｍｇ）
した。 これを硫酸化チロシン固定化セファロース（フ
ァルマシア社製）カラムに吸着させ，０. ２Ｍグリシン
塩酸緩衝液で溶出させた。この抗体画分をＰＢＳに透析
後，チロシン固定化セファロース（ファルマシア社製）
カラムに通液してチロシンと結合する抗体成分を除去し
た。通過した画分を限外濾過で濃縮してウサギ抗硫酸化
チロシン抗体１５ｍｇを得た。この抗体は，前記したご
とくの反応特異性を有していた。
衝液（以下，ＰＢＳと略す。）１ｍｌに溶解して等量の
ＦＣＡ（ナカライテスク社製）と混合してエマルジョン
を作製し，ウサギに皮下注射して免疫した。３週間後に
同量のＦＰＢをＦＩＡ（ナカライテスク社製）とエマル
ジョン化して同様に追加免疫した。さらに３週間後，Ｆ
ＰＢ単独で最終免疫を行い，その５日後に採血し，血清
４９ｍｌを分離した。この血清から５０％飽和硫安分画
して沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.３）に透析
後，同じ緩衝液で平衡化したジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）セファロース（ファルマシア社製）に吸着さ
せ，食塩の濃度勾配により溶出して，精製（２３ｍｇ）
した。 これを硫酸化チロシン固定化セファロース（フ
ァルマシア社製）カラムに吸着させ，０. ２Ｍグリシン
塩酸緩衝液で溶出させた。この抗体画分をＰＢＳに透析
後，チロシン固定化セファロース（ファルマシア社製）
カラムに通液してチロシンと結合する抗体成分を除去し
た。通過した画分を限外濾過で濃縮してウサギ抗硫酸化
チロシン抗体１５ｍｇを得た。この抗体は，前記したご
とくの反応特異性を有していた。
【００１９】実施例２ 参考例２で調製した硫酸化チロシンとＫＬＨの結合物１
ｍｇを生理食塩水リン酸緩衝液（以下，ＰＢＳと略
す。）１ｍｌに溶解して等量のＦＣＡ（ナカライテスク
社製）と混合してエマルジョンを作製し，マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ，日本クレア社製）２匹に腹腔内投与により免
疫した。３週間後に同量の硫酸化チロシンとＫＬＨの結
合物をＦＩＡ（ナカライテスク社製）とエマルジョン化
して同様に追加免疫した。さらに３週間後，硫酸化チロ
シン単独で最終免疫を行い，その３日後に脾臓を摘出し
て細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）に懸濁し
て，あらかじめ培養しておいたミエローマＰ３・Ｕ１
（４ｘ１０7 ）と混合して，５０％ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）４０００（シグマ社製）を用いて融合し
た。融合後，ＨＡＴ選択培地にて２週間培養してハイブ
リドーマを選択した後，酵素免疫測定法にて抗硫酸化チ
ロシン抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニング
した。すなわち，参考例２で得られた硫酸化チロシン−
ＢＳＡ結合物を吸着させた９６穴マイクロタイタープレ
ートにハイブリドーマ上清を加え，洗浄後パーオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を加えた。これを数時
間放置した後，洗浄し基質溶液を添加して対照のより発
色している上清のハイブリドーマをスクリーニングし，
限界希釈法にてクローニングした。こうして得られたハ
イブリドーマの１株を「ＭＳＴ−２」と命名し，通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工
研条寄第３６４０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４０）〕。
ｍｇを生理食塩水リン酸緩衝液（以下，ＰＢＳと略
す。）１ｍｌに溶解して等量のＦＣＡ（ナカライテスク
社製）と混合してエマルジョンを作製し，マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ，日本クレア社製）２匹に腹腔内投与により免
疫した。３週間後に同量の硫酸化チロシンとＫＬＨの結
合物をＦＩＡ（ナカライテスク社製）とエマルジョン化
して同様に追加免疫した。さらに３週間後，硫酸化チロ
シン単独で最終免疫を行い，その３日後に脾臓を摘出し
て細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）に懸濁し
て，あらかじめ培養しておいたミエローマＰ３・Ｕ１
（４ｘ１０7 ）と混合して，５０％ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）４０００（シグマ社製）を用いて融合し
た。融合後，ＨＡＴ選択培地にて２週間培養してハイブ
リドーマを選択した後，酵素免疫測定法にて抗硫酸化チ
ロシン抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニング
した。すなわち，参考例２で得られた硫酸化チロシン−
ＢＳＡ結合物を吸着させた９６穴マイクロタイタープレ
ートにハイブリドーマ上清を加え，洗浄後パーオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を加えた。これを数時
間放置した後，洗浄し基質溶液を添加して対照のより発
色している上清のハイブリドーマをスクリーニングし，
限界希釈法にてクローニングした。こうして得られたハ
イブリドーマの１株を「ＭＳＴ−２」と命名し，通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工
研条寄第３６４０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４０）〕。
【００２０】上記で得られたハイブリドーマ「ＭＳＴ−
２」〔微工研条寄第３６４０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６
４０）〕の細胞数６×１０8 をギット培地（和光純薬工
業社製）６００ｍｌに植え込み，５％の炭酸ガス存在下
３７℃で４日間培養した。培養後，遠心分離により細胞
を除き，得られた培養上清を水酸化ナトリウム溶液でｐ
Ｈを９．０に調節した後，プロテインＡセファロースカ
ラムに通液した。通液後，トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
６）で洗浄した後，グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．３）
で溶出した抗体画分を集めてＰＢＳに透析したところ，
１．１ｍｇの抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体（Ｍ
ＳＹＡ−２）を得た。
２」〔微工研条寄第３６４０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６
４０）〕の細胞数６×１０8 をギット培地（和光純薬工
業社製）６００ｍｌに植え込み，５％の炭酸ガス存在下
３７℃で４日間培養した。培養後，遠心分離により細胞
を除き，得られた培養上清を水酸化ナトリウム溶液でｐ
Ｈを９．０に調節した後，プロテインＡセファロースカ
ラムに通液した。通液後，トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
６）で洗浄した後，グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．３）
で溶出した抗体画分を集めてＰＢＳに透析したところ，
１．１ｍｇの抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体（Ｍ
ＳＹＡ−２）を得た。
【００２１】得られた抗硫酸化チロシンモノクローナル
抗体（ＭＳＹＡ−２）を参考例２で作製した硫酸化チロ
シン−ＢＳＡ及びチロシン−ＢＳＡを固定化したマイク
ロタイタープレートを用いて酵素免疫測定法で反応性を
検討した。すなわち，上記抗体（ＭＳＹＡ−２）０．１
ｍｇ／ｍｌを１０倍ずつ１０5 まで希釈し各プレートに
加え，２時間室温で放置した後，洗浄し，パーオキシダ
ーゼ標識の抗マウスＩｇＧ抗体を加え，１時間放置し
た。放置後，洗浄し，基質（オルトフェニレンジアミ
ン）を添加して活性を測定した。その結果を図１に示
す。図１は，縦軸に吸光度（４９２ｎｍ）を，横軸に抗
体濃度（μｇ／ｍｌ）を，それぞれ示しており，その図
からも明らかなごとく，本発明の抗体は，硫酸化チロシ
ンに対しては０．０１μｇ／ｍｌまで発色したが，チロ
シンには１０μｇ／ｍｌでもほとんど発色せず，チロシ
ンとはほとんど反応しなかった。
抗体（ＭＳＹＡ−２）を参考例２で作製した硫酸化チロ
シン−ＢＳＡ及びチロシン−ＢＳＡを固定化したマイク
ロタイタープレートを用いて酵素免疫測定法で反応性を
検討した。すなわち，上記抗体（ＭＳＹＡ−２）０．１
ｍｇ／ｍｌを１０倍ずつ１０5 まで希釈し各プレートに
加え，２時間室温で放置した後，洗浄し，パーオキシダ
ーゼ標識の抗マウスＩｇＧ抗体を加え，１時間放置し
た。放置後，洗浄し，基質（オルトフェニレンジアミ
ン）を添加して活性を測定した。その結果を図１に示
す。図１は，縦軸に吸光度（４９２ｎｍ）を，横軸に抗
体濃度（μｇ／ｍｌ）を，それぞれ示しており，その図
からも明らかなごとく，本発明の抗体は，硫酸化チロシ
ンに対しては０．０１μｇ／ｍｌまで発色したが，チロ
シンには１０μｇ／ｍｌでもほとんど発色せず，チロシ
ンとはほとんど反応しなかった。
【００２２】
【発明の効果】本発明の抗硫酸化チロシン抗体は，遊離
の硫酸化チロシン又はペプチド鎖中の硫酸化チロシンと
結合し，かつ硫酸化されていないチロシンとは結合しな
いという反応特異性を有するため，硫酸化チロシンを簡
便，かつ短時間に定量することができる。また，本発明
のハイブリドーマは，この反応特異性を有する抗硫酸化
チロシンモノクローナル抗体を産生することができる。
の硫酸化チロシン又はペプチド鎖中の硫酸化チロシンと
結合し，かつ硫酸化されていないチロシンとは結合しな
いという反応特異性を有するため，硫酸化チロシンを簡
便，かつ短時間に定量することができる。また，本発明
のハイブリドーマは，この反応特異性を有する抗硫酸化
チロシンモノクローナル抗体を産生することができる。
【図１】本発明の抗硫酸化チロシン抗体の反応交差性を
示す図である。
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】 遊離の硫酸化チロシン又はペプチド鎖中
の硫酸化チロシンと結合し，かつ硫酸化されていないチ
ロシンとは結合しないことを特徴とする抗硫酸化チロシ
ン抗体。 - 【請求項２】 哺乳動物を硫酸化チロシン又はそのタン
パク質複合体で免疫して血清を得，得られた血清をチロ
シン固定化担体で吸着操作を行うことを特徴とする請求
項１記載の抗体の製造方法。 - 【請求項３】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
１記載の抗体。 - 【請求項４】 請求項３記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ。 - 【請求項５】 請求項４記載のハイブリドーマを培養
し，その培養物から請求項３の抗体を採取することを特
徴とする請求項３記載のモノクローナル抗体の製造方
法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4078986A JPH05244987A (ja) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | 抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法及び抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
| US08/340,427 US5716836A (en) | 1992-02-28 | 1994-11-14 | Anti-sulfated tyrosine antibody specific for sulfated tyrosine, process for producing the same, and hybridoma capable of producing anti-sulfated tyrosine monoclonal antibody specific for sulfated tyrosine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4078986A JPH05244987A (ja) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | 抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法及び抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05244987A true JPH05244987A (ja) | 1993-09-24 |
Family
ID=13677221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4078986A Pending JPH05244987A (ja) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | 抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法及び抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5716836A (ja) |
| JP (1) | JPH05244987A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US20120244594A9 (en) | 1998-09-04 | 2012-09-27 | Cell Signaling Technology, Inc. | Immunoaffinity isolation of modified peptides from complex mixtures |
| US6441140B1 (en) * | 1998-09-04 | 2002-08-27 | Cell Signaling Technology, Inc. | Production of motif-specific and context-independent antibodies using peptide libraries as antigens |
| US9085609B2 (en) | 1998-09-04 | 2015-07-21 | Cell Signaling Technology, Inc. | Production of motif-specific and context-independent antibodies using peptide libraries as antigens |
| US20040002450A1 (en) * | 2000-12-29 | 2004-01-01 | Janette Lazarovits | Y17 - isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof |
| US20040001839A1 (en) * | 2000-12-29 | 2004-01-01 | Avigdor Levanon | Multimers - isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof |
| US7132510B2 (en) * | 2000-12-29 | 2006-11-07 | Bio-Technology General (Israel) Ltd. | Specific human antibodies for selective cancer therapy |
| US20040001822A1 (en) * | 2000-12-29 | 2004-01-01 | Avigdor Levanon | Y1-isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof |
| US20110111424A1 (en) | 2001-06-21 | 2011-05-12 | Cell Signaling Technology, Inc. | Analysis of ubiquitinated polypeptides |
| US20040202665A1 (en) * | 2002-07-01 | 2004-10-14 | Janette Lazarovits | Compositions and methods for therapeutic treatment |
| CN1678348A (zh) * | 2002-07-01 | 2005-10-05 | 萨文特医药公司 | 用于治疗性治疗的组合物和方法 |
| US20040208877A1 (en) * | 2002-07-01 | 2004-10-21 | Avigdor Levanon | Antibodies and uses thereof |
| US20050266009A1 (en) * | 2003-06-30 | 2005-12-01 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies and uses thereof |
| US20050152906A1 (en) * | 2003-06-30 | 2005-07-14 | Avigdor Levanon | Specific human antibodies |
| US20050069955A1 (en) * | 2003-06-30 | 2005-03-31 | Daniel Plaksin | Antibodies and uses thereof |
| US7589182B1 (en) * | 2005-01-07 | 2009-09-15 | Los Alamos National Security, Llc | Anti-sulfotyrosine antibodies |
| US20070160601A1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-07-12 | Angela Widom | Neutralizing antibodies against primate psgl-1 and uses therefor |
| US20070298034A9 (en) * | 2005-12-09 | 2007-12-27 | Angela Widom | Sulfotyrosine specific antibodies and uses therefor |
| US20150232540A1 (en) | 2006-07-11 | 2015-08-20 | Cell Signaling Technology, Inc. | Analysis of ubiquitnated polypeptides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS635133B2 (ja) * | 1978-01-24 | 1988-02-02 | Paburitsuku Herusu Raboratarii Saauisu Boodo | |
| JPS56145222A (en) * | 1980-04-28 | 1981-11-11 | Toshiyuki Hamaoka | Improved antibody and its preparation |
| US4474893A (en) * | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
| US4777127A (en) * | 1985-09-30 | 1988-10-11 | Labsystems Oy | Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus |
-
1992
- 1992-02-28 JP JP4078986A patent/JPH05244987A/ja active Pending
-
1994
- 1994-11-14 US US08/340,427 patent/US5716836A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5716836A (en) | 1998-02-10 |
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