JP3112463B2 - モノクローナル抗体の作製方法 - Google Patents
モノクローナル抗体の作製方法Info
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- JP3112463B2 JP3112463B2 JP02077336A JP7733690A JP3112463B2 JP 3112463 B2 JP3112463 B2 JP 3112463B2 JP 02077336 A JP02077336 A JP 02077336A JP 7733690 A JP7733690 A JP 7733690A JP 3112463 B2 JP3112463 B2 JP 3112463B2
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- monoclonal antibody
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、モノクローナル抗体と結合させた抗原蛋白
質を免疫原として別のエピトープを認識するモノクロー
ナル抗体を作製する方法に関する。
質を免疫原として別のエピトープを認識するモノクロー
ナル抗体を作製する方法に関する。
本発明の方法によって作製されたモノクローナル抗体
は、サンドイッチ型ELISA法などの測定用抗体として有
用に利用される。
は、サンドイッチ型ELISA法などの測定用抗体として有
用に利用される。
従来の技術 インシュリンやエリスロポエチンをはじめとする種々
のペプチド性ホルモンの免疫学的測定法は、特異性が高
く、迅速かつ少量の検体量で測定できることから、すぐ
れた測定手法として広く応用されている。特に、免疫学
的測定法の中で、放射性同位元素を使用するラジオイム
ノアッセイ（RIA）法が古くから開発され利用されてい
る。
のペプチド性ホルモンの免疫学的測定法は、特異性が高
く、迅速かつ少量の検体量で測定できることから、すぐ
れた測定手法として広く応用されている。特に、免疫学
的測定法の中で、放射性同位元素を使用するラジオイム
ノアッセイ（RIA）法が古くから開発され利用されてい
る。
しかしながら、RIA法では、放射性同位元素を使用す
るため、特別な施設を必要とし、廃棄物処理上の問題を
有するという欠点があった。そこで近年RIA法に変わる
免疫学的測定法として酵素を利用したエンザイムイムノ
アッセイ（ELISA）法が開発されるに至った。この方法
では、多くの場合、特異性、迅速性、検出感度を良好に
する目的で測定対象である抗原の異なるエピトープを認
識する２種類の抗体を使用し、抗原抗体複合体を形成さ
せるいわゆるサンドイッチ型のELISA法が一般的、かつ
最もすぐれた手法として用いられている。サンドイッチ
型ELISA法で使用する抗体を、ウサギ等の動物を免疫し
て得られる抗血清から調製されるポリクローナル抗体を
使用して実施する場合には、抗血清中に異なるエピトー
プを認識する多種類の抗体が存在しているので、異なる
抗血清あるいは同一の抗血清から得られる異なるポリク
ローナル抗体を選択し利用することができる。しかしな
がら、免疫動物血清から得られるポリクローナル抗体の
特性は一定ではなく、免疫の都度、抗血清から調製され
た抗体の特性を検定し、必要とする感度を示すELISA法
を組み立てるに使用し得るか否かを検討する必要がある
という煩雑な手間を要し、この点がポリクローナル抗体
を用いる測定方法の大きな欠点となっていた。そこで恒
久的に均質な特性を有する抗体、すなわち異なるエピト
ープを認識する２種類のモノクローナル抗体が利用され
るに至った。モノクローナル抗体の作製においては、抗
体を生産するハイブリドーマ細胞を樹立する必要があ
る。しかしながら、一般に抗原の認識されやすい部位は
決っているため、多くの場合、作製したハイブリドーマ
の生産する抗体は、同一あるいは近似の部位を認識して
しまう。また、高い親和力を持つ抗体は近似のエピトー
プを認識するため、サンドイッチ型ELISAに有効な異な
るエピトープを認識する２種類の抗体を取得するには、
非常に多数のハイブリドーマが生産する抗体の中からこ
のような抗体を選出する必要があり、非常に多くの労力
を要するという問題があった。
るため、特別な施設を必要とし、廃棄物処理上の問題を
有するという欠点があった。そこで近年RIA法に変わる
免疫学的測定法として酵素を利用したエンザイムイムノ
アッセイ（ELISA）法が開発されるに至った。この方法
では、多くの場合、特異性、迅速性、検出感度を良好に
する目的で測定対象である抗原の異なるエピトープを認
識する２種類の抗体を使用し、抗原抗体複合体を形成さ
せるいわゆるサンドイッチ型のELISA法が一般的、かつ
最もすぐれた手法として用いられている。サンドイッチ
型ELISA法で使用する抗体を、ウサギ等の動物を免疫し
て得られる抗血清から調製されるポリクローナル抗体を
使用して実施する場合には、抗血清中に異なるエピトー
プを認識する多種類の抗体が存在しているので、異なる
抗血清あるいは同一の抗血清から得られる異なるポリク
ローナル抗体を選択し利用することができる。しかしな
がら、免疫動物血清から得られるポリクローナル抗体の
特性は一定ではなく、免疫の都度、抗血清から調製され
た抗体の特性を検定し、必要とする感度を示すELISA法
を組み立てるに使用し得るか否かを検討する必要がある
という煩雑な手間を要し、この点がポリクローナル抗体
を用いる測定方法の大きな欠点となっていた。そこで恒
久的に均質な特性を有する抗体、すなわち異なるエピト
ープを認識する２種類のモノクローナル抗体が利用され
るに至った。モノクローナル抗体の作製においては、抗
体を生産するハイブリドーマ細胞を樹立する必要があ
る。しかしながら、一般に抗原の認識されやすい部位は
決っているため、多くの場合、作製したハイブリドーマ
の生産する抗体は、同一あるいは近似の部位を認識して
しまう。また、高い親和力を持つ抗体は近似のエピトー
プを認識するため、サンドイッチ型ELISAに有効な異な
るエピトープを認識する２種類の抗体を取得するには、
非常に多数のハイブリドーマが生産する抗体の中からこ
のような抗体を選出する必要があり、非常に多くの労力
を要するという問題があった。
発明が解決しようとする課題 上記したように、異なるエピトープを有する２種類の
モノクローナル抗体を取得するには、非常に多数のモノ
クローナル抗体の中から有効な抗体を選出することが必
要であり、このために莫大な労力をはらわねばならなか
った。
モノクローナル抗体を取得するには、非常に多数のモノ
クローナル抗体の中から有効な抗体を選出することが必
要であり、このために莫大な労力をはらわねばならなか
った。
本発明は、このような問題点を解決するためになされ
たものである。すなわち、本発明者らは、抗原となる蛋
白質のエピトープ部分が抗原として認識されないように
該蛋白質のエピトープをモノクローナル抗体によりブロ
ックしておき、このような蛋白質を抗原として用いるこ
とにより所望とする抗原認識性の異ったモノクローナル
抗体を得ることができることを見出し、本発明を完成す
るに至った。
たものである。すなわち、本発明者らは、抗原となる蛋
白質のエピトープ部分が抗原として認識されないように
該蛋白質のエピトープをモノクローナル抗体によりブロ
ックしておき、このような蛋白質を抗原として用いるこ
とにより所望とする抗原認識性の異ったモノクローナル
抗体を得ることができることを見出し、本発明を完成す
るに至った。
従って本発明の課題は、モノクローナル抗体と結合し
た抗原蛋白質を用いるエピトープ認識性の異なったモノ
ーナル抗体の作製方法を提供することにある。
た抗原蛋白質を用いるエピトープ認識性の異なったモノ
ーナル抗体の作製方法を提供することにある。
なお、本発明により得られるノクローナル抗体結合蛋
白質は、免疫用抗原として有用であり、また、本方法に
より得られるエピトープ認識性の異なった抗体は、サン
ドイッチ型ELISA法などの測定用抗体として有用であ
る。
白質は、免疫用抗原として有用であり、また、本方法に
より得られるエピトープ認識性の異なった抗体は、サン
ドイッチ型ELISA法などの測定用抗体として有用であ
る。
課題を解決するための手段 モノクローナル抗体は、蛋白質のエピトープ部分を認
識して結合する。本発明は、このように抗原抗体反応に
より結合した蛋白質は、モノクローナル抗体の認識部位
が、モノクローナル抗体と結合することによりブロック
され蛋白質の別の部分が抗原として認識されることを見
出し、この知見を利用して別のエピトープを認識するモ
ノクローナル抗体を作製しようとするものである。より
具体的には、エピトープをモノクローナル抗体によりブ
ロックした抗原蛋白質を作製し、これであるいはモノク
ローナル自体で動物を免疫し、得られる脾細胞とミエロ
ーマ細胞との間で細胞融合を行わせ、得られる抗体生産
ハイブリドーマを培養し、この中から異なるエピトープ
を認識する抗体を生産するハイブリドーマを選出し、こ
の抗体を培養し、異なった抗原認識性を有するモノクロ
ーナル抗体を得る方法に関する。
識して結合する。本発明は、このように抗原抗体反応に
より結合した蛋白質は、モノクローナル抗体の認識部位
が、モノクローナル抗体と結合することによりブロック
され蛋白質の別の部分が抗原として認識されることを見
出し、この知見を利用して別のエピトープを認識するモ
ノクローナル抗体を作製しようとするものである。より
具体的には、エピトープをモノクローナル抗体によりブ
ロックした抗原蛋白質を作製し、これであるいはモノク
ローナル自体で動物を免疫し、得られる脾細胞とミエロ
ーマ細胞との間で細胞融合を行わせ、得られる抗体生産
ハイブリドーマを培養し、この中から異なるエピトープ
を認識する抗体を生産するハイブリドーマを選出し、こ
の抗体を培養し、異なった抗原認識性を有するモノクロ
ーナル抗体を得る方法に関する。
本発明におけるモノクローナル抗体と結合させた抗原
蛋白質は、モノクローナル抗体と抗原蛋白質とをあらか
じめin vitroで反応させ免疫特異的結合を行わせた後に
グルタルアルデヒド等の架橋剤で共有結合を行わせて作
製することができる。さらには、免疫動物自身の有する
抗原蛋白が種差を超えて抗体と結合する場合には、免疫
動物に抗体を投与し、動物内で動物自身の抗原蛋白と投
与した抗体との間で結合を行わせて抗体と結合した抗原
蛋白を得ることもできる。使用するモノクローナル抗体
は、望ましくは、免疫動物と同一種のものがよい。なぜ
ならばエピトープを認識し結合した抗原・抗体結合物の
抗体部分の免疫活性をおさえて抗原部分の別のエピトー
プを認識する抗体を取得するためである。
蛋白質は、モノクローナル抗体と抗原蛋白質とをあらか
じめin vitroで反応させ免疫特異的結合を行わせた後に
グルタルアルデヒド等の架橋剤で共有結合を行わせて作
製することができる。さらには、免疫動物自身の有する
抗原蛋白が種差を超えて抗体と結合する場合には、免疫
動物に抗体を投与し、動物内で動物自身の抗原蛋白と投
与した抗体との間で結合を行わせて抗体と結合した抗原
蛋白を得ることもできる。使用するモノクローナル抗体
は、望ましくは、免疫動物と同一種のものがよい。なぜ
ならばエピトープを認識し結合した抗原・抗体結合物の
抗体部分の免疫活性をおさえて抗原部分の別のエピトー
プを認識する抗体を取得するためである。
本発明では、このようにして抗原とモノクローナル抗
体を反応させ、結合させた抗原抗体複合物あるいはモノ
クローナル抗体自体を免疫原として使用する。このよう
な抗原抗体複合物を異なるエピトープ認識性をもったモ
ノクローナル抗体を得るための抗原として使用した例は
これまで報告されていない。
体を反応させ、結合させた抗原抗体複合物あるいはモノ
クローナル抗体自体を免疫原として使用する。このよう
な抗原抗体複合物を異なるエピトープ認識性をもったモ
ノクローナル抗体を得るための抗原として使用した例は
これまで報告されていない。
本発明におけるこのような別のモノクローナル抗体を
得る方法としては、具体的には抗原−モノクローナル抗
体結合物あるいは、モノクローナル抗体のみで常法に従
い、試験動物に例えば２週間毎に３回の免疫を行い、３
日後にこの免疫動物の脾細胞を取り出し、これをミエロ
ーマ細胞との間で細胞融合を行わせる。これを培養して
増殖させ、抗原の別のエピトープを認識し、この部分と
結合する抗体を生産するハイブリドーマを選択し、この
ハイブリドーマを培養することによってモノクローナル
抗体を調製する。これらの培養は、動物の体内、例えば
腹腔内で行ってもよく、また培養器内において培養を行
ってもよい。得られたモノクローナル抗体の溶液をELIS
Aプレートに加え抗体結合プレートを作製した後に、抗
原溶液を加えて反応させ抗体結合プレートに抗原を結合
させる。本プレートに標識物質（例えばアルカリフォス
ファターゼ等の酵素あるいは125I等の放射性同位元素）
を結合させた免疫に使用した抗体を反応させ、前記抗体
結合プレート上に結合した標識抗体量を測定することか
ら、異なるエピトープを認識する別のモノクローナル抗
体を選出し、有効な抗体を取得することができる。
得る方法としては、具体的には抗原−モノクローナル抗
体結合物あるいは、モノクローナル抗体のみで常法に従
い、試験動物に例えば２週間毎に３回の免疫を行い、３
日後にこの免疫動物の脾細胞を取り出し、これをミエロ
ーマ細胞との間で細胞融合を行わせる。これを培養して
増殖させ、抗原の別のエピトープを認識し、この部分と
結合する抗体を生産するハイブリドーマを選択し、この
ハイブリドーマを培養することによってモノクローナル
抗体を調製する。これらの培養は、動物の体内、例えば
腹腔内で行ってもよく、また培養器内において培養を行
ってもよい。得られたモノクローナル抗体の溶液をELIS
Aプレートに加え抗体結合プレートを作製した後に、抗
原溶液を加えて反応させ抗体結合プレートに抗原を結合
させる。本プレートに標識物質（例えばアルカリフォス
ファターゼ等の酵素あるいは125I等の放射性同位元素）
を結合させた免疫に使用した抗体を反応させ、前記抗体
結合プレート上に結合した標識抗体量を測定することか
ら、異なるエピトープを認識する別のモノクローナル抗
体を選出し、有効な抗体を取得することができる。
本発明で得られるモノクローナル抗体と結合した抗原
蛋白質は、モノクローナル抗体結合部位以外の部位にお
いて抗原性を示せば良く、特別な活性や特性を必要とし
ない。
蛋白質は、モノクローナル抗体結合部位以外の部位にお
いて抗原性を示せば良く、特別な活性や特性を必要とし
ない。
実施例１ 本実施例では、モノクローナル抗体を結合させた抗原
蛋白質（抗原−抗体複合体）の調製例を示す。
蛋白質（抗原−抗体複合体）の調製例を示す。
EPO−抗EPO抗体複合体の調製： BLOOD74巻1415頁〜1423頁の方法に従って調製したヒ
ト組換え型EPO及び抗EPO抗体R2を使用した。PBS（リン
酸緩衝生理的食塩水phosphete buffered saline）に2mg
/mlになる様に調製したEPO溶液1mlにPBSで2mg/mlになる
様に調製した抗EPO抗体R2溶液4mlを加え４℃で一晩反応
させた後、25％グルタルアルデヒド溶液を0.2％（v/v）
になる様に加え、、室温で１時間反応させた後、４℃で
一晩透析を行った。なお透析外液は0.05M PBS ５で
適時２回の外液交換を行った。以上の操作によりEPO−
抗EPO抗体複合体を調製した。
ト組換え型EPO及び抗EPO抗体R2を使用した。PBS（リン
酸緩衝生理的食塩水phosphete buffered saline）に2mg
/mlになる様に調製したEPO溶液1mlにPBSで2mg/mlになる
様に調製した抗EPO抗体R2溶液4mlを加え４℃で一晩反応
させた後、25％グルタルアルデヒド溶液を0.2％（v/v）
になる様に加え、、室温で１時間反応させた後、４℃で
一晩透析を行った。なお透析外液は0.05M PBS ５で
適時２回の外液交換を行った。以上の操作によりEPO−
抗EPO抗体複合体を調製した。
実施例２ 本実例ではモノクローナル抗体を結合させた抗原蛋白
質（抗原−抗体複合体）により免疫する例を示す。
質（抗原−抗体複合体）により免疫する例を示す。
（１） EPO−抗EPO抗体複合体による免疫 実施例１により得たEPO−抗EPO抗体複合体を抗原とし
て使用し、マウス（BALB/cマウス）を免疫した。
て使用し、マウス（BALB/cマウス）を免疫した。
第１回免疫： 前記の方法で調製したEPO−抗EPO抗体複合体液に等量
のフロイント完全アジュバンドを混合して得たエマルジ
ョン0.2mlをマウスに対し腹腔内注射で投与した。
のフロイント完全アジュバンドを混合して得たエマルジ
ョン0.2mlをマウスに対し腹腔内注射で投与した。
第２回免疫： ２週間後に同上のエマルジョン液200μをマウスに
対し腹腔内注射で投与した。
対し腹腔内注射で投与した。
第３回免疫： EPO−抗EPO抗体複合液50μをマウスに対し、２週間
後に腹腔内投与した。
後に腹腔内投与した。
（２） 抗EPO抗体産生ハイブリドーマの調製： ｉ）細胞融合：細胞融合は常法に従い行った。以下概
略を記載する。前記免疫処理終了から３日後に免疫マウ
スの脾臓を無菌的に摘出し、合成培養液（PRMI 1640
液）と15％牛胎児血清（FCS）との混合液で洗浄後、該
混合液中で脾臓をハサミで切断して単細胞化を行い該混
合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をRPMI1640液
に分散した。細胞数は、３×108個であった。別にマウ
スのミエローマ細胞（P3/NSI/1−Ag4−１）を前記15％F
CSを含むRPMI培養液中で培養し、増殖した細胞をRPMI16
40液で洗浄した。細胞数は２×108個であった。次に前
記で調製した免疫マウス脾細胞とマウスミエローマ細胞
とをRPMI1640液に分散し、混合した後、遠心し、上清を
除去した。混合細胞をポリエチレングリコール1500の50
％溶液中で細胞融合させた後、融合細胞をHT培養液（ヒ
ポキサンチン（100μＭ）、チミジン（16μＭ）及び15
％FCSを含むRPMI1640液）に分散し、分散液を２枚の96
穴マイクロプレートに撒き、２日目以降、HAT培養液
〔ヒポキサンチン（100μＭ）、アミノプテリン（0.4μ
Ｍ）、チミジン（16μＭ）及び15％FCSを含むRPMI1640
液〕と徐々に交換して培養を行うことによりHAT選択を
行った。各穴で２週間の培養を行い、168穴においてハ
イブリドーマを確認した。
略を記載する。前記免疫処理終了から３日後に免疫マウ
スの脾臓を無菌的に摘出し、合成培養液（PRMI 1640
液）と15％牛胎児血清（FCS）との混合液で洗浄後、該
混合液中で脾臓をハサミで切断して単細胞化を行い該混
合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をRPMI1640液
に分散した。細胞数は、３×108個であった。別にマウ
スのミエローマ細胞（P3/NSI/1−Ag4−１）を前記15％F
CSを含むRPMI培養液中で培養し、増殖した細胞をRPMI16
40液で洗浄した。細胞数は２×108個であった。次に前
記で調製した免疫マウス脾細胞とマウスミエローマ細胞
とをRPMI1640液に分散し、混合した後、遠心し、上清を
除去した。混合細胞をポリエチレングリコール1500の50
％溶液中で細胞融合させた後、融合細胞をHT培養液（ヒ
ポキサンチン（100μＭ）、チミジン（16μＭ）及び15
％FCSを含むRPMI1640液）に分散し、分散液を２枚の96
穴マイクロプレートに撒き、２日目以降、HAT培養液
〔ヒポキサンチン（100μＭ）、アミノプテリン（0.4μ
Ｍ）、チミジン（16μＭ）及び15％FCSを含むRPMI1640
液〕と徐々に交換して培養を行うことによりHAT選択を
行った。各穴で２週間の培養を行い、168穴においてハ
イブリドーマを確認した。
ii）上記ハイブリドーマ細胞のスクリーニングによる
選出：前記で得た168穴のハイブリドーマより特定の細
胞、すなわちEPOと特異的に結合し得る抗体を産生する
ハイブリドーマを選び出すために125I−EPO（EPOをIODO
−GEN法にて125Iで標識したもの。比放射活性は、75μC
i/μg EPO）を用いて125I−EPOと特異的に結合する抗体
がハイブリドーマ培養液中に存在することを確認するこ
とにより選出した。その結果、目的に適合したものとし
て76穴の細胞が選出され、そのうち125I−EPOとの結合
値の高かったもの12穴についてハイブリドーマの継代培
養を続け、限界希釈法によりモノクローン化を行い、安
定的に抗体産生を行うハイブリドーマ細胞12種を得た。
（なお、ハイブリドーマの産生する抗体を2N−１〜12と
命名した。） iii）モノクローナル抗EPO抗体の生産：前記ハイブリ
ドーマ細胞12種類を用いて抗体産生をマウス腹腔内で行
った。すなわち常法に従い、マウス腹腔内に各ハイブリ
ドーマ細胞を移植し、マウス腹腔内で抗体を産生させ
（腹水として回収）、50％硫安分画に付した後、バイオ
ラド社（BioRad）製ハイドロキシアパタイトHPLC（HPHT
カラム、0.01mM CaCl2含有リン酸buffer pH6.8 10mM→3
50mMで溶出し、IgG画分を取得）カラムを通し、精製免
疫グロブリン（IgG）を得た。
選出：前記で得た168穴のハイブリドーマより特定の細
胞、すなわちEPOと特異的に結合し得る抗体を産生する
ハイブリドーマを選び出すために125I−EPO（EPOをIODO
−GEN法にて125Iで標識したもの。比放射活性は、75μC
i/μg EPO）を用いて125I−EPOと特異的に結合する抗体
がハイブリドーマ培養液中に存在することを確認するこ
とにより選出した。その結果、目的に適合したものとし
て76穴の細胞が選出され、そのうち125I−EPOとの結合
値の高かったもの12穴についてハイブリドーマの継代培
養を続け、限界希釈法によりモノクローン化を行い、安
定的に抗体産生を行うハイブリドーマ細胞12種を得た。
（なお、ハイブリドーマの産生する抗体を2N−１〜12と
命名した。） iii）モノクローナル抗EPO抗体の生産：前記ハイブリ
ドーマ細胞12種類を用いて抗体産生をマウス腹腔内で行
った。すなわち常法に従い、マウス腹腔内に各ハイブリ
ドーマ細胞を移植し、マウス腹腔内で抗体を産生させ
（腹水として回収）、50％硫安分画に付した後、バイオ
ラド社（BioRad）製ハイドロキシアパタイトHPLC（HPHT
カラム、0.01mM CaCl2含有リン酸buffer pH6.8 10mM→3
50mMで溶出し、IgG画分を取得）カラムを通し、精製免
疫グロブリン（IgG）を得た。
iv）サンドイッチELISA用抗体の選出：前記の12種の
各々の抗体を10μg/mlになるように0.05M炭酸ナトリウ
ム緩衝液（pH9.6）に溶解して調製した抗体液をELISAプ
レート（ダイナテック社製IMMULON 2 REMOVA−WELL ST
RIPSにて調製）の各ウエルに100μｇずつ分注し、４℃
で一晩（あるいは、室温２時間）静置後、抗体液を除去
し、PBS−Tween溶液（0.05％Tween20,0.02％NaN3含有PB
S溶液）でウェル内を３回洗浄した後に、各ウェルに１
％BSA−PBS溶液（１％BSA含有PBS溶液）を200μずつ
分注し、室温で２時間静置後、ウェル内をPBS−Tween溶
液で３回洗浄し、抗体コートウェル（抗体結合支持体）
とした。調製した抗体コートウェルにEPO溶液（0,10,10
0,1000mU/mlとなる様に１％BSA−PBS溶液で調製）を入
れ、室温で２時間反応した後、PBS−Tween溶液で各ウェ
ルを３回洗浄した。次に各ウェルに125I−R2（抗EPO抗
体R2をIODO−GEN法にて125Iで標識したもの。比放射活
性は50μCi/μg IgG）溶液（１％BSA−PBSで106cpm/ml
になるように調製）50μを加え室温で２時間反応させ
た後、PBS−Tween溶液で各ウェルを３回洗浄した。洗浄
した各ウェルをオートガンマーカウンターにてその放射
能量を測定し、抗体コートウェルにEPOを介して結合し
たIgG（サンドイッチELISA用抗体）を選出した。前記2N
−１〜12の12種のうち、８種の抗体が結合性を示し、EP
O溶液中のEPO濃度に比例した放射能量の増加が認められ
た。これらは抗EPO抗体R2とは異なるエピトープを認識
するサンドイッチELISAに有効な抗EPO抗体であった。
各々の抗体を10μg/mlになるように0.05M炭酸ナトリウ
ム緩衝液（pH9.6）に溶解して調製した抗体液をELISAプ
レート（ダイナテック社製IMMULON 2 REMOVA−WELL ST
RIPSにて調製）の各ウエルに100μｇずつ分注し、４℃
で一晩（あるいは、室温２時間）静置後、抗体液を除去
し、PBS−Tween溶液（0.05％Tween20,0.02％NaN3含有PB
S溶液）でウェル内を３回洗浄した後に、各ウェルに１
％BSA−PBS溶液（１％BSA含有PBS溶液）を200μずつ
分注し、室温で２時間静置後、ウェル内をPBS−Tween溶
液で３回洗浄し、抗体コートウェル（抗体結合支持体）
とした。調製した抗体コートウェルにEPO溶液（0,10,10
0,1000mU/mlとなる様に１％BSA−PBS溶液で調製）を入
れ、室温で２時間反応した後、PBS−Tween溶液で各ウェ
ルを３回洗浄した。次に各ウェルに125I−R2（抗EPO抗
体R2をIODO−GEN法にて125Iで標識したもの。比放射活
性は50μCi/μg IgG）溶液（１％BSA−PBSで106cpm/ml
になるように調製）50μを加え室温で２時間反応させ
た後、PBS−Tween溶液で各ウェルを３回洗浄した。洗浄
した各ウェルをオートガンマーカウンターにてその放射
能量を測定し、抗体コートウェルにEPOを介して結合し
たIgG（サンドイッチELISA用抗体）を選出した。前記2N
−１〜12の12種のうち、８種の抗体が結合性を示し、EP
O溶液中のEPO濃度に比例した放射能量の増加が認められ
た。これらは抗EPO抗体R2とは異なるエピトープを認識
するサンドイッチELISAに有効な抗EPO抗体であった。
実施例３ 本実施例は、抗EPOモノクローナル抗体を抗原とし、
マウスを免疫してマウス体内でマウスEPOと抗EPO抗体複
合体を形成させることにより、マウス内でマウスEPO−
抗体EPO抗体複合体を抗原とするもので、抗EPOモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を取得する方法であ
る。なお、使用した抗EPOモノクローナル抗体R4及びハ
イブリドーマの選出に用いたヒト組換え型EPOは、BLOO
D、74巻1415頁〜1423頁の方法に従って調製した。
マウスを免疫してマウス体内でマウスEPOと抗EPO抗体複
合体を形成させることにより、マウス内でマウスEPO−
抗体EPO抗体複合体を抗原とするもので、抗EPOモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を取得する方法であ
る。なお、使用した抗EPOモノクローナル抗体R4及びハ
イブリドーマの選出に用いたヒト組換え型EPOは、BLOO
D、74巻1415頁〜1423頁の方法に従って調製した。
（１） 抗EPO抗体R4による実験動物の免疫： 抗EPO抗体を抗原として、実験動物マウス（C57 BL/6
N）を免疫した。免疫は、前記実施例２と同様に２週間
間隔で３回行った。各回の免疫には、マウス一匹あた
り、抗EPO抗体をそれぞれ100μg,50μg,50μｇ使用し
た。
N）を免疫した。免疫は、前記実施例２と同様に２週間
間隔で３回行った。各回の免疫には、マウス一匹あた
り、抗EPO抗体をそれぞれ100μg,50μg,50μｇ使用し
た。
（２） 抗EPO抗体産生ハイブリドーマの調製： 前記実施例２と同様の操作により行った。細胞融合
は、免疫脾細胞４×108個とミエローマ細胞２×108個で
行い、96穴マイクロプレート２枚に撒き、２週間の培養
を行い174穴においてハイブリドーマの増殖を確認し
た。125I−EPOを用いて特異的に結合する抗体がハイブ
リドーマ培養液中に存在することを確認し、65穴の細胞
を選出した。そのうち、高い結合性を示す12穴について
ハイブリドーマの継代培養を続け、限界希釈法によりモ
ノクローン化を行い安定的に抗体生産を行うハイブリド
ーマ細胞12種を得た（なお、ハイブリドーマの産生する
抗体を4N−１〜12と命名した）。得られた12種のハイブ
リドーマ細胞を用いてマウス腹腔内で抗体生産を行い、
硫安分画、ハイドロキシアパタイトHPLC処理により精製
抗体を調製し、125I標識抗EPO抗体R4（125I−R4,比放射
活性は56μMci/μｇ）と得られた12種の抗体を用いてEP
OのサンドイッチELISA法に適した異なるエピトープの認
識の可否を検定した。この結果、９種の抗体において、
EPO濃度に比例した放射能量の増加が認められ、抗EPO抗
体R4とは異なるエピトープを認識するサンドイッチELIS
A法に有効な抗EPO抗体を得ることができた。
は、免疫脾細胞４×108個とミエローマ細胞２×108個で
行い、96穴マイクロプレート２枚に撒き、２週間の培養
を行い174穴においてハイブリドーマの増殖を確認し
た。125I−EPOを用いて特異的に結合する抗体がハイブ
リドーマ培養液中に存在することを確認し、65穴の細胞
を選出した。そのうち、高い結合性を示す12穴について
ハイブリドーマの継代培養を続け、限界希釈法によりモ
ノクローン化を行い安定的に抗体生産を行うハイブリド
ーマ細胞12種を得た（なお、ハイブリドーマの産生する
抗体を4N−１〜12と命名した）。得られた12種のハイブ
リドーマ細胞を用いてマウス腹腔内で抗体生産を行い、
硫安分画、ハイドロキシアパタイトHPLC処理により精製
抗体を調製し、125I標識抗EPO抗体R4（125I−R4,比放射
活性は56μMci/μｇ）と得られた12種の抗体を用いてEP
OのサンドイッチELISA法に適した異なるエピトープの認
識の可否を検定した。この結果、９種の抗体において、
EPO濃度に比例した放射能量の増加が認められ、抗EPO抗
体R4とは異なるエピトープを認識するサンドイッチELIS
A法に有効な抗EPO抗体を得ることができた。
発明の効果 本発明の実施により、モノクローナル抗体と結合させ
た抗原蛋白質を免疫原として、あるいはモノクローナル
抗体自体を抗原として免疫した動物の脾臓細胞とエミロ
ーマ細胞の融合細胞より、使用したモノクローナル抗体
と異った抗原認識性を有するモノクローナル抗体を容易
に得ることができる。この抗体は、先の抗体と組み合わ
せて使用することによりサンドイッチELISA法などの免
疫測定用抗体として使用することができる。
た抗原蛋白質を免疫原として、あるいはモノクローナル
抗体自体を抗原として免疫した動物の脾臓細胞とエミロ
ーマ細胞の融合細胞より、使用したモノクローナル抗体
と異った抗原認識性を有するモノクローナル抗体を容易
に得ることができる。この抗体は、先の抗体と組み合わ
せて使用することによりサンドイッチELISA法などの免
疫測定用抗体として使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭60−208922（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−45228（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−241360（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−112599（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−501657（ＪＰ，Ａ) Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．74，Ｎｏ．４ （1989）ｐ．1415−1423 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】モノクロナール抗体と結合させた抗原蛋白
質を免疫原とすることによって、該モノクロナール抗体
の抗原蛋白質のエピトープとは別の認識部位をもつモノ
クロナール抗体を採取することよりなる、モノクロナー
ル抗体の作製方法。 - 【請求項２】モノクロナール抗体と結合させた抗原蛋白
質を免疫原として試験動物を免疫し、その脾臓の単細胞
を採取し、この単細胞をミエローマ細胞と細胞融合させ
これを培養し、前記抗原蛋白質の別のエピトープを認識
するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマを選
別し、これを培養して該モノクロナール抗体を採取する
ことよりなる、モノクロナール抗体の作製方法。 - 【請求項３】抗原蛋白質に対するモノクロナール抗体を
免疫原とすることによって、該モノクロナール抗体の抗
原蛋白質のエピトープとは別の認識部位をもつモノクロ
ーナル抗体を採取することよりなる、モノクロナール抗
体の作製方法。 - 【請求項４】モノクロナール抗体を免疫原として試験動
物を免疫し、その脾臓の単細胞を採取し、この単細胞を
ミエローマ細胞と細胞融合させこれを培養し、前記抗原
蛋白質の別のエピトープを認識するモノクロナール抗体
を産生するハイブリドーマを選別し、これを培養して該
モノクロナール抗体を採取することよりなる、モノクロ
ナール抗体の作製方法。 - 【請求項５】モノクロナール抗体が抗エリスロポエチン
抗体、抗原蛋白質がエリスロポエチンである請求項１乃
至４のいずれかに記載のモノクロナール抗体の作製方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02077336A JP3112463B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | モノクローナル抗体の作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02077336A JP3112463B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | モノクローナル抗体の作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03279400A JPH03279400A (ja) | 1991-12-10 |
| JP3112463B2 true JP3112463B2 (ja) | 2000-11-27 |
Family
ID=13631083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02077336A Expired - Lifetime JP3112463B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | モノクローナル抗体の作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3112463B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA035459B1 (ru) * | 2005-12-29 | 2020-06-19 | Сентокор, Инк. | Антитело против il-23p19 |
| CN109991405B (zh) * | 2017-12-29 | 2023-01-24 | 上海索昕生物科技有限公司 | 一种免疫检测试剂盒及其应用 |
-
1990
- 1990-03-27 JP JP02077336A patent/JP3112463B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．７４，Ｎｏ．４（１９８９）ｐ．１４１５−１４２３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03279400A (ja) | 1991-12-10 |
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