JPWO2013125221A1 - 抗体精製用アフィニティリガンド - Google Patents
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Abstract
抗体可変領域と特異的に結合する分子や、該分子をスクリーニングする方法を提供することを課題とし、以下を解決手段とした。i)ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー1〜7、ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー1〜6、及び、ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー1〜11の各ファミリーにおけるアミノ酸配列のアラインメントを行い、ヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列を同定する。ii)同定されたヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列を含むポリペプチドを調製し、該ポリペプチド用いて抗体可変領域と特異的に結合する分子をスクリーニングする。【選択図】なし
Description
本発明は、ヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列の同定方法や、ヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドや、ヒト抗体可変領域と特異的に結合する分子をスクリーニングする方法や、該スクリーニング方法により得られるヒト抗体可変領域と特異的に結合する分子に関する。
抗体は、特定分子に対する高い特異的結合能を有することから、生物学研究や臨床検査において広く用いられている。また、近年では、抗体そのものを治療用薬剤として治療に用いる試みが数多くなされており、特に癌細胞をターゲットとした抗体医薬の開発は非常に注目を集めている。
抗体医薬の開発のためには、大規模な抗体製造と抗体精製を行う技術が必要とされ、抗体精製のために、現在最も一般的に利用されている方法はプロテインAを用いたアフィニティクロマトグラフィー法である(非特許文献1〜3参照)。プロテインAは黄色ブドウ球菌の細胞壁由来のタンパク質であり、抗体分子のFc(定常)領域に強い結合能を持つことが知られている。定常領域には、様々な抗体分子のクラス・サブクラスを超えて共通した構造が保存されていることから、プロテインAをリガンドとして用いたアフィニティクロマトグラフィーは、抗原の異なる様々な種類の抗体分子の精製に用いることができる。
しかし、プロテインAは高価な上に、免疫原性であることが知られている(非特許文献4及び5参照)。また、プロテインAは抗体定常領域に親和性を示すが、抗体Fv(可変)領域には親和性を示さないことから、一本鎖抗体(scFv抗体)や、diabody抗体等のような、可変領域のみから構成される低分子抗体の精製には使用することができない。このため、定常領域を持たない抗体のアフィニティ精製にも利用することができる、安価で安全なリガンドの開発が求められている。
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本発明の課題は、ヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドや、抗体可変領域と特異的に結合する分子や、該分子をスクリーニングする方法を提供することにある。
一般に、抗原認識部位である可変領域は、抗体ごとに異なる多様な配列からなると考えられており、異なる抗体に共通な可変領域配列が存在することは予想されていなかった。本発明者らは、免疫関係のデータベース[the international ImMunoGeneTics information system(IMGT)]からヒト抗体タンパクの可変領域のアミノ産配列に着目し、各ファミリーごとに相同性の高い配列(コンセンサス配列)の同定を行った。すなわち、ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列データを用いて、ファミリーごとにアミノ酸配列のアラインメント解析を行い、配列番号1〜24に示されるアミノ酸配列が各ファミリーのコンセンサスアミノ酸配列であることを見いだした。さらに、このコンセンサスアミノ酸配列を含むポリペプチドを調製して、ペプチドライブラリーをファージディスプレイ法にて発現させたファージライブラリーを用い、各ファミリー別の鋳型抗体に結合するペプチド配列のスクリーニングを行い、各ファミリーのコンセンサスアミノ酸配列を特異的に認識するペプチドを同定し、本発明を完成するに至った。
本発明によれば、抗体可変領域に高親和性の分子をスクリーニングすることが可能となり、scFv抗体やdiabody抗体を含む様々な抗体の精製に利用可能な、安全で安価なリガンドの開発を行うことができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られる、抗体可変領域を特異的に認識する分子は、抗体精製のためのアフィニティリガンドとして利用できる。
また今回同定された各ファミリーに特異的なコンセンサス配列は、ペプチドライブラリーのみならず、ファージ等のスクリーニング法を用いたリガンドのスクリーニングやアプタマー等のヒト抗体用のアフィニテイリガンドの選別を行うすべての技術において、基本的な標的配列となるものであり、きわめて有用である。
ヒト抗体遺伝子は、その可変領域で使用される遺伝子レパトワの種類によっていくつかのファミリーに分類される。重鎖遺伝子(VH)は、IGHV1−7の7種類、軽鎖遺伝子(VKおよびVL)は、それぞれIGKV1−6の6種類,IGLV1−11の11種類と考えられる。抗体の可変領域の中で特に多様性の高い配列をもつCDR1,2(CDR3はここでは省く)は、抗原との結合に関与すると思われるが、それ以外のFR1−3の領域には、比較的ホモロジーの高い配列が存在する。以下、VH及びVKのファミリーごとに、ヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列を同定する方法や、同定されたアミノ酸コンセンサス配列について述べる。
本発明のヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列の同定方法としては、(a)ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー1〜7、ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー1〜6、及び、ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー1〜11の各ファミリーにおけるアミノ酸配列のアラインメントを行う工程;並びに(b)上記(a)により得られたアラインメントから、ヒト抗体可変領域の各アミノ酸位置における最も頻度の高いアミノ酸の種類を決定する工程;によりヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列を同定する方法であれば特に制限されるものではなく、かかる同定方法により、以下に示すようなアミノ酸コンセンサス配列を具体的に同定することができる。本発明は、このようにして同定されたアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドや、かかるポリペプチドをコードする核酸(DNA及びRNA)にも関する。
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー1のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、第2位のアミノ酸がV、又はMであり、第9位のアミノ酸がA、又はPであり、第14位のアミノ酸がP、L、又はTであり、第16位のアミノ酸がA、S、又はTであり、第24位のアミノ酸がA、又はVであり、第27位のアミノ酸がY、G、又はFであり、第29位のアミノ酸がF、又はLであり、第30位のアミノ酸がT、N、又はSであり、第31位のアミノ酸がG、S、E、又はYであり、第32位のアミノ酸がY、L、S又はRであり、第33位のアミノ酸がY、D、S、A、T、又はGであり、第34位のアミノ酸がM、I、V、又はLであり、第35位のアミノ酸がH、N、S、又はQであり、第38位のアミノ酸がRであり、第41位のアミノ酸がP、T、又はRであり、第42位のアミノ酸がG、又はRであり、第43位のアミノ酸がQ、又はKであり、第44位のアミノ酸がG、R、又はAであり、第48位のアミノ酸がM、又はIであり、第50位のアミノ酸がW、R、I、又はGであり、第51位のアミノ酸がI、M、F、又はSであり、第52位のアミノ酸がN、D、I、S、V、又はTであり、第53位のアミノ酸がP、A、又はVであり、第54位のアミノ酸がN、S、E、I、Y、G、又はFであり、第55位のアミノ酸がS、G、D、F、L、又はNであり、第57位のアミノ酸がG、N、S、E、T、又はIであり、第58位のアミノ酸がT、又はAであり、第59位のアミノ酸がN、G、S、I、又はKであり、第61位のアミノ酸がA、又はSであり、第63位のアミノ酸がK、又はEであり、第64位のアミノ酸がF、又はLであり、第66位のアミノ酸がG、E、又はDであり、第67位のアミノ酸がR、又はWであり、第70位のアミノ酸がM、S、又はIであり、第72位のアミノ酸がR、E、A、又はTであり、第73位のアミノ酸がD、又はNであり、第74位のアミノ酸がT、E、K、M、又はRであり、第76位のアミノ酸がI、T、A、又はMであり、第77位のアミノ酸がS、又はDであり、第79位のアミノ酸がA、又はVであり、第84位のアミノ酸がS、又はRであり、第85位のアミノ酸がR、又はSであり、第89位のアミノ酸がE、又はDである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー2のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号2に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1位のアミノ酸がQ、又はRであり、第2位のアミノ酸がI、又はVであり、第5位のアミノ酸がK、又はRであり、第10位のアミノ酸がT、A、又はVであり、第16位のアミノ酸がQ、又はEであり、第22位のアミノ酸がC、又はRであり、第23位のアミノ酸がT、又はAであり、第24位のアミノ酸がF、又はVであり、第31位のアミノ酸がT、又はNであり、第32位のアミノ酸がS、又はAであり、第33位のアミノ酸がG、又はRであり、第34位のアミノ酸がV、E、又はMであり、第35位のアミノ酸がG、W、R、又はCであり、第36位のアミノ酸がV、C、又はAであり、第37位のアミノ酸がG、又はSであり、第50位のアミノ酸がL、又はIであり、第52位のアミノ酸がL、R、又はHであり、第54位のアミノ酸がY、D、又はFであり、第55位のアミノ酸がW、又はSであり、第56位のアミノ酸がN、又はDであり、第58位のアミノ酸がD、又はEであり、第60位のアミノ酸がR、Y、F、又はSであり、第62位のアミノ酸がS、又はGであり、第63位のアミノ酸がP、又はTであり、第66位のアミノ酸がK、又はNであり、第67位のアミノ酸がS、又はTであり、第72位のアミノ酸がT、又はSであり、第78位のアミノ酸がN、又はSであり、第93位のアミノ酸がG、又はAであり、第94位のアミノ酸がT、又はVである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー3のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号3に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、第1位のアミノ酸がQ、E、又はTであり、第2位のアミノ酸がV、又はDであり、第3位のアミノ酸がQ、又はHであり、第5位のアミノ酸がV、又はLであり、第6位のアミノ酸がE、又はDであり、第7位のアミノ酸がS、又はTであり、第8位のアミノ酸がG、R、又はAであり、第10位のアミノ酸がG、V、又はAであり、第11位のアミノ酸がL、又はVであり、第12位のアミノ酸がV、又はIであり、第13位のアミノ酸がK、Q、R、又はEであり、第15位のアミノ酸がG、又はRであり、第16位のアミノ酸がG、R、又はPであり、第17位のアミノ酸がS、又はAであり、第19位のアミノ酸がR、又はKであり、第20位のアミノ酸がL、又はPであり、第23位のアミノ酸がA、又はTであり、第25位のアミノ酸がS、又はCであり、第26位のアミノ酸がG、又はAであり、第28位のアミノ酸がT、又はAであり、第30位のアミノ酸がS、D、又はGであり、第31位のアミノ酸がD、S、N、Y、又はGであり、第32位のアミノ酸がY、N、S、A、又はHであり、第33位のアミノ酸がY、S、E、D、A、V、G、T、W、又はPであり、第34位のアミノ酸がM、又はLであり、第35位のアミノ酸がS、N、H、又はDであり、第37位のアミノ酸がI、V、F、又はAであり、第38位のアミノ酸がR、又はHであり、第39位のアミノ酸がQ、R、又はKであり、第40位のアミノ酸がA、又はPであり、第41位のアミノ酸がP、T、又はSであり、第45位のアミノ酸がL、又はPであり、第46位のアミノ酸がE、又はVであり、第47位のアミノ酸がW、又はYであり、第49位のアミノ酸がS、A、又はGであり、第50位のアミノ酸がR、F、C、G、A、V、S、L、Y又はNであり、第51位のアミノ酸がI、N、V、又はTであり、第52位のアミノ酸がR、K、E、S、Y、N、W、又はGであり、第52位のアミノ酸の次に、S、又はNが挿入されており、第53位のアミノ酸の前に、Kが挿入されており、第53位のアミノ酸がA、T、W、S、G、Y、又はQ、若しくは欠失しており、第54位のアミノ酸がS、A、G、N、D、又はYであり、第55位のアミノ酸がG、又はSであり、第56位のアミノ酸がS、G、又はY、若しくは欠失しており、第57位のアミノ酸がT、A、R、S、N、E、D、又はYであり、第58位のアミノ酸がI、T、又はKであり、第59位のアミノ酸がD、E、A、S、Y、H、N、G、又はTであり、第61位のアミノ酸がA、T、G、P、又はVであり、第62位のアミノ酸がD、G、N、又はAであり、第63位のアミノ酸がS、又はPであり、第64位のアミノ酸がV、A、又はRであり、第65位のアミノ酸がK、又はMであり、第66位のアミノ酸がG、又はRであり、第67位のアミノ酸がR、又はQであり、第69位のアミノ酸がT、I、又はAであり、第73位のアミノ酸がD、V、又はEであり、第74位のアミノ酸がN、D、又はGであり、第75位のアミノ酸がS、又はAであり、第76位のアミノ酸がK、T、又はRであり、第77位のアミノ酸がN、S、又はKであり、第78位のアミノ酸がS、T、R、F、又はIであり、第79位のアミノ酸がA、又はLであり、第80位のアミノ酸がY、F、又はHであり、第81位のアミノ酸がL、V、又はQであり、第83位のアミノ酸がM、K、又はTであり、第84位のアミノ酸がN、I、S、又はGであり、第85位のアミノ酸がS、N、又はRであり、第86位のアミノ酸がL、又はRであり、第87位のアミノ酸がR、I、又はKであり、第88位のアミノ酸がT、A、P、又はDであり、第89位のアミノ酸がE、又はGであり、第90位のアミノ酸がD、又はGであり、第91位のアミノ酸がT、又はMであり、第93位のアミノ酸がV、L、又はAである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー4のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号4に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、第2位のアミノ酸がV、又はLであり、第6位のアミノ酸がE、D、又はQであり、第7位のアミノ酸がS、W、又はLであり、第9位のアミノ酸がP、S、又はAであり、第12位のアミノ酸がV、又はLであり、第16位のアミノ酸がQ、D、E、又はGであり、第23位のアミノ酸がT、又はAであり、第24位のアミノ酸がV、又はIであり、第25位のアミノ酸がS、T、又はYであり、第29位のアミノ酸がI、V、又はFであり、第30位のアミノ酸がSであり、第31位のアミノ酸がS、又はGであり、第32位のアミノ酸がG、又はSであり、第32位のアミノ酸の次に、G、S、又はDが挿入されており、第33位のアミノ酸がY、又はNであり、第34位のアミノ酸がY、S、又はWであり、第36位のアミノ酸がS、G、又はCであり、第38位のアミノ酸がI、又はVであり、第41位のアミノ酸がH、又はPであり、第42位のアミノ酸がP、L、又はAであり、第43位のアミノ酸がGであり、第44位のアミノ酸がKであり、第45位のアミノ酸がGであり、第51位のアミノ酸がY、C、S、R、又はEであり、第52位のアミノ酸がI、又はFであり、第53位のアミノ酸がY、N、又はIであり、第54位のアミノ酸がY、H、又はTであり、第58位のアミノ酸がT、又はIであり、第59位のアミノ酸がY、又はNであり、第60位のアミノ酸がY、又はNであり、第67位のアミノ酸がR、又はLであり、第68位のアミノ酸がV、A、又はIであり、第70位のアミノ酸がM、又はIであり、第74位のアミノ酸がT、K、P、又はRであり、第78位のアミノ酸がQ、又はHであり、第80位のアミノ酸がS、P、又はYであり、第82位のアミノ酸がK、又はNであり、第83位のアミノ酸がL、又はPであり、第84位のアミノ酸がS、又はGであり、第88位のアミノ酸がA、又は欠失しており、第89位のアミノ酸がA、又はVであり、第91位のアミノ酸がT、又はAであり、第92位のアミノ酸がA、又はGであり、第94位のアミノ酸がY、又はDである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー5のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号5に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号5に示されるアミノ酸配列において、第34位のアミノ酸がI、又はTであり、第42位のアミノ酸がG、又はRであり、第75位のアミノ酸がS、又はPである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー6のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号6に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号6に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)又は(ii)に示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー7のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号7に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号7に示されるアミノ酸配列において、第84位のアミノ酸がC、又はSであり、第85位のアミノ酸がS、又はTである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー1のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号8に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号8に示されるアミノ酸配列において、第1位のアミノ酸がD、A、N、又はVであり、第3位のアミノ酸がQ、W、又はRであり、第4位のアミノ酸がM、又はLであり、第5位のアミノ酸がT、又はIであり、第9位のアミノ酸がS、又はFであり、第10位のアミノ酸がT、S、A、L、又はFであり、第11位のアミノ酸がL、M、V、又はFであり、第15位のアミノ酸がV、又はTであり、第20位のアミノ酸がT、又はSであり、第22位のアミノ酸がT、I、又はSであり、第24位のアミノ酸がR、Q、又はWであり、第25位のアミノ酸がA、V、又はMであり、第26位のアミノ酸がS、又はRであり、第27位のアミノ酸がQ、又はEであり、第28位のアミノ酸がG、S、又はDであり、第30位のアミノ酸がR、又はSであり、第31位のアミノ酸がS、又はNであり、第32位のアミノ酸がW、A、Y、D、又はNであり、第34位のアミノ酸がA、N、又はGであり、第36位のアミノ酸がY、又はFであり、第37位のアミノ酸がQ、L、又はRであり、第41位のアミノ酸がG、E、又はAであり、第43位のアミノ酸がA、V、又はSであり、第45位のアミノ酸がK、又はEであり、第46位のアミノ酸がL、R、S、又はHであり、第47位のアミノ酸がL、又はFであり、第48位のアミノ酸がI、又はLであり、第50位のアミノ酸がD、K、S、A、又はYであり、第52位のアミノ酸がS、又はKであり、第53位のアミノ酸がS、N、T、又はDであり、第55位のアミノ酸がE、Q、又はHであり、第56位のアミノ酸がS、T、又はPであり、第59位のアミノ酸がP、又はSであり、第65位のアミノ酸がS、又はRであり、第70位のアミノ酸がE、又はDであり、第71位のアミノ酸がF、又はYであり、第73位のアミノ酸がL、又はFであり、第76位のアミノ酸がS、又はIであり、第77位のアミノ酸がS、N、又はCであり、第79位のアミノ酸がQ、又はKであり、第80位のアミノ酸がP、又はSであり、第81位のアミノ酸がD、又はEであり、第83位のアミノ酸がF、V、又はIであり、第85位のアミノ酸がT、又はAであり、第88位のアミノ酸がG、又はCである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー2のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号9に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号9に示されるアミノ酸配列において、第2位のアミノ酸がI、又はVであり、第7位のアミノ酸がT、又はSであり、第11位のアミノ酸がL、又はSであり、第12位のアミノ酸がS、又はPであり、第17位のアミノ酸がQ、又はEであり、第23位のアミノ酸がC、又はFであり、第24位のアミノ酸がK、又はRであり、第30位のアミノ酸がL、又はVであり、第31位のアミノ酸がH、D、又はYであり、第33位のアミノ酸がD、又はNであり、第33位のアミノ酸の次に、Dが挿入されており、第35位のアミノ酸がK、N、又はYであり、第36位のアミノ酸がT、又はNであり、第39位のアミノ酸がY、D、S、又はNであり、第40位のアミノ酸がW、又はCであり、第41位のアミノ酸がY、L、又はFであり、第42位のアミノ酸がL、又はQであり、第44位のアミノ酸がK、又はRであり、第48位のアミノ酸がS、又はPであり、第50位のアミノ酸がQ、又はRであり、第51位のアミノ酸がL、又はRであり、第55位のアミノ酸がE、L、T、又はKであり、第56位のアミノ酸がV、G、L、又はIであり、第58位のアミノ酸がS、N、又はYであり、第59位のアミノ酸がR、又はWであり、第60位のアミノ酸がF、A、又はDであり、第69位のアミノ酸がG、又はDであり、第72位のアミノ酸がS、又はAである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー3のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号10に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号10に示されるアミノ酸配列において、第4位のアミノ酸がL、又はMであり、第9位のアミノ酸がA、G、又はPであり、第13位のアミノ酸がL、又はVであり、第19位のアミノ酸がA、又はVであり、第24位のアミノ酸がR、又はGであり、第28位のアミノ酸がS、又はGであり、第32位のアミノ酸がS、又はN、若しくは欠失しており、第33位のアミノ酸がN、又は欠失しており、第35位のアミノ酸がA、T、又はSであり、第43位のアミノ酸がQ、又はLであり、第51位のアミノ酸がD、又はGであり、第54位のアミノ酸がN、S、又はTであり、第58位のアミノ酸がG、又はSであり、第61位のアミノ酸がA、又はDであり、第68位のアミノ酸がS、又はPであり、第70位のアミノ酸がT、又はRであり、第71位のアミノ酸がD、又はEであり、第78位のアミノ酸がS、又はRであり、第80位のアミノ酸がE、又はQであり、第81位のアミノ酸がP、又はSである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー4のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号11に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号11に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)又は(ii)に示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー5のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号12に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号12に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)又は(ii)に示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー6のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号13に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号13に示されるアミノ酸配列において、第1位のアミノ酸がE、又はDであり、第2位のアミノ酸がI、又はVであり、第4位のアミノ酸がL、又はMであり、第9位のアミノ酸がD、又はAであり、第11位のアミノ酸がQ、又はLであり、第16位のアミノ酸がK、又はGであり、第24位のアミノ酸がR、又はQであり、第27位のアミノ酸がQ、又はEであり、第28位のアミノ酸がS、又はGであり、第31位のアミノ酸がS、又はNであり、第32位のアミノ酸がS、又はYであり、第34位のアミノ酸がH、又はYであり、第43位のアミノ酸がS、又はAであり、第55位のアミノ酸がF、又はIであり、第73位のアミノ酸がL、又はFであり、第76位のアミノ酸がN、又はSである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示する
ことができる。
ことができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー1のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号14に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号14に示されるアミノ酸配列において、第4位のアミノ酸がL、又はVであり、第10位のアミノ酸がA、又はVであり、第12位のアミノ酸がG、E、又はAであり、第13位のアミノ酸がT、又はAであり、第15位のアミノ酸がG、又はRであり、第17位のアミノ酸がR、又はKであり、第23位のアミノ酸がS、又はTであり、第28位のアミノ酸がN、又はDであり、第29位のアミノ酸がI、又はMであり、第31位のアミノ酸がS、N、又はAであり、第31位のアミノ酸の次に、Gが挿入されており、第32位のアミノ酸がN、又はYであり、第33位のアミノ酸がY、A、D、又はTであり、第35位のアミノ酸がY、N、H、又はSであり、第43位のアミノ酸がT、又はKであり、第51位のアミノ酸がR、S、Y、G、D、又はEであり、第52位のアミノ酸がN、又はDであり、第53位のアミノ酸がN、D、又はSであり、第54位のアミノ酸がQ、L、N、又はKであり、第55位のアミノ酸がR、又はLであり、第59位のアミノ酸がV、又はIであり、第60位のアミノ酸がP、又はSであり、第62位のアミノ酸がR、又はQであり、第70位のアミノ酸がT、又はAであり、第73位のアミノ酸がS、又はTであり、第75位のアミノ酸がA、又はGであり、第77位のアミノ酸がS、又はTであり、第80位のアミノ酸がR、Q、又はWであり、第81位のアミノ酸がS、A、T、又はPであり、第82位のアミノ酸がE、又はGである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー2のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号15に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号15に示されるアミノ酸配列において、第8位のアミノ酸がP、A、又はRであり、第9位のアミノ酸がS、又はFであり、第10位のアミノ酸がA、又はVであり、第12位のアミノ酸がG、又はRであり、第13位のアミノ酸がS、又はAであり、第18位のアミノ酸がV、又はIであり、第31位のアミノ酸がG、S、又はDであり、第33位のアミノ酸がN、又はDであり、第34位のアミノ酸がY、L、R、又はHであり、第36位のアミノ酸がS、又はFであり、第40位のアミノ酸がQ、又はKであり、第41位のアミノ酸がH、P、又はRであり、第42位のアミノ酸がP、又はLであり、第43位のアミノ酸がG、又はSであり、第44位のアミノ酸がK、又はTであり、第45位のアミノ酸がA、又はTであり、第46位のアミノ酸がP、又はSであり、第47位のアミノ酸がK、又はRであり、第49位のアミノ酸がM、又はLであり、第52位のアミノ酸がE、D、又はNであり、第53位のアミノ酸がV、又はGであり、第54位のアミノ酸がS、又はNであり、第55位のアミノ酸がK、N、又はTであり、第60位のアミノ酸がV、又はIであり、第61位のアミノ酸がP、又はSであり、第62位のアミノ酸がD、又はNであり、第63位のアミノ酸がR、又はLであり、第64位のアミノ酸がF、又はSであり、第65位のアミノ酸がS、又はFであり、第72位のアミノ酸がT、M、又はVであり、第77位のアミノ酸がV、I、又はTであり、第81位のアミノ酸がQ、又はKであり、第82位のアミノ酸がA、又はSであり、第84位のアミノ酸がD、又はVであり、第87位のアミノ酸がD、又はNであり、第89位のアミノ酸がY、又はHである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示する
ことができる。
ことができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー3のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号16に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号16に示されるアミノ酸配列において、第2位のアミノ酸がY、又はSであり、第3位のアミノ酸がE、V、又はGであり、第4位のアミノ酸がL、又はPであり、第5位のアミノ酸がT、又はMであり、第7位のアミノ酸がP、L、D、又はVであり、第8位のアミノ酸がL、H、P、又はSであり、第9位のアミノ酸がS、又はAであり、第13位のアミノ酸がA、又はSであり、第14位のアミノ酸がL、T、又はPであり、第15位のアミノ酸がG、又はAであり、第16位のアミノ酸がQ、又はKであり、第17位のアミノ酸がT、A、又はMであり、第18位のアミノ酸がA、又はVであり、第19位のアミノ酸がR、又はSであり、第23位のアミノ酸がG、S、又はQであり、第25位のアミノ酸がN、D、又はEであり、第26位のアミノ酸がN、A、V、K、又はSであり、第27位のアミノ酸がI、L、又はMであり、第28位のアミノ酸がG、P、A、R、又はEであり、第29位のアミノ酸がS、Y、K、E、D、又はGであり、第30位のアミノ酸がK、Q、N、Y、又はSであり、第31位のアミノ酸がN、S、A、又はYであり、第32位のアミノ酸がV、A、又はEであり、第33位のアミノ酸がH、Y、R、D、C、又はSであり、第35位のアミノ酸がY、又はFであり、第39位のアミノ酸がP、又はSであり、第42位のアミノ酸がA、D、F、又はSであり、第44位のアミノ酸がV、又はEであり、第47位のアミノ酸がI、又はVであり、第49位のアミノ酸がR、S、D、K、E、Q、G、又はYであり、第50位のアミノ酸がD、K、又はSであり、第51位のアミノ酸がS、又はNであり、第52位のアミノ酸がN、D、E、又はKであり、第54位のアミノ酸がP、又はYであり、第55位のアミノ酸がS、又はPであり、第56位のアミノ酸がG、又はRであり、第59位のアミノ酸がE、又はDであり、第65位のアミノ酸がN、S、T、又はKであり、第66位のアミノ酸がS、又はPであり、第68位のアミノ酸がN、又はTであり、第69位のアミノ酸がT、I、又はMであり、第70位のアミノ酸がA、T、又はVであり、第71位のアミノ酸がT、又はSであり、第75位のアミノ酸がS、又はTであり、第76位のアミノ酸がR、又はGであり、第77位のアミノ酸がA、I、V、又はTであり、第78位のアミノ酸がQ、E、又はLであり、第79位のアミノ酸がA、V、又はTであり、第80位のアミノ酸がG、E、又はMであり、第83位のアミノ酸がA、又はDであり、第87位のアミノ酸がC、又はYである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー4のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号17に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号17に示されるアミノ酸配列において、第1位のアミノ酸がQ、又はLであり、第2位のアミノ酸がP、又はLであり、第7位のアミノ酸がS、又はPであり、第8位のアミノ酸がS、又はPであり、第13位のアミノ酸がS、又はLであり、第16位のアミノ酸がS、又はAであり、第18位のアミノ酸がV、又はIであり、第27位のアミノ酸がG、又はEであり、第30位のアミノ酸がS、又はTであり、第32位のアミノ酸がI、A、又はTであり、第34位のアミノ酸がA、又はEであり、第36位のアミノ酸がH、又はYであり、第39位のアミノ酸がQ、又はRであり、第41位のアミノ酸がG、又はEであり、第42位のアミノ酸がK、又はRであり、第43位のアミノ酸がA、G、又はSであり、第45位のアミノ酸がR、又はQであり、第47位のアミノ酸がL、又はIであり、第50位のアミノ酸がL、又はVであり、第51位のアミノ酸がE、N、又はKであり、第52位のアミノ酸がG、又はSであり、第53位のアミノ酸がS、又はDであり、第56位のアミノ酸がY、又はHであり、第57位のアミノ酸がN、又はSであり、第60位のアミノ酸がS、又はDであり、第62位のアミノ酸がV、又はIであり、第67位のアミノ酸がS、又はMであり、第74位のアミノ酸がD、又はEであり、第79位のアミノ酸がI、又はFであり、第81位のアミノ酸がN、又はSであり、第84位のアミノ酸がL、F、又はSであり、第85位のアミノ酸がE、又はDであり、第89位のアミノ酸がD、又はEであり、第91位のアミノ酸がY、又はHである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー5のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号18に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号18に示されるアミノ酸配列において、第2位のアミノ酸がA、又はPであり、第8位のアミノ酸がS、A、T、又はPであり、第10位のアミノ酸がL、S、又はHであり、第14位のアミノ酸がP、又はSであり、第16位のアミノ酸がA、又はEであり、第18位のアミノ酸がA、又はVであり、第19位のアミノ酸がS、又はRであり、第20位のアミノ酸がL、又はFであり、第23位のアミノ酸がT、又はMであり、第25位のアミノ酸がR、S、又はPであり、第27位のアミノ酸がG、又はDであり、第28位のアミノ酸がI、又はFであり、第29位のアミノ酸がN、又はSであり、第30位のアミノ酸がV、又はLであり、第32位のアミノ酸がT、S、又はDであり、第33位のアミノ酸がY、又はFであり、第34位のアミノ酸がR、N、又はWであり、第36位のアミノ酸がY、F、又はRであり、第41位のアミノ酸がK、又はNであり、第43位のアミノ酸がG、又はEであり、第44位のアミノ酸がS、又はNであり、第45位のアミノ酸がP、又はLであり、第47位のアミノ酸がQ、又はRであり、第51位のアミノ酸がR、S、又はYであり、第53位のアミノ酸がK、Y、又はHであり、第57位のアミノ酸がD、S、又はNであり、第59位のアミノ酸がQ、H、又はGであり、第72位のアミノ酸がK、又はNであり、第76位のアミノ酸がA、T、又はSであり、第78位のアミノ酸がA、又はTであり、第80位のアミノ酸がI、又はLであり、第82位のアミノ酸がL、V、又はRであり、第88位のアミノ酸がS、又はPである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー6のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号19に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号19に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)又は(ii)に示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー7のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号20に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号20に示されるアミノ酸配列において、第2位のアミノ酸がA、又はTであり、第23位のアミノ酸がG、又はAであり、第33位のアミノ酸がH、又はYであり、第36位のアミノ酸がY、又はNであり、第48位のアミノ酸がT、又はAであり、第52位のアミノ酸がD、又はSであり、第78位のアミノ酸がS、又はLであり、第80位のアミノ酸がA、又はVである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー8のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号21に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号21に示されるアミノ酸配列において、第63位のアミノ酸がR、又はCである配列;(iii)上記(i)又は(ii
)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー9のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号22に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号22に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)又は(ii)に示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー10のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号23に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号23に示されるアミノ酸配列において、第28位のアミノ酸がN、又はIであり、第37位のアミノ酸がL、又はPであり、第38位のアミノ酸がQ、又はEであり、第63位のアミノ酸がL、又はFである配列;(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)〜(iii)のいずれかに示される配列を好適に例示することができる。
ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー11のアミノ酸コンセンサス配列としては、例えば、(i)配列番号24に示されるアミノ酸配列;(ii)配列番号24に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列;の(i)又は(ii)に示される配列を好適に例示することができる。
上記したように、各ヒト抗体は、VHおよびVKごとに使用しているファミリーの種類が規定されており、使用されている各ファミリーの頻度では、VHではIGHV3やIGHV4が、VKではIGKV1の頻度が高いといわれている。例えば、ヒト癌遺伝子HER2/neu(c-erbB-2)の遺伝子産物であるHER2蛋白に特異的に結合することで抗腫瘍効果を発揮する抗HER2ヒト化モノクローナル抗体であるハーセプチン(登録商標、一般名;トラスツズマブ)の場合は、IGHV3とIGKV1が使用され、抗血管内皮細胞増殖因子(VEGF)に対するヒト化モノクローナル抗体であるアバスチン(登録商標、一般名;ベバシズマブ)の場合は、IGHV7とIGKV1が使用され、慢性リンパ性白血病治療薬であるヒト化抗CD52モノクローナル抗体であるマブキャンパス(登録商標、一般名;アレムツズマブ)の場合は、IGHV4とIGKV1が使用され、上皮成長因子受容体に対するヒトモノクローナル抗体であるベクチビックス(登録商標、一般名;パニツムマブ)の場合は、IGHV4とIGKV1が使用される。したがって、個々のヒト(ヒト化)抗体ごとにファミリーにマッチさせたヒト抗体可変領域と特異的に結合するペプチド等の分子をスクリーニングすることによって、各種のヒト(ヒト化)抗体の精製に利用可能なリガンドを汎用的に得ることができる。また、かかるリガンドを使用すれば、さまざまな定常領域をもたない低分子抗体を含め、ヒト抗体の選別に汎用的に使用できる技術となり、その有用性は非常に高い。以下、ヒト抗体可変領域と特異的に結合する分子をスクリーニングする方法や、スクリーニングで得られるペプチドについて述べる。
本発明のヒト抗体可変領域と特異的に結合する分子をスクリーニングする方法としては、(a)本発明のヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドを含むスクリーニング用ポリペプチドを調製する工程;(b)上記工程(a)により調製されたポリペプチドと被検物質とを接触させ、上記ポリペプチドと結合する被検物質を選択する工程;を順次備えることを特徴とするスクリーニング方法であれば特に制限されず、上記工程(a)において、上記本発明のアミノ酸コンセンサス配列を含むスクリーニング用ポリペプチドを調製する方法としては、上記スクリーニング用ポリペプチドのアミノ酸配列に従って一般的な化学合成法により調製してもよいし、上記スクリーニング用ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を基に、遺伝子工学的手法を用いて調製してもよいが、遺伝子工学的手法を用いて調製することが好ましく、また、調製された上記スクリーニング用ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、向流分配法等の通常の方法に従って精製することが好ましい。上記スクリーニング用ポリペプチドとしては、本発明のヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドを含むものであれば特に制限されないが、ヒト抗体可変領域の立体構造を形成させるために、上記ヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドのC末端に、ヒト抗体可変領域のCDR3領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドが付加されたものであることが好ましく、また、上記スクリーニング用ポリペプチドは、調製や精製に用いるためのマーカー配列やタグ配列を、さらに含むものであってもよい。
上記工程(b)としては、上記工程(a)により調製されたヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列を含むポリペプチドと被検物質とを接触させ、上記ヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列を含むポリペプチドと特異的に結合する被検物質を選択する工程であれば特に制限されるものではないが、上記ポリペプチドと被検物質とを適当な液体中で接触させることが好ましく、具体的には、上記ポリペプチドと被検物質とをPBS等の適当な緩衝液中でインキュベートして接触させることが好ましい。また、上記「被検物質」としては、特に制限されないが、具体的には、ペプチド、タンパク質、核酸、糖、低分子化合物等を好適に例示することができ、なかでも、ペプチドであることが好ましい。上記工程(b)において、被検物質がペプチドである場合には、例えば、ファージディスプレイ法(Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317, 1985)を用いて、上記本発明のポリペプチドと結合するペプチドを選択することができる。ファージディスプレイ法は、ファージの外殻タンパク質にランダムなアミノ酸配列を有するペプチド(通常、アミノ酸数5〜12個程度)を、融合タンパク質として提示させたファージライブラリを用いてスクリーニングする方法であり、ファージライブラリは、Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317 (1985)、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390 (1990)等に記載された方法にしたがって、ランダム化したDNAを化学合成してファージDNAの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このDNAを大腸菌に導入することにより調製することができる。また、例えば、Phage Display Peptide Library Kit(New England Biolab社製)等の市販のファージライブラリを用いることもできる。スクリーニングにより得られたヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列を含むポリペプチドと特異的に結合する被検物質は、さらにヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列との親和性を調べることもでき、例えばELISA法やSPR解析などの公知の手法を用いることができる。
また、本発明のヒト抗体可変領域と特異的に結合する分子としては、上記本発明のスクリーニング方法により得られる分子であれば特に制限されず、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、糖、低分子化合物等を挙げることができるが、ペプチドであることが好ましい。かかるペプチドとして具体的には、配列番号32〜47や、配列番号66〜304を挙げることができ、中でも配列番号32、66、69、71、78、80、82、83、85、87、90、92、94〜100、及び104〜304に示されるアミノ酸配列の他、上記アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを好適に例示することができる。本発明のヒト抗体可変領域と特異的に結合する分子は、抗体、中でも定常領域をもたない抗体、例えば一本鎖抗体(scFv抗体)や、diabody抗体等のような、可変領域のみから構成される低分子抗体とも結合することができ、抗体精製のためのアフィニティリガンドとして有用である。本発明のヒト抗体可変領域と特異的に結合するリガンドペプチドは、バクテリア由来ではないため、バクテリア由来のプロテインAと異なり安全である上に、安価に調製することができ、免疫原性も低いという利点を有する。
上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、1〜5個、好ましくは1〜4個、より好ましくは1〜3個、特に1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を挙げることができる。
明確な三次元構造を持つ一本鎖核酸で、抗体と似た方法で標的分子と結びつくことができ、免疫原性(抗体を作らせる性質)がほとんどないアプタマーは、核酸医薬の一種として、血管新生因子を標的とした加齢性黄斑変性症治療薬のマクゲン(Macugen;登録商標)等を代表に開発が進んでいる。アプタマーのもう一つの用途として注目されるのが、ヒトIgG特異的に結合するRNAアプタマーの性質を利用した、抗体精製用分離剤である。精製時に酸性条件下での溶出を要するため、抗体の失活・凝集を指摘されるプロテインA樹脂精製法に代わり、アプタマー樹脂は抗体を中性で溶出出来ることを最大の特徴とする。このため、今回同定されたアミノ酸コンセンサス配列情報、特にアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドをコードするRNAを、抗体精製用分離アプタマー剤に応用すれば、工業生産レベルに高効率な抗体精製用分離剤として、新規抗体医薬品の実用化に寄与する。その他、本発明のアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドをコードするDNAは、アミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドを遺伝子工学的に調製する上で有用である。
[ヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域のコンセンサス配列の決定]
IMGT Database(http://imgt.cines.fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入手して、以下に示すように、ファミリーごとにアミノ酸配列のアラインメント解析を行った。
IMGT Database(http://imgt.cines.fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入手して、以下に示すように、ファミリーごとにアミノ酸配列のアラインメント解析を行った。
<ヒト抗体重鎖>
ヒト抗体重鎖IGHV1(31種):
IGHV1−2−02、IGHV1−2−04、IGHV1−2−03、IGHV1−2−01、IGHV1−8−01、IGHV1−46−01、IGHV1−46−03、IGHV1−46−02、IGHV1−24−01、IGHV1−69−03、IGHV1−69−13、IGHV1−69−12、IGHV1−69−01、IGHV1−96−07、IGHV1−69−11、IGHV1−69−05、IGHV1−69−06、IGHV1−69−02、IGHV1−69−08、IGHV1−96−04、IGHV1−69−09、IGHV1−69−10、IGHV1−18−01、IGHV1−18−02、IGHV1−3−01、IGHV1−3−02、IGHV1−58−01、IGHV1−58−02、IGHV1−45−01、IGHV1−45−03、IGHV1−45−02。
ヒト抗体重鎖IGHV1(31種):
IGHV1−2−02、IGHV1−2−04、IGHV1−2−03、IGHV1−2−01、IGHV1−8−01、IGHV1−46−01、IGHV1−46−03、IGHV1−46−02、IGHV1−24−01、IGHV1−69−03、IGHV1−69−13、IGHV1−69−12、IGHV1−69−01、IGHV1−96−07、IGHV1−69−11、IGHV1−69−05、IGHV1−69−06、IGHV1−69−02、IGHV1−69−08、IGHV1−96−04、IGHV1−69−09、IGHV1−69−10、IGHV1−18−01、IGHV1−18−02、IGHV1−3−01、IGHV1−3−02、IGHV1−58−01、IGHV1−58−02、IGHV1−45−01、IGHV1−45−03、IGHV1−45−02。
ヒト抗体重鎖IGHV2(24種):
IGHV2−5−04、IGHV2−5−07、IGHV2−5−01、IGHV2−5−03、IGHV2−5−10、IGHV2−5−05、IGHV2−5−06、IGHV2−5−09、IGHV2−5−02、IGHV2−5−08、IGHV2−70−01、IGHV2−70−13、IGHV2−70−02、IGHV2−70−07、IGHV2−70−08、IGHV2−70−11、IGHV2−70−03、IGHV2−70−06、IGHV2−70−05、IGHV2−70−04、IGHV2−70−10、IGHV2−70−09、IGHV2−70−12、IGHV2−26−01。
IGHV2−5−04、IGHV2−5−07、IGHV2−5−01、IGHV2−5−03、IGHV2−5−10、IGHV2−5−05、IGHV2−5−06、IGHV2−5−09、IGHV2−5−02、IGHV2−5−08、IGHV2−70−01、IGHV2−70−13、IGHV2−70−02、IGHV2−70−07、IGHV2−70−08、IGHV2−70−11、IGHV2−70−03、IGHV2−70−06、IGHV2−70−05、IGHV2−70−04、IGHV2−70−10、IGHV2−70−09、IGHV2−70−12、IGHV2−26−01。
ヒト抗体重鎖IGHV3(87種):
IGHV3−11−01、IGHV3−11−03、IGHV3−21−01、IGHV3−21−02、IGHV3−48−01、IGHV3−48−02、IGHV3−48−03、IGHV3−13−01、IGHV3−13−03、IGHV3−13−02、IGHV3−47−01、IGHV3−47−02、IGHV3−9−01、IGHV3−20−01、IGHV3−43−01、IGHV3−43−02、IGHV3−7−01、IGHV3−7−02、IGHV3−30−3−01、IGHV3−30−3−02、IGHV3−30−17、IGHV3−30−16、IGHV3−30−14、IGHV3−30−11、IGHV3−30−07、IGHV3−30−04、IGHV3−30−01、IGHV3−30−08、IGHV3−30−09、IGHV3−30−15、IGHV3−30−01、IGHV3−30−08、IGHV3−30−09、IGHV3−30−15、IGHV3−30−10、IGHV3−30−03、IGHV3−30−06、IGHV3−30−12、IGHV3−30−18、IGHV3−30−19、IGHV3−33−01、IGHV3−33−03、IGHV3−33−04、IGHV3−33−02、IGHV3−30−02、IGHV3−74−01、IGHV3−74−02、IGHV3−74−03、IGHV3−23−01、IGHV3−23−02、IGHV3−23−04、IGHV3−23−03、IGHV3−23−05、IGHV3−38−01、IGHV3−38−02、IGHV3−d−01、IGHV3−53−01、IGHV3−53−03、IGHV3−53−02、IGHV3−66−01、IGHV3−66−02、IGHV3−64−01、IGHV3−64−02、IGHV3−64−03、IGHV3−64−05、IGHV3−64−04、IGHV3−16−01、IGHV3−16−02、IGHV3−19−01、IGHV3−35−01、IGHV3−15−01、IGHV3−15−05、IGHV3−15−02、IGHV3−15−07、IGHV3−15−04、IGHV3−15−06、IGHV3−15−03、IGHV3−15−08、IGHV3−49−03、IGHV3−49−05、IGHV3−49−01、IGHV3−49−04、IGHV3−49−02、IGHV3−72−01、IGHV3−72−02、IGHV3−73−01、IGHV3−73−02。
IGHV3−11−01、IGHV3−11−03、IGHV3−21−01、IGHV3−21−02、IGHV3−48−01、IGHV3−48−02、IGHV3−48−03、IGHV3−13−01、IGHV3−13−03、IGHV3−13−02、IGHV3−47−01、IGHV3−47−02、IGHV3−9−01、IGHV3−20−01、IGHV3−43−01、IGHV3−43−02、IGHV3−7−01、IGHV3−7−02、IGHV3−30−3−01、IGHV3−30−3−02、IGHV3−30−17、IGHV3−30−16、IGHV3−30−14、IGHV3−30−11、IGHV3−30−07、IGHV3−30−04、IGHV3−30−01、IGHV3−30−08、IGHV3−30−09、IGHV3−30−15、IGHV3−30−01、IGHV3−30−08、IGHV3−30−09、IGHV3−30−15、IGHV3−30−10、IGHV3−30−03、IGHV3−30−06、IGHV3−30−12、IGHV3−30−18、IGHV3−30−19、IGHV3−33−01、IGHV3−33−03、IGHV3−33−04、IGHV3−33−02、IGHV3−30−02、IGHV3−74−01、IGHV3−74−02、IGHV3−74−03、IGHV3−23−01、IGHV3−23−02、IGHV3−23−04、IGHV3−23−03、IGHV3−23−05、IGHV3−38−01、IGHV3−38−02、IGHV3−d−01、IGHV3−53−01、IGHV3−53−03、IGHV3−53−02、IGHV3−66−01、IGHV3−66−02、IGHV3−64−01、IGHV3−64−02、IGHV3−64−03、IGHV3−64−05、IGHV3−64−04、IGHV3−16−01、IGHV3−16−02、IGHV3−19−01、IGHV3−35−01、IGHV3−15−01、IGHV3−15−05、IGHV3−15−02、IGHV3−15−07、IGHV3−15−04、IGHV3−15−06、IGHV3−15−03、IGHV3−15−08、IGHV3−49−03、IGHV3−49−05、IGHV3−49−01、IGHV3−49−04、IGHV3−49−02、IGHV3−72−01、IGHV3−72−02、IGHV3−73−01、IGHV3−73−02。
ヒト抗体重鎖IGHV4(72種):
IGHV4−31−09、IGHV4−31−10、IGHV4−31−07、IGHV4−31−08、IGHV4−31−01、IGHV4−31−03、IGHV4−31−02、IGHV4−31−04、IGHV4−31−06、IGHV4−30−2−01、IGHV4−30−2−02、IGHV4−30−2−04、IGHV4−30−2−03、IGHV4−30−4−03、IGHV4−30−4−04、IGHV4−30−4−01、IGHV4−30−4−05、IGHV4−30−4−06、IGHV4−30−4−02、IGHV4−31−05、IGHV4−61−04、IGHV4−59−02、IGHV4−61−08、IGHV4−61−06、IGHV4−61−07、IGHV4−61−01、IGHV4−61−03、IGHV4−59−01、IGHV4−59−03、IGHV4−59−07、IGHV4−59−09、IGHV4−59−08、IGHV4−59−04、IGHV4−59−06、IGHV4−59−05、IGHV4−39−04、IGHV4−39−05、IGHV4−39−03、IGHV4−39−01、IGHV4−39−07、IGHV4−39−06、IGHV4−39−02、IGHV4−61−05、IGHV4−4−07、IGHV4−61−02、IGHV4−34−01、IGHV4−34−13、IGHV4−34−02、IGHV4−34−03、IGHV4−34−06、IGHV4−34−07、IGHV4−34−08、IGHV4−34−04、IGHV4−34−05、IGHV4−34−12、IGHV4−34−11、IGHV4−59−10、IGHV4−34−09、IGHV4−34−10、IGHV4−b−01、IGHV4−b−02、IGHV4−4−03、GHV4−4−04、GHV4−4−05、GHV4−4−01、GHV4−4−06、GHV4−4−02、GHV4−28−01、GHV4−28−04、GHV4−28−03、GHV4−28−02、GHV4−28−05。
ヒト抗体重鎖IGHV5(5種):
IGHV5−51−02、IGHV5−51−04、IGHV5−51−03、IGHV5−51−01、IGHV5−51−05。
ヒト抗体重鎖IGHV6(2種):
IGHV6−1−01、IGHV6−1−02。
ヒト抗体重鎖IGHV7(3種):
IGHV7−4−1−01、IGHV7−4−1−02、IGHV7−4−1−03。
IGHV4−31−09、IGHV4−31−10、IGHV4−31−07、IGHV4−31−08、IGHV4−31−01、IGHV4−31−03、IGHV4−31−02、IGHV4−31−04、IGHV4−31−06、IGHV4−30−2−01、IGHV4−30−2−02、IGHV4−30−2−04、IGHV4−30−2−03、IGHV4−30−4−03、IGHV4−30−4−04、IGHV4−30−4−01、IGHV4−30−4−05、IGHV4−30−4−06、IGHV4−30−4−02、IGHV4−31−05、IGHV4−61−04、IGHV4−59−02、IGHV4−61−08、IGHV4−61−06、IGHV4−61−07、IGHV4−61−01、IGHV4−61−03、IGHV4−59−01、IGHV4−59−03、IGHV4−59−07、IGHV4−59−09、IGHV4−59−08、IGHV4−59−04、IGHV4−59−06、IGHV4−59−05、IGHV4−39−04、IGHV4−39−05、IGHV4−39−03、IGHV4−39−01、IGHV4−39−07、IGHV4−39−06、IGHV4−39−02、IGHV4−61−05、IGHV4−4−07、IGHV4−61−02、IGHV4−34−01、IGHV4−34−13、IGHV4−34−02、IGHV4−34−03、IGHV4−34−06、IGHV4−34−07、IGHV4−34−08、IGHV4−34−04、IGHV4−34−05、IGHV4−34−12、IGHV4−34−11、IGHV4−59−10、IGHV4−34−09、IGHV4−34−10、IGHV4−b−01、IGHV4−b−02、IGHV4−4−03、GHV4−4−04、GHV4−4−05、GHV4−4−01、GHV4−4−06、GHV4−4−02、GHV4−28−01、GHV4−28−04、GHV4−28−03、GHV4−28−02、GHV4−28−05。
ヒト抗体重鎖IGHV5(5種):
IGHV5−51−02、IGHV5−51−04、IGHV5−51−03、IGHV5−51−01、IGHV5−51−05。
ヒト抗体重鎖IGHV6(2種):
IGHV6−1−01、IGHV6−1−02。
ヒト抗体重鎖IGHV7(3種):
IGHV7−4−1−01、IGHV7−4−1−02、IGHV7−4−1−03。
<ヒト抗体κ軽鎖>
ヒト抗体κ軽鎖IGKV1(28種):
IGKV1−5−01、IGKV1−5−02、IGKV1−5−03、IGKV1−13−02、IGKV1D−13−01、IGKV1−37−01、IGKV1D−37−01、IGKV1−27−01、IGKV1−33−01、IGKV1D−33−01、IGKV1−39−01、IGKV1D−39−01、IGKV1−17−01、IGKV1−17−02、IGKV1−6−01、IGKV1−16−01、IGKV1−17−01、IGKV1−12−01、IGKV1−12−02、IGKV1D−12−01、IGKV1D−12−02、IGKV1D−16−01、IGKV1D−16−02、IGKV1−8−01、IGKV1D−8−01、IGKV1−9−01、IGKV1D−43−01、IGKV1D−42−01。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV1(28種):
IGKV1−5−01、IGKV1−5−02、IGKV1−5−03、IGKV1−13−02、IGKV1D−13−01、IGKV1−37−01、IGKV1D−37−01、IGKV1−27−01、IGKV1−33−01、IGKV1D−33−01、IGKV1−39−01、IGKV1D−39−01、IGKV1−17−01、IGKV1−17−02、IGKV1−6−01、IGKV1−16−01、IGKV1−17−01、IGKV1−12−01、IGKV1−12−02、IGKV1D−12−01、IGKV1D−12−02、IGKV1D−16−01、IGKV1D−16−02、IGKV1−8−01、IGKV1D−8−01、IGKV1−9−01、IGKV1D−43−01、IGKV1D−42−01。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV2(13種):
IGKV2−29−02、IGKV2−29−03、IGKV2D−29−02、IGKV2D−29−01、IGKV2−28−01、IGKV2D−28−01、IGKV2−40−01、IGKV2−40−02、IGKV2D−40−01、IGKV2−24−01、IGKV2D−24−02、IGKV2−30−01、IGKV2D−30−01。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV3(12種):
IGKV3−11−01、IGKV3D−11−01、IGKV3−11−02、IGKV3−20−01、IGKV3D−20−01、IGKV3−20−02、IGKV3−7−01、IGKV3−7−03、IGKV3−7−02、IGKV3D−7−01、IGKV3−15−01、IGKV3D−15−01。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV4(1種):
IGKV4−1。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV5(1種):
IGKV5−2。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV6(3種):
IGKV6−21、IGKV6D−21、IGKV6D−41。
IGKV2−29−02、IGKV2−29−03、IGKV2D−29−02、IGKV2D−29−01、IGKV2−28−01、IGKV2D−28−01、IGKV2−40−01、IGKV2−40−02、IGKV2D−40−01、IGKV2−24−01、IGKV2D−24−02、IGKV2−30−01、IGKV2D−30−01。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV3(12種):
IGKV3−11−01、IGKV3D−11−01、IGKV3−11−02、IGKV3−20−01、IGKV3D−20−01、IGKV3−20−02、IGKV3−7−01、IGKV3−7−03、IGKV3−7−02、IGKV3D−7−01、IGKV3−15−01、IGKV3D−15−01。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV4(1種):
IGKV4−1。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV5(1種):
IGKV5−2。
ヒト抗体κ軽鎖IGKV6(3種):
IGKV6−21、IGKV6D−21、IGKV6D−41。
<ヒト抗体λ軽鎖>
ヒト抗体λ軽鎖IGLV1(11種):
IGLV1−47−01、IGLV1−47−02、IGLV1−44−01、IGLV1−36−01、IGLV1−40−02、IGLV1−40−03、IGLV1−40−01、IGLV1−50−01、IGLV1−51−01、IGLV1−52−02、IGLV1−41−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV2(20種):
IGLV2−8−01、IGLV2−8−03、IGLV2−8−02、IGLV2−11−01、IGLV2−11−02、IGLV2−11−03、IGLV2−14−03、IGLV2−14−04、IGLV2−14−01、IGLV2−14−02、IGLV2−23−01、IGLV2−23−03、IGLV2−23−02、IGLV2−18−02、IGLV2−18−04、IGLV2−18−01、IGLV2−18−03、IGLV2−33−01、IGLV2−33−02、IGLV2−33−03。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV3(18種):
IGLV3−9−01、IGLV3−9−02、IGLV3−12−01、IGLV3−12−02、IGLV3−21−02、IGLV3−21−03、IGLV3−21−01、IGLV3−25−02、IGLV3−25−03、IGLV3−25−01、IGLV3−16−01、IGLV3−10−01、IGLV3−10−02、IGLV3−27−01、IGLV3−22−01、IGLV3−1−01、IGLV3−19−01、IGLV3−32−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV4(6種):
IGLV4−60−01、IGLV4−60−02、IGLV4−60−03、IGLV4−69−01、IGLV4−69−02、IGLV4−3−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV5(8種):
IGLV5−45−02、IGLV5−45−03、IGLV5−45−01、IGLV5−39−01、IGLV5−39−02、IGLV5−48−01、IGLV5−37−01、IGLV5−52−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV6(1種):
IGLV6−57−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV7(3種):
IGLV7−46−01、IGLV7−46−02、IGLV7−43−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV8(3種):
IGLV8−61−01、IGLV8−61−03、IGLV8−61−02。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV9(3種):
IGLV9−49−01、IGLV9−49−03、IGLV9−49−02。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV10(3種):
IGLV10−54−01、IGLV10−54−03、IGLV10−54−02。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV11(1種):
IGLV11−55−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV1(11種):
IGLV1−47−01、IGLV1−47−02、IGLV1−44−01、IGLV1−36−01、IGLV1−40−02、IGLV1−40−03、IGLV1−40−01、IGLV1−50−01、IGLV1−51−01、IGLV1−52−02、IGLV1−41−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV2(20種):
IGLV2−8−01、IGLV2−8−03、IGLV2−8−02、IGLV2−11−01、IGLV2−11−02、IGLV2−11−03、IGLV2−14−03、IGLV2−14−04、IGLV2−14−01、IGLV2−14−02、IGLV2−23−01、IGLV2−23−03、IGLV2−23−02、IGLV2−18−02、IGLV2−18−04、IGLV2−18−01、IGLV2−18−03、IGLV2−33−01、IGLV2−33−02、IGLV2−33−03。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV3(18種):
IGLV3−9−01、IGLV3−9−02、IGLV3−12−01、IGLV3−12−02、IGLV3−21−02、IGLV3−21−03、IGLV3−21−01、IGLV3−25−02、IGLV3−25−03、IGLV3−25−01、IGLV3−16−01、IGLV3−10−01、IGLV3−10−02、IGLV3−27−01、IGLV3−22−01、IGLV3−1−01、IGLV3−19−01、IGLV3−32−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV4(6種):
IGLV4−60−01、IGLV4−60−02、IGLV4−60−03、IGLV4−69−01、IGLV4−69−02、IGLV4−3−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV5(8種):
IGLV5−45−02、IGLV5−45−03、IGLV5−45−01、IGLV5−39−01、IGLV5−39−02、IGLV5−48−01、IGLV5−37−01、IGLV5−52−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV6(1種):
IGLV6−57−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV7(3種):
IGLV7−46−01、IGLV7−46−02、IGLV7−43−01。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV8(3種):
IGLV8−61−01、IGLV8−61−03、IGLV8−61−02。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV9(3種):
IGLV9−49−01、IGLV9−49−03、IGLV9−49−02。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV10(3種):
IGLV10−54−01、IGLV10−54−03、IGLV10−54−02。
ヒト抗体λ軽鎖IGLV11(1種):
IGLV11−55−01。
アラインメント解析の結果、以下のように各ファミリーのコンセンサス配列を決定した。
<ヒト抗体重鎖>
ヒト抗体重鎖IGHV1コンセンサス配列(配列番号1:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV2コンセンサス配列(配列番号2:QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLALIDWDDDKRYSTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV3コンセンサス配列(配列番号3:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSVISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV4コンセンサス配列(配列番号4:QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV5コンセンサス配列(配列番号5:EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV6コンセンサス配列(配列番号6:QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV7コンセンサス配列(配列番号7:QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC)
<ヒト抗体重鎖>
ヒト抗体重鎖IGHV1コンセンサス配列(配列番号1:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV2コンセンサス配列(配列番号2:QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLALIDWDDDKRYSTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV3コンセンサス配列(配列番号3:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSVISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV4コンセンサス配列(配列番号4:QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV5コンセンサス配列(配列番号5:EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV6コンセンサス配列(配列番号6:QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYC)
ヒト抗体重鎖IGHV7コンセンサス配列(配列番号7:QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC)
<ヒト抗体κ軽鎖>
ヒト抗体κ軽鎖IGKV1コンセンサス配列(配列番号8:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV2コンセンサス配列(配列番号9:DIVMTQTPLSLPVTPGQPASISCRSSQSLLHSDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV3コンセンサス配列(配列番号10:EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV4コンセンサス配列(配列番号11:DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV5コンセンサス配列(配列番号12:ETTLTQSPAFMSATPGDKVNISCKASQDIDDDMNWYQQKPGEAAIFIIQEATTLVPGIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV6コンセンサス配列(配列番号13:EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV1コンセンサス配列(配列番号8:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV2コンセンサス配列(配列番号9:DIVMTQTPLSLPVTPGQPASISCRSSQSLLHSDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV3コンセンサス配列(配列番号10:EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV4コンセンサス配列(配列番号11:DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV5コンセンサス配列(配列番号12:ETTLTQSPAFMSATPGDKVNISCKASQDIDDDMNWYQQKPGEAAIFIIQEATTLVPGIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFC)
ヒト抗体κ軽鎖IGKV6コンセンサス配列(配列番号13:EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYC)
<ヒト抗体λ軽鎖>
ヒト抗体λ軽鎖IGLV1コンセンサス配列(配列番号14:QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVHWYQQLPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV2コンセンサス配列(配列番号15:QSALTQPPSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV3コンセンサス配列(配列番号16:SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDNLGKKYAHWYQQKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGNTATLTISGAQAEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV4コンセンサス配列(配列番号17:QPVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSSYIIAWHQQQPGKAPRYLMKLESDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGADRYLTISNLQSEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV5コンセンサス配列(配列番号18:QPVLTQPSSLSASPGASARLTCTLRSGINVGTYRIYWYQQKPGSPPRYLLRYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV6コンセンサス配列(配列番号19:NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYC)ヒト抗体λ軽鎖IGLV7コンセンサス配列(配列番号20:QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGHYPYWFQQKPGQAPRTLIYDTSNKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV8コンセンサス配列(配列番号21:QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSYYPSWYQQTPGQAPRTLIYSTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV9コンセンサス配列(配列番号22:QPVLTQPPSASASLGASVTLTCTLSSGYSNYKVDWYQQRPGKGPRFVMRVGTGGIVGSKGDGIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV10コンセンサス配列(配列番号23:QAGLTQPPSVSKGLRQTATLTCTGNSNNVGNQGAAWLQQHQGHPPKLLSYRNNNRPSGISERLSASRSGNTASLTITGLQPEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV11コンセンサス配列(配列番号24:RPVLTQPPSLSASPGATARLPCTLSSDLSVGGKNMFWYQQKPGSSPRLFLYHYSDSDKQLGPGVPSRVSGSKETSSNTAFLLISGLQPEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV1コンセンサス配列(配列番号14:QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVHWYQQLPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV2コンセンサス配列(配列番号15:QSALTQPPSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV3コンセンサス配列(配列番号16:SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDNLGKKYAHWYQQKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGNTATLTISGAQAEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV4コンセンサス配列(配列番号17:QPVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSSYIIAWHQQQPGKAPRYLMKLESDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGADRYLTISNLQSEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV5コンセンサス配列(配列番号18:QPVLTQPSSLSASPGASARLTCTLRSGINVGTYRIYWYQQKPGSPPRYLLRYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV6コンセンサス配列(配列番号19:NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYC)ヒト抗体λ軽鎖IGLV7コンセンサス配列(配列番号20:QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGHYPYWFQQKPGQAPRTLIYDTSNKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV8コンセンサス配列(配列番号21:QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSYYPSWYQQTPGQAPRTLIYSTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV9コンセンサス配列(配列番号22:QPVLTQPPSASASLGASVTLTCTLSSGYSNYKVDWYQQRPGKGPRFVMRVGTGGIVGSKGDGIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV10コンセンサス配列(配列番号23:QAGLTQPPSVSKGLRQTATLTCTGNSNNVGNQGAAWLQQHQGHPPKLLSYRNNNRPSGISERLSASRSGNTASLTITGLQPEDEADYYC)
ヒト抗体λ軽鎖IGLV11コンセンサス配列(配列番号24:RPVLTQPPSLSASPGATARLPCTLSSDLSVGGKNMFWYQQKPGSSPRLFLYHYSDSDKQLGPGVPSRVSGSKETSSNTAFLLISGLQPEDEADYYC)
[ヒト抗体重鎖コンセンサス配列からなるタンパク質の作製]
図3及び4に示すように、ヒト抗体重鎖コンセンサス配列(配列番号1〜7)をコードする塩基配列(配列番号25〜31)を合成した。さらに、図5に示すように、Overlap Extension PCR法を用いて、上記各ヒト抗体重鎖コンセンサス配列をコードする塩基配列にペルツズマブ重鎖CDR3(105−128)及びヒスチジンタグを付加した。CDR3の付加は、作製したペプチドに立体構造をとらせるためのものである。次に、図6及び7に示すように、発現型プラスミド(マルトース結合タンパク質(MBP)融合発現)に、CDR3(105−128)を付加したヒト抗体重鎖コンセンサス配列をコードする塩基配列を導入して、ヒト抗体重鎖コンセンサス配列発現プラスミドを作製した。上記ヒト抗体重鎖コンセンサス配列発現プラスミドにより形質転換した大腸菌を培養してペリプラズム画分を抽出し、アミロースレジンを用いて精製した。さらに、ニッケルビーズによる精製を行い、MBP融合ヒト抗体重鎖可変領域タンパク質(MBP−IGHVDJ−6×His)を作製した。
図3及び4に示すように、ヒト抗体重鎖コンセンサス配列(配列番号1〜7)をコードする塩基配列(配列番号25〜31)を合成した。さらに、図5に示すように、Overlap Extension PCR法を用いて、上記各ヒト抗体重鎖コンセンサス配列をコードする塩基配列にペルツズマブ重鎖CDR3(105−128)及びヒスチジンタグを付加した。CDR3の付加は、作製したペプチドに立体構造をとらせるためのものである。次に、図6及び7に示すように、発現型プラスミド(マルトース結合タンパク質(MBP)融合発現)に、CDR3(105−128)を付加したヒト抗体重鎖コンセンサス配列をコードする塩基配列を導入して、ヒト抗体重鎖コンセンサス配列発現プラスミドを作製した。上記ヒト抗体重鎖コンセンサス配列発現プラスミドにより形質転換した大腸菌を培養してペリプラズム画分を抽出し、アミロースレジンを用いて精製した。さらに、ニッケルビーズによる精製を行い、MBP融合ヒト抗体重鎖可変領域タンパク質(MBP−IGHVDJ−6×His)を作製した。
同様に、ヒト抗体κ軽鎖コンセンサス配列(配列番号8〜13)をコードする塩基配列(配列番号48〜53)にペルツズマブκ軽鎖CDR3(105−128)及びヒスチジンタグを付加した塩基配列を合成した。次に、発現型プラスミド(マルトース結合タンパク質(MBP)融合発現)に、CDR3(105−128)を付加したヒト抗体κ軽鎖コンセンサス配列をコードする塩基配列を導入して、配列番号60〜65の塩基配列を有するヒト抗体κ軽鎖コンセンサス配列発現プラスミドを作製した(図7)。上記ヒト抗体κ軽鎖コンセンサス配列発現プラスミドにより形質転換した大腸菌を培養してペリプラズム画分を抽出し、アミロースレジンを用いて精製した。さらに、ニッケルビーズによる精製を行い、MBP融合ヒト抗体軽鎖可変領域タンパク質(MBP−IGKVDJ−6×His)(配列番号54〜59)を作製した。
作製したMBP融合ヒト抗体重鎖可変領域タンパク質(MBP−IGHVDJ−6×His)及びMBP融合ヒト抗体軽鎖可変領域タンパク質(MBP−IGKVDJ−6×His)をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー(CBB)で染色した結果を図6及び7に示す。
作製したMBP融合ヒト抗体重鎖可変領域タンパク質(MBP−IGHVDJ−6×His)及びMBP融合ヒト抗体軽鎖可変領域タンパク質(MBP−IGKVDJ−6×His)をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー(CBB)で染色した結果を図6及び7に示す。
[ヒト抗体重鎖コンセンサス配列を認識するペプチドの1次スクリーニング]
ファージディスプレイ法により、ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー3(IGHV3)コンセンサス配列を認識するペプチドのスクリーニングを行った(図8)。4回のパニング後の溶出ファージプラークのうち、任意の32クローンを選択し、モノクローナルファージを調製した。このモノクローナルファージから、1本鎖ファージゲノムを抽出し、配列を解析した。その結果、図9に示すような16種類(配列番号32〜47)のペプチド配列が得られ、32クローンのうち17クローンが配列番号32に示される共通のアミノ酸配列(GAMHLPWHMGTL)であることが明らかとなった。この配列番号32に示されるアミノ酸配列からなるペプチド(GAMHLPWHMGTL)を、ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー3(IGHV3)コンセンサス配列を特異的に認識する可能性のあるペプチドとして、ペプチド3と命名した。
ファージディスプレイ法により、ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー3(IGHV3)コンセンサス配列を認識するペプチドのスクリーニングを行った(図8)。4回のパニング後の溶出ファージプラークのうち、任意の32クローンを選択し、モノクローナルファージを調製した。このモノクローナルファージから、1本鎖ファージゲノムを抽出し、配列を解析した。その結果、図9に示すような16種類(配列番号32〜47)のペプチド配列が得られ、32クローンのうち17クローンが配列番号32に示される共通のアミノ酸配列(GAMHLPWHMGTL)であることが明らかとなった。この配列番号32に示されるアミノ酸配列からなるペプチド(GAMHLPWHMGTL)を、ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー3(IGHV3)コンセンサス配列を特異的に認識する可能性のあるペプチドとして、ペプチド3と命名した。
[ペプチド3とIGHV3コンセンサス配列との結合]
図10に示すように、ペプチド3(配列番号32)をコードする塩基配列を、発現用プラスミド(グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合発現ベクター)に導入して、ペプチド3発現プラスミドを作製した。上記ペプチド3発現プラスミドにより形質転換した大腸菌を培養して可溶化画分を抽出し、ニッケルビーズによる精製を行い、GST融合ペプチド3を作製した。実施例2で作製したMBP融合IGHVDJ3タンパク質をマイクロプレートに固相化させ、上記GST融合ペプチド3、マウス抗GSTモノクローナル抗体、及びHRP標識ヒツジ抗マウスIgGモノクローナル抗体を用いてELISA法を行い、ペプチド3とIGHV3コンセンサス配列との結合を調べた。図11に示す結果から、ペプチド3はIGHV3コンセンサス配列と特異的に結合することが明らかとなった。
図10に示すように、ペプチド3(配列番号32)をコードする塩基配列を、発現用プラスミド(グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合発現ベクター)に導入して、ペプチド3発現プラスミドを作製した。上記ペプチド3発現プラスミドにより形質転換した大腸菌を培養して可溶化画分を抽出し、ニッケルビーズによる精製を行い、GST融合ペプチド3を作製した。実施例2で作製したMBP融合IGHVDJ3タンパク質をマイクロプレートに固相化させ、上記GST融合ペプチド3、マウス抗GSTモノクローナル抗体、及びHRP標識ヒツジ抗マウスIgGモノクローナル抗体を用いてELISA法を行い、ペプチド3とIGHV3コンセンサス配列との結合を調べた。図11に示す結果から、ペプチド3はIGHV3コンセンサス配列と特異的に結合することが明らかとなった。
[ヒト抗体重鎖コンセンサス配列を認識するペプチドの1次スクリーニングとSPR解析]
また、同様にヒト抗体重鎖可変領域ファミリー1〜7(IGHV1〜7)コンセンサス配列を認識するペプチドのスクリーニングを行った。そして、同定したペプチド(配列番号66〜73)と、ファージディスプレイ法でテンプレートとして使用したヒト抗体重鎖可変領域ファミリータンパク質との親和性を、SPR解析により、Multiple cycleで調べた。SPR解析は、以下の方法で行った。
また、同様にヒト抗体重鎖可変領域ファミリー1〜7(IGHV1〜7)コンセンサス配列を認識するペプチドのスクリーニングを行った。そして、同定したペプチド(配列番号66〜73)と、ファージディスプレイ法でテンプレートとして使用したヒト抗体重鎖可変領域ファミリータンパク質との親和性を、SPR解析により、Multiple cycleで調べた。SPR解析は、以下の方法で行った。
(ペプチドリガンドのSPR法を用いた親和性測定)
BIAcore X100(GE Healthcare社製)の機器を用いて表面プラズモン共鳴法(SPR)で測定した。CM5センサーチップへのMBP−Fvタンパクの固定化はpH5.0の10mM酢酸溶液を用いて行った。チップへのリガンド固定化量は3000〜8000レスポンスユニット(RU)の間で行われた。合成したペプチド、および購入したペプチド(Filgen社)をアナライトとし、HBS緩衝液(0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% Tween20)をもちいて溶解し、流速10μl/minまたは30μl/min、25℃、最大150μMの濃度で測定した。チップの再生を行う際には0.5% Tween20−PBSを用いた。BIAcore X100エバリュエーションソフトウェアを用いて測定データから動態定数を算出した。
BIAcore X100(GE Healthcare社製)の機器を用いて表面プラズモン共鳴法(SPR)で測定した。CM5センサーチップへのMBP−Fvタンパクの固定化はpH5.0の10mM酢酸溶液を用いて行った。チップへのリガンド固定化量は3000〜8000レスポンスユニット(RU)の間で行われた。合成したペプチド、および購入したペプチド(Filgen社)をアナライトとし、HBS緩衝液(0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% Tween20)をもちいて溶解し、流速10μl/minまたは30μl/min、25℃、最大150μMの濃度で測定した。チップの再生を行う際には0.5% Tween20−PBSを用いた。BIAcore X100エバリュエーションソフトウェアを用いて測定データから動態定数を算出した。
結果を表1に示す。コード6ペプチドのpQは環状のピログルタミン酸を表す。中でも、コード4ペプチド(配列番号69)や、コード8ペプチド(配列番号71)がテンプレートとの親和性が高く、アフィニティリガンドとして特に優れていることが示された。
また、同様にヒト抗体重鎖可変領域ファミリー1〜7(IGHV1〜7)コンセンサス配列を認識するペプチドのスクリーニングを行った。そして、同定したペプチド(配列番号82〜94)と、ファージディスプレイ法でテンプレートとして使用したヒト抗体重鎖可変領域ファミリータンパク質との結合を、SPR解析により、single cycleで調べた結果を表2に示す。また、コード4ペプチド(配列番号69)とMBP−VH3(MBP−IGHVDJ3−6×His)又はコントロールのMBPとの親和性をSPR解析により調べた結果を図12のAに示す。
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー3(IGHV3)コンセンサス配列を認識するペプチドのうち、配列番号69で示されるコード4ペプチドのアミノ酸配列の一アミノ酸をアルギニンに置換した1アミノ酸変異体(コード33〜44ペプチド;配列番号95〜106)のペプチドを作製し、前記と同様にテンプレートとして使用したMBP−IGHVDJ3−Hisとの結合をSPR解析により、single cycleで調べた(表3)。
結果から、コード39〜41のペプチドのテンプレートのMBP−IGHVDJ3−Hisとの結合が顕著に減少したことから、コード4ペプチドの7〜9番目のアミノ酸が、テンプレートとの結合に直接的に係るアミノ酸であり、結合に重要であることが示唆された。すなわち、これらの3アミノ酸以外のアミノ酸については、欠失、置換、挿入があっても、テンプレートとの結合能力はあまり影響を受けないと考えられる。
[ヒト抗体κ軽鎖コンセンサス配列を認識するペプチドの1次スクリーニングとSPR解析]
また、同様にヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー1〜6(IGKV1〜6)コンセンサス配列を認識するペプチドのスクリーニングを行った。そして、同定したペプチド(配列番号74〜81)と、ファージディスプレイ法でテンプレートとして使用したヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリーとの結合を、SPR解析により、Multiple cycleで調べた結果を表4に示す。中でも、コード15ペプチド(配列番号78)や、コード18ペプチド(配列番号80)がテンプレートとの親和性が高く、アフィニティリガンドとして特に優れていることが示された。また、コード15ペプチドとMBP−VK3(MBP−IGKVDJ3−6×His)又はコントロールのMBPとの親和性をSPR解析により調べた結果を図12のBに示す。
また、同様にヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー1〜6(IGKV1〜6)コンセンサス配列を認識するペプチドのスクリーニングを行った。そして、同定したペプチド(配列番号74〜81)と、ファージディスプレイ法でテンプレートとして使用したヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリーとの結合を、SPR解析により、Multiple cycleで調べた結果を表4に示す。中でも、コード15ペプチド(配列番号78)や、コード18ペプチド(配列番号80)がテンプレートとの親和性が高く、アフィニティリガンドとして特に優れていることが示された。また、コード15ペプチドとMBP−VK3(MBP−IGKVDJ3−6×His)又はコントロールのMBPとの親和性をSPR解析により調べた結果を図12のBに示す。
上述のファージディスプレイを用いたアフィニティリガンド1次スクリーニングにおける、4回のパニング後の溶出ファージプラークのうち、任意に選択したクローン以外の198クローンについて、モノクローナルファージを調製し、ファージが提示する計198ペプチド(配列番号107〜304)のアミノ酸配列を同定した。これらのペプチドも、ヒト抗体重鎖コンセンサス配列および、ヒト抗体κ軽鎖コンセンサス配列を認識するペプチドの可能性がある。、
[ヒト抗体重鎖コンセンサス配列またはヒト抗体κ軽鎖コンセンサス配列を認識するペプチドのファージELISA法による2次スクリーニング]
上記で同定した198ペプチドのうち、19ペプチドについては、ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー(IGHV)コンセンサス配列タンパク(VH)を認識するペプチドの2次スクリーニングを、また、198ペプチドのうちの179ペプチドについては、ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー3,6(IGKV3,6)コンセンサス配列タンパク(VK3,VK6)を認識するペプチドの2次スクリーニングを行った。2次スクリーニングの方法としては、同定されたペプチド配列を新たに合成することなく、各ペプチドを提示したファージクローンを用いたファージELISA法により2次スクリーニングを行った。
上記で同定した198ペプチドのうち、19ペプチドについては、ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー(IGHV)コンセンサス配列タンパク(VH)を認識するペプチドの2次スクリーニングを、また、198ペプチドのうちの179ペプチドについては、ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー3,6(IGKV3,6)コンセンサス配列タンパク(VK3,VK6)を認識するペプチドの2次スクリーニングを行った。2次スクリーニングの方法としては、同定されたペプチド配列を新たに合成することなく、各ペプチドを提示したファージクローンを用いたファージELISA法により2次スクリーニングを行った。
(ファージELISA法による同定ペプチドの2次スクリーニング)
大腸菌 ER2738株に感染したM13ファージに198種のペプチドを提示させ、37℃で4.5時間振とう培養した後に、培養液を遠心した時の上清画分を検体試料とした。ネガティブコントロールとして、M13ファージを含む大腸菌培養上清、或いは大腸菌のみの培養上清を使用した。スクリーニングするペプチドのターゲットとなる、MBP融合VHタンパクミックス、VK3タンパク、MBP融合VK6タンパク、MBPタンパクは、全てPBSバッファーに溶解した。マキシソープ イムノプレート(Nalge Nunc International)に1wellあたり100ngのターゲットタンパクをいれ、37℃で1時間静置し、その後4℃ over night インキュベートによりターゲットタンパクをプレートに固層化した。PBST(PBS−0.05%Tween20)により各wellの洗浄を3回繰り返し、3%BSA(Bovine Serum Albumin)溶液を各wellに200ulずつ入れ、37℃で2時間ブロッキングした。各ペプチドを提示するファージが含まれる大腸菌の培養上清を、0.5%BSA/PBSで10倍希釈し、各wellに100ulずつ分注して室温で1時間静置した。PBSTでwellを3回洗浄した後、1次抗体として、2000倍希釈したウサギ抗fdバクテリオファージ抗体(#B7786:Sigma-Aldrich)を各wellに100ulずつ分注し、室温で1時間静置した。PBSTにより各wellを3回洗浄後、2次抗体として、5000倍希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(#NA9340:GE Healthcare)を各wellに100ulずつ分注して室温で1時間静置した。PBSTでwellを5回洗浄した後、基質(OptEIA TMB Substrate Reagent Set:BD Bioscience)を各wellに100ulずつ分注して、室温で15分間静置した後、100ul 1Mの硫酸100ul/wellにより、反応を停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダー(Immuno Mini NJ-2300: Nalge Nunc International)により、450nmの波長で計測した。
大腸菌 ER2738株に感染したM13ファージに198種のペプチドを提示させ、37℃で4.5時間振とう培養した後に、培養液を遠心した時の上清画分を検体試料とした。ネガティブコントロールとして、M13ファージを含む大腸菌培養上清、或いは大腸菌のみの培養上清を使用した。スクリーニングするペプチドのターゲットとなる、MBP融合VHタンパクミックス、VK3タンパク、MBP融合VK6タンパク、MBPタンパクは、全てPBSバッファーに溶解した。マキシソープ イムノプレート(Nalge Nunc International)に1wellあたり100ngのターゲットタンパクをいれ、37℃で1時間静置し、その後4℃ over night インキュベートによりターゲットタンパクをプレートに固層化した。PBST(PBS−0.05%Tween20)により各wellの洗浄を3回繰り返し、3%BSA(Bovine Serum Albumin)溶液を各wellに200ulずつ入れ、37℃で2時間ブロッキングした。各ペプチドを提示するファージが含まれる大腸菌の培養上清を、0.5%BSA/PBSで10倍希釈し、各wellに100ulずつ分注して室温で1時間静置した。PBSTでwellを3回洗浄した後、1次抗体として、2000倍希釈したウサギ抗fdバクテリオファージ抗体(#B7786:Sigma-Aldrich)を各wellに100ulずつ分注し、室温で1時間静置した。PBSTにより各wellを3回洗浄後、2次抗体として、5000倍希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(#NA9340:GE Healthcare)を各wellに100ulずつ分注して室温で1時間静置した。PBSTでwellを5回洗浄した後、基質(OptEIA TMB Substrate Reagent Set:BD Bioscience)を各wellに100ulずつ分注して、室温で15分間静置した後、100ul 1Mの硫酸100ul/wellにより、反応を停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダー(Immuno Mini NJ-2300: Nalge Nunc International)により、450nmの波長で計測した。
ファージELISA法による、IGHVコンセンサス配列を認識するペプチドの2次スクリーニングの結果を図13に示す。図中、buffer:bufferのみ(ターゲットタンパク無し)、MBP:Maltose-Binding Protein、VH:MBP融合IGHV3コンセンサス配列ターゲットタンパク(VH3)を主としVH4およびVH6を含むターゲットタンパクのミックスをそれぞれ示す。Bufferはターゲットタンパク固層化のないネガティブコントロールを示し、MBPの値は、MBP融合VHタンパクにおける、非特異的結合(バックグラウンド)の値を指す。検体試料19種の全てにおいて、VH特異的な結合を認めるペプチドは無かった(図13)。
ファージELISA法による、IGKV3,6コンセンサス配列を認識するペプチドの2次スクリーニングの結果を図14に示す。MBP:Maltose-Binding Protein、VK3:IGKV3コンセンサス配列ターゲットタンパク、VK6:MBP融合IGKV6コンセンサス配列ターゲットタンパクを示す。MBPの値は、MBP融合VK6タンパクにおける、非特異的結合の値を指す。179種のペプチド配列のうち7種の配列は、VK3と特異的に結合するペプチドであることが確認された(図14)。ハーセプチンのファミリーは、一般にIGHV3とIGKV1と同定されているが、本実施例のファージELASA法によるスクリーニングの結果、IGKV3ペプチドにおいてより高いハーセプチンに対する活性が認められた。ペプチドによっては、異なるファミリーを認識する点も考慮し、以降の実施例において、本結果を基に解析を進めた。以上、SPR解析による1次スクリーニングにおいて、2種のペプチドを同定し、ファージELISA法による2次スクリーニングにおいて、7種のペプチドを同定することが出来た(図15)。
[磁気ビーズ免疫沈降法を用いたペプチドリガンド結合能の評価]
スクリーニングした計9種のペプチドリガンドを用いて、実際に一本鎖抗体をどの程度精製することが可能かを調べるため、合成した各9種のペプチドを結合させた磁気ビーズを作製した。更に、ハーセプチンとして知られるヒト癌遺伝子産物HER2蛋白特異的抗体の、scFv(single chain Fv:VHおよびVLから構成される可変領域[Fv]をフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単鎖可変領域フラグメント)一本鎖抗体を作製し、該一本差抗体を前記9種のペプチド結合磁気ビーズに反応させる免疫沈降法により、ハーセプチンscFv抗体の精製/回収率を解析し、各ペプチドの抗体精製能を評価した。以下に、その方法を示す。
スクリーニングした計9種のペプチドリガンドを用いて、実際に一本鎖抗体をどの程度精製することが可能かを調べるため、合成した各9種のペプチドを結合させた磁気ビーズを作製した。更に、ハーセプチンとして知られるヒト癌遺伝子産物HER2蛋白特異的抗体の、scFv(single chain Fv:VHおよびVLから構成される可変領域[Fv]をフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単鎖可変領域フラグメント)一本鎖抗体を作製し、該一本差抗体を前記9種のペプチド結合磁気ビーズに反応させる免疫沈降法により、ハーセプチンscFv抗体の精製/回収率を解析し、各ペプチドの抗体精製能を評価した。以下に、その方法を示す。
(ペプチド磁気ビーズ免疫沈降法によるscFv抗体結合試験)
図16に概略を示す。100ulの磁気ビーズ(Dynabeads M-280 Streptavidin:Invitrogen)を0.5%のTween20を含むTBSTにて洗浄後、3%BSA加TBSTにて、室温1時間のブロッキングを行った。磁気スタンドにビーズ入りカラムをセットし、上清を除去後、ビオチン化させた上記9種のペプチドをTBSTにて100μg/mLに調整した後、100μLをカラムに添加した。10−15分毎に攪拌しながら、室温にて1時間反応させ、9種のペプチドをそれぞれビーズに結合させた。上清の未反応ビオチン化被検ペプチドを除去後、ビーズをTBSTおよびPBSにて洗浄し、PBSにて100μg/mLに調製したHisタグ付scFv抗体(自家調製)を、被検ペプチド結合ビーズに100μL添加し、4℃で16〜18時間吸着反応を行った。反応終了後に磁気スタンドにて上清を除去後、ビーズを回収して100μLのLaemmli液を添加し、99℃、10分間の加熱処理により結合ペプチドをビーズから剥離した。磁気スタンドにてビーズを集め、上清を分取して2−メルカプトエタノール(2−ME)で還元し、SDS−PAGE用サンプルとして供した。回収したscFv抗体は、12%ミニゲル(Bio−RAD)を用い、25mA/gel/40minの条件で電気泳動を行った後、40V-60分、90V-2時間の条件でPVDF膜に転写した。転写されたPVDF膜はTBSTにて洗浄後、1%スキムミルクを含むTBSTにて4℃、16−18時間のブロッキングを行った。TBSTにて洗浄後、1%スキムミルクを含むTBSTにて5000倍希釈したHRP結合抗Hisタグ抗体(Anti-His C-term抗体,Invitrogen)を、転写されたPVDF膜と室温1時間反応させた。反応終了後にPVDF膜をTBSTにより洗浄し、アマシャム社製ECLキットを用いて発色させた蛍光を、ルミノ・イメージアナライザー(Image Quant LAS 4000:GE Healthcare)にて測定した後、Image Quant TL(GE Healthcare)にて蛍光強度を数値化した。
図16に概略を示す。100ulの磁気ビーズ(Dynabeads M-280 Streptavidin:Invitrogen)を0.5%のTween20を含むTBSTにて洗浄後、3%BSA加TBSTにて、室温1時間のブロッキングを行った。磁気スタンドにビーズ入りカラムをセットし、上清を除去後、ビオチン化させた上記9種のペプチドをTBSTにて100μg/mLに調整した後、100μLをカラムに添加した。10−15分毎に攪拌しながら、室温にて1時間反応させ、9種のペプチドをそれぞれビーズに結合させた。上清の未反応ビオチン化被検ペプチドを除去後、ビーズをTBSTおよびPBSにて洗浄し、PBSにて100μg/mLに調製したHisタグ付scFv抗体(自家調製)を、被検ペプチド結合ビーズに100μL添加し、4℃で16〜18時間吸着反応を行った。反応終了後に磁気スタンドにて上清を除去後、ビーズを回収して100μLのLaemmli液を添加し、99℃、10分間の加熱処理により結合ペプチドをビーズから剥離した。磁気スタンドにてビーズを集め、上清を分取して2−メルカプトエタノール(2−ME)で還元し、SDS−PAGE用サンプルとして供した。回収したscFv抗体は、12%ミニゲル(Bio−RAD)を用い、25mA/gel/40minの条件で電気泳動を行った後、40V-60分、90V-2時間の条件でPVDF膜に転写した。転写されたPVDF膜はTBSTにて洗浄後、1%スキムミルクを含むTBSTにて4℃、16−18時間のブロッキングを行った。TBSTにて洗浄後、1%スキムミルクを含むTBSTにて5000倍希釈したHRP結合抗Hisタグ抗体(Anti-His C-term抗体,Invitrogen)を、転写されたPVDF膜と室温1時間反応させた。反応終了後にPVDF膜をTBSTにより洗浄し、アマシャム社製ECLキットを用いて発色させた蛍光を、ルミノ・イメージアナライザー(Image Quant LAS 4000:GE Healthcare)にて測定した後、Image Quant TL(GE Healthcare)にて蛍光強度を数値化した。
各ペプチド磁気ビーズによって回収されたハーセプチンscFv抗体を、SDS−PAGE電気泳動にかけた後、各バンドのシグナル強度を画像解析により半定量化した(図17)。図中1)−7)が、2次スクリーニングによって同定されたIGKV3コンセンサス配列を認識するペプチドであり、8)が1次スクリーニングによって同定されたIGKV3コンセンサス配列を認識するペプチド、9)が1次スクリーニングによって同定されたIGHV3コンセンサス配列を認識するペプチドである。6)(コード166ペプチド)と9)(コード4ペプチド)において、ハーセプチンscFv抗体回収率30%を超える結果が得られた。
[VH/VLヒト抗体リガンドの精製順組み合わせによるペプチドハーセプチンscFv抗体の回収率変化]
上記ペプチド磁気ビーズ免疫沈降法で回収率の高かった、コード166ペプチド(VK−6)およびコード4ペプチド(VH3−4)が結合する磁気ビーズを作製し、2種類のビーズを順に反応させ、結合したハーセプチンscFv抗体の各量を、SDS-PAGE電気泳動によるバンド画像解析−半定量法により求めた(図18)。
上記ペプチド磁気ビーズ免疫沈降法で回収率の高かった、コード166ペプチド(VK−6)およびコード4ペプチド(VH3−4)が結合する磁気ビーズを作製し、2種類のビーズを順に反応させ、結合したハーセプチンscFv抗体の各量を、SDS-PAGE電気泳動によるバンド画像解析−半定量法により求めた(図18)。
各ペプチド磁気ビーズの反応順で、コントロールに対するペプチドハーセプチンscFv抗体回収率のグラフ化したものを、図19に示す。20μgまたは10μgのハーセプチンscFv抗体タンパク-SDS-PAGE泳動バンド蛍光強度を100%として、1回目と2回目それぞれの反応により回収された抗体タンパクの、蛍光強度を割り出した。半定量的解析法のため、各合計値は100%を超えた。Beads Onlyの左端グラフは、ペプチドを結合していない磁気ビーズを使用した場合の、非特異的(バックグラウンド)結合量を示す。初回の反応に、ハーセプチンscFv抗体のVHに結合するVH3−4ペプチド磁気ビーズを使用し、初回反応でビーズと結合しなかった抗体を含む上清を、抗体のVLに結合するVK−6ペプチド磁気ビーズと反応させた(図19 中央グラフ)。また、各反応順を逆にした場合の抗体回収率も解析した(図19 右グラフ)。結果、反応させる抗体の濃度が20μgと10μgのどちらの場合においても、先にVK−6ペプチド磁気ビーズで反応させ、その後未回収抗体をVH3−4ペプチド磁気ビーズで反応させた組み合わせ(図19 右グラフ)の方が、高い回収率であることが明らかとなった。
[一アミノ酸変異ペプチドによるscFv抗体回収率変化]
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー3(IGHV3)コンセンサス配列を認識するペプチドのうち、配列番号69で示されるコード4ペプチドのアミノ酸配列の一アミノ酸をアラニンに置換した1アミノ酸変異体(コード243〜247ペプチド;配列番号305〜309)のペプチドを作製し(表5)、一アミノ酸変異ペプチドにはビオチンを結合させ、前記と同様にペプチド磁気ビーズを作製し、免疫沈降法にペプチドハーセプチンscFv抗体回収率を調べた。
ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー3(IGHV3)コンセンサス配列を認識するペプチドのうち、配列番号69で示されるコード4ペプチドのアミノ酸配列の一アミノ酸をアラニンに置換した1アミノ酸変異体(コード243〜247ペプチド;配列番号305〜309)のペプチドを作製し(表5)、一アミノ酸変異ペプチドにはビオチンを結合させ、前記と同様にペプチド磁気ビーズを作製し、免疫沈降法にペプチドハーセプチンscFv抗体回収率を調べた。
上記5種の一アミノ酸変異ペプチド磁気ビーズを用いた免疫沈降法による、ペプチドハーセプチンscFv抗体回収率の結果を図20に示す。回収率は、7番目のアミノ酸がアラニンに変異したペプチド磁気ビーズ(コード245ペプチド)において、最高値の84%の抗体回収に成功したのに対し、変異のないオリジナルペプチド磁気ビーズ(コード4ペプチド)では23%であった。8番及び9番アミノ酸の変異では、回収率が急激に下降していることから、ハーセプチンscFv抗体のVH鎖に対する結合には、コード4ペプチドの8番及び9番アミノ酸が強く関与している可能性が示唆された。
ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー3(IGKV3)コンセンサス配列を認識するペプチドのうち、配列番号228で示されるコード166ペプチドのアミノ酸配列の一アミノ酸をアラニンに置換した1アミノ酸変異体(コード248〜259ペプチド;配列番号310〜321)(表6)についても同様に、変異の箇所によって、抗体の回収率が向上または低下する可能性がある。
[His-Tag ELISAによるリガンドペプチド定量的結合量測定]
ペプチド結合磁気ビーズによるハーセプチンscFv抗体回収率に関し、より精密な定量結果を得るため、His-Tag Protein ELISA Kit (CELLBIOLABS, Inc.)を用いた、タンパク量測定を行った。解析は、キット添付のプロトコールに従って行い、ポリヒスチジンコートのマイクロプレートにスタンダードもしくは被検体を添加後、抗6-His抗体を反応させ、洗浄後にHRP標識の二次抗体を添加し、HRPに反応する発色基質を用いて450nmの吸光度を測定した。
ペプチド結合磁気ビーズによるハーセプチンscFv抗体回収率に関し、より精密な定量結果を得るため、His-Tag Protein ELISA Kit (CELLBIOLABS, Inc.)を用いた、タンパク量測定を行った。解析は、キット添付のプロトコールに従って行い、ポリヒスチジンコートのマイクロプレートにスタンダードもしくは被検体を添加後、抗6-His抗体を反応させ、洗浄後にHRP標識の二次抗体を添加し、HRPに反応する発色基質を用いて450nmの吸光度を測定した。
表5に示したヒト抗体重鎖可変領域ファミリー3(IGHV3)コンセンサス配列を認識するコード4ペプチド(VH3−4)および、その一アミノ酸変異ペプチド5種の、His-Tag Protein ELISAによる抗体回収率を示す(図21)。SDS−PAGEによるバンド濃度の半定量的解析結果(図20)とは異なり、7番目のアミノ酸がアラニンに変異したペプチド磁気ビーズ(V7B:コード245ペプチド)において、とりわけ高い回収率を示すことはなかったが、オリジナルのVH3−4ペプチドにおいて、変異ペプチドに比して高い回収率が得られた。また、図17で用いた、2次スクリーニングにより同定された6種のIGKV3コンセンサス配列を認識するペプチドと、1次スクリーニングにより同定された1種のIGKV3コンセンサス配列を認識するペプチド(Vk3)についても、同様にHis-Tag Protein ELISAを用いて回収抗体量を定量した(図21)。SDS−PAGEによるバンド濃度の半定量的解析結果(図17)とは異なり、コード161ペプチドにおいて最も高い回収率(80%)が得られる結果となった。
本発明は、抗体精製の分野などに好適に利用することができる。
Claims (35)
- 以下の工程(a)及び(b)によりヒト抗体可変領域のアミノ酸コンセンサス配列を同定する方法。
(a)ヒト抗体重鎖可変領域ファミリー1〜7、ヒト抗体κ軽鎖可変領域ファミリー1〜6、及び、ヒト抗体λ軽鎖可変領域ファミリー1〜11の各ファミリーにおけるアミノ酸配列のアラインメントを行う工程;
(b)上記(a)により得られたアラインメントから、ヒト抗体可変領域の各アミノ酸位置における最も頻度の高いアミノ酸の種類を決定する工程; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、
第2位のアミノ酸がV、又はMであり、
第9位のアミノ酸がA、又はPであり、
第14位のアミノ酸がP、L、又はTであり、
第16位のアミノ酸がA、S、又はTであり、
第24位のアミノ酸がA、又はVであり、
第27位のアミノ酸がY、G、又はFであり、
第29位のアミノ酸がF、又はLであり、
第30位のアミノ酸がT、N、又はSであり、
第31位のアミノ酸がG、S、E、又はYであり、
第32位のアミノ酸がY、L、S又はRであり、
第33位のアミノ酸がY、D、S、A、T、又はGであり、
第34位のアミノ酸がM、I、V、又はLであり、
第35位のアミノ酸がH、N、S、又はQであり、
第38位のアミノ酸がRであり、
第41位のアミノ酸がP、T、又はRであり、
第42位のアミノ酸がG、又はRであり、
第43位のアミノ酸がQ、又はKであり、
第44位のアミノ酸がG、R、又はAであり、
第48位のアミノ酸がM、又はIであり、
第50位のアミノ酸がW、R、I、又はGであり、
第51位のアミノ酸がI、M、F、又はSであり、
第52位のアミノ酸がN、D、I、S、V、又はTであり、
第53位のアミノ酸がP、A、又はVであり、
第54位のアミノ酸がN、S、E、I、Y、G、又はFであり、
第55位のアミノ酸がS、G、D、F、L、又はNであり、
第57位のアミノ酸がG、N、S、E、T、又はIであり、
第58位のアミノ酸がT、又はAであり、
第59位のアミノ酸がN、G、S、I、又はKであり、
第61位のアミノ酸がA、又はSであり、
第63位のアミノ酸がK、又はEであり、
第64位のアミノ酸がF、又はLであり、
第66位のアミノ酸がG、E、又はDであり、
第67位のアミノ酸がR、又はWであり、
第70位のアミノ酸がM、S、又はIであり、
第72位のアミノ酸がR、E、A、又はTであり、
第73位のアミノ酸がD、又はNであり、
第74位のアミノ酸がT、E、K、M、又はRであり、
第76位のアミノ酸がI、T、A、又はMであり、
第77位のアミノ酸がS、又はDであり、
第79位のアミノ酸がA、又はVであり、
第84位のアミノ酸がS、又はRであり、
第85位のアミノ酸がR、又はSであり、
第89位のアミノ酸がE、又はDである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号2に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、
第1位のアミノ酸がQ、又はRであり、
第2位のアミノ酸がI、又はVであり、
第5位のアミノ酸がK、又はRであり、
第10位のアミノ酸がT、A、又はVであり、
第16位のアミノ酸がQ、又はEであり、
第22位のアミノ酸がC、又はRであり、
第23位のアミノ酸がT、又はAであり、
第24位のアミノ酸がF、又はVであり、
第31位のアミノ酸がT、又はNであり、
第32位のアミノ酸がS、又はAであり、
第33位のアミノ酸がG、又はRであり、
第34位のアミノ酸がV、E、又はMであり、
第35位のアミノ酸がG、W、R、又はCであり、
第36位のアミノ酸がV、C、又はAであり、
第37位のアミノ酸がG、又はSであり、
第50位のアミノ酸がL、又はIであり、
第52位のアミノ酸がL、R、又はHであり、
第54位のアミノ酸がY、D、又はFであり、
第55位のアミノ酸がW、又はSであり、
第56位のアミノ酸がN、又はDであり、
第58位のアミノ酸がD、又はEであり、
第60位のアミノ酸がR、Y、F、又はSであり、
第62位のアミノ酸がS、又はGであり、
第63位のアミノ酸がP、又はTであり、
第66位のアミノ酸がK、又はNであり、
第67位のアミノ酸がS、又はTであり、
第72位のアミノ酸がT、又はSであり、
第78位のアミノ酸がN、又はSであり、
第93位のアミノ酸がG、又はAであり、
第94位のアミノ酸がT、又はVである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、
第1位のアミノ酸がQ、E、又はTであり、
第2位のアミノ酸がV、又はDであり、
第3位のアミノ酸がQ、又はHであり、
第5位のアミノ酸がV、又はLであり、
第6位のアミノ酸がE、又はDであり、
第7位のアミノ酸がS、又はTであり、
第8位のアミノ酸がG、R、又はAであり、
第10位のアミノ酸がG、V、又はAであり、
第11位のアミノ酸がL、又はVであり、
第12位のアミノ酸がV、又はIであり、
第13位のアミノ酸がK、Q、R、又はEであり、
第15位のアミノ酸がG、又はRであり、
第16位のアミノ酸がG、R、又はPであり、
第17位のアミノ酸がS、又はAであり、
第19位のアミノ酸がR、又はKであり、
第20位のアミノ酸がL、又はPであり、
第23位のアミノ酸がA、又はTであり、
第25位のアミノ酸がS、又はCであり、
第26位のアミノ酸がG、又はAであり、
第28位のアミノ酸がT、又はAであり、
第30位のアミノ酸がS、D、又はGであり、
第31位のアミノ酸がD、S、N、Y、又はGであり、
第32位のアミノ酸がY、N、S、A、又はHであり、
第33位のアミノ酸がY、S、E、D、A、V、G、T、W、又はPであり、
第34位のアミノ酸がM、又はLであり、
第35位のアミノ酸がS、N、H、又はDであり、
第37位のアミノ酸がI、V、F、又はAであり、
第38位のアミノ酸がR、又はHであり、
第39位のアミノ酸がQ、R、又はKであり、
第40位のアミノ酸がA、又はPであり、
第41位のアミノ酸がP、T、又はSであり、
第45位のアミノ酸がL、又はPであり、
第46位のアミノ酸がE、又はVであり、
第47位のアミノ酸がW、又はYであり、
第49位のアミノ酸がS、A、又はGであり、
第50位のアミノ酸がR、F、C、G、A、V、S、L、Y又はNであり、
第51位のアミノ酸がI、N、V、又はTであり、
第52位のアミノ酸がR、K、E、S、Y、N、W、又はGであり、
第52位のアミノ酸の次に、S、又はNが挿入されており、
第53位のアミノ酸の前に、Kが挿入されており、
第53位のアミノ酸がA、T、W、S、G、Y、又はQ、若しくは欠失しており、
第54位のアミノ酸がS、A、G、N、D、又はYであり、
第55位のアミノ酸がG、又はSであり、
第56位のアミノ酸がS、G、又はY、若しくは欠失しており、
第57位のアミノ酸がT、A、R、S、N、E、D、又はYであり、
第58位のアミノ酸がI、T、又はKであり、
第59位のアミノ酸がD、E、A、S、Y、H、N、G、又はTであり、
第61位のアミノ酸がA、T、G、P、又はVであり、
第62位のアミノ酸がD、G、N、又はAであり、
第63位のアミノ酸がS、又はPであり、
第64位のアミノ酸がV、A、又はRであり、
第65位のアミノ酸がK、又はMであり、
第66位のアミノ酸がG、又はRであり、
第67位のアミノ酸がR、又はQであり、
第69位のアミノ酸がT、I、又はAであり、
第73位のアミノ酸がD、V、又はEであり、
第74位のアミノ酸がN、D、又はGであり、
第75位のアミノ酸がS、又はAであり、
第76位のアミノ酸がK、T、又はRであり、
第77位のアミノ酸がN、S、又はKであり、
第78位のアミノ酸がS、T、R、F、又はIであり、
第79位のアミノ酸がA、又はLであり、
第80位のアミノ酸がY、F、又はHであり、
第81位のアミノ酸がL、V、又はQであり、
第83位のアミノ酸がM、K、又はTであり、
第84位のアミノ酸がN、I、S、又はGであり、
第85位のアミノ酸がS、N、又はRであり、
第86位のアミノ酸がL、又はRであり、
第87位のアミノ酸がR、I、又はKであり、
第88位のアミノ酸がT、A、P、又はDであり、
第89位のアミノ酸がE、又はGであり、
第90位のアミノ酸がD、又はGであり、
第91位のアミノ酸がT、又はMであり、
第93位のアミノ酸がV、L、又はAである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号4に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、
第2位のアミノ酸がV、又はLであり、
第6位のアミノ酸がE、D、又はQであり、
第7位のアミノ酸がS、W、又はLであり、
第9位のアミノ酸がP、S、又はAであり、
第12位のアミノ酸がV、又はLであり、
第16位のアミノ酸がQ、D、E、又はGであり、
第23位のアミノ酸がT、又はAであり、
第24位のアミノ酸がV、又はIであり、
第25位のアミノ酸がS、T、又はYであり、
第29位のアミノ酸がI、V、又はFであり、
第30位のアミノ酸がSであり、
第31位のアミノ酸がS、又はGであり、
第32位のアミノ酸がG、又はSであり、
第32位のアミノ酸の次に、G、S、又はDが挿入されており、
第33位のアミノ酸がY、又はNであり、
第34位のアミノ酸がY、S、又はWであり、
第36位のアミノ酸がS、G、又はCであり、
第38位のアミノ酸がI、又はVであり、
第41位のアミノ酸がH、又はPであり、
第42位のアミノ酸がP、L、又はAであり、
第43位のアミノ酸がGであり、
第44位のアミノ酸がKであり、
第45位のアミノ酸がGであり、
第51位のアミノ酸がY、C、S、R、又はEであり、
第52位のアミノ酸がI、又はFであり、
第53位のアミノ酸がY、N、又はIであり、
第54位のアミノ酸がY、H、又はTであり、
第58位のアミノ酸がT、又はIであり、
第59位のアミノ酸がY、又はNであり、
第60位のアミノ酸がY、又はNであり、
第67位のアミノ酸がR、又はLであり、
第68位のアミノ酸がV、A、又はIであり、
第70位のアミノ酸がM、又はIであり、
第74位のアミノ酸がT、K、P、又はRであり、
第78位のアミノ酸がQ、又はHであり、
第80位のアミノ酸がS、P、又はYであり、
第82位のアミノ酸がK、又はNであり、
第83位のアミノ酸がL、又はPであり、
第84位のアミノ酸がS、又はGであり、
第88位のアミノ酸がA、又は欠失しており、
第89位のアミノ酸がA、又はVであり、
第91位のアミノ酸がT、又はAであり、
第92位のアミノ酸がA、又はGであり、
第94位のアミノ酸がY、又はDである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号5に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号5に示されるアミノ酸配列において、
第34位のアミノ酸がI、又はTであり、
第42位のアミノ酸がG、又はRであり、
第75位のアミノ酸がS、又はPである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)又は(ii)に示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号6に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号6に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号7に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号7に示されるアミノ酸配列において、
第84位のアミノ酸がC、又はSであり、
第85位のアミノ酸がS、又はTである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号8に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号8に示されるアミノ酸配列において、
第1位のアミノ酸がD、A、N、又はVであり、
第3位のアミノ酸がQ、W、又はRであり、
第4位のアミノ酸がM、又はLであり、
第5位のアミノ酸がT、又はIであり、
第9位のアミノ酸がS、又はFであり、
第10位のアミノ酸がT、S、A、L、又はFであり、
第11位のアミノ酸がL、M、V、又はFであり、
第15位のアミノ酸がV、又はTであり、
第20位のアミノ酸がT、又はSであり、
第22位のアミノ酸がT、I、又はSであり、
第24位のアミノ酸がR、Q、又はWであり、
第25位のアミノ酸がA、V、又はMであり、
第26位のアミノ酸がS、又はRであり、
第27位のアミノ酸がQ、又はEであり、
第28位のアミノ酸がG、S、又はDであり、
第30位のアミノ酸がR、又はSであり、
第31位のアミノ酸がS、又はNであり、
第32位のアミノ酸がW、A、Y、D、又はNであり、
第34位のアミノ酸がA、N、又はGであり、
第36位のアミノ酸がY、又はFであり、
第37位のアミノ酸がQ、L、又はRであり、
第41位のアミノ酸がG、E、又はAであり、
第43位のアミノ酸がA、V、又はSであり、
第45位のアミノ酸がK、又はEであり、
第46位のアミノ酸がL、R、S、又はHであり、
第47位のアミノ酸がL、又はFであり、
第48位のアミノ酸がI、又はLであり、
第50位のアミノ酸がD、K、S、A、又はYであり、
第52位のアミノ酸がS、又はKであり、
第53位のアミノ酸がS、N、T、又はDであり、
第55位のアミノ酸がE、Q、又はHであり、
第56位のアミノ酸がS、T、又はPであり、
第59位のアミノ酸がP、又はSであり、
第65位のアミノ酸がS、又はRであり、
第70位のアミノ酸がE、又はDであり、
第71位のアミノ酸がF、又はYであり、
第73位のアミノ酸がL、又はFであり、
第76位のアミノ酸がS、又はIであり、
第77位のアミノ酸がS、N、又はCであり、
第79位のアミノ酸がQ、又はKであり、
第80位のアミノ酸がP、又はSであり、
第81位のアミノ酸がD、又はEであり、
第83位のアミノ酸がF、V、又はIであり、
第85位のアミノ酸がT、又はAであり、
第88位のアミノ酸がG、又はCである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号9に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号9に示されるアミノ酸配列において、
第2位のアミノ酸がI、又はVであり、
第7位のアミノ酸がT、又はSであり、
第11位のアミノ酸がL、又はSであり、
第12位のアミノ酸がS、又はPであり、
第17位のアミノ酸がQ、又はEであり、
第23位のアミノ酸がC、又はFであり、
第24位のアミノ酸がK、又はRであり、
第30位のアミノ酸がL、又はVであり、
第31位のアミノ酸がH、D、又はYであり、
第33位のアミノ酸がD、又はNであり、
第33位のアミノ酸の次に、Dが挿入されており、
第35位のアミノ酸がK、N、又はYであり、
第36位のアミノ酸がT、又はNであり、
第39位のアミノ酸がY、D、S、又はNであり、
第40位のアミノ酸がW、又はCであり、
第41位のアミノ酸がY、L、又はFであり、
第42位のアミノ酸がL、又はQであり、
第44位のアミノ酸がK、又はRであり、
第48位のアミノ酸がS、又はPであり、
第50位のアミノ酸がQ、又はRであり、
第51位のアミノ酸がL、又はRであり、
第55位のアミノ酸がE、L、T、又はKであり、
第56位のアミノ酸がV、G、L、又はIであり、
第58位のアミノ酸がS、N、又はYであり、
第59位のアミノ酸がR、又はWであり、
第60位のアミノ酸がF、A、又はDであり、
第69位のアミノ酸がG、又はDであり、
第72位のアミノ酸がS、又はAである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号10に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号10に示されるアミノ酸配列において、
第4位のアミノ酸がL、又はMであり、
第9位のアミノ酸がA、G、又はPであり、
第13位のアミノ酸がL、又はVであり、
第19位のアミノ酸がA、又はVであり、
第24位のアミノ酸がR、又はGであり、
第28位のアミノ酸がS、又はGであり、
第32位のアミノ酸がS、又はN、若しくは欠失しており、
第33位のアミノ酸がN、又は欠失しており、
第35位のアミノ酸がA、T、又はSであり、
第43位のアミノ酸がQ、又はLであり、
第51位のアミノ酸がD、又はGであり、
第54位のアミノ酸がN、S、又はTであり、
第58位のアミノ酸がG、又はSであり、
第61位のアミノ酸がA、又はDであり、
第68位のアミノ酸がS、又はPであり、
第70位のアミノ酸がT、又はRであり、
第71位のアミノ酸がD、又はEであり、
第78位のアミノ酸がS、又はRであり、
第80位のアミノ酸がE、又はQであり、
第81位のアミノ酸がP、又はSである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)又は(ii)に示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号11に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号11に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)又は(ii)に示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号12に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号12に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号13に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号13に示されるアミノ酸配列において、
第1位のアミノ酸がE、又はDであり、
第2位のアミノ酸がI、又はVであり、
第4位のアミノ酸がL、又はMであり、
第9位のアミノ酸がD、又はAであり、
第11位のアミノ酸がQ、又はLであり、
第16位のアミノ酸がK、又はGであり、
第24位のアミノ酸がR、又はQであり、
第27位のアミノ酸がQ、又はEであり、
第28位のアミノ酸がS、又はGであり、
第31位のアミノ酸がS、又はNであり、
第32位のアミノ酸がS、又はYであり、
第34位のアミノ酸がH、又はYであり、
第43位のアミノ酸がS、又はAであり、
第55位のアミノ酸がF、又はIであり、
第73位のアミノ酸がL、又はFであり、
第76位のアミノ酸がN、又はSである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号14に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号14に示されるアミノ酸配列において、
第4位のアミノ酸がL、又はVであり、
第10位のアミノ酸がA、又はVであり、
第12位のアミノ酸がG、E、又はAであり、
第13位のアミノ酸がT、又はAであり、
第15位のアミノ酸がG、又はRであり、
第17位のアミノ酸がR、又はKであり、
第23位のアミノ酸がS、又はTであり、
第28位のアミノ酸がN、又はDであり、
第29位のアミノ酸がI、又はMであり、
第31位のアミノ酸がS、N、又はAであり、
第31位のアミノ酸の次に、Gが挿入されており、
第32位のアミノ酸がN、又はYであり、
第33位のアミノ酸がY、A、D、又はTであり、
第35位のアミノ酸がY、N、H、又はSであり、
第43位のアミノ酸がT、又はKであり、
第51位のアミノ酸がR、S、Y、G、D、又はEであり、
第52位のアミノ酸がN、又はDであり、
第53位のアミノ酸がN、D、又はSであり、
第54位のアミノ酸がQ、L、N、又はKであり、
第55位のアミノ酸がR、又はLであり、
第59位のアミノ酸がV、又はIであり、
第60位のアミノ酸がP、又はSであり、
第62位のアミノ酸がR、又はQであり、
第70位のアミノ酸がT、又はAであり、
第73位のアミノ酸がS、又はTであり、
第75位のアミノ酸がA、又はGであり、
第77位のアミノ酸がS、又はTであり、
第80位のアミノ酸がR、Q、又はWであり、
第81位のアミノ酸がS、A、T、又はPであり、
第82位のアミノ酸がE、又はGである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号15に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号15に示されるアミノ酸配列において、
第8位のアミノ酸がP、A、又はRであり、
第9位のアミノ酸がS、又はFであり、
第10位のアミノ酸がA、又はVであり、
第12位のアミノ酸がG、又はRであり、
第13位のアミノ酸がS、又はAであり、
第18位のアミノ酸がV、又はIであり、
第31位のアミノ酸がG、S、又はDであり、
第33位のアミノ酸がN、又はDであり、
第34位のアミノ酸がY、L、R、又はHであり、
第36位のアミノ酸がS、又はFであり、
第40位のアミノ酸がQ、又はKであり、
第41位のアミノ酸がH、P、又はRであり、
第42位のアミノ酸がP、又はLであり、
第43位のアミノ酸がG、又はSであり、
第44位のアミノ酸がK、又はTであり、
第45位のアミノ酸がA、又はTであり、
第46位のアミノ酸がP、又はSであり、
第47位のアミノ酸がK、又はRであり、
第49位のアミノ酸がM、又はLであり、
第52位のアミノ酸がE、D、又はNであり、
第53位のアミノ酸がV、又はGであり、
第54位のアミノ酸がS、又はNであり、
第55位のアミノ酸がK、N、又はTであり、
第60位のアミノ酸がV、又はIであり、
第61位のアミノ酸がP、又はSであり、
第62位のアミノ酸がD、又はNであり、
第63位のアミノ酸がR、又はLであり、
第64位のアミノ酸がF、又はSであり、
第65位のアミノ酸がS、又はFであり、
第72位のアミノ酸がT、M、又はVであり、
第77位のアミノ酸がV、I、又はTであり、
第81位のアミノ酸がQ、又はKであり、
第82位のアミノ酸がA、又はSであり、
第84位のアミノ酸がD、又はVであり、
第87位のアミノ酸がD、又はNであり、
第89位のアミノ酸がY、又はHである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号16に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号16に示されるアミノ酸配列において、
第2位のアミノ酸がY、又はSであり、
第3位のアミノ酸がE、V、又はGであり、
第4位のアミノ酸がL、又はPであり、
第5位のアミノ酸がT、又はMであり、
第7位のアミノ酸がP、L、D、又はVであり、
第8位のアミノ酸がL、H、P、又はSであり、
第9位のアミノ酸がS、又はAであり、
第13位のアミノ酸がA、又はSであり、
第14位のアミノ酸がL、T、又はPであり、
第15位のアミノ酸がG、又はAであり、
第16位のアミノ酸がQ、又はKであり、
第17位のアミノ酸がT、A、又はMであり、
第18位のアミノ酸がA、又はVであり、
第19位のアミノ酸がR、又はSであり、
第23位のアミノ酸がG、S、又はQであり、
第25位のアミノ酸がN、D、又はEであり、
第26位のアミノ酸がN、A、V、K、又はSであり、
第27位のアミノ酸がI、L、又はMであり、
第28位のアミノ酸がG、P、A、R、又はEであり、
第29位のアミノ酸がS、Y、K、E、D、又はGであり、
第30位のアミノ酸がK、Q、N、Y、又はSであり、
第31位のアミノ酸がN、S、A、又はYであり、
第32位のアミノ酸がV、A、又はEであり、
第33位のアミノ酸がH、Y、R、D、C、又はSであり、
第35位のアミノ酸がY、又はFであり、
第39位のアミノ酸がP、又はSであり、
第42位のアミノ酸がA、D、F、又はSであり、
第44位のアミノ酸がV、又はEであり、
第47位のアミノ酸がI、又はVであり、
第49位のアミノ酸がR、S、D、K、E、Q、G、又はYであり、
第50位のアミノ酸がD、K、又はSであり、
第51位のアミノ酸がS、又はNであり、
第52位のアミノ酸がN、D、E、又はKであり、
第54位のアミノ酸がP、又はYであり、
第55位のアミノ酸がS、又はPであり、
第56位のアミノ酸がG、又はRであり、
第59位のアミノ酸がE、又はDであり、
第65位のアミノ酸がN、S、T、又はKであり、
第66位のアミノ酸がS、又はPであり、
第68位のアミノ酸がN、又はTであり、
第69位のアミノ酸がT、I、又はMであり、
第70位のアミノ酸がA、T、又はVであり、
第71位のアミノ酸がT、又はSであり、
第75位のアミノ酸がS、又はTであり、
第76位のアミノ酸がR、又はGであり、
第77位のアミノ酸がA、I、V、又はTであり、
第78位のアミノ酸がQ、E、又はLであり、
第79位のアミノ酸がA、V、又はTであり、
第80位のアミノ酸がG、E、又はMであり、
第83位のアミノ酸がA、又はDであり、
第87位のアミノ酸がC、又はYである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号17に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号17に示されるアミノ酸配列において、
第1位のアミノ酸がQ、又はLであり、
第2位のアミノ酸がP、又はLであり、
第7位のアミノ酸がS、又はPであり、
第8位のアミノ酸がS、又はPであり、
第13位のアミノ酸がS、又はLであり、
第16位のアミノ酸がS、又はAであり、
第18位のアミノ酸がV、又はIであり、
第27位のアミノ酸がG、又はEであり、
第30位のアミノ酸がS、又はTであり、
第32位のアミノ酸がI、A、又はTであり、
第34位のアミノ酸がA、又はEであり、
第36位のアミノ酸がH、又はYであり、
第39位のアミノ酸がQ、又はRであり、
第41位のアミノ酸がG、又はEであり、
第42位のアミノ酸がK、又はRであり、
第43位のアミノ酸がA、G、又はSであり、
第45位のアミノ酸がR、又はQであり、
第47位のアミノ酸がL、又はIであり、
第50位のアミノ酸がL、又はVであり、
第51位のアミノ酸がE、N、又はKであり、
第52位のアミノ酸がG、又はSであり、
第53位のアミノ酸がS、又はDであり、
第56位のアミノ酸がY、又はHであり、
第57位のアミノ酸がN、又はSであり、
第60位のアミノ酸がS、又はDであり、
第62位のアミノ酸がV、又はIであり、
第67位のアミノ酸がS、又はMであり、
第74位のアミノ酸がD、又はEであり、
第79位のアミノ酸がI、又はFであり、
第81位のアミノ酸がN、又はSであり、
第84位のアミノ酸がL、F、又はSであり、
第85位のアミノ酸がE、又はDであり、
第89位のアミノ酸がD、又はEであり、
第91位のアミノ酸がY、又はHである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号18に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号18に示されるアミノ酸配列において、
第2位のアミノ酸がA、又はPであり、
第8位のアミノ酸がS、A、T、又はPであり、
第10位のアミノ酸がL、S、又はHであり、
第14位のアミノ酸がP、又はSであり、
第16位のアミノ酸がA、又はEであり、
第18位のアミノ酸がA、又はVであり、
第19位のアミノ酸がS、又はRであり、
第20位のアミノ酸がL、又はFであり、
第23位のアミノ酸がT、又はMであり、
第25位のアミノ酸がR、S、又はPであり、
第27位のアミノ酸がG、又はDであり、
第28位のアミノ酸がI、又はFであり、
第29位のアミノ酸がN、又はSであり、
第30位のアミノ酸がV、又はLであり、
第32位のアミノ酸がT、S、又はDであり、
第33位のアミノ酸がY、又はFであり、
第34位のアミノ酸がR、N、又はWであり、
第36位のアミノ酸がY、F、又はRであり、
第41位のアミノ酸がK、又はNであり、
第43位のアミノ酸がG、又はEであり、
第44位のアミノ酸がS、又はNであり、
第45位のアミノ酸がP、又はLであり、
第47位のアミノ酸がQ、又はRであり、
第51位のアミノ酸がR、S、又はYであり、
第53位のアミノ酸がK、Y、又はHであり、
第57位のアミノ酸がD、S、又はNであり、
第59位のアミノ酸がQ、H、又はGであり、
第72位のアミノ酸がK、又はNであり、
第76位のアミノ酸がA、T、又はSであり、
第78位のアミノ酸がA、又はTであり、
第80位のアミノ酸がI、又はLであり、
第82位のアミノ酸がL、V、又はRであり、
第88位のアミノ酸がS、又はPである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)又は(ii)に示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号19に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号19に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号20に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号20に示されるアミノ酸配列において、
第2位のアミノ酸がA、又はTであり、
第23位のアミノ酸がG、又はAであり、
第33位のアミノ酸がH、又はYであり、
第36位のアミノ酸がY、又はNであり、
第48位のアミノ酸がT、又はAであり、
第52位のアミノ酸がD、又はSであり、
第78位のアミノ酸がS、又はLであり、
第80位のアミノ酸がA、又はVである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号21に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号21に示されるアミノ酸配列において、
第63位のアミノ酸がR、又はCである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)又は(ii)に示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号22に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号22に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号23に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号23に示されるアミノ酸配列において、
第28位のアミノ酸がN、又はIであり、
第37位のアミノ酸がL、又はPであり、
第38位のアミノ酸がQ、又はEであり、
第63位のアミノ酸がL、又はFである配列;
(iii)上記(i)又は(ii)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 以下の(i)又は(ii)に示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチド。
(i)配列番号24に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号24に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列; - 請求項2〜25のいずれか記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 以下の工程(a)及び(b)を順次備えることを特徴とするヒト抗体可変領域と特異的に結合する分子をスクリーニングする方法。
(a)請求項2〜25のいずれかに示されるアミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドを含むスクリーニング用ポリペプチドを調製する工程;
(b)上記工程(a)により調製されたスクリーニング用ポリペプチドと被検物質とを接触させ、上記ポリペプチドと特異的に結合する被検物質を選択する工程; - スクリーニング用ポリペプチドが、アミノ酸コンセンサス配列からなるポリペプチドのC末端側に、さらにCDR3を含むことを特徴とする請求項26記載の方法。
- 被検物質が、ペプチドであることを特徴とする請求項26記載の方法。
- ファージディスプレイ法を用いることを特徴とする請求項26〜28のいずれかに記載の方法。
- 請求項26〜29のいずれかに記載の方法により得られる、ヒト抗体可変領域と特異的に結合する分子。
- ペプチドであることを特徴とする請求項30記載の分子。
- 配列番号32、66、69、71、78、80、82、83、85、87、90、92、94〜99、若しくは104〜304のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は上記アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
- 請求項26〜29のいずれかに記載の方法により得られる、ヒト抗体可変領域と特異的に結合する分子を用いて抗体を精製する方法。
- 配列番号32、66、69、71、78、80、82、83、85、87、90、92、94〜99、又は104〜304のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は上記アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを用いて抗体を精製する方法。
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