TW202128748A - 提升抗體對抗原之親和性的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題係提供一種提升抗體對抗原之親和性的新穎方法，係藉由不改變互補性決定區域的胺基酸序列，但改變框架區域的胺基酸序列；以及一種對抗原之親和性經提升的抗體。
上述課題係藉由於抗體之輕鏈框架區域的胺基酸序列中，將選自由以Kabat法所定義之輕鏈的第60、63、65、67、70、72、74、76、77、79及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少3個胺基酸殘基(惟，包含選自輕鏈的第60、74、76、77、79及81號的胺基酸中之至少1者)設為帶電荷胺基酸殘基而解決。
Description
本發明係關於提升抗體對抗原之親和性的方法。本發明係關於與未修改抗體相比，對抗原的親和性已提升的修改抗體。本發明係關於與未修改抗體相比，對抗原的親和性已提升的修改抗體。
先前，已知藉由修改抗體的胺基酸序列，使該抗體對抗原之親和性變化的技術。例如，專利文獻1中，藉由將抗體的框架區域3的至少3個胺基酸殘基設為帶電荷胺基酸殘基，而控制對抗原的親和性的方法。此方法中，維持互補性決定區域(CDR)的胺基酸序列原樣，提升抗體對抗原之親和性。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]美國專利申請公開案第2018/0179298號說明書
本發明的目的係提供不修改CDR的胺基酸序列，但修改框架區域(FR)的胺基酸殘基而提升抗體對抗原之親和性的新穎方法，以及對抗原之親和性經提升的新穎抗體。
本發明者們發現抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中各位置的預定胺基酸殘基的胺基酸頻率的合計值、以及該FR中各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率，係參與抗體對抗原的親和性，進而完成本發明。
本發明提供一種提升抗體對抗原之親和性的方法，係包含：於未修改抗體中，將選自以Kabet法所定義的輕鏈的第60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少3個胺基酸殘基設為帶電荷胺基酸殘基，藉此與未修改抗體相比，提升對抗原之親和性，其中，該3個胺基酸殘基係包含選自由輕鏈的第60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少一者。
本發明係提供一種抗體的製造方法，該抗體為與未修改抗體相比，對抗原之親和性經提升者，該製造方法係包含下列步驟：於未修改抗體中，將選自由以Kabat法所定義之輕鏈的第60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少3個胺基酸殘基設為帶電荷胺基酸殘基的步驟，以及回收此步驟所得之抗體的步驟，其中，該3個胺基酸殘基係包含選自由輕鏈的第60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少一者。
本發明提供一種修改抗體，其係與未修改抗體相比，對抗原之親和性經提升者。此修改抗體中，選自由未修改抗體中以Kabat法所定義之輕鏈的第60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少3個胺基酸殘基被設為帶電荷胺基酸殘基，其中，該3個胺基酸殘基係包含選自由輕鏈的第60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少一者。
根據本發明，可提供對抗原之親和性經提升的抗體。
10:胺基酸序列的解析裝置(解析裝置)
20:序列數據伺服器
30:網絡
40:記憶媒體
100:控制部(電腦本體)
101,211:輸入部
102,212:輸出部(顯示部)
110:CPU
111:記憶體
112:記憶裝置
113:介面
114:讀取裝置
115:匯流排
210:控制部
213:記憶部
214:通信部
215:胺基酸序列數據庫
圖1係胺基酸序列的解析系統的概略圖。
圖2係顯示胺基酸序列的解析系統的硬體構成圖。
圖3係顯示由胺基酸序列的解析裝置所進行之未修改抗體的胺基酸序列的解析處理的流程圖。
圖4係顯示解析結果的顯示畫面的一例之圖。
圖5係顯示由胺基酸序列的解析裝置所進行之用以具體辨識出抗體的候補修改位點之胺基酸序列的解析處理的流程圖。
圖6係顯示解析結果的顯示畫面的一例之圖。
圖7係顯示由胺基酸序列的解析裝置所進行之胺基酸序列的解析處理的流程圖，該解析處理係用以作成將抗體的候補修改位點設成帶電荷胺基酸殘基時的序列。
圖8係顯示由胺基酸序列的解析裝置所進行之胺基酸序列的解析處理的流程圖，該解析處理係用以作成當CDR的電特性為中性時將抗體的候補修改位點設成帶電荷胺基酸殘基時的序列。
圖9係將抗體的溶出液以SDS-PAGE分離且以考馬西藍(CBB)染色之凝膠的照片。
[1.提升抗體對抗原之親和性的方法]
本實施態樣之使抗體對抗原之親和性提升的方法(以下，亦稱為「親和性的提升方法」)，係於抗體之輕鏈FR胺基酸序列中滿足預定條件的胺基酸殘基之中，將至少3個胺基酸殘基設為帶電荷胺基酸殘基。藉此，與未修改的抗體相比，提升抗體對抗原的親和性。在此，成為藉由根據上述本發明所提供的方法而提升對抗原的親和性之原本的抗體稱為「未修改抗體」。本說明書中之「未修改抗體」意指具有適用「親和性的提升方法」前的胺基酸序列之抗體。「未修改抗體」，不僅為具有天然胺基酸序列的抗體(野生型抗體)，亦包含胺基酸序列基於「親和性的提升方法」以外的方法經人為變更而得的抗體。
本實施態樣中，未修改抗體沒有特別限定。本實施態樣之親和性的提升方法不需要變更CDR的胺基酸序列，因此可為任一種辨識抗原的抗體。較佳實施態樣中，未修改抗體係編碼輕鏈可變區域的基因的鹼基序列為公知或可確認該鹼基序列的抗體。具體而言，抗體基因的鹼基序列已揭示於公知數據庫的抗體，或可取得產生該抗體之融合瘤的抗體。此等之數據
庫可列舉例如：GeneBank、abYsis、IMGT等。抗體的類型可為IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE之任一者，較佳為IgG。未修改抗體在具有包含FR的可變區域的限制下，亦可為抗體片段的形態。此等之抗體片段可列舉例如：Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、單鏈抗體(scFv)、還原型IgG(rIgG)等。此等之中，特佳為Fab片段。
未修改抗體之一例於表1顯示人源化抗HER2抗體(曲妥珠單抗)的輕鏈以及重鏈的胺基酸序列，以及Fab片段的重鏈胺基酸序列。表1中，附加底線部分表示可變區域，以灰色標記部分表示CDR。
[表1]
野生型的人源化抗HER2抗體的輕鏈之各CDR以及可變區域的胺基酸序列係如下述。
˙輕鏈CDR1：RASQDVNTAVA(序列編號38)
˙輕鏈CDR2：SASFLYS(序列編號39)
˙輕鏈CDR3：QQHYTTPPT(序列編號40)
˙可變區域：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFIYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTV(序列編號41)
野生型的人源化抗HER2抗體的重鏈之各CDR以及可變區域的胺基酸序列係如下述。
˙重鏈CDR1：DTYIH(序列編號42)
˙重鏈CDR2：RIYPTNGYTRYADSVKG(序列編號43)
˙重鏈CDR3：WGGDGFYAMDY(序列編號44)
˙可變區域：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(序列編號45)
框架區域(FR)係存在於抗體的輕鏈以及重鏈之各別的可變區域，為CDR以外的區域。FR係擔任連結3個CDR的支架的角色，賦予CDR的結構穩定性。因此，FR的胺基酸序列係於同種(species)抗體間被高度地保存。輕鏈以及重鏈之各別的可變區域中，有CDR1、CDR2以及CDR3之3個CDR，以及FR1、FR2、FR3以及FR4之4個FR。該等係從可變區域的N末端側以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4的順序排列。以下，述及抗體的FR時，除非特別限定，「框架區域」以及「FR」之用語意指輕鏈FR。
本實施態樣之親和性的提升方法，係在未修改抗體的輕鏈FR胺基酸序列中滿足預定條件的胺基酸殘基中，將至少3個設為帶電荷胺基酸殘基。滿足預定條件的胺基酸殘基，係滿足下述(1)及(2)條件二者的胺基酸殘基。
(1)未修改抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中，精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、天冬胺酸以及麩胺酸的胺基酸頻率的合計值成為35%以上的位置。
(2)未修改抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中，溶劑暴露表面積比率顯示為20%以上。
本說明書中，未修改抗體中，將滿足上述(1)以及(2)條件之胺基酸殘基作成帶電荷胺基酸殘基之行為，亦稱為「進行修改」或「修改」。以下，將未修改抗體藉由本實施態樣之親和性的提升方法修改而得之抗體亦稱為「修改抗體」。
由於CDR參與抗體的特異性，因此本實施態樣之親和性的提升方法中，較佳為不變更CDR的胺基酸序列。亦即，修改抗體之CDR的胺基酸序列，較佳為與未修改抗體之CDR的胺基酸序列相同。
本實施態樣中，修改抗體對抗原之親和性，可藉由抗原抗體反應中之動力學參數評估，亦可藉由ELISA法等免疫學測定法評估。動力學的參數係可列舉例如：解離常數(Kd)、結合速度常數(kon)以及解離速度常數(koff)。其等之中較佳為Kd。抗原抗體反應中之動力學參數，可藉由表面電漿子共振(SPR)技術等而取得。與未修改抗體相比較，修改抗體之抗原抗體反應中之Kd值例如為約1/2、約1/5、約1/10、約1/20、約1/50、約1/100或約1/1000。
本說明書中之「位置」意指某胺基酸序列中胺基酸殘基的位置。本實施態樣中，FR的胺基酸序列中之位置，係藉由對CDR的胺基酸殘基附加編號的方法(以下，亦稱為「編號法」)所定義之FR的胺基酸序列中之位置。編號法係用以定義CDR的界限以及長度之方法，已知於所屬技術領域。藉由編號法對CDR的胺基酸序列附加編號時，亦對FR的胺基酸序列附加編號。本實施態樣中，FR的胺基酸序列中之位置，係以編號法所附加的編號顯示。本說明書中，「Ln」(n為正整數)係表示輕鏈胺基酸序列中第n號的位置。例如，L1意指輕鏈胺基酸序列之第1號位置，L2意指輕鏈胺基酸序列之第2號位置。
編號法可列舉例如：Kabat法(Kabat EA.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest.,NIH publication No.91-3242)、Chothia法(Chothia C.以及Lesk AM.,Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins.,J Mol Biol.,vol.196,p.901-917,1987)、IMGT法(Lefranc MP.等人，Developmental and Comparative Immunology 29(2005)185-203)、Honergger法(Honegger A.等人，Yet Another Numbering Scheme for Immunoglobulin Variable Domains：An Automatic Modeling and Analysis Tool.,J Mol Biol.,vol.309,p.657-670,2001)、ABM法、Contact法等。本實施態樣中，抗體的FR可以任一編號法定義，較佳係藉由Kabat法定義。未修改抗體中，以Kabat法定義，輕鏈FR1係定義為包含輕鏈的第1至23號的胺基酸殘基的區域，輕鏈FR2係定義為包含輕鏈的第35至49號的胺基酸殘基的區域，輕鏈FR3係定義為包含輕鏈的第57至88號的胺基
酸殘基的區域，輕鏈FR4係定義為包含輕鏈的第98至109號的胺基酸殘基的區域。
胺基酸頻率，亦稱為胺基酸出現頻率，意指將複數個胺基酸序列的整列(alignment)，於該等胺基酸序列之各位置中，顯示預定的胺基酸以何種程度出現的比例。胺基酸頻率本身為已知的指標。胺基酸序列的整列，意指將複數個胺基酸序列整列為可比較的狀態。胺基酸序列的整列，例如可藉由ClustalW、TREBMAL等習知多重整列程式等進行。再者，胺基酸頻率的算出方法本身係習知，可藉由上述多重整列程式等算出。胺基酸序列的整列以及胺基酸頻率的算出可藉由abYsis進行。abYsis不僅可利用為提供抗體序列的數據庫，亦可利用為抗體之序列、結構以及功能之解析及預測用之軟體。例如，於經整列的複數個胺基酸序列之預定位置中，某胺基酸在該複數個胺基酸序列全部出現時，此位置之該胺基酸的胺基酸頻率成為100%。於經整列的複數個胺基酸序列之預定位置中，某胺基酸於該複數個胺基酸序列中出現半數時，此位置之該胺基酸的胺基酸頻率成為50%。於經整列的複數個胺基酸序列之預定位置中，某胺基酸一次都沒有出現時，此位置之該胺基酸的胺基酸頻率成為0%。
本實施態樣中，未修改抗體之FR中，為了具體辨識出滿足上述(1)條件的胺基酸殘基，取得複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列。藉由整列所取得之複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列，可取得參考抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中之各位置的胺基酸頻率。從複數個參考抗體所取得之各位置的胺基酸頻率，可利用為未修改抗體之輕鏈胺基酸序列中之對應位置的胺基酸頻率。參考抗體係在與未修改抗體為胺基酸序列不同的抗體之限制下，沒有
特別限定。抗體之FR的胺基酸序列，由於在同種抗體間高度地保存，參考抗體較佳為與未修改抗體為同種的抗體。參考抗體之輕鏈胺基酸序列，可由GeneBank、abYsis、IMGT等習知的數據庫取得。參考抗體之輕鏈胺基酸序列的數目沒有特別限定，例如為1000以上，較佳為10000以上。取得之複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列，可為輕鏈全體的胺基酸序列，亦可為輕鏈之一部分胺基酸序列。輕鏈之一部分胺基酸序列，較佳為包含FR1及/或FR3的胺基酸序列。
將所取得之複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列整列，取得參考抗體之FR的胺基酸序列之各位置中精胺酸(R)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、纈胺酸(V)、天冬胺酸(D)以及麩胺酸(E)之各別的胺基酸頻率。此處，「將複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列整列」意指於複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列之間，以使藉由預定的編號法所附加之FR中的胺基酸殘基編號成一致的方式，排列該複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列。本實施態樣中，較佳為使藉由Kabat法所附加之FR中之胺基酸殘基的編號成一致的方式，排列複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列。針對各位置，將R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率之值合計並算出合計值。例如，於經整列之複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列中，某1個位置的胺基酸頻率的合計值X(%)，係可從出現在該位置的R、S、T、V、D以及E的數目，以及所取得之參考抗體之輕鏈胺基酸序列的數目，藉由下述式(I)算出。針對包含經整列之複數個參考抗體之輕鏈FR1及/或輕鏈FR3的胺基酸序列之各位置進行該計算。算出所使用之參考抗體之輕鏈胺基酸序列的數目，於每個位置亦可不同。例如，L1之X
值係可基於10000個參考抗體之輕鏈胺基酸序列算出，L2之X值係可基於15000個參考抗體之輕鏈胺基酸序列算出。
於經整列的複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列中，具體辨識出所取得之胺基酸頻率的合計值成為35%以上，較佳成為37%以上的位置。然後，滿足上述(1)條件的胺基酸殘基，係具體辨識為於未修改抗體之輕鏈FR中，位於與從複數個參考抗體所具體辨識出的位置對應之位置的胺基酸殘基。此等胺基酸殘基，例如，亦可藉由將未修改抗體之輕鏈胺基酸序列、及複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列整列而具體辨識。複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列例如基於藉由Kabat法所定義之FR進行整列時，未修改抗體之FR中，藉由Kabat法所附加之胺基酸殘基的編號，係具體辨識為與上述胺基酸頻率的合計值成為35%以上之參考抗體的序列中的位置相同的胺基酸殘基。
本實施態樣中，滿足上述(2)條件的胺基酸殘基，係基於未修改抗體之輕鏈胺基酸序列予以具體辨識。具體而言，首先，使用未修改抗體之輕鏈胺基酸序列，取得該未修改抗體之輕鏈的三維結構數據。三維結構數據係包含構成蛋白質之各胺基酸殘基的座標數據，較佳為藉由RasMol、Jmol等習知的分子圖案程式可將蛋白質的立體結構視覺化的數據。三維結構數據亦可針對未修改抗體之輕鏈進行X射線結晶結構解析、NMR解析等習知的立體結構解析而取得。較佳實施態樣中，三維結構數據，可從PDB(Protein
Data Bank)、BMRB(Biological Magnetic Resonance Bank)等習知的蛋白質立體結構數據庫，藉由檢索未修改抗體之輕鏈胺基酸序列而獲得。數據庫中，存在具有與未修改抗體之輕鏈胺基酸序列一致序列的蛋白質時，下載該蛋白質的三維結構數據。
蛋白質立體結構數據庫中，沒有未修改抗體之輕鏈的三維結構數據時，亦可取得作成該三維結構數據所必須的資訊，基於此資訊作成三維結構數據。例如，亦可基於未修改抗體之輕鏈胺基酸序列，藉由同源建模法等作成三維結構數據。同源建模法中，三維結構數據的作成所必須的資訊，係使用與未修改抗體之輕鏈胺基酸序列具有至少20%同一性且立體結構為已知的抗體之輕鏈胺基酸序列(以下，亦稱為「參考序列」)。所屬技術領域中，已知胺基酸序列的同一性高的蛋白質之間為立體結構互相類似。參考序列可由例如GeneBank、abYsis、IMGT等習知的數據庫取得。同源建模法中，將未修改抗體之輕鏈胺基酸序列與參考序列整列，基於整列的結果，從參考序列之已知結構構築未修改抗體之輕鏈的三維結構。藉由同源建模法進行之三維結構數據作成本身為習知，例如可藉由MODELLER等習知的立體結構預測程式進行。
其次，基於所取得之三維結構數據，取得未修改抗體之FR的各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率。所屬技術領域中，溶劑暴露表面積係以接近蛋白質分子表面(凡得瓦爾表面)的方式，定義為假設水分子的探針球(1.4Å)轉動時之該探針球的中心的軌跡面。溶劑暴露表面積本身為習知的指標。蛋白質的溶劑暴露表面積可從該蛋白質的三維結構數據藉由SURFace、GETAREA、Discovery Studio等習知程式或軟體取得。再者，亦可取得蛋白
質中各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積。蛋白質中胺基酸殘基的溶劑暴露表面積，係根據該胺基酸的側鏈大小而不同。此處，將蛋白質中胺基酸殘基的溶劑暴露表面積作為該胺基酸的側鏈大小經規格化之指標，使用溶劑暴露表面積比率。溶劑暴露表面積比率本身為習知的指標。例如，蛋白質A中胺基酸X的溶劑暴露表面積比率Y(%)，係藉由下述式(II)算出。式中，「Ala-X-Ala」係由胺基酸X以2個丙胺酸夾持之序列構成的三肽。
然後，於未修改抗體之FR的胺基酸序列中，具體辨識出所取得之溶劑暴露表面積比率為20%以上，較佳為25%以上之胺基酸殘基。藉此，於未修改抗體之FR的胺基酸序列中，可具體辨識存在於R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率的合計值成為35%以上的位置且溶劑暴露表面積比率顯示為20%以上之胺基酸殘基。
滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基之中，帶電荷胺基酸殘基胺基酸殘基的數目例如為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。帶電荷胺基酸殘基可為鹼性胺基酸殘基，亦可為酸性胺基酸殘基。較佳地，帶電荷胺基酸殘基為相同電荷的胺基酸殘基。帶電荷胺基酸殘基可為相同殘基，亦可為不同殘基。鹼性胺基酸殘基意指離胺酸殘基、精胺酸殘基以及組胺酸殘基。酸性胺基酸殘基意指天冬胺酸殘基以及麩胺酸殘
基。本實施態樣中，帶電荷胺基酸殘基較佳為鹼性胺基酸殘基，特佳為離胺酸殘基以及精胺酸殘基。
滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基之中，成為帶電荷胺基酸殘基之胺基酸殘基較佳為中性胺基酸殘基。所謂中性胺基酸殘基：丙胺酸殘基、天冬醯胺殘基、異白胺酸殘基、甘胺酸殘基、麩醯胺殘基、半胱胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、酪胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、脯胺酸殘基、纈胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基以及色胺酸殘基。
滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基為帶電荷胺基酸殘基時，該胺基酸殘基亦可維持原樣。或者是，滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基為酸性胺基酸殘基時，該胺基酸殘基亦可作成鹼性胺基酸殘基。再者，滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基為鹼性胺基酸殘基時，該胺基酸殘基亦可作成酸性胺基酸殘基。
本實施態樣中，基於未修改抗體之CDR的胺基酸序列之CDR的電特性為中性時，滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基亦可設為帶電荷胺基酸殘基。帶電荷胺基酸殘基較佳為鹼性胺基酸殘基。此處，所謂CDR的電特性係本發明者們所獨自定義的指標，CDR的胺基酸序列中之帶電荷胺基酸殘基的數目而決定。具體而言，CDR的電特性係藉由下述式(III)決定。
Z=[CDR的胺基酸序列中的鹼性胺基酸殘基的數目]-[CDR的胺基酸序列中的酸性胺基酸殘基的數目]‧‧‧(III)
(式中，Z為-1、0或1時，CDR的電特性為中性，
Z為2以上時，CDR的電特性為正電荷，
Z為-2以下時，CDR的電特性為負電荷)
CDR的電特性可基於輕鏈及/或重鏈之CDR的胺基酸序列決定。決定輕鏈之CDR的電特性時，式(III)中之CDR的胺基酸序列意指輕鏈之CDR1、CDR2以及CDR3之全部的胺基酸序列。再者，決定重鏈之CDR的電特性時，式(III)中之CDR的胺基酸序列意指重鏈之CDR1、CDR2以及CDR3之全部的胺基酸序列。較佳地，基於輕鏈以及重鏈二者之CDR胺基酸序列決定。此時，上述式(III)中之CDR的胺基酸序列意指輕鏈之CDR1、CDR2以及CDR3、以及重鏈之CDR1、CDR2以及CDR3之全部的胺基酸序列。本實施態樣中，基於輕鏈以及重鏈二者之CDR的胺基酸序列所決定之電特性為中性之未修改抗體中，可將滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基之至少3個設為帶電荷胺基酸殘基，較佳是設為鹼性胺基酸殘基。
CDR的胺基酸序列可從揭示抗體基因序列之公共數據庫獲得。或者是，有產生未修改抗體之融合瘤時，CDR的胺基酸序列係可藉由習知的方法，從該融合瘤取得編碼重鏈以及輕鏈的核酸，藉由定序該核酸的鹼基序列而獲得。
CDR的電特性根據抗體而不同。例如，於Kabat法中，後述實施例中所使用之野生型(亦即未修改)之抗溶菌酶抗體之輕鏈的CDR中，鹼性胺基酸殘基(精胺酸)為1個，無酸性胺基酸殘基。再者，重鏈的CDR中，鹼性胺基酸殘基(離胺酸)為1個，酸性胺基酸殘基(天冬胺酸)為3個。據此，野生型之抗溶菌酶抗體之CDR的電特性係定義為中性(Z=-1)。又，基於Chothia法之該抗溶菌酶抗體之CDR的電特性成為負電荷。
滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基，較佳為存在於FR1及/或FR3之胺基酸殘基。輕鏈FR1以及FR3中，滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基可列舉例如：以Kabat法所定義之輕鏈第1、3、5、7、9、10、12、14、17、18、20、22、60、63、65、67、69、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基。此等之中，第1、3、5、7、9、10、12、14、17、18、20以及22號的胺基酸殘基係存在於以Kabat法所定義之輕鏈FR1，第60、63、65、67、69、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基係存在於以Kabat法所定義之輕鏈FR3。
較佳實施態樣中，滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基係以Kabat法所定義之輕鏈的第3、5、9、17、18、20、22、60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基。該等胺基酸殘基之中，設為帶電荷胺基酸殘基之至少3個胺基酸殘基，較佳係包含選自以Kabat法所定義之輕鏈的第3、5、9、17、18、20、22、60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基中之至少1者。設為帶電荷胺基酸殘基之至少3個胺基酸殘基，更佳係包含選自以Kabat法所定義之輕鏈的第3、5、9、17、18、20、22、60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基中之至少3個。
修改未修改抗體之輕鏈FR1的胺基酸殘基時，設為帶電荷胺基酸殘基之至少3個胺基酸殘基，較佳係選自以Kabat法所定義之輕鏈的第3、5、9、17、18、20以及22號的胺基酸殘基。如此之3個胺基酸殘基可舉出例如下列1)至4)之任一組合。
1)以Kabat法所定義之輕鏈的第3、5以及9號的胺基酸殘基；
2)以Kabat法所定義之輕鏈的第17、18以及20號的胺基酸殘基；
3)以Kabat法所定義之輕鏈的第18、20以及22號的胺基酸殘基；以及
4)以Kabat法所定義之輕鏈的第5、9以及22號的胺基酸殘基。
修改未修改抗體之輕鏈FR3的胺基酸殘基時，設為帶電荷胺基酸殘基之至少3個胺基酸殘基，較佳係選自以Kabat法所定義之輕鏈的第60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基。該等胺基酸殘基之中，設為帶電荷胺基酸殘基之至少3個胺基酸殘基較佳係包含選自以Kabat法所定義之輕鏈的第60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基中之至少1者。設為帶電荷胺基酸殘基之至少3個胺基酸殘基，更佳係包含選自以Kabat法所定義之輕鏈的60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基中之至少3個。如此之3個胺基酸殘基可舉出例如下列5)至8)之任一組合。
5)以Kabat法所定義之輕鏈的第60、76以及77號的胺基酸殘基；
6)以Kabat法所定義之輕鏈的第74、76以及77號的胺基酸殘基；
7)以Kabat法所定義之輕鏈的第77、79以及81號的胺基酸殘基；以及
8)以Kabat法所定義之輕鏈的第76、77以及81號的胺基酸殘基。
滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基作成帶電荷胺基酸殘基的方法，可列舉胺基酸殘基的置換、插入等。以胺基酸殘基的插入所致之修改中，在滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基、及與該胺基酸殘基之N末端側鄰接的胺基酸殘基之間，插入帶電荷胺基酸殘基。例如，藉由在未修改抗體之L2的胺基酸殘基與L3的胺基酸殘基之間插入帶電荷胺基酸殘基，可
將L3的胺基酸殘基作成帶電荷胺基酸。較佳實施態樣中，將滿足上述(1)及(2)條件的胺基酸殘基置換成帶電荷胺基酸殘基。
本實施態樣中，可藉由DNA重組技術以及其他的分子生物學的技術等習知的方法，將未修改抗體之FR的胺基酸殘基作成帶電荷胺基酸殘基。例如，有產生未修改抗體之融合瘤時，使用自該融合瘤抽取的RNA，藉由反轉錄反應以及RACE(Rapid Amplification of cDNA ends)法，合成編碼輕鏈的多核苷酸。將此多核苷酸使用用以修改FR之至少3個胺基酸殘基的引子藉由PCR法擴增，藉此，取得編碼經修改FR的輕鏈的多核苷酸。將所得之多核苷酸組入該技術中習知的表現用載體，取得包含編碼該修改抗體之多核苷酸的表現載體。表現載體的種類並無特別限定，可為哺乳動物細胞用表現載體，亦可為大腸桿菌用表現載體。將所得之表現載體藉由轉形(Transformation)或轉染至適當的宿主細胞(例如，哺乳動物細胞或大腸桿菌)，可獲得親和性提升的抗體。
取得單鏈抗體(scFv)之修改抗體時，例如WO2013/084371所示般，可使用自上述融合瘤抽取的RNA藉由反轉錄反應以及PCR法合成編碼輕鏈可變區域的多核苷酸。此多核苷酸藉由重疊延伸PCR法等連結，取得編碼未修改之scFv的多核苷酸。將所得之多核苷酸使用用以修改FR之至少3個胺基酸殘基的引子並藉由PCR法擴增，取得編碼FR經修改之scFv的多核苷酸。將所得之多核苷酸組入該技術中習知的表現載體，取得包含編碼以scFv形態存在之修改抗體的多核苷酸的表現載體。將所得之表現載體藉由轉形或轉染至適當的宿主細胞，可獲得以scFv形態存在之修改抗體。
沒有產生未修改抗體之融合瘤時，可例如藉由Kohler以及Milstein,Nature,vol.256,p.495-497,1975所記載之方法等習知的方法製作抗體產生融合瘤。或者是，亦可使用從經感興趣對象的抗原免疫的小鼠等動物的脾臟取得的RNA。使用自脾臟取得的RNA時，可例如Fukunaga A以及Tsumoto K,Protein Eng.Des.Sel.2013,vol.26,pp.773-780所示般，自所得之編碼未修改的scFv之多核苷酸之中，藉由噬菌體展示法等選擇具有所期望之親和性的編碼未修改的scFv之多核苷酸。
[2.親和性提升的抗體以及其製造方法]
本實施態樣之與未修改抗體相比，對抗原之親和性經提升的抗體(以下，亦稱為「親和性提升抗體」)，係於未修改抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中，在存在於R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率的合計值成為35%以上的位置且溶劑暴露表面積比率顯示為20%以上的胺基酸殘基之中，以至少3個被設為帶電荷胺基酸殘基為特徵。此親和性提升抗體，與本實施態樣之親和性的提升方法的說中所記載的「修改抗體」相同。
本實施態樣之親和性提升抗體，較佳係未修改抗體之輕鏈FR1及/或FR3的胺基酸殘基設為帶電荷胺基酸殘基的抗體。如此之抗體可列舉例如：未修改抗體中以Kabat法所定義之輕鏈的第1、3、5、7、9、10、12、14、17、18、20、22、60、63、65、67、69、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基之中，至少3個被設為帶電荷胺基酸殘基的抗體。較佳實施態樣中，親和性提升抗體係於未修改抗體中選自以Kabat法所定義之輕鏈的第3、5、9、17、18、20、22、60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基中之至少3個的胺基酸殘基設為帶電荷胺基
酸殘基的抗體。此抗體中，上述3個胺基酸殘基，更佳係包含選自以Kabat法所定義之輕鏈的第3、5、9、17、18、20、22、60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基中之至少1者。帶電荷胺基酸殘基較佳為鹼性胺基酸殘基。
本實施態樣之親和性提升抗體，係未修改抗體之輕鏈FR1的胺基酸殘基經修改的抗體時，較佳為未修改抗體中以Kabat法所定義之輕鏈的第3、5、9、17、18、20以及22號的胺基酸殘基之中，至少3個被設為帶電荷胺基酸殘基的抗體。如此之至少3個胺基酸殘基可舉出例如上述1)至4)之任一組合。
本實施態樣之親和性提升抗體，係未修改抗體之輕鏈FR1的胺基酸殘基經修改的抗體時，較佳為未修改抗體中以Kabat法所定義之輕鏈的第60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基之中，至少3個被設為帶電荷胺基酸殘基的抗體。特佳是選自以Kabat法所定義之輕鏈的第60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基中之至少3個被設為帶電荷胺基酸殘基的抗體。如此之至少3個的胺基酸殘基可舉出例如上述5)至8)之任一組合。
本實施態樣之親和性提升抗體，可藉由本實施態樣之與未修改抗體相比，對抗原之親和性經提升的抗體的製造方法(以下，亦稱為「製造方法」)獲得。本實施態樣之製造方法中，首先，於抗體(未修改抗體)之輕鏈FR的胺基酸序列中，在存在於R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率的合計值成為35%以上的位置且溶劑暴露表面積比率顯示為20%以上的胺基酸殘基之中，將至少3個設為帶電荷胺基酸殘基。修改此未修改抗體中之胺基酸殘基的步驟，係與本實施態樣之親和性的提升方法所述者相同。
其次，回收藉由上述修改所得之抗體。例如，將表現親和性提升抗體的宿主細胞溶解於包含適當的可溶化劑的溶液中，使抗體於該溶液中游離。上述宿主細胞將抗體分泌至培養基時，回收培養上清液。遊離的抗體係可藉由親和層析等該技術領域中習知的方法回收。例如，製造的抗體為IgG時，可藉由使用蛋白質A或G的親和層析回收。因應所需，回收的抗體亦可藉由凝膠過濾等該技術領域中習知的方法進行精製。
[3.抗體之胺基酸序列的解析方法]
本發明的範圍中，亦包含抗體之胺基酸序列的解析方法(以下，亦稱為「解析方法」)。本實施態樣的解析方法中，取得抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中之各位置的R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率的合計值，及該胺基酸序列中之各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率，輸出所取得之各位置的胺基酸頻率的合計值以及各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率。所輸出的資訊例如是修改經解析的抗體時，係對檢討應修改的候補胺基酸殘基有用。關於胺基酸頻率的合計值以及溶劑暴露表面積比率之詳細內容，係與本實施態樣之親和性的提升方法所述者相同。本實施態樣的解析方法，亦可使用例如圖1所示之胺基酸序列的解析系統實施。
(胺基酸序列之解析系統的概要)
以下，參照圖式說明胺基酸序列之解析系統的一例。然而，本實施態樣不限定於此例所示之態樣。參照圖1，胺基酸序列之解析系統係具備胺基酸序列的解析裝置10及序列數據伺服器20。解析裝置10與序列數據伺服器20係經由內部網路、網際網路等網絡30連接。圖1中，解析裝置10顯示為
具備控制部100(電腦本體)、輸入部101、顯示部102之汎用電腦系統，但不限定為此態樣。
經由網絡30，從解析裝置10對序列數據伺服器20，要求複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列、抗體之輕鏈的三維結構數據等序列資訊時，該等序列資訊係從序列數據伺服器20下載至解析裝置10。序列數據伺服器20係具備儲存複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列的資訊、抗體之輕鏈的三維結構數據等胺基酸序列相關資訊之數據庫(以下，亦稱為「胺基酸序列數據庫」)。序列數據伺服器20亦可為與利用解析裝置10的使用者不同的第三者管理的外部數據伺服器。可從外部數據伺服器的數據庫(以下，亦稱為「外部數據庫」)可列舉例如：GeneBank、abYsis、IMGT、PDB、BMRB等。
圖1中顯示1個序列數據伺服器，但解析裝置10亦可連接複數個序列數據伺服器。複數個序列數據伺服器亦可具備各個不同種類的胺基酸序列數據庫。例如，某序列數據伺服器可具備包含複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列之與蛋白質的胺基酸序列資訊相關的數據庫，另外的序列數據伺服器可具備包含抗體之輕鏈之與蛋白質的三維結構數據相關的數據庫。
解析裝置10係從使用者所輸入或後述之記憶媒體40取得未修改抗體之輕鏈胺基酸序列。再者，解析裝置10係經由網絡30，向序列數據伺服器20要求複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列以及抗體之輕鏈的三維結構數據。序列數據伺服器20係經由網絡30，向解析裝置10提供所要求的數據。然後，解析裝置10係使用所取得之序列，解析未修改抗體的胺基酸序列。
(胺基酸序列之解析系統的硬體構成)
參照圖2，解析裝置10的控制部100係具備CPU(中央處理單元(Central Processing Unit))110、記憶體111、記憶裝置112、介面113、讀取裝置114以及可數據通信地連接該等的匯流排115。控制部100係經由介面113可通信地連接輸入部101以及輸出部102等外部機器、以及網絡30。記憶媒體40係以CD-ROM、USB記憶體等電腦可讀取之非暫時性的有形記憶媒體。序列數據伺服器20係具備控制部210、輸入部211、輸出部212、記憶部213以及通信部214。記憶部213中儲存胺基酸序列數據庫215。序列數據伺服器20係經由通信部214可通信地連接網絡30。輸入部101以及211例如為滑鼠、鍵盤等輸入裝置。輸出部102以及212例如為液晶顯示器等顯示裝置。
CPU 110係實行記憶體111或記憶裝置112所記憶之本實施態樣的電腦程式，進行後述的處理。記憶體111係包含ROM(唯讀記憶體(Read Only Memory))以及RAM(隨機存取記憶體(Random Access Memory))。ROM係藉由例如遮罩ROM、PROM、EPROM、EEPROM等所構成。ROM中係紀錄藉由CPU110所實行之電腦程式以及該電腦程式之實行所使用之數據。RAM係藉由例如SRAM、DRAM等所構成。RAM係使用於ROM以及記憶裝置112所紀錄的程式的讀取。再者，RAM係實行該等程式時，作為CPU 110的作業區域利用。
記憶裝置112例如藉由硬碟所構成。記憶裝置112中，儲存有用以實行CPU 110的作業系統、應用程式等程式以及該程式實行所使用的數據。應用程式可列舉例如本實施態樣之電腦程式、用以實行胺基酸序列的整列的程式、用以實行胺基酸頻率的算出的程式、用以實行溶劑暴露表面
積比率的算出的程式等。再者，記憶裝置112中亦可紀錄胺基酸頻率以及溶劑暴露表面積比率之各別的閾值。
讀取裝置114係藉由CD-ROM驅動機、DVD-ROM驅動機、USB埠、SD讀卡機、CF讀卡機、隨身碟(Memory stick reader)、固態硬碟(Solid state drive)、軟性磁碟驅動機等所構成。讀取裝置114係可讀取記憶媒體40所紀錄的數據(例如，未修改抗體及/或複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列及/或編碼其等之核酸序列的資訊等)、以及電腦程式。
(胺基酸序列的解析裝置的處理順序)
參照圖3，說明藉由於解析裝置10所實行之抗體的胺基酸序列的解析處理。此處，以使用由外部數據庫下載之複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列以及未修改抗體之輕鏈的三維結構數據，輸出各位置的胺基酸頻率的合計值以及各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率的情況為例進行說明。然而，本實施態樣不限定為此例。以下的說明中如無特別敘明，控制部100進行之處理意指CPU110進行之處理。
步驟S10中，控制部100係經由網絡30，從序列數據伺服器20的胺基酸序列數據庫215下載複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列的數據，記憶於記憶裝置112。下載的胺基酸序列可為輕鏈全部序列，亦可為包含FR1及/或FR3的胺基酸序列之輕鏈一部分序列。使用者已經有複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列的數據時，控制部100係可取得由使用者輸入的該胺基酸序列的數據取代下載。輸入可藉由輸入部101進行，亦可藉由將記憶媒體40所保存之該胺基酸序列的數據轉送至記憶裝置112而進行。
步驟S11中，控制部100係將取得之複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列整列。具體而言，控制部100係以使由Kabat法所賦予之FR中的胺基酸殘基編號為一致的方式，將複數個參考抗體之胺基酸序列整列。整列亦可基於Kabat法以外的編號法進行。步驟S12中，控制部100算出複數個參考抗體之FR的胺基酸序列之各位置中R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率的合計值。此算出係與本實施態樣之親和性的提升方法中所述者相同。
步驟S13中，控制部100係取得未修改抗體之輕鏈胺基酸序列。取得之未修改抗體之輕鏈胺基酸序列可為輕鏈全體的胺基酸序列，亦可為輕鏈的一部分胺基酸序列。輕鏈的一部分胺基酸序列，較佳包含FR1及/或FR3的胺基酸序列，更佳是進一步包含CDR的胺基酸序列。較佳實施態樣中，控制部100取得未修改抗體的輕鏈全體的胺基酸序列。此胺基酸序列可由使用者輸入，亦可保存於記憶媒體40或記憶裝置112。未修改抗體之輕鏈胺基酸序列存在於胺基酸序列數據庫215內時，控制部100亦可下載該胺基酸序列的數據。步驟S14中，控制部100係於未修改抗體的FR中，具體辨識出存在於位置的胺基酸殘基，該位置係對應於由複數個參考抗體所具體辨識的位置。控制部100亦可將未修改抗體之輕鏈胺基酸序列與複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列整列並具體辨識。藉此，控制部100係將算出的胺基酸頻率的合計值作為未修改抗體之FR的胺基酸序列之各位置中之胺基酸頻率的合計值而取得，並記憶於記憶裝置112。
步驟S15中，控制部100係基於未修改抗體之輕鏈胺基酸序列，從胺基酸序列數據庫215下載未修改抗體之輕鏈的三維結構數據。控制部100係從胺基酸序列數據庫215檢索未修改抗體之輕鏈胺基酸序列，於數
據庫中，存在具有與未修改抗體之輕鏈胺基酸序列一致序列之蛋白質時，下載該蛋白質的三維結構數據作為未修改抗體之輕鏈的三維結構數據並記憶於記憶裝置112。
步驟S16中，控制部100係基於所取得之三維結構數據，算出未修改抗體之FR的各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率，並記憶於記憶裝置112。此算出係與本實施態樣之親和性的提升方法中所述者相同。使用者具有未修改抗體之輕鏈的三維結構數據時，控制部100係可取得由使用者輸入之三維結構數據取代下載。輸入可藉由輸入部101進行，亦可將記憶媒體40所保存之三維結構數據轉送至記憶裝置112而進行。於胺基酸序列數據庫215中沒有未修改抗體之輕鏈的三維結構數據時，控制部100可自數據庫取得作成該三維結構數據所必須的資訊，基於此資訊作成三維結構數據。具體而言，控制部100係從胺基酸序列數據庫215檢索參考序列，並下載該胺基酸序列。其次，控制部100係將參考序列與未修改抗體的胺基酸序列整列。然後，控制部100基於整列結果，從參考序列之已知結構作成未修改抗體之輕鏈的三維結構數據。三維結構數據的作成係與本實施態樣之親和性的提升方法中所述者相同。
步驟S17中，控制部100係將於步驟S14所具體辨識之未修改抗體之FR的胺基酸序列之各位置中的胺基酸頻率的合計值、以及於步驟S16所算出之未修改抗體之FR的各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率傳送至輸出部102。圖4中，顯示輸出部102所顯示之解析結果的畫面之一例。此畫面中，顯示未修改抗體之FR1的胺基酸序列之各位置(L1至L23)中的胺基酸頻率的合計值與溶劑暴露表面積比率。然而，畫面的顯示不限定為此例。
圖3所示之處理中，步驟S13亦可於步驟S10、S11或S12之前進行。步驟S15以及S16只要於未修改抗體的胺基酸序列的取得步驟(步驟S13)之後即可，亦可於步驟S10、S11或S12之前進行。步驟S10以及S15只要於未修改抗體的胺基酸序列的取得步驟(步驟S13)之後即可，亦可同時進行。
[4.抗體的候補修改位點的具體辨識方法]
本發明的範圍，亦包含抗體的候補修改位點的具體辨識方法(以下，亦稱為「具體辨識方法」)。本實施態樣之具體辨識方法中，取得抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中之各位置的R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率的合計值、以及該胺基酸序列中之各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率，將存在於胺基酸頻率的合計值成為35%以上的位置且溶劑暴露表面積比率顯示為20%以上的胺基酸殘基，具體辨識為親和性的提升用之候補應修改位點。胺基酸頻率的合計值以及溶劑暴露表面積比率的詳細內容，係與本實施態樣之親和性的提升方法所述者相同。
抗體之輕鏈胺基酸序列中，藉由本實施態樣之具體辨識方法所具體辨識之胺基酸殘基之中，至少3個被設為帶電荷胺基酸殘基，藉此與未修改抗體相比可提升抗體對抗原之親和性。然後，藉由回收胺基酸殘基經修改的抗體，可獲得抗體對抗原之親和性經提升的修改抗體。關於胺基酸殘基的修改以及抗體的回收，係與本實施態樣之親和性的提升方法以及本實施態樣之製造方法所述者相同。
本實施態樣之具體辨識方法，係與本實施態樣之解析方法同樣地，可藉由如圖1所示之胺基酸序列的解析系統實施。用以實施本實施態
樣之具體辨識方法的胺基酸序列解析系統的概略以及硬體構成，係與本實施態樣之解析方法所述者相同。
(胺基酸序列的解析裝置的處理順序)
參照圖5，說明藉由解析裝置10所實行，用以具體辨識抗體的候補修改位點之胺基酸序列的解析處理。此處，使用從外部數據庫下載之複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列以及未修改抗體之輕鏈的三維結構數據，算出各位置的胺基酸頻率的合計值以及各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率的情況為例進行說明。然而，本實施態樣不限定為此例。以下的說明中如無特別敘明，控制部100進行之處理，意指CPU110進行之處理。步驟S20至S26係與步驟S10至S16所述者相同。
步驟S27中，控制部100係於步驟S24所具體辨識之未修改抗體之FR的胺基酸序列的位置之中，具體辨識出存在於R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率的合計值成為35%以上的位置，且於步驟S26所算出之溶劑暴露表面積比率顯示為20%以上的胺基酸殘基。然後，步驟S28中，控制部100係將步驟S27所具體辨識之胺基酸殘基傳送至輸出部102。圖6中，顯示輸出部102所顯示之解析結果的畫面之一例。此畫面中，顯示未修改抗體之輕鏈FR1的胺基酸序列之各位置(L1至L23)中之胺基酸頻率的合計值與溶劑暴露表面積比率。此畫面中，步驟S27所具體辨識之胺基酸殘基的位置與各值係以粗體字及標記強調並顯示。然而，畫面的顯示不限定為此例。具體辨識之胺基酸殘基係作為未修改抗體中之候補修改位點提示給使用者。
參照圖7，說明用以作成藉由解析裝置10所實行之將抗體的候補修改位點作成帶電荷胺基酸殘基時之序列的胺基酸序解析處理。此處，
使用從外部數據庫所下載之複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列以及未修改抗體之輕鏈的三維結構數據，算出各位置的胺基酸頻率的合計值以及各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率的情況為例進行說明。然而，本實施態樣不限定為此例。以下的說明中如無特別敘明，控制部100進行之處理，意指CPU110進行之處理。步驟S30至S36係與步驟S10至S16所述者相同，步驟S37係與步驟S27相同。
步驟S38中，控制部100係作成將步驟S37所具體辨識之胺基酸殘基之至少3個被設為帶電荷胺基酸殘基時之胺基酸序列、及/或編碼其序列之鹼基序列。作成胺基酸序列時，控制部100係將步驟S33所取得之未修改抗體之輕鏈胺基酸序列中，步驟S37所具體辨識之胺基酸殘基之至少3個作成R、K、D或E之胺基酸序列(修改抗體之輕鏈胺基酸序列)，並記憶於記憶裝置112。哪個任意胺基酸殘基要作成帶電荷胺基酸殘基可預先設定，亦可由使用者決定。選擇R、K、D以及E中之任一者作為帶電荷胺基酸殘基，係可預先設定，亦可由使用者決定。
作成編碼修改抗體之輕鏈胺基酸序列之鹼基序列時，控制部100係於步驟S33所取得之胺基酸序列中，作成將步驟S37所具體辨識之胺基酸殘基之至少3個被設為R、K、D或E之胺基酸序列，將其轉換為鹼基序列，並記憶於記憶裝置112。1個胺基酸具有複數種密碼子時，選擇何種密碼子，可預先設定，亦可由使用者決定。作成鹼基序列時，控制部100亦可於步驟S33中，取得編碼未修改抗體之輕鏈的鹼基序列。取得該鹼基序列時，控制部100亦可將對應步驟S37所具體辨識之胺基酸殘基之密碼子，設成對應帶電荷胺基酸殘基的密碼子，藉此作成編碼修改抗體之輕鏈胺基酸序
列的鹼基序列。然後，步驟S39中，控制部100係將步驟S37所具體辨識之胺基酸殘基、以及步驟S38所作成之修改抗體之輕鏈胺基酸序列及/或編碼其之鹼基序列傳送至輸出部102。
本實施態樣之具體辨識方法中，亦可基於未修改抗體之CDR的胺基酸序列算出CDR的電特性並輸出。CDR的電特性係與本實施態樣之親和性的提升方法所述者相同。再者，所算出之CDR的電特性為中性時，作為候補修改位點之具體辨識胺基酸殘基之中，可作成將至少3個設為帶電荷胺基酸殘基(較佳為鹼性胺基酸殘基)時之修改胺基酸序列並輸出。
參照圖8，說明藉由解析裝置10所實行之胺基酸序列的解析處理，該解析處理係用以作成當CDR的電特性為中性時將抗體的候補修改位點設為鹼性胺基酸殘基時之序列。此處，使用從外部數據庫下載之複數個參考抗體之輕鏈胺基酸序列以及未修改抗體之輕鏈的三維結構數據，算出各位置的胺基酸頻率的合計值以及各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率的情況為例進行說明。然而，本實施態樣不限定為此例。以下的說明中如無特別敘明，控制部100進行之處理，意指CPU110進行之處理。步驟S40至S46係與步驟S10至S16所述者相同，步驟S47係與步驟S27相同。
步驟S48中，控制部100係基於步驟S43所取得之未修改抗體之輕鏈胺基酸序列，算出未修改抗體之CDR的電特性。CDR的電特性係藉由上述式(III)算出。步驟S49中，判定所算出之CDR的電特性是否為中性。藉由上述式(III)所算出之值為-1、0或1時，CDR的電特性判定為中性，處理係進入步驟S50。步驟S50中，控制部100係作成將步驟S47所具體辨識之胺基酸殘基之至少3個作成鹼性胺基酸殘基時之胺基酸序列及/或編碼
期之序列的鹼基序列。然後，步驟S51中，控制部100係將步驟S47所具體辨識之胺基酸殘基、步驟S48所算出之CDR的電特性以及步驟S50所作成之修改抗體之輕鏈胺基酸序列及/或編碼其之鹼基序列傳送至輸出部102。步驟S49中，藉由上述式(III)所算出之值為-2以下或2以上時，CDR的電特性判定為非中性，處理係進入步驟S52。步驟S52中，控制部100係將步驟S47所具體辨識之胺基酸殘基與步驟S48所算出之CDR的電特性傳送至輸出部102。
以下，藉由實施例更詳細地說明本發明，但本發明不限定為該等實施例者。
[實施例]
實施例1輕鏈FR1或FR3的胺基酸殘基經修改的抗體之製作
將抗溶菌酶抗體之FR1或FR3的3個胺基酸殘基置換成帶電荷胺基酸殘基，並製作各抗體的變異體。
(1)野生型抗溶菌酶抗體的基因取得
委託GenScript股份有限公司合成抗溶菌酶抗體的基因，取得包含野生型抗溶菌酶抗體基因之質體DNA。
(2)抗溶菌酶抗體變異體的製作
[試劑]
QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN公司)
PrimeSTAR(註冊商標)Max DNA Polymerase(TakaraBio股份有限公司)
Ligation high ver.2(東洋紡股份有限公司)
T4 Polynucleotide Kinase(東洋紡股份有限公司)
Dpn I(東洋紡股份有限公司)
Competent high DH5α(東洋紡股份有限公司)
(2.1)引子的設計以及PCR
為了將野生型抗溶菌酶抗體之輕鏈FR1或FR3之預定的3個胺基酸殘基置換為精胺酸殘基，使用上述(1)所得之質體以及下述鹼基序列所示之引子實施PCR。又，各引子的名稱所記載之3個編號，表示以Kabat法所定義之輕鏈FR中經置換為精胺酸殘基之胺基酸殘基的位置。使用序列編號1至11的引子作為前置引子，使用序列編號12至22的引子作為反置引子。
[變異體製作用引子]
2,4,6變異體FOR：5’AGAACCAGAAGCCCGGCGACCCTCTCGGTCACCCCCGGC 3’(序列編號1)
2,4,8變異體FOR：5’AGAGCAGAGCGACCCTCTCGGTCACCCCCGGC 3’(序列編號2)
3,5,9變異體FOR：5’GCCCGCGCACCCTCTCGGTCACCCCCGGC 3’(序列編號3)
4,8,13變異體FOR：5’CCCTCTCGAGAACCCCCGGCAACTCGGTGTCGC 3’(序列編號4)
5,9,22變異體FOR：5’GGCAACTCGGTGTCGCTCCGCTGCCGCGCCTC GCAGTCG 3’(序列編號5)
13,16,19變異體FOR：5’AACTCGCGATCGCTCTCGTGCCGCGCCTCGC AGTCG 3’(序列編號6)
16,21,23變異體FOR：5’GTGTCGCGATCGCGACGCGCCTCGCAGTCG ATCGGC 3’(序列編號7)
17,18,20變異體FOR：5’CTCTCGTGCCGCGCCTCGCAG 3’(序列編號8)
18,20,22變異體FOR：5’CGCTGCCGCGCCTCGCAGTCGATCGGC 3’(序列編號9)
19,21,23變異體FOR：5’AGATCGAGACGCGCCTCGCAGTCGATCGGC 3’(序列編號10)
63,65,67變異體FOR：5’GGCACCGACTTCACCCTGTCG 3’(序列編號11)
2,4,6變異體REV：5’GACTCTATCTCCTCTGGACATTATGACTGAGGC 3’(序列編號12)
2,4,8變異體REV：5’GGGTTCTGACTCTATCTCCTCTGGACATTATGAC TGAGGC 3’(序列編號13)
3,5,9變異體REV：5’TCTGGCGCAGGCGGATATCTCCTCTGGACATTAT G 3’(序列編號14)
4,8,13變異體REV：5’TCGCTCTGCTCTGGGTTCTGACGATATCTCCTC TGGACATTATG 3’(序列編號15)
5,9,22變異體REV：5’GGGGGTGACCGAGAGGGTGCGCGGGCTCTGGCGCAGGACGATATCTCCTCTGG 3’(序列編號16)
13,16,19變異體REV：5’TCGGGGGGTTCGCGAGAGGGTCGCCGGGCTCTGGG 3’(序列編號17)
16,21,23變異體REV：5’CGAGTTTCGGGGGGTGACCGAGAGGGTCGC 3’(序列編號18)
17,18,20變異體REV：5’GCGCACGCGGCGGCCGGGGGTGACCGAGAGGG 3’(序列編號19)
18,20,22變異體REV：5’GAGGCGCACGCGGTTGCCGGGGGTGACCGA GAGGG 3’(序列編號20)
19,21,23變異體REV：5’CGATCTCGAGTTGCCGGGGGTGACCGAGAGGG 3’(序列編號21)
63,65,67變異體REV：5’TCTGCCTCTGCCTCTGAAGCGCGACGGGATCCCCG 3’(序列編號22)
使用上述(1)所得之質體作為模板，調製下列組成的PCR反應液。
[PCR反應液]
所調製的PCR反應液以下述反應條件進行PCR反應。
[反應條件]
98℃、10秒，
98℃、10秒，54℃、10秒，以及72℃、45秒進行30循環，以及
72℃、3分鐘。
於所得之PCR產物(25μL)中添加1μL的DpnI(10U/μL)，將PCR產物進行片段化。使用DpnI處理完成的PCR產物，調製下列組成的接合反應液。該反應液於16℃培育1小時，進行接合反應。
[接合反應液]
(2.2)轉形、質體萃取以及序列確認
於接合反應後的溶液(3μL)添加DH5α(30μL)，於冰上靜置30分鐘後，混合物於42℃加熱45秒進行熱休克。再次於冰上靜置2分鐘，全量塗布於含有安比西林(ampicillin)的LB培養盤。將該培養盤於37℃培育16小時，藉此獲得大腸桿菌的轉形體。將培養盤上的單一菌落取置於含有安比西林的LB液體培養基中，於37℃振盪培養(250rpm)16小時。從所得之大腸桿菌使用QIAprep Spin Miniprep套組萃取質體。所得之各質體的鹼基序列使用
pCDNA3.4載體引子進行確認。以下，使用此等質體作為哺乳動物細胞表現用質體。
(3)於哺乳動物細胞的表現
[試劑]
Expi293(商標)細胞(Invitrogen公司)
Expi293(商標)Expression培養基(Invitrogen公司)
ExpiFectamine(商標)293轉染套組(Invitrogen公司)
(3.1)轉染
Expi293細胞係於5%CO2環境下，以37℃振盪培養(150rpm)使其增殖。準備數量對應樣品數目的30mL的細胞培養物(3.0×106cells/mL)。使用編碼各變異體的質體以及編碼野生型抗體的質體，調製下列組成的DNA溶液，靜置5分鐘。
[DNA溶液]
調製下列組成的轉染試劑，並靜置5分鐘。
混合所調製之DNA溶液以及轉染試劑，並靜置20分鐘。將所得之混合液(3mL)添加至細胞培養物(30mL)，於5%CO2環境下，以37℃振盪培養(150rpm)20小時。20小時後，於各培養物分別添加150μL之ExpiFectamine(商標)轉染增強劑1及1.5mL之轉染增強劑2，於5%CO2環境下，以37℃振盪培養(150rpm)6日。
(3.2)抗體的回收以及精製
將各細胞培養物以3000rpm進行5分鐘離心處理，回收培養上清液。培養上清液包含從經轉染的Expi293(商標)細胞所分泌之各抗體。將所得之培養上清再度以15000×G進行10分鐘離心處理，回收上清液。對所得之上清液(30mL)添加100μL的抗體精製用載體Ni Sepharose High Performance(GE Healthcare)，於室溫使其反應2小時。回收載體且去除上清液，添加TBS(1mL)洗淨載體。於載體添加包含100mM咪唑的TBS 1000μL，溶出載體所捕捉的抗體。此溶出操作合計進行3次，取得抗體溶液。
(4)親和性的測定
將所製作之變異體的親和性使用Biacore(註冊商標)T200(GE Healthcare公司)進行測定。使用源自雞蛋白的溶菌酶(Sigma-Aldrich公司)作為抗溶菌酶抗體的抗原。將抗原固定化(固定化：50RU)於Biacore(註冊商標)用感測晶片Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare公司)。稀釋抗體溶液，調製出30nM、15nM、7.5nM、3.75nM以及1875nM的抗體溶液。將各濃度的抗體溶液送液至Biacore(註冊商標)T200(GE Healthcare公司)(結合時間(association time)120秒以及解離時間(dissociation time)1800
秒)。使用Biacore(註冊商標)Evaluation軟體解析測定數據，取得各抗體的親和性相關數據。各抗體的Kd值示於表2。
[表2]
(5)結果
如表2所示，輕鏈FR3已修改的63,65,67變異體、輕鏈FR1已修改的18,20,22變異體、3,5,9變異體、17,18,20變異體、18,20,22變異體以及5,9,22變異體的Kd值，係成為比野生型抗溶菌酶抗體的Kd值更低。據此，與野生型相比，表2所示之變異體，係藉由將FR3或FR1之3個胺基酸殘基設為鹼性胺基酸殘基而提升對抗原之親和性。
另一方面，未示於表2的變異體係起始無法確認抗體的表現。表現係將上述(3.2)所得之溶出液藉由SDS-PAGE以及CBB染色進行分析而確認。結果示於圖9。由圖9可知，於電泳道1及2觀察到抗體的重鏈以及輕鏈的條帶。據此，確認野生型抗體以及63,65,67變異體的表現。然而，由於電泳道3至8未觀察到抗體條帶，無法確認2,4,6變異體、2,4,8變異體、4,8,13變異體、19,21,23變異體、13,16,19變異體以及16,21,23變異體的表現。
實施例2 對抗原之親和性經提升的抗體的特徵
為了發現對抗原之親和性經提升之實施例1的變異體的共通特徵，本發明者們算出輕鏈FR1以及FR3之各位置的胺基酸頻率。再者，本發明者們考量胺基酸殘基的側鏈面對抗體分子表面之情事，係參與抗原之親和性的提升，算出輕鏈FR1以及FR3之各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率。
(1)胺基酸頻率
從提供抗體的胺基酸序列之公共數據庫的abYsis，下載作為參考抗體之約30,000個小鼠抗體之輕鏈胺基酸序列。以使由Kabat法所附加之輕鏈FR中的胺基酸殘基的編號為一致的方式，將取得之參考抗體之輕鏈胺基酸序列整列。於取得之參考抗體之輕鏈FR1以及FR3的各位置中取得胺基酸頻率。序列的整列以及胺基酸頻率係藉由abYsis取得。可理解對應於對抗原之親和性經提升的實施例1的變異體之經修改胺基酸殘基的位置中，R、S、T、V、D以及E的出現頻率為高傾向。此處，輕鏈FR1以及FR3的各位置中，算出該等胺基酸頻率的合計值。胺基酸頻率的合計值，係藉由上述式(I)算出。此處，於取得之參考抗體之輕鏈FR之由Kabat法所附加的編號，係與野生型抗溶菌酶抗體之輕鏈FR相同。據此，由參考抗體之輕鏈胺基酸序列所得之胺基酸頻率的合計值，係作為野生型抗溶菌酶抗體之輕鏈胺基酸序列的值使用。
(2)溶劑暴露表面積比率
從提供蛋白質的三維結構數據之公共數據庫的PDB，檢索野生型抗溶菌酶抗體之輕鏈胺基酸序列，下載該抗體輕鏈的三維結構數據。使用所取得之三維結構數據，藉由Discovery Studio Client v17.2.0.16349，取得野生型抗溶菌酶抗體之輕鏈FR1以及FR3之各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率。
又，Discovery Studio Client v17.2.0.16349中，溶劑暴露表面積比率係藉由上述式(II)算出。
(3)結果
表3、表4A以及表4B顯示野生型抗溶菌酶抗體之輕鏈FR1以及FR3的各位置中之R、S、T、V、D以及E的各別胺基酸頻率以及其等之合計值、以及各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率。
[表3]
[表4A]
[表4B]
由該等表可觀察到，作為對抗原之親和性經提升的實施例1的變異體之共通特徵，在抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中，滿足下述(a)以及(b)條件二者的胺基酸殘基中的3個係被設為帶電荷胺基酸殘基。再者，可理解實施例1中無法確認的變異體中所修改的胺基酸殘基，係未滿足下述(a)及/或(b)的條件。
(a)抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中，存在於精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、天冬胺酸以及麩胺酸的胺基酸頻率的合計值成為35%以上的位置。
(b)抗體之輕鏈FR的胺基酸序列中，溶劑暴露表面積比率顯示為20%以上。
實施例3 輕鏈FR3的胺基酸殘基經修改的抗體之製作
藉由將實施例2中觀察到之滿足上述(a)以及(b)條件二者的胺基酸殘基中的3個置換成帶電荷胺基酸殘基，藉此檢視確認是否可提升抗體對抗原之親和性。具體而言，製作與實施例1所製作之變異體不同的抗溶菌酶抗體的變異體，測定該等對抗原之親和性。
(1)抗溶菌酶抗體的變異體之製作
從表4A以及B選擇在野生型抗溶菌酶抗體之輕鏈FR3中修改的3個胺基酸殘基。為了將所選擇之預定的3個胺基酸殘基置換為精胺酸殘基，使用下述鹼基序列所示之引子，與實施例1同樣地操作實施PCR。使用序列編號23至28的引子作為前置引子，使用序列編號29至34的引子作為反置引子。
[變異體製作用引子]
60,63,65變異體FOR：5’GAGGCTCGGGCACCGACTTCACCCT GTC 3’(序列編號23)
60,76,77變異體FOR：5’TCGGGCACCGACTTCACCCTGTCGATCAGAAGAGTCGAGACGGAGGAC 3’(序列編號24)
65,67,70變異體FOR：5’CCAGATTCACCCTGTCGATCAACAGCGTCGAG 3’(序列編號25)
67,70,72變異體FOR：5’CCAGATTCAGACTGTCGATCAACAGCGTCGAGAC 3’(序列編號26)
74,76,77變異體FOR：5’AGTCGAGACGGAGGACTTCGG 3’(序列編號27)
77,79,81變異體FOR：5’AGAACGAGAGACTTCGGCATGTAC TTCTGC 3’(序列編號28)
60,63,65變異體REV：5’TGCCTCTGAAGCGTCTCGGGATCCCCGAGATC 3’(序列編號29)
60,76,77變異體REV：5’GCCCGAGCCGCTGAAGCGTCTCGGGATCCCCGAGATC 3’(序列編號30)
65,67,70變異體REV：5’TGCCTCTGCCTCTGCCGCTGAAGC 3’(序列編號31)
67,70,72變異體REV：5’TGCCTCTGCCCGAGCCGCTGAAG 3’(序列編號32)
74,76,77變異體REV：5’CTTCTGATTCTCAGGGTGAAGTCG 3’(序列編號33)
77,79,81變異體REV：5’GACTCTGTTGATCGACAGGGTGAA GTCG 3’(序列編號34)
使用所得之PCR產物，與實施例1同樣地施作，取得包含編碼變異體輕鏈之基因的質體、以及包含編碼野生型重鏈之基因的質體。使用此等質體，與實施例1同樣地施作，於Expi293(商標)細胞表現各抗體，精製所得之培養上清，取得抗溶菌酶抗體的變異體的溶液。
(2)親和性的測定
將所製作之變異體的親和性使用Biacore(註冊商標)T200(GE Healthcare公司)，與實施例1同樣地施作進行測定。結果示於表5。
[表5]
如表5所示，任一變異體的Kd值皆比野生型抗溶菌酶抗體的Kd值低。據此，暗示藉由將實施例2中所觀察到之滿足上述(a)以及(b)條件二者的胺基酸殘基中的3個置換為精胺酸殘基，可提升抗體對抗原之親和性。
實施例4 輕鏈FR1或FR3的胺基酸殘基經修改的抗體之製作(2)
使用與實施例1之抗溶菌酶抗體不同殖株(clone)(Hy-HEL5)的小鼠抗溶菌酶抗體、小鼠抗甲狀腺刺激荷爾蒙(TSH)抗體、以及人源化抗HER2抗體(曲妥珠單抗)作為未修改抗體。在此等抗體之輕鏈FR1或FR3中，將滿足上述(a)以及(b)條件二者的胺基酸殘基中的3個置換成帶電荷胺基酸殘基，藉此檢視確認是否可提升抗體對抗原之親和性。
(1)變異體的製作
(1.1)編碼抗溶菌酶抗體(Hy-HEL5)之變異體輕鏈的基因之取得
根據表3，選擇輕鏈FR1的第3、5以及9號的胺基酸殘基作為滿足上述(a)以及(b)條件二者的胺基酸殘基。為了將此等的胺基酸殘基置換為組胺
酸殘基，使用下述鹼基序列所示之引子，與實施例1同樣地施作實施PCR。使用序列編號46的引子作為前置引子，使用序列編號47的引子作為反置引子。
3,5,9變異體(His)FOR：5’CATCTGCACCAATCACCGCACATTATGTCCGCATCTC 3’(序列編號46)
3,5,9變異體(His)REV：5’TATGTCCCCTCTGCTCATAATCACAGAGGCACTG 3’(序列編號47)
(1.2)編碼抗TSH抗體之變異體的輕鏈的基因之取得
使用表3所記載的胺基酸頻率的合計作為野生型抗TSH抗體之輕鏈FR的胺基酸序列之各位置中之R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率的合計值。抗TSH抗體之輕鏈FR的各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率，與實施例2同樣地施作，基於從數據庫PDB下載之野生型抗TSH抗體之輕鏈的三維結構數據而取得。選擇輕鏈FR1的第18、20以及22號的胺基酸殘基作為滿足上述(a)以及(b)條件二者的胺基酸殘基。為了將此等胺基酸殘基置換為離胺酸殘基，使用下述鹼基序列所示之引子，與實施例1同樣地施作實施PCR。使用序列編號48的引子作為前置引子，使用序列編號49的引子作為反置引子。
18,20,22變異體(Lys)FOR：5’AAGGCCAAGATTAAGTGCAGATCTAATCAGAGCGTTG 3’(序列編號48)
18,20,22變異體(Lys)REV：5’ATCTCCAAGACTGACAGGCAGGGAGAGTG 3’(序列編號49)
(1.3)編碼人源化抗HER2抗體之變異體輕鏈的基因之取得
從數據庫abYsis下載作為參考抗體之約30,000個人類抗體之輕鏈胺基酸序列。與實施例2同樣地施作，將所取得之參考抗體之輕鏈胺基酸序列整列，算出FR的胺基酸序列之各位置中的R、S、T、V、D以及E的胺基酸頻率的合計值。抗HER2抗體之輕鏈FR的各胺基酸殘基的溶劑暴露表面積比率，係與實施例2同樣地施作，基於從數據庫PDB下載之人源化抗HER2抗體之輕鏈的三維結構數據而取得。選擇輕鏈FR3的第76、77以及81號的胺基酸殘基。為了將此等胺基酸殘基置換為精胺酸殘基，使用下述鹼基序列所示之引子與實施例1同樣地施作實施PCR。使用序列編號50的引子作為前置引子，使用序列編號51的引子作為反置引子。
76,77,81變異體(Arg)FOR：5’CAGCCGAGAGACTTCGCCACGTATTACTG 3’(序列編號50)
76,77,81變異體(Arg)REV：5’CAGTCTTCTGATCGTCAGGGTAAAATCGGTAC 3’(序列編號51)
(1.4)各抗體之變異體的取得
使用所得之PCR產物，與實施例1同樣地施作，取得編碼各抗體之變異體輕鏈的基因的質體、以及編碼各抗體之野生型重鏈的基因的質體。使用該等質體，與實施例1同樣地施作，於Expi293(商標)細胞表現各抗體，精
製所得之培養上清液，取得各抗體之變異體的溶液。人源化抗HER2抗體之76,77,81變異體(Arg)之輕鏈胺基酸序列示於序列編號52。
(2)親和性的測定
將所製作之變異體的親和性使用Biacore(註冊商標)T200(GE Healthcare公司)，與實施例1同樣地施作進行測定。測定中，使用TSH蛋白質(R&D Systems公司)作為抗TSH抗體的抗原，使用HER2蛋白質(R&D Systems公司，目錄編號：1129-ER)作為抗HER2抗體的抗原。結果示於表6。表中，「Ratio」係野生型的Kd值設為1時之變異型的Kd值的比。
[表6]
如表6所示，任一變異體的Kd值皆比野生型的抗體的Kd值低。據此，暗示即使為與實施例1的抗溶菌酶抗體不同的抗體，藉由修改滿足上述(a)以及(b)條件二者的胺基酸殘基中的3個，可提升抗體對抗原之親和性。
<110> 西斯美股份有限公司(SYSMEX CORPORATION)
<120> 提升抗體對抗原之親和性的方法及其用途(Method for improving affinity of antibody for antigen and use thereof)
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<223> 經修改抗體(modified antibody)
<400> 52
10:胺基酸序列的解析裝置
20:序列數據伺服器
30:網絡
100:調控部(電腦本體)
101:輸入部
102:輸出部
Claims (10)
- 一種提升抗體對抗原之親和性的方法，係包含於未修改抗體中，將選自以Kabat法所定義之輕鏈的第60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少3個胺基酸殘基設為帶電荷胺基酸殘基，藉此與前述未修改抗體相比，提升對抗原之親和性，其中，前述3個胺基酸殘基係包含選自前述輕鏈的第60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少1者。
- 一種抗體的製造方法，該抗體為與未修改抗體相比，對抗原之親和性經提升者，該製造方法係包含下列步驟：於未修改抗體中，將選自以Kabat法所定義之輕鏈的第60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少3個胺基酸殘基設為帶電荷胺基酸殘基的步驟，以及回收前述工程所得之抗體的步驟；其中，前述3個胺基酸殘基係包含選自前述輕鏈的第60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少1者。
- 如請求項1或2所述之製造方法，其中，前述至少3個胺基酸殘基係選自前述輕鏈的第60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組。
- 如請求項1至3中任一項所述之製造方法，其中，前述至少3個胺基酸殘基為前述輕鏈的第60、76以及77號的胺基酸殘基。
- 一種修改抗體，為與未修改抗體相比，對抗原之親和性經提升者，該修改抗體中，選自前述未修改抗體中以Kabat法所定義之輕鏈的第60、63、65、67、70、72、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少3個胺基酸殘基係被設為帶電荷胺基酸殘基，其中，前述3個胺基酸殘基係包含選自前述輕鏈的第60、74、76、77、79以及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少1者。
- 如請求項5所述之修改抗體，其中，前述至少3個胺基酸殘基為選自前述輕鏈的第60、74、76、77、79及81號的胺基酸殘基所組成群組中之至少3個。
- 如請求項5或6所述之修改抗體，其中，前述至少3個胺基酸殘基為前述輕鏈的第60、76及77號的胺基酸殘基。
- 如請求項1至4中任一項所述之製造方法或如請求項5至7中任一項所述之修改抗體，其中，前述帶電荷胺基酸殘基為鹼性胺基酸殘基。
- 如請求項1至4及8中任一項所述之製造方法或如請求項5至8中任一項所述之修改抗體，其為抗體片段的形態。
- 如請求項9所述之製造方法或修改抗體，其中，前述抗體片段為Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、單鏈抗體(scFv)、還原型IgG(rIgG)。
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