JP2023109916A - ｍＲＮＡディスプレイ抗体ライブラリー及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】複数の抗体又は抗体断片をコードする高多様性核酸ライブラリーを作成する方法を提供する。【解決手段】高多様性核酸ライブラリーは、（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを含むか又はそれらに由来し、その各々が複数のメンバーを含む。好ましくは、サブライブラリーの各メンバーが、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む。特に好ましい実施形態では、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーの少なくとも２つのメンバーのうちの少なくとも一部が組み換えられて、発現ライブラリーにおける発現ライブラリーメンバーを形成し、発現ライブラリーの各メンバーは、別個の抗体又は抗体断片をコードする。【選択図】図１
Description
本出願は、２０１７年１１月２０日に出願された本出願人の同時係属の米国仮特許出願
第６２／５８８，９１４号に対する優先権を主張する。
第６２／５８８，９１４号に対する優先権を主張する。
本発明の分野は、特に、ｍＲＮＡディスプレイライブラリー及び組換え高親和性バイン
ダーを作製するためのｍＲＮＡディスプレイライブラリーの使用に関するため、極めて高
い多様性の抗体ライブラリーのための組成物及び方法である。
ダーを作製するためのｍＲＮＡディスプレイライブラリーの使用に関するため、極めて高
い多様性の抗体ライブラリーのための組成物及び方法である。
背景の説明には、本発明の理解に有用であり得る情報が含まれる。本明細書で提供され
る情報がいずれも本明細書で請求される発明の先行技術であるか又はこれに関連するもの
であること、或いは具体的又は暗示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを
認めるものではない。
る情報がいずれも本明細書で請求される発明の先行技術であるか又はこれに関連するもの
であること、或いは具体的又は暗示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを
認めるものではない。
本明細書における刊行物及び特許出願はいずれも、各々の個々の刊行物又は特許出願が
具体的且つ個別に参照によって組み込まれることが示された場合と同程度に、参照によっ
て組み込まれる。組み込まれる参考文献における用語の定義及び使用が、本明細書で提供
される用語の定義と一致しないか、これに反する場合、本明細書で提供されるその用語の
定義が適用され、参考文献中でのその用語の定義は適用されない。
具体的且つ個別に参照によって組み込まれることが示された場合と同程度に、参照によっ
て組み込まれる。組み込まれる参考文献における用語の定義及び使用が、本明細書で提供
される用語の定義と一致しないか、これに反する場合、本明細書で提供されるその用語の
定義が適用され、参考文献中でのその用語の定義は適用されない。
高親和性、特異的抗体又は結合分子により腫瘍抗原又はネオエピトープを標的化するこ
とが、癌患者を治療するための効果的な方法であると証明されている。ますます多くの患
者特異的且つ／若しくは癌特異的腫瘍抗原及び／又はネオエピトープが、オミクスデータ
解析を介してインビボ、インビトロ、又はインシリコで同定されるにつれて、安定であり
、可溶性であり、機能的であり、且つ適応可能である抗体又はバインダーを高い確率で選
択できる抗体ライブラリー又はディスプレイライブラリーを作製することの要求が高まっ
てきた。高親和性の特異的抗体又は結合分子は、天然の抗体プールの中で同定され得るか
、又は天然の抗体プールに由来し得るが、そのような同定又は由来の天然抗体又はバイン
ダーは、そのような抗原又はネオエピトープへの曝露の頻度又は強度に依存して、そのよ
うな天然抗体の多様性が制限される可能性があるため、効果的又は特異的ではない場合が
ある。
とが、癌患者を治療するための効果的な方法であると証明されている。ますます多くの患
者特異的且つ／若しくは癌特異的腫瘍抗原及び／又はネオエピトープが、オミクスデータ
解析を介してインビボ、インビトロ、又はインシリコで同定されるにつれて、安定であり
、可溶性であり、機能的であり、且つ適応可能である抗体又はバインダーを高い確率で選
択できる抗体ライブラリー又はディスプレイライブラリーを作製することの要求が高まっ
てきた。高親和性の特異的抗体又は結合分子は、天然の抗体プールの中で同定され得るか
、又は天然の抗体プールに由来し得るが、そのような同定又は由来の天然抗体又はバイン
ダーは、そのような抗原又はネオエピトープへの曝露の頻度又は強度に依存して、そのよ
うな天然抗体の多様性が制限される可能性があるため、効果的又は特異的ではない場合が
ある。
このような問題を解決するための１つのアプローチとして、組換えファージディスプレ
イライブラリーが使用され得る。このようなアプローチは、適度に高い多様性を有するラ
イブラリーの作製を可能にするが、多くの場合、バインダーのために何度も濃縮を行う必
要があり、手間と時間がかかる。さらに、比較的大きな多様性を有するにもかかわらず、
バインダーは理想的な親和性と安定性を欠く傾向がある。さらに、多様性は通常、ライブ
ラリー量、トランスフェクション効率などの実用的な考慮事項によって制限される。その
ようなアプローチ及び他のアプローチはさらに、例えば、国際公開第２００６／０７２７
７３号パンフレットに記載されるように複数の人工的な選択圧力を使用して最適化され得
る。このような方法は、安定性の特徴を向上させる場合があるが、著しい量のライブラリ
ー操作と時間が必要とされる。
イライブラリーが使用され得る。このようなアプローチは、適度に高い多様性を有するラ
イブラリーの作製を可能にするが、多くの場合、バインダーのために何度も濃縮を行う必
要があり、手間と時間がかかる。さらに、比較的大きな多様性を有するにもかかわらず、
バインダーは理想的な親和性と安定性を欠く傾向がある。さらに、多様性は通常、ライブ
ラリー量、トランスフェクション効率などの実用的な考慮事項によって制限される。その
ようなアプローチ及び他のアプローチはさらに、例えば、国際公開第２００６／０７２７
７３号パンフレットに記載されるように複数の人工的な選択圧力を使用して最適化され得
る。このような方法は、安定性の特徴を向上させる場合があるが、著しい量のライブラリ
ー操作と時間が必要とされる。
さらに別のアプローチにおいて、ｍＲＮＡディスプレイが実施され得る。ここで、候補
結合分子（典型的にはｓｃＦｖ）をコードするｍＲＮＡ配列は、それらの３’末端でピュ
ーロマイシン分子と結合し、ｍＲＮＡ配列によってコードされるペプチドは、インビトロ
翻訳を介して生成され、ｍＲＮＡをｍＲＮＡによってコードされるタンパク質に直接結合
した融合産物を生成する。しかしながら、現在のｍＲＮＡディスプレイ技術は、トランス
フェクション制限に関連する問題を有利に回避し、少なくとも概念的にはより高い多様性
を可能にするが、構造的完全性又は安定性、比較的低い親和性、及び／又は交差反応性の
問題は依然として残っている。ｍＲＮＡディスプレイからのｓｃＦｖの少なくとも選択さ
れた結合特性をさらに改善するために、ＶＨ－ＣＤＲ３スペクトラタイピング分析が実施
された（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉ
ｏｎ，２０１５，ｖｏｌ．２８ ｎｏ．１０，ｐｐ．４２７－４３５を参照のこと）。し
かしながら、このようなプロセスは反復分析を必要とし、全ての抗原に対して生産的では
ない場合がある。
結合分子（典型的にはｓｃＦｖ）をコードするｍＲＮＡ配列は、それらの３’末端でピュ
ーロマイシン分子と結合し、ｍＲＮＡ配列によってコードされるペプチドは、インビトロ
翻訳を介して生成され、ｍＲＮＡをｍＲＮＡによってコードされるタンパク質に直接結合
した融合産物を生成する。しかしながら、現在のｍＲＮＡディスプレイ技術は、トランス
フェクション制限に関連する問題を有利に回避し、少なくとも概念的にはより高い多様性
を可能にするが、構造的完全性又は安定性、比較的低い親和性、及び／又は交差反応性の
問題は依然として残っている。ｍＲＮＡディスプレイからのｓｃＦｖの少なくとも選択さ
れた結合特性をさらに改善するために、ＶＨ－ＣＤＲ３スペクトラタイピング分析が実施
された（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉ
ｏｎ，２０１５，ｖｏｌ．２８ ｎｏ．１０，ｐｐ．４２７－４３５を参照のこと）。し
かしながら、このようなプロセスは反復分析を必要とし、全ての抗原に対して生産的では
ない場合がある。
したがって、ｍＲＮＡディスプレイ及び他の方法を使用して候補バインダーを作製し且
つ同定する方法は知られているが、高い構造的完全性／安定性、低い親和性、及び／又は
低い交差反応性を有するバインダーによる高い多様性のライブラリーは、実現しないまま
であった。したがって、安定な組換え高親和性バインダーを迅速に作製するためのｍＲＮ
Ａディスプレイライブラリーの改善された組成物、方法、及び使用の必要性が依然として
存在する。
つ同定する方法は知られているが、高い構造的完全性／安定性、低い親和性、及び／又は
低い交差反応性を有するバインダーによる高い多様性のライブラリーは、実現しないまま
であった。したがって、安定な組換え高親和性バインダーを迅速に作製するためのｍＲＮ
Ａディスプレイライブラリーの改善された組成物、方法、及び使用の必要性が依然として
存在する。
本発明の主題は、様々な生体分子、特に、癌抗原又はネオエピトープに対する安定で可
溶性の機能的な抗体又はバインダーの信頼性があり且つ効率的な同定を可能にする複数の
抗体又は抗体断片をコードする高多様性核酸ライブラリーの様々な組成物、方法、及び使
用を対象とする。したがって、主題の一態様は、複数の抗体又は抗体断片をコードする高
多様性核酸ライブラリーを作製する方法を含む。この方法では、各々が複数のメンバーを
有する３つのサブライブラリー：（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複
数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーが作製されるか
又は提供される。３つのサブライブラリーの各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する
少なくとも１つのランダムカセットを含む。３つのライブラリーの少なくとも２つのメン
バーの少なくとも一部が組み換えられて、発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバ
ーを形成し、これは、複数の発現ライブラリーメンバーを有する。別々の抗体又は抗体断
片をコードする各発現ライブラリーメンバー。好ましい実施形態では、発現ライブラリー
メンバーは、ｍＲＮＡ断片に転写され、続いてこれは３’末端でピューロマイシン分子と
結合される。
溶性の機能的な抗体又はバインダーの信頼性があり且つ効率的な同定を可能にする複数の
抗体又は抗体断片をコードする高多様性核酸ライブラリーの様々な組成物、方法、及び使
用を対象とする。したがって、主題の一態様は、複数の抗体又は抗体断片をコードする高
多様性核酸ライブラリーを作製する方法を含む。この方法では、各々が複数のメンバーを
有する３つのサブライブラリー：（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複
数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーが作製されるか
又は提供される。３つのサブライブラリーの各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する
少なくとも１つのランダムカセットを含む。３つのライブラリーの少なくとも２つのメン
バーの少なくとも一部が組み換えられて、発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバ
ーを形成し、これは、複数の発現ライブラリーメンバーを有する。別々の抗体又は抗体断
片をコードする各発現ライブラリーメンバー。好ましい実施形態では、発現ライブラリー
メンバーは、ｍＲＮＡ断片に転写され、続いてこれは３’末端でピューロマイシン分子と
結合される。
本発明の主題の別の態様では、本発明者らは、複数の核酸ライブラリーを有する組成物
を企図する。複数の核酸ライブラリーは、（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、
（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを含む
。サブライブラリー（１）～（３）の各々は、複数のメンバーを含み、サブライブラリー
の各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む
。
を企図する。複数の核酸ライブラリーは、（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、
（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを含む
。サブライブラリー（１）～（３）の各々は、複数のメンバーを含み、サブライブラリー
の各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む
。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、高多様性の核酸ライブラリーを作
製するための上の組成物の使用を企図する。
製するための上の組成物の使用を企図する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、複数の核酸ライブラリーメンバー
を有する高多様性核酸ライブラリー組成物を企図する。高多様性核酸ライブラリーメンバ
ーは、それぞれ複数の縮重塩基位置を有する複数のランダムカセットを含む組換え核酸を
含む。複数のランダムカセットは、以下：（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、
（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーからの
２つのライブラリーのいずれかからの少なくとも２つのメンバーに由来する。
を有する高多様性核酸ライブラリー組成物を企図する。高多様性核酸ライブラリーメンバ
ーは、それぞれ複数の縮重塩基位置を有する複数のランダムカセットを含む組換え核酸を
含む。複数のランダムカセットは、以下：（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、
（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーからの
２つのライブラリーのいずれかからの少なくとも２つのメンバーに由来する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、癌ネオエピトープに対する治療用
組換え抗体を作製するための高多様性核酸ライブラリーの使用を企図する。
組換え抗体を作製するための高多様性核酸ライブラリーの使用を企図する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、組換え抗体を作製する方法を企図
する。この方法では、各々が複数のメンバーを有する３つのサブライブラリー：（１）Ｖ
Ｈ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及
び（３）ＶＬサブライブラリーが作製されるか又は提供される。３つのサブライブラリー
の各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む
。３つのライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部が組み換えられて、
発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバーを形成し、これは、複数の発現ライブラ
リーメンバーを有する。別々の抗体又は抗体断片をコードする各発現ライブラリーメンバ
ー。次に、方法は、発現ライブラリーメンバーを用いて組換え抗体又はその断片の作製を
続ける。
する。この方法では、各々が複数のメンバーを有する３つのサブライブラリー：（１）Ｖ
Ｈ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及
び（３）ＶＬサブライブラリーが作製されるか又は提供される。３つのサブライブラリー
の各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む
。３つのライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部が組み換えられて、
発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバーを形成し、これは、複数の発現ライブラ
リーメンバーを有する。別々の抗体又は抗体断片をコードする各発現ライブラリーメンバ
ー。次に、方法は、発現ライブラリーメンバーを用いて組換え抗体又はその断片の作製を
続ける。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、上記の方法により構築された組成
物に抗原を接触させることにより、抗原に対して１００ｎＭ以下の親和性を有する高親和
性バインダーを単離する方法を企図する。
物に抗原を接触させることにより、抗原に対して１００ｎＭ以下の親和性を有する高親和
性バインダーを単離する方法を企図する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、下に提供される表１又は表２から
選択されるオリゴヌクレオチドを用いて作製される組換え核酸断片を企図する。
選択されるオリゴヌクレオチドを用いて作製される組換え核酸断片を企図する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、下に提供される表１又は表２から
選択される核酸配列を有する合成核酸混合物を企図する。
選択される核酸配列を有する合成核酸混合物を企図する。
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点は、添付の図面とともに、好ましい実
施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
本発明者らは目下、高多様性核酸ライブラリーのメンバーによってコードされる抗体又
はその断片の選択されたドメインの標的化された多様性を用いて高多様性核酸ライブラリ
ーを構築することによって、特異的且つ効果的な組換え抗体又はその断片が、作製又は同
定され得ることを発見した。このような目的を達成するために、本発明者らは目下、抗体
／バインダーの１つ以上のドメイン又はサブドメインを予め選択することができ、予め選
択されたドメイン又はサブドメイン内のランダムカセットを使用して、複数の核酸サブラ
イブラリーを作製できることを発見した。本発明者らはさらに、サブライブラリーのメン
バーを組み換えて、ライブラリーのメンバー間で高い多様性を可能にしながらも、癌抗原
又はネオエピトープ（好ましくは癌特異的、患者特異的ネオエピトープ又はネオ抗原）に
対してインビボで使用された場合に、安定であり、可溶性であり、機能的であり、且つ適
応可能である抗体／バインダーを同定する確率を高める高多様性核酸ライブラリーを構築
できることを発見した。
はその断片の選択されたドメインの標的化された多様性を用いて高多様性核酸ライブラリ
ーを構築することによって、特異的且つ効果的な組換え抗体又はその断片が、作製又は同
定され得ることを発見した。このような目的を達成するために、本発明者らは目下、抗体
／バインダーの１つ以上のドメイン又はサブドメインを予め選択することができ、予め選
択されたドメイン又はサブドメイン内のランダムカセットを使用して、複数の核酸サブラ
イブラリーを作製できることを発見した。本発明者らはさらに、サブライブラリーのメン
バーを組み換えて、ライブラリーのメンバー間で高い多様性を可能にしながらも、癌抗原
又はネオエピトープ（好ましくは癌特異的、患者特異的ネオエピトープ又はネオ抗原）に
対してインビボで使用された場合に、安定であり、可溶性であり、機能的であり、且つ適
応可能である抗体／バインダーを同定する確率を高める高多様性核酸ライブラリーを構築
できることを発見した。
実際に、以下でより詳細に示されるとおり、本明細書に提示されるライブラリーは、典
型的には、シングルパス又はツーパスの濃縮において、バインダーが１００ｎＭ以下、よ
り典型的には１０ｎＭ以下のＫｄを有する任意の抗原に対する少なくとも１つのバインダ
ーの単離を可能にする。さらに、企図された系及び方法は、少なくとも１０９、少なくと
も１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくと
も１０１４、少なくとも１０１５、又は少なくとも１０１６の異なるライブラリーメンバ
ーの多様性を有するｓｃＦｖライブラリーを、従来のライブラリー構築と比較して大幅に
短縮された時間枠内で可能にする。したがって、抗体発見の速度が実質的に上昇すること
が理解されるはずである。
型的には、シングルパス又はツーパスの濃縮において、バインダーが１００ｎＭ以下、よ
り典型的には１０ｎＭ以下のＫｄを有する任意の抗原に対する少なくとも１つのバインダ
ーの単離を可能にする。さらに、企図された系及び方法は、少なくとも１０９、少なくと
も１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくと
も１０１４、少なくとも１０１５、又は少なくとも１０１６の異なるライブラリーメンバ
ーの多様性を有するｓｃＦｖライブラリーを、従来のライブラリー構築と比較して大幅に
短縮された時間枠内で可能にする。したがって、抗体発見の速度が実質的に上昇すること
が理解されるはずである。
本明細書で使用する場合、用語「腫瘍」は、人体内の１つ以上の解剖学的位置に配置さ
れ得るか、又は見出され得る１つ以上の癌細胞、癌組織、悪性腫瘍細胞、又は悪性腫瘍組
織を指し、且つそれらと互換的に使用される。
れ得るか、又は見出され得る１つ以上の癌細胞、癌組織、悪性腫瘍細胞、又は悪性腫瘍組
織を指し、且つそれらと互換的に使用される。
本明細書で使用する場合、用語「結合する」は、用語「認識する」及び／又は「検出す
る」を指し、且つそれらと互換的に使用することができ、２つの分子間の相互作用は、１
０－６Ｍ以下又は１０－７Ｍ以下のＫＤを有して高親和性を有する。
る」を指し、且つそれらと互換的に使用することができ、２つの分子間の相互作用は、１
０－６Ｍ以下又は１０－７Ｍ以下のＫＤを有して高親和性を有する。
本明細書で使用する場合、用語「提供する」又は「提供すること」は、製造するか、作
製するか、配置するか、使用可能にするか、又は使用の準備をすることのいずれかの行為
を指し、且つ含む。
製するか、配置するか、使用可能にするか、又は使用の準備をすることのいずれかの行為
を指し、且つ含む。
核酸サブライブラリーの構築
一般に、抗体の構造部品（重鎖、軽鎖、定常ドメイン、可変ドメイン）は、それらの機
能に密接に関係する。例えば、重鎖における可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）はと
もに、抗体に特異性をもたらすエピトープ結合ドメインを構成する。ＶＨ及びＶＬの各々
は、抗原に対するそれらの特異性に基づく固有のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定
領域（ＣＤＲｓ、ＣＤＲ１～３）を含む。したがって、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードす
る配列をランダム化することにより、抗体を作製又は同定するための組換え核酸ライブラ
リーが作製され得ることが以前に企図されていた。しかしながら、本発明者らは、ＶＨ及
びＶＬの全てのＣＤＲを完全にランダム化することは、ライブラリーに大きな多様性をも
たらす可能性がある一方で、全てのランダム化されたＶＨ及びＶＬが、抗体（例えば、Ｉ
ｇＧ１など）を形成するために組み換えられるときに可溶性又は安定に発現され得るわけ
ではないため、ランダム配列の全ての組合せを作製し、全てのランダム化された組合せを
スクリーニングすることにおいて非効率も生じさせることを見出した。さらに、多様性空
間全体を網羅することは、可能なライブラリーメンバーの数が非常に多いため、現実的で
はない。
一般に、抗体の構造部品（重鎖、軽鎖、定常ドメイン、可変ドメイン）は、それらの機
能に密接に関係する。例えば、重鎖における可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）はと
もに、抗体に特異性をもたらすエピトープ結合ドメインを構成する。ＶＨ及びＶＬの各々
は、抗原に対するそれらの特異性に基づく固有のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定
領域（ＣＤＲｓ、ＣＤＲ１～３）を含む。したがって、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードす
る配列をランダム化することにより、抗体を作製又は同定するための組換え核酸ライブラ
リーが作製され得ることが以前に企図されていた。しかしながら、本発明者らは、ＶＨ及
びＶＬの全てのＣＤＲを完全にランダム化することは、ライブラリーに大きな多様性をも
たらす可能性がある一方で、全てのランダム化されたＶＨ及びＶＬが、抗体（例えば、Ｉ
ｇＧ１など）を形成するために組み換えられるときに可溶性又は安定に発現され得るわけ
ではないため、ランダム配列の全ての組合せを作製し、全てのランダム化された組合せを
スクリーニングすることにおいて非効率も生じさせることを見出した。さらに、多様性空
間全体を網羅することは、可能なライブラリーメンバーの数が非常に多いため、現実的で
はない。
したがって、本発明者らは、ＶＨ及びＶＬのサブドメインを２つのカテゴリー：異なる
抗体（又はその抗体をコードする遺伝子）のＶＨ又はＶＬの間で一般的に共通するフレー
ムワーク領域、並びに最終的なペプチド生成物（例えば、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１など）の安
定性及び／又は可溶性に著しい影響を与えることなく、少なくとも部分的に又は完全にラ
ンダム化され得る標的化される多様化領域に分割できることを企図する。好ましくは、Ｖ
Ｈの標的化される多様化領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２－ｎ（ＣＤＲ２のＮ末端側）、ＣＤ
Ｒ２－ｃ（ＣＤＲ２のＣ末端側）、及びＣＤＲ３の少なくとも一部を含む。さらに好まし
い態様では、ＶＬの標的化される多様化領域は、ＣＤＲ３の少なくとも一部を含む。
抗体（又はその抗体をコードする遺伝子）のＶＨ又はＶＬの間で一般的に共通するフレー
ムワーク領域、並びに最終的なペプチド生成物（例えば、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１など）の安
定性及び／又は可溶性に著しい影響を与えることなく、少なくとも部分的に又は完全にラ
ンダム化され得る標的化される多様化領域に分割できることを企図する。好ましくは、Ｖ
Ｈの標的化される多様化領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２－ｎ（ＣＤＲ２のＮ末端側）、ＣＤ
Ｒ２－ｃ（ＣＤＲ２のＣ末端側）、及びＣＤＲ３の少なくとも一部を含む。さらに好まし
い態様では、ＶＬの標的化される多様化領域は、ＣＤＲ３の少なくとも一部を含む。
そのため、本発明の主題の１つの例示的且つ特に好ましい態様では、核酸ライブラリー
は、ＶＨ及び／又はＶＬの１つ以上の標的化される多様化領域における１つ以上のランダ
ム配列カセットを含む組換え核酸を生成することによって作製され得る。一つの好ましい
実施形態では、本発明者らは、単一のサブライブラリー内のランダム化された組換え配列
が多すぎて、単一のサブライブラリーの量を迅速又は適時のスクリーニングのために扱う
ことが非実用的又は非効率的になり得ることを回避しながら、各サブライブラリーが、ラ
ンダム化された標的化される多様化領域内の多様性を保持するように、異なる標的化され
る多様化領域内に異なるセットのランダム配列カセットを有する３つの異なるサブライブ
ラリーを企図している。さらに、標的化される多様化領域間の保存された領域は、最大の
安定性及び可溶性のために選択されるか又は設計される。
は、ＶＨ及び／又はＶＬの１つ以上の標的化される多様化領域における１つ以上のランダ
ム配列カセットを含む組換え核酸を生成することによって作製され得る。一つの好ましい
実施形態では、本発明者らは、単一のサブライブラリー内のランダム化された組換え配列
が多すぎて、単一のサブライブラリーの量を迅速又は適時のスクリーニングのために扱う
ことが非実用的又は非効率的になり得ることを回避しながら、各サブライブラリーが、ラ
ンダム化された標的化される多様化領域内の多様性を保持するように、異なる標的化され
る多様化領域内に異なるセットのランダム配列カセットを有する３つの異なるサブライブ
ラリーを企図している。さらに、標的化される多様化領域間の保存された領域は、最大の
安定性及び可溶性のために選択されるか又は設計される。
一実施形態では、サブライブラリーは、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーを含む。
ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーは、ＶＨ ＣＤＲ１の少なくとも一部及び／又はＶ
Ｈ ＣＤＲ２の一部に相当する１つ以上のランダム配列カセットを有する複数の組換え核
酸（例えば、組換えＤＮＡ）を含む。本明細書で使用する場合、ＶＨ ＣＤＲ１の一部に
相当するランダムカセットは、ランダムカセットが組換え核酸の領域内に位置することを
意味し、その中でＣＤＲ１部分をコードする配列が、天然抗体のＶＨドメインに少なくと
も構造的又は機能的に類似しているＶＨドメインの一部をコードするために存在すべきで
ある。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー中の組換え核酸は、以下のとおりの
構造を有する（ランダム化された領域は下線が引かれ、固定の配列決定された領域は括弧
に入れられる）：
本明細書で使用する場合、ＵＴＲは非翻訳領域を指し、ＦＷはフレームワーク領域（例え
ば、ＦＷ１は、第２のフレームワーク領域（ＦＷ２）とは異なり得る第１のフレームワー
ク領域である）を指す。この構造において、ランダム配列カセットは、ＣＤＲ１若しくは
ＣＤＲ２、又は好ましくは、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の両方の領域において挿入され得る。い
くつかの実施形態では、２つ以上ランダム配列カセット、好ましくは２つのランダム配列
カセットは、ＣＤＲ２の領域において挿入され得る：ＣＤＲ２－ｎ（ＣＤＲ２の５’－末
端側に関して）及びＣＤＲ－ｃ（ＣＤＲ２の３’－末端側に関して）。
ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーは、ＶＨ ＣＤＲ１の少なくとも一部及び／又はＶ
Ｈ ＣＤＲ２の一部に相当する１つ以上のランダム配列カセットを有する複数の組換え核
酸（例えば、組換えＤＮＡ）を含む。本明細書で使用する場合、ＶＨ ＣＤＲ１の一部に
相当するランダムカセットは、ランダムカセットが組換え核酸の領域内に位置することを
意味し、その中でＣＤＲ１部分をコードする配列が、天然抗体のＶＨドメインに少なくと
も構造的又は機能的に類似しているＶＨドメインの一部をコードするために存在すべきで
ある。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー中の組換え核酸は、以下のとおりの
構造を有する（ランダム化された領域は下線が引かれ、固定の配列決定された領域は括弧
に入れられる）：
ば、ＦＷ１は、第２のフレームワーク領域（ＦＷ２）とは異なり得る第１のフレームワー
ク領域である）を指す。この構造において、ランダム配列カセットは、ＣＤＲ１若しくは
ＣＤＲ２、又は好ましくは、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の両方の領域において挿入され得る。い
くつかの実施形態では、２つ以上ランダム配列カセット、好ましくは２つのランダム配列
カセットは、ＣＤＲ２の領域において挿入され得る：ＣＤＲ２－ｎ（ＣＤＲ２の５’－末
端側に関して）及びＣＤＲ－ｃ（ＣＤＲ２の３’－末端側に関して）。
サブライブラリーはまた、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーを含み得る。ＶＨ－
ＣＤＲ３サブライブラリーの各々は、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくとも一部に相当する１つ以
上のランダム配列カセットを有する複数の組換え核酸（例えば、組換えＤＮＡ）を含む。
ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーと同様に、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー中
の組換え核酸は以下のとおりの構造を有し得る（ランダム化された領域は下線が引かれ、
固定の配列決定された領域は括弧に入れられる）：
好ましくは、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー及び／又はＶＨ－ＣＤＲ３サブライブ
ラリーの組換え核酸の固定配列（例えば、プロモーター－５’ＵＴＲ－ＦＷ１＋ＣＤＲ１
＋ＦＷ２＋ＣＤＲ２＋ＦＷ３、ＦＷ４）は、固定配列が最も発現可能であり、一本鎖可変
断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖの改変形態、全長免疫グロブリン、又は免疫グロブリンの一
部として発現されるペプチドを含む複数の形態に適応可能であるように、天然抗体（例え
ば、種々の抗原に対するＩｇＧ１）の中で最も一般的及び／又は保存された配列を使用す
るように選択される。したがって、好ましい実施形態では、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライ
ブラリーの組換え核酸及びＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの組換え核酸の固定配列は、
互いに少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０
％同一である（共有される）。
ＣＤＲ３サブライブラリーの各々は、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくとも一部に相当する１つ以
上のランダム配列カセットを有する複数の組換え核酸（例えば、組換えＤＮＡ）を含む。
ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーと同様に、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー中
の組換え核酸は以下のとおりの構造を有し得る（ランダム化された領域は下線が引かれ、
固定の配列決定された領域は括弧に入れられる）：
ラリーの組換え核酸の固定配列（例えば、プロモーター－５’ＵＴＲ－ＦＷ１＋ＣＤＲ１
＋ＦＷ２＋ＣＤＲ２＋ＦＷ３、ＦＷ４）は、固定配列が最も発現可能であり、一本鎖可変
断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖの改変形態、全長免疫グロブリン、又は免疫グロブリンの一
部として発現されるペプチドを含む複数の形態に適応可能であるように、天然抗体（例え
ば、種々の抗原に対するＩｇＧ１）の中で最も一般的及び／又は保存された配列を使用す
るように選択される。したがって、好ましい実施形態では、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライ
ブラリーの組換え核酸及びＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの組換え核酸の固定配列は、
互いに少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０
％同一である（共有される）。
サブライブラリーはまた、ＶＬサブライブラリーを含み得る。ＶＬサブライブラリーは
、ＶＬ ＣＤＲ３の少なくとも一部に相当する１つ以上のランダム配列カセットを有する
複数の組換え核酸（例えば、組換えＤＮＡ）を含む。ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリ
ーと同様に、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー中の組換え核酸は以下のとおりの構造
を有し得る（ランダム化された領域は下線が引かれ、固定の配列決定された領域は括弧に
入れられる）：
好ましくは、ＶＬサブライブラリーの組換え核酸の固定配列は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブ
ライブラリー又はＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの組換え核酸のものと少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である（共有さ
れる）。
、ＶＬ ＣＤＲ３の少なくとも一部に相当する１つ以上のランダム配列カセットを有する
複数の組換え核酸（例えば、組換えＤＮＡ）を含む。ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリ
ーと同様に、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー中の組換え核酸は以下のとおりの構造
を有し得る（ランダム化された領域は下線が引かれ、固定の配列決定された領域は括弧に
入れられる）：
ライブラリー又はＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの組換え核酸のものと少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である（共有さ
れる）。
任意のランダム化された配列は、ランダム配列カセットを作製するために考慮され得る
が、本発明者らは、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及びＶＬドメインのＣＤＲ３の
ための戦略化されたランダム配列カセットが、結合ペプチド（例えば、ｓｃＦｖなど）と
して発現された場合に、高い複雑性及び大きな潜在的な結合面を与えることを企図する。
例えば、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのＣＤＲ１、ＣＤＲ２のための戦略化され
たランダム配列カセットは、カセット１個当たり３個以下、好ましくは２個以下、又はよ
り好ましくは１個のランダム配列（カセット１個当たり３個以下、２個以下、又は１個の
ランダムアミノ酸をコードする）を有するセミランダム配列カセットであってもよい。ラ
ンダムカセット中のランダム配列の位置は、カセット中のランダムアミノ酸に応じて変動
し得る。別の例において、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのＣＤＲ３のための戦略化さ
れたランダム配列カセットは、カセット１個当たり４個以上、好ましくは５個以上、又は
より好ましくは６個以上のランダム配列（カセット１個当たり４個以上、好ましくは５個
以上、又はより好ましくは６個以上のランダムアミノ酸をコードする）が存在するように
、よりランダム化された配列を含み得る。さらに別の例において、ＶＬサブライブラリー
のＣＤＲ３のための戦略化されたランダム配列は、カセット１個当たり４個以上、好まし
くは５個以上、又はより好ましくは６個以上のランダム配列（カセット１個当たり４個以
上、好ましくは５個以上、又はより好ましくは６個以上のランダムアミノ酸をコードする
）が存在するように、よりランダム化された配列を含み得る。
が、本発明者らは、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及びＶＬドメインのＣＤＲ３の
ための戦略化されたランダム配列カセットが、結合ペプチド（例えば、ｓｃＦｖなど）と
して発現された場合に、高い複雑性及び大きな潜在的な結合面を与えることを企図する。
例えば、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのＣＤＲ１、ＣＤＲ２のための戦略化され
たランダム配列カセットは、カセット１個当たり３個以下、好ましくは２個以下、又はよ
り好ましくは１個のランダム配列（カセット１個当たり３個以下、２個以下、又は１個の
ランダムアミノ酸をコードする）を有するセミランダム配列カセットであってもよい。ラ
ンダムカセット中のランダム配列の位置は、カセット中のランダムアミノ酸に応じて変動
し得る。別の例において、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのＣＤＲ３のための戦略化さ
れたランダム配列カセットは、カセット１個当たり４個以上、好ましくは５個以上、又は
より好ましくは６個以上のランダム配列（カセット１個当たり４個以上、好ましくは５個
以上、又はより好ましくは６個以上のランダムアミノ酸をコードする）が存在するように
、よりランダム化された配列を含み得る。さらに別の例において、ＶＬサブライブラリー
のＣＤＲ３のための戦略化されたランダム配列は、カセット１個当たり４個以上、好まし
くは５個以上、又はより好ましくは６個以上のランダム配列（カセット１個当たり４個以
上、好ましくは５個以上、又はより好ましくは６個以上のランダムアミノ酸をコードする
）が存在するように、よりランダム化された配列を含み得る。
本発明の主題の特定の好ましい態様では、本発明者らは、サブライブラリーのための好
ましいランダム配列カセットが、表１（ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー及びＶＨ－
ＣＤＲ３サブライブラリーに関する）、及び表２（ＶＬサブライブラリーに関する）にお
いて提示されるオリゴヌクレオチドを使用して作製され得ることを企図する。表１及び２
において示されるとおり、各オリゴヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣアンビギュイティコード
として示される縮重コードを有する（強調された）ランダム配列を含む。例えば、ＣＤＲ
１ランダム配列カセットのための１つのオリゴヌクレオチドは、ランダム配列「ＲＶＴ」
を含み、これは、「Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｔ」を表し、その組合せは、スレオニン（Ｔ）
、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）又はグリ
シン（Ｇ）のうちの１つをコードできる。縮重コドンによってコードされるアミノ酸の選
択は、右に表され、Ｘとともに示される。
ましいランダム配列カセットが、表１（ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー及びＶＨ－
ＣＤＲ３サブライブラリーに関する）、及び表２（ＶＬサブライブラリーに関する）にお
いて提示されるオリゴヌクレオチドを使用して作製され得ることを企図する。表１及び２
において示されるとおり、各オリゴヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣアンビギュイティコード
として示される縮重コードを有する（強調された）ランダム配列を含む。例えば、ＣＤＲ
１ランダム配列カセットのための１つのオリゴヌクレオチドは、ランダム配列「ＲＶＴ」
を含み、これは、「Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｔ」を表し、その組合せは、スレオニン（Ｔ）
、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）又はグリ
シン（Ｇ）のうちの１つをコードできる。縮重コドンによってコードされるアミノ酸の選
択は、右に表され、Ｘとともに示される。
さらに且つ好ましくは、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのためのランダム配列カセッ
トは、異なる長さの核酸配列を含み得る。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのた
めのランダム配列カセットは、１０～３０個のアミノ酸、好ましくは１０～２５個のアミ
ノ酸、より好ましくは１０～２０個のアミノ酸の任意の長さであり得る。したがって、表
１において示されるとおり、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのためのランダム配列カセ
ットを作製するためのオリゴヌクレオチドは、Ｄ／Ｇ－Ｒ／Ｌ及びＡ／Ｇをコードする配
列間に「ＮＮＫ」（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ、Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ、Ｇ／Ｔを表す）の様々なリピート
（例えば、４～１０のリピート）を含み得る（図３も参照のこと）。軽鎖配列の作製及び
多様性は、図４において例示的に示される。
トは、異なる長さの核酸配列を含み得る。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのた
めのランダム配列カセットは、１０～３０個のアミノ酸、好ましくは１０～２５個のアミ
ノ酸、より好ましくは１０～２０個のアミノ酸の任意の長さであり得る。したがって、表
１において示されるとおり、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのためのランダム配列カセ
ットを作製するためのオリゴヌクレオチドは、Ｄ／Ｇ－Ｒ／Ｌ及びＡ／Ｇをコードする配
列間に「ＮＮＫ」（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ、Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ、Ｇ／Ｔを表す）の様々なリピート
（例えば、４～１０のリピート）を含み得る（図３も参照のこと）。軽鎖配列の作製及び
多様性は、図４において例示的に示される。
最も典型的には、表１及び２において提示されるオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ
において提供され、これはＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を使用して二重鎖ＤＮ
Ａ断片に変換されて、固定の配列決定された領域（例えば、ＶＬサブライブラリーなどの
組換え核酸に関して、５’－（プロモーター－５’ＵＴＲ－ＦＷ１＋ＣＤＲ１＋ＦＷ２＋
ＣＤＲ２＋ＦＷ３）－（ＦＷ４））を含む骨格に挿入され得る。さらに、表１及び２に提
示されるオリゴヌクレオチドはまた、ポリメラーゼ酵素を使用せずに二重鎖核酸を形成す
るために相補的なオリゴヌクレオチドとともに存在することもまた企図される。
において提供され、これはＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を使用して二重鎖ＤＮ
Ａ断片に変換されて、固定の配列決定された領域（例えば、ＶＬサブライブラリーなどの
組換え核酸に関して、５’－（プロモーター－５’ＵＴＲ－ＦＷ１＋ＣＤＲ１＋ＦＷ２＋
ＣＤＲ２＋ＦＷ３）－（ＦＷ４））を含む骨格に挿入され得る。さらに、表１及び２に提
示されるオリゴヌクレオチドはまた、ポリメラーゼ酵素を使用せずに二重鎖核酸を形成す
るために相補的なオリゴヌクレオチドとともに存在することもまた企図される。
いくつかの実施形態では、サブライブラリーの組換え核酸はまた、組換え核酸によって
コードされるペプチドが、タンパク質タグに対するバインダーを使用して単離され得るよ
うに、タンパク質タグをコードする核酸配列を含む。例えば、好ましいタンパク質タグと
しては、ＦＬＡＧタグ（配列モチーフＤＹＫＤＤＤＤＫを有する）、Ｍｙｃタグ（配列モ
チーフＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを有する）、及びＨＡ－タグが挙げられる。いくつかの実施
形態では、タンパク質タグは、シグナルを強化するか又は検出を増大させるために繰り返
され得る（例えば、ＦＬＡＧタグの３回の反復（３Ｘ ＦＬＡＧ）など）。
コードされるペプチドが、タンパク質タグに対するバインダーを使用して単離され得るよ
うに、タンパク質タグをコードする核酸配列を含む。例えば、好ましいタンパク質タグと
しては、ＦＬＡＧタグ（配列モチーフＤＹＫＤＤＤＤＫを有する）、Ｍｙｃタグ（配列モ
チーフＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを有する）、及びＨＡ－タグが挙げられる。いくつかの実施
形態では、タンパク質タグは、シグナルを強化するか又は検出を増大させるために繰り返
され得る（例えば、ＦＬＡＧタグの３回の反復（３Ｘ ＦＬＡＧ）など）。
サブライブラリーの組換え核酸に挿入されたいくつかのランダム配列カセットは、フレ
ームシフト、ナンセンス変異、及び組換え核酸によってコードされるペプチドの構造を不
安定化させている配列を導入し得ることが企図される。したがって、いくつかの実施形態
では、本発明者らは、不安定又はミスフォールドしたペプチドをコードする任意の組換え
核酸がライブラリーから除去され得るように、サブライブラリーの組換え核酸をインビト
ロで試験することを企図する。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー又はＶＬサブラ
イブラリーの組換え核酸は、それぞれＣＤＲ配列とは独立して免疫グロブリンのＶＨ３ド
メイン又はＶＬ（Ｖκ）ドメインの構造化エピトープに結合するスタフィロコッカス・ア
ウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ又はフィネゴ
ルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）のプロテインＬに対するそれら
の結合親和性について試験され得る。
ームシフト、ナンセンス変異、及び組換え核酸によってコードされるペプチドの構造を不
安定化させている配列を導入し得ることが企図される。したがって、いくつかの実施形態
では、本発明者らは、不安定又はミスフォールドしたペプチドをコードする任意の組換え
核酸がライブラリーから除去され得るように、サブライブラリーの組換え核酸をインビト
ロで試験することを企図する。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー又はＶＬサブラ
イブラリーの組換え核酸は、それぞれＣＤＲ配列とは独立して免疫グロブリンのＶＨ３ド
メイン又はＶＬ（Ｖκ）ドメインの構造化エピトープに結合するスタフィロコッカス・ア
ウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ又はフィネゴ
ルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）のプロテインＬに対するそれら
の結合親和性について試験され得る。
プロテインＡ又はプロテインＬに対するそれらの結合親和性によって組換え核酸をスク
リーニングするための任意の好適な方法が企図される。例示的な一実施形態では、サブラ
イブラリーの組換え核酸は、インビトロ転写によってｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡの３
’末端がピューロマイシンに結合（共有結合）される。ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡ
から転写されるペプチドがピューロマイシンを介してｍＲＮＡと結合されるように、ピュ
ーロマイシン結合型ｍＲＮＡはインビトロで転写される。次に、ペプチドをプロテインＡ
又はプロテインＬと接触させて、プロテインＡ又はプロテインＬに効率的に結合するペプ
チドを同定する。好ましくは、１０－６Ｍ以下、好ましくは１０－７Ｍ以下のＫＤを有す
る親和性を有するプロテインＡ又はプロテインＬに結合するペプチドが選択され、単離さ
れる。プロテインＡ又はプロテインＬに対して高い親和性を有するペプチドが単離される
と、単離されたペプチドのｃＤＮＡが、ピューロマイシン及びペプチドと結合したｍＲＮ
Ａのインビトロ逆転写を介して作製され得る。次に、そうして作製された単離ペプチドの
ｃＤＮＡは、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー又はＶＬサブライブラリーの選択された組
換え核酸を作製するためのランダム配列カセットとして挿入され得る。或いは、サブライ
ブラリーの組換え核酸が、組換え核酸のためのインビトロ転写工程（ＤＮＡフォーマット
における）が必要とされなくてもよいように、任意選択によりピューロマイシン分子と予
め結合されたｍＲＮＡの形態で存在し得ることもまた企図される。
リーニングするための任意の好適な方法が企図される。例示的な一実施形態では、サブラ
イブラリーの組換え核酸は、インビトロ転写によってｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡの３
’末端がピューロマイシンに結合（共有結合）される。ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡ
から転写されるペプチドがピューロマイシンを介してｍＲＮＡと結合されるように、ピュ
ーロマイシン結合型ｍＲＮＡはインビトロで転写される。次に、ペプチドをプロテインＡ
又はプロテインＬと接触させて、プロテインＡ又はプロテインＬに効率的に結合するペプ
チドを同定する。好ましくは、１０－６Ｍ以下、好ましくは１０－７Ｍ以下のＫＤを有す
る親和性を有するプロテインＡ又はプロテインＬに結合するペプチドが選択され、単離さ
れる。プロテインＡ又はプロテインＬに対して高い親和性を有するペプチドが単離される
と、単離されたペプチドのｃＤＮＡが、ピューロマイシン及びペプチドと結合したｍＲＮ
Ａのインビトロ逆転写を介して作製され得る。次に、そうして作製された単離ペプチドの
ｃＤＮＡは、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー又はＶＬサブライブラリーの選択された組
換え核酸を作製するためのランダム配列カセットとして挿入され得る。或いは、サブライ
ブラリーの組換え核酸が、組換え核酸のためのインビトロ転写工程（ＤＮＡフォーマット
における）が必要とされなくてもよいように、任意選択によりピューロマイシン分子と予
め結合されたｍＲＮＡの形態で存在し得ることもまた企図される。
サブライブラリーからのｓｃＦｖライブラリーの構築
本発明者らはさらに、サブライブラリーのうちの少なくとも２つの組換え核酸（メンバ
ー）を組み換えて、組換えｓｃＦｖ核酸を形成できることを企図する。好ましい実施形態
では、少なくとも２つの組換え核酸（メンバー）の各々は、異なるサブライブラリーから
選択される。例えば、１つの組換え核酸は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数
のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーの各々から選択され得る
。他の例に関して、１つの組換え核酸は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数の
ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーのうちの２つの各々から選
択され得る。好ましくは、サブライブラリーから選択される組換え核酸のうちの少なくと
も１つ、より好ましくはそのうちの全ては、上記のとおりの親和性結合スクリーニングに
より予め選択される。
本発明者らはさらに、サブライブラリーのうちの少なくとも２つの組換え核酸（メンバ
ー）を組み換えて、組換えｓｃＦｖ核酸を形成できることを企図する。好ましい実施形態
では、少なくとも２つの組換え核酸（メンバー）の各々は、異なるサブライブラリーから
選択される。例えば、１つの組換え核酸は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数
のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーの各々から選択され得る
。他の例に関して、１つの組換え核酸は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数の
ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーのうちの２つの各々から選
択され得る。好ましくは、サブライブラリーから選択される組換え核酸のうちの少なくと
も１つ、より好ましくはそのうちの全ては、上記のとおりの親和性結合スクリーニングに
より予め選択される。
最も典型的には、組換えｓｃＦｖ核酸は、サブライブラリーに由来する組換え核酸の一
部を組み換えることによって構築され得る。この実施形態では、組換え核酸の一部は、組
換え核酸に挿入されたランダム配列カセットを含む。したがって、例えば、第１の工程と
して、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの組換え核酸の一部は、
（ランダム配列カセットは下線が引かれる）、好ましくは、
より好ましくは、
であってもよい。同様に、例えば、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの組換え核酸の一部
は、
（ランダム配列カセットは下線が引かれる）、好ましくは、
より好ましくは、
であってもよい。次に、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー及びＶＨ－ＣＤＲ３サブラ
イブラリーに由来する組換え核酸の一部が単離され（例えば、ＰＣＲによって）、組み換
えられて（例えば、制限－ライゲーション法を介して融合される、組換えＰＣＲを介して
作製されるなど）、ＶＨドメイン組換え核酸が形成され得る。したがって、通常、ＶＨド
メイン組換え核酸は、
（ランダム配列カセットは下線が引かれる）の構造であろう。任意選択により、ＶＨドメ
イン組換え核酸はまた、上記のとおりその３’末端においてタンパク質タグ（例えば、Ｆ
ＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグなど）をコードする核酸配列を含み得る。加えて、こ
のように作製されたＶＨドメイン組換え核酸は、ＶＨドメインライブラリーメンバーとし
てＶＨドメインライブラリー中に配置され得る。
部を組み換えることによって構築され得る。この実施形態では、組換え核酸の一部は、組
換え核酸に挿入されたランダム配列カセットを含む。したがって、例えば、第１の工程と
して、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの組換え核酸の一部は、
は、
イブラリーに由来する組換え核酸の一部が単離され（例えば、ＰＣＲによって）、組み換
えられて（例えば、制限－ライゲーション法を介して融合される、組換えＰＣＲを介して
作製されるなど）、ＶＨドメイン組換え核酸が形成され得る。したがって、通常、ＶＨド
メイン組換え核酸は、
イン組換え核酸はまた、上記のとおりその３’末端においてタンパク質タグ（例えば、Ｆ
ＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグなど）をコードする核酸配列を含み得る。加えて、こ
のように作製されたＶＨドメイン組換え核酸は、ＶＨドメインライブラリーメンバーとし
てＶＨドメインライブラリー中に配置され得る。
そのように形成されたＶＨドメイン組換え核酸はさらに、ＶＬサブライブラリーの組換
え核酸と組み換えられて、組換えｓｃＦｖ核酸が形成され得る。図５は、サブライブラリ
ーからの配列を組み換える１つの例示的な方法を示す。示されるとおり、また典型的には
、ＶＨドメイン組換え核酸の一部及びＶＬサブライブラリーの組換え核酸の一部が、組換
えｓｃＦｖ核酸に融合される。例えば、ＶＬサブライブラリーの組換え核酸が、ＶＨドメ
イン組換え核酸の一部の３’末端に融合され得るように、ＶＨドメイン組換え核酸の一部
は、
（好ましくは、その３’末端においてタンパク質タグをコードする任意の核酸を伴わない
）を含んでもよく、且つＶＬサブライブラリーの組換え核酸の一部は、
（プロモーター及び５’－ＵＴＲを伴わない）を含んでもよい。したがって、典型的な組
換えｓｃＦｖ核酸は、
の構造であろう。ＶＨドメイン組換え核酸の一部及びＶＬサブライブラリーの組換え核酸
の一部は、単一のポリペプチドをコードするように同じ読み枠に置かれることが非常に好
ましい。
え核酸と組み換えられて、組換えｓｃＦｖ核酸が形成され得る。図５は、サブライブラリ
ーからの配列を組み換える１つの例示的な方法を示す。示されるとおり、また典型的には
、ＶＨドメイン組換え核酸の一部及びＶＬサブライブラリーの組換え核酸の一部が、組換
えｓｃＦｖ核酸に融合される。例えば、ＶＬサブライブラリーの組換え核酸が、ＶＨドメ
イン組換え核酸の一部の３’末端に融合され得るように、ＶＨドメイン組換え核酸の一部
は、
）を含んでもよく、且つＶＬサブライブラリーの組換え核酸の一部は、
換えｓｃＦｖ核酸は、
の一部は、単一のポリペプチドをコードするように同じ読み枠に置かれることが非常に好
ましい。
好ましくは、ＶＨドメイン組換え核酸の一部及びＶＬサブライブラリーの組換え核酸の
一部は、２つの部分の間のリンカー（短いペプチドスペーサー断片）をコードする核酸を
介して融合される。リンカー又はスペーサーのためのペプチド配列の任意の好適な長さ及
び順序が使用され得る。しかしながら、リンカーペプチドの長さは、３～３０個のアミノ
酸、好ましくは５～２０個のアミノ酸、より好ましくは５～１５個のアミノ酸であること
が好ましい。例えば、本発明者らは、グリシンリッチ配列（例えば、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｓ
ｅｒ－ｇｌｙ－ｇｌｙなど）が、ＶＨとＶＬドメイン間でｓｃＦｖの可動性をもたらすよ
うに利用されることを企図する。
一部は、２つの部分の間のリンカー（短いペプチドスペーサー断片）をコードする核酸を
介して融合される。リンカー又はスペーサーのためのペプチド配列の任意の好適な長さ及
び順序が使用され得る。しかしながら、リンカーペプチドの長さは、３～３０個のアミノ
酸、好ましくは５～２０個のアミノ酸、より好ましくは５～１５個のアミノ酸であること
が好ましい。例えば、本発明者らは、グリシンリッチ配列（例えば、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｓ
ｅｒ－ｇｌｙ－ｇｌｙなど）が、ＶＨとＶＬドメイン間でｓｃＦｖの可動性をもたらすよ
うに利用されることを企図する。
任意選択により、組換えｓｃＦｖ核酸はまた、上記のとおりその３’末端においてタン
パク質タグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグなど）をコードする核酸配列
を含み得る。加えて、このように作製された組換えｓｃＦｖ核酸は、発現ライブラリーメ
ンバーとして発現ライブラリー中において配置され得る。
パク質タグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグなど）をコードする核酸配列
を含み得る。加えて、このように作製された組換えｓｃＦｖ核酸は、発現ライブラリーメ
ンバーとして発現ライブラリー中において配置され得る。
いくつかの実施形態では、そのように形成された組換えｓｃＦｖ核酸はさらに、１つ以
上の目的のリガンド（例えば、癌抗原、ネオエピトープなど）に対するそれらの結合親和
性、安定性、ｐＨ感受性、及び／又は種間交差反応性に基づいて、スクリーニング及び／
又は分類される。例えば、組換えｓｃＦｖ核酸によってコードされるｓｃＦｖペプチドの
安定性は、経時的にペプチドのサイズを測定するサイズ排除クロマトグラフィーによって
分析され得る。他の例に関して、組換えｓｃＦｖ核酸によってコードされるｓｃＦｖペプ
チドのｐＨ感受性及び結合親和性は、異なる緩衝液条件（ｐＨ、温度など）においてｓｃ
Ｆｖペプチドを１つ以上のリガンドと接触させることによって分析され得る。
上の目的のリガンド（例えば、癌抗原、ネオエピトープなど）に対するそれらの結合親和
性、安定性、ｐＨ感受性、及び／又は種間交差反応性に基づいて、スクリーニング及び／
又は分類される。例えば、組換えｓｃＦｖ核酸によってコードされるｓｃＦｖペプチドの
安定性は、経時的にペプチドのサイズを測定するサイズ排除クロマトグラフィーによって
分析され得る。他の例に関して、組換えｓｃＦｖ核酸によってコードされるｓｃＦｖペプ
チドのｐＨ感受性及び結合親和性は、異なる緩衝液条件（ｐＨ、温度など）においてｓｃ
Ｆｖペプチドを１つ以上のリガンドと接触させることによって分析され得る。
発現ライブラリーに由来する所望の組換えｓｃＦｖ核酸のそれらの分析及びさらなる単
離に関して、本発明者らは、組換えｓｃＦｖ核酸が、ｍＲＮＡの形態で存在する場合があ
り、任意選択により、ｍＲＮＡの３’末端でピューロマイシン分子と予め結合されること
を企図する。次に、ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡから転写されるペプチドがピューロ
マイシンを介してｍＲＮＡと結合されるように、ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡはイン
ビトロで転写され得る。次に、ペプチドは、１つ以上のリガンドと、任意選択により異な
る緩衝液条件（ｐＨ、温度など）において接触される。好ましくは、ｐＨ５．０～８．０
、好ましくはｐＨ６．０～８．０、より好ましくはｐＨ６．５～８．０で１０－６Ｍ以下
、好ましくは１０－７Ｍ以下のＫＤを有する親和性を有してリガンドに結合するペプチド
が、選択され、且つ単離される。リガンドに対して高い親和性を有するペプチドが単離さ
れると、単離されたペプチドのｃＤＮＡが、ピューロマイシン及びペプチドと結合したｍ
ＲＮＡのインビトロ逆転写を介して作製され得る。
離に関して、本発明者らは、組換えｓｃＦｖ核酸が、ｍＲＮＡの形態で存在する場合があ
り、任意選択により、ｍＲＮＡの３’末端でピューロマイシン分子と予め結合されること
を企図する。次に、ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡから転写されるペプチドがピューロ
マイシンを介してｍＲＮＡと結合されるように、ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡはイン
ビトロで転写され得る。次に、ペプチドは、１つ以上のリガンドと、任意選択により異な
る緩衝液条件（ｐＨ、温度など）において接触される。好ましくは、ｐＨ５．０～８．０
、好ましくはｐＨ６．０～８．０、より好ましくはｐＨ６．５～８．０で１０－６Ｍ以下
、好ましくは１０－７Ｍ以下のＫＤを有する親和性を有してリガンドに結合するペプチド
が、選択され、且つ単離される。リガンドに対して高い親和性を有するペプチドが単離さ
れると、単離されたペプチドのｃＤＮＡが、ピューロマイシン及びペプチドと結合したｍ
ＲＮＡのインビトロ逆転写を介して作製され得る。
さらに、組換えｓｃＦｖ核酸によってコードされる単離ペプチドのそのように作製され
たｃＤＮＡを、免疫グロブリンの部分に移植し、置き換えて、組換え免疫グロブリン又は
その断片を形成できる。例えば、そのように作製されたｃＤＮＡは、免疫グロブリンの重
鎖及び軽鎖の可変領域が単離ペプチドによって形成されるｓｃＦｖと置き換えられ得るよ
うに、免疫グロブリン重鎖定常領域の骨格と融合され得る。或いは、本発明者らはまた、
組換えｓｃＦｖ核酸のＶＨ部分（又はＶＨドメイン組換え核酸に由来する）及びＶＬ部分
（又は組換えｓｃＦｖ核酸に由来する）を、免疫グロブリンの部分に移植し、置き換えて
、組換え免疫グロブリン又はその断片を形成できることを企図する。例えば、組換えｓｃ
Ｆｖ核酸のＶＨ部分（又はＶＨドメイン組換え核酸に由来する）及びＶＬ部分（又は組換
えｓｃＦｖ核酸に由来する）を、それぞれ免疫グロブリン重鎖定常領域又は軽鎖定常領域
の骨格と融合させて、所望のリガンドに特異的な可変領域を有する免疫グロブリンを形成
する。
たｃＤＮＡを、免疫グロブリンの部分に移植し、置き換えて、組換え免疫グロブリン又は
その断片を形成できる。例えば、そのように作製されたｃＤＮＡは、免疫グロブリンの重
鎖及び軽鎖の可変領域が単離ペプチドによって形成されるｓｃＦｖと置き換えられ得るよ
うに、免疫グロブリン重鎖定常領域の骨格と融合され得る。或いは、本発明者らはまた、
組換えｓｃＦｖ核酸のＶＨ部分（又はＶＨドメイン組換え核酸に由来する）及びＶＬ部分
（又は組換えｓｃＦｖ核酸に由来する）を、免疫グロブリンの部分に移植し、置き換えて
、組換え免疫グロブリン又はその断片を形成できることを企図する。例えば、組換えｓｃ
Ｆｖ核酸のＶＨ部分（又はＶＨドメイン組換え核酸に由来する）及びＶＬ部分（又は組換
えｓｃＦｖ核酸に由来する）を、それぞれ免疫グロブリン重鎖定常領域又は軽鎖定常領域
の骨格と融合させて、所望のリガンドに特異的な可変領域を有する免疫グロブリンを形成
する。
これらの例において、免疫グロブリンは、異なる型の免疫グロブリンを構成する重鎖又
は定常ドメインの任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇ
Ｙ）及び任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及
びＩｇＡ２）を含み得ることが企図される。加えて、「抗体」は、ヒト抗体、ヒト化抗体
、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含んでもよいが、これらに限
定されない。この文脈において、企図された系及び方法により、単離されたＶＨ及びＶＬ
ドメインを所望の種（例えば、ヒト）の抗体の残部に移植することによって種特異的抗体
の作製が可能になることが留意されるべきである。別の例において、そのように作製され
たｃＤＮＡを、免疫グロブリンの他の部分をコードする核酸と融合させて、免疫グロブリ
ンの断片を形成できる。この例において、免疫グロブリンの断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ
’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、及びＦｖであり得ること
が企図される。本発明者らはさらに、そのように作製されたｃＤＮＡの一部を、免疫グロ
ブリンの他の部分をコードする核酸と融合させて、ＶＨセグメント及び／又はＶＬセグメ
ントのいずれかを含む任意の断片を形成できることを企図する。
は定常ドメインの任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇ
Ｙ）及び任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及
びＩｇＡ２）を含み得ることが企図される。加えて、「抗体」は、ヒト抗体、ヒト化抗体
、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含んでもよいが、これらに限
定されない。この文脈において、企図された系及び方法により、単離されたＶＨ及びＶＬ
ドメインを所望の種（例えば、ヒト）の抗体の残部に移植することによって種特異的抗体
の作製が可能になることが留意されるべきである。別の例において、そのように作製され
たｃＤＮＡを、免疫グロブリンの他の部分をコードする核酸と融合させて、免疫グロブリ
ンの断片を形成できる。この例において、免疫グロブリンの断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ
’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、及びＦｖであり得ること
が企図される。本発明者らはさらに、そのように作製されたｃＤＮＡの一部を、免疫グロ
ブリンの他の部分をコードする核酸と融合させて、ＶＨセグメント及び／又はＶＬセグメ
ントのいずれかを含む任意の断片を形成できることを企図する。
さらに、本発明者らは、ｓｃＦｖ部分が、様々なタンパク質及び非タンパク質分子のた
めの標的化実体として使用され得ることを企図する。例えば、ｓｃＦｖ部分を、（典型的
にはキメラタンパク質として）ＡＬＴ－８０３型分子に結合させて、特異的な標的化性能
を有するＴｘＭ実体を形成してもよい（例えば、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ｎ
ｏｖ １１；２９１（４６）：２３８６９－２３８８１を参照のこと）。別の例において
、ｓｃＦｖ部分を担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合して、薬物が担体に結合
される場合に腫瘍微小環境における特定の位置に１つ以上の薬物の標的特異的な送達を可
能にし得る。
めの標的化実体として使用され得ることを企図する。例えば、ｓｃＦｖ部分を、（典型的
にはキメラタンパク質として）ＡＬＴ－８０３型分子に結合させて、特異的な標的化性能
を有するＴｘＭ実体を形成してもよい（例えば、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ｎ
ｏｖ １１；２９１（４６）：２３８６９－２３８８１を参照のこと）。別の例において
、ｓｃＦｖ部分を担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合して、薬物が担体に結合
される場合に腫瘍微小環境における特定の位置に１つ以上の薬物の標的特異的な送達を可
能にし得る。
本発明者らはさらに、ランダム配列の標的化された多様化を介してサブライブラリーを
構築すること、及び／又はサブライブラリーのメンバーを予め選択することによって、発
現ライブラリーが、不安定配列、非結合配列、又は誤って折り畳まれた配列を除去するこ
とにより、多様性の犠牲を最小限に抑えながら、約１０１２の複雑さを達成できることを
企図する。したがって、発現ライブラリーを作製するための上記のアプローチは、配列の
複雑さに意味のある大きさを提供しつつ、少量でバインダー／抗体をスクリーニングする
のに実用的である。加えて、発現ライブラリーを作製するための上記のアプローチは、バ
インダー／抗体のスクリーニング手順を単純化した。従来、結合ドメイン（又はモチーフ
）をコードする任意の核酸配列（例えば、ランダム化された配列）のインビトロバリデー
ションは、核酸配列をＦａｂドメインに変換することを必要とし、その後、結合親和性を
、目的のリガンドとのプルダウンアッセイを介して試験することができた。本明細書に提
示される方法は、核酸配列をＦａｂドメインに変換することなく、親和性（例えば、Ｋｄ
値）、ｐＨ感受性、及び種間交差反応性（例えば、表面プラズモン共鳴アッセイなどを介
して）による順位付けを介して、結合ドメイン（又はモチーフ）をコードする核酸配列の
インビトロバリデーションを可能にする。さらに、安定性及び感受性に基づく各ライブラ
リーからのメンバーの事前選択は、所望のバインダー／ｓｃＦｖ／抗体ドメインがより迅
速且つ効率的に同定され得るように、ライブラリーにおいて試験されることになるプール
を減少させる。したがって、本発明者らはまた、インビトロ翻訳後のライブラリーメンバ
ーが固相結合抗原に対してスクリーニングされるｍＲＮＡディスプレイ技術を用いて、高
多様性プールから高親和性バインダー（例えば、ナノ及びピコモルＫｄを有する）を単離
するための方法を企図する。バインダーが同定されると、それらは、以下にさらに記載さ
れるとおり、親和性及びＫｏｎ／Ｋｏｆｆ特性に関して表面プラズモン共鳴分光法によっ
てさらに特徴付けられ得る。別の観点から見ると、企図された系及び方法は、インビボ免
疫系から完全に独立したプロセスにおいて、バインダーの迅速な検出及びｓｃＦｖ又は抗
体の作製を可能にする。
構築すること、及び／又はサブライブラリーのメンバーを予め選択することによって、発
現ライブラリーが、不安定配列、非結合配列、又は誤って折り畳まれた配列を除去するこ
とにより、多様性の犠牲を最小限に抑えながら、約１０１２の複雑さを達成できることを
企図する。したがって、発現ライブラリーを作製するための上記のアプローチは、配列の
複雑さに意味のある大きさを提供しつつ、少量でバインダー／抗体をスクリーニングする
のに実用的である。加えて、発現ライブラリーを作製するための上記のアプローチは、バ
インダー／抗体のスクリーニング手順を単純化した。従来、結合ドメイン（又はモチーフ
）をコードする任意の核酸配列（例えば、ランダム化された配列）のインビトロバリデー
ションは、核酸配列をＦａｂドメインに変換することを必要とし、その後、結合親和性を
、目的のリガンドとのプルダウンアッセイを介して試験することができた。本明細書に提
示される方法は、核酸配列をＦａｂドメインに変換することなく、親和性（例えば、Ｋｄ
値）、ｐＨ感受性、及び種間交差反応性（例えば、表面プラズモン共鳴アッセイなどを介
して）による順位付けを介して、結合ドメイン（又はモチーフ）をコードする核酸配列の
インビトロバリデーションを可能にする。さらに、安定性及び感受性に基づく各ライブラ
リーからのメンバーの事前選択は、所望のバインダー／ｓｃＦｖ／抗体ドメインがより迅
速且つ効率的に同定され得るように、ライブラリーにおいて試験されることになるプール
を減少させる。したがって、本発明者らはまた、インビトロ翻訳後のライブラリーメンバ
ーが固相結合抗原に対してスクリーニングされるｍＲＮＡディスプレイ技術を用いて、高
多様性プールから高親和性バインダー（例えば、ナノ及びピコモルＫｄを有する）を単離
するための方法を企図する。バインダーが同定されると、それらは、以下にさらに記載さ
れるとおり、親和性及びＫｏｎ／Ｋｏｆｆ特性に関して表面プラズモン共鳴分光法によっ
てさらに特徴付けられ得る。別の観点から見ると、企図された系及び方法は、インビボ免
疫系から完全に独立したプロセスにおいて、バインダーの迅速な検出及びｓｃＦｖ又は抗
体の作製を可能にする。
実施例
効率を維持しながら多様性を最大化するために、標的化される多様化領域（複数可）を
同定するための任意の好適な多様化スキームが企図され得るが、本発明者らは、ＶＨ３／
Ｖｋ１が、免疫グロブリンの様々なドメインの中でランダム化のための良好な候補領域の
１つであり得、ＶＨ３が、最も安定で可溶性のＶＨドメインであると考えられ、且つ軽鎖
のＶｋ１が、安定で可溶性であることを見出した。したがって、ＶＨ３／Ｖｋ１ランダム
化対が、より効率的に完全なサイズの免疫グロブリンに変換することが企図される。した
がって、本発明者らは、ＶＨ３及びＶｋ１フレームワークを使用する事前選択戦略を開発
した。図１は、ＶＨ３／Ｖｋ１の対を使用する１つの例示的ランダム化戦略を示す。１個
の抗原に特異的な少なくとも１４個の免疫グロブリン分子のタンパク質配列が比較され、
分析される。１４個の免疫グロブリン分子の中で最も安定で保存された配列がフレームワ
ークとして使用され、可変配列の位置を分析して、ランダム化された配列及びランダム化
の程度（例えば、完全にランダム、部分的にランダムなど）として使用する。
効率を維持しながら多様性を最大化するために、標的化される多様化領域（複数可）を
同定するための任意の好適な多様化スキームが企図され得るが、本発明者らは、ＶＨ３／
Ｖｋ１が、免疫グロブリンの様々なドメインの中でランダム化のための良好な候補領域の
１つであり得、ＶＨ３が、最も安定で可溶性のＶＨドメインであると考えられ、且つ軽鎖
のＶｋ１が、安定で可溶性であることを見出した。したがって、ＶＨ３／Ｖｋ１ランダム
化対が、より効率的に完全なサイズの免疫グロブリンに変換することが企図される。した
がって、本発明者らは、ＶＨ３及びＶｋ１フレームワークを使用する事前選択戦略を開発
した。図１は、ＶＨ３／Ｖｋ１の対を使用する１つの例示的ランダム化戦略を示す。１個
の抗原に特異的な少なくとも１４個の免疫グロブリン分子のタンパク質配列が比較され、
分析される。１４個の免疫グロブリン分子の中で最も安定で保存された配列がフレームワ
ークとして使用され、可変配列の位置を分析して、ランダム化された配列及びランダム化
の程度（例えば、完全にランダム、部分的にランダムなど）として使用する。
このランダム化戦略に基づいて、本発明者らはさらに、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤ
Ｒ２－ｎ、ＣＤＲ２－ｃ（図２を参照のこと）及びＶＨドメインのＣＤＲ３（図３を参照
のこと）について、標的化された多様化配列（ランダム化された配列、ランダムオリゴ）
を作製した。ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２－ｎ、ＣＤＲ２－ｃ、ＣＤＲ３、及びＶ
ＬドメインのＣＤＲ３のランダムオリゴを用いて組換えｓｃＦｖ核酸を作製する工程は上
に記載され、図４の模式図においても示される。高多様性ライブラリーは、図５において
例示的に示されるとおりに構築され、上でより詳細に論じられた。
Ｒ２－ｎ、ＣＤＲ２－ｃ（図２を参照のこと）及びＶＨドメインのＣＤＲ３（図３を参照
のこと）について、標的化された多様化配列（ランダム化された配列、ランダムオリゴ）
を作製した。ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２－ｎ、ＣＤＲ２－ｃ、ＣＤＲ３、及びＶ
ＬドメインのＣＤＲ３のランダムオリゴを用いて組換えｓｃＦｖ核酸を作製する工程は上
に記載され、図４の模式図においても示される。高多様性ライブラリーは、図５において
例示的に示されるとおりに構築され、上でより詳細に論じられた。
図１～５において記載されるとおりの組換えｓｃＦｖ核酸を作製する標的化された多様
化スキーム及び方法を使用して、本発明者らは、高多様性ライブラリーを作製し、それか
ら組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１（α－Ｂ７－Ｈ４、クローンナンバー８０１）バインダー
を単離した。組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１の安定性は、抗体の分解又は変形を評価するた
めの１５分間の分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより決定された。図６において示
されるとおり、α－Ｂ７－Ｈ４８０１の溶出物は、著しく小さいピークを伴わない単一の
ピークを示し、これは上記の方法によって作製されたα－Ｂ７－Ｈ４８０１バインダーが
、高い安定性を有するｓｃＦｖ又は抗体を生成できたことを示している。
化スキーム及び方法を使用して、本発明者らは、高多様性ライブラリーを作製し、それか
ら組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１（α－Ｂ７－Ｈ４、クローンナンバー８０１）バインダー
を単離した。組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１の安定性は、抗体の分解又は変形を評価するた
めの１５分間の分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより決定された。図６において示
されるとおり、α－Ｂ７－Ｈ４８０１の溶出物は、著しく小さいピークを伴わない単一の
ピークを示し、これは上記の方法によって作製されたα－Ｂ７－Ｈ４８０１バインダーが
、高い安定性を有するｓｃＦｖ又は抗体を生成できたことを示している。
本発明者らは、組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１が、他の市販のα－Ｂ７－Ｈ４抗体（リツ
キサン（登録商標）、ＬＥＡＦ（登録商標））と実質的に同様な抗体成分を含むことを見
出した。組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１と２つの市販のα－Ｂ７－Ｈ４抗体（リツキサン（
登録商標）、ＬＥＡＦ（登録商標））の断片が、キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナト
リウム（ＣＥ－ＳＤＳ）を介して分析された。図７において示されるとおり、組換えα－
Ｂ７－Ｈ４８０１抗体と２つの市販のα－Ｂ７－Ｈ４抗体（リツキサン（登録商標）、Ｌ
ＥＡＦ（登録商標））断片のＣＥ－ＳＤＳ分離は、２つの著明なピークを示し、各々が軽
鎖（中央のピーク）及びグリコシル化された重鎖（右のピーク）に相当する。左のピーク
は、ＣＥ－ＳＤＳ分析のための１０Ｋｄの標準的なマーカーの位置を示す。
キサン（登録商標）、ＬＥＡＦ（登録商標））と実質的に同様な抗体成分を含むことを見
出した。組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１と２つの市販のα－Ｂ７－Ｈ４抗体（リツキサン（
登録商標）、ＬＥＡＦ（登録商標））の断片が、キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナト
リウム（ＣＥ－ＳＤＳ）を介して分析された。図７において示されるとおり、組換えα－
Ｂ７－Ｈ４８０１抗体と２つの市販のα－Ｂ７－Ｈ４抗体（リツキサン（登録商標）、Ｌ
ＥＡＦ（登録商標））断片のＣＥ－ＳＤＳ分離は、２つの著明なピークを示し、各々が軽
鎖（中央のピーク）及びグリコシル化された重鎖（右のピーク）に相当する。左のピーク
は、ＣＥ－ＳＤＳ分析のための１０Ｋｄの標準的なマーカーの位置を示す。
本発明者らはさらに、様々な組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体が、標的リガンドに対する異な
る結合特性（例えば、親和性、特異性など）を示し得ることを見出した。図８は、平均蛍
光強度（ＭＦＩ）によって測定される、Ｂ７－Ｈ４発現２９３Ｔ細胞との結合について試
験される２つの組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体であるα－Ｂ７－Ｈ４８０１及びα－Ｂ７－Ｈ
４８１７を示す。結果は、α－Ｂ７－Ｈ４８０１抗体が、α－Ｂ７－Ｈ４８１７抗体と比
較してＢ７－Ｈ４発現２９３Ｔ細胞に対してより高い結合親和性を有することを示し、こ
れは、別々にランダム化されたＣＤＲドメインが、リガンドに対して異なる結合親和性を
もたらし得ることを示している。一番右端のパネルは、非特異的ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ
１）による対照実験を示す。
る結合特性（例えば、親和性、特異性など）を示し得ることを見出した。図８は、平均蛍
光強度（ＭＦＩ）によって測定される、Ｂ７－Ｈ４発現２９３Ｔ細胞との結合について試
験される２つの組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体であるα－Ｂ７－Ｈ４８０１及びα－Ｂ７－Ｈ
４８１７を示す。結果は、α－Ｂ７－Ｈ４８０１抗体が、α－Ｂ７－Ｈ４８１７抗体と比
較してＢ７－Ｈ４発現２９３Ｔ細胞に対してより高い結合親和性を有することを示し、こ
れは、別々にランダム化されたＣＤＲドメインが、リガンドに対して異なる結合親和性を
もたらし得ることを示している。一番右端のパネルは、非特異的ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ
１）による対照実験を示す。
組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体はさらに、フローサイトメトリーを使用して、抗原提示細胞
（ＡＰＣ）上で発現されるリガンド（Ｂ７－Ｈ４）に対する特異的且つ効率的な結合を決
定するために試験された。図９において示されるとおり、組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体は、
Ｂ７－Ｈ４リガンドに特異的に結合でき（非特異的アイソタイプ結合からピークアウトを
分離している）、これは、組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体が十分に機能的であることを示して
いる。
（ＡＰＣ）上で発現されるリガンド（Ｂ７－Ｈ４）に対する特異的且つ効率的な結合を決
定するために試験された。図９において示されるとおり、組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体は、
Ｂ７－Ｈ４リガンドに特異的に結合でき（非特異的アイソタイプ結合からピークアウトを
分離している）、これは、組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体が十分に機能的であることを示して
いる。
本発明者らはまた、Ｂ７－Ｈ４（ｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１）対するｓｃＦｖペプチ
ドとｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１とともに同じｓｃＦｖペプチドによって作製された組換
えα－Ｂ７－Ｈ４抗体（ＩｇＧ α－Ｂ７－Ｈ４８０１）が、表面プラズモン共鳴アッセ
イを使用して機能的に互換性があることを見出した。このアッセイにおいて、Ｆｌａｇタ
グ付きｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１は、表面結合ニュートラアビジンと結合されるα－Ｆ
ｌａｇビオチン化抗体を介して表面に固定化される。次に、表面に固定化されたｓｃＦｖ
Ｂ７－Ｈ４８０１ペプチドは、Ｂ７－Ｈ４を含む分析物と接触される。同様のアッセイ
がα－Ｂ７－Ｈ４抗体により実施された。図１０及び表３において示されるとおり、ｓｃ
Ｆｖ Ｂ７－Ｈ４８０１及びＩｇＧ α－Ｂ７－Ｈ４８０１は、Ｂ７－Ｈ４に対して実質
的に同様の親和性及び結合特性を示し、それらが、機能的に互換性があることを示してい
る。さらに、インビトロ翻訳ペプチド（ｓｃＦｖ）の結合親和性は、ペプチドを抗体骨格
に移植することなく直接的に測定され得るため、発現ライブラリー中のより多くの組換え
ｓｃＦｖ核酸が効率的にスクリーニングされ得る。
ドとｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１とともに同じｓｃＦｖペプチドによって作製された組換
えα－Ｂ７－Ｈ４抗体（ＩｇＧ α－Ｂ７－Ｈ４８０１）が、表面プラズモン共鳴アッセ
イを使用して機能的に互換性があることを見出した。このアッセイにおいて、Ｆｌａｇタ
グ付きｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１は、表面結合ニュートラアビジンと結合されるα－Ｆ
ｌａｇビオチン化抗体を介して表面に固定化される。次に、表面に固定化されたｓｃＦｖ
Ｂ７－Ｈ４８０１ペプチドは、Ｂ７－Ｈ４を含む分析物と接触される。同様のアッセイ
がα－Ｂ７－Ｈ４抗体により実施された。図１０及び表３において示されるとおり、ｓｃ
Ｆｖ Ｂ７－Ｈ４８０１及びＩｇＧ α－Ｂ７－Ｈ４８０１は、Ｂ７－Ｈ４に対して実質
的に同様の親和性及び結合特性を示し、それらが、機能的に互換性があることを示してい
る。さらに、インビトロ翻訳ペプチド（ｓｃＦｖ）の結合親和性は、ペプチドを抗体骨格
に移植することなく直接的に測定され得るため、発現ライブラリー中のより多くの組換え
ｓｃＦｖ核酸が効率的にスクリーニングされ得る。
ＶＨのＣＤＲ１～３及びＶＬのＣＤＲ３において様々なランダム配列カセットを有する
Ｂ７－Ｈ４に対する複数のｓｃＦｖペプチドの間で、本発明者らは、特定のドメイン（特
定のランダム配列カセット）における類似性が、ｓｃＦｖペプチドにリガンドに対する同
様の結合特性を有するようにし得るかどうかを試験した。５つのｓｃＦｖペプチド（８０
１、８０２、９０５、９０６、及び８１７）は、Ｂ７－Ｈ４に対するそれらの結合親和性
について試験された。表４において示されるとおり、それらの中で４つのｓｃＦｖペプチ
ド（クローン８０１、８０２、９０５、９０６）は、同様のＣＤＲ３配列を有する。ＶＨ
のＣＤＲ３において同様のランダム配列カセットを有するそれらの４つのｓｃＦｖペプチ
ドは、２５℃と３７℃の両方においてＢ７－Ｈ４に対する同様の結合親和性を示し（表５
において示されるとおり）、これは、少なくともＢ７－Ｈ４に対するｓｃＦｖペプチド中
において、ＶＨのＣＤＲ３における配列が、リガンドに対する結合に重要であり得ること
を示している。
Ｂ７－Ｈ４に対する複数のｓｃＦｖペプチドの間で、本発明者らは、特定のドメイン（特
定のランダム配列カセット）における類似性が、ｓｃＦｖペプチドにリガンドに対する同
様の結合特性を有するようにし得るかどうかを試験した。５つのｓｃＦｖペプチド（８０
１、８０２、９０５、９０６、及び８１７）は、Ｂ７－Ｈ４に対するそれらの結合親和性
について試験された。表４において示されるとおり、それらの中で４つのｓｃＦｖペプチ
ド（クローン８０１、８０２、９０５、９０６）は、同様のＣＤＲ３配列を有する。ＶＨ
のＣＤＲ３において同様のランダム配列カセットを有するそれらの４つのｓｃＦｖペプチ
ドは、２５℃と３７℃の両方においてＢ７－Ｈ４に対する同様の結合親和性を示し（表５
において示されるとおり）、これは、少なくともＢ７－Ｈ４に対するｓｃＦｖペプチド中
において、ＶＨのＣＤＲ３における配列が、リガンドに対する結合に重要であり得ること
を示している。
本発明者らはまた、サブライブラリー及び発現ライブラリーを用いてインターロイキン
－８（ＩＬ－８）（ｓｃＦｖ ＩＬ－８）に結合する複数のｓｃＦｖペプチドを作製し、
様々な条件（温度及びｐＨ）においてＩＬ－８に対する親和性を試験した。例示的なｓｃ
Ｆｖ ＩＬ－８ペプチド及び様々な条件において測定されたそれらの結合親和性は、表６
において示される。表６において示されるクローンの中で、クローン４９－７、４９－１
及び４９－１２が同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有し、クローン４９－１９、４９－３７
、及び４９－２５が同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有する。加えて、クローン４９－３及
び４３－２は、同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有する。Ｂ７－Ｈ４に対するｓｃＦｖペプ
チドとは対照的に、本発明者らは、ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドの結合親和性が、ＶＨの
ＣＤＲ３におけるランダム配列における類似性に決定的に依存的ではない場合があること
を見出した。例えば、クローン４９－１８、４９－３７、及び４９－２５が、同様のＶＨ
ＣＤＲ３配列を含有する一方で、それらの配列の結合親和性（ＫＤＸ１０－９Ｍにおい
て測定される単位）は、０．８９４Ｘ１０－９Ｍと２５Ｘ１０－９Ｍの間で変動する。
－８（ＩＬ－８）（ｓｃＦｖ ＩＬ－８）に結合する複数のｓｃＦｖペプチドを作製し、
様々な条件（温度及びｐＨ）においてＩＬ－８に対する親和性を試験した。例示的なｓｃ
Ｆｖ ＩＬ－８ペプチド及び様々な条件において測定されたそれらの結合親和性は、表６
において示される。表６において示されるクローンの中で、クローン４９－７、４９－１
及び４９－１２が同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有し、クローン４９－１９、４９－３７
、及び４９－２５が同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有する。加えて、クローン４９－３及
び４３－２は、同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有する。Ｂ７－Ｈ４に対するｓｃＦｖペプ
チドとは対照的に、本発明者らは、ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドの結合親和性が、ＶＨの
ＣＤＲ３におけるランダム配列における類似性に決定的に依存的ではない場合があること
を見出した。例えば、クローン４９－１８、４９－３７、及び４９－２５が、同様のＶＨ
ＣＤＲ３配列を含有する一方で、それらの配列の結合親和性（ＫＤＸ１０－９Ｍにおい
て測定される単位）は、０．８９４Ｘ１０－９Ｍと２５Ｘ１０－９Ｍの間で変動する。
本発明者らはさらに、好中球サイズを測定することにより、ｓｃＦｖ ＩＬ－８が、Ｉ
Ｌ－８を効率的に捕捉することによってＩＬ－８の作用を中和できるかどうかを試験した
。一般に、好中球は、ＩＬ－８によって刺激されると拡大される（例えば、より大きな直
径を有するなど）（図１１に示されるとおり）。本発明者らは、好中球拡大に対するその
ようなＩＬ－８作用を、組換えα－ＩＬ－８抗体（ｍＡｂ αＩＬ－８２０１、図１２に
おいて示されるとおり、上段左のグラフ）又はいくつかのｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチド（
αＩＬ－８＃２、αＩＬ－８４９－３、αＩＬ－８４９－１０、図１２において示される
とおり、下段のグラフ）の添加によって大幅に消失できたことを見出したが、これは、ｓ
ｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドが、培地中の遊離ＩＬ－８に結合することによってＩＬ－８の
作用を効率的に中和できたことを示している。
Ｌ－８を効率的に捕捉することによってＩＬ－８の作用を中和できるかどうかを試験した
。一般に、好中球は、ＩＬ－８によって刺激されると拡大される（例えば、より大きな直
径を有するなど）（図１１に示されるとおり）。本発明者らは、好中球拡大に対するその
ようなＩＬ－８作用を、組換えα－ＩＬ－８抗体（ｍＡｂ αＩＬ－８２０１、図１２に
おいて示されるとおり、上段左のグラフ）又はいくつかのｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチド（
αＩＬ－８＃２、αＩＬ－８４９－３、αＩＬ－８４９－１０、図１２において示される
とおり、下段のグラフ）の添加によって大幅に消失できたことを見出したが、これは、ｓ
ｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドが、培地中の遊離ＩＬ－８に結合することによってＩＬ－８の
作用を効率的に中和できたことを示している。
ＩＬ－８は、好中球をＩＬ－８放出の部位（例えば、感染の部位）に向かって遊走させ
る好中球走化性因子である。ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドの機能的作用を評価するために
、好中球を、多孔性膜を有する挿入物の底に置き、ＩＬ－８によって誘引された好中球が
多孔性膜を介して挿入物から培地に向かって遊出できるように、様々な濃度のＩＬ－８を
含む媒体中に置いた。図１３において示されるとおり、培地中のＩＬ－８濃度を増大させ
ることによって、遊走した好中球の数が増加した。興味深いことに、そのようなＩＬ－８
作用は、ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチド（αＩＬ－８４３－２）又はｓｃＦｖ ＩＬ－８ペ
プチドに由来する組換えＩＬ－８抗体（ｍＡｂ αＩＬ－８２０１）の添加により、ほぼ
完全に消失した。
る好中球走化性因子である。ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドの機能的作用を評価するために
、好中球を、多孔性膜を有する挿入物の底に置き、ＩＬ－８によって誘引された好中球が
多孔性膜を介して挿入物から培地に向かって遊出できるように、様々な濃度のＩＬ－８を
含む媒体中に置いた。図１３において示されるとおり、培地中のＩＬ－８濃度を増大させ
ることによって、遊走した好中球の数が増加した。興味深いことに、そのようなＩＬ－８
作用は、ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチド（αＩＬ－８４３－２）又はｓｃＦｖ ＩＬ－８ペ
プチドに由来する組換えＩＬ－８抗体（ｍＡｂ αＩＬ－８２０１）の添加により、ほぼ
完全に消失した。
図１４は、本明細書に提示されるｍＲＮＡディスプレイライブラリーを使用して単離さ
れた様々なｓｃＦｖに関するさらなる実験データを示す。より具体的には、各データポイ
ントは下部に示される標的に対するｓｃＦｖを表し、各ｓｃＦｖに対する親和性値を決定
した。見てのとおり、（同じ）ライブラリーにより、様々な異なる標的に対して複数の高
親和性のバインダーが得られ、全てのバインダーはマイクロＭ以下で、及び多くはナノＭ
以下の親和性範囲を有した。さらに、本発明者らはまた、ヒトＩｇＧ上にＣＤＲを移植し
た際に、ｓｃＦｖの親和性が維持され得るかどうかについても検討している。図１５は、
ヒトＩｇＧ１足場に移植された選択されたｓｃＦｖについての２９個のＣＤＲ移植実験の
例示的な結果を示す。図１５の結果から分かるとおり、ヒト化ＩｇＧ１抗体は高い特異性
と親和性を保持した（通常、１桁以内）。
れた様々なｓｃＦｖに関するさらなる実験データを示す。より具体的には、各データポイ
ントは下部に示される標的に対するｓｃＦｖを表し、各ｓｃＦｖに対する親和性値を決定
した。見てのとおり、（同じ）ライブラリーにより、様々な異なる標的に対して複数の高
親和性のバインダーが得られ、全てのバインダーはマイクロＭ以下で、及び多くはナノＭ
以下の親和性範囲を有した。さらに、本発明者らはまた、ヒトＩｇＧ上にＣＤＲを移植し
た際に、ｓｃＦｖの親和性が維持され得るかどうかについても検討している。図１５は、
ヒトＩｇＧ１足場に移植された選択されたｓｃＦｖについての２９個のＣＤＲ移植実験の
例示的な結果を示す。図１５の結果から分かるとおり、ヒト化ＩｇＧ１抗体は高い特異性
と親和性を保持した（通常、１桁以内）。
本明細書の発明的概念から逸脱することなく、既に記載されたもの以外にも多くの変形
形態が可能であることは、当業者には明らかなはずである。したがって、本発明の主題は
、添付の特許請求の範囲以外に制限されるものではない。さらに、本明細書及び特許請求
の範囲の両方を解釈する際には、全ての用語は、文脈に沿った可能な限り広範な方法で解
釈されるべきである。特に、用語「含む」及び「含むこと」は、非排他的な様式で要素、
構成要素、又は工程を参照していると解釈されるべきであり、参照される要素、構成要素
、又は工程が存在し得るか、利用され得るか、又は明示的に参照されない他の要素、構成
要素、又は工程と組み合わされ得ることを示している。本明細書及び後続の特許請求の範
囲全体で使用されるとおり、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らか
にそうでないことを指示しない限り、複数の参照を含む。また、本明細書において使用さ
れるとおり、「ｉｎ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、「ｉ
ｎ」及び「ｏｎ」を含む。本明細書の請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ、．．．．及びＮからなる群
から選択されるもののうちの少なくとも１つを指す場合、本文は、Ａ＋Ｎ、又はＢ＋Ｎな
どではなく、群から１つの要素のみを必要とするものと解釈されるべきである。
形態が可能であることは、当業者には明らかなはずである。したがって、本発明の主題は
、添付の特許請求の範囲以外に制限されるものではない。さらに、本明細書及び特許請求
の範囲の両方を解釈する際には、全ての用語は、文脈に沿った可能な限り広範な方法で解
釈されるべきである。特に、用語「含む」及び「含むこと」は、非排他的な様式で要素、
構成要素、又は工程を参照していると解釈されるべきであり、参照される要素、構成要素
、又は工程が存在し得るか、利用され得るか、又は明示的に参照されない他の要素、構成
要素、又は工程と組み合わされ得ることを示している。本明細書及び後続の特許請求の範
囲全体で使用されるとおり、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らか
にそうでないことを指示しない限り、複数の参照を含む。また、本明細書において使用さ
れるとおり、「ｉｎ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、「ｉ
ｎ」及び「ｏｎ」を含む。本明細書の請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ、．．．．及びＮからなる群
から選択されるもののうちの少なくとも１つを指す場合、本文は、Ａ＋Ｎ、又はＢ＋Ｎな
どではなく、群から１つの要素のみを必要とするものと解釈されるべきである。
Claims (81)
- 複数の抗体又は抗体断片をコードする高多様性核酸ライブラリーを作製する方法であっ
て、
（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラ
リー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを作製又は提供する工程であって、前記サブライ
ブラリー（１）～（３）の各々が複数のメンバーを含み；
前記サブライブラリーの各メンバーが、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのラ
ンダムカセットを含む工程；及び
前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー
、及び前記ＶＬサブライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部を組み換
えて、発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバーを形成する工程であって、前記発
現ライブラリーが、複数の発現ライブラリーメンバーを含み、各発現ライブラリーメンバ
ーが、別個の抗体又は抗体断片をコードする工程を含む、方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の一部
及びＶＨ ＣＤＲ２の一部のうちの少なくとも１つに相当するランダムカセットを含む、
請求項１に記載の方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の少な
くとも一部及びＶＨ ＣＤＲ２の一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項
１に記載の方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ２の少な
くとも一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項３に記載の方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくと
も一部に相当するランダムカセットを含む、請求項１に記載の方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのメンバーの少なくとも２つのランダムカセット
が、異なる長さを有するペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。 - 前記ペプチドが、１０～２０個のアミノ酸の範囲の長さを有する、請求項６に記載の方
法。 - 前記ＶＬサブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＬ ＣＤＲ３の一部でランダムカセ
ットを含む、請求項１に記載の方法。 - 前記サブライブラリーの複数のメンバーが、共通の配列を有する、請求項１に記載の方
法。 - 前記発現ライブラリーメンバーの各々が、複数の前記ランダムカセットを含む、請求項
１に記載の方法。 - 組み換える工程が、前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのメンバーの少なくとも
一部及び前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つを単離し、合わせて融合して
、ＶＨドメインライブラリーにおけるＶＨドメインライブラリーメンバーを形成する工程
を含み、前記ＶＨドメインライブラリーが、複数のＶＨドメインライブラリーメンバーを
含む、請求項１に記載の方法。 - 前記ＶＬサブライブラリーのメンバーの少なくとも一部を単離し、前記ＶＬサブライブ
ラリーのメンバーの一部を前記ＶＨドメインライブラリーメンバーの１つと融合して、前
記発現ライブラリーメンバーを形成する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。 - 前記ＶＬサブライブラリーのメンバーの一部が、リンカーをコードする配列を介して結
合される、請求項１２に記載の方法。 - 前記リンカーが、グリシンリッチペプチドである、請求項１３に記載の方法。
- 組み換える工程が、前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのメンバーの少なくとも
一部及び前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つを単離し、合わせて融合して
、発現ライブラリーメンバーの第１の群を形成する工程を含む、請求項１に記載の方法。 - 発現ライブラリーメンバーの第２の群であって、前記第２の群が、前記ＶＬサブライブ
ラリーのメンバーの少なくとも一部を含む前記第２の群をさらに含む、請求項１５に記載
の方法。 - 前記別個の抗体又は抗体断片が、ｓｃＦｖを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記発現ライブラリーメンバーをサブクローニングして、前記ｓｃＦｖを有するＩｇＧ
１を構築する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。 - 前記第１の群及び第２の群の各々からそれぞれ１つのメンバーをサブクローニングして
、組換えＶＨ及びＶＬドメインを有するＩｇＧ１を形成する工程をさらに含む、請求項１
６に記載の方法。 - 以下：リガンドに対する親和性、ｐＨ感受性、及び種間交差反応性のうちの少なくとも
１つに基づいて前記発現ライブラリーメンバーのサブセットを選択する工程をさらに含む
、請求項１に記載の方法。 - ５０ｎＭ未満のＫｄで前記リガンドに結合するｓｃＦｖをコードする前記発現ライブラ
リーメンバーのサブセットを選択する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。 - 前記ランダムカセットが、配列番号１～配列番号２５から選択されるオリゴヌクレオチ
ドを使用して作製される、請求項１に記載の方法。 - 前記発現ライブラリーメンバーをｍＲＮＡ断片に転写する工程；及び
前記ｍＲＮＡ断片の３’末端でピューロマイシン分子を結合する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - （１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブ
ラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを含む複数の核酸ライブラリーを有する組成物
であって；
前記サブライブラリー（１）～（３）の各々が、複数のメンバーを含み；且つ
前記サブライブラリーの各メンバーが、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのラ
ンダムカセットを含む、組成物。 - フレキシブルペプチドリンカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２４に記載
の組成物。 - 前記サブライブラリー（１）～（３）の少なくとも１つが、フレキシブルペプチドリン
カーをコードする核酸配列を含む、請求項２４に記載の組成物。 - 第１の前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーが、第２の前記複数のＶＨ－ＣＤＲ
３サブライブラリーとは異なる長さを有する、請求項２４に記載の組成物。 - 前記複数の縮重塩基位置が、少なくとも２つの縮重塩基位置である、請求項２４に記載
の組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の一部
及びＶＨ ＣＤＲ２の一部のうちの少なくとも１つに相当するランダムカセットを含む、
請求項２４に記載の組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の少な
くとも一部及びＶＨ ＣＤＲ２の一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項
２４に記載の組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ２の少な
くとも一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項２４に記載の組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくと
も一部に相当するランダムカセットを含む、請求項２４に記載の組成物。 - 前記ＶＬサブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＬ ＣＤＲ３の一部でランダムカセ
ットを含む、請求項２４に記載の組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのメンバーの少なくとも２つのランダムカセット
が、異なる長さを有するペプチドをコードする、請求項２４に記載の組成物。 - 前記ペプチドが、１０～２０個のアミノ酸の範囲の長さを有する、請求項３４に記載の
組成物。 - 前記サブライブラリーの複数のメンバーが、コンセンサス配列を含む、請求項２４に記
載の組成物。 - 前記ランダムカセットが、配列番号１～配列番号２５から選択されるオリゴヌクレオチ
ドを使用して作製される、請求項２４に記載の組成物。 - 複数のＶＨドメインライブラリーメンバーを有するＶＨドメインをさらに含み、前記Ｖ
Ｈドメインライブラリーメンバーの各々が、前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの
メンバーの少なくとも一部及び前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つのメンバーの
少なくとも一部を含む、請求項２４に記載の組成物。 - 高多様性核酸ライブラリーを作製するための請求項２４～３８に記載の組成物の使用。
- 各ライブラリーメンバーが、
それぞれ複数の縮重塩基位置を有する複数のランダムカセットを含む組換え核酸を含み；
前記複数のランダムカセットが、以下：（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（
２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーからの２
つのライブラリーのいずれかから少なくとも２つのメンバーに由来し；且つ
前記サブライブラリーの各々が、複数のメンバーを含む、複数のライブラリーメンバーを
有する高多様性核酸ライブラリー組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の一部
及びＶＨ ＣＤＲ２の一部のうちの少なくとも１つに相当するランダムカセットを含む、
請求項４０に記載の組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ２の少な
くとも一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項４０に記載の組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ２の少な
くとも一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項４０に記載の組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくと
も一部に相当するランダムカセットを含む、請求項４０に記載の組成物。 - 前記ＶＬサブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＬ ＣＤＲ３の一部でランダムカセ
ットを含む、請求項４０に記載の組成物。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのメンバーの少なくとも２つのランダムカセット
が、異なる長さを有するペプチドをコードする、請求項４０に記載の組成物。 - 前記ペプチドが、１０～２０個のアミノ酸の範囲の長さを有する、請求項４６に記載の
組成物。 - 前記サブライブラリーの複数のメンバーが、コンセンサス配列を含む、請求項４０に記
載の組成物。 - 前記ランダムカセットが、配列番号１～配列番号２５から選択されるオリゴヌクレオチ
ドを使用して作製される、請求項４０に記載の組成物。 - 前記複数のライブラリーメンバーが、前記複数のランダムカセットの２つの間にリンカ
ーを含む、請求項４０に記載の組成物。 - 各ライブラリーメンバーが、別個の抗体又は抗体断片をコードする、請求項４０に記載
の組成物。 - 前記複数のライブラリーメンバーが、以下：リガンドに対する親和性、ｐＨ感受性、及
び種間交差反応性のうちの少なくとも１つに基づいて分類される、請求項４０に記載の組
成物。 - 前記ライブラリーメンバーのサブセットが、５０ｎＭ未満のＫｄで前記リガンドに結合
するｓｃＦｖをコードする、請求項４０に記載の組成物。 - 前記ライブラリーメンバーが、ｍＲＮＡ断片であり、各々が３’末端でピューロマイシ
ンと結合される、請求項４０に記載の組成物。 - 癌ネオエピトープに対する治療用組換え抗体を作製するための請求項４０～５３に記載
の組成物の使用。 - （１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブ
ラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを作製又は提供する工程であって、前記サブラ
イブラリー（１）～（３）の各々が複数のメンバーを含み；
前記サブライブラリーの各メンバーが、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのラ
ンダムカセットを含む工程；
前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー
、及び前記ＶＬサブライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部を組換え
て、発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバーを形成する工程であって、前記発現
ライブラリーが、複数の発現ライブラリーメンバーを含み、各発現ライブラリーメンバー
が、別個の抗体又は抗体断片をコードする工程；及び
前記発現ライブラリーメンバーを用いて前記組換え抗体又はその断片の作製する工程
を含む、組換え抗体を作製する方法。 - 前記組換え抗体又はその断片が、前記発現ライブラリーメンバーを抗体ベクターにサブ
クローニングすることによって作製される、請求項５６に記載の方法。 - 前記抗体又はその断片が、
（ａ）完全免疫グロブリン分子；
（ｂ）ｓｃＦｖ；
（ｃ）モノクローナル抗体；
（ｄ）ヒト抗体；
（ｅ）ヒト化抗体；
（ｆ）キメラ抗体；
（ｇ）Ｆａｂ断片；
（ｈ）Ｆａｂ’断片；
（ｉ）Ｆ（ａｂ’）２；
（ｊ）Ｆｖ；及び
（ｋ）ジスルフィド結合Ｆｖ
からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。 - 前記抗体ベクターが、
（ｂ）ヒトＩｇＧ１定常ドメイン；
（ｃ）ヒトＩｇＧ２定常ドメイン；
（ｄ）ヒトＩｇＧ３定常ドメイン；
（ｅ）ヒトＩｇＧ４定常ドメイン；及び
（ｆ）ヒトＩｇＡ定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項５７に記載の
方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の一部
及びＶＨ ＣＤＲ２の一部のうちの少なくとも１つに相当するランダムカセットを含む、
請求項５６に記載の方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の少な
くとも一部及びＶＨ ＣＤＲ２の一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項
５６に記載の方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ２の少な
くとも一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項５６に記載の方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくと
も一部に相当するランダムカセットを含む、請求項５６に記載の方法。 - 前記ＶＬサブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＬ ＣＤＲ３の一部でランダムカセ
ットを含む、請求項５６に記載の方法。 - 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのメンバーの少なくとも２つのランダムカセット
が、異なる長さを有するペプチドをコードする、請求項５６に記載の方法。 - 前記ペプチドが、１０～２０個のアミノ酸の範囲の長さを有する、請求項５６に記載の
方法。 - 前記サブライブラリーの複数のメンバーが、コンセンサス配列を含む、請求項５６に記
載の方法。 - 前記発現ライブラリーメンバーの各々が、複数の前記ランダムカセットを含む、請求項
５６に記載の方法。 - 組み換える工程が、前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのメンバーの少なくとも
一部及び前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つを単離し、合わせて融合して
、ＶＨドメインライブラリーにおけるＶＨドメインライブラリーメンバーを形成する工程
を含み、前記ＶＨドメインライブラリーが、複数のＶＨドメインライブラリーメンバーを
含む、請求項５６に記載の方法。 - 前記ＶＬサブライブラリーのメンバーの少なくとも一部を単離し、前記ＶＬサブライブ
ラリーのメンバーの一部を前記ＶＨドメインライブラリーの１つと融合して、前記発現ラ
イブラリーメンバーを形成する工程をさらに含む、請求項５６に記載の方法。 - 前記ＶＬサブライブラリーのメンバーの一部が、リンカーと結合される、請求項７０に
記載の方法。 - 前記リンカーが、グリシンリッチペプチドである、請求項７１に記載の方法。
- 組み換える工程が、前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのメンバーの少なくとも
一部及び前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つを単離し、合わせて融合して
、発現ライブラリーメンバーの第１の群を形成する工程を含む、請求項５６に記載の方法
。 - 発現ライブラリーメンバーの第２の群であって、前記第２の群が、前記ＶＬサブライブ
ラリーのメンバーの少なくとも一部を含む前記第２の群をさらに含む、請求項７３に記載
の方法。 - 前記第１の群及び第２の群の各々からそれぞれ１つのメンバーをサブクローニングして
、組換えＶＨ及びＶＬドメインを有するＩｇＧ１を形成する工程をさらに含む、請求項７
４に記載の方法。 - 以下：リガンドに対する親和性、ｐＨ感受性、及び種間交差反応性のうちの少なくとも
１つに基づいて前記発現ライブラリーメンバーのサブセットを選択する工程をさらに含む
、請求項５６に記載の方法。 - ５０ｎＭ未満のＫｄで前記リガンドに結合するｓｃＦｖをコードする前記発現ライブラ
リーメンバーのサブセットを選択する工程をさらに含む、請求項７６に記載の方法。 - 前記ランダムカセットが、配列番号１～配列番号２５から選択されるオリゴヌクレオチ
ドを使用して作製される、請求項５６に記載の方法。 - 抗原に対して１００ｎＭ以下の親和性を有する高親和性バインダーを単離する方法であ
って、
請求項１～２３又は請求項５６～７８に記載の方法によって構築された組成物に前記抗原
を接触させる工程を含む、方法。 - 配列番号１～配列番号２５から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して作製される組
換え核酸断片。 - 配列番号１～配列番号２５から選択される核酸配列を有する合成核酸混合物。
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