JP6931765B2 - インフルエンザウィルス核内蛋白質に結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、インフルエンザウィルスの核内タンパク質に結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法に関する。

特許文献１は、インフルエンザウィルスに結合する抗体を開示している。特許文献１に開示された抗体の少なくとも一部は、アルパカに由来する。特許文献１は、本明細書に参照として援用される。

米国特許出願公開第２０１４／０３０２０６３号明細書

本発明の目的は、インフルエンザウィルスの核内タンパク質に結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供することである。

本発明は、アミノ酸配列からなる抗体であって、前記アミノ酸配列は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインからなり：
Ｎ − ＦＲ１ − ＣＤＲ１ − ＦＲ２ − ＣＤＲ２ − ＦＲ３ − ＣＤＲ３ − ＦＲ４ − Ｃ
ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
前記ＣＤＲ１はＧＲＴＦＩＮＬＤＭＧ（配列番号：０１）により表されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲ２は、ＡＩＴＲＮＧＡＩＴＳＹＡＤＳＡＫＧ（配列番号：０２）により表されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲ３は、ＹＳＩＳＮＹＧＳＧＷＹＫＰＤＹ（配列番号：０３）により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
前記抗体は、Ａ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質に結合可能である。

本発明は、インフルエンザウィルスの核内タンパク質に結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供する。

図１Ａは、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる様々な遺伝子をライゲーションするために用いられたベクターのマップを示す。 図１Ｂは、図１Ａに示されるベクターマップの詳細を示す。 図２は、ＶＨＨ抗体を発現するために用いられたベクターマップを示す。 図３Ａは、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（濃度：０．１９５ｎＭ）のリコンビナント核内タンパク質への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｂは、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（濃度：０．３９ｎＭ）のリコンビナント核内タンパク質への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｃは、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（濃度：０．７８ｎＭ）のリコンビナント核内タンパク質への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｄは、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（濃度：１．５６ｎＭ）のリコンビナント核内タンパク質への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｅは、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（濃度：３．１２５ｎＭ）のリコンビナント核内タンパク質への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｆは、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（濃度：６．２５ｎＭ）のリコンビナント核内タンパク質への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｇは、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（濃度：１２．５ｎＭ）のリコンビナント核内タンパク質への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｈは、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（濃度：２５ｎＭ）のリコンビナント核内タンパク質への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図４Ａは、インフルエンザウィルスＡ型Ｈ１Ｎ１ １１６７５に対する配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図４Ｂは、インフルエンザウィルスＡ型Ｈ１Ｎ１ ４０２０５に対する配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図４Ｃは、インフルエンザウィルスＡ型Ｈ２Ｎ２に対する配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図４Ｄは、インフルエンザウィルスＡ型Ｈ３Ｎ２に対する配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図４Ｅは、インフルエンザウィルスＡ型Ｈ７Ｎ９に対する配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図４Ｆは、インフルエンザウィルスＢ型に対する配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。

本発明による抗体は、Ａ型インフルエンザウィルスに結合する。特に、本発明による抗体は、Ａ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質に結合する。特許文献１にも開示されているように、インフルエンザウィルスに結合する抗体は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインを含むアミノ酸配列からなる。

Ｎ − ＦＲ１ − ＣＤＲ１ − ＦＲ２ − ＣＤＲ２ − ＦＲ３ − ＣＤＲ３ − ＦＲ４ − Ｃ
ここで、ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示す。

本発明においては、ＣＤＲ１はＧＲＴＦＩＮＬＤＭＧ（配列番号：０１）により表されるアミノ酸配列からなる。

本発明においては、ＣＤＲ２は、ＡＩＴＲＮＧＡＩＴＳＹＡＤＳＡＫＧ（配列番号：０２）により表されるアミノ酸配列からなる。

本発明においては、ＣＤＲ３は、ＹＳＩＳＮＹＧＳＧＷＹＫＰＤＹ（配列番号：０３）により表されるアミノ酸配列からなる。

望ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：０１、配列番号：０２、および、配列番号：０３により表される。この場合、より望ましくは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４は、それぞれ、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：０４）、ＷＦＲＱＰＰＧＫＥＲＥＹＶＡ（配列番号：０５）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＥＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＡ（配列番号：０６）、およびＷＧＱＧＡＱＶＴＶＳＳ（配列番号：０７）により表されるアミノ酸配列からなる。

言い換えれば、本発明による抗体は、以下のアミノ酸配列からなることがより望ましい。
EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFINLDMGWFRQPPGKEREYVAAITRNGAITSYADSAKGRFTISRDNAKNTVSLEMNSLKPEDTGVYYCAAYSISNYGSGWYKPDYWGQGAQVTVSS（配列番号：０８）
配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなる抗体は、Ｂ型インフルエンザウィルスのような、Ａ型インフルエンザウィルス以外のインフルエンザウィルスに対して抗原交差反応性を示さない。

本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質を検出するための検出装置または検出方法において用いられる。この場合、本発明の抗体は、固相担体及び標識物質の少なくとも一方に結合した複合体の状態で用いられる。

固相担体は、抗原抗体反応の反応系における溶媒に不溶な担体であれば、その形状及び材質は特に制限されない。固相担体の形状としては、例えば、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター、薄膜などが挙げられる。固相担体の材質としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、金、銀、アルミニウム等の金属、ガラスなどが挙げられる。抗体を固相担体へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。

標識物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、放射性物質などが使用される。抗体を標識物質へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。

本発明の抗体を用いた検出方法では、当該抗体を含む複合体と被分析物とが接触させられ、被分析物中のＡ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質と、複合体中の抗体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化が検出される。当該物理量としては、例えば、発光強度、色度、光透過度、濁度、吸光度、放射線量などが挙げられる。検出方法の具体例としては、酵素免疫測定法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、表面プラズモン共鳴測定法などの公知の方法が挙げられる。

本発明の抗体を用いた検出装置は、抗原抗体反応に基づき変化する上記物理量のいずれかを検出するための検出部を含む。検出部は、各種光度計、分光器、線量計など公知の装置で構成される。

（実施例）
（実施例１）
Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスA型に含まれる核内タンパク質に結合するＶＨＨ抗体（すなわち、重鎖抗体の重鎖の可変領域）が、以下の手順に従って調製された。以下、核内タンパク質は「ＮＰ」と呼ばれる。

（アルパカへの免疫および単核球の取得）
ＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリを作製するため、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスA型(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai)由来のリコンビナント核内タンパク質（配列番号：２４）を抗原として用いてアルパカが免疫された。リコンビナント核内タンパク質は、ヒゲタ醤油株式会社においてブレビバチルス発現システムを用いて作製された。リコンビナント核内タンパク質は、アジュバントを用いてアルパカに投与される前に調整された。

実施例１において用いられたリコンビナント核内タンパク質（配列番号：２４）の配列は以下の通りである。
MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIWRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN（配列番号：２４）
具体的には、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するリコンビナント核内タンパク質が、アルパカへ投与された。１週間後、再度、同じ濃度を有するリコンビナント核内タンパク質が、アルパカへ投与された。このようにして、５週間かけて５回、アルパカはリコンビナント核内タンパク質を用いて免役された。さらに１週間後、アルパカの血液を採取した。次いで、以下のように血液から単核球が取得された。

リンパ球分離チューブ（株式会社グライナージャパンより購入、商品名：Leucosep）に、血球分離溶液（コスモ・バイオ株式会社より購入、商品名：Lymphoprep）が添加された。次いで、溶液は、摂氏20度の温度で1000×gで1分間遠心された。

アルパカから採取された血液は、ヘパリンによって処理された。次に、このように処理された血液に等量のリン酸緩衝生理食塩水（以下、「PBS」という）が添加され、サンプル液を得た。次いで、サンプル液は血球分離溶液が添加されたリンパ球分離チューブに添加された。

リンパ球分離チューブは、摂氏20度の温度で800×gで 30分遠心された。

単核球を含有する画分が回収され、３倍の容量を有するPBSが添加された。画分は、摂氏20度の温度で 300×gで 5分遠心された。沈殿物が、PBSを用いて穏やかに懸濁された。懸濁後、細胞数の測定のために10マイクロリットルの懸濁液が分離された。残りの懸濁液が、摂氏20度の温度で 300×gで 5分間遠心された。

沈殿物に２ミリリットルの容積を有するＲＮＡ保存溶液（商品名：RNAlater）が添加された。次いで、溶液は穏やかに懸濁された。懸濁液が、２本の1.5mLチューブに注入された。各チューブは、１ミリリットルの懸濁液を含んでいた。チューブは、摂氏−２０度の温度下で保存された。細胞数の測定のために分離された懸濁液（５マイクロリットル）が、チュルク液（１５マイクロリットル）と混合され、血球計算盤を用いて単核球の数が数えられた。

（ＶＨＨ抗体のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリの作製）
次に、単核球からTOTAL RNAを抽出し、そしてVHH抗体のcDNA遺伝子ライブラリが以下の手順で作製された。以下の手順では、RNase free gradeの試薬および器具が使用された。

単核球分画に、トータルＲＮＡ抽出試薬（商品名：TRIzol Reagent、１ミリリットル）を加えた。試薬は緩やかに混和され、そして室温にて5分間放置された。クロロホルム（200マイクロリットル）が試薬に加えられ、そして15秒間、試薬は力強く振られた。試薬は、室温で２〜３分間静置された。試薬は、摂氏４度で15分間、12,000xg以下で遠心された。

上清が新しいチューブに移された。RNaseフリー水およびクロロホルム（各２００マイクロリットル）がチューブに加えられた。さらに500ミリリットルのイソプロパノールがチューブに加えられた。チューブに含まれる液体はボルテックスミキサーを用いて撹拌された。液体は室温で10分間静置された。次いで、液体は摂氏４度の温度で15分間、12,000xg以下で遠心された。上清が捨てられ、沈殿物が１ミリリットルの75% エタノールでリンスされた。この溶液は、摂氏４度の温度で５分間、7,500xg以下で遠心された。溶液は乾燥され、全RNAを得た。得られた全RNAは、RNaseフリー水に溶解された。

Total RNAからcDNAを取得するため，逆転写酵素を含むキット（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：PrimeScript II 1^st strand cDNA Synthesis Kit）が用いられた。キットに含まれるRandom 6 merおよびOligo dT primerがプライマーとして用いられた。キットの標準プロトコルに従って、cDNAが取得された。

アルパカに含まれるＶＨＨ抗体の遺伝子が、cDNAからＰＣＲ法によって獲得された。ＰＣＲのための酵素はタカラバイオ株式会社よりEx-taqの商品名として入手された。

以下の試薬が混合され、混合液を得た。
10x buffer 5 マイクロリットル
dNTPs 4 マイクロリットル
Primer F 2 マイクロリットル
Primer R 2 マイクロリットル
cDNA template 1 マイクロリットル
Ex-taq 0.25 マイクロリットル
混合液は以下のＰＣＲ法に供された。

まず、混合液は、摂氏９５度で２分間で加熱された。

次いで、混合液の温度は、以下のサイクルに従って変化された。

摂氏９６度で３０秒間
摂氏５２度で３０秒間、そして
摂氏６８度で４０秒間。

このサイクルが３０回繰り返された。

最後に、混合液は、摂氏６８度で４分間加熱した後、摂氏４度で保存された。

このＰＣＲ法においては、以下のプライマーが使用された。
primer 1: 5’- GGTGGTCCTGGCTGC -3’ （配列番号：０９）
primer 2: 5’- ctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggcTSAGKTGCAGCTCGTGGAGTC -3’ （配列番号：１０）
primer 3: 5’- TGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ （配列番号：１１）
primer 4: 5’- TTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ （配列番号：１２）
primer 5: 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ （配列番号：１３）
primer 6: 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgaTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ （配列番号：１４）
(参考文献：Biomed Environ Sci, 2012; 27(2):118-121)
３回のＰＣＲ法が実施された。

１回目のＰＣＲ法では、cDNA、Primer 1 およびPrimer 3からなるプライマーセットＡ、およびcDNA、Primer 1 およびPrimer 4からなるプライマーセットＢが用いられた。

２回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＡを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 3からなるプライマーセットＣ、およびプライマーセットＢを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 4からなるプライマーセットＤが用いられた。

３回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＣを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 5からなるプライマーセットＥ、およびプライマーセットＤを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 6からなるプライマーセットＦが用いられた。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリが形成された。言い換えれば、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリは、プライマーセットＥおよびプライマーセットＦを用いて増幅された遺伝子を含んでいた。

（ファージライブラリの作製）
次に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリから、以下の手順に従ってファージライブラリが作製された。

市販されているプラスミドｐＵＣ１１９（例えば、タカラバイオ株式会社より入手可能）由来のプラスミドＶｅｃｔｏｒ１（４０５７塩基対、図１Ａ参照）が、制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。図１Ａにおける制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）は、GGCCCAGCCGGCC（配列番号：１５）により表される遺伝子配列からなる。制限酵素サイトＳｆｉＩ（ｂ）は、GGCCTCTGCGGCC（配列番号：１６）により表される遺伝子配列からなる。図１Ｂは、プラスミドＶｅｃｔｏｒ１の詳細なベクターマップを示す。

プラスミドＶｅｃｔｏｒ１は、以下の遺伝子配列からなる。
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccAAGCTTCGAAGGAGACAGTCATAatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggagcTCAAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCAGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCGATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTTGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTgtaGGCCtctGCGGCCGCagaGcaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcaTAGggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttagcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtctTAATAAgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgCATATGaAAATTGTAAgcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacaGGGCGCGTcccatATGgtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcga（配列番号：１７）
同様に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリも制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が得られた。

このように処理されたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１が、ＶＨＨ抗体遺伝子断片と、１：２の割合で混合された。混合液に、酵素（東洋紡株式会社より入手、商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２）が注入された。混合液は摂氏１６度の温度下で２時間静置された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がプラスミドＶｅｃｔｏｒ１にライゲーションされた。

このようにしてライゲーションされたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１を用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＨＳＴ０２）がトランスフェクトされた。

次いで、大腸菌は、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するアンピシリンを含有する２ＹＴプレート培地上で１５時間、培養された。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる遺伝子断片から得られるタンパク質を提示するファージのライブラリが得られた。

培養後、２ＹＴプレート培地上に形成されたシングルコロニーの数をカウントすることでライブラリの濃度を算出した。その結果、ライブラリは、５ｘ１０⁷／ミリリットルの濃度を有していた。

（バイオパニング）
核内タンパク質に特異的に結合するＶＨＨ抗体が、ファージライブラリから以下の手順に従って得られた。

ＶＨＨ抗体を発現したファージの中から、抗原に結合するクローンを抽出するため、２回のバイオパンニングを実施した。

ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片が導入された大腸菌（ＨＳＴ０２）を、吸光度を示す値（OD₆₀₀）が1.0になるまで摂氏３０度にて１００mLの 2YT AG（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１%グルコースを含有した２ＹＴ培地）の培地中で培養し、大腸菌を増殖させた。

ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を感染多重度（ＭＯＩ）がおよそ２０となるよう大腸菌含有培地へ加えた。

その後、培地が３０分ほど摂氏３７度で保温された。次いで、培地を4000rpmの回転数で10分間遠心し、大腸菌を回収した。１００mLの2YTAK培地（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した２ＹＴ培地）中で、摂氏30度で、２１３ｒｐｍにて遠心しながら、大腸菌を一晩培養した。

上記のように培養された大腸菌を含有する培養液（１００ミリリットル）が、２本の遠沈管（容積：５０ミリリットル）に注入された。２つの培養液は、４０００ｒｐｍの回転数で10分間遠心された。次いで、上清（各２０ミリリットル）が回収された。

上清（４０ミリリットル）が、NaCl（２．５Ｍ）を含有する20% PEG溶液（１０ミリリットル）に添加された。次いで、混合液は、転倒混和された。その後、混合液は、およそ１時間氷上にて冷却された。混合液は、４０００ｒｐｍの回転数で10分間遠心された。次いで、上清が除去された。10%グリセロールを含有するPBSが沈殿物に向けて注入された。最後に、沈殿物は、ほぐしながら溶解された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリが得られた。

（ＮＰに特異的に結合するＶＨＨ抗体のスクリーニング）
（Ａ） ＮＰ抗原の固定化
ＮＰをＰＢＳと混合し、ＮＰ溶液を調製した。ＮＰの濃度は２マイクログラム／ミリリットルであった。ＮＰ溶液（２ミリリットル）が、イムノチューブ（ヌンク社より購入）に注入された。ＮＰ溶液はイムノチューブ内で一晩静置された。このようにして、イムノチューブの内部にＮＰが固定された。

次いで、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。

３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳをイムノチューブに満たした。このようにして、ＮＰが抗原としてイムノチューブの内部にブロッキングされた。

イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。その後、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。

（Ｂ）パニング
ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリ（濃度：およそ５Ｅ＋１１／ミリリットル）が、３％のスキムミルクを含有した３ミリリットルのＰＢＳと混合され、混合液を調製した。混合液は、ＮＰ抗原が固定化されたイムノチューブに注入された。

イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。

イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。

イムノチューブの内部は、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）で１０回、洗浄された。

イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴにより満たされた。その後、イムノチューブは、１０分間、静置された。次いで、イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴで１０回、洗浄された。

ＮＰ抗原に結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを抽出するために、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）がイムノチューブに注入された。

イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。

溶液を中和するため、溶液は、１ｍＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）を含有するチューブに移した。再度、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）を用いたファージの抽出を繰り返した。このようにして、３ｍＬの抽出液が得られた。

抽出液（１ｍＬ）が、９ｍＬの大腸菌ＨＳＴ０２と混合された。混合液は、摂氏３０度の温度で１時間、静置された。

コロニーを計数するため、大腸菌ＨＳＴ０２を含有する１０マイクロリットルの混合液は、２ＴＹＡ培地を含む小プレート（１０ミリリットル／プレート）にまかれた。

残りの混合液は遠心分離された。上澄み液は捨てられ、かつ沈殿物は２ＴＹＡ培地を含む大プレート（４０ミリリットル／プレート）にまかれた。これらの２つのプレートは、摂氏３０度の温度下にて一晩静置された。このようにして、１回目のパニングが行われた。

１回目のパニングの手順と全く同様に、２回目のパニングが行われた。言い換えれば、パニングが繰り返された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが精製された。

２回目のパニングの後、大腸菌のコロニーが爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされた１つのコロニーは、９６平底プレートの１つのウェルに置かれた。これが繰り返された。１つのウェルは、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＧ培地を含有していた。

ウェル内の溶液が、摂氏３０度で２１３ｒｐｍの回転数で撹拌された。

増殖した大腸菌を含む溶液（５０マイクロリットル）が回収された。回収された溶液は、プレートに含まれる５０マイクロリットルの２ＹＴＡ培地と混合された。２ＹＴＡ培地は、感染多重度ＭＯＩが２０になるようなヘルパーファージを含有していた。溶液は、摂氏３７度の温度で４０分間静置された。

２ＹＴＡ培地を含むプレートは、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。上清が捨てられた。沈殿物が大腸菌を含んでいた。沈殿物は、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＫ培地と混合された。混合液は、摂氏３０度にて一晩静置された。

混合液は、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。大腸菌を含む上清が回収された。

（Ｃ） ＥＬＩＳＡによるファージ提示ＶＨＨ抗体および抗原の定性評価
９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入、商品名：ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに、２マイクログラム／ミリリットルの濃度を有する核内タンパク質溶液を抗原として添加した。各ウェルにおけるＨＡタンパク質溶液の容積は、５０マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、４℃で１晩、放置された。このようにして、ＮＰ抗原が各ウェルに固定された。

各ウェルは、ＰＢＳにより３回、洗浄された。次いで、３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳが各ウェルに注入された（２００マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは、室温で１時間、放置された。このようにして、核内タンパク質が各ウェルでブロックされた。その後、各ウェルは、ＰＢＳで３回、洗浄された。

ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが、各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、ファージはＮＰ抗原と反応した。

各ウェルは、ＰＢＳＴを用いて３回、洗浄された。次に、抗Ｍ１３抗体（ａｂｃａｍ社より入手、商品名：ａｂ５０３７０、１００００倍希釈）が各ウェルに添加された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、各ウェルはＰＢＳＴで３回、洗浄された。

発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手、商品名：1-STEP ULTRA TMB-ELISA）が各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは２分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。

硫酸水溶液（１規定）が５０マイクロリットル／ウェルの濃度で各ウェルに添加され、反応を停止させた。

４５０ナノメートルの波長での溶液の吸光度が測定された。

良好な吸光度測定の結果を有する１６のウェルが選択された。選択された１６つのウェルに含有されるファージに含まれるＤＮＡ配列が、グライナー社により解析された。ＤＮＡ配列の解析結果は、以下のとおりである。以下の１つＤＮＡ配列が見いだされた。

GAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGACGTACCTTCATTAATCTTGACATGGGCTGGTTCCGCCAGCCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATACGTAGCAGCTATAACTCGAAATGGTGCTATAACATCGTATGCGGACTCCGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTCTCTGGAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGGCGTTTATTACTGTGCAGCATATTCTATATCGAACTACGGTAGTGGCTGGTATAAGCCCGACTACTGGGGCCAGGGGGCCCAGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：１８）

配列番号：１８により表されるＤＮＡ配列から合成される蛋白質は、以下のアミノ酸配列からなる。
EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFINLDMGWFRQPPGKEREYVAAITRNGAITSYADSAKGRFTISRDNAKNTVSLEMNSLKPEDTGVYYCAAYSISNYGSGWYKPDYWGQGAQVTVSS（配列番号：０８）

（抗ＮＰ ＶＨＨ抗体の発現）
ベクターｐＲＡ２（＋）が発現ベクターとして用いられた（図２参照)。ベクターｐＲＡ２（＋）は、メルク社から購入された。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より購入）を用いて、ＶＨＨ配列がベクターｐＲＡ２（＋）に付加された。以下、付加された手順が詳細に説明される。

まず、以下２つのプライマー（配列番号：１９および配列番号：２０）を用いて、ＰＣＲ法により、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１から、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が複製された。このようにして、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の１つのＤＮＡ（配列番号：２１）が得られた。

Primer 1: 5’- CAGCCGGCCATGGCTGCTGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTG-3’ （配列番号：１９）
Primer 2: 5’- ATGGTGGCGGCCGCGTGAGGAGACGGTGACCTGGGCC-3’ （配列番号：２０）

5'-CAGCCGGCCATGGCTGCTGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGACGTACCTTCATTAATCTTGACATGGGCTGGTTCCGCCAGCCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATACGTAGCAGCTATAACTCGAAATGGTGCTATAACATCGTATGCGGACTCCGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTCTCTGGAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGGCGTTTATTACTGTGCAGCATATTCTATATCGAACTACGGTAGTGGCTGGTATAAGCCCGACTACTGGGGCCAGGGGGCCCAGGTCACCGTCTCCTCACGCGGCCGCCACCAT-3’ （配列番号：２１）

一方、以下２つのプライマー（配列番号：２２および配列番号２３）を用いて、ＰＣＲ法により、ベクターｐＲＡ２に含まれる一部の塩基配列が増幅された。このようにして、ＤＮＡ（配列番号：２５）が得られた。
Primer 1: 5’- CGCGGCCGCCACCATCATCACCACCATTAATAG-3’（配列番号：２２）
Primer 2: 5’- AGCCATGGCCGGCTGGGCCGCGAGTAATAAC-3’（配列番号：２３）

CGCGGCCGCCACCATCATCACCACCATTAATAGcactagtcaagaggatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatgaattccgtgtattctatagtgtcacctaaatcgtatgtgtatgatacataaggttatgtattaattgtagccgcgttctaacgacaatatgtacaagcctaattgtgtagcatctggcttactgaagcagaccctatcatctctctcgtaaactgccgtcagagtcggtttggttggacgaaccttctgagtttctggtaacgccgtcccgcacccggaaatggtcagcgaaccaatcagcagggtcatcgctagccagatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctttatttcaaggagacagtcataATGaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggct（配列番号：２５）

以下の２つのＤＮＡ（Ｉ）および（ＩＩ）以外のＤＮＡは、制限酵素ＤｐｎＩ（東洋紡より入手）を用いて断片化された。言い換えれば、以下の２つのＤＮＡ（Ｉ）および（ＩＩ）の２つのＤＮＡはそのままであったが、他のＤＮＡは断片化された。

（Ｉ） 配列番号：２１により表されるＤＮＡ
（ＩＩ） 配列番号：２５により表されるＤＮＡ
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より購入）を用いて、配列番号：２１により表されるＤＮＡが、配列番号：２５により表されるＤＮＡと融合された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がベクターｐＲＡ２（＋）にライゲーションされた。

ライゲーション溶液（１０マイクロリットル）および大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオより入手、１００マイクロリットル）が氷上にて混合された。混合液は、３０分間、氷上にて静置された。次いで、混合液は、摂氏４２度で４５秒間加熱された。最後に、混合液は、３分間、氷上で静置された。この手順は、一般的なヒートショック法として知られている。

摂氏３７度で１時間振とう培養後、全量の混合液が、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度でアンピシリンを含有するＬＢＡ培地上に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度で一晩静置された。

ＬＢＡ培地上に形成されたコロニーの中から、３つのコロニーが選択された。選択された３つのコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）で一晩培養された。

培養された大腸菌に含まれるプラスミドは、プラスミド抽出キット（Ｓｉｇｍａより入手、商品名：Ｇｅｎｅ Ｅｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて、ＬＢＡ培地から抽出された。目的のＶＨＨ抗体の遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認するため、プラスミドの配列がグライナー社によって解析された。シーケンスの解析のために、一般的なＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒセットが用いられた。

シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたプラスミドが選択された。

選択されたプラスミドを用いて、大腸菌（Competent Cell BL21 (DE3) pLysS, ライフ テクノロロジーズ社より入手）がヒートショック法によりトランフェクトされた。

トランスフェクトされた大腸菌を含有する溶液に、ＬＢＡ培地（１ミリリットル）が添加された。次いで、大腸菌は、２１３ｒｐｍで振とうされながら、摂氏３７度で１時間、回復培養された。

次いで、大腸菌溶液が回収された。回収された大腸菌溶液（１ミリリットル）は、ＬＢＡ培地に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度の温度で一晩、静置された。

ＬＢＡ培地内に形成されたコロニーの中から、１つのコロニーが選択された。選択されたコロニーは、爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされたコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）中で、２１３ｒｐｍで振とうされながら摂氏３７度の温度で培養された。このようにして、培養液を得た。

さらに、培養液（３ミリリットル）はＬＢＡ培地（１０００ミリリットル）に混合された。６００ナノメートルの波長での混合液の吸光度が０．６になるまで、混合液は摂氏２８度の温度で１２０ｒｐｍで振とうされた。

吸光度が０．６となったのち、イソプロピルチオガラクトシド溶液が混合液に添加された。ＩＰＴＧ溶液の最終濃度は０．５ｍＭであった。混合液に含有される大腸菌は、摂氏２０度で１晩、培養された。培養された大腸菌を回収するため、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、摂氏４度で遠心された。

回収された大腸菌は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭイミダゾールを含有する混合溶媒に混合された。混合溶媒は、５０ミリリットルの容量を有していた。混合液に含有される大腸菌は、超音波を用いて破砕された。

大腸菌を含む破砕液は、４００００ｇで３０分間、摂氏４度で遠心された。上清が回収され、溶出液を得た。回収された上清は、０．４５マイクロメートルフィルタを用いて濾過された。

濾液は、Ｎｉ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（株式会社キアゲンより入手）を用いて推奨プロトコルに従って精製された。精製時には、１ミリリットルのＮｉ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅに対して３ミリリットルを有する溶出バッファが用いられた。

さらに、抗ＮＰ抗体を含有する溶出液がカラムクロマトグラフィー（ゼネラルエレクトリック社より入手、商品名：Ａｋｔａ ｐｕｒｉｆｉｅｒ）を用いて精製された。このようにして、抗ＮＰ抗体を含有する溶液が得られた。

このようにして得られた溶液に含有される抗ＮＰ抗体は、吸光度計（スクラム社より入手、商品名：ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて、２８０ナノメートルでの波長での吸収測定値に基づいて定量された。その結果、抗ＮＰ抗体の濃度は２．３２ミリグラム／ミリリットルであった。

（Ｄ−１） リコンビナントＮＰを用いた抗ＮＰ抗体の表面プラズモン共鳴評価
リコンビナントＮＰおよび表面プラズモン共鳴評価装置を用いて、抗ＮＰ抗体が以下のように評価された。表面プラズモン共鳴（以下、「ＳＰＲ」という）の詳細は以下の通りである。

ＳＰＲ評価装置：Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化バッファ：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
ランニングバッファ：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
センサチップ：ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化用試薬：N-ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）およびエチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド（ＥＤＣ）
抗Ｆｌａｇ抗体：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡより入手）
ＮＰ：バキュロウイルスを用いて作製したＦｌａｇタグ融合インフルエンザウィルスＨ１Ｎ１由来のリコンビナントヌクレオプロテイン（ＮＰ）タンパク質
抗Ｆｌａｇ抗体は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００のコントロールソフトウェアに含まれているウィザードに従って固定化された。抗Ｆｌａｇ抗体の固定化のためには、５．０のｐＨを有する酢酸溶液が用いられた。

被分析物として、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなる抗ＮＰ抗体が用いられた。１回目〜８回目の分析において、ランニングバッファに含有される抗ＮＰ抗体の濃度は、それぞれ、０．１９５ｎＭ、０．３９ｎＭ、０．７８ｎＭ、１．５６ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭに調整された。まず、リコンビナント核内タンパク質を抗Ｆｌａｇ抗体に捕捉させて、その後抗ＮＰ抗体を流し、抗ＮＰ抗体を評価した。図３Ａ〜図３Ｈは、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。その結果、解離定数Ｋｄは、０．２２４ｎＭであった。

（Ｄ−２） 他のインフルエンザウィルス亜型に対する交差反応性の評価
次に、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体のＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ９由来のリコンビナントヌクレオプロテイン（すなわち、ＮＰ）に対する結合能力を評価するため、リコンビナント核内タンパク質への結合能力がＥＬＩＳＡ測定法により評価された。

Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１由来のリコンビナントヌクレオプロテイン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社より入手、商品名：１１６７５−Ｖ０８Ｈ）を、５００マイクログラム／ミリリットルの濃度で含有する溶液が用意された。

同様に、それぞれＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ９由来のリコンビナントヌクレオプロテイン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社より入手、商品名：４０２０５−Ｖ０８Ｈ、４００３３−Ｖ０８Ｈ、４０２０８−Ｖ０８Ｈ、および４０１１１−Ｖ０８Ｈ）を、５００マイクログラム／ミリリットルの濃度で含有する４つの溶液が用意された。

さらに、Ｂ型インフルエンザウィルス由来のリコンビナントヌクレオプロテイン（ＯＲＬＡより入手）を５００マイクログラム／ミリリットルの濃度で含有する溶液が用意された。以下、これらの６つの溶液を「溶液群Ａ」という。

溶液群Ａに含まれる６つの各溶液の一部は、５％スキムミルク（和光純薬より入手）及び０．０５％ｔｗｅｅｎ２０の両者を含有するＰＢＳ（以下、この溶液を「スキムミルク含有ＰＢＳＴ」という）で５０倍に希釈された。このようにして、６つのリコンビナントＮＰの希釈液を含む希釈液群Ｂ（濃度：１０マイクログラム／ミリリットル）が得られた。

希釈液群Ｂに含まれる６つの各溶液の一部が、スキムミルク含有ＰＢＳＴで１０倍に再度希釈された。このようにして、６つのリコンビナントＮＰの希釈液を含む希釈液群Ｃ（濃度：１マイクログラム／ミリリットル）が得られた。これが繰り返され、希釈液群Ｄ（濃度：０．１マイクログラム／ミリリットル）、希釈液群Ｅ（濃度：０．０１マイクログラム／ミリリットル）、希釈液群Ｆ（濃度：１×１０^-3マイクログラム／ミリリットル）、希釈液群Ｇ（濃度：１×１０^-4マイクログラム／ミリリットル）および、希釈液群Ｈ（濃度：１×１０^-5マイクログラム／ミリリットル）が得られた。

９６ウェルプレート（Maxisorp, Nunc）のウェルに、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体を含有する溶液（濃度：５マイクログラム／ミリリットル）が注入された。各ウェルは、２００マイクロリットルの溶液を含んでいた。９６ウェルプレートは、室温で２時間静置され、ウィルスをウェル内に固定化した。

スキムミルク含有ＰＢＳＴが、各ウェルに注入され、ウィルスをブロックした。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、２５０マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、室温にて３時間、静置された。

０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳＴが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳＴは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、２００マイクロリットルであった。これが２回、繰り返された。

希釈液群Ｂ〜希釈液群Ｈに含まれるリコンビナントＮＰの各希釈液が、ウェルに注入された。参照として、スキムミルク含有ＰＢＳＴが他のウェルに注入された。このスキムミルク含有ＰＢＳＴのみを含むウェルは、測定時のバックグラウンドを除去するために参照として用いられた。各ウェルに注入された溶液の容量は１００マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、室温にて静置された。これにより、希釈液群Ｂ〜希釈液群Ｈに含まれる希釈液に含有される各リコンビナントＮＰは、ウェルに含まれる抗ＮＰＶＨＨ抗体に結合した。９６ウェルプレートは、室温にて１時間、静置された。

０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳＴが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳＴは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、２００マイクロリットルであった。これが５回繰り返された。

抗ＮＰ抗体（ａｂｃａｍ社より入手、商品名：ａｂ１１０６６１）が０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳＴで希釈され（濃度：５マイクログラム／ミリリットル）各ウェルに注入された。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、１００マイクロリットルであった。これにより、抗ＮＰ抗体は、ウェルに含まれるリコンビナントＮＰに結合した。９６ウェルプレートは、室温で１時間静置された。

０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳＴが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳＴは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、２００マイクロリットルであった。これが５回、繰り返された。

標識抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社より入手、商品名：goat anti-mouse IgG-HRP）が０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳＴで２００００倍に希釈された。このようにして希釈された標識抗体が、各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間静置された。

０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳＴが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳＴは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、２００マイクロリットルであった。これが５回、繰り返された。

発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手、商品名：1-STEP ULTRA TMB-ELISA）が各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは３０分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。

低濃度の硫酸および塩酸を含有する発色停止剤（ＳｃｙＴｅｋ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手、商品名：ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ）が５０マイクロリットル／ウェルの濃度で各ウェルに添加され、反応を停止させた。

４５０ナノメートルの波長での溶液の吸光度が測定された。図４Ａ〜図４Ｆは、それぞれ、インフルエンザウィルスＡ型Ｈ１Ｎ１ １１６７５、Ｈ１Ｎ１ ４０２０５、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、およびインフルエンザウィルスＢ型に対する配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。

図４Ａ〜図４Ｆから理解されるように、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体は、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ９由来のリコンビナント核内タンパク質に対して高い交差反応性を有する。一方、配列番号：０８により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体は、Ｂ型インフルエンザウィルスに対して低い交差反応性を有する。

本発明は、インフルエンザウィルスの核内タンパク質に結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供する。

Claims (7)

1. アミノ酸配列からなる抗体であって、前記アミノ酸配列は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインからなり、
   Ｎ − ＦＲ１ − ＣＤＲ１ − ＦＲ２ − ＣＤＲ２ − ＦＲ３ − ＣＤＲ３ − ＦＲ４ − Ｃ
   ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
   前記ＣＤＲ１はＧＲＴＦＩＮＬＤＭＧ（配列番号：０１）により表されるアミノ酸配列からなり、
   前記ＣＤＲ２は、ＡＩＴＲＮＧＡＩＴＳＹＡＤＳＡＫＧ（配列番号：０２）により表されるアミノ酸配列からなり、
   前記ＣＤＲ３は、ＹＳＩＳＮＹＧＳＧＷＹＫＰＤＹ（配列番号：０３）により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
   Ｈ１Ｎ１型、Ｈ２Ｎ２型、Ｈ３Ｎ２型、およびＨ７Ｎ９型のＡ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質のいずれにも結合可能である、抗体。
2. 請求項１に記載の抗体であって、
   前記ＦＲ１は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：０４）により表されるアミノ酸配列からなり、
   前記ＦＲ２は、ＷＦＲＱＰＰＧＫＥＲＥＹＶＡ（配列番号：０５）により表されるアミノ酸配列からなり、
   前記ＦＲ３は、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＥＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＡ（配列番号：０６）により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
   前記ＦＲ４は、ＷＧＱＧＡＱＶＴＶＳＳ（配列番号：０７）により表されるアミノ酸配列からなる、抗体。
3. 請求項１または２に記載の抗体を含み、前記抗体は、固相担体及び標識物質の少なくとも一方と結合されている、複合体。
4. 前記固相担体は、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター及び薄膜から選択される、
   請求項３に記載の複合体。
5. 前記標識物質は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素及び放射性物質から選択される、
   請求項３に記載の複合体。
6. 請求項３に記載の複合体と、検出部とを含み、
   前記検出部は、被分析物中の前記核内タンパク質と前記複合体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出する、
   検出装置。
7. 請求項３に記載の複合体と、被分析物とを接触させるステップと、
   前記被分析物中の前記核内タンパク質と前記複合体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出するステップとを含む、
   検出方法。

Images