JP2020148511A - 検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】検出対象物を高精度に検出することができる検出方法を提供する。【解決手段】検出方法は、検出対象物と、検出対象物と特異的に結合する性質を有し、標識物と結合された第１の抗体と、検出対象物と特異的に結合する性質を有し、非標識物と結合された第２の抗体と、を反応させて複合体を形成する形成ステップＳ１０と、複合体に含まれる標識物の物理量を測定して、検出対象物を検出する検出ステップＳ２０と、を含み、第１の抗体は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４により表される４つのアミノ酸配列をそれぞれ有する４つの抗体のうちの少なくとも１つであり、第２の抗体は、配列番号：１及び配列番号：２により表される２つのアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの抗体のうちの少なくとも１つである。【選択図】図８

Description

本開示は、検出対象物に特異的に結合する抗体を用いた検出対象物の検出方法に関する。

特許文献１は、インフルエンザウィルスに結合する抗体を開示している。特許文献１に開示された抗体の少なくとも一部は、アルパカに由来する。特許文献１は、本明細書に参照として援用される。

米国特許出願公開第２０１４／０３０２０６３号明細書

例えば、抗体を用いて微量の検出対象物を高精度に検出する検出方法が求められている。そこで、本開示は、検出対象物質を高精度に検出することができる検出方法を提供する。

本開示の一態様に係る検出方法は、検出対象物と、前記検出対象物と特異的に結合する性質を有し、標識物と結合された第１の抗体と、前記検出対象物と特異的に結合する性質を有し、非標識物と結合された第２の抗体と、を反応させて複合体を形成する形成ステップと、前記複合体に含まれる標識物の物理量を測定して、前記検出対象物を検出する検出ステップと、を含み、前記第１の抗体は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４により表される４つのアミノ酸配列をそれぞれ有する４つの抗体のうちの少なくとも１つであり、前記第２の抗体は、配列番号：１及び配列番号：２により表される２つのアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの抗体のうちの少なくとも１つである。

なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、装置、方法、集積回路、コンピュータプログラム、又は、コンピュータで読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの非一時的な記録媒体で実現されてもよく、システム、装置、方法、集積回路、コンピュータプログラム、及び、記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。

本開示によれば、検出対象物質を高精度に検出することができる。

図１Ａは、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる様々な遺伝子をライゲーションするために用いられたベクターのマップを示す図である。 図１Ｂは、図１Ａに示されるベクターマップの詳細を示す図である。 図２は、ＶＨＨ抗体を発現するために用いられたベクターマップを示す図である。 図３Ａは、配列番号：１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図３Ｂは、配列番号：１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図３Ｃは、配列番号：１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図４Ａは、配列番号：２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図４Ｂは、配列番号：２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図４Ｃは、配列番号：２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図５Ａは、配列番号：３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図５Ｂは、配列番号：３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図５Ｃは、配列番号：３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図６Ａは、配列番号：４により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図６Ｂは、配列番号：４により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図６Ｃは、配列番号：４により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図７Ａは、配列番号：５により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図７Ｂは、配列番号：５により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図７Ｃは、配列番号：５により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を第２の抗体として用いた場合の、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）に対する第１の抗体及び第２の抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図８は、実施の形態に係る検出方法の一例を示すフローチャートである。 図９は、実施の形態における検出ステップの処理フローの一例を示すフローチャートである。 図１０は、実施の形態における検出ステップの処理フローの他の例を示すフローチャートである。

（本開示の概要）
本開示の一態様の概要は以下の通りである。

本開示の一態様に係る検出方法は、検出対象物と、前記検出対象物と特異的に結合する性質を有し、標識物と結合された第１の抗体と、前記検出対象物と特異的に結合する性質を有し、非標識物と結合された第２の抗体と、を反応させて複合体を形成する形成ステップと、前記複合体に含まれる標識物の物理量を測定して、前記検出対象物を検出する検出ステップと、を含み、前記第１の抗体は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４により表される４つのアミノ酸配列をそれぞれ有する４つの抗体のうちの少なくとも１つであり、前記第２の抗体は、配列番号：１及び配列番号：２により表される２つのアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの抗体のうちの少なくとも１つである。

これにより、第１の抗体と第２の抗体との組み合わせに応じて、検出対象物を高精度に検出することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法では、前記検出対象物は、Ａ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質であってもよい。

これにより、本開示の一態様に係る検出方法によれば、Ａ型インフルエンザウィルスを高精度に検出することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法では、前記Ａ型インフルエンザウィルスは、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｙｏｇｏ／ＹＳ／２０１１ ｐｄｍ）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４ ｐｄｍ）、 Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）、 Ｈ７Ｎ７（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−２／２００４）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｔｏｔｔｏｒｉ／７２３／１９８０）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／２／８１）、 Ｈ２Ｎ３（Ａ／ｄｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１７／０１）、 Ｈ２Ｎ９（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２７８／７８）、 Ｈ３Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／５／７７）、 Ｈ３Ｎ８（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／４／０３）、 Ｈ４Ｎ６（Ａ／ｄｋ／Ｃｚｅｃｈ／５６）、 Ｈ５Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／１０２１８／８４）、 Ｈ５Ｎ３（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８２０／８０）、 Ｈ６Ｎ５（Ａ／ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ／Ｓ． Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／７２）、 Ｈ７Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３０１／７８）、 Ｈ７Ｎ７（Ａ／ｓｅａｌ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／１／１９８０）、 Ｈ９Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４４８／７８）、 Ｈ９Ｎ２（Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１９６６）、 Ｈ１１Ｎ６（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／１／１９５６）、及び、Ｈ１２Ｎ５（Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６）の少なくとも１種であってもよい。

これにより、本開示の一態様に係る検出方法によれば、複数種類の亜型のＡ型インフルエンザウィルスを検出することができるため、Ａ型インフルエンザウィルスを高精度に検出することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法では、前記非標識物は、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター及び薄膜のうちの１つであってもよい。

これにより、本開示の一態様に係る検出方法によれば、様々な形状の非標識物に検出対象物を担持させて検出することができる。そのため、例えば、検出対象物を固定化基板に固定させて検出する方法、又は、検出対象物を微粒子に固定させて流動的に検出する方法など、検出対象物の性質に応じて、適宜、検出方法を選択することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法では、前記標識物は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素及び放射性物質のうちの１つであってもよい。

これにより、本開示の一態様に係る検出方法によれば、標識物そのものが常に発する物理量又は標識物が例えば励起光などの外部からの刺激を受けて発する物理量を測定することができるため、多様な検出形態から適切な検出形態を選択することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法は、前記検出ステップでは、前記複合体中の前記標識物の物理量の変化を測定することにより、前記検出対象物を検出してもよい。

これにより、本開示の一態様に係る検出方法によれば、例えば、標識物への励起光の照射、基質の添加、又は、電場の印加などの外部からの刺激により標識物が発する物理量の変化を測定することができる。また、例えば、磁場を印加することにより、複合体を移動させることにより、標識物が常に発する物理量の位置移動を測定することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法では、前記非標識物は、磁性粒子であり、前記標識物は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素及び放射性物質のうちの１つであり、前記検出ステップでは、前記複合体を移動させる磁場を印加し、前記磁場により前記複合体を移動させた際の前記標識物の位置変化を測定することにより、前記検出対象物を検出してもよい。

これにより、本開示の一態様に係る検出方法によれば、複合体を構成する標識物のみを検出することができるため、検出対象物を高精度に検出することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法では、前記標識物は、蛍光物質であり、前記検出ステップでは、前記複合体に、前記標識物が蛍光を発生する波長の光を照射し、前記複合体中の前記標識物が発する蛍光であり、かつ、前記光の照射により前記非標識物が発生する局在化表面プラズモン共鳴によって増強された蛍光を測定することにより、前記検出対象物を検出してもよい。

これにより、本開示の一態様に係る検出方法によれば、微量の検出対象物を高感度に検出することができる。

以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。

なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本開示を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化することがある。

（実施の形態）
本実施の形態に係る検出方法では、検出対象物に特異的に結合する性質を有し、かつ、互いに競合しない２種類以上の抗体を用いる。これらの抗体は、標識物と結合された第１の抗体と、非標識物と結合された第２の抗体とを含む。第１の抗体及び第２の抗体は、検出対象物と抗原抗体反応により結合し、複合体を形成する。本実施の形態に係る検出方法では、複合体中の標識物の物理量を測定することにより、検出対象物を検出する。具体的な検出方法については、後述する。

検出対象物は、抗原抗体反応により第１の抗体及び第２の抗体と複合体を形成し得るものであればよい。例えば、検出対象物は、細菌（特に、病原性細菌）、放線菌、酵母、カビ、及び、ウィルスなどの微生物、それらの微生物に対する抗体、花粉、腫瘍マーカー抗原などの生体試料中の抗原性ペプチド、又は、細菌などが酸性する毒素などであってもよい。

本実施の形態では、検出対象物は、Ａ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質（ＮＰ）である例について説明する。Ａ型インフルエンザウィルスの亜型は、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ２Ｎ３型、Ｈ２Ｎ９型、Ｈ３Ｎ２型、Ｈ３Ｎ８型、Ｈ４Ｎ６型、Ｈ５Ｎ１型、Ｈ５Ｎ２型、Ｈ５Ｎ３型、Ｈ６Ｎ５型、Ｈ７Ｎ２型、Ｈ７Ｎ７型、Ｈ９Ｎ２型、Ｈ１１Ｎ６型、及び、Ｈ１２Ｎ５型の少なくとも１種であってもよい。

例えば、Ａ型インフルエンザウィルスは、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｙｏｇｏ／ＹＳ／２０１１）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｔｏｔｔｏｒｉ／７２３／１９８０）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／２／８１）、 Ｈ２Ｎ３（Ａ／ｄｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１７／０１）、 Ｈ２Ｎ９（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２７８／７８）、 Ｈ３Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／５／７７）、 Ｈ３Ｎ８（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／４／０３）、 Ｈ４Ｎ６（Ａ／ｄｋ／Ｃｚｅｃｈ／５６）、 Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）、 Ｈ５Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／１０２１８／８４）、 Ｈ５Ｎ３（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８２０／８０）、 Ｈ６Ｎ５（Ａ／ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ／Ｓ． Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／７２）、 Ｈ７Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３０１／７８）、 Ｈ７Ｎ７（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−２／２００４）、 Ｈ７Ｎ７（Ａ／ｓｅａｌ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／１／１９８０）、 Ｈ９Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４４８／７８）、 Ｈ９Ｎ２（Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１９６６）、 Ｈ１１Ｎ６（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／１／１９５６）、及び、Ｈ１２Ｎ５（Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６）のうちの少なくとも１種である。

このように、複数種類の亜型のＡ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質を検出することができるため、本実施の形態に係る検出方法によれば、Ａ型インフルエンザウィルスを高精度に検出することができる。

このとき、第１の抗体及び第２の抗体は、Ａ型インフルエンザウィルス、特に、Ａ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質に結合する。特許文献１にも開示されているように、インフルエンザウィルスに結合する抗体は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下の構造ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
Ｎ − ＦＲ１ − ＣＤＲ１ − ＦＲ２ − ＣＤＲ２ − ＦＲ３ − ＣＤＲ３ − ＦＲ４ − Ｃ

ここで、ＦＲは、フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を示し、かつ、ＣＤＲは、相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を示す。フレームワーク領域は、相補性決定領域を構造的に支える役割を持つ領域であり、抗体の可変領域のうち、保存性の高い領域を含む。相補性決定領域は、抗原に直接接触して抗原と相補的な立体構造を形成する領域である。つまり、相補性決定領域は、抗原との結合部位を形成する領域であり、抗原に対する特異性を決定する領域である。相補性決定領域は、抗体の可変領域のうち、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含む。このように、抗体の可変領域は、複数のＣＤＲ及びＦＲから構成されている。また、これらのＣＤＲ及びＦＲは、Ｎ末端側から配列される順番により、例えば、1つ目の相補性決定領域をＣＤＲ１、２つ目の相補性決定領域をＣＤＲ２、1つ目のフレームワーク領域をＦＲ１、２つ目のフレームワーク領域をＦＲ２と表現される。

なお、実施例にて後述するように、発明者は、ＶＨＨ抗体ライブラリのスクリーニングにより、反応性の高いＡ型インフルエンザウィルス抗体を複数クローン得た。中でも、第１の抗体及び第２の抗体として、Ｎ末端側から順に、下記のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つの相補性決定領域を有する抗体を組み合わせることにより、微量のＮＰを高感度に検出できることが分かった。

さらに、第１の抗体及び第２の抗体は、Ｎ末端側から順に、下記のアミノ酸配列を含むＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのフレーム領域を有する。これにより、第１の抗体及び第２の抗体は、ＣＤＲの立体構造（例えば、ループ構造）を安定的に維持することができるため、ＣＤＲは抗原捕捉能を発揮することができる。

第１の抗体は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４により表される４つのアミノ酸配列をそれぞれ有する４つの抗体のうちの少なくとも１つである。また、第２の抗体は、配列番号：１及び配列番号：２により表される２つのアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの抗体のうちの少なくとも１つである。以下、配列番号：１により表されるアミノ酸配列を有する抗体を「Ａ１」、配列番号：２により表されるアミノ酸配列を有する抗体を「Ａ２」、配列番号：３により表されるアミノ酸配列を有する抗体を「Ａ３」、及び、配列番号：４により表されるアミノ酸配列を有する抗体を「Ａ４」と称する。

これらの抗体のアミノ酸配列は、以下の通りである。
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSAFSLYAMGWHRQAPGKQRELVAYITNGDITNYADSVQGRVIISRDNAKNTVYLHMNSLKPEDTAVYYCYAVGGRTFWGQGTQVTVSS（配列番号：１）

QVQLVESGGGLVQTGGPLRLSCAVSDRTDSNYAMGWFRQAPGKEREFVAAISGTGYVTGYADSARNRFTLSRDNGKNAVYLQMNSLEPADTAVYYCAATSDQRYPGPRSSGYDYWGQGTQVTVSS（配列番号：２）

EVQLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFSNYYMGWFRQAPGKERQSLATVNSGGTGEAYADSIRGRFTISRDNAKNTVTLQMSSLQPEDTAVYYCARVDGRVLSTIVVSYDYWGQGTQVTVSS（配列番号：３）

EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFINLDMGWFRQPPGKEREYVAAITRNGAITSYADSAKGRFTISRDNAKNTVSLEMNSLKPEDTGVYYCAAYSISNYGSGWYKPDYWGQGAQVTVSS（配列番号：４）

例えば、抗体Ａ１では、ＣＤＲ１は、ＧＳＡＦＳＬＹＡＭＧ（配列番号：５）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、ＹＵＴＮＧＤＵＴＮＹＡＤＳＶＱＧ（配列番号：６）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、ＶＧＧＲＴＦ（配列番号：７）により表されるアミノ酸配列を含む。この場合、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：８）、ＷＨＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡ（配列番号：９）、ＲＶＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＨＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＡ（配列番号：１０）、及び、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：１１）により表されるアミノ酸配列を含む。

また、抗体Ａ２では、ＣＤＲ１は、ＤＲＴＤＳＮＹＡＭＧ（配列番号：１２）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、ＡＩＳＧＴＧＹＶＴＧＹＡＤＳＡＲＮ（配列番号：１３）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、ＴＳＤＱＲＹＰＧＰＲＳＳＧＹＤＹ（配列番号：１４）により表されるアミノ酸配列を含む。この場合、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＴＧＧＰＬＲＬＳＣＡＶＳ（配列番号：１５）、ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号：１６）、ＲＦＴＬＳＲＤＮＧＫＮＡＶＹＬＱＭＮＳＬＥＰＡＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号：１７）、及び、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：１８）により表されるアミノ酸配列を含む。

また、抗体Ａ３では、ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＳＮＹ（配列番号：１９）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＣＤＲ２は、ＮＳＧＧＴＧ（配列番号：２０）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、ＲＶＤＧＲＶＬＳＴＩＶＶＳＹＤＹ（配列番号：２１）により表されるアミノ酸配列を含む。この場合、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳ（配列番号：２２）、ＹＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＱＳＬＡＴＶ（配列番号：２３）、ＥＡＹＡＤＳＩＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＴＬＱＭＳＳＬＱＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号：２４）、及び、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：２５）により表されるアミノ酸配列を含む。

また、抗体Ａ４では、ＣＤＲ１は、ＧＲＴＦＩＮＬＤＭＧ（配列番号：２６）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、ＡＩＴＲＮＧＡＩＴＳＹＡＤＳＡＫＧ（配列番号：２７）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、ＹＳＩＳＮＹＧＳＧＷＹＫＰＤＹ（配列番号：２８）により表されるアミノ酸配列を含む。この場合、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：２９）、ＷＦＲＱＰＰＧＫＥＲＥＹＶＡ（配列番号：３０）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＥＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＡ（配列番号：３１）、及び、ＷＧＱＧＡＱＶＴＶＳＳ（配列番号：３２）により表されるアミノ酸配列を含む。

例えば、第１の抗体及び第２の抗体がＡ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質に特異的に結合する場合、上記の抗体Ａ１〜Ａ４は、いずれもＢ型インフルエンザウィルスのような、Ａ型インフルエンザウィルス以外のインフルエンザウィルスに対して抗原交差反応性を示さないことが好ましい。

標識物は、物理量を発生させることにより検出対象物を標識する物質である。標識物は、発光物質、放射性物質又は色素のように、当該物質自身が発生させる静的な物理量により検出対象物を標識する物質であってもよい。また、標識物は、蛍光物質又は酵素のように、当該物質が外部からの刺激を受けて発生させる動的な物理量により検出対象物を標識する物質であってもよい。外部からの刺激とは、例えば、光、磁界、又は、基質などである。当該物理量は、例えば、蛍光強度、発光強度、色度、光透過度、濁度、吸光度、及び、放射線量などが挙げられる。物理量の測定方法は、例えば、蛍光免疫測定法、表面プラズモン共鳴測定法、電気化学発光免疫測定法、酵素免疫測定法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、及び、放射免疫測定法などの公知の方法が挙げられる。本実施の形態では、標識物は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、及び、放射性物質のうちの１つである。抗体を標識物へ結合させる方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、又は、架橋法などの公知の方法が使用される。

非標識物は、検出対象物を固定する（担持する）ための基材である。非標識物は、抗原抗体反応の反応系における溶媒に不溶な担体であれば、その形状及び材質は特に制限されない。非標識物の形状は、例えば、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター、及び、薄膜などが挙げられる。非標識物の材質は、例えば、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、金、銀、アルミニウム等の金属、及び、ガラスなどが挙げられる。抗体を非標識物へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、又は、架橋法などの公知の方法が使用される。

本実施の形態における検出装置は、抗原抗体反応に基づき変化する上記の物理量のいずれかを検出するための検出部を備える。検出部は、各種光度計、分光器、又は、線量計など公知の装置で構成される。

［抗体の調製］
以下、上記の抗体Ａ１〜Ａ４の調製方法について説明する。ここでは、抗体Ａ３の調製方法を具体的に説明する。Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスＡ型に含まれる核内タンパク質に結合するＶＨＨ抗体（すなわち、重鎖抗体の重鎖の可変領域）が、以下の手順に従って調製された。以下、核内タンパク質は「ＮＰ」と呼ばれる。

（アルパカへの免疫及び単核球の取得）
ＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリを作製するため、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスＡ型（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ）由来のリコンビナント核内タンパク質（配列番号：３３）を抗原として用いてアルパカが免疫された。リコンビナント核内タンパク質は、ヒゲタ醤油株式会社においてブレビバチルス発現システムを用いて作製された。リコンビナント核内タンパク質は、アジュバントを用いてアルパカに投与される前に調整された。

リコンビナント核内タンパク質（配列番号：３３）の配列は以下の通りである。
MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIWRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN（配列番号：３３）

具体的には、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するリコンビナント核内タンパク質が、アルパカへ投与された。１週間後、再度、同じ濃度を有するリコンビナント核内タンパク質が、アルパカへ投与された。このようにして、５週間かけて５回、アルパカはリコンビナント核内タンパク質を用いて免役された。さらに１週間後、アルパカの血液を採取した。次いで、以下のように血液から単核球が取得された。

リンパ球分離チューブ（株式会社グライナージャパンより購入、商品名：Ｌｅｕｃｏｓｅｐ）に、血球分離溶液（コスモ・バイオ株式会社より購入、商品名：Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）が添加された。次いで、溶液は、摂氏２０度の温度で１０００×ｇで１分間遠心された。

アルパカから採取された血液は、ヘパリンによって処理された。次に、このように処理された血液に等量のリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という）が添加され、サンプル液を得た。次いで、サンプル液は血球分離溶液が添加されたリンパ球分離チューブに添加された。

リンパ球分離チューブは、摂氏２０度の温度で８００×ｇで３０分遠心された。

単核球を含有する画分が回収され、３倍の容量を有するＰＢＳが添加された。画分は、摂氏２０度の温度で ３００×ｇで ５分遠心された。沈殿物が、ＰＢＳを用いて穏やかに懸濁された。懸濁後、細胞数の測定のために１０マイクロリットルの懸濁液が分離された。残りの懸濁液が、摂氏２０度の温度で ３００×ｇで ５分間遠心された。

沈殿物に２ミリリットルの容積を有するＲＮＡ保存溶液（商品名：ＲＮＡｌａｔｅｒ）が添加された。次いで、溶液は穏やかに懸濁された。懸濁液が、２本の１．５ｍＬチューブに注入された。各チューブは、１ミリリットルの懸濁液を含んでいた。チューブは、摂氏−２０度の温度下で保存された。細胞数の測定のために分離された懸濁液（５マイクロリットル）が、チュルク液（１５マイクロリットル）と混合され、血球計算盤を用いて単核球の数が数えられた。

（ＶＨＨ抗体のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリの作製）
次に、単核球からＴＯＴＡＬ ＲＮＡを抽出し、そしてＶＨＨ抗体のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリが以下の手順で作製された。以下の手順では、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｇｒａｄｅの試薬及び器具が使用された。

単核球分画に、トータルＲＮＡ抽出試薬（商品名：ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、１ミリリットル）を加えた。試薬は緩やかに混和され、そして室温にて５分間放置された。クロロホルム（２００マイクロリットル）が試薬に加えられ、そして１５秒間、試薬は力強く振られた。試薬は、室温で２〜３分間静置された。試薬は、摂氏４度で１５分間、１２，０００×ｇ以下で遠心された。

上清が新しいチューブに移された。ＲＮａｓｅフリー水及びクロロホルム（各２００マイクロリットル）がチューブに加えられた。さらに５００ミリリットルのイソプロパノールがチューブに加えられた。チューブに含まれる液体はボルテックスミキサーを用いて撹拌された。液体は室温で１０分間静置された。次いで、液体は摂氏４度の温度で１５分間、１２，０００×ｇ以下で遠心された。上清が捨てられ、沈殿物が１ミリリットルの７５％ エタノールでリンスされた。この溶液は、摂氏４度の温度で５分間、７，５００×ｇ以下で遠心された。溶液は乾燥され、全ＲＮＡを得た。得られた全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリー水に溶解された。

Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを取得するため，逆転写酵素を含むキット（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １^ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）が用いられた。キットに含まれるＲａｎｄｏｍ ６ ｍｅｒ及びＯｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒがプライマーとして用いられた。キットの標準プロトコルに従って、ｃＤＮＡが取得された。

アルパカに含まれるＶＨＨ抗体の遺伝子が、ｃＤＮＡからＰＣＲ法によって獲得された。ＰＣＲのための酵素はタカラバイオ株式会社よりＥｘ−ｔａｑの商品名として入手された。

以下の試薬が混合され、混合液を得た。
10x buffer ５ マイクロリットル
dNTPs ４ マイクロリットル
Primer F ２ マイクロリットル
Primer R ２ マイクロリットル
cDNA template １ マイクロリットル
Ex-taq ０．２５ マイクロリットル
混合液は以下のＰＣＲ法に供された。

まず、混合液は、摂氏９５度で２分間で加熱された。

次いで、混合液の温度は、以下のサイクルに従って変化された。

摂氏９６度で３０秒間
摂氏５２度で３０秒間、そして
摂氏６８度で４０秒間。

このサイクルが３０回繰り返された。
最後に、混合液は、摂氏６８度で４分間加熱した後、摂氏４度で保存された。

このＰＣＲ法においては、以下のプライマーが使用された。
primer 1： 5’- GGTGGTCCTGGCTGC -3’ （配列番号：３４）
primer 2： 5’- ctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggcTSAGKTGCAGCTCGTGGAGTC -3’ （配列番号：３５）
primer 3： 5’- TGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ （配列番号：３６）
primer 4： 5’- TTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ （配列番号：３７）
primer 5： 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ （配列番号
：３８）
primer 6： 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgaTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ （配列番号：３９）
（参考文献：Biomed Environ Sci, 2012; 27(2):118-121）

３回のＰＣＲ法が実施された。

１回目のＰＣＲ法では、ｃＤＮＡ、Ｐｒｉｍｅｒ １及びＰｒｉｍｅｒ ３からなるプライマーセットＡ、並びに、ｃＤＮＡ、Ｐｒｉｍｅｒ １及びＰｒｉｍｅｒ ４からなるプライマーセットＢが用いられた。

２回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＡを用いて増幅された遺伝子、Ｐｒｉｍｅｒ ２及びＰｒｉｍｅｒ ３からなるプライマーセットＣ、並びに、プライマーセットＢを用いて増幅された遺伝子、Ｐｒｉｍｅｒ ２及びＰｒｉｍｅｒ ４からなるプライマーセットＤが用いられた。

３回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＣを用いて増幅された遺伝子、Ｐｒｉｍｅｒ ２及びＰｒｉｍｅｒ ５からなるプライマーセットＥ、並びに、プライマーセットＤを用いて増幅された遺伝子、Ｐｒｉｍｅｒ ２及びＰｒｉｍｅｒ ６からなるプライマーセットＦが用いられた。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリが形成された。言い換えれば、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリは、プライマーセットＥ及びプライマーセットＦを用いて増幅された遺伝子を含んでいた。

（ファージライブラリの作製）
次に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリから、以下の手順に従ってファージライブラリが作製された。

市販されているプラスミドｐＵＣ１１９（例えば、タカラバイオ株式会社より入手可能）由来のプラスミドＶｅｃｔｏｒ１（４０５７塩基対、図１Ａ参照）が、制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。図１Ａにおける制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）は、ＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号：４０）により表される遺伝子配列からなる。制限酵素サイトＳｆｉＩ（ｂ）は、ＧＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣ（配列番号：４１）により表される遺伝子配列からなる。図１Ｂは、プラスミドＶｅｃｔｏｒ１の詳細なベクターマップを示す。

プラスミドＶｅｃｔｏｒ１は、以下の遺伝子配列からなる。
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccAAGCTTCGAAGGAGACAGTCATAatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggagcTCAAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCAGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCGATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTTGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTgtaGGCCtctGCGGCCGCagaGcaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcaTAGggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttagcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtctTAATAAgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgCATATGaAAATTGTAAgcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacaGGGCGCGTcccatATGgtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcga（配列番号：４２）
同様に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリも制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が得られた。

このように処理されたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１が、ＶＨＨ抗体遺伝子断片と、１：２の割合で混合された。混合液に、酵素（東洋紡株式会社より入手、商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２）が注入された。混合液は摂氏１６度の温度下で２時間静置された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がプラスミドＶｅｃｔｏｒ１にライゲーションされた。

このようにしてライゲーションされたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１を用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＨＳＴ０２）がトランスフェクトされた。

次いで、大腸菌は、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するアンピシリンを含有する２ＹＴプレート培地上で１５時間、培養された。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる遺伝子断片から得られるタンパク質を提示するファージのライブラリが得られた。

培養後、２ＹＴプレート培地上に形成されたシングルコロニーの数をカウントすることでライブラリの濃度を算出した。その結果、ライブラリは、５×１０⁷／ミリリットルの濃度を有していた。

（バイオパニング）
核内タンパク質に特異的に結合するＶＨＨ抗体が、ファージライブラリから以下の手順に従って得られた。

ＶＨＨ抗体を発現したファージの中から、抗原に結合するクローンを抽出するため、２回のバイオパンニングを実施した。

ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片が導入された大腸菌（ＨＳＴ０２）を、吸光度を示す値（ＯＤ_６００）が１．０になるまで摂氏３０度にて１００ｍＬの ２ＹＴ ＡＧ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び１％グルコースを含有した２ＹＴ培地）の培地中で培養し、大腸菌を増殖させた。

ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を感染多重度（ＭＯＩ）がおよそ２０となるよう大腸菌含有培地へ加えた。

その後、培地が３０分ほど摂氏３７度で保温された。次いで、培地を４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心し、大腸菌を回収した。１００ｍＬの２ＹＴＡＫ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した２ＹＴ培地）中で、摂氏３０度で、２１３ｒｐｍにて遠心しながら、大腸菌を一晩培養した。

上記のように培養された大腸菌を含有する培養液（１００ミリリットル）が、２本の遠沈管（容積：５０ミリリットル）に注入された。２つの培養液は、４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心された。次いで、上清（各２０ミリリットル）が回収された。

上清（４０ミリリットル）が、ＮａＣｌ（２．５Ｍ）を含有する２０％ ＰＥＧ溶液（１０ミリリットル）に添加された。次いで、混合液は、転倒混和された。その後、混合液は、およそ１時間氷上にて冷却された。混合液は、４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心された。次いで、上清が除去された。１０％グリセロールを含有するＰＢＳが沈殿物に向けて注入された。最後に、沈殿物は、ほぐしながら溶解された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリが得られた。

（ＮＰに特異的に結合するＶＨＨ抗体のスクリーニング）
（Ａ） ＮＰ抗原の固定化
ＮＰをＰＢＳと混合し、ＮＰ溶液を調製した。ＮＰの濃度は２マイクログラム／ミリリットルであった。ＮＰ溶液（２ミリリットル）が、イムノチューブ（ヌンク社より購入）に注入された。ＮＰ溶液はイムノチューブ内で一晩静置された。このようにして、イムノチューブの内部にＮＰが固定された。

次いで、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。

３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳをイムノチューブに満たした。このようにして、ＮＰが抗原としてイムノチューブの内部にブロッキングされた。

イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。その後、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。

（Ｂ）パニング
ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリ（濃度：およそ５Ｅ＋１１／ミリリットル）が、３％のスキムミルクを含有した３ミリリットルのＰＢＳと混合され、混合液を調製した。混合液は、ＮＰ抗原が固定化されたイムノチューブに注入された。

イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。

イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。

イムノチューブの内部は、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）で１０回、洗浄された。

イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴにより満たされた。その後、イムノチューブは、１０分間、静置された。次いで、イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴで１０回、洗浄された。

ＮＰ抗原に結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを抽出するために、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）がイムノチューブに注入された。

イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。

溶液を中和するため、溶液は、１ｍＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）を含有するチューブに移した。再度、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）を用いたファージの抽出を繰り返した。このようにして、３ｍＬの抽出液が得られた。

抽出液（１ｍＬ）が、９ｍＬの大腸菌ＨＳＴ０２と混合された。混合液は、摂氏３０度の温度で１時間、静置された。

コロニーを計数するため、大腸菌ＨＳＴ０２を含有する１０マイクロリットルの混合液は、２ＴＹＡ培地を含む小プレート（１０ミリリットル／プレート）にまかれた。

残りの混合液は遠心分離された。上澄み液は捨てられ、かつ沈殿物は２ＴＹＡ培地を含む大プレート（４０ミリリットル／プレート）にまかれた。これらの２つのプレートは、摂氏３０度の温度下にて一晩静置された。このようにして、１回目のパニングが行われた。

１回目のパニングの手順と全く同様に、２回目のパニングが行われた。言い換えれば、パニングが繰り返された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが精製された。

２回目のパニングの後、大腸菌のコロニーが爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされた１つのコロニーは、９６平底プレートの１つのウェルに置かれた。これが繰り返された。１つのウェルは、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＧ培地を含有していた。

ウェル内の溶液が、摂氏３０度で２１３ｒｐｍの回転数で撹拌された。

増殖した大腸菌を含む溶液（５０マイクロリットル）が回収された。回収された溶液は、プレートに含まれる５０マイクロリットルの２ＹＴＡ培地と混合された。２ＹＴＡ培地は、感染多重度ＭＯＩが２０になるようなヘルパーファージを含有していた。溶液は、摂氏３７度の温度で４０分間静置された。

２ＹＴＡ培地を含むプレートは、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。上清が捨てられた。沈殿物が大腸菌を含んでいた。沈殿物は、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＫ培地と混合された。混合液は、摂氏３０度にて一晩静置された。

混合液は、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。大腸菌を含む上清が回収された。

（Ｃ） ＥＬＩＳＡによるファージ提示ＶＨＨ抗体及び抗原の定性評価
９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入、商品名：ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに、２マイクログラム／ミリリットルの濃度を有する核内タンパク質溶液を抗原として添加した。各ウェルにおけるＨＡタンパク質溶液の容積は、５０マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、４℃で一晩、放置された。このようにして、ＮＰ抗原が各ウェルに固定された。

各ウェルは、ＰＢＳにより３回、洗浄された。次いで、３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳが各ウェルに注入された（２００マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは、室温で１時間、放置された。このようにして、核内タンパク質が各ウェルでブロックされた。その後、各ウェルは、ＰＢＳで３回、洗浄された。

ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが、各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、ファージはＮＰ抗原と反応した。

各ウェルは、ＰＢＳＴを用いて３回、洗浄された。次に、抗Ｍ１３抗体（ａｂｃａｍ社より入手、商品名：ａｂ５０３７０、１００００倍希釈）が各ウェルに添加された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、各ウェルはＰＢＳＴで３回、洗浄された。

発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手、商品名：１−ＳＴＥＰ ＵＬＴＲＡ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ）が各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは２分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。

硫酸水溶液（１規定）が５０マイクロリットル／ウェルの濃度で各ウェルに添加され、反応を停止させた。

４５０ナノメートルの波長での溶液の吸光度が測定された。

良好な吸光度測定の結果を有する１４のウェルが選択された。選択された１４つのウェルに含有されるファージに含まれるＤＮＡ配列が、グライナー社により解析された。ＤＮＡ配列の解析結果は、以下の通りである。以下の１つＤＮＡ配列が見いだされた。
GAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGCCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAATTATTACATGGGCTGGTTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGAACGACAGTCTCTAGCGACAGTTAACTCAGGTGGTACTGGGGAGGCCTATGCAGACTCCATACGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGACGCTACAAATGAGCAGCCTGCAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCACGAGTCGACGGGCGTGTCCTGAGTACAATAGTAGTTTCTTACGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：４３）

配列番号：４３により表されるＤＮＡ配列から合成される蛋白質は、以下のアミノ酸配列からなる。
EVQLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFSNYYMGWFRQAPGKERQSLATVNSGGTGEAYADSIRGRFTISRDNAKNTVTLQMSSLQPEDTAVYYCARVDGRVLSTIVVSYDYWGQGTQVTVSS（配列番号：３）

（抗ＮＰ ＶＨＨ抗体の発現）
ベクターｐＲＡ２（＋）が発現ベクターとして用いられた（図２参照)。ベクターｐＲＡ２（＋）は、メルク社から購入された。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より購入）を用いて、ＶＨＨ配列がベクターｐＲＡ２（＋）に付加された。以下、付加された手順が詳細に説明される。

まず、以下２つのプライマー（配列番号：４４及び配列番号：４５）を用いて、ＰＣＲ法により、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１から、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が複製された。このようにして、配列番号：２により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の１つのＤＮＡ（配列番号：４６）が得られた。

Primer 1： 5’- CAGCCGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGG -3’ （配列番号：４４）
Primer 2： 5’- ATGGTGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCC -3’ （配列番号：４５）

5'- CAGCCGGCCATGGCTGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGCCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAATTATTACATGGGCTGGTTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGAACGACAGTCTCTAGCGACAGTTAACTCAGGTGGTACTGGGGAGGCCTATGCAGACTCCATACGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGACGCTACAAATGAGCAGCCTGCAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCACGAGTCGACGGGCGTGTCCTGAGTACAATAGTAGTTTCTTACGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCACACCAT -3’ （配列番号：４６）

一方、以下２つのプライマー（配列番号：４７及び配列番号：４８）を用いて、ＰＣＲ法により、ベクターｐＲＡ２に含まれる一部の塩基配列が増幅された。このようにして、ＤＮＡ（配列番号：４９）が得られた。
Primer 1： 5’- GCGGCCGCACACCATCATCACCACCATTAATAG-3’（配列番号：４７）
Primer 2： 5’- AGCCATGGCCGGCTGGGCCGCGAGTAATAAC-3’（配列番号：４８）

GCGGCCGCACACCATCATCACCACCATTAATAGcactagtcaagaggatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatgaattccgtgtattctatagtgtcacctaaatcgtatgtgtatgatacataaggttatgtattaattgtagccgcgttctaacgacaatatgtacaagcctaattgtgtagcatctggcttactgaagcagaccctatcatctctctcgtaaactgccgtcagagtcggtttggttggacgaaccttctgagtttctggtaacgccgtcccgcacccggaaatggtcagcgaaccaatcagcagggtcatcgctagccagatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctttatttcaaggagacagtcataATGaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggct（配列番号：４９）

以下の２つのＤＮＡ（Ｉ）および（ＩＩ）以外のＤＮＡは、制限酵素ＤｐｎＩ（東洋紡より入手）を用いて断片化された。言い換えれば、以下の２つのＤＮＡ（Ｉ）及び（ＩＩ）の２つのＤＮＡはそのままであったが、他のＤＮＡは断片化された。
（Ｉ） 配列番号：４６により表されるＤＮＡ
（ＩＩ） 配列番号：４９により表されるＤＮＡ

Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より購入）を用いて、配列番号：２１により表されるＤＮＡが、配列番号：４９により表されるＤＮＡと融合された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がベクターｐＲＡ２（＋）にライゲーションされた。

ライゲーション溶液（１０マイクロリットル）及び大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオより入手、１００マイクロリットル）が氷上にて混合された。混合液は、３０分間、氷上にて静置された。次いで、混合液は、摂氏４２度で４５秒間加熱された。最後に、混合液は、３分間、氷上で静置された。この手順は、一般的なヒートショック法として知られている。

摂氏３７度で１時間振とう培養後、全量の混合液が、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度でアンピシリンを含有するＬＢＡ培地上に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度で一晩静置された。

ＬＢＡ培地上に形成されたコロニーの中から、３つのコロニーが選択された。選択された３つのコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）で一晩培養された。

培養された大腸菌に含まれるプラスミドは、プラスミド抽出キット（Ｓｉｇｍａより入手、商品名：Ｇｅｎｅ Ｅｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて、ＬＢＡ培地から抽出された。目的のＶＨＨ抗体の遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認するため、プラスミドの配列がグライナー社によって解析された。シーケンスの解析のために、一般的なＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒセットが用いられた。

シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたプラスミドが選択された。

選択されたプラスミドを用いて、大腸菌（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ， ライフテクノロジーズ社より入手）がヒートショック法によりトランフェクトされた。

トランスフェクトされた大腸菌を含有する溶液に、ＬＢＡ培地（１ミリリットル）が添加された。次いで、大腸菌は、２１３ｒｐｍで振とうされながら、摂氏３７度で１時間、回復培養された。

次いで、大腸菌溶液が回収された。回収された大腸菌溶液（１ミリリットル）は、ＬＢＡ培地に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度の温度で一晩、静置された。

ＬＢＡ培地内に形成されたコロニーの中から、１つのコロニーが選択された。選択されたコロニーは、爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされたコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）中で、２１３ｒｐｍで振とうされながら摂氏３７度の温度で培養された。このようにして、培養液を得た。

さらに、培養液（３ミリリットル）はＬＢＡ培地（１０００ミリリットル）に混合された。６００ナノメートルの波長での混合液の吸光度が０．６になるまで、混合液は摂氏２８度の温度で１２０ｒｐｍで振とうされた。

吸光度が０．６となったのち、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）溶液が混合液に添加された。ＩＰＴＧ溶液の最終濃度は０．５ｍＭであった。混合液に含有される大腸菌は、摂氏２０度で一晩、培養された。培養された大腸菌を回収するため、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、摂氏４度で遠心された。

回収された大腸菌は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５ｍＭイミダゾールを含有する混合溶媒に混合された。混合溶媒は、５０ミリリットルの容量を有していた。混合液に含有される大腸菌は、超音波を用いて破砕された。

大腸菌を含む破砕液は、４００００×ｇで３０分間、摂氏４度で遠心された。上清が回収され、溶出液を得た。回収された上清は、０．４５マイクロメートルフィルタを用いて濾過された。

濾液は、Ｎｉ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（株式会社キアゲンより入手）を用いて推奨プロトコルに従って精製された。精製時には、１ミリリットルのＮｉ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅに対して３ミリリットルを有する溶出バッファが用いられた。

さらに、抗ＮＰ抗体を含有する溶出液がカラムクロマトグラフィー（ゼネラルエレクトリック社より入手、商品名：Ａｋｔａ ｐｕｒｉｆｉｅｒ）を用いて精製された。このようにして、抗ＮＰ抗体を含有する溶液が得られた。

このようにして得られた溶液に含有される抗ＮＰ抗体は、吸光度計（スクラム社より入手、商品名：ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて、２８０ナノメートルでの波長での吸収測定値に基づいて定量された。その結果、抗ＮＰ抗体の濃度は１．３０ミリグラム／ミリリットルであった。

なお、抗体Ａ１及び抗体Ａ２の調製方法については、抗体Ａ１に含まれる配列番号：１により表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号：５０）、抗体Ａ２に含まれる配列番号：２により表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号：５１）である以外は、上記の方法と同様である。また、抗体Ａ４の調製方法については、特開２０１８−５８８１１号公報に記載の方法であるため、ここでの記載を省略する。

CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCGCCTTCAGCCTCTATGCCATGGGCTGGCACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCATATATTACTAATGGTGACATCACAAACTATGCGGACTCCGTGCAGGGCCGTGTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAACACGGTGTATCTACACATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTATTGTTATGCAGTGGGGGGTCGGACCTTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：５０）

CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGGGGATTGGTGCAGACTGGGGGCCCGCTGAGACTCTCCTGCGCAGTCTCTGATCGCACCGACAGTAACTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTATTAGCGGCACTGGTTATGTCACTGGCTATGCAGACTCCGCGAGGAATCGCTTCACCCTCTCCAGAGACAACGGCAAGAACGCGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGGAACCTGCGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCCACATCAGATCAACGCTATCCTGGTCCTCGCTCCTCGGGATATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：５１）

［実施例］
以下、第１の抗体及び第２の抗体の組み合わせについて、実施例を用いてより具体的に説明するが、これらの実施例は、本開示を何ら制限するものではない。

以下の実験例１〜３では、３種類のＡ型インフルエンザウィルスを抗原とし、上述した抗体の調製方法により調製された５種類の抗体について、第１の抗体及び第２の抗体として用いる組み合わせを検討した。

３種類のＡ型インフルエンザウィルスは、（１）亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）、（２）亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）、及び、（３）亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）である。

５種類の抗体は、（１）抗体Ａ１、（２）抗体Ａ２、（３）抗体Ａ３、（４）抗体Ａ４、及び、（５）配列番号：５２により表されるアミノ酸配列を含む抗体（以下、抗体Ａ５と称する）である。
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCIASGSIFSPNVMGWYRQAPGKPRELVAAITLGESTNYADSVKGRFTISRSNAENTVYLQMDSLKPEDTAVYYCNAGPILERVGPYWGQGTQVTVSS（配列番号：５２）

抗体Ａ５では、ＣＤＲ１は、ＧＳＩＦＳＰＮＶ（配列番号：５３）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、ＩＴＬＧＥＳＴ（配列番号：５４）により表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、ＮＡＧＰＩＬＥＲＶＧＰＹ（配列番号：５５）により表されるアミノ酸配列を含む。また、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＩＡＳ（配列番号：５６）、ＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＰＲＥＬＶＡＡ（配列番号：５７）、ＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＳＮＡＥＮＴＶＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号：５８）、及び、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：５９）により表されるアミノ酸配列を含む。

配列番号：５２により表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、以下の通りである。
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTATCGCCTCTGGGAGCATCTTCAGTCCCAATGTCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGAAAGCCGCGCGAGTTGGTCGCGGCTATTACCCTTGGTGAGAGCACCAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAAGCAACGCCGAGAACACAGTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTAATGCCGGGCCCATCTTAGAACGGGTTGGGCCTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：６０）

（実施例１）
実施例１では、第２の抗体として、抗体Ａ１を用い、第１の抗体として、抗体Ａ１〜Ａ５及びこれらの５種類の抗体の混合物（ａｌｌ）のそれぞれを用いた。ＮＰ抗原として、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）を用いた。

まず、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、商品名：ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに、１０μｇ／ｍＬの抗体Ａ１を提示するモノクローナルファージを第２の抗体（Ａｎｔｉ−ＮＰ ＶＨＨ−Ｈｉｓｔａｇ）として添加した。各ウェルにおける抗体Ａ１溶液の容積は、５０μＬであった。９６ウェルプレートは、４℃で１時間、放置された。このようにして、ファージの表面に提示された抗体Ａ１が各ウェルに固定された。

各ウェルは、ＰＢＳにより３回、洗浄された。次いで、３％スキムミルクを含有するＰＢＳが各ウェルに注入された（２００μＬ／ウェル）。９６ウェルプレートは、室温で１時間、静置された。このようにして、抗体Ａ１を提示するモノクローナルファージが各ウェルでブロックされた。その後、各ウェルは、ＰＢＳで３回、洗浄された。

ＮＰ抗原として、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）が、各ウェルに注入された（５０μＬ／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、ＮＰ抗原は、ファージの表面に提示された抗体Ａ１と反応した。

各ウェルは、ＰＢＳＴで３回洗浄された。次いで、第１の抗原として、抗体Ａ１〜Ａ５及びこれらの５種類の抗体の混合物（ａｌｌ）のそれぞれが異なるウェルに注入された（５０μＬ／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、第２の抗体は、抗体Ａ１と結合したＮＰ抗原と反応した。

各ウェルは、ＰＢＳにより、３回洗浄された。次いで、３％スキムミルクを含有するＰＢＳが各ウェルに注入された（２００μＬ／ウェル）。９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、第１の抗体が各ウェルでブロックされた。その後、各ウェルは、ＰＢＳで３回、洗浄された。

次いで、抗Ｍ１３抗体（ａｂｃａｍ社、商品名：ａｂ５０３７０、１００００倍希釈）が各ウェルに添加された（５０μＬ／ウェル）。次いで、各ウェルはＰＢＳＴで３回洗浄された。

発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、商品名：１−ＳＴＥＰ ＵＬＴＲＡ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ）が各ウェルに注入された（５０μＬ／ウェル）。９６ウェルプレートは２分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。次いで、硫酸水溶液（１規定）が各ウェルに５０μＬずつ添加され、発色剤と抗体との反応を停止させた。次いで、この反応溶液の波長４５０ｎｍにおける吸光度が測定された（図３Ａ参照）。

続いて、ＮＰ抗原として、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）を用いたこと以外は、上記と同様に行い、第１の抗体と第２の抗体との組み合わせを検討した（図３Ｂ参照）。

続いて、ＮＰ抗原として、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）を用いたこと以外は、上記と同様に行い、第１の抗体と第２の抗体との組み合わせを検討した（図３Ｃ参照）。

（実施例２）
実施例２は、第２の抗体として、抗体Ａ２を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）を用いた結果を図４Ａに示す。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）を用いた結果を図４Ｂに示す。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）を用いた結果を図４Ｃに示す。

（比較例１）
比較例１は、第２の抗体として、抗体Ａ３を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）を用いた結果を図５Ａに示す。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）を用いた結果を図５Ｂに示す。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）を用いた結果を図５Ｃに示す。

（比較例２）
比較例２は、第２の抗体として、抗体Ａ４を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）を用いた結果を図６Ａに示す。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）を用いた結果を図６Ｂに示す。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）を用いた結果を図６Ｃに示す。

（比較例３）
比較例３は、第２の抗体として、抗体Ａ５を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）を用いた結果を図７Ａに示す。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）を用いた結果を図７Ｂに示す。ＮＰ抗原としてＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）を用いた結果を図７Ｃに示す。

（結果と考察）
実施例１〜２及び比較例１〜３では、それぞれ３種類のＮＰ抗原に対する第１の抗体と第２の抗体との組み合わせを検討した。Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）に対する第１の抗体と第２の抗体との組み合わせを検討した結果を表１に示す。

なお、表１〜表３において、第１の抗体及び第２の抗体の抗原に対する反応性（特異的結合性）が強く（具体的には、測定された吸光度の最大値が１以上であり）、抗原濃度の相対値に対して濃度依存的な結合が見られる場合、◎を付している。また、光源濃度の相対値に対して濃度依存的な結合が見られるが、第１の抗体及び第２の抗体の抗原に対する反応性（特異的結合性）が弱い（具体的には、測定された吸光度の最大値が０．５以上１未満）場合、〇を付している。また、第１の抗体及び第２の抗体の抗原に対する反応性が非常に弱い（具体的には、測定された吸光度の最大値が０．２５以上０．５未満）の場合、又は、第１の抗体及び第２の抗体の抗原に対する反応性は弱くないが、抗原濃度の相対値に対して濃度依存的な結合であるか不明である場合、△を付している。また、第１の抗体及び第２の抗体が抗原に結合しない（具体的には、測定された吸光度の最大値が０．２５未満）場合、×を付している。

Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）に対する第１の抗体と第２の抗体との組み合わせを検討した結果を表２に示す。

Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）に対する第１の抗体と第２の抗体との組み合わせを検討した結果を表３に示す。

図３Ａ〜図７Ｃ及び表１〜表３により、第２の抗体として抗体Ａ１又は抗体Ａ２を使用した場合、第１の抗体として、抗体Ａ１、抗体Ａ２、抗体Ａ３及び抗体Ａ４を使用したときに、上記の３種類のＮＰ抗原に対して、比較的高い反応性（特異的結合性）、又は、濃度依存的な結合が見られた。特に、第１の抗体として、抗体Ａ２、抗体Ａ３及び抗体Ａ４を使用したときに、第２の抗体として抗体Ａ１又は抗体Ａ２を使用すると、上記の３種類のＮＰ抗原に対して、高い反応性を示し、かつ、当該反応性が抗原濃度の相対値に対して濃度依存的であることが分かった。

一方、第２の抗体として、抗体Ａ３、抗体Ａ４又は抗体Ａ５を使用した場合、上記の３種類のＮＰ抗原のいずれかに対して、第１の抗体及び第２の抗体は結合しない、又は、反応性が非常に弱かった。

したがって、本開示に係る検出方法では、第１の抗体と第２の抗体との組み合わせにより、検出対象物を高感度に検出することができることが確認できた。当該組み合わせは、第１の抗体が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４により表される４つのアミノ酸配列をそれぞれ有する４つの抗体のうちの少なくとも１つであり、第２の抗体が、配列番号：１及び配列番号：２により表される２つのアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの抗体のうちの少なくとも１つである。

［検出方法］
続いて、本実施の形態に係る検出方法について説明する。図８は、本実施の形態に係る検出方法の一例を示すフローチャートである。

図８に示すように、本実施の形態に係る検出方法では、まず、検出対象物と、検出対象物と特異的に結合する性質を有し、標識物と結合された第１の抗体と、検出対象物と特異的に結合する性質を有し、非標識物と結合された第２の抗体と、を反応させて複合体を形成する（形成ステップＳ１０）。上述したように、非標識物は、検出対象物を固定する（担持する）ための基材である。非標識物の形状は、例えば、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター、又は、薄膜などである。標識物は、物理量を発生させることにより検出対象物を標識する物質である。標識物は、発光物質、放射性物質又は色素のように、当該物質自身が発生させる静的な物理量により検出対象物を標識する物質であってもよい。標識物が発光物質、放射性物質又は色素である場合、標識物は常に発光、放射、又は、発色している。このように、標識物が常に発する物理量を静的な物理量という。また、標識物は、外部からの刺激を受けて発生させる動的な物理量により検出対象物を標識する物質であってもよい。例えば、標識物が蛍光物質であるとき、標識物は、励起光を照射されることにより蛍光を発する。また、例えば、標識物が量子ドットである場合、標識物は電圧を印加されることにより発光する。また、例えば、標識物が酵素である場合、標識物は基質を添加されることにより、基質を分解する。基質が分解された分解産物が蛍光又は発光してもよく、発色してもよい。このように、外部からの刺激を受けることにより発生する物理量を動的な物理量という。

次いで、複合体に含まれる標識物の物理量を測定して、検出対象物を検出する（検出ステップＳ２０）。標識物が発光物質、放射性物質又は色素である場合、複合体中の標識物が発する光、放射線、又は発色を測定することにより、検出対象物を検出することができる。また、例えば標識物が蛍光物質、量子ドット、又は酵素である場合、複合体中の標識物が発する蛍光、光、酵素基質反応による呈色などを測定することにより、検出対象物を検出する。

なお、検出ステップＳ２０では、複合体中の標識物の物理量の変化を測定することにより、検出対象物を検出してもよい。物理量の変化を測定するとは、例えば、複合体中の標識物が発する物理量が増強され、増強された物理量を測定することであってもよく、複合体の位置変化を測定することであってもよい。例えば、複合体の位置変化を測定するとは、複合体が移動可能な形状であり、複合体が流体の流れに乗って移動する、又は、磁場による掃引により移動することにより、標識物が静的に発する物理量又は標識物質が動的に発する物理量を測定することである。以下、これらの具体的な態様を説明する。

図９は、本実施の形態における検出ステップＳ２０の処理フローの一例を示すフローチャートである。図９に示すように、検出ステップＳ２０では、複合体を移動させる磁場を印加し（ステップＳ２２）、磁場により複合体を移動させた際の標識物の位置変化を測定することにより、検出対象物を検出する（ステップＳ２４）。このとき、非標識物は、磁性粒子であり、標識物質は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素及び放射性物質のうちの１つである。磁性粒子とは、強磁性粒子であってもよく、常磁性粒子であってもよい。複合体中に磁性粒子を含むことにより、複合体は、複合体が存在する空間に磁場が印加されると、磁場により所定の方向に掃引され、移動する。

図１０は、本実施の形態における検出ステップＳ２０の処理フローの他の例を示すフローチャートである。図１０に示すように、検出ステップＳ２０では、複合体に標識物が蛍光を発する波長の光を照射し（ステップＳ２６）、複合体中の標識物が発する蛍光であり、かつ、当該光の照射により非標識物が発生する局在化表面プラズモン共鳴によって増強された蛍光を測定することにより、検出対象物を検出する（ステップＳ２８）。このとき、標識物は、蛍光物質であり、非標識物は、局在化表面プラズモン共鳴を発生させる基材である。非標識物の形状は、金属を含むプレート、ディスク、ビーズなどの粒子、フィルム、又は、膜であってもよい。また、非標識物は、ビーズなどの粒子である場合、磁性を帯びてもよく、磁性を帯びていなくてもよい。非標識物が磁性粒子であり、かつ、励起光の照射により局在化表面プラズモンを発生させる基材である場合、図９に示すステップＳ２２の処理により、磁場が印加されると、複合体は、磁場により所定の方向に掃引されて移動する。複合体は、複合体中の標識物が励起されて蛍光を発する波長であり、かつ、非標識物を構成する金属が励起されて局在化表面プラズモンを発生する波長を照射されると、複合体中の標識物が発する蛍光は、局在化表面プラズモン共鳴により増強される。これにより、微量の検出対象物を高感度に検出することができる。

以上、本開示に係る検出装置について、実施の形態及び実施例に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態及び実施例に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態及び実施例に施したものや、実施の形態及び実施例における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲に含まれる。

上記の実施の形態において、検出方法は、検出対象物がＡ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質である例を説明したが、第１の抗体及び第２の抗体が結合可能な物質であれば特に限定されない。

また、本開示の検出方法を実施するための検出システム及び検出装置は、病院、商業施設、空港、学校などの多数の人が集まる施設に設置されてもよく、家のリビングなど家族が集まる場所に設置されてもよい。この場合、当該検出装置は、例えば、当該検出装置が設置された周囲の空気を捕集して、捕集された空気中に含まれる検出対象物を検出してもよく、床の埃、唾、痰、嘔吐物、又は、それらが付着した物を捕集して、検出対象物を検出してもよい。特に、空気中に含まれる検出対象物は、微量であるため、検出することが難しいが、本開示の検出方法を用いることにより、微量の検出対象物も検出可能となる。

本開示に係る検出方法は、検出対象物に特異的に結合する複数種類の抗体を組み合わせることにより、例えば空気中に浮遊するウィルスを高感度に検出することができるため、検出装置及び検出システム等に利用可能である。

Claims (8)

1. 検出対象物と、前記検出対象物と特異的に結合する性質を有し、標識物と結合された第１の抗体と、前記検出対象物と特異的に結合する性質を有し、非標識物と結合された第２の抗体と、を反応させて複合体を形成する形成ステップと、
   前記複合体に含まれる標識物の物理量を測定して、前記検出対象物を検出する検出ステップと、
   を含み、
   前記第１の抗体は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４により表される４つのアミノ酸配列をそれぞれ有する４つの抗体のうちの少なくとも１つであり、
   前記第２の抗体は、配列番号：１及び配列番号：２により表される２つのアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの抗体のうちの少なくとも１つである、
   検出方法。
2. 前記検出対象物は、Ａ型インフルエンザウィルスの核内タンパク質である、
   請求項１に記載の検出方法。
3. 前記Ａ型インフルエンザウィルスは、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｙｏｇｏ／ＹＳ／２０１１）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／６−５／２０１４）、 Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７）、 Ｈ７Ｎ７（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−２／２００４）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｔｏｔｔｏｒｉ／７２３／１９８０）、 Ｈ１Ｎ１（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／２／８１）、 Ｈ２Ｎ３（Ａ／ｄｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１７／０１）、 Ｈ２Ｎ９（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２７８／７８）、 Ｈ３Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／５／７７）、 Ｈ３Ｎ８（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／４／０３）、 Ｈ４Ｎ６（Ａ／ｄｋ／Ｃｚｅｃｈ／５６）、 Ｈ５Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／１０２１８／８４）、 Ｈ５Ｎ３（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８２０／８０）、 Ｈ６Ｎ５（Ａ／ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ／Ｓ． Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／７２）、 Ｈ７Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３０１／７８）、 Ｈ７Ｎ７（Ａ／ｓｅａｌ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／１／１９８０）、 Ｈ９Ｎ２（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４４８／７８）、 Ｈ９Ｎ２（Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１９６６）、 Ｈ１１Ｎ６（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／１／１９５６）、及び、Ｈ１２Ｎ５（Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６）の少なくとも１種である、
   請求項２に記載の検出方法。
4. 前記非標識物は、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター及び薄膜のうちの１つである、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
5. 前記標識物は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素及び放射性物質のうちの１つである、
   請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出方法。
6. 前記検出ステップでは、前記複合体中の前記標識物の物理量の変化を測定することにより、前記検出対象物を検出する、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
7. 前記非標識物は、磁性粒子であり、
   前記標識物は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素及び放射性物質のうちの１つであり、
   前記検出ステップでは、
   前記複合体を移動させる磁場を印加し、
   前記磁場により前記複合体を移動させた際の前記標識物の位置変化を測定することにより、前記検出対象物を検出する、
   請求項６に記載の検出方法。
8. 前記標識物は、蛍光物質であり、
   前記検出ステップでは、
   前記複合体に、前記標識物が蛍光を発生する波長の光を照射し、前記複合体中の前記標識物が発する蛍光であり、かつ、前記光の照射により前記非標識物が発生する局在化表面プラズモン共鳴によって増強された蛍光を測定することにより、前記検出対象物を検出する、
   請求項６に記載の検出方法。

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