JP2017036258A - インフルエンザウィルスに結合する抗体 - Google Patents

インフルエンザウィルスに結合する抗体 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、インフルエンザウィルスに結合する新規な抗体を提供する。【解決手段】本発明は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインにより表されるアミノ酸配列からなる抗体である：Ｎ−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−Ｃ。ＣＤＲ１はＧＦＴＦＥＲＦＤＭＧ（配列番号：０１）またはＧＲＴＦＧＡＰＹＭＡ（配列番号：０２）により表されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２は、ＲＦＮＳＤＤＧＲＫＳＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号：０３）またはＧＤＳＴＹＹＡＤＳＭＫＮ（配列番号：０４）により表されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３は、ＳＱＡＹＴＳＳＴＤＴＳＳＴＤＡＥＤＲ（配列番号：０５）またはＤＫＷＰＦＴＧＤＶＲＳＡＧＧＹＤＹ（配列番号：０６）により表されるアミノ酸配列からなる。【選択図】なし

Description

本発明は、インフルエンザウィルスに結合する抗体に関する。
特許文献１は、インフルエンザウィルスに結合する抗体を開示している。特許文献１に開示された抗体の少なくとも一部は、アルパカに由来する。特許文献１は、本明細書に参照として援用される。
米国特許出願公開第２０１４／０３０２０６３号明細書
本発明の目的は、インフルエンザウィルスに結合する新規な抗体を提供することである。
本発明は、アミノ酸配列からなる抗体であって、前記アミノ酸配列は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインからなり：
Ｎ − ＦＲ１ − ＣＤＲ１ − ＦＲ２ − ＣＤＲ２ − ＦＲ３ − ＣＤＲ３ − ＦＲ４ − Ｃ
ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
前記ＣＤＲ１はＧＦＴＦＥＲＦＤＭＧ（配列番号：０１）またはＧＲＴＦＧＡＰＹＭＡ（配列番号：０２）により表されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲ２は、ＲＦＮＳＤＤＧＲＫＳＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号：０３）またはＧＤＳＴＹＹＡＤＳＭＫＮ（配列番号：０４）により表されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲ３は、ＳＱＡＹＴＳＳＴＤＴＳＳＴＤＡＥＤＲ（配列番号：０５）またはＤＫＷＰＦＴＧＤＶＲＳＡＧＧＹＤＹ（配列番号：０６）により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
前記抗体は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスに結合可能である。
本発明は、インフルエンザウィルスに結合する新規な抗体を提供する。
図１Ａは、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる様々な遺伝子をライゲーションするために用いられたベクターのマップを示す。 図１Ｂは、図１Ａに示されるベクターマップの詳細を示す。 図２は、ＶＨＨ抗体を発現するために用いられたベクターの合成手順を示す。 図３は、配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体を用いた場合におけるＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図４は、配列番号：１６により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体を用いた場合におけるＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図５は、配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体を含有する溶液の４５０ナノメートルの波長での吸光度測定結果を示すグラフである。 図６は、配列番号：１６により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体を含有する溶液の４５０ナノメートルの波長での吸光度測定結果を示すグラフである。 図７は、配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体およびリコンビナントヘマグルチニン蛋白質の間の相互作用のＳＰＲ測定結果を示すグラフである。 図８は、配列番号：１６により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体およびリコンビナントヘマグルチニン蛋白質の間の相互作用のＳＰＲ測定結果を示すグラフである。
本発明による抗体は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスに結合する。特許文献１にも開示されているように、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスに結合する抗体は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインを含むアミノ酸配列からなる。
Ｎ − ＦＲ１ − ＣＤＲ１ − ＦＲ２ − ＣＤＲ２ − ＦＲ３ − ＣＤＲ３ − ＦＲ４ − Ｃ
ここで、ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示す。
本発明においては、ＣＤＲ１はＧＦＴＦＥＲＦＤＭＧ（配列番号：０１）またはＧＲＴＦＧＡＰＹＭＡ（配列番号：０２）により表されるアミノ酸配列からなる。
本発明においては、ＣＤＲ２は、ＲＦＮＳＤＤＧＲＫＳＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号：０３）またはＧＤＳＴＹＹＡＤＳＭＫＮ（配列番号：０４）により表されるアミノ酸配列からなる。
本発明においては、ＣＤＲ３は、ＳＱＡＹＴＳＳＴＤＴＳＳＴＤＡＥＤＲ（配列番号：０５）またはＤＫＷＰＦＴＧＤＶＲＳＡＧＧＹＤＹ（配列番号：０６）により表されるアミノ酸配列からなる。
望ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：０１、配列番号：０３、および、配列番号：０５により表される。この場合、より望ましくは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４は、それぞれ、EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCVAS（配列番号：０７）、WVRQAPGKSLEWVS（配列番号：０８）、RFAISRDNAENTLYLQMNNLIPEDTATYYCVK（配列番号：０９）、およびGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号：１０）により表されるアミノ酸配列からなる。言い換えれば、本発明による抗体は、以下のアミノ酸配列からなることがより望ましい。
EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCVASGFTFERFDMGWVRQAPGKSLEWVSRFNSDDGRKSYADAVKGRFAISRDNAENTLYLQMNNLIPEDTATYYCVKSQAYTSSTDTSSTDAEDRGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号：１５）
配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなる抗体は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルス以外のインフルエンザウィルスに対して抗原交差反応性を示さない。
あるいは、望ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：０２、配列番号：０４、および、配列番号：０６により表される。この場合、より望ましくは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４は、それぞれ、QVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAA（配列番号：１１）、WFRQAPGKEREFVAGISWS（配列番号：１２）、RFTISRDNAKNTVYLQMNSLNPEDTAVYYCAA（配列番号：１３）および、WGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号：１４）により表されるアミノ酸配列からなる。言い換えれば、本発明による抗体は、以下のアミノ酸配列からなることがより望ましい。
QVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAAGRTFGAPYMAWFRQAPGKEREFVAGISWSGDSTYYADSMKNRFTISRDNAKNTVYLQMNSLNPEDTAVYYCAADKWPFTGDVRSAGGYDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号：１６）
配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなる抗体とは異なり、配列番号：１６により表されるアミノ酸配列からなる抗体は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルス以外のインフルエンザウィルスに対して抗原交差反応性を示す。
（実施例）
（実施例１）
Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスA型に含まれるヘマグルチニン（以下、「HA」という）に結合するＶＨＨ抗体（すなわち、重鎖抗体の重鎖の可変領域）が、以下の手順に従って調製された。
（アルパカへの免疫および単核球の取得）
ＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリを作製するため、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスA型(A/California/04/2009)由来のリコンビナントHA蛋白質（Sino Biologicalから購入、カタログ番号：11055-V08H）を抗原として用いてアルパカが免疫された。
具体的には、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するリコンビナントHA蛋白質が、アルパカへ投与された。１週間後、再度、同じ濃度を有するリコンビナントHA蛋白質が、アルパカへ投与された。このようにして、５週間かけて５回、アルパカはリコンビナントHA蛋白質を用いて免役された。さらに１週間後、アルパカの血液を採取した。次いで、以下のように血液から単核球が取得された。
リンパ球分離チューブ（株式会社グライナージャパンより購入、商品名：Leucosep）に、血球分離溶液（コスモ・バイオ株式会社より購入、商品名：Lymphoprep）が添加された。次いで、溶液は、摂氏20度の温度で1000×gで1分間遠心された。
アルパカから採取された血液は、ヘパリンによって処理された。次に、このように処理された血液に等量のリン酸緩衝生理食塩水（以下、「PBS」という）が添加され、サンプル液を得た。次いで、サンプル液は血球分離溶液が添加されたリンパ球分離チューブに添加された。
リンパ球分離チューブは、摂氏20度の温度で800×gで 30分遠心された。
単核球を含有する画分が回収され、３倍の容量を有するPBSが添加された。画分は、摂氏20度の温度で 300×gで 5分遠心された。沈殿物が、PBSを用いて穏やかに懸濁された。懸濁後、細胞数の測定のために10マイクロリットルの懸濁液が分離された。残りの懸濁液が、摂氏20度の温度で 300×gで 5分間遠心された。
沈殿物に２ミリリットルの容積を有するＲＮＡ保存溶液（商品名：RNAlater）が添加された。次いで、溶液は穏やかに懸濁された。懸濁液が、２本の1.5mLチューブに注入された。各チューブは、１ミリリットルの懸濁液を含んでいた。チューブは、摂氏−２０度の温度下で保存された。細胞数の測定のために分離された懸濁液（５マイクロリットル）が、チュルク液（１５マイクロリットル）と混合され、血球計算盤を用いて単核球の数が数えられた。
（ＶＨＨ抗体のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリの作製）
次に、単核球からTOTAL RNAを抽出し、そしてVHH抗体のcDNA遺伝子ライブラリが以下の手順で作製された。以下の手順では、RNase free gradeの試薬および器具が使用された。
単核球分画に、トータルＲＮＡ抽出試薬（商品名：TRIzol Reagent、１ミリリットル）を加えた。試薬は緩やかに混和され、そして室温にて5分間放置された。クロロホルム（200マイクロリットル）が試薬に加えられ、そして15秒間、試薬は力強く振られた。試薬は、室温で2〜3分間静置された。試薬は、摂氏４度で15分間、12,000xg以下で遠心された。
上清が新しいチューブに移された。RNaseフリー水およびクロロホルム（各２００マイクロリットル）がチューブに加えられた。さらに500ミリリットルのイソプロパノールがチューブに加えられた。チューブに含まれる液体はボルテックスミキサーを用いて撹拌された。液体は室温で10分間静置された。次いで、液体は摂氏４度の温度で15分間、12,000xg以下で遠心された。上清が捨てられ、沈殿物が１ミリリットルの75% エタノールでリンスされた。この溶液は、摂氏４度の温度で５分間、7,500xg以下で遠心された。溶液は乾燥され、全RNAを得た。得られた全RNAは、RNaseフリー水に溶解された。
Total RNAからcDNAを取得するため，逆転写酵素を含むキット（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit）が用いられた。キットに含まれるRandom 6 merおよびOligo dT primerがプライマーとして用いられた。キットの標準プロトコルに従って、cDNAが取得された。
アルパカに含まれるＶＨＨ抗体の遺伝子が、cDNAからＰＣＲ法によって獲得された。ＰＣＲのための酵素はタカラバイオ株式会社よりEx-taqの商品名として入手された。
以下の試薬が混合され、混合液を得た。
10x buffer 5 マイクロリットル
dNTPs 4 マイクロリットル
Primer F 2 マイクロリットル
Primer R 2 マイクロリットル
cDNA template 1 マイクロリットル
Ex-taq 0.25 マイクロリットル
混合液は以下のＰＣＲ法に供された。
まず、混合液は、摂氏９５度で２分間で加熱された。
次いで、混合液の温度は、以下のサイクルに従って変化された。

摂氏９６度で３０秒間
摂氏５２度で３０秒間、そして
摂氏６８度で４０秒間。

このサイクルが３０回繰り返された。
最後に、混合液は、摂氏６８度で４分間加熱した後、摂氏４度で保存された。
このＰＣＲ法においては、以下のプライマーが使用された。
primer 1: 5’- GGTGGTCCTGGCTGC -3’ （配列番号：１７）
primer 2: 5’- ctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggcTSAGKTGCAGCTCGTGGAGTC -3’ （配列番号：１８）
primer 3: 5’- TGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ （配列番号：１９）
primer 4: 5’- TTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ （配列番号：２０）
primer 5: 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ （配列番号：２１）
primer 6: 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgaTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ （配列番号：２２）
(参考文献：Biomed Environ Sci, 2012; 27(2):118-121)
３回のＰＣＲ法が実施された。
１回目のＰＣＲ法では、cDNA、Primer 1 およびPrimer 3からなるプライマーセットＡ、およびcDNA、Primer 1 およびPrimer 4からなるプライマーセットＢが用いられた。
２回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＡを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 3からなるプライマーセットＣ、およびプライマーセットＢを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 4からなるプライマーセットＤが用いられた。
３回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＣを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 5からなるプライマーセットＥ、およびプライマーセットＤを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 6からなるプライマーセットＦが用いられた。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリが形成された。言い換えれば、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリは、プライマーセットＥおよびプライマーセットＦを用いて増幅された遺伝子を含んでいた。
（ファージライブラリの作製）
次に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリから、以下の手順に従ってファージライブラリが作製された。
市販されているプラスミドｐＵＣ１１９（例えば、タカラバイオ株式会社より入手可能）由来のプラスミドＶｅｃｔｏｒ１（４０５７塩基対、図１Ａ参照）が、制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。図１Ａにおける制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）は、GGCCCAGCCGGCC（配列番号：２３）により表される遺伝子配列からなる。制限酵素サイトＳｆｉＩ（ｂ）は、GGCCTCTGCGGCC（配列番号：２４）により表される遺伝子配列からなる。図１Ｂは、プラスミドＶｅｃｔｏｒ１の詳細なベクターマップを示す。
プラスミドＶｅｃｔｏｒ１は、以下の遺伝子配列からなる。
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccAAGCTTCGAAGGAGACAGTCATAatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggagcTCAAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCAGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCGATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTTGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTgtaGGCCtctGCGGCCGCagaGcaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcaTAGggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttagcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtctTAATAAgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgCATATGaAAATTGTAAgcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacaGGGCGCGTcccatATGgtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcga（配列番号：２５）
同様に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリも制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が得られた。
このように処理されたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１が、ＶＨＨ抗体遺伝子断片と、１：２の割合で混合された。混合液に、酵素（東洋紡株式会社より入手、商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２）が注入された。混合液は摂氏１６度の温度下で２時間静置された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がプラスミドＶｅｃｔｏｒ１にライゲーションされた。
このようにしてライゲーションされたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１を用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＨＳＴ０２）がトランスフェクトされた。
次いで、大腸菌は、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するアンピシリンを含有する２ＹＴプレート培地上で１５時間、培養された。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる遺伝子断片から得られるタンパク質を提示するファージのライブラリが得られた。
培養後、２ＹＴプレート培地上に形成されたシングルコロニーの数をカウントすることでライブラリの濃度を算出した。その結果、ライブラリは、２．６ｘ１０＾８個／ミリリットルの濃度を有していた。
（バイオパニング）
ＨＡ蛋白質に特異的に結合するＶＨＨ抗体が、ファージライブラリから以下の手順に従って得られた。
ＶＨＨ抗体を発現したファージの中から、抗原に結合するクローンを抽出するため、２回のバイオパンニングを実施した。
ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片が導入された大腸菌（ＨＳＴ０２）を、吸光度を示す値（OD600）が1.0になるまで摂氏３０度にて１００mLの 2YT AG（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１%グルコースを含有した２ＹＴ培地）の培地中で培養し、大腸菌を増殖させた。
ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を感染多重度（すなわち、ＭＯＩ）がおよそ２０となるよう大腸菌含有培地へ加えた。
その後、培地が３０分ほど摂氏３７度で保温された。次いで、培地を4000rpmの回転数で10分間遠心し、大腸菌を回収した。１００mLの2YTAK培地（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した２ＹＴ培地）中で、摂氏30度で、２１３ｒｐｍにて遠心しながら、大腸菌を一晩培養した。
上記のように培養された大腸菌を含有する培養液（１００ミリリットル）が、２本の遠沈管（容積：５０ミリリットル）に注入された。２つの培養液は、４０００ｒｐｍの回転数で10分間遠心された。次いで、上清（各２０ミリリットル）が回収された。
上清（４０ミリリットル）が、NaCl（２．５Ｍ）を含有する20% PEG溶液（１０ミリリットル）に添加された。次いで、混合液は、転倒混和された。その後、混合液は、およそ１時間氷上にて冷却された。混合液は、４０００ｒｐｍの回転数で10分間遠心された。次いで、上清が除去された。10%グリセロールを含有するPBSが沈殿物に向けて注入された。最後に、沈殿物は、ほぐしながら溶解された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリが得られた。
（ＨＡに特異的に結合するＶＨＨ抗体のスクリーニング）
（Ａ） ＨＡ抗原の固定化
ＨＡをＰＢＳと混合し、ＨＡ溶液を調製した。ＨＡの濃度は１０マイクログラム／ミリリットルであった。ＨＡ溶液（２ミリリットル）が、イムノチューブ（ヌンク社より購入）に注入された。ＨＡ溶液はイムノチューブ内で１時間静置された。このようにして、イムノチューブの内部にＨＡが固定された。
次いで、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。
３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳをイムノチューブに満たした。このようにして、ＨＡが抗原としてイムノチューブの内部にブロッキングされた。
イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。その後、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。
（Ｂ）パニング
ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリ（濃度：およそ１０Ｅ＋１１／ミリリットル）が、３％のスキムミルクを含有した２ミリリットルのＰＢＳと混合され、混合液を調製した。混合液は、ＨＡ抗原が固定化されたイムノチューブに注入された。
イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。
イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。
イムノチューブの内部は、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）で１０回、洗浄された。
イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴにより満たされた。その後、イムノチューブは、１０分間、静置された。次いで、イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴで１０回、洗浄された。
ＨＡ抗原に結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを抽出するために、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）がイムノチューブに注入された。
イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。
溶液を中和するため、溶液は、１ｍＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）を含有するチューブに移した。再度、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）を用いたファージの抽出を繰り返した。このようにして、３ｍＬの抽出液が得られた。
抽出液（１ｍＬ）が、９ｍＬの大腸菌ＨＳＴ０２と混合された。混合液は、摂氏３０度の温度で１時間、静置された。
コロニーを計数するため、大腸菌ＨＳＴ０２を含有する１０マイクロリットルの混合液は、２ＴＹＡ培地を含む小プレート（１０ミリリットル／プレート）にまかれた。
残りの混合液は遠心分離された。上澄み液は捨てられ、かつ沈殿物は２ＴＹＡ培地を含む大プレート（４０ミリリットル／プレート）にまかれた。これらの２つのプレートは、摂氏３０度の温度下にて一晩静置された。このようにして、１回目のパニングが行われた。
１回目のパニングの手順と全く同様に、２回目のパニングが行われた。言い換えれば、パニングが繰り返された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが精製された。
２回目のパニングの後、大腸菌のコロニーが爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされた１つのコロニーは、９６平底プレートの１つのウェルに置かれた。これが繰り返された。１つのウェルは、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＧ培地を含有していた。
ウェル内の溶液が、摂氏３０度で２１３ｒｐｍの回転数で撹拌された。
増殖した大腸菌を含む溶液（５０マイクロリットル）が回収された。回収された溶液は、プレートに含まれる５０マイクロリットルの２ＹＴＡ培地と混合された。２ＹＴＡ培地は、感染多重度ＭＯＩが２０になるようなヘルパーファージを含有していた。溶液は、摂氏３７度の温度で４０分間静置された。
２ＹＴＡ培地を含むプレートは、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。上清が捨てられた。沈殿物が大腸菌を含んでいた。沈殿物は、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＫ培地と混合された。混合液は、摂氏３０度にて一晩静置された。
混合液は、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。大腸菌を含む上清が回収された。
（Ｃ） ＥＬＩＳＡによるファージ提示ＶＨＨ抗体および抗原の定性評価
９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入、商品名：ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するＨＡタンパク質溶液を抗原として添加した。各ウェルにおけるＨＡタンパク質溶液の容積は、５０マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、室温で１時間、放置された。このようにして、ＨＡ抗原が各ウェルに固定された。
各ウェルは、ＰＢＳにより３回、洗浄された。次いで、３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳが各ウェルに注入された（２００マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは、室温で１時間、放置された。このようにして、ＨＡタンパク質が各ウェルでブロックされた。その後、各ウェルは、ＰＢＳで３回、洗浄された。
ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが、各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、ファージはＨＡ抗原と反応した。
各ウェルは、ＰＢＳＴを用いて３回、洗浄された。次に、抗Ｍ１３抗体（ａｂｃａｍ社より入手、商品名：ａｂ５０３７０、１００００倍希釈）が各ウェルに添加された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、各ウェルはＰＢＳＴで３回、洗浄された。
発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手、商品名：1-STEP ULTRA TMB-ELISA）が各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは２分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。
硫酸水溶液（１規定）が５０マイクロリットル／ウェルの濃度で各ウェルに添加され、反応を停止させた。
４５０ナノメートルの波長での溶液の吸光度が測定された。
良好な吸光度測定の結果を有する６つのウェルが選択された。選択された６つのウェルに含有されるファージに含まれるＤＮＡ配列が、グライナー社により解析された。ＤＮＡ配列の解析結果は、以下のとおりである。以下の２つのＤＮＡ配列が見いだされた。

GAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTTGTGCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACGTTCGAGCGTTTTGACATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAAAGCCTCGAGTGGGTCTCGCGTTTTAATAGTGATGATGGTCGAAAAAGTTATGCGGACGCCGTGAAGGGCCGATTCGCCATTTCCAGAGACAACGCCGAAAACACGCTATATCTACAAATGAACAATCTGATACCTGAAGACACGGCCACTTATTATTGTGTGAAGTCTCAAGCTTACACATCTTCTACTGATACATCTTCTACTGATGCCGAAGACAGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC（配列番号：２６）

CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCGCTGGACGCACCTTCGGTGCACCTTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATTTGTAGCAGGTATATCTTGGAGTGGTGATAGCACATACTATGCAGACTCCATGAAGAACCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTAAACCCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCGGATAAGTGGCCCTTTACCGGTGATGTGCGGTCCGCGGGGGGGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC（配列番号：２７）
配列番号：２６により表されるＤＮＡ配列から合成される蛋白質は、以下のアミノ酸配列からなる。
EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCVASGFTFERFDMGWVRQAPGKSLEWVSRFNSDDGRKSYADAVKGRFAISRDNAENTLYLQMNNLIPEDTATYYCVKSQAYTSSTDTSSTDAEDRGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号：１５）
配列番号：２７により表されるＤＮＡ配列から合成される蛋白質は、以下のアミノ酸配列からなる。
QVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAAGRTFGAPYMAWFRQAPGKEREFVAGISWSGDSTYYADSMKNRFTISRDNAKNTVYLQMNSLNPEDTAVYYCAADKWPFTGDVRSAGGYDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号：１６）
（抗Ｈ１Ｎ１ ＶＨＨ抗体の発現）
ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）がＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より購入された。Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、ＰＣＲ法で３ｘＦｌａｇタグおよび２つの制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）（ｂ）がベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に付加された。図２を参照せよ。図２に示される手順が、以下、詳細に説明される。
まず、以下２つのプライマーおよび制限酵素（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて、ＰＣＲ法により、制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）が、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に付加された。
Primer 1: 5’- GCCGGCTGGGCcGCGAGGAGCAGCAGACCA -3’ （配列番号：２８）
Primer 2: 5’- GCCCAGCCGGCcATGGCCATGGATATCGGA -3’ （配列番号：２９）
次に、以下２つのプライマーおよび制限酵素（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて、ＰＣＲ法により、５’末端側および３’末端側にそれぞれ制限酵素サイトＢａｍｈＩおよびＸｈｏＩを有する３ｘＦｌａｇタグＤＮＡ断片が作製された。
Primer 1: 5’- CATGGATATCGGAATTAATTCggatccGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCctcgagCACCACCACCACCACCACTGA -3’ （配列番号：３０）

Primer 2: 5’- TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGctcgagGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCggatccGAATTAATTCCGATATCCATG -3’ （配列番号：３１）
２つの制限酵素ＢａｍｈＩおよびＸｈｏＩ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、この３ｘＦｌａｇタグＤＮＡ断片およびベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が処理された。
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、３ｘＦｔａｇタグＤＮＡ断片が、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）にライゲーションされた。このようにして、３ｘＦｌａｇタグおよび制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）が付加されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が得られた。
以下２つのプライマーおよび制限酵素（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて、ＰＣＲ法により、５’末端側および３’末端側にそれぞれ制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＢａｍｈＩを有するＤＮＡ断片が作製された。
Primer 1: 5’- AAATACCTGCTGCCGccatggATATCGGAATTAATTCggcctctgcggccGCAggatccGACTACAAAGACCAT-3’ （配列番号：３２）
Primer 2: 5’- ATGGTCTTTGTAGTCggatccTGCggccgcagaggccGAATTAATTCCGATATccatggCGGCAGCAGGTATTT-3’ （配列番号：３３）
次に、２つの制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍｈＩ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、このＤＮＡ断片およびベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が処理された。
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、このＤＮＡ断片がベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）にライゲーションされた。このようにして、３ｘＦｌａｇタグおよび制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）（ｂ）が付加されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が得られた。
ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）のシーケンスがグライナー社により解析された。シーケンスの解析のために、一般的なＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒセットが用いられた。
シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が選択された。
ＰＣＲ法により得られた液体に含まれるベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が、ＤＮＡ抽出キット（プロメガ社より入手）を用いて、５０マイクロリットルの蒸留水中で精製かつ回収された。このようにして回収されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が、ＳｆｉＩ制限酵素により処理された。
一方、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１が、ＳｆｉＩ制限酵素で処理された。このようにして、それぞれ配列番号：１５および配列番号１６により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の２つのＤＮＡ（配列番号：３４および配列番号：３５）が得られた。

5’-GGCCCAGCCGGCCATGGCTGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTTGTGCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACGTTCGAGCGTTTTGACATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAAAGCCTCGAGTGGGTCTCGCGTTTTAATAGTGATGATGGTCGAAAAAGTTATGCGGACGCCGTGAAGGGCCGATTCGCCATTTCCAGAGACAACGCCGAAAACACGCTATATCTACAAATGAACAATCTGATACCTGAAGACACGGCCACTTATTATTGTGTGAAGTCTCAAGCTTACACATCTTCTACTGATACATCTTCTACTGATGCCGAAGACAGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTGCGGCC-3’（配列番号：３４）
5’-GGCCCAGCCGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCGCTGGACGCACCTTCGGTGCACCTTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATTTGTAGCAGGTATATCTTGGAGTGGTGATAGCACATACTATGCAGACTCCATGAAGAACCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTAAACCCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCGGATAAGTGGCCCTTTACCGGTGATGTGCGGTCCGCGGGGGGGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTGCGGCC-3’ （配列番号：３５）
これらの２つのＤＮＡは、ＳｆｉＩ制限酵素により処理された。次に、このようにして処理されたＤＮＡが、電気泳動法により回収された。回収されたＤＮＡ（配列番号：３６および配列番号：３７）は、ＳｆｉＩ制限酵素により処理されたプラスミドに、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ株式会社より入手）を用いてライゲーションされた。

5’-CGGCCATGGCTGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTTGTGCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACGTTCGAGCGTTTTGACATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAAAGCCTCGAGTGGGTCTCGCGTTTTAATAGTGATGATGGTCGAAAAAGTTATGCGGACGCCGTGAAGGGCCGATTCGCCATTTCCAGAGACAACGCCGAAAACACGCTATATCTACAAATGAACAATCTGATACCTGAAGACACGGCCACTTATTATTGTGTGAAGTCTCAAGCTTACACATCTTCTACTGATACATCTTCTACTGATGCCGAAGACAGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTG-3’ （配列番号：３６）

5’-CGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCGCTGGACGCACCTTCGGTGCACCTTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATTTGTAGCAGGTATATCTTGGAGTGGTGATAGCACATACTATGCAGACTCCATGAAGAACCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTAAACCCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCGGATAAGTGGCCCTTTACCGGTGATGTGCGGTCCGCGGGGGGGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTG-3’ （配列番号：３７）
ライゲーション溶液（２．５マイクロリットル）および大腸菌ＤＨ５α（ニッポンジーンより入手、２５マイクロリットル）が氷上にて混合された。混合液は、６分間、氷上にて静置された。次いで、混合液は、摂氏４２度で４５秒間加熱された。最後に、混合液は、１分間、氷上で静置された。この手順は、一般的なヒートショック法として知られている。
全量の混合液が、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度でアンピシリンを含有するＬＢＡ培地上に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度で一晩静置された。
ＬＢＡ培地上に形成されたコロニーの中から、３つのコロニーが選択された。選択された３つのコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）で一晩培養された。
培養された大腸菌に含まれるプラスミドは、プラスミド抽出キット（株式会社キアゲンより入手、商品名：ＱＩＡｐｒｅｐｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いて、ＬＢＡ培地から抽出された。目的のＶＨＨ抗体の遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認するため、プラスミドの配列がグライナー社によって解析された。シーケンスの解析のために、一般的なＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒセットが用いられた。
シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたプラスミドが選択された。
選択されたプラスミドを用いて、大腸菌（Competent Cell BL21 (DE3) pLysS, ライフ テクノロロジーズ社より入手）がヒートショック法によりトランフェクトされた。
トランスフェクトされた大腸菌を含有する溶液に、ＳＯＣ培地（５０マイクロリットル）が添加された。次いで、大腸菌は、２１３ｒｐｍで振とうされながら、摂氏３７度で１時間、回復培養された。
次いで、大腸菌溶液が回収された。回収された大腸菌溶液（５ミリリットル）は、ＬＢＡ培地に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度の温度で一晩、静置された。
ＬＢＡ培地内に形成されたコロニーの中から、１つのコロニーが選択された。選択されたコロニーは、爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされたコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）中で、２１３ｒｐｍで振とうされながら摂氏３７度の温度で培養された。このようにして、培養液を得た。
さらに、培養液（２５ミリリットル）はＬＢＡ培地（５００ミリリットル）に混合された。６００ナノメートルの波長での混合液の吸光度が０．５になるまで、混合液は摂氏３７度の温度で１６０ｒｐｍで振とうされた。
吸光度が０．５となったのち、イソプロピルチオガラクトシド溶液が混合液に添加された。ＩＰＴＧ溶液の最終濃度は１ｍＭであった。混合液に含有される大腸菌は、摂氏３７度で６時間、培養された。培養された大腸菌を回収するため、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、摂氏４度で遠心された。
回収された大腸菌は、１０倍の容量を有するＰＢＳに混合された。混合液は、ボルテックスミキサーを用いて撹拌された。このようにして、大腸菌が洗浄された。次いで、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、摂氏４度で遠心され、大腸菌を回収した。回収された大腸菌は、再度、１０倍の容量を有するＰＢＳに混合された。混合液に含有される大腸菌は、超音波を用いて破砕された。
大腸菌を含む破砕液は、１００００ｒｐｍで１５分間、摂氏４度で遠心された。上清が回収された。回収された上清は、０．４５マイクロメートルフィルタを用いて濾過された。
濾液は、Ｈｉｓ−ｔｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて推奨プロトコルに従って精製された。精製時には、１ミリリットルの濾液のために３マイクロリットルの全量を有する溶出バッファが用いられた。濾液に含有される緩衝液が、ＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて、ＰＢＳに置換された。置換時には、１ミリリットルの濾液のために２．５マイクロリットルの全量を有するＰＢＳが用いられた。このようにして、抗Ｈ１Ｎ１抗体を含有する溶液が得られた。
このようにして得られた溶液に含有される抗Ｈ１Ｎ１抗体は、吸光度計（スクラム社より入手、商品名：ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて、２８０ナノメートルでの波長での吸収測定値に基づいて定量された。その結果、抗Ｈ１Ｎ１抗体の濃度は４ミリグラム／ミリリットルであった。
（Ｄ−１） リコンビナントＨＡを用いた抗Ｈ１Ｎ１抗体の表面プラズモン共鳴評価
リコンビナントＨＡおよび表面プラズモン共鳴評価装置を用いて、抗Ｈ１Ｎ１抗体が以下のように評価された。表面プラズモン共鳴（以下、「ＳＰＲ」という）の詳細は以下の通りである。
ＳＰＲ評価装置：Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化バッファ：ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
ランニングバッファ：ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
センサチップ：ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化用試薬：N-ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）およびエチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド（ＥＤＣ）
ＨＡ：インフルエンザウィルス亜型Ｈ１Ｎ１由来のリコンビナントヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社より入手、商品名：１１０５５−Ｖ０８Ｈ）
ＨＡは、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００のコントロールソフトウェアに含まれているウィザードに従って固定化された。ＨＡの固定化のためには、５．０のｐＨを有する酢酸溶液が用いられた。酢酸溶液は、１マイクログラム／ミリリットルの濃度を有していた。固定化量は、２５０ＲＵにセットされた。
被分析物として、配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなる抗Ｈ１Ｎ１抗体が用いられた。１回目〜４回目の分析において、ランニングバッファに含有される抗Ｈ１Ｎ１抗体の濃度は、それぞれ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、および１２．５ｎＭに調整された。図３は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。その結果、解離定数Ｋｄは、４．９５ｎＭであった。
被分析物として、配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなる抗Ｈ１Ｎ１抗体に代えて、配列番号：１６により表されるアミノ酸配列からなる抗Ｈ１Ｎ１抗体が用いられたこと以外は、同様の実験が行われた。図４は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄは、１．５３ｎＭであった。
（Ｄ−２） 抗Ｈ１Ｎ１抗体のＥＬＩＳＡ評価
次に、配列番号：１５または配列番号：１６により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体のＨＡ蛋白質への結合能力がＥＬＩＳＡ測定法により評価された。
配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体を５マイクログラム／ミリリットルの濃度で含有する溶液が用意された。以下、この溶液を「溶液Ａ」という。溶液Ａは、３％スキムミルクを含有するＰＢＳで４倍に希釈された。このようにして、希釈液Ｂが得られた。希釈液Ｂの一部が、３％スキムミルクを含有するＰＢＳで４倍に再度、希釈された。このようにして、希釈液Ｃが得られた。これが繰り返され、希釈液Ｃ〜希釈液Ｇが得られた。
Influenza A ウィルス型H1N1（ｓｔｒａｉｎ Ａ／Ｎａｒｉｔａ／１／２００９（Ｈ１Ｎ１）、北海道大獣医学部より入手）が、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘと混合された。ウィルスの最終濃度は２０マイクログラム／ミリリットルであった。このようにして、ウィルスを含有する溶液が得られた。さらに、この溶液は４倍に希釈された。
９６ウェルプレート（Maxisorp, Nunc）のウェルに、ウィルスを含有する溶液（濃度：５マイクログラム／ミリリットル）が注入された。各ウェルは、５０マイクロリットルの溶液を含んでいた。９６ウェルプレートは、室温で２時間静置され、ウィルスをウェル内に固定化した。
０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳの容量は、２００マイクロリットルであった。これが２回、繰り返された。
３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳが、各ウェルに注入され、ウィルスをブロックした。各ウェルに注入されたＰＢＳの容量は、２００マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、室温にて１時間、静置された。
０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳの容量は、２００マイクロリットルであった。これが２回、繰り返された。
希釈液Ｂ〜希釈液Ｇが、各ウェルに注入された。各ウェルに注入された溶液の容量は５０マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、室温にて静置された。これにより、希釈液Ｂ〜希釈液Ｇに含有されるＶＨＨ抗体は、ウェルに含まれるウィルスのＨＡタンパクに結合した。９６ウェルプレートは、室温にて１時間、静置された。
０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳの容量は、２００マイクロリットルであった。これが２回、繰り返された。９６ウェルプレートは、室温にて１時間、静置された。
標識抗体（SIGMA ALDRICH社より入手、商品名：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ＨＲＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ）がPBSで１００００倍に希釈された。このようにして希釈された標識抗体が、各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、暗所にて１時間静置された。
０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳの容量は、２００マイクロリットルであった。これが２回、繰り返された。９６ウェルプレートは、室温にて１時間、静置された。
発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手、商品名：1-STEP ULTRA TMB-ELISA）が各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは３０分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。
硫酸水溶液（１規定）が５０マイクロリットル／ウェルの濃度で各ウェルに添加され、反応を停止させた。
４５０ナノメートルの波長での溶液の吸光度が測定された。図５は、配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の測定結果を示すグラフである。図６は、配列番号：１６により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の測定結果を示すグラフである。
（Ｄ−３） 他のインフルエンザウィルス亜型に対する交差性の評価
配列番号：１５（または配列番号：１６）により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体のＡ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９由来のリコンビナントヘマグルチニン蛋白質（すなわち、ＨＡ）に対する結合能力を評価するため、上述のＳＰＲ評価装置が用いられた。
インフルエンザウィルス亜型Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９由来のリコンビナントヘマグルチニン蛋白質は、それぞれ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社より商品名４０３５４−Ｖ０８Ｈ１、４０１６０−Ｖ０８Ｈ１、および４０１０４−Ｖ０８Ｈ１として入手した。ヘマグルチニン蛋白質の固定化量は、およそ２００ＲＵに設定された。
ＳＰＲ測定装置を用いて、ＶＨＨ抗体（濃度：１００ｎＭ）およびリコンビナントヘマグルチニン蛋白質の間の相互作用が測定された。図７は、配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の測定結果を示すグラフである。図８は、配列番号：１６により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体の測定結果を示すグラフである。図７および図８において、縦軸は、固定化された抗原に結合したＶＨＨ抗体の量を表している。
図７から理解されるように、配列番号：１５により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体は、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９由来のリコンビナントヘマグルチニン蛋白質に対して低い交差性を有する。一方、図８から理解されるように、配列番号：１６により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体は、Ａ型インフルエンザウィルス亜型Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９由来のリコンビナントヘマグルチニン蛋白質に対して比較的高い交差性を有する。
本発明は、インフルエンザウィルスに結合する新規な抗体を提供する。

Claims (5)

  1. アミノ酸配列からなる抗体であって、前記アミノ酸配列は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインからなり：
    Ｎ − ＦＲ１ − ＣＤＲ１ − ＦＲ２ − ＣＤＲ２ − ＦＲ３ − ＣＤＲ３ − ＦＲ４ − Ｃ
    ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
    前記ＣＤＲ１はＧＦＴＦＥＲＦＤＭＧ（配列番号：０１）またはＧＲＴＦＧＡＰＹＭＡ（配列番号：０２）により表されるアミノ酸配列からなり、
    前記ＣＤＲ２は、ＲＦＮＳＤＤＧＲＫＳＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号：０３）またはＧＤＳＴＹＹＡＤＳＭＫＮ（配列番号：０４）により表されるアミノ酸配列からなり、
    前記ＣＤＲ３は、ＳＱＡＹＴＳＳＴＤＴＳＳＴＤＡＥＤＲ（配列番号：０５）またはＤＫＷＰＦＴＧＤＶＲＳＡＧＧＹＤＹ（配列番号：０６）により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
    前記抗体は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスに結合可能である。
  2. 請求項１に記載の抗体であって、
    前記ＣＤＲ１は、GFTFERFDMG（配列番号：０１）により表されるアミノ酸配列からなり、
    前記ＣＤＲ２は、RFNSDDGRKSYADAVKG（配列番号：０３）により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
    前記ＣＤＲ３は、SQAYTSSTDTSSTDAEDR（配列番号：０５）により表されるアミノ酸配列からなる。
  3. 請求項２に記載の抗体であって、
    前記ＦＲ１は、EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCVAS（配列番号：０７）により表されるアミノ酸配列からなり、
    前記ＦＲ２は、WVRQAPGKSLEWVS（配列番号：０８）により表されるアミノ酸配列からなり、
    前記ＦＲ３は、RFAISRDNAENTLYLQMNNLIPEDTATYYCVK（配列番号：０９）により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
    前記ＦＲ４は、GQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号：１０）により表されるアミノ酸配列からなる。
  4. 請求項１に記載の抗体であって、
    前記ＣＤＲ１は、ＧＲＴＦＧＡＰＹＭＡ（配列番号：０２）により表されるアミノ酸配列からなり、
    前記ＣＤＲ２は、ＧＤＳＴＹＹＡＤＳＭＫＮ（配列番号：０４）により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
    前記ＣＤＲ３は、ＤＫＷＰＦＴＧＤＶＲＳＡＧＧＹＤＹ（配列番号：０６）により表されるアミノ酸配列からなる。
  5. 請求項４に記載の抗体であって、
    前記ＦＲ１は、QVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAA（配列番号：１１）により表されるアミノ酸配列からなり、
    前記ＦＲ２は、WFRQAPGKEREFVAGISWS（配列番号：１２）により表されるアミノ酸配列からなり、
    前記ＦＲ３は、RFTISRDNAKNTVYLQMNSLNPEDTAVYYCAA（配列番号：１３）により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
    前記ＦＲ４は、WGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号：１４）により表されるアミノ酸配列からなる。
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