JPH02496A

JPH02496A - モノクローナル抗体、製法、及び利用法

Info

Publication number: JPH02496A
Application number: JP32748588A
Authority: JP
Inventors: Junichi Yano; 純一矢野; Isaaki Kawakatsu; 川勝　一左哲
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1987-12-24
Filing date: 1988-12-23
Publication date: 1990-01-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】【産業上の利用分野】

本発明は、新規なモノクローナル抗体に関し、更に詳し
くは、本発明は細胞膜周辺に存在し情報の伝達系に関与
しているとされる膜蛋白質（メンブレン　サイトスケル
トン　プロティン）の一定部位を認識することによって
医薬品としての優れた有用性を有するモノクローナル抗
体に関する。近年、分子生物学的手法の飛躍的な発達により、従来は
全く別の機能を担うとされていた情報伝達系と細胞骨格
系とが、密接に関与していることが判ってきた。その中でも、膜蛋白質（メンブレン　サイトスケルトン
　プロティン）と称される一群の蛋白質は、細胞表面の
受容体（リセブター）が細胞外からの生理的刺激を一定
の化学的情報に変換した後に細胞内部にその情報を伝え
る最初の担体として機能することが、多くの研究によっ
て解明されるようになった。上記した膜蛋白質のうちでも、３６．０００程度の分子
量を有する蛋白質群は、３６に蛋白質群（本明細書にお
いて「３６にファミリー」という）と呼ばれ、癌化、炎
症、免疫等の情報の伝達に関与する多機能を有する独特
の蛋白質であることが判っている。３６にファミリーと総称される蛋白質は、同じ細胞内蛋
白質であるアクチン、フォトリン等の周辺の蛋白質とと
もに、脂質（リピド）、カルシウムに依存して相互作用
を行っていると考えられる。３６にファミＩＪ−については種々の研究が進んでおり
、カルバクチン１　　［Ｃａ１ｐａｃｔｉｎ　１゜この
ものは、リボコルチン２　　（ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ　
２）とも呼ばれる］、カルバクチン２　［Ｃａ１ｐａｃ
ｔｉｎ　２゜このものは、リポコルチンｌ　　（Ｉｉｐ
ｏｃｏｒｔｉｎｌ）とも呼ばれる〕等は、その存在とと
もに一次構造が明らかにされている［Ｃｅ１ｌ　　４６
．２０１〜２１２　（１９８６）、Ｃｅ１１４６、　＋
９１−１９９　（１９８６）、〕。更に、Ｉ　ＢＣ［Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｂｌｏｏ
ｄ　ｃｏａｇｕｌａ−ｔｉｏｎ〕と呼ばれる蛋白質につ
いても、その−次構造が明らかにされている［Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　　（Ｔｏｋｙｏ）１０２、１２６１〜
１２７３．　　（１９８７）］またこれら以外の３６に
ファミリーに属する蛋白質についても、その存在が示唆
されており、この３６にファミＩＪ−の細胞生理学上の
機能分担と、各疾病における関与を解明することが期待
されていた。３６にファミリーと癌化との関係については既に報告が
あり［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、７
６　５２１２〜５２１６　（１９７９）　）　、発癌遺
伝子を持つウィルスにより癌化した培養細胞において、
そのチロシン残基へのリン酸化導入が顕著に増加するこ
とが明らかにされている。この研究で観察されているの
は上記カルバクチンＩであると考えられるが、癌化にお
けるリン酸化の増加が細胞の無限増殖をどのように誘導
するか等は、未だ解明されてはいない。炎症の生理学的意義と３６にファミリーとの関係につい
ても研究されている。生体内において炎症を伝達する化学物質であるプロスタ
グランジン、ロイコトリエン、ＰＡＦ等は炎症部位にお
いてフォスフオライベース＾２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐ
ａｓｅ　Ａ２）によって細胞膜から遊離される。従来、
リポモジュリン（Ｉｉｐｏｍｏｄｕｌｉｎ）　、マクロ
コルチン（ｍａｃｒｏｃｏｒｔｉｎ）　、レノコルチン
（ｒｅｎｏｃｏｒｔｉｎ）等と呼ばれていた抗炎症性蛋
白質が３６にファミリーの一員であることが明らかとな
り、上記したフオスフォライベースＡ、を阻害すること
によってその抗炎症作用を発現していることが確認され
ている。このフォスフナライベースＡ２阻害作用は、３６にファ
ミリーに属する蛋白質であってこれまでに知られている
すべてのものが有する性質である。またこの作用は、リ
ン酸化によって喪失することも判明している。免疫の生理学的作用機作と３６にファミリーとの関係に
ついても研究がなされている。サプレッサーＴ細胞やマクロファージ等が産生ずるグリ
コシレージョン　インヒビティング　ファクター（Ｇｆ
Ｆ）が３６にファミリーの一員であることが明らかにさ
れＣＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。８３、１６０〜１６４　（１９８６））　、アレルギー
、りニーマチ等の免疫性疾患との関係が今後の研究課題
となっている。また、カルエレクトリン、クロモビンデイン、カルシメ
ジン、エンドネクシン、アネクシン等と呼ばれる細胞内
蛋白質も、３６にファミリーに属するものであると考え
られ、生理学的には更に多様な情報伝達に関与している
ものと推察することができる。叙上のように、３６にファミリーと総称される細胞蛋白
質群は、生理学上極めて意義の大きい物質群であり、こ
れらを同定し定量することは優れた医薬品開発に直接関
係する極めて重要な研究課題であった。

【従来の技術】

上記したように、３６にファミリーに属する蛋白質を同
定し又は定量する手法を確立することは、医薬品開発上
極めて重要である。ところで、機能分担が予測される構造類似の蛋白質群を
分離し同定する手段としては、これまで以下のようなも
のを考えることができた。 ■ＤＮＡプローブを用いてＤＮＡ配列を認識することに
よって、間接的に当該蛋白質を同定する方法。 ■モノクローナル抗体（以下ｒＭｂＪともいう）を取得
することにより、いわゆる抗原抗体反応によって当該蛋
白質を認識する方法。Ｍｂを利用する方法は、発現された蛋白質に直接結合し
、各々が唯一の抗原決定基を認識するところから、理想
的な解析手段と考えられる。３６にファミリーのうちヒトカルバクチン１に対するＭ
ｂは、従来より知られていたＣ　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ。Ｂｉｏｌ、　　６．２７４５〜２７５１　（１９８６）
　］　、しかしながら、この方法では粗精製の蛋白質を
用いて免疫をしていたため、Ｍｂが当該蛋白質のいずこ
の部位（ｓｉｔｅ）を認識しているのかが不明であった
ため、特定の機能を検査しつる抗体としては不適当であ
った。またウサギリポモジュリンに対するＭｂも知られていた
がＣＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１３２．１２８６〜１
２９３　（１９８４）〕、上記と同様に当該蛋白質中の
認識部位が不明確であったために同様の問題が残ってい
た。

【発明が解決しようとする課題】

カルバクチン１、カルバクチン２の遺伝子配列を探って
みると、これらの蛋白質のアミノ酸配列においては、い
ずれも互いに類似性のある４つの領域（ｄｏｍａｉｎ）
の繰り返し構造を有し、かつそのＮ末端（アミノ基を有
する末端）からの一定の領域（本明細書において「Ｎ末
端領域」という）のみが、互いに異なる構造を有するこ
とが判った。このＮ末端領域には、チロシン特異的リン酸化酵素、Ｃ
−キナーゼによるリン酸化部位、リピドの修飾が予想さ
れる部位、プロテアーゼにより加水分解される部位等が
集中している。以上のことから、３６にファミリーに属する蛋白質群の
うち、構造上類似性のないＮ末端領域が、各蛋白質に特
徴的な機能をになっていることが容易に予測することが
できた。そこで、そのようなＮ末端領域を特異的に認識すること
ができるＭｂが取得できれば、■３６にファミリーに属
する蛋白質の疾病に対する作用機作を解明することがで
きるし、また■３６にファミリーに属する蛋白質相互間
での交差反応の可能性も否定した同定をすることができ
ることとなる。このようなことから、本発明者らは、上記Ｎ末端領域を
特異的に認識することができるＭｂを取得することを目
的として種々研究を重ねた結果、ついに本発明に到達し
たものである。

【課題を解決するための手段】

本発明においては、まず上記Ｎ末端領域のうち機能部位
抗原性から考えて最適なペプチドを化学的に合成する。このためにまず、３６にファミリーのＤＮＡ塩基配列か
ら予想されるアミノ酸配列を用いるホモロジー検索等に
よるコンピューター解析の手法により抗原性を予測し、
種々のペプチドを化学的に合成する。ここで免疫に用いるペプチドは、適当なプロテアーゼ分
解酵素の切断位置が存在する場合には、精製した３６に
ファミリー蛋白質より精製することもできる。本発明においては、抗原性を高めるために、上記のよう
にして取得したペプチドを、適当なキャリア（ｃａｒｒ
ｉｅｒ）　、例えばキーホール　リムベットヘモシアニ
ン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎ
ｉｎ）等に結合させて免疫することができる。また、目的によっては、３６にファミリー蛋白質のＮ末
端領域の遺伝子配列を大腸菌プラスミドの、例えば、β
−ガラクトシダーゼの部分に結合し、融合蛋白質として
発現したものを精製して用いることもできる。ペプチドとキャリアの結合反応には、適当な化学試薬、
例えば、ゲルタールアルデヒド、カルボジイミド、ＭＢ
Ｓ　　（Ｎ−（ｍ−７レイミドベンゾイルオキシ）スク
シンイミド）等を用いることができる。以下に、このようにして得られたものを抗原として用い
、本発明に係るＭｂを取得する方法について述べる。まず免疫化細胞の調製について説明する。これは動物の体内に抗原を投与し、その動物の細胞を取
得することによって得ることができるものである。当該動物としては、例えば、マウス等のこれまで常法と
して実験に供されてきた動物を使用することができる。抗原は腹腔内等に投与することが望ましい。投与は、常
法により７０インドのコンプリードアシュバンドに混合
して投与するのが適当であるが、本発明においては投与
後数週間の間隔で数回投与を繰り返すことが好ましい。投与間隔は、２週間で充分であるし、投与回数は２〜４
回が好ましい。その後、当該動物を層殺し、例えば、膵臓等の臓器を摘
出し、常法に従って細胞を得る。次に免疫化細胞に増殖機能を付与するための骨髄腫細胞
との細胞融合について述べる。ここに用いる骨髄細胞は、例えば、５Ｐ２１０−へｇ１
４株等を、例えば、Ｆｅ２　（牛脂住血ａ）を含む培地
で培養し、望ましくは対数増殖期にある細胞を用いる。細胞融合の方法は、免疫化細胞と骨髄腫細胞を細胞数の
比で１：１〜ｌＱ：ｌの範囲で混合し、ポリエチレング
リコール等の融合剤又は電気刺激等の方法を用いること
ができる。融合後の細胞は、直ちに又は通常培地での前培養後、ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを加えたいわ
ゆるＨＡＴ培地で培養することにより、免疫化細胞と骨
髄腫細胞の組み合わせで融合した細胞のみを選択するこ
とができる。本発明においては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ法）等によって抗体価を！認しつつ抗体産生細胞の選
別を行うことができる。抗体価を確認することができた細胞は、限外希釈法、軟
寒天法等の常法に従って、ウェル（Ｗｅｌｌ）プレート
及びシャーレによる培養を繰り返し、このあいだに抗体
産生能、産生抗体の免疫化学的試験、抗原特異性試験等
を行うことによって選別することができる。また、マイ
クロマニュビニレーター又はセルソーターを用いて選別
することもできる。本発明に係る細胞は、通常の状態において継続的に本発
明に係るＭｂを産生ずることができる。従って、本発明に係るＭｂを利用するときは、本発明に
係る細胞の培養液の土浦液を直接そのまま本発明に係る
Ｍｂ溶液として利用することができる。また、本発明に係るＭｂは、例えばマウス等の通常実験
に供される動物体内に（例えば腹腔内に）、抗体産生細
胞を投与し、例えば腹水等の動物体液を採取することに
よっても生産することができる。本発明に係る細胞の培養液又は腹水より本発明に係るＭ
ｂを精製取得するためには、例えば、硫安沈澱、イオン
交換クロマトグラフィー等の方法によって取得すること
ができる。こうして取得したＭｂは、例えば各種の緩衝液、必要に
応じて塩、更にはアジド等を添加することにより、又は
凍結乾燥等の方法により安定した物質として保存するこ
とができる。これらの抗体のイミュノグロプリン各クラスの同定は、
クラス特異性抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により行うこと
ができる。このようにして得られた３６にファミリーの各Ｎ末端領
域を認識することができるＭｂは、以下の免疫生化学的
手法により、３６にファミＩＪ−に属する各蛋白質に特
異的に結合することを確認することができる。本発明に係るＭｂを用い、ウェスタン・プロッティング
の手法を適用する同定方法について説明する。この手法は、生物由来検体中の当該ペプチドの同定及び
定量に応用することができる。即ち、当該ペプチド又は
当該ペプチドを含む生物由来の検体を、常法に従って、
５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画した後
、ナイロンメンプラン又はニトロセルロースノンプラン
にプロッティングする。メンプラン上に移行したペプチ
ドとＭｂとを結合させ、ついで、ｆｆ５５又はＩ２５（
でＪＨＪしたプロティンＡ　（ｐｒｏｔｅＩｎ　Ａ）と
結合させる。このとき、過剰のＭｂとプロティンΔは、
そのつど充分に洗浄により除去しておく。これにより、用いたＭｂの特異性に応じて当該ペプチド
の位置に、その量に応じたｓｓ３又は２５■が存在する
ことになり、メンプラン上の′Ｓ又は＋２５１をＲ１ス
キャナー又はオートラジオグラフィーで検出することで
ペプチドの同定と定ｑを行うことができる。次に、ＲＩＰ（ラジオイミュノプレシビテイション）の
手法を適用することを特徴とする当該ペプチドの同定方
法について述べる。ＲＩＰにおいては、例えば、３ＳＳ等で標識したメチオ
ニン等を含む培養液中で、検体となる細胞を培養するこ
とによって検体となる細胞に取り込ませる。その後、可
溶化のための緩衝液を加えた後、可溶化物（Ｉｙｓａｔ
ｅ）を取得する。そして、本発明に係るＭｂを加えて混
合することにより抗原抗体反応を完結させる。その後常法に従い、プロティンＡ−セファロース等を加
えた後、遠心分離と緩衝液による洗浄を繰り返して、本
発明に係るペプチド以外の混在物を取り除く。その後、
常法に従って電気泳動を行い、ラジオアイソトープの検
出を行う。検体細胞に当該ペプチドが存在すれば、用い
たＭｂの特異性に応じたバンドが現れることとなる。次にイミュノサイトケミストリーの手法を適用すること
を特徴とする生物中の当該ペプチドの検出方法について
説明する。培養細胞の場合は、フォルムアルデヒド−リン酸緩衝液
（ＰＢＳ）溶液等の適切な固定液で固定し、必要に応じ
てトリトン処理を行い、試料とすることができる。これ
らの試料に、本発明に係るＭｂを加えて抗原抗体反応を
完結させた後、リン酸緩衝液で充分に洗浄する。二次抗
体としてビオチン結合−抗イミュノグロプリンを反応さ
せた後、充分に洗浄する。ここに生じたペプチド−Ｍｂ
−ビオチン結合二次抗体の複合物に蛍光標識したアビジ
ンを反応させ、その蛍光を蛍光顕微鏡で観察することに
より細胞中のペプチドを検出することができる。病理組織の場合には、ホルマリンその他の適切な固定液
で固定し切片としたもの、又は凍結は切片をホルムアル
デヒド固定したもの等を、必要に応じて界面活性剤等の
処理を行った標本を試料として同様の操作によりイミユ
ノサイトケミストリ−を行うことができる。

【発明の効果】

本発明により、３６にファミリー内の各蛋白質のＮ末端
領域を特異的に認識することができるＭｂの取得が可能
となった。これらに、上に詳述したウェスタン・プロッ
ティング、イミュノサイトケミス）　ＩＪ−等の免疫生
化学的手法を応用することにより３６にファミリーに属
する各蛋白質を、微量な存在量であっても判別すること
が可能となった。このことは、当該各蛋白質の機能分担、各組織での存在
比、分布状態（プロセッシング、リン酸化）等を追跡す
る画期的な方法を獲得したことを意味する。また、当該Ｍｂは、３６にファミＩＪ−各蛋白質の制御
部位と考えられるＮ末端領域を特異的に認識するため、
リン酸化、糖、リピドの修飾、カルバクチンＩにおいて
はＩＯＫ蛋白質結合等を適当な抗体の組み合わせにより
阻害する系を組むことが可能となり、これらの現象が３
６にファミリー各蛋白質の機能発現にどのようにかかわ
っているのかを検討する有益な資料とすることができる
。これらのことから、本発明Ｍｂは、癌化、免疫疾患、炎
症等の疾病時の生体内情報伝達メカニズムの解明に有用
であり、これら疾病の治療法の確立に必須と考えられる
。

【実施例】

以下に、本発明の実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、これらの実施例は本発明の一例を示すもので
あって、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１カルバクチン１のＮ末端領域に対するＭｂの作製（１）
抗原の作製遺伝子配列より予測されるアミノ酸配列のうち、１番目
のメチオニンから２８番目のリジンまでの２８個のアミ
ノ酸を常法に従って化学合成した。このペプチドｌ０ｍｇを精製蒸留水２ｒｎｌに溶解した
ものを、４　ｍｇ／−のＢＳＡ溶液（シグマ社製フラク
ションＶを使用）と混合し、カップリング剤として水溶
性カルボジイミド（蛋白質研究奨励金製）を最終濃度０
．２Ｍとなるように加えた。 ρＮが６．０になるように維持しながら、３０分から１
時間のあいだｐＨの変動がなくなるまでカップリング反
応を行わせた後、４℃でＰＢＳ　（−）で透析し、ゲル
濾過カラムを通して未反応物を除く。このようにして１２ｍｇのペプチド−ＢＳＡ結合体を得
た。なお、カルバクチン１のＮ末端領域に相当するアミノ酸
配列（１番目から２８番目までの２８個）は判明してい
て、以下の通りである。！Ｊｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａ　１−）１ｉ　５−Ｇ
ｌ　ｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−）１１ｓ−３
ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ＾Ｉａ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（２）免疫化細胞の
調製ｌＯ週令の８＾ＬＢ／（、ＩＩＥ性マウマウス腔内に、
（１）で得られた物質１００μｇを含む溶液０．１−と
、フロイントのコンプリードアシュバンド（ＤＩＦＣＯ
社製）０．１−との混合液を投与する。その後２週間間
隔で２回、上記溶液とインコンプリードアシュバンド（
ＤＩＦＣＯ社製）との混合溶液を腹腔内に投与する。その後、そのマウスを頚椎脱臼により致死させ、無菌的
に膵臓を採取する。セレクター（ＢＥＬＣＯ社製）に上記膵臓的１ｇを乗せ
、ダルベツコ変法ＩＡ曲（０−Ｍ（！ＭＪ培地を供給し
ながら約１０μのメツシュを通過させて０−ＭＥＮに懸
濁状態の膵臓細胞を得る。これを１００Ｇ、　５分間の
遠心分離にかけて、膵臓細胞を採取する。０．８４％の塩化エンモニウム溶液に２０　ｍ　１４の
ヘベス（ＩＩＢＰＥｓ）緩衝液（ｐＨ７，４）を加えた
溶液１ｒｎｌ中に上記細胞を入れて溶血させる。ｌ、　
０ＯＯＧ、５分間の遠心分離にかけて細胞を取得する。再びＤ−旺Ｍ培地に懸濁させる。（３）骨髄腫細胞の調製８−アザグアニン耐性でかつイミュノグロプリン非分泌
型のマウス骨髄腫細胞株５Ｐ２１０−へｇ１４株を、２
０％のウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＤ−ＭＥ！Ｍ培地
で、１０％ＣＯ７・３７℃インキュベーター内で培養し
、対数増殖期にある細胞を集め、次の操作に用いた。１．０００Ｇ、　５分間の遠心分離にかけて細胞のみを
取得し、更にＤ−ＭＥＭ培地に懸濁して、血球計算盤で
細胞数をカウントする。再び１，０ＯＯＧ、　５分間の
遠心分離にかけて後、Ｄ−ＭＢＭ培地に懸濁させる。（４）細胞の融合（２）で得た免疫化細胞１０’〜３ＸＩＯ’個を含むＤ
−旺Ｍ培地と、（３）で得た骨髄腫細胞１０”個を含む
Ｄ−ＭＢＭ培地とを混合し一様にした後、１．０ＯＯＧ
。５分間の遠心分離にかける。上清を除き沈渣を取得し、
これに２５％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール１５
００（ＰＢＧ　１５００゜ベーリンガー社製）とヘペス
緩衝液３７．５ｍＭを含む溶液１−を１分間にわたって
滴下する。その後、Ｄ−１，ｌ［ｉＭ培地でゆっくり希
釈して全体を１０ｍｊ！とする。これに２０％ＦＣ８を含むＤ−旺Ｍ培地ｌＯ−を加えて
、１、０ＯＯＧ、５分間の遠心分離にかける。得られた
細胞に２０％ＦＣ５を含むＤ−ＭＥＭを加えて１０　’
　ｃｅｌｌ／−になるようにし、コーニング社製の２４
穴培養プレートにｌｉｅ／ｗｅｌｌの割合となるように
乗せる。１０％ＣＯ６・３７℃インキュベーター中で２４時間培
養する。その後、）ＩＡＴ溶液を添加して融合細胞以外の細胞を
除き、更に２週間培養を続ける。（５）ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定ダイナチック・
ラボラトリ−社製マイクロタイタープレート（ＮＣＬＯ
ｏｌ−０１０−２１０１）の各ｗａｌｌを、（１）で得
たペプチドｌμｓ／ｍｆでコーティングする。測定対象となる抗体を含む上清液１５０μβをｗｅｌｌ
に採り、３７℃インキュベーター内で２時間放置し、そ
の後ＰＢＳ　（リン酸緩衝液）で洗浄した。これにペル
オキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス全抗体を加え、３７℃
インキュベーターで１時間放置し、Ｉ’ＢＳで洗浄後発
色剤（八ＢＴＳ）を加えて１５分間発色させ、停止液（
０，１Ｍクエン！！！！２−０．０２％ナトリウムアジ
ド）を加えて反応を停止させた後、タイターチック社製
マルチスキャンでｗｅｌｌの吸光度を測定して、抗体価
を算出した。（６）抗体産生細胞の選別ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で確認されたｗｅｌｌ内の細胞を、６
０ＩＩＩＩＩｌφのシャーレ内の軟寒天培地上に撒く。１０％Ｃ０２・３７℃インキュベーター内で２週間培養
し、コロニーを形成させる。できたコロニーを採り、２４穴培養プレートにのせる。再びＥＬＩＳＡ法によって抗体活性を確認する。抗体活
性の確認されたｗｅｌｌ内の細胞を、６０叩φのシャー
レ内の軟寒天培地上に撒く。１０％ＣＯ２・３７℃インキュベーター内で２週間培養
し、コロニーを形成させる。できたコロニーを採り、２
４穴培養プレートにのせる。再びＥＬＩＳＡ法によって
抗体活性を確認し、有用な細胞を選別した。（７）抗体の取得 ■　（６）で得た抗体産生細胞は、本発明抗体を常時産
生ずるので、この抗体産生細胞を培養した培養液の土浦
液は、直接、本発明抗体溶液として使用することができ
る。 ■　（６）で得た抗体産生細胞の培養液に硫酸アンモニ
ウムを最１４１度３０％となるように加える。遠心分離
し、沈渣をとり、これにｐｌ！７．４のリン酸緩衝液２
０ｍＭを加え、同じリン酸緩衝液（０，０２％ナトリウ
ムアジドを含む）を用いて透析して硫酸アンモニウムを
除く。透析後の液体を凍結乾燥して、白色粉末を得る。 ■　ＢＡＬＢ／Ｃ雄件マウス腹腔内に、ブリスタン０．
５−を注射し、２週間飼育する。（６）で得た抗体産生
細胞を１０６〜３　Ｘ　１０　’　ｃｅｌｌ／マウスと
なるように注射し、１０日間飼育する。腹腔内にたまっ
た腹水約ＩＯ−を注射筒を用いて採取する。この腹水に硫酸アンモニウムを最終濃度３０％となるよ
うに加える。その後、これ゛にｐ）１７．４のリン酸緩
衝液２０ｍＭを加え、同じリン酸緩衝液（０，０２％ナ
トリウムアジドを含む）を用いて透析して硫酸アンモニ
ウムを除く。透析後の液体を凍結乾燥して、白色粉末を
得る。（８）イミ二ノグロプリン各クラスの同定イミュノグロ
プリン各クラスの同定は、クラス特異性抗体（ＩｇＡ、
　ＩｇＧ１．　ＩｇＧ２ａ、　ＩｇＧ２ｂ、　１ｇＧ３
゜ＩｇＭは、バイオライド社製のものを用いた）を加え
、３７℃、２時間反応させた後、ＰＢＳで充分に洗浄し
た。これにペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス全抗体
を加え、３７℃インキュベーターで１時間放置し、ＰＢ
Ｓで洗浄後、発色剤（ＡＢＴＳ）を加えて１５分間発色
させ、各クラスの判定を行った。この結果の一部を表１
に示す。表１細胞株３、　ｌ０Ｈ３，１１＾４．５Ｂ４．７Ｇ４゜９Ｈ５，２＾５．２Ｃ５、ｌ０Ｅ６．４Ｃ６，７Ｃ６，９Ｆ９．２Ｂ１０．９Ｂ１０．１１＾１１．２Ｐ実施例２カルバクチン２ＯＮ末端領域に対するＭｂの作製カルバ
クチン２のＮ末端領域に相当するアミノ酸配列（１３番
目から３５番目までの２３個）は判明していて、以下の
通りである。Ｐｈｅ−１！ｅ−Ｇ　Ｉｕ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１
ｕ−Ｇ　Ｉｎ−ＧＩ　ｕ−Ｔｙｒ−ＶａｂＧＩｎＴｈｒ
−Ｖａ　Ｉ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−ＧＩ　
ｙ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｐｒｏ−ＧＩ　ｙ−３ｅｒ−ｌａこの２３個のアミノ酸配列を有するペプチドを化学合成
により得た。その、後、実施例１と同様な操作により、目的とするＭ
ｂを得た。イミュノグロプリン各クラスの同定を実施例１と同様に
行い、表２に示す結果を得た。（以下次頁）表２１，５　＾２．５Ｃ２、１００５，３Ｂ５．５Ｂ５．８Ａ７、ＩＢ７．５０１０．５＾Ｍｅｔ−＾１ａ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｇ　１ｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−＾
１ａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕこの２２個のアミノ酸配
列を有するペプチドを化学合成により得た。その後、実施例１と同様な操作により、目的とするＭｂ
を得た。イミュノグロプリン各クラスの同定を実施例１と同様に
行い、表３に示す結果を得た。（以下次頁）実施例３ＩＢＣのＮ末端領域に対するＭｂの作製ＩＢＣのＮ末端
領域に相当するアミノ酸配列（１番目から２２番目まで
の２２個）は判明していて、以下の通りである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）３６Ｋファミリ−に属する蛋白質を特異的に認識
することを特徴とするモノクローナル抗体。
（２）３６Ｋファミリーに属する蛋白質のＮ末端領域の
アミノ酸配列に相当するペプチドを化学合成し、必要に
応じてキャリアを結合させるか又は結合させずに、この
ものを抗原として抗体を取得することを特徴とする、３
６Ｋファミリ−に属する蛋白質を特異的に認識するモノ
クローナル抗体を製造する方法。
（３）３６Ｋファミリーに属する蛋白質を特異的に認識
するモノクローナル抗体を用いて、３６Ｋファミリーに
属する蛋白質を同定し、又は定量する方法。