JPS61227596A - 抗リン酸化チロシンモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents
抗リン酸化チロシンモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マInfo
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- JPS61227596A JPS61227596A JP60069631A JP6963185A JPS61227596A JP S61227596 A JPS61227596 A JP S61227596A JP 60069631 A JP60069631 A JP 60069631A JP 6963185 A JP6963185 A JP 6963185A JP S61227596 A JPS61227596 A JP S61227596A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の目的
産業上の利用分野
この発明は新規なモノクローナル抗体およびそれを産生
ずるハイプリドーマに関するものである。
ずるハイプリドーマに関するものである。
さらに詳細には、この発明は抗リン酸化チロシン（以下
、Ｐ−Ｔ７ｒと略称）モノクローナル抗体およびそれを
産生ずるマウス・ハイプリドーマＰＴＢ１０−６に関す
るものであシ、このモノクローナル抗体はＰ−Ｔｙｒ含
有蛋白質の同５１ｊ＆よび分離のための試薬として有用
である。
、Ｐ−Ｔ７ｒと略称）モノクローナル抗体およびそれを
産生ずるマウス・ハイプリドーマＰＴＢ１０−６に関す
るものであシ、このモノクローナル抗体はＰ−Ｔｙｒ含
有蛋白質の同５１ｊ＆よび分離のための試薬として有用
である。
近年、ある種の腫瘍ウイＭヌの癌遺伝子産物やインシュ
リン、表皮成長因子（ＫＧＦ ’）など成長因子に対す
る受容体が千ロジン残基に特異的な蛋白質リン酸化酵素
（チロシンキナーゼ）活性を有し、さらにそれ自身も分
子内に、Ｐ−Ｔ７ｒを含むことが判明し、細胞の増殖や
成長にＰ−Ｔｙｒ含有蛋白が深く関与していることが認
められてきた之め、Ｐ−Ｔｙｒ含有蛋白の同定および分
離を簡便に行うことは、細胞増殖、癌化の機作解明等を
はじめとする研究に極めて有用である。
リン、表皮成長因子（ＫＧＦ ’）など成長因子に対す
る受容体が千ロジン残基に特異的な蛋白質リン酸化酵素
（チロシンキナーゼ）活性を有し、さらにそれ自身も分
子内に、Ｐ−Ｔ７ｒを含むことが判明し、細胞の増殖や
成長にＰ−Ｔｙｒ含有蛋白が深く関与していることが認
められてきた之め、Ｐ−Ｔｙｒ含有蛋白の同定および分
離を簡便に行うことは、細胞増殖、癌化の機作解明等を
はじめとする研究に極めて有用である。
従来の技術
これまでＰ−Ｔｙｒ蛋白の同定には、蛋白をラジオ・ア
イソトープで標識し、電気泳動にかけ几のち、アルカリ
で処理する方法あるいはモレキュラー・アンド・セνラ
ー・バイオロジー（ＭＯｌｅＱｕｌａｒａｎｄ Ｃｅ１
ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）第３巻悪８、第１３４３
−１３５２頁（１９８３年）に記載されたｐ−７ゾベン
ジＡ７ｊｔヌホネートを抗原として用いることにより得
た抗体を利用する方法などが知−Ｔ７ｒ以外の抗原とも
反応するためｊ抗原との親和性、反応の特異性の面で満
足すべきものではなかった。
イソトープで標識し、電気泳動にかけ几のち、アルカリ
で処理する方法あるいはモレキュラー・アンド・セνラ
ー・バイオロジー（ＭＯｌｅＱｕｌａｒａｎｄ Ｃｅ１
ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）第３巻悪８、第１３４３
−１３５２頁（１９８３年）に記載されたｐ−７ゾベン
ジＡ７ｊｔヌホネートを抗原として用いることにより得
た抗体を利用する方法などが知−Ｔ７ｒ以外の抗原とも
反応するためｊ抗原との親和性、反応の特異性の面で満
足すべきものではなかった。
発明が解決しようとする問題点
この発明の発明者たちは、上記の従来技術の欠点である
操作の煩雑さ、ならびに抗原との親和性、反応の特異性
の面での不満足さを解消すぺ〈種々研究を行った結果、
操作が簡便であシ、親和性、特異性の面でも満足すべき
ものであるこの発明のモノクローナμ抗体を得、この発
明を完成した。
操作の煩雑さ、ならびに抗原との親和性、反応の特異性
の面での不満足さを解消すぺ〈種々研究を行った結果、
操作が簡便であシ、親和性、特異性の面でも満足すべき
ものであるこの発明のモノクローナμ抗体を得、この発
明を完成した。
発明の構成
問題点を解決する九めの手段
この発明の抗すン酸化チロシンモノクローナＶ抗体は、
新規なマウス・ハイプリドーマＰＴＢ１０−６を培地ま
たはマウスの腹水中で常法によシ培養することによシ製
造される。
新規なマウス・ハイプリドーマＰＴＢ１０−６を培地ま
たはマウスの腹水中で常法によシ培養することによシ製
造される。
ここで用いるマウス・ハイプリドーマＰＴＢ１０−６ｆ
ｌ、リン酸化チロシンをＮ−サクシンイミりｌ’ ３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートのような適当
な架橋剤を用いてヘモシアニンま几はガンマグロブリン
と結合させることによシ得たリン酸化チロシン−ヘモシ
アニン結合物ま九はリン酸化チロシン−ガンマグロブリ
ン結合物を抗原とし、それらを用いて常法によシ免疫さ
れたマウスの牌臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを常
法、例えばケーラーおよびミルスタイン（Ｋａｈｌｅｒ
ａｎｄ Ｍｉｌａｔｅｉｎ）の細胞融合技術の基本方法
〔ネイチ１−第２５６巻第４９５頁（１９７５年）参照
〕によ多細胞融合して製造することができるが、詳細に
は、下記実施例を参照されたい。
ｌ、リン酸化チロシンをＮ−サクシンイミりｌ’ ３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートのような適当
な架橋剤を用いてヘモシアニンま几はガンマグロブリン
と結合させることによシ得たリン酸化チロシン−ヘモシ
アニン結合物ま九はリン酸化チロシン−ガンマグロブリ
ン結合物を抗原とし、それらを用いて常法によシ免疫さ
れたマウスの牌臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを常
法、例えばケーラーおよびミルスタイン（Ｋａｈｌｅｒ
ａｎｄ Ｍｉｌａｔｅｉｎ）の細胞融合技術の基本方法
〔ネイチ１−第２５６巻第４９５頁（１９７５年）参照
〕によ多細胞融合して製造することができるが、詳細に
は、下記実施例を参照されたい。
また、上記ハイプリドーマを培養する培地としては、ハ
イプリドーマの培養に適した培地であればよく、そのよ
うな例としては、例えばダｙベッコ氏改変イーグル氏最
小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅａｇｌｅｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｍ
ｅｄｉｕｒｎ、、以下Ｄ−ＭＫＭと略称する）にウシ胎
児血清、Ｌ−グＶタミン、２−メルカプトエタノ−Ｖお
よび抗生物質（例えば、ペニシリンＧ、７．）レプトマ
イシン、ゲンタミシン等）を含有せしめた培地が挙げら
れる。
イプリドーマの培養に適した培地であればよく、そのよ
うな例としては、例えばダｙベッコ氏改変イーグル氏最
小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅａｇｌｅｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｍ
ｅｄｉｕｒｎ、、以下Ｄ−ＭＫＭと略称する）にウシ胎
児血清、Ｌ−グＶタミン、２−メルカプトエタノ−Ｖお
よび抗生物質（例えば、ペニシリンＧ、７．）レプトマ
イシン、ゲンタミシン等）を含有せしめた培地が挙げら
れる。
この発明のハイプリドーマの培養は、通常、培地を用い
る時には５７”Ｃで２−４日間、ま友マウスの腹腔内で
培養する時には７−２０日間程度で行なわれる。
る時には５７”Ｃで２−４日間、ま友マウスの腹腔内で
培養する時には７−２０日間程度で行なわれる。
このようにして製造され九モノクローナ〃抗体は培養物
またはマウスの腹水から、蛋白質の単離、精製に一般的
に用いられる常法により分離、精製することができる。
またはマウスの腹水から、蛋白質の単離、精製に一般的
に用いられる常法により分離、精製することができる。
そのような方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫
安塩析、ＤＥＡＥ−セルロースを用いるカラム・クロマ
トグラフィー、ゲル〔例えば、セファ０−ヌ４Ｂ、セフ
１デツクヌｔ 商Ｌ）７ｖマシア・ファイン・ケミカシ
ズＡＢ社製）等〕を用いるゲＡ／濾過法、免疫グロブリ
ン結合多糖類（例えば、抗つシエｙＧ−セフ１０−ス４
Ｂ、等を使用するカラム・クロマトグラフィー）、抗原
結合セフ１０−スを使用するアフイニティカラムクロマ
トグラフィー、凍結乾燥、結晶化等が挙げられる。
安塩析、ＤＥＡＥ−セルロースを用いるカラム・クロマ
トグラフィー、ゲル〔例えば、セファ０−ヌ４Ｂ、セフ
１デツクヌｔ 商Ｌ）７ｖマシア・ファイン・ケミカシ
ズＡＢ社製）等〕を用いるゲＡ／濾過法、免疫グロブリ
ン結合多糖類（例えば、抗つシエｙＧ−セフ１０−ス４
Ｂ、等を使用するカラム・クロマトグラフィー）、抗原
結合セフ１０−スを使用するアフイニティカラムクロマ
トグラフィー、凍結乾燥、結晶化等が挙げられる。
このようにして得られた抗すン酸化千ロジンモノクロー
ナル抗体は、Ｐ−Ｔｙｒとの反応に極めて高い特異性、
親和性を示し、リン酸化セリン、リン酸化スレオニン等
とはほとんど反応せず、ｐ−’ｒｙｒ含有蛋白の同定お
よび分離のための試薬として有用である。
ナル抗体は、Ｐ−Ｔｙｒとの反応に極めて高い特異性、
親和性を示し、リン酸化セリン、リン酸化スレオニン等
とはほとんど反応せず、ｐ−’ｒｙｒ含有蛋白の同定お
よび分離のための試薬として有用である。
この発明の抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体の物
理化学的及び生物学的性質は以下の通りである。
理化学的及び生物学的性質は以下の通りである。
１）分子量
実施例３で得九本発明のモノクローナＶ抗体は、２−メ
Ｖカプトエタノ−Ｎの存在下で、ドデシル硫酸ナトリウ
ムで処理した後、ポリアクυ〜アミドゲル電気泳動で調
べたところ、分子量約５９，０００と約２７，０００の
サブユニットから成り立っていることが判明した。これ
らのサブユニットは、イムノグロブリンの重鎖と軽鎖に
相当し、本発明のモノクローナル抗体がイムノグロブリ
ンであることを確認できた。
Ｖカプトエタノ−Ｎの存在下で、ドデシル硫酸ナトリウ
ムで処理した後、ポリアクυ〜アミドゲル電気泳動で調
べたところ、分子量約５９，０００と約２７，０００の
サブユニットから成り立っていることが判明した。これ
らのサブユニットは、イムノグロブリンの重鎖と軽鎖に
相当し、本発明のモノクローナル抗体がイムノグロブリ
ンであることを確認できた。
１１）イムノグロブリンのクラスとアイソタイプ実施例
５で得た本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリ
ンのクラスとアイソタイプをオフタロニー法によって調
べた。
５で得た本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリ
ンのクラスとアイソタイプをオフタロニー法によって調
べた。
７フイニテイー精製したモノクローナル抗体ヲ、ウサギ
抗マウスイムノグロブリンＭ、Ｇ□％ Ｇｇ ａ％Ｇ２
．Ｇ、、Ａおよびに鎖、重鎖の血清（マイルズ社製）の
それぞれと沈降線の形成を調べたところ本発明のモノク
ローナル抗体は、ＩｇＡクラスであシ、に鎖の軽鎖をも
つ抗体であることが判明した。
抗マウスイムノグロブリンＭ、Ｇ□％ Ｇｇ ａ％Ｇ２
．Ｇ、、Ａおよびに鎖、重鎖の血清（マイルズ社製）の
それぞれと沈降線の形成を調べたところ本発明のモノク
ローナル抗体は、ＩｇＡクラスであシ、に鎖の軽鎖をも
つ抗体であることが判明した。
１１１） 抗体の特異性
９６穴、マイクロタイタープレートの各ウェルを２μｆ
／ｋｌとし交アフィニティー精製抗体溶液１８０μｌで
室温−夜コートし、１％牛血清７ｙプミン（ＢＳＡ）で
ブロックした後、各種Ｐ −１π関連化合物の存在下で
ヨード標識したＰ−Ｔｙｒ−ＢＳＡ結合物（ニーｐ−Ｔ
ｙｒ−ＢＳＡ ） ２５ ｎｆを反応させた。室温で一
夜静置後、プレートを充分に洗浄し、各ウニＶを切りと
り、ガンマカウンターにて、カウントした。
／ｋｌとし交アフィニティー精製抗体溶液１８０μｌで
室温−夜コートし、１％牛血清７ｙプミン（ＢＳＡ）で
ブロックした後、各種Ｐ −１π関連化合物の存在下で
ヨード標識したＰ−Ｔｙｒ−ＢＳＡ結合物（ニーｐ−Ｔ
ｙｒ−ＢＳＡ ） ２５ ｎｆを反応させた。室温で一
夜静置後、プレートを充分に洗浄し、各ウニＶを切りと
り、ガンマカウンターにて、カウントした。
特異性は、固相抗体への１２６エーｐ−Ｔｙｒ−ＢＳＡ
の結合に封子るＰ−Ｔｙｒ関連化合物の阻害で調ベアｔ
（表参照）。
の結合に封子るＰ−Ｔｙｒ関連化合物の阻害で調ベアｔ
（表参照）。
その結果、本抗体は、Ｎ−アセチ／Ｉ／ −Ｐ−Ｔｙｒ
。
。
Ｐ−Ｔ７ｒ並びにフェニルホスフェートに対して高い特
異性金示し、リン酸化セリン、リン酸化スレオニンなど
とは、はとんど反応しないことが判明Ｎ−アセチルリ４
謝ヒチロシン １．０ ｍＭ ７６
．２％すΔ駿化チロシン ０．００
８ ＜５．０８．０ １９．
１ フェニルホスフェート＊８．０ ２０．
５す４ｆヒセリン ８．０
＜５．ＯＮ−アセチルチロシンアミド
８，０ ＜５．０７−ｙ’ｉシ
ン−ＩＪ ｙｉｌＢ ＡＭＰ ） ８．０
＜５．０７デノシンニリ櫃（ＡＤＰ）
８．０ ＜５．０７デノシン三り
４ｔＡＴｐ） ８．０ ＜５．
０環状Ａ Ｍ Ｐ ８．０
＜５．０イノシΔ駿（工ＭＰ ）
８．０ ＜５．Ｏｐ−アミノフ
ェニシアｙソ４ ８．０ ＜５．
０米 フェニルホスフェートは、Ｐ−Ｔ７ｒのアラニン
側鎖のみを欠いた構造であり、本発明の目的からは、本
物質に対する交差反応性は特に問題とならないｔ、むし
ろ実施例５記載のように−・１抗：Ｐ−Ｔ７ズ抗体の７
フイニテイ、ｉ精製に際してのハブ艷Ｚ溶出用など゛ど
して利用し・うるも１のでおる。
異性金示し、リン酸化セリン、リン酸化スレオニンなど
とは、はとんど反応しないことが判明Ｎ−アセチルリ４
謝ヒチロシン １．０ ｍＭ ７６
．２％すΔ駿化チロシン ０．００
８ ＜５．０８．０ １９．
１ フェニルホスフェート＊８．０ ２０．
５す４ｆヒセリン ８．０
＜５．ＯＮ−アセチルチロシンアミド
８，０ ＜５．０７−ｙ’ｉシ
ン−ＩＪ ｙｉｌＢ ＡＭＰ ） ８．０
＜５．０７デノシンニリ櫃（ＡＤＰ）
８．０ ＜５．０７デノシン三り
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０環状Ａ Ｍ Ｐ ８．０
＜５．０イノシΔ駿（工ＭＰ ）
８．０ ＜５．Ｏｐ−アミノフ
ェニシアｙソ４ ８．０ ＜５．
０米 フェニルホスフェートは、Ｐ−Ｔ７ｒのアラニン
側鎖のみを欠いた構造であり、本発明の目的からは、本
物質に対する交差反応性は特に問題とならないｔ、むし
ろ実施例５記載のように−・１抗：Ｐ−Ｔ７ズ抗体の７
フイニテイ、ｉ精製に際してのハブ艷Ｚ溶出用など゛ど
して利用し・うるも１のでおる。
ＩＶ）癌遺伝子産物の認識性
原波肉腫つイＶスで形質転換したラット細胞を、ＲＩＰ
Ａ緩衝液〔１％トリトンＸ−１００，１％デオキシコレ
−）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０
．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
ｔｒｒ１ｓ−ａｃｌ） （ｐＨ８，２）、ＩＱｍＭエチ
レンジアミン四酢酸（ＢＤＴＡ ）、２ＱｍＭフッ化ナ
トリウム、１％トラシロール〕で可溶化した。この液１
００〜３００μｌに、アフィニティーｆｉｌｌた抗Ｐ−
Ｔｙｒモノクローナ！し抗体５０μｇを加えて、４℃で
１時間反応させ、抗原抗体結合物を抗マウヌイムノグロ
プリン抗体を結合させたセフ７０−ス４Ｂ（商標：ファ
Ｖマシア社製）にて沈降させた。沈降物中に〔γ−３２
Ｐ〕ＡＴＰ（５〜１０μＣ１）を加え、塩化マンガン（
１０ｍＭ）の存在下で２０℃、１０分間反応させた。
Ａ緩衝液〔１％トリトンＸ−１００，１％デオキシコレ
−）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０
．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
ｔｒｒ１ｓ−ａｃｌ） （ｐＨ８，２）、ＩＱｍＭエチ
レンジアミン四酢酸（ＢＤＴＡ ）、２ＱｍＭフッ化ナ
トリウム、１％トラシロール〕で可溶化した。この液１
００〜３００μｌに、アフィニティーｆｉｌｌた抗Ｐ−
Ｔｙｒモノクローナ！し抗体５０μｇを加えて、４℃で
１時間反応させ、抗原抗体結合物を抗マウヌイムノグロ
プリン抗体を結合させたセフ７０−ス４Ｂ（商標：ファ
Ｖマシア社製）にて沈降させた。沈降物中に〔γ−３２
Ｐ〕ＡＴＰ（５〜１０μＣ１）を加え、塩化マンガン（
１０ｍＭ）の存在下で２０℃、１０分間反応させた。
リン酸化された蛋白を５ＤＳ−ポリアクリルアミドケｌ
し電気泳動を行ない、オートラジオグラフィーが検出さ
れた・ 実施例 次いでこの発明を実施例により説明する。
し電気泳動を行ない、オートラジオグラフィーが検出さ
れた・ 実施例 次いでこの発明を実施例により説明する。
実施例１（ハイプリドーマ ＰＴＢｌｏ−６の取得）
（１） 免疫用抗原の調製
リン酸化チロシン（Ｐ−Ｔ７ｒ、！：略丁）をへテロ２
官能試薬であるＮ−サクシンイミジｒｖ３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート（以下５ＰＤＰと略す）を
用いて、担体効果の高いヘモシアニン（ＫＬＨ）又は、
ニワトリガンマグロブリン（α袷）に結合させたものを
免疫用抗原とした。
官能試薬であるＮ−サクシンイミジｒｖ３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート（以下５ＰＤＰと略す）を
用いて、担体効果の高いヘモシアニン（ＫＬＨ）又は、
ニワトリガンマグロブリン（α袷）に結合させたものを
免疫用抗原とした。
すなわち、Ｐ−Ｔｙｒ及び担体蛋白をそれぞれ５ＰＤＰ
と反応させることによシ（反応モル比；ｓ Ｐ Ｄ Ｐ
／Ｐ−Ｔｙｒ＝１．２、Ｓ Ｐ Ｄ Ｐ ／ Ｋ Ｌ
Ｈ＝１００．５ＰＤＰ／ＣＧＧ＝４５ ）、２−ピリ
ジ）Ｖジチオプロピオニジ基を導入した。なお、不要な
試薬類は、透析又はゲル濾過によシ除いた。担体蛋白と
５ＰＤＰとの結合物は、さらにジチオスライド−７”（
ＤＴ’ｆ’）で還元することによりピリＳ／ジチオ基を
脱離し、遊離チオールとした後、両者を混合し結合させ
ＫＬＨ１０万ダルトンあたり９分子量 Ｐ−Ｔｙｒ、−
Ｋ Ｌ ＩＩ ）、ＣＧＧｌ ５万ダルトンあ九９２２
分子（Ｐ−Ｔｙｒ２２−ＣＧＧ ）のＰ−Ｔｙｒが結合
した免疫用抗原を得た。
と反応させることによシ（反応モル比；ｓ Ｐ Ｄ Ｐ
／Ｐ−Ｔｙｒ＝１．２、Ｓ Ｐ Ｄ Ｐ ／ Ｋ Ｌ
Ｈ＝１００．５ＰＤＰ／ＣＧＧ＝４５ ）、２−ピリ
ジ）Ｖジチオプロピオニジ基を導入した。なお、不要な
試薬類は、透析又はゲル濾過によシ除いた。担体蛋白と
５ＰＤＰとの結合物は、さらにジチオスライド−７”（
ＤＴ’ｆ’）で還元することによりピリＳ／ジチオ基を
脱離し、遊離チオールとした後、両者を混合し結合させ
ＫＬＨ１０万ダルトンあたり９分子量 Ｐ−Ｔｙｒ、−
Ｋ Ｌ ＩＩ ）、ＣＧＧｌ ５万ダルトンあ九９２２
分子（Ｐ−Ｔｙｒ２２−ＣＧＧ ）のＰ−Ｔｙｒが結合
した免疫用抗原を得た。
（２） Ｐ−Ｔｙｒ免疫脾細胞の調製ｐ−Ｔｙｒ、−
Ｋ ＩＪ Ｈ１４５μｆｔ−７０インド完全アジユバン
）（ＣＦ’Ａ）と乳化させて、６〜８週令のＢ Ａ Ｌ
Ｂ ／ Ｃマウス（雌）の四肢の付は根及び足置に投
与し、２週間後、同量の抗原をフロイント不完全アジュ
バントとともに投与し、進用免疫を行なった。１９日後
ｐ−Ｔｙｒ、−Ｋ Ｌ ＩＩＩ ２５ ｔｔｆとｐ−Ｔ
ｙｒ、、−ＣＧ Ｇ ２２５ ｐｆの混合溶液を静脈内
投与し、翌日、ｐ−ｒｙｒ、２−ＣＧＧ２２５μｆを腹
腔内に投与したのちさらにその翌日も同様にＰ−Ｔｙｒ
２２−ｃａａ２２５ｔｔｆ を腹腔内に投与した。
Ｋ ＩＪ Ｈ１４５μｆｔ−７０インド完全アジユバン
）（ＣＦ’Ａ）と乳化させて、６〜８週令のＢ Ａ Ｌ
Ｂ ／ Ｃマウス（雌）の四肢の付は根及び足置に投
与し、２週間後、同量の抗原をフロイント不完全アジュ
バントとともに投与し、進用免疫を行なった。１９日後
ｐ−Ｔｙｒ、−Ｋ Ｌ ＩＩＩ ２５ ｔｔｆとｐ−Ｔ
ｙｒ、、−ＣＧ Ｇ ２２５ ｐｆの混合溶液を静脈内
投与し、翌日、ｐ−ｒｙｒ、２−ＣＧＧ２２５μｆを腹
腔内に投与したのちさらにその翌日も同様にＰ−Ｔｙｒ
２２−ｃａａ２２５ｔｔｆ を腹腔内に投与した。
最終投与２日後にマウスを開腹し、牌臓をとり出し、ビ
ンセットなどでこれを充分にほぐし、塩化アンモニウム
／トリク緩衝液にて混入する赤血球を溶解させた後、５
％牛脂児血清（ＦｏＳ）を含むハンクス溶液に懸濁させ
た。
ンセットなどでこれを充分にほぐし、塩化アンモニウム
／トリク緩衝液にて混入する赤血球を溶解させた後、５
％牛脂児血清（ＦｏＳ）を含むハンクス溶液に懸濁させ
た。
得られ几脾細胞懸濁液とマウヌミエローマ例−力細胞懸
濁液（ＢＡＬＢ／Ｃマウヌ由来のミエローマ）ｔ−１０
： １の細胞比で混合し、遠心分離後これに１５％のジ
メチルスル本キサイドＬＤＭＳＯ）を含む４２．５％ポ
リエチレングリコ−Ａ／（分子量４．０００）を徐々に
滴下し、よくまぜながら３７°Ｃで１分間反応させるこ
とにより、細胞を融合させた。この融合細胞を２０％Ｆ
Ｏ８を含むダルベツコ氏改変イーグル氏最小栄養培地（
２ｍＭＩ、−グｌレタミン、２Ｘ１０−５Ｍ２−メルカ
プトエタノール、１００単位／ゴペニシリンＧ、１００
μｙ７ｔｐｔｔヌトレプトマイシンを含む、以下０Ｍ培
地）に懸濁して、９６ウエルプレートに分注した。融合
細胞は、ＨＡＴ培地（上記ＯＮ培地に、ｌＸｌＣｒ’Ｍ
ヒポキサン千ン、４Ｘｉ （ｊ’Ｍアミノプテリン、お
よび１．６ Ｘ Ｉ Ｑ−’Ｍナミジンを添加し几培地
）によシ選択し、融合細胞の増殖したウニＶの上清につ
き、抗Ｐ−Ｔ７ｒ抗体の有無を調べ友。
濁液（ＢＡＬＢ／Ｃマウヌ由来のミエローマ）ｔ−１０
： １の細胞比で混合し、遠心分離後これに１５％のジ
メチルスル本キサイドＬＤＭＳＯ）を含む４２．５％ポ
リエチレングリコ−Ａ／（分子量４．０００）を徐々に
滴下し、よくまぜながら３７°Ｃで１分間反応させるこ
とにより、細胞を融合させた。この融合細胞を２０％Ｆ
Ｏ８を含むダルベツコ氏改変イーグル氏最小栄養培地（
２ｍＭＩ、−グｌレタミン、２Ｘ１０−５Ｍ２−メルカ
プトエタノール、１００単位／ゴペニシリンＧ、１００
μｙ７ｔｐｔｔヌトレプトマイシンを含む、以下０Ｍ培
地）に懸濁して、９６ウエルプレートに分注した。融合
細胞は、ＨＡＴ培地（上記ＯＮ培地に、ｌＸｌＣｒ’Ｍ
ヒポキサン千ン、４Ｘｉ （ｊ’Ｍアミノプテリン、お
よび１．６ Ｘ Ｉ Ｑ−’Ｍナミジンを添加し几培地
）によシ選択し、融合細胞の増殖したウニＶの上清につ
き、抗Ｐ−Ｔ７ｒ抗体の有無を調べ友。
抗体活性は、Ｐ−Ｔｙｒ４血清ア血清７ンブミンＡ）結
合物を吸着させ次マイクロタイタープレートを用いた、
固相ラジオイムノアッセイ法で調べた。
合物を吸着させ次マイクロタイタープレートを用いた、
固相ラジオイムノアッセイ法で調べた。
抗体活性のあるウェルの細胞は、軟寒天法によシクロー
二ングを行ない、１個の細胞由来でＰ−Ｔ７ｒ との
親和性の最も強いハイプリドーマを選び、ＰＴＢＩＱ−
６と命名した。
二ングを行ない、１個の細胞由来でＰ−Ｔ７ｒ との
親和性の最も強いハイプリドーマを選び、ＰＴＢＩＱ−
６と命名した。
なお、親和性は、平衡透析法によシ調べた。
実施例２
抗Ｐ−Ｔ７ｒ抗体の製造
ハイプリドーマ ＰＴＢｌｏ−６を０Ｍ培地を用い、３
７”Ｃ１５％二酸化二数ガヌ気流中で、４日間培養し１
，０００ ｒｐｍ で４−Ｃ１１０分間遠心分離して、
抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体を含む、培養上清を得た。
７”Ｃ１５％二酸化二数ガヌ気流中で、４日間培養し１
，０００ ｒｐｍ で４−Ｃ１１０分間遠心分離して、
抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体を含む、培養上清を得た。
実施例６
抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体の製造
プリスタン（２，６，ｉ ０．１４−テトラメナＶペン
タデカン）を１週間間隔で２回ＢＡＬＢ／Ｃマウス５匹
の腹腔内に投与し、１週間後各々のマウスの腹腔にｌＸ
１０７個のハイブリドーマ ＰＴＢｌｏ−６を移植した
。移植後１〜２週間後に腹水２０肩ｊを採取した。
タデカン）を１週間間隔で２回ＢＡＬＢ／Ｃマウス５匹
の腹腔内に投与し、１週間後各々のマウスの腹腔にｌＸ
１０７個のハイブリドーマ ＰＴＢｌｏ−６を移植した
。移植後１〜２週間後に腹水２０肩ｊを採取した。
腹Ｘは、遠心分離により不溶物をのぞいた後。
５０％飽和硫酸アンモニウム沈殿によりガンマグロブリ
ン分画とし、さらにＰ−Ｔｙｒを結合させたセファｏ
−、ｘ ｃ Ｌ−４Ｂ ｔ 商ｉｌ ”フ７Ａ／マシア
社＊）ｋＭいたアフィニティークロマトクラフィーによ
シ抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体のみを特異的に精製し、精製された
抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体１７１１ｇを得た。なお、７フイニテ
イーカラムよシの抗体の溶出は、フェ二Ｖホスフェート
によるハプテン溶出か又はグアニジン塩酸による非特異
的溶出を行なった。
ン分画とし、さらにＰ−Ｔｙｒを結合させたセファｏ
−、ｘ ｃ Ｌ−４Ｂ ｔ 商ｉｌ ”フ７Ａ／マシア
社＊）ｋＭいたアフィニティークロマトクラフィーによ
シ抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体のみを特異的に精製し、精製された
抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体１７１１ｇを得た。なお、７フイニテ
イーカラムよシの抗体の溶出は、フェ二Ｖホスフェート
によるハプテン溶出か又はグアニジン塩酸による非特異
的溶出を行なった。
Claims (3)
- （１）マウス・ハイブリドーマＰＴＢ １０−６によっ
て産生され、リン酸化チロシン抗原に特異的に反応する
モノクローナル抗体。 - （２）マウス・ハイブリドーマＰＴＢ １０−６を、リ
ン酸化チロシン−ヘモシアニン結合物またはリン酸化チ
ロシン−ガンマグロブリン結合物で免疫されたマウス脾
細胞とマウス・ミエローマ細胞とを融合させて得ること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノクローナ
ル抗体。 - （３）リン酸化チロシン抗原に特異的に反応するモノク
ローナル抗体を産生するマウス・ハイブリドーマＰＴＢ
１０−６。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60069631A JPS61227596A (ja) | 1985-04-01 | 1985-04-01 | 抗リン酸化チロシンモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60069631A JPS61227596A (ja) | 1985-04-01 | 1985-04-01 | 抗リン酸化チロシンモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61227596A true JPS61227596A (ja) | 1986-10-09 |
Family
ID=13408397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60069631A Pending JPS61227596A (ja) | 1985-04-01 | 1985-04-01 | 抗リン酸化チロシンモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61227596A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006036784A (ja) * | 1998-09-04 | 2006-02-09 | Cell Signaling Technology Inc | 抗原としてペプチドライブラリーを用いたモチーフ特異性および状況独立性抗体の産生 |
-
1985
- 1985-04-01 JP JP60069631A patent/JPS61227596A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006036784A (ja) * | 1998-09-04 | 2006-02-09 | Cell Signaling Technology Inc | 抗原としてペプチドライブラリーを用いたモチーフ特異性および状況独立性抗体の産生 |
| JP2012162535A (ja) * | 1998-09-04 | 2012-08-30 | Cell Signaling Technology Inc | 抗原としてペプチドライブラリーを用いたモチーフ特異性および状況独立性抗体の産生 |
| JP2016210783A (ja) * | 1998-09-04 | 2016-12-15 | セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド | 抗原としてペプチドライブラリーを用いたモチーフ特異性および状況独立性抗体の産生 |
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