JPH023697A - 抗―ｒａｓ蛋白質抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｒａｓプロト−腫瘍遺伝予科（ｆａｍｉｌｙ）の３種、
ｒａｓ’、　ｒａｓＫおよびｒａｓ’は、高度に維持さ
れた２１ＫＤａの蛋白質（ｐ２１）をコードセしている
〔例えばＣａｐｏｎらのＮａｔｕｒｅ　３０２．３３−
３７（１９８３）参照〕。

種々の動物およびヒト腫瘍から単離されたＤＮＡは、Ｎ
ＩＨ３Ｔ３細胞類を形質転換することができ、かつ１２
番目または６１番目のコドンにおける単一塩基の変化を
伴う活性化されたｒａｓ遺伝子を大きい割合で含む。

ｒａｓ’、　ｒａｓＫおよびｒａｓＮと命名された腫瘍
遺伝子類の科によりコードされたｐ２１　ｒａｓ蛋白質
の種々の領域から誘導された合成ポリペプチドを使用す
るモノクローナル抗体類の調製は、米国特許出願番号筒
７３９，４１６号（１９８５年５月３０日出願）に記載
されている。これらの抗体類は、アミノ酸配列に基づき
、合成された免疫原性ペプチドの特定の科に対してそれ
ぞれ選択的である。かくして該抗体類は、生物学的液体
試料中の特異的なｒａｓ遺伝子産物の存在を分析するた
めに使用することができる。

アミノ酸配列の１２位に特定のアミノ酸を存するｒａｓ
　ｐ２１蛋白質に対して選択的であるｒａｓＭＩ瘍遺伝
子産物に対する抗体類を提供することもこの分野におい
て知られている。例えば、シーに１−ｒａｓ　（１２位
はセリン）蛋白質に結合し、ｖ−Ｈａ−ｒａｓ（１２位
はアルギニン）蛋白質には結合しない抗−ｐ２１−ｓｅ
ｒウサギポリクローナル抗体は、商品となっている（Ｃ
ｅｔｕｓ　Ｄｉａｇｒｏｓｔｉｃｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌ
ｌｅ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）。

また、アミノ酸配列の１２位にＶａｌ、ＡｓｐおよびＡ
ｒｇを有するポリペプチドに対して特異的なポリクロー
ナル抗体も入手可能である。これらの抗体類は、対応す
る変異蛋白質の存在についての細胞および組織抽出物の
分析に有用なキット形態において提供されている。該変
異蛋白質は、ヒト腫瘍類における変態過程を促進すると
考えられる。更に、ｐ２１ｒａｓ蛋白質の維持された領
域に対して支配され、従って、全ての既知の形態の該ｐ
２１蛋白質と反応的である全一反応性抗体として働くモ
ノクローナル抗体も商品となっている。該全一反応性抗
体は、ｒａｓ腫瘍遺伝子の発現を検査するために有用で
あることが示されている。このような材料の調製は、Ｃ
１ａｒｋらのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ　８２．５２８０−５２８４（１９８５）に記載
されている。

発癌現象の研究に使用されてきたマウス皮膚癌モデルに
おいて、ＤＭＢＡおよびＤＢ　（ｃｈ）　ＡＣＲにより
誘発された乳頭腫および癌の約８０％が、６１番目のコ
ドンの２番目の位置において訂転位（変異）を含む活性
化旧ｒａｓｐａｆＩＪＩ遺伝子を含んでおり（Ｂｉｚｕ
ｂらのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
　８３．６０４８−６０５２（１９８６）〕、対応する
蛋白質におけるＧｌｎのＬｅｕによる置換を生じている
ことが以前に示されている。また、Ｈ−ｒａｓ遺伝子は
、これらと同様な腫瘍において高度に発現されるが、正
常および変異蛋白質を区別することは、不可能であると
いうことも免疫組織化学的染色により示されている（Ｂ
ｉｚｕｂらのＯｎｃｏｇｅｎｅ＋上、　１３１−１４２
（１９８７）　：ｌ。

さらに、ｐ２１　ｒａｓ腫瘍遺伝子中のこの位置におけ
る変異は、ヒト組織内の変態過程を促進する蛋白質を生
じることも知られている。マウスの場合と同様に、この
変異は、正常アミノ酸配列におけるグルタミンに代えて
ロイシンを生じる。このような変化を選択的に認識する
ことができるモノクローナル抗体は、細胞、組繊および
生物学的液体中の該ｐ２１　Ｌｅｕ６１変異蛋白質を同
定するに当って極めて有用であろう。

本発明は、ｒａｓ蛋白質の６１位にまたがるアミノ酸配
列を有し、該配列が、その位置において正常ｒａｓ蛋白
質に見出されるグルタミンに代えてロイシンを含むこと
により特徴づけられる新規ポリペプチド類の調製、免疫
原性担体物質に共有的に結合されたこのようなポリペプ
チド類を用いて免疫原性組成物を調製するこのようなポ
リペプチド類の使用、このようなポリペプチド類により
導出される抗体類の製造、該ｐ２１　ＴＬｅｕ６１変異
蛋白質に対し特異的なモノクローナル類を提供するため
のこのような抗体類の選別、ならびに該ｐ２１　ＴＬｅ
ｕ６１変異蛋白質の存在を測定するためのこのような抗
体類を用いる免疫分析および免疫化学的方法の使用に関
するものである。この配列は、ヒトおよびマウスの肉蛋
白質におけるｒａｓ科（ｒａｓ’、　ｒａｓＫ、　ｒａ
ｓ″′）の３種の間で維持されているため（Ｃａｐｏｎ
らのＮａｔｕｒｅ　３０２，３３（１９８３）およびＧ
ｕｅｒｒｅｒｏらのＰｒｏｃｅｄ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２．７８１０
（１９８５）　）　、このようなモノクローナル類は、
ｐ２１ＴＬｅｕ６１変異蛋白質類に対する全一反応性抗
体として使用することができる。特に、モノクローナル
抗体ｒａｓ（５３−６９）　Ｌｅｕ６１の特性を有する
、すなわち、組織培養細胞の免疫ブロットおよび免疫組
織化学的染色において変異ｒａｓρ２１蛋白質に対して
選択的に反応し、正常ｒａｓ　ｐ２Ｌ蛋白質には選択的
に反応しないモノクローナル抗体は、本発明の好ましい
実施態様である。

更に本発明の実施態様は、正常ｒａｓ　ｐ２１蛋白質お
よびｐ２１ＴＬｅｕ６１変異ｒａｓ　ｐ２１蛋白質を同
等によく認識するモノクローナル抗体類の種類を含んで
いる。６１位の周辺領域は、該ｒａｓプロトー腫瘍遺伝
子科のすべての種類の間で維持されているため、このよ
うなモノクローナル抗体類は、正常および変異蛋白質の
両方を認識する全一反応性ｐ２１抗体として使用するこ
とができる。

本発明の第１の態様は、ｒａｓ蛋白質の６１位にまたが
り、その位置に正常なアミノ酸グルタミンまたは変異置
換ロイシンを有する配列から誘導されたアミノ酸配列を
有するポリペプチド類の調製に関する。最も好ましくは
、本発明のポリペプチド類は次の特定の配列を含む： Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａ
ｓｐ−Ｂ　　　　（Ｉ　）Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−＾
１ａ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｂ　　　　（ｎ　）（
ただし、Ａは、■−または免疫原性担体物質に共有的に
結合可能な側鎖官能基を有するアミノ酸残基であり、Ｂ
は、−０１１または免疫原性担体物質に共有的に結合可
能な側鎖官能基を有するアミノ酸残基である） 配列Ｉは、６１位にＬｅｕを含む変異ｒａｓ　ｐ２１蛋
白質の６１位にまたがる配列を示し、一方、配列■は、
６１位にＧｉｎを含む正常ｒａｓ　ｐ２１蛋白質の６１
位にまたがる配列を示す。配列］および■における特定
の実施態様として提供されているもののように、該ｒａ
ｓ　ｐ２１蛋白質のアミノまたはカルボキシ末端に対し
てより短いか、より長いかまたは配列されているｒａｓ
　ｐ２１蛋白質の６１位にまたがる配列類を利用するこ
とは、当分野の技術的範囲内にある。

このような代替配列類もまた本発明の一部である。

上記の特定のまたは代替の配列類は、この技術において
よく知られたペプチド合成法を利用して合成され得る。

このような方法は、液相合成および固相合成を含み、後
者は、例えばＭｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄにより開発された
方法が適用される（Ｊ、Ａｍ、Ｃ：ｈｅｍ。

Ｓｏｃ、８５．２１４９（１９６３）　）本発明のペプ
チド類を合成するための好適な方法は、通常の同和合成
樹脂に共有的に結合されているアミノ酸を有する、合成
されるべきペプチドのカルボキシ末端アミノ酸に対し、
アミノ酸類の段階的付加を用いる固相法である。この目
的のために適した樹脂は商品となっており、例えば交差
結合ポリスチレン樹脂を包含する。このような樹脂は、
現在では所望のカルボキシ末端アミノ酸が既に樹脂に共
有的に結合されて商業的に得られ得る。付加されたアミ
ノ酸類は、通常利用されている側鎖保護基類により保護
され得る。この目的に適した側鎖保護基類は、ベンジル
、ベンジルオキシカルボニル、クロロベンジル、ｐ−ク
ロロ−ベンジルオキシカルボニル、トルエンスルホニル
またはジメチルベンジルを包含する。

Ａおよび／またはＢが、免疫原性担体物質に共有的に結
合可能な側鎖官能基を有するアミノ酸である場合の配列
ＩまたはＨのペプチド類は、本発明のモノクローナル抗
体類を導出するための免疫原として特に好ましい。Ａお
よび／またはＢ置換基として用いるために適したアミノ
酸類は、Ｃｙｓ、Ｌｙｓおよび↑ｒｐを含むが、Ｃｙｓ
が好ましい。最も好ましい実施態様においては、Ａまた
はＢのいずれかがＣｙｓであるペプチド類の混合物が使
用される。Ａおよび／またはＢ置換基としてアミノ酸が
用いられる場合には、それは該ｒａｓ　ｐ２１蛋白質の
配列の一部を構成するものではなく、結合基として機能
していると容易に理解される。

高速液体クロマトグラフィー等のそれ自体公知の方法に
よる精製後、たとえば上述したような該ペプチド類が、
本発明の特定の抗体類を調製するための免疫原として好
適に使用され得る。このような免疫原は、該ペプチド類
の各々を、通常使用されている免疫原性担体物質に共有
的に結合させることにより容易に得られる “免疫原性担体物質”なる用語は、宿主動物中において
免疫原性応答を独立的に導出する性質を有し、かつ、該
ポリペプチド類中の遊離のカルボキシル、アミノまたは
ヒドロキシ基と免疫原性担体物質の対応する基との間に
おける直接的ペプチドまたはエステル結合の形成による
か、Ｃｙｓ残基のスルフィドリル基を介してのカップリ
ングによるか、または別法として通常使用されている二
官能性結合試薬を介しての結合のいずれかにより前記ポ
リペプチド類に共有的に結合され得る物質類を包含する
ことを意味する。

本発明のポリペプチド類の免疫原性担体物質に対する共
有カップリングは、この技術において公知の方法により
実施することができる。かくして例えば直接共有カップ
リングに当っては、カルボジイミド、最も好ましくはジ
シクロへキシルカルボジイミドまたは１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドをカッ
プリング剤として使用することができる。このような直
接カップリングにおいては、この工程に対してわずかに
酸性の反、応媒体、例えば約３から６．５の範囲、最も
好ましくは約４から６．５の範囲のｐＨを有する媒体を
使用することが望ましい。

カップリングを行なうために適した二官能性結合剤は、
ゲルタールアルデヒドのようなＣ２−、ジアルカナール
である。このようなカップリングは、Ｓ、＾ｌ”ａｆｆ
ｌｅａｓの（１＋ｕｗｕｎｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ　６
　、４３（１９６９）　）により記載されている条件を
使用して、好適に実施することができる。

本発明のポリペプチド類の免疫原性担体物質へのカップ
リングに用いるための更に別の好ましい試ｉ！！、ｍ−
マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
（Ｈａｓ）であって、これは室温において例えばジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）等の水溶性溶媒中で使用する
ことができる。ｐＨ７，２の適当なリン酸塩緩衝溶液中
に溶解された該免疫原性担体物質を用いることが好まし
い。

得られた免疫原は、更に精製することなく、または、必
要ならば、例えば未反応のペプチドおよびカップリング
剤を除くための透析もしくは別法として適当なカラム材
料、例えばセファデックスＧ−２５によるカラムクロマ
トグラフィー等の当分野で周知の方法による精製の後に
使用することができる。

本発明の免疫原の調製において使用できる適当な担体物
質は、蛋白質類、ポリペプチド類、例えばポリリジンま
たはアミノ酸類の共重合体、多糖類などのような天然ま
たは合成重合体化合物を含む。特に好ましい担体物質は
、蛋白質類およびポリペプチド類、特に蛋白質類である
。

本発明の免疫原の調製において使用される蛋白質の同定
は、狭く臨界的なものではない。適当な蛋白質の例とし
ては、例えばヒトガンマグロブリン、ヒト血清アルブミ
ン、ウシ血清アルブミン、メチル化ウシ血清アルブミン
、ウサギ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、ウシ
タイログロブリンおよびウマガンマグロブリン等の哺乳
類血清蛋白質類またはヘモシアニン、最も好ましくはキ
ーホールリンペット　ヘモシアニン等の非哺乳類蛋白質
類を含んでいる。

本発明の該免疫原類は、宿主動物中に正常および変異ｒ
ａｓ　ｐ２１ＴＬｅｕ６１蛋白質のそれぞれに対して特
異的な抗体類の形成を、かかる宿主中に該免疫原を、好
ましくは補助剤を用いて注射することにより誘導するた
めに使用することができる。ある期間を通じて反復注射
することにより、改善された力価を得ることができる。

この目的に適した宿主動物は、ウサギ、モルモット、ウ
マ、ヤギ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ等の哺乳類を
含む。

得られた抗血清は、各腫瘍遺伝子蛋白質類と選択的に複
合体を形成するであろう抗体類を包含する。

このような血清は、それ自体該腫瘍遺伝子蛋白質類の分
析の実施において使用可能であり、または必要であれば
抗体類を、例えば硫酸アンモニウム沈澱に続くゲルクロ
マトグラフィーのようなこの分野において周知の方法を
使用して濃縮することができる。別法であるが本発明の
好ましい実施態様においては、変異ｒａｓ　ｐ２１蛋白
質類の検出に有用なモノクローナル抗体類が、例えばＭ
ｉｌｓｔｅｉｎおよびＫ１５ｈ　ｌｅｒの（Ｎａｔｕｒ
ｅ、％汚、４９５−４９７．１９７５）に記載されてい
る方法のような当分野で公知の方法により得られ得る。

このような方法においては、本発明の免疫原は、マウス
またはラット中に注射される。該宿主動物は、次いで解
剖され、そのヒ臓から取出された細胞がミエローマ細胞
と融合される。

その結果は、　ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
）類”と称される融合細胞であって、それはインビトロ
において再生成する。ハイプリドーマの母集団は、免疫
原として使用された該ポリペプチドに対する単一の抗体
種をそれぞれ分泌する個々のクローンを単離するために
選別される。このようにして得られた個々の抗体種は、
該免疫原性物質上に認識される特異的な抗原性部位に対
する応答において生じた免疫された動物由来の単一のＢ
細胞の産生物である。この場合、正常または変異蛋白質
の部分配列が用いられたため、該抗体は、該部分配列の
みならず該全蛋白質に対してもまた特異的であり得る。

更に、該正常ペプチド配列に対する該モノクローナル抗
体類は、該正常および変異ｐ２１蛋白質の両方を認識す
るが、該変異ペプチドに対して生じたモノクローナル抗
体は、変異蛋白質には選択的に結合するが、正常蛋白質
には結合しない。

次いで、異なったハイブリドーマ細胞株類は、所望の抗
原に対する抗体を産生ずるものを同定するために選別さ
れる。各々のハイブリドーマ細胞株により産生される抗
体類は、本発明におけるそれらの用途の選択の前に、好
ましくはそれらの最初の産生を刺激する免疫原性物質に
対して最良の親和性を有するものを同定するために選別
される。

本発明に従って製造されたモノクローナル抗体は、いず
れの通常の免疫測定分析においても試験試料中、好まし
くはヒト組織または尿、血液、組織抽出物、もしくは唾
液等の生物学的液中のそれぞれのｒａｓ　ｐ２１蛋白質
類を検出するために使用され得る。このような方法のひ
とつにおいては、既知量の分析されるべき試料、本発明
の該特異的抗体および標識ｒａｓ　ｐ２１正常または変
異［ｍｕｔａｎｔ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）　］ポ
リペプチド類または蛋白質類が共に混合されて放置され
る。該抗体−抗原複合体は、結合されない試薬類からこ
の分野で公知の方法、すなわち硫酸アンモニウム、ポリ
エチレングリコール、または過剰のもしくは不溶性担体
に結合された第２の抗体を用いた処理によって分離され
る。適当な不溶性担体は、キナール（Ｋｙｎａｒ）、デ
クストラン被覆活性炭等の重合体類を含む。該標識ｒａ
ｓポリペプチドまたは蛋白質の濃度は、前記ポリペプチ
ドまたは蛋白質が結合または非結合状態で見出される相
のいずれかにおいて測定される。次いで、該特異的ｒａ
ｓ　ｐ２１蛋白質の試料中の含存量は、それ自体公知の
方法で標準曲線から決定され得る。この様な適切な標準
曲線は、既知量のｒａｓ　ｐ２１蛋白質と所定量の標識
ｒａｓ　ｐ２１蛋白質および本発明のｒａｓ　ｐ２１特
異性抗体とを混合し、各既知量に対する結合の程度を測
定することにより得ることができる。本発明の抗体類は
、該正常および変異形態のｒａｓ　ｐ２１蛋白質を区別
することができるため、該ｒａｓ腫瘍遺伝子蛋白質の変
異形態の存在の測定、およびそれらの程度の定量化を、
該蛋白質の他の形態の存在下において行なうことが可能
である。

該正常または変異ｒａｓ腫瘍遺伝子蛋白質に特異的であ
って、該抗原に対する結合に対して互いに干渉しない２
種類の異なったモノクローナル抗体の使用は、２一部位
免疫測定分析法において採用されうる。適した同質およ
び異種２一部位免疫測定分析方法は、米国特許第４，３
７６．１１０号に記載されている。

本発明の実施において使用することができる更に別の免
疫測定方法は、免疫ブロット技術の使用を含む。この技
術において、該ｒａｓ　ｐ２１蛋白質を含有する試料は
、ＳＯＳ試料緩衝溶液と、スルフィドリル還元剤として
の２−メルカプトエタノールと共にまたはその不存在で
、混合され、煮沸されて、ポリアクリルアミドゲル上で
電気泳動にかけられる。蛋白質類は、“トランスブロツ
ビ装置を用いて、ＴｏｉｖｂｉｎらのＰｒｏｃｄ、Ｎａ
ｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ。

川、４３５０−４３５２（１９７９）に記載された方法
に従って、ニトロセルロースフィルターに電気泳動的に
移される。緩衝化されたウシ血清アルブミンを用いた前
熟成後に、該フィルターは、所望のヒトｒａｓ　ｐ２１
蛋白質に対する抗血清と共に一夜熟成される。次いで、
該フィルターは、洗浄され、該ｒａｓ特異性抗体が発現
された種のＩｇＧに対して支配的な、適切な標識抗血清
と共に順次的に熟成される。このような第２の抗体は、
放射性同位体の様な通常の標識により、またはパーオキ
シダーゼ等の酵素などにより標識できる。次いで、該フ
ィルターは、再び洗浄され、該蛋白質のバンドが観察さ
れるまで該酵素に対する適切な基質と共に熟成される。

試験試料中にｒａｓ蛋白質が存在するか否かのみを知る
必要がある場合には、全一特異性抗体の使用が採用され
得る。他方、変異ｒａｓ蛋白質の存在または不存在を測
定すべき場合には、この変異ｒａｓ蛋白質に対して特異
的な変異抗体がそれぞれの試験試料について使用される
。

また、本発明の抗体類は、異種的“サンドインチ”型分
析においても使用され得る。このような異種分析におい
ては、非標識抗体、好ましくはモノクローナル抗体が、
分析されるべき蛋白質を試料から抽出するために使用さ
れ、このような抗体は免疫測定分析において通常使用さ
れる支持体のいずれかに固定化される。これらの支持体
のうちには、濾紙、プラスチックビーズまたは、ポリエ
チレン、ポリスチレン、ポリプロピレンもしくは他の適
当な材料からなる試験管が含まれる。この目的のために
は、アガロース、交差結合デキストランおよび他の多ｖ
Ｍ類等の特別な材料もまた有用である。このような結合
のための技術は、当業者には周知である。例えば抗体類
は、多ｔＪ！ＩＩ重合体に対して米国特許第３．６４５
．８５２号に記載されている工程を用いて結合すること
ができる。

本発明において使用される標識された特異的抗体類は、
当分野で知られている免疫測定分析に使用されているも
のと同じ標識により提供され得る。

これらの中には、米国特許第３．９４０，４７５号に記
載されているようなケイ光測定により検出するためのケ
イ光化標識、および米国特許第３．６４５，０９０号に
記載されているような酵素的マーカーがあげられる。ま
た、例えば、Ｈｕｎ　ｔｅｒおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ
の（Ｎａｔｕｒｅ　１４４．、９４５（１９６２）　）
またはＤａｖｉｄらの（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
１３．１０１４（１９７４）　：ｌの方法を用いた、例
えば■１２５等の放射標識抗体を使用することも可能で
ある。

典型的な異種的サンドインチ分析においては、該不溶性
サンドインチ複合体に会合した標識抗体の量が、適当な
方法により不溶性担体物質を試験することにより測定さ
れる。しかしながら、液体試料中の試験蛋白質の存在ま
たは不存在は、分析中に反応せずに可溶性形態で残る標
識抗体の量に関連させて分析することも可能である。

更に本発明の他の実施態様においては、本発明の該抗体
類は、それらに特異的に反応する各々のｒａｓ蛋白質類
の免疫親和性クロマトグラフィー精製のために使用する
ことができる。この目的のために、該抗体類は、それ自
体公知の方法により母体に固定化され、好ましくは、Ｐ
ｈａｒｍａｉａ　（ウプサラ、スウェーデン）から商業
的に入手可能なセファローズＩＶＢ等の交差結合アガロ
ース等の適当な免疫親和性クロマトグラフィー母体に共
有的に結合される。種々の供給源からの免疫親和性クロ
マトグラフィーによるヒトｒａｓ蛋白質類の精製は、周
知のいずれかの方法、すなわちバッチ式または好ましく
はカラムクロマトグラフィーのいずれかにより実施する
ことができる。

限定的な意味ではないが、より特定的には本発明は、以
下に関するものである。

変異配列（Ｔ）は、上述したように６１番目のコドンに
おいて異なっており、ＡがＨであり、かつＢがＯＨであ
る配列Ｉにおいて示されるようにＬｅｕが、Ｇｉｎを置
換している。Ｔ配列の２つのペプチドは、Ｃｙｓがアミ
ノまたはカルボキシル末端のいずれかに付加されて合成
された。このことは、ある種のペプチドがアミノ末端に
おいてＣｙｓに結合した場合に免疫原性であり、一方、
他のものはカルボキシル末端において結合した場合、免
疫原性であるという観察に基づいている。抗体産生の可
能性を増大させるために、両方のペプチドが調製され、
プールされ、ＫＬＨに接合された。１０匹のマウスが該
ペプチドにより注射され、それらの免疫応答について、
精製された細菌的に製造された正常および変異ｒａｓ　
ｐ２１蛋白質類を用いたＥＬＩＳＡ分析により試験され
た。

融合のために選ばれたマウスは、正常蛋白質よりも変異
蛋白質に関して４倍高い血清力価を持っていた。融合細
胞が置かれている２４００マイクロタイターの穴のうち
、εＬＩＳＡ分析によって試験した約７００穴からの上
澄みは、両方の蛋白質に対して陽性であった；しかしな
がら、一つの穴の上澄みは、変異蛋白質のみを認識した
。この穴からの細胞を、クローン化し、腹水産生のため
にマウス中に注射した。ｒａｓ　（５３−６９）　Ｌｅ
ｕ６１　と称されるこの調製物からの腹水液を、実施例
５で述べたと同様にしてアフィニティー精製した。ｒａ
ｓ　（５３−６９）　Ｌｅｕ６１抗体に対するＥＬＩＳ
Ａ力価は、正常蛋白質に対して＜１０２であり、一方、
変異蛋白質に対する力価は、１０６であった。これらの
結果は、背景の５倍を超える指数を与える抗血清の最大
希釈の逆数として示されている。

アフィニティー精製したｒａｓ　（５３−６９）　Ｌｅ
ｕ６１モノクローナル抗体を、免疫ブロット実験におい
て精製し、細菌的に調製した正常および変異ｒａｓ　ｐ
２１蛋白質類に対するその反応性について試験した。

ゲル電気泳動およびＣｏｍｍａｓｓｉｅブルーで染色し
た後の精製蛋白質の移動を調べた。変異蛋白質は、５ｒ
ｉｖａｓｔａｖａらの（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２．３Ｂ−４２（１９８５））によ
って示されている様に正常蛋白質よりも早く移動する。

それ程強くないバンドが、正常蛋白質よりもゆっくりと
、また変異蛋白質よりも早く移動することが分った。ま
た、二重線ｐ２１バンドも、それらのアミノ酸配列の１
２位にＬｅｕを有する蛋白質に特異的なマウスモノクロ
ーナル抗体およびウサギポリクローナル抗体を使用して
Ｃ１ａｒｋらの（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ　８２．５２８０−５２８４（１９８５）　
）によって検出された。ゆるやかなバンドの由来は未知
であるが、それらは混合実験において追加的マーカーと
して役立つ。

蛋白質・類が、Ｈ−ｒａｓ蛋白質と特異的に反応す゛る
ことか示されているウサギアフィニティー精製ｒａｓ’
　（１７１−１８９）抗体を用い免疫ブロットによって
検出されたＣＢｉｚｕｂらのＯｎｃｏｇｅｎｅ、　１９
８７）、抗−Ｈｒａｓペプチド抗血清は、ｒａｓ’の可
変的カルボキシル末端に対して検出させるため、それは
変異および正常蛋白質類を同等によく認識する；抗体も
また、それ程強くない種を認識した。免疫ブロット後、
両方の蛋白質類に対するモノクローナル抗体ｒａｓ　（
５３−６９）　Ｌｅｕ６１の反応性を試験した。該モノ
クローナル抗体は、ｐ２１ＴＬｅｕ６１蛋白質を特異的
に認識した；高蛋白質濃度においても正常ｒａｓ　ｐ２
１蛋白質とは反応しなかった。このことは、両方の蛋白
質が適用されたレーン中において、はっきりと見られた
。

アフィニティー精製ｒａｓ（５３−６９）Ｌｅｕ６１モ
ノクローナル抗体を、正常および変異蛋白質を含む組織
培養細胞の免疫組織化学的染色に使用した。Ｎｌｌ１３
Ｔ３細胞（Ｃ）、ｃ−ｒａｓ’Ｌｅｕ６１で形質転換さ
れたＮＩＨ３Ｔ３細胞および正常ラットｃ−ｒａｓ’で
形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した。２０ない
し８０μｇ／ｍｌの抗体濃度において（Ａ、Ｄ、Ｅ、）
　ｃ−ｒａｓ’Ｌｅｕ６１で形質転換されたＮ　Ｉ　Ｈ
３Ｔ３細胞の細胞質染色が、容易に検出された；これら
の細胞は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中の正細胞内質に比較して
１０４ｇｔ量の変異蛋白質を産生ずる。染色パターンは
、Ｂｉｚｕｂらの（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、前出文献）によ
って先に述べられたラットモノクローナル抗体Ｙ１３−
２３８およびウサギアフィニティー精製ＩＩ−ｒａｓ（
１７１−１８９）特異的抗体により見出されたものと類
似していた。′染色は、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡが第１の
抗体に代えて用いられた場合または正常な旧１１３　Ｔ
　３細胞中においては検出されなかった。ＬＴＲ制御下
ラッうｃ−ｒａｓ’で形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞
は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較して約１００倍の量の正常
ｐ２１蛋白質を含んでいる。ｒａｓ　（５３−６９）　
Ｌｅｕ６１抗体の高い濃度（８０μｇ／ｄ）において、
ある種の染色がこれらの細胞中に見られた。しかしなが
ら、これは１０倍低い変異蛋白質に関して観察された強
度とは接近していなかった。

従って、我々の分析は、モノクローナル抗体、ｒａｓ　
（５３−６９）　Ｌｅｕ６１がＥＬＩＳＡ分析における
正常蛋白質に比較して変異蛋白質とでも少なくとも１０
４倍、免疫ブロット実験においても、少なくとも１０２
倍、および組織培養細胞の免疫組織化学染色においても
少なくとも１０”倍反応することを示す。免疫沈澱法は
、ｒａｓ　（５３−６９）　Ｌｅｕ６１抗体について未
だに改良されていない。

該モノクローナル抗体は、更に種々のマウスモデル系の
発癌性の免疫組織化学的分析に使用することができる。

この配列は、ｒａｓ’、　ｒａｓにおよびｒａｓＮヒト
およびマウス蛋白質におけるのと同一であるので、これ
はまたマウスおよびヒト両者の腫瘍中の３種全ての対応
する変異蛋白質の検出にも有用である。

実施例１ ペフ・　・の礼菅１と　人 免疫のために使用されるペプチドの合成を、メリフィー
ルドの固相方法によって行なった。粗調製物を、Ｐｅ１
ｉｘらの［ｒｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ｒｅｓ、＋筺、１３０−１４８（１９８５）　）の
手法を用いる予備的高圧液体クロマトグラフィーによっ
て均質に精製し、酸加水分解後、期待されたアミノ酸組
成物を得た。

該蛋白質（４■）を、結合剤としてｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドを使用し、キャ
リアー蛋白質、キーホール　リンペット　ヘモシアニン
（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉ
ｎ）（［、Ｈ）　（５ｍｇ）に結合させた。接合および
その後の検査を、Ｇｒｅｅｎらの（Ｃｅｌｌ、２８，４
７７−４８７．　（１９８２）　）によって記述されて
いる様にして行なった。

１、　Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−
Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−ＧｌｕＧｌｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ
−ＯＨの合成固相ペプチド合成を、操作手法を用いてＲ
Ｄ２０振盪ヘッド（Ｋｒａｆｔ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ、
Ｉｎｃ、Ｍｉｎｎｉｏｌａ＋ＮＹ）を備えたＳ−５００
型振盪機に取り付けられた直立した容器中で行なった。

Ｃｙｓ　（Ｄｍｂ）　−１％交交差台したポリスチレン
（２００−４００メツシユ）樹脂（４ｇ、　０．４８ｍ
モル／ｇ樹脂）を、対称無水物方法を用いて１７循環の
固相ペプチド合成に付した。

保護された最終ペプチド樹脂の一部（１，２ｇ）を、０
°Ｃで１時間、無水液体ＩＰ　（１０％ジチオエタンを
含む２０ｄ）で処理し、蒸発させた（高真空、ＣａＯト
ラップ）。粗ペプチドおよび樹脂混合物を、ＥｔＯ＾Ｃ
で摩砕し、ＴＦ＾で抽出し、蒸発し、エーテルで摩砕し
、乾燥して５１０ｍｇを得た。粗生成物の一部（３０１
ａ＋ｇ）を、蒸留水に溶解し、濾過し、Ｎｕｃｌｅｏｓ
ｉｌ　Ｃ＋＊　５　ｕカラム（２，５Ｘ　２５ｃｍ）に
入れた。該生成物を、（Ａ）：　ｏｚｏ（０，１％ＴＦ
＾含有）および（Ｂ）　：ＣＨ＋ＣＮ（０，１％ＴＦ＾
含有）からなる溶媒系により、１０〜３５％（Ｂ）から
の直線勾配を用いて１５０分間において溶離した（５ｉ
ｘ分）。

分画を１分ごとに集め、各部分を、分析用ＨＰＬＣ系を
用いて分析した。生成物を含む分画を合し、蒸発し、凍
結乾燥して純粋なペプチド：３３■を得た。該生成物は
、分析用ＨＰＬＣの結果、均質であることを示し、そし
て期待されたアミノ酸組酸物を得た（６Ｎ　ＨＣＩ、　
１１０°、２４時間）：八ｓｐ３．０６；　　Ｓｅｒ、
　　１．０２；　　Ｇｌｕ、　　３．Ｌ５；　Ｇｌｙ、
　　０．９５；　　Ａｌａ。

２．００；　　Ｍｅｔ、　　１．０５；　　ｌｉｅ、　
　０．８０；　　Ｌｅｕ、　　１．８６；　Ｔｙｒ。

１．１０；　　Ａｒｇ、１．０４゜ Ｉｌ、　　Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−
Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−八ｌａ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ａｓ
ｐ−ＯＨの合成Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−１％交交差台した
ポリスチレン樹脂（５，０ｇ、　０．３９ｍモル／ｇ樹
脂）を、第１部に述べたと同様にして１７循環の固相ペ
プチド合成に付し、無水肝で開裂させ、そして精製した
。該生成物は、分析用ＨＰＬＣによって均質であること
を示し、期待したアミノ酸組成物を与えた（６Ｎ１１Ｃ
Ｌ　１１０”　、　２４時間）　：　Ａｓｐ、３．０１
；　Ｔｈｒ、　０．９６；Ｓｅｒ、　０．９２；　Ｇｌ
ｕ、　３．１２：　Ｇｌｙ、　１．０３；　Ａｌａ、　
２．０４；Ｍｅｔ、　　１．９２；　　Ｉｌｅ、　　０
．９６；　　Ｌｅｕ、　　２．０３；　　Ｔｙｒ、　　
１．０１；Ａｒｇ、　１．０１゜ ＩＩＩ、Ｌｅｕ−八３ｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｔ
ｈｒ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＧｌｕＧｌｕ−Ｔｙｒ
−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｏｆｆの
合成りｏｃ　Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−樹脂（２ｇ、　０．
５ｍモル／ｇ樹脂）を、Ｖｅｇａモデル１０００ペプチ
ド合成装置上の反応容器に充填し、１７循環固相ペプチ
ド合成を行なった。１ｇの集合し保護されたペプチド樹
脂を、第１部に述べたと同様にしてＩＩＦで開裂させ、
精製した。最終生成物は、分析用）ＩＰＬｃによって均
質であり、期待されたアミノ酸組成物を与えた。

ＩＶ、　　Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１ｉｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−八ｒｇ−＾５ｐ−Ｃｙ
ｓ−ＯＨＢｏｃ−Ｃｙｓ　（４−メチルベンジル）−樹
脂（２ｇ、　０．６５ｍモル／ｇ樹脂）を、１７循環の
固相ペプチド合成に付し、第１部に述べたと同様にして
無水１１Ｆで開裂させ、精製した。精製された生成物は
、分析ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによって均質であるべきことを
示し、予期したアミノ酸組成物が得られた。

■、主キーールリンペット　ヘモシアニンによるｔｌ−
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−八
Ｉａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＧｌｕＧｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−およびＣ
ｙｓＬｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｔｈｒ
−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−
５ｅｒ−へｌａ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−へｓｐ−の接合５０
％グリセリン中の１２ｍｇのキーホール　リンペット　
ヘモシアニンを、２５°Ｃで、ＤＭＦ（０，２ｍｆ）中
のｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−サクシンイミドエステ
ル（２，１■）の溶液中に添加し、３０分間磁気撹拌し
た。該反応混合物を、０，０５Ｍ　ＮａＨｔＰＯ４（ｐ
Ｈ６，０）で予め平衡にしたセファデックスＧ−２５カ
ラム（１，２Ｘ５０ｃｍ）に充填した。分画（１ｍ１７
分）を集め、第一番目の主ピーク（２８０ｎｍによって
検出）をためた（ＭＢ−ＫＬＨ複合体〕。結合すべきペ
プチド類（各々５■）を、１　ｍｌの０．０５Ｍ　Ｎａ
ＨｚＰＯ４緩衝液（ｐＨ６）中の２のＢＭ−ＫＬＨ複合
体に添加し、反応混合物のｐＨを、ＩＮ　ＮａＯＨ（ｍ
ｌ量）の添加によって７−７．５に調整し、２５°Ｃで
１夜攪拌した。反応混合物を、４°Ｃで７２時間、繰返
し交換しながらダルベツコ（Ｄｕ　ｌ　ｂｅｃｃｏ）の
リン酸塩緩衝食塩水に対して透析した（３５００Ｍ−切
離）、透析された溶液（１８ｍｌりを、抗体の発生に直
接使用した。

実施例２ ２１ＴＬｅｕ６１　　　ベタ　−の 先に報告されたインビボ変異誘発方法の修正された方法
を、発現ベクターの構築のために使用し、６１ｓｔコド
ンの第２位にＡＴトランスバージョンを含むｒａｓ’ｐ
２１蛋白質を生成させた（ＭｏｒｉｎａｇａらのＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　２　、６３６−６３９（１９
８４）　）　、小さな制限断片を、変異誘発法において
、その使用に当って、この変異を含んだゲノムｒａｓ’
腫瘍遺伝子を含むクローンから単離した。エクソン２　
Ａｃｃｌ−Ｆｓｐｌ断片（６４塩基対）を、ｐＪＣＬ−
３３およびＬａｃａ　ｌ　らの（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８１．５３０３−５３０９
（１９８４））に従って構築された細菌細胞中で正常１
−ｒａｓ　ｐ２１を生産する発現ベクターからの、線状
（ＰｖｕｌＩ）および裂孔（ｇａｐｐｅｄ）　（Ｈ４ｎ
ｄＩＩ　Ｉ）　Ｄ　Ｎ　Ａと混合した。

該混合物を、変異された断片が、発現ベクターからの突
孔化したＤＮＡにアニールできる様に変性させ、また正
常状態に戻した。ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼＩのフ
レナラ断片によって修復させ、結合させ、温度感受性ラ
ムダファージリプレッサー蛋白質をコードするプラスミ
ドｐＲＫ２４８ｃｒ　ｔｓ（ＣｒｏｗｅｌらのＧｅｎｅ
　３Ｂ、　３ｌ−３８（１９８５）　）を有するＥ、ｃ
ｏｌｉ発現クローンを形質転換するために使用した。個
々のコロニーからプラスミドＤＮＡを、Ｂｉｚｕｂ　ら
の（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、
８３＋　６０４８６０５２（１９８５）　）によって先
に報告されている様にコドン６１においてへＴトランス
バージョンを認識するＸｂａｌを用いて消化によって選
別した。ｌ−４ａｓ　ｐ２１蛋白質を、Ｅ、ｃｏｌｔ中
において合成させ、抽出手順として８Ｍ尿素を使用して
、Ｍａｎｎｅらの（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、８１．５３０
３−５３０９（１９８４）　）の修飾法によって単離し
た。

実施例３ のプロトコール はぼ１２週令の雌のＢａ１ｂ／Ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏ
ｎ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ）を、完結Ｆｒｅｕｄのアジュバント
（Ｇｉｂｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ
、ＮＹ）と１：１に混合されたＫＬＨ結合蛋白質の１０
０ｍｇを用いて腹腔内接種によって免疫化させた。マウ
スをまた、後足に５０ｕｌのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　Ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ（Ｄｉｒｃｏ）で筋肉内接種によって
免疫化させた。更に、免疫化を、最初の注射後、６週お
よび１０週ロー不完全なＦｒｅｕｄのアジュバントと１
：１で混合されたＫＬＨ結合蛋白質の１００μｇを使用
して行なった。これらのマウスを５ケ月間休ませた。全
ての血清試料を、Ｂｉｚｕｂらの（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、
　１　１３１＝１４２（１９８７））によるＥＬＩＳＡ
分析によって抗−ペプチド抗体の存在について試験した
。９６大のマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ
　Ｉｌ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、穴当りｌ　ＯＯｎｇ正
常および変異ペプチドまたは４００ｎｇの正常または変
異ｐ２１蛋白質で被った。ＥＬＴＳＡ分析によって、融
合にそれを使用するために選んだマウスは、ｐ２１ＴＬ
ｅｕ６１蛋白質による方が、正常ｐ２１蛋白質によるよ
りも４倍高い血清力価を有していた。

実施例４ 鳳−一金 融合の４．３および２日前、選択されたマウスを、ＰＢ
Ｓ中の接合ペプチド４００μｇ、２００μｇ、および２
００μｇ　（Ｓｔａｅｈｌｉ　　らのＪ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏＭｅｔｈｏｄｓ。

牝、　２９７−３０４（１９８０）　）のそれぞれを用
いて腹腔内接種によって免疫化した。１１目に肺臓を除
去し、細胞をＧａ１ｆｒｉおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ　ｐａ
ｒｔ　Ｃ７３，３−４６（１９８１））によって述べら
れたＮＳＯ骨髄腫系によりＦａｃｅｋａｓ　らの（Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏ＋。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、３５．１−２１（１９８０））方法を
使用して融合した。該細胞を、ＨＡＴ培地中２．５　Ｘ
　１０’ＮＳＯ細胞／　ｍｌの濃度において２５−９６
穴の組織培養プレート中に接種した。１０日ないし２週
間後、上澄み液を除去し、正常ｒａｓ’ｐ２１蛋白質に
対するのではなく変異物に対する抗体の存在についてＥ
ＬＩＳＡ分析によって試験した。一つだけの上澄み液の
抗体（ｒａｓ　（５３−６９）　Ｌｅｕ６１ｍＡＢ）が
変異物を認識し、正常ｐ２１蛋白質でないことが分かっ
た。陽性の穴からの細胞を、Ｃｏｆｆ１ｎｏらの（Ｊ、
Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、　７９．　（１９７２））
に述べられた軟寒天中で２回クローン化させた。腹水液
を、Ｋｗａｎらの（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ、ｅｄｓ。

５ｅｔｔｏｒｏ　＆　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ　Ｐｌｅｎ
ｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ。

ＮＹ、３１−４５．（１９８０）　）　ニ述ヘラレタト
同様ニシテ、ＣＦＡ、１５マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において５×１０６細胞／マ
ウスを接種することによって調製した。

実施例５ ｒａｓ　（５３−６９）　Ｌｅｕ６１モノクロ−ル　　
の実施例４に述べたと同様にして調製した５　ｍｌの腹
水液を、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ＾１７０−ターを使用して
、２０００ｒｐｍ　Ｔ：　１０分間遠心分離によって清
澄化させた。

ＡｆｆｉＧｅｌ蛋白質八Ｍａｐｓ　へＩキフト（Ｂｉｏ
ｒａｄ、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＣｅｎｔｒｅ、　ＮＹ＋Ｕ
ＳＡ）を使用して、製造者の仕様書に従って抗体を精製
した。溶出した抗体を、ＰＢＳ　（２５ｍＭＮａＰＯ４
，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，２）に対して透析し
た。

蛋白質の濃度を、Ｂｉｏｒａｄの蛋白質分析キットの使
用によって測定した。ＥＬＩＳＡ分析を、精製した抗体
を滴定するために使用した。

実施例６ 細胞を、穴当り２Ｘ１０’の細胞を接種した４室Ｌａｂ
−Ｔｅｋ組織培養スライド（Ｍｉｌｅｓ　ＬａｂＯｒａ
ｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、＋　Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ｆＬ、　ＵＳＡ）
上で１夜生育させ、Ｆｕｒｔｈらの（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、
４３．２９４−３０４．　（１９８２）　）に述べられ
たと同様にしてメタノールで固定した。

Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキ・ント　（マウスＩｇ
Ｇ）　（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕ
ｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＩＪｓＡ）を、Ｂｉｚｕｂら
の（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、　１．１３１−１４２（１９８
７）　）の方法による組織培養のペルオキシダーゼ染色
に使用した。

アフィニティー精製したｒａｓ（５３−６９）Ｌｅｕ６
１　ｍＡｂによる免疫ブロットを、以下の様に行なった
。精製した細菌的に調製した正常および変異ｔｌ−ｒａ
ｓ蛋白質類（Ｌｅｕ６１）を、ＳＯＳ試料緩衝液と（昆
合し、５分間沸騰させ、更に１２．５％のポリアクリル
アミドゲルを通じて電気泳動により分別した。免疫ブロ
ットを、予備染色したＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ、　ＭＤ）低分子量マーカーを用いて配列させた。精
製した変異蛋白質および正常ｐ２１蛋白質を、Ｃｏｍｍ
ａｓｓｉｅブルーを用いて染色した。バぶルＢおよびＣ
からの蛋白質を、製造者の仕様書に従ってｌ１ｏｅｆｆ
ｅｒのトランスブロットの装置を使用してニトロセルロ
ースフィルター（０，２２μｍ）に移した。フィルター
（パネルＢおよびＣ）を、３７°Ｃで一夜、ＰＢＳ中の
３％ゼラチンおよび０．０２％ＮａＮ、と共に培養した
。

ＰＢＳですすいだ後、パネルＢ中のフィルターを、ウサ
ギアフィニティー精製Ｉｆ−ｒａｓ（１７１−１８９）
特異的抗体と共に培養した。ウサギポリクローナル抗体
を、ＰＢＳ中、１μｇ７ｍｌの濃度に希釈し、ゆるやか
に振盪させながら、室温で３．５時間、“パネルＢ″の
フィルターと共に培養した。パネルＣからのフィルター
を、ＰＢＳ中で７５μｇ／ｍｆｌに希釈したアフィニテ
ィー精製ｒａｓ（５３−６９）Ｌｅｕ６１　ｍＡｂと共
に、ゆるやかに振盪しながら室温で２．５時間培養した
。次いでこれをＰＢＳですすぎ、ＰＢＳおよび０．２％
ＢＳＡ中で１１５００に希釈したヤギ抗−マウス■ｇＧ
抗体（Ｉｌｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄａｎａｐｏｌｉｓ。

ＩＮ）と共に培養し、更にゆるやかに振盪しながら室温
で２時間培養した。パネルＢおよびＣのフィルターを、
ＰＢＳおよび０．０５％ツイーン２０中、室温で１５分
間洗浄した。フィルターを、抗体緩衝液ｐＨ６，５（２
０ｍＭ　ＮａＰＯ４，０，５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％
ツイーン２０．１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ：＋）中
で１／１０００に希釈した１２５１蛋白質Ｇ　（１２ｍ
Ｃｉ／　ｕ　ｇ）　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡ
ｒｌｌｎ。

ＩＬ）と共に、ゆる′やかに振盪しながら室温で２時間
培養した。それらを、室温で１５分間、ＰＢＳおよヒ０
．０５％ツイーン２０で４回洗浄し、サランラップで包
み、−７０°Ｃで２日間Ｌｉｇｈｔｉｎｇ　Ｐｌｕｓス
クリーンを用い予備閃光されたコダックＸＡＲ５フィル
ムに露光させた。Ｃｏｍｍａｓｓｉｅブルーで染色した
ゲルおよびパネルＢおよびＣに対応するオートラジオグ
ラムを、蛋白質が整列できる様に同一の倍率で写真にと
った。

出願人　　エフ・ホフマン・う・ロシュ・ラント・コン
パニー・アクチェンゲゼルシャフト代理人　弁理士　平
　木　祐　輔

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、【遺伝子配列があります】（ I ）および【遺伝子
   配列があります】（II） （ただし、Ａは、Ｈ−または免疫原性担体物質に共有的
   に結合可能な側鎖官能基を有するアミノ酸残基であり、
   Ｂは、−ＯＨまたは免疫原性担体物質に共有的に結合可
   能な側鎖官能基を有するアミノ酸残基である） からなる群から選択されるポリペプチド。 ２、カルボキシ末端がポリスチレン固相合成樹脂に対し
   て共有的に結合され、側鎖およびＮ−末端において保護
   された形態の請求項１に記載のポリペプチド。 ３、ｒａｓｐ２１ＴＬｅｕ６１変異蛋白質に選択的に結
   合し、他のいかなるｒａｓｐ２１蛋白質とも非−交差反
   応性であるモノクローナル抗体。 ４、抗体調製のための免疫原性担体物質に対し共有的に
   結合されてなる、請求項１に記載のポリペプチド。 ５、請求項２に記載のポリペプチドから樹脂を脱保護し
   、および脱離することからなる請求項１に記載のポリペ
   プチドの製造方法。 ６、免疫親和性クロマトグラフィーまたは免疫測定分析
   用の試薬としての、請求項１に記載のポリペプチドに対
   して特異的な抗体の使用。 ７、請求項１に記載の配列 I または配列IIのペプチド
   類の混合物が用いられている免疫原性組成物により常に
   導出され、該混合物はＡがＣｙｓである第１のペプチド
   またはＢがＣｙｓである第２のペプチドを用いて得られ
   ることを特徴とするモノクローナル抗体。 ８、請求項１に記載の配列IIのペプチドからなる免疫原
   性組成物により常に導出され、正常および変異ｒａｓｐ
   ２１配列と反応的であるモノクローナル抗体。 ９、請求項３に記載の抗体を用いることを特徴とする試
   験試料中のｒａｓｐ２１ＴＬｅｕ６１蛋白質に対する免
   疫測定分析。 １０、異種分析である請求項９に記載の免疫測定分析。 １１、免疫ブロット法を用い、試験試料中の分析される
   該ｒａｓｐ２１ＴＬｅｕ６１蛋白質と請求項３に記載の
   該抗体との間に形成される免疫複合体の存在を、該免疫
   複合体を標識第２抗体に接触させることにより測定する
   請求項１０に記載の免疫測定分析。 １２、第２抗体が酵素により標識され、この酵素の基質
   が添加され、該基質の無色から着色状態への変化を生じ
   る請求項１１に記載の免疫測定分析。 １３、同質分析である請求項９に記載の免疫測定分析。 １４、既知量の標識ｒａｓｐ２１ＴＬｅｕ６１蛋白質ま
   たはその６１位にまたがる部分配列を用いる競合阻害分
   析である請求項１３に記載の免疫測定分析。 １５、試験試料がヒト生物学的液体である請求項１１に
   記載の免疫測定分析。