JP2020534796A - エピトープ翻訳後修飾状態に特異的な抗体の開発方法及び開発のための組成物 - Google Patents

エピトープ翻訳後修飾状態に特異的な抗体の開発方法及び開発のための組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、とりわけ、目的のタンパク質を認識する抗体を生成する方法を提供する。幾つかの態様において、目的のタンパク質は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を含有する。幾つかの態様において、翻訳後修飾を含まない部位に特異的に結合する非ＰＴＭ結合抗体を生成する方法が提供される。幾つかの態様において、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する既存の抗体からもたらされる複数の抗体を含む汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリーが、提供される。さらなる態様において、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する既存の抗体からもたらされる複数の抗体を含む非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーが、提供される。【選択図】図１

Description

[0002]多くの細胞活動は、リン酸化のような、翻訳後修飾により制御される。しかしながら、細胞成長、機能、発生、及び分化におけるこれらの修飾の役割の研究は、特異的な試薬の欠如により妨害される。最も一般に使用される、抗体（「Ａｂ」）を生成する方法は、動物の免疫を通じてである。しかしながら、この方法は、一般に、低処理であり、高価であり、時間がかかり、生成されたＡｂは、新たに補充することが常に可能なわけではない。翻訳後修飾特異的なＡｂクローンの希少さは、課題になる。
[0003]翻訳後修飾抗原に対する抗体を生成する伝統的な方法は、現在、効率的ではない。さらに、対の１つのメンバーが、修飾されたエピトープに結合し、対の第２のメンバーが、修飾されていない同じ配列に結合する、Ａｂ対を開発する、現行の方法はない。
[0004]したがって、特異的な翻訳後修飾状態を有するエピトープを認識し、結合し、及び／又はモジュレートする抗体の開発の改良された方法及び組成物が依然として必要とされている。
[0005]特異的な翻訳後修飾を有するエピトープを認識し、結合し、及び又はモジュレートする抗体の開発を可能にする方法が、本明細書において提供される。本開示は、初めて、翻訳後修飾特異的な抗体の産生への構造ベース指向進化のアプローチを記載する。幾つかの実施形態において、特異的な、翻訳後修飾されたエピトープに結合する既存の傾向及びコンテキスト配列に結合する一般的な様式を有する抗体フレームワークに基づく焦点が絞られた抗体ライブラリーを産生する方法が、本明細書において記載される。
[0006]本開示は、とりわけ、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケット内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；ＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対してライブラリーをスクリーニングし、これにより、汎ＰＴＭ結合抗体を同定する工程を含む、ＰＴＭ状態に無関係に翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を認識する抗体を生成する方法を提供する。
[0007]本開示は、とりわけ、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；ＰＴＭと相互作用することが決定されている抗体のＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位において荷電していないアミノ酸を導入する工程；ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケット内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；ＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対してライブラリーをスクリーニングし、これにより、汎ＰＴＭ結合抗体を同定する工程を含む、修飾状態に関わらず又は修飾状態に依存のいずれかで、翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を認識する抗体を生成する方法を提供する。
[0008]幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、天然に存在するＰＴＭ部位である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、遺伝子操作されたＰＴＭ部位である。幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、部位特異的変異誘発により、目的のペプチド又はタンパク質に導入される。当該技術分野において公知の様々な様式を使用して、遺伝子操作されたＰＴＭ部位を生じさせることができる。幾つかの実施形態において、部位特異的変異誘発は、点変異、一連の点変異、欠損又は挿入を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、目的のペプチド又はタンパク質において１個又は複数のアミノ酸置換により導入される。幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、１個又は複数のアミノ酸の目的のペプチド又はタンパク質への挿入により導入される。幾つかの実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質に挿入された１個又は複数のアミノ酸は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、１個又は複数のアミノ酸置換は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸置換であり得る。
[0009]幾つかの実施形態において、生じた抗体は、修飾状態に関わらず、ＰＴＭ部位を認識する。幾つかの実施形態において、生じた抗体は、修飾状態に依存して、ＰＴＭ部位を認識する。例えば、幾つかの実施形態において、修飾状態は、ＰＴＭを欠くことであり得る。
[0010]幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位が、構造上予想されたものである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位は、実験で決定されたものである。幾つかの実施形態において、任意の荷電していないアミノ酸が使用され得るが、荷電していないアミノ酸は、アラニン又はグリシンである。当該技術分野における様々な方法を使用して、荷電していないアミノ酸を導入することができる。荷電していないアミノ酸を導入する任意の適当な方法が使用され得る。幾つかの実施形態において、荷電していないアミノ酸は、部位変異誘発により導入される。
[0011]本明細書における方法は、任意のＰＴＭに適用され得る。例えば、ＰＴＭは、任意の種類のアセチル化、アミド化、脱アミド、プレニル化（例えば、ファルネシル化若しくはゲラニル化）、ホルミル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、ニトロシル化、リン酸化、シアリル化、硫酸化、ポリシアリル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化、リボシル化、硫酸化、又はその任意の組合せであり得る。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、負に荷電している、正に荷電している、親水性である、及び／又は疎水性である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、リン酸化である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、グリコシル化である。幾つかの実施形態において、グリコシル化は、シアリル化、アセチル化又はメチル化である。
[0012]１つの態様において、本開示は、とりわけ、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；ＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対してライブラリーをスクリーニングし、これにより、非ＰＴＭ結合抗体を同定する工程を含む、翻訳後修飾の非存在下でＰＴＭ部位に特異的に結合する非ＰＴＭ結合抗体を生成する方法を提供する。
[0013]１つの態様において、本開示は、とりわけ、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；ＰＴＭと相互作用することが決定されている抗体のＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位におけるＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸を導入する工程；ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側のいずれかの１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；及びＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対してライブラリーをスクリーニングし、これにより、非ＰＴＭ結合抗体を同定する工程を含む、翻訳後修飾される可能性を有する部位だが、かかる部位が、翻訳後修飾（ＰＴＭ）により修飾されていないとき、部位に特異的に結合する非ＰＴＭ結合抗体を生成する方法を提供する。
[0014]幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、天然に存在するＰＴＭ部位である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、遺伝子操作されたＰＴＭ部位である。幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、部位特異的変異誘発により、目的のペプチド又はタンパク質に導入される。当該技術分野における公知の様々な様式を使用して、遺伝子操作されたＰＴＭ部位が産生され得る。幾つかの実施形態において、部位特異的変異誘発は、点変異、一連の点変異、欠損又は挿入を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、目的のペプチド又はタンパク質における１個又は複数のアミノ酸置換により導入される。幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、１個又は複数のアミノ酸の目的のペプチド又はタンパク質への挿入により導入される。幾つかの実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質に挿入される１個又は複数のアミノ酸は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、１個又は複数のアミノ酸置換は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸置換であり得る。
[0015]幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位は、構造上予想されたものである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位は、実験で決定されたものである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、負に荷電している。ＰＴＭは、任意の負に荷電したＰＴＭであり得る。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、リン酸化である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、グリコシル化である。幾つかの実施形態において、グリコシル化は、シアリル化である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸である。天然に存在する又はしない、任意の種類の負に荷電したアミノ酸は、本明細書において提供される方法において使用され得る。幾つかの実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。
[0016]幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、正に荷電している。ＰＴＭは、任意の正に荷電したＰＴＭであり得る。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、レチニリデンシッフ塩基形成又はアルギニル化である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸である。天然に存在する又はしない、任意の種類の正に荷電したアミノ酸は、本明細書における方法において使用され得る。幾つかの実施形態において、正に荷電したアミノ酸は、リジン、アルギニン、又はヒスチジンである。
[0017]幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、非標準的なアミノ酸である。天然に存在する又はしない、任意の種類の非標準的なアミノ酸は、本明細書における方法において使用され得る。幾つかの実施形態において、非標準的なアミノ酸は、ホスホセリン、ホスホチロシン、ｐ−アジド−フェニルアラニン、ベンゾイル−フェニルアラニン、又はアセチル−リジンである。
[0018]幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、サプレッサーｔＲＮＡにより導入される。天然に存在する又はしない、任意の種類の、この方法で導入されたアミノ酸は、本明細書における方法において使用され得る。幾つかの実施形態において、かかるアミノ酸は、セレノシステイン又はピロリジンである。
[0019]幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、疎水性である。任意の種類の疎水性ＰＴＭは、本明細書における方法に修正可能である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭが疎水性であるとき、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、親水性である。したがって、幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、親水性である。天然に存在する又はしない、任意の種類の親水性アミノ酸は、本明細書における方法において使用され得る。幾つかの実施形態において、親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、又はスレオニンである。
[0020]幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、親水性である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭが親水性であるとき、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、疎水性である。したがって、幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、疎水性である。天然に存在する又はしない、任意の種類の疎水性アミノ酸は、本明細書における方法において使用され得る。幾つかの実施形態において、疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである。
[0021]当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸を導入することができる。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、部位変異誘発により導入される。
[0022]幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケット部位に隣接するコンテキスト配列を、無作為化して、非ＰＴＭ結合抗体のライブラリーを生成する。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の上流又は下流の３〜１５個の残基を含む。当該技術分野において公知の部位特異的変異誘発の任意の方法を使用して、ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域を無作為化することができる。例えば、エラープローンＰＣＲ、プライマー伸長による部位特異的変異誘発、インバースＰＣＲ、クンケルベースの変異誘発、カセット変異誘発、全体プラスミド変異誘発、ＡＸＭ変異誘発、エラープローンローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、又はｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的変異誘発を使用して、無作為化をコンテキスト配列に導入して、抗体ライブラリーを生成することができる。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域は、エラープローンローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により、無作為化される。
[0023]幾つかの実施形態において、コンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域は、ＰＴＭ結合ポケットを変化させることなく、無作為化される。
[0024]任意の種類のライブラリーは、候補汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体をディスプレイするため使用することができる。例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ及び／又はｍＲＮＡディスプレイを使用することができる。幾つかの実施形態において、候補汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。
[0025]幾つかの実施形態において、候補汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーは、少なくとも１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、又は１０１２の多様性を有する。
[0026]当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、抗体ライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、ファージディスプレイ又はマイクロエマルジョンスクリーニングアプローチを使用することができる。幾つかの実施形態において、ライブラリーをスクリーニングする工程は、ホールセルパニングを含む。幾つかの実施形態において、ホールセルパニングは、エマルジョンベースである。
[0027]幾つかの実施形態において、方法は、同定された汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を検証する工程をさらに含む。当該技術分野において公知の任意の方法は、汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を検証するために使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又は機能的アッセイは、抗体検証のため使用することができる。幾つかの実施形態において、検証工程は、高処理である。
[0028]上で、及び以下でより詳細に考察される通り、本明細書における方法のＰＴＭは、任意の種類のＰＴＭであり得、抗体の検証は、様々な方法、例えば、高処理の検証を通じて又は機能的アッセイを用いて行うことができる。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、リン酸化であり、高処理の検証工程は、ホスホ−セリン又はホスホ−チロシンを、抑制可能なアンバー（ＵＡＧ）停止コドンに組み込み、これにより、汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を検証するためのリン酸化タンパク質を産生する細胞株の使用を含む。
[0029]本明細書において記載される方法において、任意の種類の細胞を使用することができる。例えば、細胞は、古細菌細胞、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、又は真核生物の細胞であり得る。幾つかの実施形態において、細胞株は、大腸菌である。幾つかの実施形態において、細胞株は、昆虫細胞株である。
[0030]幾つかの実施形態において、同定された汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体は、機能的アッセイにより検証される。幾つかの実施形態において、汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を検証する工程は、検証を行うために、ｓｃＦｖをＩｇＧに変換する工程を含む。当該技術分野における任意の方法は、ｓｃＦｖをＩｇＧに変換するために使用することができる。例えば、ｓｃＦｖをＩｇＧに変換する１つの方法は、可変重鎖及び軽鎖遺伝子をｐＭＩＮＥＲＶＡベクターにクローニングする工程及びＣＨＯ細胞の一過性遺伝子導入によりベクターを発現させる工程を含む。
[0031]さらなる実施形態において、検証工程は、同定された汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体が、ＰＴＭに対する立体インヒビター抗体であるかを決定することを含む。
[0032]幾つかの実施形態において、目的の酵素上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；酵素上のＰＴＭ部位に結合するＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；目的の酵素に対するライブラリーをスクリーニングする工程及びＰＴＭ修飾の非存在下でＰＴＭ部位を認識する抗体を選択する工程；並びに酵素活性アッセイを行うことにより、立体阻害性抗体を選択する工程を含む、酵素に対する立体阻害性抗体を生成する方法が提供される。
[0033]幾つかの実施形態において、目的の酵素上のＰＴＭ部位を遺伝子操作する工程；目的の酵素上の遺伝子操作されたＰＴＭ部位を特異的に認識する抗体を用意する工程；抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；酵素上の遺伝子操作されたＰＴＭ部位に結合するＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；遺伝子操作されたＰＴＭ部位を有さない目的の酵素に対するライブラリーをスクリーニングする工程及び遺伝子操作されたＰＴＭ部位の非存在下で抗体を認識する抗体を選択する工程；並びに酵素活性アッセイを行うことにより、立体阻害性抗体を選択する工程を含む、酵素に対する立体阻害性抗体を生成する方法が提供される。
[0034]幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、天然に存在するＰＴＭ部位である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、遺伝子操作されたＰＴＭ部位である。幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、部位特異的変異誘発により、目的の酵素に導入される。当該技術分野において公知の様々な様式を使用して、遺伝子操作されたＰＴＭ部位を産生することができる。幾つかの実施形態において、部位特異的変異誘発は、点変異、一連の点変異、欠損又は挿入を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、目的の酵素における１個又は複数のアミノ酸置換により導入される。幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、１個又は複数のアミノ酸の目的の酵素への挿入により、導入される。幾つかの実施形態において、目的の酵素に挿入された１個又は複数のアミノ酸は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、１個又は複数のアミノ酸置換は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸置換であり得る。
[0035]幾つかの実施形態において、汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体は、先行する開示のいずれか１つの方法に従い生成される。
[0036]１つの態様において、本開示は、とりわけ、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する既存の抗体からもたらされる複数の抗体を含む汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリーを提供し、複数の抗体は、ＰＴＭ結合ポケット及びＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合する１個又は複数の無作為化された領域を含む。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケットは、ＰＴＭと相互作用することが決定されている１個又は複数の部位において荷電していないアミノ酸を含む。
[0037]天然に存在する又はしない、任意の荷電していないアミノ酸は、本明細書における方法において使用され得る。幾つかの実施形態において、荷電していないアミノ酸は、アラニン又はグリシンである。
[0038]本明細書において提供される方法におけるＰＴＭは、任意のＰＴＭであり得る。例えば、ＰＴＭは、任意の種類のアセチル化、アミド化、脱アミド、プレニル化（例えば、ファルネシル化若しくはゲラニル化）、ホルミル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、ニトロシル化、リン酸化、シアリル化、硫酸化、ポリシアリル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化、リボシル化、硫酸化、又はその任意の組合せであり得る。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、リン酸化である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、グリコシル化である。任意の種類のグリコシル化は、本明細書において記載される方法と合致する。幾つかの実施形態において、グリコシル化は、シアリル化である。
[0039]１つの態様において、本開示は、とりわけ、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する既存の抗体からもたらされる複数の抗体を含む非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーを提供し、複数の抗体は、ＰＴＭ結合ポケット及びＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合する１個又は複数の無作為化された領域を含み、ＰＴＭ結合ポケットは、ＰＴＭと相互作用することが決定されている１個又は複数の部位におけるＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸を含む。
[0040]幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、負に荷電している。任意の負に荷電したＰＴＭは、本明細書において記載される方法と合致する。幾つかの実施形態において、非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーは、ＰＴＭを特異的に認識する既存の抗体からもたらされる複数の抗体を含む。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、リン酸化である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、グリコシル化である。幾つかの実施形態において、グリコシル化は、シアリル化である。
[0041]幾つかの実施形態において、非ＰＴＭ結合抗体を生成する方法は、抗体のＰＴＭ結合ポケットにおける１個又は複数の部位においてＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸を導入する工程を含む。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸である。天然に存在する又はしない、任意の負に荷電したアミノ酸は、本明細書において記載される方法において使用することができる。幾つかの実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。
[0042]幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、正に荷電している。任意の正に荷電したＰＴＭは、本明細書において記載される方法と合致する。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、レチニリデンシッフ塩基形成又はアルギニル化である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸である。天然に存在する又はしない、任意の正に荷電したアミノ酸は、本明細書において記載される方法において使用することができる。幾つかの実施形態において、正に荷電したアミノ酸は、リジン、アルギニン、又はヒスチジンである。
[0043]幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、疎水性である。任意の疎水性ＰＴＭは、本明細書において記載される方法と合致する。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、親水性である。天然に存在する又はしない、任意の親水性アミノ酸は、本明細書において記載される方法を用いて使用することができる。幾つかの実施形態において、親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、又はスレオニンである。
[0044]幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、親水性である。任意の親水性ＰＴＭは、本明細書において記載される方法と合致する。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、疎水性である。天然に存在する又はしない、任意の疎水性アミノ酸は、本明細書において記載される方法において使用することができる。幾つかの実施形態において、疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである。
[0045]上で、及びさらに以下の詳細において記載される通り、ＰＴＭは、任意のＰＴＭであり得る。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、リン酸化である。本明細書において記載される方法において、既存の抗体は、任意のリン酸化残基に結合することができる。幾つかの実施形態において、リン酸化残基は、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、及び／又はＴｈｒである。したがって、幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、リン酸化であり、既存の抗体は、リン酸化Ｓｅｒ（ｐＳｅｒ）、リン酸化Ｔｙｒ（ｐＴｙｒ）、及び／又はリン酸化スレオニン（ｐＴｈｒ）に結合する。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＳｅｒである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＴｙｒである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＴｈｒである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＨｉｓ（リン酸化ヒスチジン）である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＡｒｇ（リン酸化アルギニン）である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＬｙｓ（リン酸化リジン）である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＳｅｒ、ｐＴｙｒ、ｐＴｈｒ、ｐＨｉｓ、ｐＡｒｇ、及び／又はｐＬｙｓの組合せである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＳｅｒ及びｐＴｙｒの組合せである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＳｅｒ及びｐＴｈｒの組合せである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＴｙｒ及びｐＴｈｒの組合せである。
[0046]幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケットは、ＣＤＲ Ｈ２領域及び／又はＣＤＲ Ｌ２領域を含む。幾つかの実施形態において、１個又は複数の無作為化された領域は、ＰＴＭ部位の上流又は下流の３〜１５個の残基を含むコンテキスト配列に結合する。
[0047]幾つかの実施形態において、汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーの１個又は複数の無作為化された領域は、無作為ＣＤＲ Ｈ３、又はＬ３を含む。幾つかの実施形態において、１個又は複数の無作為化された領域は、無作為ＣＤＲ Ｈ１、Ｌ１、Ｈ３及び／又はＬ３を含む。幾つかの実施形態において、１個又は複数の無作為化された領域は、無作為化されたフレームワーク領域を含む。
[0048]幾つかの実施形態において、汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーのＰＴＭ結合ポケットは、ＣＤＲ Ｈ２領域を含み、１個又は複数の無作為化された領域は、無作為ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ３、及び／又はＣＤＲ Ｌ２を含む。
[0049]幾つかの実施形態において、汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーの１個又は複数の無作為化された領域は、部位特異的変異誘発により生成される。
[0050]幾つかの実施形態において、汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーの１個又は複数の無作為化された領域は、エラープローンＲＣＡにより生成される。
[0051]幾つかの実施形態において、汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーの１個又は複数の無作為化された領域は、アラニン及び／又はヒスチジンスキャニングにより、生成される。
[0052]幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリー、細菌ディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、及びｍＲＮＡディスプレイライブラリーからなる群から選択される。
[0053]幾つかの実施形態において、ライブラリーは、抗体フラグメントから選択される複数の抗体を含む。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はＩｇＧから選択される複数の抗体を含む。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーである。幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖライブラリーは、Ｍ１３ ｓｃＦｖライブラリーである。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２より大きな多様性を有する。
[0054]本開示は、とりわけ、負に荷電したアミノ酸を含むように修飾された目的の修飾されたペプチドを用意する工程、負に荷電したアミノ酸へとバイアスをかけた抗体ライブラリーに対する修飾されたペプチドをスクリーニングする工程、目的の修飾されたペプチドに結合する１個又は複数の抗体を単離する工程；及び１個又は複数の抗体の修飾を含まない目的のペプチドへの結合を決定し、これにより、目的のペプチドに結合する抗体を同定する工程を含む、目的のペプチドへの抗体を産生する方法を提供する。
[0055]本開示は、とりわけ、負に荷電したアミノ酸を含むように修飾された目的の修飾されたペプチドを用意する工程、負に荷電したアミノ酸へとバイアスをかけた抗体ライブラリーに対する修飾されたペプチドをスクリーニングする工程、目的の修飾されたペプチドに結合する１個又は複数の抗体を単離する工程；親和性成熟により、１個又は複数の抗体のクローン型のライブラリーを生成する工程；修飾を含まない目的のペプチドに対するクローン型のライブラリーをスクリーニングし、これにより、目的のペプチドに結合する抗体を同定する工程を含む、目的のペプチドへの抗体を産生する方法を提供する。
[0056]実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、リン酸化アミノ酸である。実施形態において、リン酸化アミノ酸は、ホスホセリン（ＳＥＰ）又はホスホチロシンである。実施形態において、リン酸化アミノ酸は、ホスホセリン（ＳＥＰ）である。実施形態において、リン酸化アミノ酸は、ホスホチロシンである。実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、目的のペプチド内の天然に存在するアミノ酸を置換する。実施形態において、抗体ライブラリーは、ホスホバイアス抗体ライブラリーである。実施形態において、ホスホバイアス抗体ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリー、細菌ディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、又はｍＲＮＡディスプレイライブラリーから選択される。実施形態において、抗体ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。実施形態において、抗体ライブラリーは、抗体フラグメントから選択される複数の抗体を含む。実施形態において、抗体ライブラリーは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はＩｇＧから選択される複数の抗体を含む。実施形態において、抗体ライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーである。実施形態において、ｓｃＦｖライブラリーは、Ｍ１３ ｓｃＦｖライブラリーである。実施形態において、抗体ライブラリーは、約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、若しくは１０１２又は１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、若しくは１０１２より大きな多様性を有する。実施形態において、抗体ライブラリーは、約１０１３、１０１２、１０１１、若しくは１０１０又は１０１３、１０１２、１０１１、若しくは１０１０より小さな多様性を有する。実施形態において、方法は、目的のペプチドに結合する抗体の親和性成熟をさらに含む。実施形態において、親和性成熟は、指向進化により行われる。実施形態において、親和性成熟は、修飾されたペプチドに結合する１個又は複数の抗体のＣＤＲ−Ｈ２及び／又はＣＤＲ−Ｌ２領域の外側の配列を無作為化する工程を含む。実施形態において、親和性成熟は、エラープローンＰＣＲ変異誘発を含む。実施形態において、スクリーニング工程のそれぞれは、ホールセル、細胞フラグメント、又は単離されたタンパク質において行われる。実施形態において、スクリーニング工程のそれぞれは、ホールセルパニングを含む。実施形態において、ホールセルパニングは、エマルジョンベースである。実施形態において、エマルジョンベースのスクリーニングは、遅延エマルジョン感染性（ＤＥＩ）である。実施形態において、目的のペプチドは、目的のタンパク質のエピトープに基づく。実施形態において、エピトープは、目的のタンパク質の外部ドメイン内にある。実施形態において、エピトープは、直線性エピトープである。実施形態において、エピトープは、立体構造又は不連続エピトープである。実施形態において、目的のペプチドは、約５〜３０個のアミノ酸を含む。実施形態において、目的のペプチドは、およそ約１０〜２０個のアミノ酸を含む。実施形態において、目的のペプチドは、目的のタンパク質の外部ドメインにおける３個毎、４個毎、５個毎、６個毎、７個毎、８個毎、９個毎、又は１０個毎のアミノ酸の周りの配列を含む。実施形態において、目的のペプチドは、目的のタンパク質の外部ドメインにおける５個毎のアミノ酸の周りの配列を含む。実施形態において、目的のペプチドは、グリコシル化部位を含まない。実施形態において、目的のタンパク質は、細胞表面受容体である。実施形態において、細胞受容体は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、酵素結合受容体、又はリガンド開口型イオンチャンネル受容体である。実施形態において、細胞受容体は、レプチン受容体、グルカゴン受容体、インスリン受容体、ＣＸＣＲ４、ＮＴＳＲ１、ＮＴＳＲ２又は受容体チロシンキナーゼである。実施形態において、方法は、抗体が目的のタンパク質に結合するかを試験する工程をさらに含む。実施形態において、方法は、抗体が目的のタンパク質の機能を阻害するかを試験する工程をさらに含む。実施形態において、目的のタンパク質の機能は、競合的阻害により、抗体によって阻害される。実施形態において、目的のタンパク質の機能は、非競合的阻害により、抗体によって阻害される。実施形態において、非競合的阻害は、アロステリック阻害である。実施形態において、方法は、目的のタンパク質の機能が抗体により増大されかを試験する工程をさらに含む。
[0057]本開示は、とりわけ、目的のタンパク質由来の配列に基づきペプチドを合成する工程であって、配列は、負に荷電したアミノ酸を含むように修飾される、工程、先行する請求項のいずれか１つの方法に従い、ペプチドに結合する抗体を同定する工程；及び抗体が目的のタンパク質の機能を阻害するかを試験する工程を含む、目的のタンパク質を阻害する抗体を産生する方法を提供する。実施形態において、方法は、抗体が目的のタンパク質を立体的に阻害するかを決定する工程をさらに含む。
[0058]本出願において使用される、用語「約」及び「およそ」は、均等なものとして使用される。本明細書における刊行物、特許、又は特許出願への任意の引用は、それらの全体が参照により組み込まれる。約／およそと共に又はなしで本出願において使用される任意の数は、当業者により認識される任意の通常の変動をカバーすることを意味する。
[0059]本発明の他の特性、目的、及び利点は、続く詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明が、本発明の実施形態を示しながら、制限ではなく説明のみの目的で与えられることは、理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び修飾は、詳細な説明から当業者に明らかとなる。
図１は、リン酸化状態に特異的な抗体（リン酸化状態に特異的な抗体クローン型）をもたらす方法の１つの実施形態を示す一連の模式図である。模式図は、特異的なコンテキスト配列のＰＴＭ状態（例えば、リン酸化状態；リン酸化状態に特異的な抗体クローン型）を検出するそれらの能力においてのみ異なる抗体クローン型を開発する方法を説明する。方法をさらに使用して、リン酸化誘導体をまず産生して、結合を方向付け、次に、この誘導体を親和性成熟させて、コンテキスト配列への親和性を増大させることにより、任意の所定のペプチドに対する抗体をもたらすことができる。 図２は、細胞表面タンパク質のインヒビターである抗体の開発を描写するフロー図である。図２、パネルＡは、目的の受容体の外部ドメインの重複する部分を含む１０〜２０−ｍｅｒのペプチドの合成を描写する（ＧＰＣＲを描写する）。このフロー図において、１０〜２０ｍｅｒのペプチドを、天然に存在するアミノ酸を置き換える中央のホスホ−セリン（ＳＥＰ）を用いて合成する。図２、パネルＢは、目的の細胞表面タンパク質に対する抗体アロステリックインヒビターを開発するプロセスにおけるファージディスプレイステージを描写する。このフロー図において、ファージディスプレイを使用して、リン酸化特異的なｓｃＦｖヒットを同定する。図２、フロー図のパネルＣは、同定したヒットが変異誘発され、天然の配列ペプチドに対して成熟（例えば、発見成熟（「ＤｉｓＭＡＴ」）及び／又は親和性成熟（「ＡｆｆＭＡＴ」）を経験することを示す。図２、フロー図のパネルＤは、ＩｇＧを精製し、続いて、細胞ベースのアッセイにおいて精製したＩｇＧを試験することを示す。 図３は、ヒトトロンビンタンパク質の模式図及び本明細書において記載される方法に従って、ヒトトロンビンタンパク質に対して開発した抗体アロステリックインヒビターの活性を描写する一連のグラフ（図３、パネル（ａ）〜（ｄ））を示す。 図４、パネルＡ〜Ｆは、計算的な方法及びアラニンスキャニング（パネルＥ）の実験データに基づき、リン酸化ペプチドと複合したＳｃＦｖのモデルを描写する一連の模式図（パネルＡ〜Ｄ及びＦ）である。図４、パネルＡは、ロゼッタタンパク質モデリングソフトウエアのロゼッタＡｂプロトコールを使用した、上の２００／２０００計算した構造デコイのオーバーレイを示す。図４、パネルＢは、２つの最大スコアの構造が、同様のＣＤＲ構造を提示したことを示す。図４、パネルＣは、構造モデルの静電気輪郭が、Ｈ２に結合している深い負に荷電した溝を提示したことを示す。図４、パネルＥは、アラニン系統的変異導入の結果を示す。図４、パネルＥにおいて示す、親和性に重要な残基は、図４、パネルＤにおいて示す溝の一部を形成する。リン酸化抗原の正に荷電した半分（ＭＡＲＲＰＲＨＳＩＹＳ（ホス）ＳＤＥＤＤＥＤＦＥ）を、溝に手動でモデル化し、ロゼッタＦｌｅｘｉＰｅｐＤｏｃｋを使用して、精密化した（図４、パネルＦ）。結果は、左の大部分のアルギニンは、タンパク質を結合していないことを示す。 図４、パネルＡ〜Ｆは、計算的な方法及びアラニンスキャニング（パネルＥ）の実験データに基づき、リン酸化ペプチドと複合したＳｃＦｖのモデルを描写する一連の模式図（パネルＡ〜Ｄ及びＦ）である。図４、パネルＡは、ロゼッタタンパク質モデリングソフトウエアのロゼッタＡｂプロトコールを使用した、上の２００／２０００計算した構造デコイのオーバーレイを示す。図４、パネルＢは、２つの最大スコアの構造が、同様のＣＤＲ構造を提示したことを示す。図４、パネルＣは、構造モデルの静電気輪郭が、Ｈ２に結合している深い負に荷電した溝を提示したことを示す。図４、パネルＥは、アラニン系統的変異導入の結果を示す。図４、パネルＥにおいて示す、親和性に重要な残基は、図４、パネルＤにおいて示す溝の一部を形成する。リン酸化抗原の正に荷電した半分（ＭＡＲＲＰＲＨＳＩＹＳ（ホス）ＳＤＥＤＤＥＤＦＥ）を、溝に手動でモデル化し、ロゼッタＦｌｅｘｉＰｅｐＤｏｃｋを使用して、精密化した（図４、パネルＦ）。結果は、左の大部分のアルギニンは、タンパク質を結合していないことを示す。 図４、パネルＡ〜Ｆは、計算的な方法及びアラニンスキャニング（パネルＥ）の実験データに基づき、リン酸化ペプチドと複合したＳｃＦｖのモデルを描写する一連の模式図（パネルＡ〜Ｄ及びＦ）である。図４、パネルＡは、ロゼッタタンパク質モデリングソフトウエアのロゼッタＡｂプロトコールを使用した、上の２００／２０００計算した構造デコイのオーバーレイを示す。図４、パネルＢは、２つの最大スコアの構造が、同様のＣＤＲ構造を提示したことを示す。図４、パネルＣは、構造モデルの静電気輪郭が、Ｈ２に結合している深い負に荷電した溝を提示したことを示す。図４、パネルＥは、アラニン系統的変異導入の結果を示す。図４、パネルＥにおいて示す、親和性に重要な残基は、図４、パネルＤにおいて示す溝の一部を形成する。リン酸化抗原の正に荷電した半分（ＭＡＲＲＰＲＨＳＩＹＳ（ホス）ＳＤＥＤＤＥＤＦＥ）を、溝に手動でモデル化し、ロゼッタＦｌｅｘｉＰｅｐＤｏｃｋを使用して、精密化した（図４、パネルＦ）。結果は、左の大部分のアルギニンは、タンパク質を結合していないことを示す。 図４、パネルＡ〜Ｆは、計算的な方法及びアラニンスキャニング（パネルＥ）の実験データに基づき、リン酸化ペプチドと複合したＳｃＦｖのモデルを描写する一連の模式図（パネルＡ〜Ｄ及びＦ）である。図４、パネルＡは、ロゼッタタンパク質モデリングソフトウエアのロゼッタＡｂプロトコールを使用した、上の２００／２０００計算した構造デコイのオーバーレイを示す。図４、パネルＢは、２つの最大スコアの構造が、同様のＣＤＲ構造を提示したことを示す。図４、パネルＣは、構造モデルの静電気輪郭が、Ｈ２に結合している深い負に荷電した溝を提示したことを示す。図４、パネルＥは、アラニン系統的変異導入の結果を示す。図４、パネルＥにおいて示す、親和性に重要な残基は、図４、パネルＤにおいて示す溝の一部を形成する。リン酸化抗原の正に荷電した半分（ＭＡＲＲＰＲＨＳＩＹＳ（ホス）ＳＤＥＤＤＥＤＦＥ）を、溝に手動でモデル化し、ロゼッタＦｌｅｘｉＰｅｐＤｏｃｋを使用して、精密化した（図４、パネルＦ）。結果は、左の大部分のアルギニンは、タンパク質を結合していないことを示す。 図４、パネルＡ〜Ｆは、計算的な方法及びアラニンスキャニング（パネルＥ）の実験データに基づき、リン酸化ペプチドと複合したＳｃＦｖのモデルを描写する一連の模式図（パネルＡ〜Ｄ及びＦ）である。図４、パネルＡは、ロゼッタタンパク質モデリングソフトウエアのロゼッタＡｂプロトコールを使用した、上の２００／２０００計算した構造デコイのオーバーレイを示す。図４、パネルＢは、２つの最大スコアの構造が、同様のＣＤＲ構造を提示したことを示す。図４、パネルＣは、構造モデルの静電気輪郭が、Ｈ２に結合している深い負に荷電した溝を提示したことを示す。図４、パネルＥは、アラニン系統的変異導入の結果を示す。図４、パネルＥにおいて示す、親和性に重要な残基は、図４、パネルＤにおいて示す溝の一部を形成する。リン酸化抗原の正に荷電した半分（ＭＡＲＲＰＲＨＳＩＹＳ（ホス）ＳＤＥＤＤＥＤＦＥ）を、溝に手動でモデル化し、ロゼッタＦｌｅｘｉＰｅｐＤｏｃｋを使用して、精密化した（図４、パネルＦ）。結果は、左の大部分のアルギニンは、タンパク質を結合していないことを示す。 図４、パネルＡ〜Ｆは、計算的な方法及びアラニンスキャニング（パネルＥ）の実験データに基づき、リン酸化ペプチドと複合したＳｃＦｖのモデルを描写する一連の模式図（パネルＡ〜Ｄ及びＦ）である。図４、パネルＡは、ロゼッタタンパク質モデリングソフトウエアのロゼッタＡｂプロトコールを使用した、上の２００／２０００計算した構造デコイのオーバーレイを示す。図４、パネルＢは、２つの最大スコアの構造が、同様のＣＤＲ構造を提示したことを示す。図４、パネルＣは、構造モデルの静電気輪郭が、Ｈ２に結合している深い負に荷電した溝を提示したことを示す。図４、パネルＥは、アラニン系統的変異導入の結果を示す。図４、パネルＥにおいて示す、親和性に重要な残基は、図４、パネルＤにおいて示す溝の一部を形成する。リン酸化抗原の正に荷電した半分（ＭＡＲＲＰＲＨＳＩＹＳ（ホス）ＳＤＥＤＤＥＤＦＥ）を、溝に手動でモデル化し、ロゼッタＦｌｅｘｉＰｅｐＤｏｃｋを使用して、精密化した（図４、パネルＦ）。結果は、左の大部分のアルギニンは、タンパク質を結合していないことを示す。 図５、パネルＡ〜Ｄは、リン酸塩特異的なライブラリーの設計及び解析を示す、一連の模式図（パネルＡ〜Ｂ）、棒グラフ（パネルＣ）、及び表（パネルＤ）である。データは、１個の残基置換が、ｐＳｅｒ結合をｐＴｙｒ結合にスイッチし得ることを示す。構造の相違を、図５、パネルＡ及びＢにおいて説明する。変異した残基を標識する。Ｈ３及びＨ２ ＣＤＲループを標識し、結合している残基を、バーとして示す。図５、パネルＣは、抗Ｍｙｂリン酸化セリン（ｐＳｅｒ）に特異的なｓｃＦｖ（ＡＸＭ１２９３）及びその変異体を用いて、ペプチドのパネルに対するＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフである。図５、パネルＤは、Ｌ２、Ｈ３及びＬ３を同時に無作為化し、異なるリン酸化標的に対してスクリーニングしたライブラリーを示す。異なるリン酸化標的に対するスクリーニングを、ＣＤＲ−Ｈ２が、ｐＳｅｒとｐＴｙｒの両方を認識するライブラリーを使用して行い、固有のヒット数を、伝統的なライブラリーアプローチと比較した。 図５、パネルＡ〜Ｄは、リン酸塩特異的なライブラリーの設計及び解析を示す、一連の模式図（パネルＡ〜Ｂ）、棒グラフ（パネルＣ）、及び表（パネルＤ）である。データは、１個の残基置換が、ｐＳｅｒ結合をｐＴｙｒ結合にスイッチし得ることを示す。構造の相違を、図５、パネルＡ及びＢにおいて説明する。変異した残基を標識する。Ｈ３及びＨ２ ＣＤＲループを標識し、結合している残基を、バーとして示す。図５、パネルＣは、抗Ｍｙｂリン酸化セリン（ｐＳｅｒ）に特異的なｓｃＦｖ（ＡＸＭ１２９３）及びその変異体を用いて、ペプチドのパネルに対するＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフである。図５、パネルＤは、Ｌ２、Ｈ３及びＬ３を同時に無作為化し、異なるリン酸化標的に対してスクリーニングしたライブラリーを示す。異なるリン酸化標的に対するスクリーニングを、ＣＤＲ−Ｈ２が、ｐＳｅｒとｐＴｙｒの両方を認識するライブラリーを使用して行い、固有のヒット数を、伝統的なライブラリーアプローチと比較した。 図５、パネルＡ〜Ｄは、リン酸塩特異的なライブラリーの設計及び解析を示す、一連の模式図（パネルＡ〜Ｂ）、棒グラフ（パネルＣ）、及び表（パネルＤ）である。データは、１個の残基置換が、ｐＳｅｒ結合をｐＴｙｒ結合にスイッチし得ることを示す。構造の相違を、図５、パネルＡ及びＢにおいて説明する。変異した残基を標識する。Ｈ３及びＨ２ ＣＤＲループを標識し、結合している残基を、バーとして示す。図５、パネルＣは、抗Ｍｙｂリン酸化セリン（ｐＳｅｒ）に特異的なｓｃＦｖ（ＡＸＭ１２９３）及びその変異体を用いて、ペプチドのパネルに対するＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフである。図５、パネルＤは、Ｌ２、Ｈ３及びＬ３を同時に無作為化し、異なるリン酸化標的に対してスクリーニングしたライブラリーを示す。異なるリン酸化標的に対するスクリーニングを、ＣＤＲ−Ｈ２が、ｐＳｅｒとｐＴｙｒの両方を認識するライブラリーを使用して行い、固有のヒット数を、伝統的なライブラリーアプローチと比較した。 図５、パネルＡ〜Ｄは、リン酸塩特異的なライブラリーの設計及び解析を示す、一連の模式図（パネルＡ〜Ｂ）、棒グラフ（パネルＣ）、及び表（パネルＤ）である。データは、１個の残基置換が、ｐＳｅｒ結合をｐＴｙｒ結合にスイッチし得ることを示す。構造の相違を、図５、パネルＡ及びＢにおいて説明する。変異した残基を標識する。Ｈ３及びＨ２ ＣＤＲループを標識し、結合している残基を、バーとして示す。図５、パネルＣは、抗Ｍｙｂリン酸化セリン（ｐＳｅｒ）に特異的なｓｃＦｖ（ＡＸＭ１２９３）及びその変異体を用いて、ペプチドのパネルに対するＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフである。図５、パネルＤは、Ｌ２、Ｈ３及びＬ３を同時に無作為化し、異なるリン酸化標的に対してスクリーニングしたライブラリーを示す。異なるリン酸化標的に対するスクリーニングを、ＣＤＲ−Ｈ２が、ｐＳｅｒとｐＴｙｒの両方を認識するライブラリーを使用して行い、固有のヒット数を、伝統的なライブラリーアプローチと比較した。 図６は、修飾したｐＭＩＮＥＲＶＡ ｓｃＦｖからＩｇＧシステムを示す一連の模式図である。ｓｃＦｖ Ａｂを、ｇｐ３−融合物としてｐＭＩＮＥＲＶＡファージミドｐＤｏｎｏｒベクターにコードし、ファージディスプレイバイオパニング法においてスクリーニングする。スクリーニング後、所望の生物物理学的特性を有するｓｃＦｖをコードするファージミドを同定する。このファージミドを、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼを発現し、一例として、ＩｇＧアクセプターベクター（ｐＡｃｃｅｐｔｏｒ）を有する、大腸菌株に導入する。組換え現象の産物は、ＣＨ遺伝子及びＶＨ遺伝子の３’末端に隣接するポリアデニル化シグナル部位を導入する。さらに、組換え現象は、哺乳類プロモーターとＶＬ遺伝子の５’の機能的タンパク質開始部位の両方を導入する。ｓｃＦｖのＶＨとＶＬドメインの間のリンカーは、ｉ）重鎖と軽鎖可変ドメインの間のペプチドリンカーと、ｉｉ）ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの３６ｂｐの機能的基質の両方として機能することができるｐｈｉＣ３１ ３６ｂｐのａｔｔＰ部位を含む。［図の説明文：Ｐｍａｍ、哺乳類プロモーター；Ｐｙｅａｓｔ、酵母プロモーター；Ｐｃｍｖ、ＣＭＶプロモーター；５’ｓｓ及び３’ｓｓ、スプライスシグナル；ＶＬ、軽鎖の可変セクション；ＶＨ、重鎖の可変セクション；ｇｐ３、ファージＭ１３遺伝子３産物；ＰＥ．ｃｏｌｉ、大腸菌プロモーター；ＣＨ又はＦｃ、重鎖の定常領域；ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、インテグラーゼ遺伝子の基質；ａｔｔＲ及びａｔｔＬ、インテグラーゼ遺伝子の産物；ｐｏｌｙＡ、ポリアデニル化配列；ＣａｍＳ、ＣａｍＲ、それぞれ、プロモーターを含む及び含まないクロラムフェニコール抵抗性遺伝子；ＴＣＲｚｅｔａ、Ｔ細胞受容体ゼータ；ＣＡＲ−Ｔ、キメラ抗原受容体；Ｐｒｏｓｐｌｉｃｅ、Ｐｒｏｃａｔ、二重機能プロモータータイプ；ＩＲＥＳ、内部リボソームエントリー部位；ＲＢＳ、リボソーム結合部位］。 図７は、親和性成熟ライブラリー構築アプローチのためのＡＸＭ変異誘発を示す一連の模式図である。オリゴヌクレオチドのプールを、５’末端に複数のホスホロチオエート結合を含有するリバースプライマーを使用したエラープローンＰＣＲ条件下で増幅する。得られた２本鎖ＤＮＡを、Ｔ７エキソヌクレアーゼを用いて処理して、ｄｓＤＮＡ分子の未修飾の鎖を選択的に分解する。次に、得られた１本鎖ＤＮＡ、又は「メガプライマー」を、ウラシル化、循環、１本鎖ファージミドＤＮＡにアニーリングし、これを使用して、ＤＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を刺激する。次に、ライゲーションしたヘテロ二本鎖産物を、大腸菌ＡＸＥ６８８細胞に形質転換し、この際、ウラシル化した鎖は、ウラシルＮ−グリコシラーゼによりｉｎ ｖｉｖｏで切断され、メガプライマーを含有する新たに合成した組換え鎖の残存が有利になる。また、Ｅｃｏ２９ｋＩを使用して、完全には組換え体ではない任意のクローンを除去する。 図８は、ファージディスプレイを示す一連の模式図である。ファージディスプレイを、タンパク質相互作用の高処理スクリーニングのため使用する。Ｍ１３糸状ファージディスプレイの場合、目的のタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを、微量なコートタンパク質をコードする、ｐＩＩＩ遺伝子にライゲーションする。次に、ファージ遺伝子及び挿入ＤＮＡハイブリッドを、大腸菌ＴＧ１に形質導入する。対象となるタンパク質標的をマイクロタイタープレートウェル又はビーズの表面に固定することにより、その表面上の抗体標的の１つに結合するＡｂを提示するファージは残存し、一方、他のものは、洗浄により取り除かれる。残存するものを、溶出し、これを使用して、さらなるファージを産生し（ヘルパーファージを用いた細菌感染による）、これにより、対象となる（すなわち、結合する）ファージが濃縮されているファージ混合物を産生する。低ｐＨ溶出バッファーを合わせて、溶出を行うことができる。これらの工程の繰り返しサイクリングを、不所望な物質を取り除くことによる貴重な試料の濃縮に関して、「パニング」として言及する。最終工程で溶出したファージを使用して、適当な細菌宿主を感染させることができ、細菌宿主から、ファージミドを集め、対象となるＤＮＡ配列を切除し、配列決定して、対象となる、相互作用するタンパク質又はタンパク質フラグメントを同定することができる。 図９は、ファージマイクロエマルジョンスクリーニング方法を示す一連の模式図である。このスクリーニングアプローチにおいて、ｓｃＦｖバリアントをコードするバクテリオファージＭ１３のライブラリーを用いて感染させた大腸菌を、油中水滴型エマルジョンにおいて抗原でコートしたビーズを用いてコンパートメント化して、平均して、１つのコンパートメント当たりおよそ１個のビーズ及び１〜１０個の感染した細菌細胞となるようにする。結果として、それぞれのコンパートメントにおいて、複数コピーの組換えファージを産生し、組換えファージの幾つかは、抗原でコートしたビーズに結合し得る。エマルジョンを破壊し、マイクロビーズを、任意の結合したファージと共に、単離する。次に、ビーズを、ＦＩＴＣに結合した抗Ｍ１３ ＩｇＧ Ａｂとインキュベートする。故に、結合したファージを含む抗原でコートしたビーズを、複数のフルオレセイン分子で標識する。次に、これらのビーズを、フローサイトメトリーソーティングにより、濃縮することができる（ビーズに結合したファージと一緒に）。 図１０、パネルＡ〜Ｂは、高いタイターの完全な組換え抗体ライブラリーを産生するためのｉｎ ｖｉｖｏ制限酵素の使用及び飽和プラスミドＤＮＡを用いた形質転換を示す一連の模式図である。図１０、パネルＡは、組換えライブラリーの産生においてＡＸＥ６８８株を使用したｉｎ ｖｉｖｏ制限酵素を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）内にＥｃｏ２９ｋＩ部位を有する親プラスミドを、ＡＸＥ６８８［＝ＴＧ１（ｅｃｏ２９ＫＩＲ、ｅｃｏ２９ｋＩＭ）］細胞において発現したＥｃｏ２９ｋＩ酵素により切断する。図１０、パネルＢは、飽和ＤＮＡを使用したｉｎ ｖｉｖｏ細胞選択を描写する。細胞の選択性を、過飽和濃度のプラスミドＤＮＡを使用することにより活用して、完全な組換えクローンの巨大なライブラリーを生成することができる。エレクトロ−コンピテント細胞アリコート内のコンピテント細胞は、混合物中のコンピテント細胞の数に関連してＤＮＡ飽和である条件下で複数のプラスミドを取り上げ得る。ＡＸＥ６８８を使用して、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで複数のプラスミド及びＥｃｏ２９ｋＩ部位を保持する制限酵素親ＤＮＡを取り上げ、これにより、より高い割合の完全組換えクローンを用いて形質転換した細胞を得る。 図１０、パネルＡ〜Ｂは、高いタイターの完全な組換え抗体ライブラリーを産生するためのｉｎ ｖｉｖｏ制限酵素の使用及び飽和プラスミドＤＮＡを用いた形質転換を示す一連の模式図である。図１０、パネルＡは、組換えライブラリーの産生においてＡＸＥ６８８株を使用したｉｎ ｖｉｖｏ制限酵素を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）内にＥｃｏ２９ｋＩ部位を有する親プラスミドを、ＡＸＥ６８８［＝ＴＧ１（ｅｃｏ２９ＫＩＲ、ｅｃｏ２９ｋＩＭ）］細胞において発現したＥｃｏ２９ｋＩ酵素により切断する。図１０、パネルｂは、飽和ＤＮＡを使用したｉｎ ｖｉｖｏ細胞選択を描写する。細胞の選択性を、過飽和濃度のプラスミドＤＮＡを使用することにより活用して、完全な組換えクローンの巨大なライブラリーを生成することができる。エレクトロ−コンピテント細胞アリコート内のコンピテント細胞は、混合物中のコンピテント細胞の数に関連してＤＮＡ飽和である条件下で複数のプラスミドを取り上げ得る。ＡＸＥ６８８を使用して、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで複数のプラスミド及びＥｃｏ２９ｋＩ部位を保持する制限酵素親ＤＮＡを取り上げ、これにより、より高い割合の完全組換えクローンを用いて形質転換した細胞を得る。 図１１、パネルＡ〜Ｃは、選択した抗体のＣＤＲＨ３に特異的な抗イディオタイプ抗体の単離を示す一連の模式図（図１１、パネルＡ）並びにグラフ（図１１、パネルＢ及びＣ）を描写する。図１１、パネルＤは、次の酵素：トロンビン、アミラーゼ及びソルターゼを阻害する単離された抗体の代表例を示す一連の模式図及びグラフを描写する。模式図は、単離した抗体が、酵素標的に結合する範囲を示す。グラフは、様々な条件下での抗体による阻害を示す。 図１１、パネルＡ〜Ｃは、選択した抗体のＣＤＲＨ３に特異的な抗イディオタイプ抗体の単離を示す一連の模式図（図１１、パネルＡ）並びにグラフ（図１１、パネルＢ及びＣ）を描写する。図１１、パネルＤは、次の酵素：トロンビン、アミラーゼ及びソルターゼを阻害する単離された抗体の代表例を示す一連の模式図及びグラフを描写する。模式図は、単離した抗体が、酵素標的に結合する範囲を示す。グラフは、様々な条件下での抗体による阻害を示す。 図１１、パネルＡ〜Ｃは、選択した抗体のＣＤＲＨ３に特異的な抗イディオタイプ抗体の単離を示す一連の模式図（図１１、パネルＡ）並びにグラフ（図１１、パネルＢ及びＣ）を描写する。図１１、パネルＤは、次の酵素：トロンビン、アミラーゼ及びソルターゼを阻害する単離された抗体の代表例を示す一連の模式図及びグラフを描写する。模式図は、単離した抗体が、酵素標的に結合する範囲を示す。グラフは、様々な条件下での抗体による阻害を示す。 図１１、パネルＡ〜Ｃは、選択した抗体のＣＤＲＨ３に特異的な抗イディオタイプ抗体の単離を示す一連の模式図（図１１、パネルＡ）並びにグラフ（図１１、パネルＢ及びＣ）を描写する。図１１、パネルＤは、次の酵素：トロンビン、アミラーゼ及びソルターゼを阻害する単離された抗体の代表例を示す一連の模式図及びグラフを描写する。模式図は、単離した抗体が、酵素標的に結合する範囲を示す。グラフは、様々な条件下での抗体による阻害を示す。 図１２、パネルＡ〜Ｄは、本明細書において記載するファージ由来ＩｇＧ抗体を使用して作製した抗体の代表例である一連のマイクログラフ及びグラフを描写する。図１２、パネルＡは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ヒトニューロブラストーマ細胞株細胞）におけるミエリン塩基性タンパク質に特異的な抗体の免疫細胞化学染色の結果を描写する。図１２、パネルＢは、ＨｅＬａ細胞において行なった、ヒストンＨ２Ｂに特異的な抗体を使用した、ウエスタンブロットを描写する。図１２、パネルＣは、フローサイトメトリー実験が、ＮＴＳＲ１ ＧＰＣＲを過剰発現した細胞株と一緒にインキュベートしたｓｃ−Ｆｖ Ｅ１抗体を使用した、フローサイトメトリーのグラフを描写する。図１２、パネルＤは、ヒストンＨ２Ｂに特異的な抗体を使用したクロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）の結果を示すグラフである。 図１２、パネルＡ〜Ｄは、本明細書において記載するファージ由来ＩｇＧ抗体を使用して作製した抗体の代表例である一連のマイクログラフ及びグラフを描写する。図１２、パネルＡは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ヒトニューロブラストーマ細胞株細胞）におけるミエリン塩基性タンパク質に特異的な抗体の免疫細胞化学染色の結果を描写する。図１２、パネルＢは、ＨｅＬａ細胞において行なった、ヒストンＨ２Ｂに特異的な抗体を使用した、ウエスタンブロットを描写する。図１２、パネルＣは、フローサイトメトリー実験が、ＮＴＳＲ１ ＧＰＣＲを過剰発現した細胞株と一緒にインキュベートしたｓｃ−Ｆｖ Ｅ１抗体を使用した、フローサイトメトリーのグラフを描写する。図１２、パネルＤは、ヒストンＨ２Ｂに特異的な抗体を使用したクロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）の結果を示すグラフである。 図１２、パネルＡ〜Ｄは、本明細書において記載するファージ由来ＩｇＧ抗体を使用して作製した抗体の代表例である一連のマイクログラフ及びグラフを描写する。図１２、パネルＡは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ヒトニューロブラストーマ細胞株細胞）におけるミエリン塩基性タンパク質に特異的な抗体の免疫細胞化学染色の結果を描写する。図１２、パネルＢは、ＨｅＬａ細胞において行なった、ヒストンＨ２Ｂに特異的な抗体を使用した、ウエスタンブロットを描写する。図１２、パネルＣは、フローサイトメトリー実験が、ＮＴＳＲ１ ＧＰＣＲを過剰発現した細胞株と一緒にインキュベートしたｓｃ−Ｆｖ Ｅ１抗体を使用した、フローサイトメトリーのグラフを描写する。図１２、パネルＤは、ヒストンＨ２Ｂに特異的な抗体を使用したクロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）の結果を示すグラフである。 図１２、パネルＡ〜Ｄは、本明細書において記載するファージ由来ＩｇＧ抗体を使用して作製した抗体の代表例である一連のマイクログラフ及びグラフを描写する。図１２、パネルＡは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ヒトニューロブラストーマ細胞株細胞）におけるミエリン塩基性タンパク質に特異的な抗体の免疫細胞化学染色の結果を描写する。図１２、パネルＢは、ＨｅＬａ細胞において行なった、ヒストンＨ２Ｂに特異的な抗体を使用した、ウエスタンブロットを描写する。図１２、パネルＣは、フローサイトメトリー実験が、ＮＴＳＲ１ ＧＰＣＲを過剰発現した細胞株と一緒にインキュベートしたｓｃ−Ｆｖ Ｅ１抗体を使用した、フローサイトメトリーのグラフを描写する。図１２、パネルＤは、ヒストンＨ２Ｂに特異的な抗体を使用したクロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）の結果を示すグラフである。 図１３、パネル（ａ）〜（ｃ）は、ウエスタン解析における修飾特異的なクローン型（「ＭＳＣ」）抗体対の同定及び検証を表す一連の模式図を示す。図１３、パネル（ａ）は、定方向リン酸化Ａｂクローン型（「ＤＰＡＣ」）の図を示す模式図である。ＤＰＡＣは、新規のリン酸化特異的抗体及び修飾を含まない、同じ配列を認識する一致する抗体対の単離及び検証のためのプラットフォームである。図１３、パネル（ｂ）は、発見成熟（「ＤｉｓＭａｔ」）の使用を通じてリン酸化特異的なファージ抗体ヒットの分子進化を説明する模式図である。図１３、パネル（ｃ）は、大腸菌における単離し、変換したＩｇＧの検証を示す模式図である。 図１４は、動物由来のリン酸化特異的な抗体の使用を示す模式図である。動物由来のリン酸化特異的な抗体を使用した研究から得たデータは、リン酸化無関係又はセリン特異的な抗体の発見における６種の試験ＲＡｂＭａクローンに対する６６％の成功率を示す。特異的リン酸化Ａｂクローン型３（「ＤＰＡＣ３」）は、既存の抗リン酸化修飾組換えモノクローナル抗体の未修飾及びリン酸化無関連のクローナルな誘導体への変換のためのプラットフォームを指す。 図１５、パネルＡ及びパネルＢは、抗ａｋｔ４７３の発見及び発見成熟（「ＤｉｓＭａｔ」）を示す一連のグラフである。 図１５、パネルＡ及びパネルＢは、抗ａｋｔ４７３の発見及び発見成熟（「ＤｉｓＭａｔ」）を示す一連のグラフである。 図１６Ａは、遅延型エマルジョン感染性（「ＤＥＩ」）：リコンビナトリアルバイオパニングを示す模式図である。ＤＥＩは、エマルジョンベースのスクリーニングアッセイである。 図１６Ｂは、ＤＥＩアッセイにおけるＭ１３による感染に対する成長温度の効果を示す棒グラフである。大腸菌ＴＧ１細胞を、２０℃、２４℃、又は３７℃においてＯＤ６００＝０．４まで成長させた。次に、細胞を、ファージとインキュベートし、洗浄し（未結合のファージを取り除き）、アンピシリン形質導入のため３７℃において播種した。それぞれの条件下でのアンピシリン抵抗性コロニーの数をカウントし、プロットした。 図１７、パネルＡ及びＢは、ＤＥＩの実施形態において使用した細菌ディスプレイシステムを示す模式図である。図１７、パネル（Ａ）は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ細菌ディスプレイシステムの模式イメージを示す。図１７、パネル（Ｂ）は、大腸菌プロモーター（ｌａｃ）、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ融合タンパク質、Ｔｅｖタンパク質分解酵素切断部位、及び抗原フラグメントを含有する発現コンストラクト及び抗原ディスプレイの模式図を示す。プロモーター、ディスプレイタンパク質（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ）、及び抗原配列はそれぞれ、代替配列のクローニングを促進するための制限酵素部位により隣接する。（右）ｐｈｉＣ３１インテグラーゼによる組み込み。大腸菌宿主において、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼタンパク質は、２つのベクターのａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列を組換え、これにより、予め規定した向きにホーミングとドナーベクター配列の両方を含む、単一のキメラ分子を産生する。組換え現象の産物は、ＶＨをＣＨ遺伝子に融合する。さらに、組換え現象は、哺乳類プロモーターとＶＬ遺伝子の５’の機能的タンパク質開始部位の両方を導入する。特に重要なことには、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬドメインの間のリンカーが、ｉ）重鎖と軽鎖可変ドメインの間のペプチドリンカー、及びｉｉ）ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの３６ｂｐの機能的基質の両方として機能することができるｐｈｉＣ３１ ３６ｂｐのａｔｔＰ部位を含む。［図の説明文：ＰＣＭＶ、ＣＭＶプロモーター；ｍＳｉｇＰ、哺乳類シグナルペプチド；ｂＳｉｇＰ、細菌シグナルペプチド；ｓｓ、スプライスシグナル；ＶＬ、軽鎖の可変セクション；ＶＨ、重鎖の可変セクション；ｇｐ３、ファージＭ１３遺伝子３産物；ＰＳａｃＲ、枯草菌ＳａｃＲプロモーター；Ｐｔａｃ、キメラｔｒｐ及びｌａｃプロモーター；Ｆｃ、重鎖の定常領域；ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ遺伝子の基質；ａｔｔＲ及びａｔｔＬ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ遺伝子の産物；ｌｏｘＰ、ｃｒｅタンパク質の基質；ｐｏｌｙＡ、ポリアデニル化配列］。 図１７、パネルＡ及びＢは、ＤＥＩの実施形態において使用した細菌ディスプレイシステムを示す模式図である。図１７、パネル（Ａ）は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ細菌ディスプレイシステムの模式イメージを示す。図１７、パネル（Ｂ）は、大腸菌プロモーター（ｌａｃ）、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ融合タンパク質、Ｔｅｖタンパク質分解酵素切断部位、及び抗原フラグメントを含有する発現コンストラクト及び抗原ディスプレイの模式図を示す。プロモーター、ディスプレイタンパク質（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ）、及び抗原配列はそれぞれ、代替配列のクローニングを促進するための制限酵素部位により隣接する。（右）ｐｈｉＣ３１インテグラーゼによる組み込み。大腸菌宿主において、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼタンパク質は、２つのベクターのａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列を組換え、これにより、予め規定した向きにホーミングとドナーベクター配列の両方を含む、単一のキメラ分子を産生する。組換え現象の産物は、ＶＨをＣＨ遺伝子に融合する。さらに、組換え現象は、哺乳類プロモーターとＶＬ遺伝子の５’の機能的タンパク質開始部位の両方を導入する。特に重要なことには、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬドメインの間のリンカーが、ｉ）重鎖と軽鎖可変ドメインの間のペプチドリンカー、及びｉｉ）ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの３６ｂｐの機能的基質の両方として機能することができるｐｈｉＣ３１ ３６ｂｐのａｔｔＰ部位を含む。［図の説明文：ＰＣＭＶ、ＣＭＶプロモーター；ｍＳｉｇＰ、哺乳類シグナルペプチド；ｂＳｉｇＰ、細菌シグナルペプチド；ｓｓ、スプライスシグナル；ＶＬ、軽鎖の可変セクション；ＶＨ、重鎖の可変セクション；ｇｐ３、ファージＭ１３遺伝子３産物；ＰＳａｃＲ、枯草菌ＳａｃＲプロモーター；Ｐｔａｃ、キメラｔｒｐ及びｌａｃプロモーター；Ｆｃ、重鎖の定常領域；ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ遺伝子の基質；ａｔｔＲ及びａｔｔＬ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ遺伝子の産物；ｌｏｘＰ、ｃｒｅタンパク質の基質；ｐｏｌｙＡ、ポリアデニル化配列］。 図１８、パネルＡ及びＢは、大腸菌の表面の１８種の別々に提示したペプチドのマルチプレックスの結果を示す一連のグラフである。最初の１０種のペプチドについての１００万個を超える抗体次世代配列（「ＮＧＳ」）読み取りの出現の解析を示す。図１８、パネルＡは、ファージヒットのＮＧＳ解析を示す。特異的な抗体配列の機能を標的Ｎ対全ＮＧＳセット（標的Ｎを差し引く）に対してグラフ化する。図１８、パネルＢは、ＮＧＳ読み取りの３つの「分類」又はグループ化の説明を示す。図１８、パネルＢにおいて示す通り、３つの分類又はグループ化は、（ｉ）濃縮した標的１特異的なｓｃＦｖ；（ｉｉ）非特異的なｓｃＦｖ；及び（ｉｉｉ）濃縮した全ての他のｓｃＦｖである。 図１８、パネルＡ及びＢは、大腸菌の表面の１８種の別々に提示したペプチドのマルチプレックスの結果を示す一連のグラフである。最初の１０種のペプチドについての１００万個を超える抗体次世代配列（「ＮＧＳ」）読み取りの出現の解析を示す。図１８、パネルＡは、ファージヒットのＮＧＳ解析を示す。特異的な抗体配列の機能を標的Ｎ対全ＮＧＳセット（標的Ｎを差し引く）に対してグラフ化する。図１８、パネルＢは、ＮＧＳ読み取りの３つの「分類」又はグループ化の説明を示す。図１８、パネルＢにおいて示す通り、３つの分類又はグループ化は、（ｉ）濃縮した標的１特異的なｓｃＦｖ；（ｉｉ）非特異的なｓｃＦｖ；及び（ｉｉｉ）濃縮した全ての他のｓｃＦｖである。 図１９は、ウエスタン解析においてオルソロガスな抗体を使用してタンパク質に対する修飾特異的なクローン型（「ＭＳＣ」）抗体の検証を示す模式図である。
定義
[0080]本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語が、まず以下で定義される。以下の用語及び他の用語についての追加の定義は、本明細書を通じて説明される。
[0081]親和性試薬：本明細書において使用される、用語「親和性試薬」は、標的分子に特異的に結合して、例えば、標的分子の活性を同定する、追跡する、捕捉するか、又は影響する任意の分子である。本明細書において記載される方法により同定されるか、又は回収される親和性試薬は、「遺伝的にコードされる」、例えば、抗体、ペプチド又は核酸であり、したがって、配列決定される能力がある。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」を、本明細書において互換的に使用して、一緒に結合した２個以上のアミノ酸を指す。
[0082]動物：本明細書において使用される、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。幾つかの実施形態において、「動物」は、発生の任意のステージにあるヒトを指す。幾つかの実施形態において、「動物」は、発生の任意のステージにある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／又はブタ）である。幾つかの実施形態において、動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／又は虫を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子操作された動物、及び／又はクローンであってもよい。
[0083]抗体：本明細書において使用される、用語「抗体」又は「Ａｂ」又は「Ａｂｓ」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。ｔｔに「特異的に結合する」又は「免疫反応する」により、抗体が、所望の抗原の１個又は複数の抗原決定基と反応することを意味する。抗体は、抗体フラグメントを含む。抗体はまた、ポリクローナル、モノクローナル、キメラｄＡｂ（ドメイン抗体）、１本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、及びＦａｂ発現ライブラリーを含むが、これらに限定されない。抗体は、抗体全体、又は免疫グロブリン、又は抗体フラグメントであってもよい。
[0084]認識された免疫グロブリンポリペプチドは、カッパー及びラムダ軽鎖並びにアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン及びミュー重鎖又は他の種における均等物を含む。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａ又は約２１４個のアミノ酸の）は、ＮＨ２末端の約１１０個のアミノ酸の可変領域及びＣＯＯＨ末端のカッパー又はラムダ定常領域を含む。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａ又は約４４６個のアミノ酸の）は、可変領域（約１１６個のアミノ酸の）及び前述の重鎖定常領域の１つ、例えば、ガンマ（約３３０個のアミノ酸の）を同様に含む。
[0085]抗原結合部位：本明細書において使用される、用語「抗原結合部位」又は「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端の可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。「高可変領域」として言及される、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐の区間は、「フレームワーク領域」、又は「ＦＲ」として公知のより保存された隣接区間の間に挿入される。したがって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンにおける高可変領域の間、高可変領域に隣接する天然で見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの高可変領域及び重鎖の３つの高可変領域を、３次元空間において互いに関連して取り決めて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖のそれぞれの３つの高可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」として言及される。
[0086]抗イディオタイプ抗体：本明細書において使用される、「抗イディオタイプ抗体」は、別の抗体の抗原結合部位に特異的に結合し、それ故、他の抗体が特異的に結合している抗体を意味する。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体により通常認識されるエピトープを模倣し得る。イディオタイプは、免疫グロブリンの可変領域における構造の遺伝的に決定されたバリエーションである。イディオタイプ可変性の正確な遺伝子バイアスは、部分的に説明されたのみであった。しかしながら、イディオタイプバリエーションは、イディオトープとしても言及される、特に、抗原結合部位の範囲内のアミノ酸配列及びタンパク質構造（いわゆる決定基）を含む。用語「イディオタイプ」は、抗体分子の可変領域の決定基の完全なセットを命名する。
[0087]およそ又は約：本明細書において使用される、目的の１個又は複数の値に適用される、用語「およそ」又は「約」は、規定の参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態において、用語「およそ」又は「約」は、別段規定されないか、又は別段前後から明白でない限り（かかる数字が、可能性のある値の１００％を超える場合を除き）、規定の参照値のいずれかの向き（大きいか、又は小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下以内にある値の範囲を指す。
[0088]生物学的に活性：本明細書において使用される、語句「生物学的に活性」は、生物学的システム、特に、生物において活性を有する任意の剤の特徴を指す。例えば、生物に投与されるとき、その生物に対する生物学的効果を有する剤は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態において、ペプチドが、生物学的に活性である場合、ペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのペプチドの一部が、「生物学的に活性な」部分として典型的に言及される。
[0089]クローン型：本明細書において使用される、用語「クローン型」は、体細胞親和性成熟を通じて同じ祖先のＢ細胞から生じる抗体のセットを指す。
[0090]特異的なリン酸化状態に特異的な抗体クローン型１（「ＤＰＡＣ１」）：本明細書において使用される、「特異的リン酸化状態に特異的な抗体クローン型１」又は「ＤＰＡＣ１」は、新規のリン酸化特異的な抗体及び修飾を含まない、同じ配列を認識する一致する抗体対の単離及び検証のためのプラットフォームを指す（図１及び図１３）。
[0091]特異的なリン酸化状態に特異的な抗体クローン型２（「ＤＰＡＣ２」）：本明細書において使用される、「特異的なリン酸化状態に特異的な抗体クローン型２」又は「ＤＰＡＣ２」は、目的のペプチド又はタンパク質に対する抗体インヒビターの単離のためのプラットフォームを指す。実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質は、酵素であり得る。実施形態において、阻害は、立体阻害を介してである。ＤＰＡＣ２はまた、抗イディオタイプ抗体を産生するためのプラットフォームを指す（図２）。
[0092]特異的なリン酸化状態に特異的な抗体クローン型３（「ＤＰＡＣ３」）：本明細書において使用される、「特異的なリン酸化状態に特異的な抗体クローン型３」又は「ＤＰＡＣ３」は、既存の抗リン酸化修飾した組換えモノクローナル抗体の未修飾及びリン酸化に無関連のクローナルな誘導体への変換のためのプラットフォームを指す（図１４）。
[0093]発見成熟（「ＤｉｓＭａｔ」）：本明細書において使用される、「発見成熟」又は「ＤｉｓＭａｔ」は、発見ヒットクローンの無作為変異ライブラリーを産生し、次に、抗原濃度が高く、３〜４回の繰り返しラウンドのパニングを通じて一定を維持する、発見バイオパニング条件下でこれらの新規に作製されたライブラリーをバイオパニングするための、ＡＸＭエラープローンＰＣＲ変異誘発（図７）を指す。これらの変化した特異性クローンは、本明細書において「クローン型」として言及される。結合は、また親和性成熟（「ＡｆｆＭａｔ」）指向進化を使用することにより、さらに改善され得る。例えば、ＡｆｆＭａｔにおいて、免疫原濃度は、３〜４回のラウンドのそれぞれのパニング毎に４〜１０分の１に降下する。本発明において利用されるＡｆｆＭａｔは、割合外の選択プロトコールが、クローン型の親和性を増大させることを可能にする。
[0094]エピトープ：本明細書において使用される、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、又はフラグメントに特異的に結合する能力がある任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基から通常なり、特異的な３次元構造特徴、並びに特異的な電荷特徴を通常有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のペプチドに対して生じてもよい。
[0095]機能的エピトープ：本明細書において使用される、用語「機能的エピトープ」は、結合相互作用へのエネルギー関与するエピトープ内の残基を意味する。
[0096]機能的均等物又は誘導体：本明細書において使用される、用語「機能的均等物」又は「機能的誘導体」は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈において、オリジナルの配列のものと実質的に類似する生物学的活性（機能又は構造のいずれか）を保持する分子を示す。機能的誘導体又は均等物は、天然の誘導体であり得るか、又は合成で調製される。典型的な機能的誘導体は、１個又は複数のアミノ酸の置換、欠損、又は付加を有するアミノ酸配列を含み、但し、タンパク質の生物学的活性は保存される。置換しているアミノ酸は、置換されたアミノ酸のものと類似する物理化学的特性を望ましくは有する。所望の類似の物理化学的特性は、電荷、バルキネス、疎水性、親水性等における類似性を含む。
[0097]ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書において使用される、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物内よりむしろ人工的環境において、例えば、試験官又は反応容器において、細胞培養液等において生じる現象を指す。
[0098]ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書において使用される、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、ヒト及び非ヒト動物のような、多細胞生物内で生じる現象を指す。細胞ベースのシステムの文脈において、用語を使用して、生きている細胞内で生じる現象を指し得る（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムと逆）。
[0099]単離された：本明細書において使用される、用語「単離された」は、（１）最初に産生される（天然において及び／又は実験設定においてのいずれかで）とき、関連した成分の少なくとも幾つかと異なり、及び／又は（２）人の手により産生され、調製され、及び／又は製造された物質及び／又は実体を指す。単離された物質及び／又は実体は、物質及び／又は実体が最初に関連した他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、又は１００％異なってもよい。幾つかの実施形態において、単離された剤は、約８０％より高い、約８５％より高い、約９０％より高い、約９１％より高い、約９２％より高い、約９３％より高い、約９４％より高い、約９５％より高い、約９６％より高い、約９７％より高い、約９８％より高い、約９９％より高い、実質的に１００％、又は１００％の純品である。本明細書において使用される、物質が、他の成分を実質的に含まないなら、物質は、「純品」である。本明細書において使用される、用語「単離された細胞」は、多細胞生物において含有されない細胞を指す。
[0100]免疫学的結合：用語「免疫学的結合」は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的な抗原との間で生じるタイプの非共有相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強さ、又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の点で表され得、Ｋｄが小さいほど、高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野において周知の方法を使用して定量することができる。
[0101]分子ディスプレイシステム：本明細書において使用される、用語「分子ディスプレイシステム」又は「抗体ライブラリー」は、標的分子又はリガンドへの可能性のある結合剤についてスクリーニングするための可能性のある親和性試薬のライブラリーを提示する能力がある任意のシステムである。分子ディスプレイシステムの例は、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ及びｍＲＮＡディスプレイを含む。幾つかの実施形態において、ファージディスプレイが使用される。
[0102]修飾特異的なクローン型：本明細書において使用される、用語「修飾特異的なクローン型」又は「ＭＳＣ」は、数個のアミノ酸が異なり、翻訳後状態の同じエピトープに異なって結合する抗体である。「数個のアミノ酸」は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸を意味する。
[0103]ポリペプチド：本明細書において使用される、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に結合したアミノ酸の連続的な鎖を指す。用語を使用して、任意の長さのアミノ酸鎖を指すが、当業者は、用語が、非常に長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に結合した２個のアミノ酸を含む最短の鎖を指し得ることを理解する。当業者に公知である通り、ポリペプチドは、処理され、及び／又は修飾されてもよい。
[0104]翻訳後修飾：本明細書において使用される、用語「翻訳後修飾」は、タンパク質生合成中又は後のいずれかで生じるペプチド又はタンパク質の任意の修飾を一般に指す。例えば、翻訳後修飾は、制御性サブユニットのタンパク分解切断又はタンパク質全体の分解のような、官能基又はタンパク質のタンパク質又はペプチドへの共有付加を含む。
[0105]翻訳後修飾部位：本明細書において使用される、用語「翻訳後修飾部位」は、任意の修飾（複数可）のアクセプターとして作用するペプチド、タンパク質、又は酵素内の１個又は複数のアミノ酸残基を一般に指す。翻訳後修飾部位は、天然に存在し得るか、又は翻訳後修飾部位は、目的のペプチド、タンパク質又は酵素に遺伝子操作され得る。
[0106]タンパク質：本明細書において使用される、用語「タンパク質」は、別々の単位として機能する１個又は複数のポリペプチドを指す。単一ポリペプチドが、別々の機能する単位であり、別々の機能する単位を形成するために他のポリペプチドとの永久的又は一時的な物理的関連を必要としないなら、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され得る。別々の機能単位が、互いに物理的に関連する１個より多くのポリペプチドを含むなら、用語「タンパク質」は、物理的に結合し、別々の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。
[0107]ｓｃＦｖ：１本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチド分子は、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、ペプチドをコードするリンカーにより結合したＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現され得る（Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５（１６）：５８７９〜５８８３頁を参照）。多数の方法を記載して、抗体Ｖ領域由来の天然で凝集しているが、化学的には分離したポリペプチド軽鎖及び重鎖のｓｃＦｖ分子への変換のための化学構造を区別しており、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造にフォールディングする。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；第５，１３２，４０５号；及び第４，９４６，７７８号を参照。
[0108]実質的に：本明細書において使用される、用語「実質的に」は、目的の特徴又は特性のトータル又はほぼトータルの範囲又は程度を示す定量的状態を指す。生物学的技術分野における当業者は、生物学的及び化学的現象は、完了まで達し、及び／或いは完全に進行する、又は絶対的な結果を達成若しくは回避することが仮にあるとしても稀であることを理解する。それ故、用語「実質的に」を本明細書において使用して、多くの生物学的及び化学的現象における固有の完全性の可能性のある欠如を取得する。
ある特定の実施形態の詳細な説明
[0109]本発明の様々な態様は、以下のセクションにおいて詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定しようとするものではない。それぞれのセクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「又は」の使用は、別段規定されない限り、「及び／又は」を意味する。
[0110]本開示は、とりわけ、特異的な翻訳後修飾を有するエピトープを認識し、結合し、及び又はモジュレートする抗体を生成する方法及び生成するための組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本開示は、翻訳後修飾特異的な抗体の産生のための構造ベースの指向進化アプローチを記載する。幾つかの実施形態において、開示は、汎翻訳後修飾抗体の生成を記載し、抗体は、翻訳後修飾の存在又は非存在下でエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、本開示は、目的のペプチド又はタンパク質を阻害する抗体を産生する方法を提供する。実施形態において、抗体は、抗酵素立体インヒビターである。
[0111]エピトープの特異的な翻訳後修飾を標的にする抗体の生成は、研究の多くの態様における当該抗体の使用を可能にし、同じ可能性のある治療上の使用を可能にする。例えば、治療タンパク質標的又は他の生物学的標的に結合し、修飾する抗体が、生成され得る。「生物学的タンパク質標的」により、幾つかの他の実体がそれへと方向付けられ及び／又は結合する、生きている生物（例えば、細胞、タンパク質、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ等）内の任意のものを意味し、結合は、細胞及び／又は生きている生物の生理を変化させる。
[0112]１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の様な組換え抗体は、多くの魅力的な性状を有する。組換え抗体は、適当な異種性宿主における過剰発現を通じて新たに補充することが可能であり、組換え抗体は、容易に保存され、ＤＮＡとして伝達され、組換え抗体は、様々な酵素、蛍光タンパク質、及びエピトープタグへの融合物として遺伝子操作され得る。また有用なｓｃＦｖは、ＩｇＧに容易に変換され得る。しかしながら、したがって、本開示の前の、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、及びリボソームディスプレイのような、ｉｎ ｖｉｔｒｏの選択方法は、翻訳後修飾に特異的な抗体をカスタマイズするための要件と合致するにはあまりに非効率的である。
[0113]幾つかの方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡｂ多様性を生じさせるために従前に使用された。幾つかの方法は、免疫した又は免疫していない脊椎動物細胞（ナイーブライブラリーを生成するため）のいずれかの免疫領域（天然のアプローチ）のｃＤＮＡをクローニングする工程、混合したヌクレオチド合成を用いたＡｂ ＣＤＲ遺伝子フラグメントのトータルの合成、及び半合成アプローチを含み、それにより、フレームワーク遺伝子が、合成され、多様性が、多数のＣＤＲをクローニングすることにより、生成される。一定のフレームワークを含む典型的なファージディスプレイライブラリーは、（ｉ）天然に存在するＡｂにおいて最も変動するか、又は（ｉｉ）所定の抗原（「Ａｇ」）と最も相互作用すると計画されるかのいずれかが見出されている５個のＣＤＲにおける１２カ所の位置を無作為化する。これらのライブラリーを用いたトータルの可能性のある多様性は、試料採取され得る（典型的には、ファージライブラリーを用いて１０１０〜１０１１）多様性より、依然として実質的に高く（＞３．８×１０２１）、所定のＣＤＲ位置における全てのアミノ酸が、機能的Ａｂを生じる訳ではない。良好なファージディスプレイライブラリーは、一般に、＞１０％の組換え体を含む、＞１０１１である。本明細書において提供されるライブラリー産生方法を使用して（図１０）、＞１０１２及び＞８５％の組換え体であるライブラリーが、作製され得る。本明細書において記載される、幾つかの実施形態において、３カ所の一定の位置を使用してリン酸化標的を結合するための焦点が絞られたライブラリーは、無作為化されたライブラリーより、有効に２０３（＝８，０００）倍高い効率であり、価値であり、実用的である。
[0114]幾つかの実施形態において、ＣＤＲ残基の無作為化変異誘発の代わりに、先行技術の翻訳後修飾抗体結合を、ライブラリー無作為化アプローチに組み込み、対象となる結合剤の頻度がより高いライブラリーを生じ得る。
翻訳後修飾
[0115]本明細書において記載される方法は、任意の種類の翻訳後修飾を有する任意のエピトープに適用され得る。翻訳後修飾は、任意の翻訳後修飾であり得る。翻訳後修飾は、負に荷電している、正に荷電している、親水性である、及び／又は疎水性である可能性がある。
[0116]翻訳後修飾の非限定的な例として、翻訳後修飾は、任意の種類のアセチル化、アミド化、脱アミド、プレニル化（例えば、ファルネシル化若しくはゲラニル化）、ホルミル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、リン酸化、シアリル化、ポリシアリル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化、リボシル化、硫酸化、又はその任意の組合せであり得る。
[0117]幾つかの実施形態において、翻訳後修飾は、例えば、ミリストイル化、リポイル化、及び／又はパラミトイル化を含む、アシル化であり得る。翻訳後修飾は、例えば、イソプレニル化、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、糖化、フラビン部分の付加、ヘムｃ、ホスホン酸エステル化、レチニリデンシッフ塩基形成、アシル化、ホルミル化、アルキル化、メチル化、アミド化、アルギニル化、ポリグルタミル化、ポリグリシル化、ブチリル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、マロニル化、ニトロシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、アデニリル化、プロピオニル化、ピログルタミン酸形成、Ｓ−グルタチオン付加、Ｓ−ニトロシル化、Ｓ−スルフェニル化、Ｓ−スルフィニル化、Ｓ−スルホニル化、サクシニル化、硫酸化、糖化、カルバミル化、カルボニル化、ビオチニル化、カルバミル化、酸化、ペグ化、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、Ｐｕｐ化、シトルリン化、脱アミド、エリミニル化又はその任意の組合せであり得る。
[0118]幾つかの実施形態において、翻訳後修飾は、ジスルフィド架橋結合、タンパク分解切断、イソアスパラギン酸形成、ラセミ化、タンパク質スプライシング又はその任意の組合せを含み得る。
翻訳後修飾部位
[0119]本明細書において記載される実施形態において、ＰＴＭ部位は、任意のＰＴＭ部位であり得る。ＰＴＭ部位は、天然に存在する又は遺伝子操作されたいずれかであり得る。遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、目的のペプチド、タンパク質又は酵素において１個又は複数のアミノ酸の置換により、目的のペプチド、タンパク質又は酵素に導入され得る。或いは、又は前述に加えて、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、１個又は複数のアミノ酸残基を、目的のペプチド、タンパク質、又は酵素に挿入することにより、目的のペプチド、タンパク質又は酵素に導入され得る。導入された遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、任意の長さのものであり得る。非限定的な例として、導入されたＰＴＭは、約１〜２５、１〜５０、１〜１００又は１〜１５０個のアミノ酸を含み得る。幾つかの実施形態において、導入されたＰＴＭは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、導入されたＰＴＭは、約１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）又は１〜１５（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）個のアミノ酸を含む。
[0120]導入されたＰＴＭは、当該技術分野において公知の任意の方法により、目的のペプチド、タンパク質又は酵素に導入され得る。例えば、分子クローニングの周知の方法を使用して、導入されたＰＴＭ部位をコードするヌクレオチドを、目的のペプチド、タンパク質、又は酵素に挿入され得る。或いは、当該技術分野において公知の方法を使用して、所望のＰＴＭ部位に対応するアミノ酸配列を、目的のペプチド、タンパク質又は酵素に直接導入し得る。
[0121]幾つかの実施形態において、遺伝子操作されたＰＴＭは、目的のペプチド、タンパク質又は酵素に存在する１個又は複数のアミノ酸の置換により導入され得る。例えば、遺伝子操作されたＰＴＭ部位は、部位変異誘発又は無作為化変異誘発により導入され得る。部位変異誘発は、例えば、点変異、一連の点変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、若しくは間の任意の量）、欠損又は挿入であり得る。
ＰＴＭ−及び汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリーの生成
[0122]翻訳後修飾（ＰＴＭ）を認識する抗体を産生する構造ベースの指向進化アプローチを開発する方法が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；ＰＴＭと相互作用することが決定されている抗体のＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位において負に荷電しているか、又は荷電していないアミノ酸を導入する工程；ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；ＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対してライブラリーをスクリーニングし、これにより、汎ＰＴＭ結合抗体を同定する工程を含む、ＰＴＭ部位を認識する抗体を生成する方法が提供される。
[0123]１つの態様において、本開示は、リン酸化特異的結合高可変領域の組み込みにより濃縮され得る、リン酸化−アミノ酸−認識ライブラリーを使用する方法を提供する。抗リン酸化特異性を、生物物理学的マーカーとして使用して、ペプチド、これにより、タンパク質上の特異的な部位にリン酸化特異的な抗体の結合を「極限」させ得る。１つの特異的な部位が、同定されると、組換え抗体を開発して、天然の配列を認識することができる。実施形態において、本開示は、非常に高度に類似の配列を認識する抗リン酸化タンパク質抗体及び発生した抗体の発見及び検証をもたらす。
[0124]幾つかの実施形態において、抗体を生成する方法は、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程を含む。ＰＴＭは、任意のＰＴＭであり得る。典型的にＰＴＭ修飾は、上で記載される。特異的な翻訳後修飾を認識する出発抗体を有することにより、翻訳後修飾と直接的に相互作用する残基の解析及び同定を可能にする。幾つかの実施形態において、出発抗体は、抗体ＰＴＭ結合ポケットの構造解析及び決定のため使用される。
[0125]幾つかの実施形態において、出発抗体のＰＴＭ結合ポケットが、同定される。当該技術分野において、ＰＴＭ結合ポケットの同定を可能にする幾つかの方法が存在する。任意の適当な方法を使用して、抗体ＰＴＭ結合ポケットを同定することができる。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位は、構造的に予想されたものである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位は、実験で決定されたものである。
[0126]幾つかの実施形態において、荷電していないアミノ酸は、ＰＴＭと相互作用することが決定されている抗体のＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位において導入される。「導入される」により、次の：ｉ）その天然の位置における既存のアミノ酸を別の選択されたアミノ酸で置換すること；ｉｉ）追加の選択されたアミノ酸を、選択された位置の配列に付加すること；又はｉｉｉ）配列由来の選択されたアミノ酸を取り除き、オリジナルの取り除かれたアミノ酸の位置から離れた配列における異なる位置に別のアミノ酸を付加することのいずれか１つを意味する。荷電していないアミノ酸は、例えば、ＰＴＭ結合ポケット内の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５部位に導入され得る。実施形態において、荷電していないアミノ酸は、ＰＴＭ結合ポケット内の１つの部位に導入される。実施形態において、荷電していないアミノ酸は、ＰＴＭ結合ポケットに隣接して導入される。「隣接の」により、ＰＴＭ結合ポケットから取り除かれた約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸を意味する。幾つかの実施形態において、荷電していないアミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン又はグリシンである。幾つかの実施形態において、荷電していないアミノ酸は、アラニン又はグリシンである。アミノ酸の等電点（ｐＩ）は、荷電していないアミノ酸の選択においてガイドとして使用され得る（表１）。様々な方法を使用して、荷電していないアミノ酸を、抗体のＰＴＭ結合ポケットに導入することができる。当該技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。幾つかの実施形態において、荷電していないアミノ酸は、部位変異誘発により導入される。
[0127]幾つかの実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、ＰＴＭと相互作用することが決定されている抗体のＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位において導入される。負に荷電したアミノ酸は、例えば、ＰＴＭ結合ポケット内の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の部位に導入され得る。実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、ＰＴＭ結合ポケット内の１つの部位に導入される。実施形態において、荷電していないアミノ酸は、ＰＴＭ結合ポケットに隣接して導入される。幾つかの実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、リン酸化アミノ酸である。幾つかの実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、ホスホセリン（ＳＥＰ）、ホスホチロシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、ホスホセリン（ＳＥＰ）である。実施形態において、ＳＥＰは、次のアミノ酸：Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、及びイソロイシン（Ｉ）のいずれか１つ又は複数を置き換えるように、導入される。アミノ酸の等電点（ｐＩ）は、負に荷電したアミノ酸の選択においてガイドとして使用され得る（表１）。
Figure 2020534796
[0128]幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、任意のＰＴＭであり得る。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、荷電していることも、荷電していないこともある。荷電していないＰＴＭの例は、メチル化を含み得る。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、負に荷電又は正に荷電していることがある。典型的な負に荷電したＰＴＭは、リン酸化、グリコシル化及びシアリル化を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、親水性及び／又は疎水性であり得る。
[0129]幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーが、生成される。ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列は、変動する長さのものであり得る。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の上流及び／又は下流の約１〜１５（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）個のアミノ酸残基であり得る。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の上流及び／又は下流の約１５〜３０（すなわち、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のアミノ酸残基であり得る。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の上流と下流の両方であり得る。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の上流に位置する。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の下流に位置する。
[0130]当該技術分野において公知の任意の部位特異的変異誘発方法を使用して、ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域を無作為化し得る。例えば、エラープローンＰＣＲ、プライマー伸長による部位特異的変異誘発、インバースＰＣＲ、クンケルベースの変異誘発、カセット変異誘発、全体プラスミド変異誘発、ＡＸＭ 変異誘発、エラープローンローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、又はｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的変異誘発を使用して、無作為化を導入して、ライブラリーを生成し得る。幾つかの実施形態において、クンケルベースの部位特異的変異誘発が、使用される。幾つかの実施形態において、ＡＸＭ変異誘発が、使用される。幾つかの実施形態において、エラープローンローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が、使用される。
[0131]幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＰＴＭを含む目的のペプチド又はタンパク質に対してスクリーニングされる。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対してスクリーニングされる。幾つかの実施形態において、このスクリーニングは、ＰＴＭを特異的に認識する抗体の同定を可能にする。或いは、このスクリーニングは、ＰＴＭを認識しない抗体の同定を可能にする。或いは、このスクリーニングは、ＰＴＭを有するエピトープ及び有さないエピトープに結合する抗体の同定を可能にする。これらの後者の抗体は、エピトープのＰＴＭ状態に関わらず、特異的なエピトープに結合するので、これらの抗体は、「汎ＰＴＭ」抗体である。
非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーの生成
[0132]幾つかの実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；ＰＴＭと相互作用することが決定されている抗体のＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位におけるＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸を導入する工程；ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；及びＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対してライブラリーをスクリーニングし、これにより、 非ＰＴＭ結合抗体を同定する工程を含む、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含まない部位に特異的に結合する、非ＰＴＭ結合抗体の生成方法が提供される。
[0133]幾つかの実施形態において、抗体を生成する方法は、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程を含む。ＰＴＭは、任意のＰＴＭであり得る。典型的なＰＴＭ修飾は、上で記載される。特異的な翻訳後修飾を認識する出発抗体を有することは、翻訳後修飾と直接的に相互作用する残基の解析及び同定を可能にする。幾つかの実施形態において、出発抗体は、抗体ＰＴＭ結合ポケットの構造解析及び決定のため使用される。幾つかの実施形態において、出発抗体のＰＴＭ結合ポケットが、同定される。当該技術分野において、ＰＴＭ結合ポケットの同定を可能にする幾つかの方法がある。任意の適当な方法を使用して、抗体ＰＴＭ結合ポケットを同定することができる。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位は、構造上予想されたものである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位は、実験で決定されたものである。
[0134]幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、ＰＴＭと相互作用することが決定されている抗体のＰＴＭ結合ポケットにおける１個又は複数の部位において導入される。実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、任意のアミノ酸であり得る。実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、正に荷電又は負に荷電している。実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、負に荷電している。実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、正に荷電している。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、荷電したアミノが、ＰＴＭを寄せ付け得るかどうかに依存して、正に荷電又は負に荷電している。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、負に荷電している。例えば、幾つかの実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、ホスホセリン（ＳＥＰ）、ホスホチロシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、ホスホセリン（ＳＥＰ）である。幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、正に荷電している。例えば、正に荷電したアミノ酸は、リジン、アルギニン、又はヒスチジンであり得る。
[0135]ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、非標準的なアミノ酸であり得る。非限定的な例として、非標準的なアミノ酸は、ホスホセリン（ＳＥＰ）、ホスホチロシン、ｐ−アジド−フェニルアラニン、ベンゾイル−フェニルアラニン、又はアセチル−リジンである。非限定的な例として、アミノ酸は、セレノシステイン又はピロリジンであり得る。実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、サプレッサーｔＲＮＡにより導入される。
[0136]幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、親水性である。実施形態において、任意の親水性アミノ酸が、使用され得る。例えば、親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、又はスレオニンであり得る。
[0137]幾つかの実施形態において、ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸は、疎水性である。実施形態において、任意の疎水性アミノ酸が、使用され得る。例えば、疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである。
[0138]幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーが、生成される。ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列は、変動する長さのものであり得る。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の上流及び／又は下流の約１〜１５（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）個のアミノ酸のアミノ酸残基であり得る。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の上流及び／又は下流の約１５〜３０（すなわち、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のアミノ酸残基であり得る。実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の上流に位置する。実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の下流に位置する。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、ＰＴＭ部位の上流と下流の両方であり得る。
[0139]当該技術分野において公知の任意の部位特異的変異誘発方法を使用して、ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域を無作為化し得る。例えば、エラープローンＰＣＲ、プライマー伸長による部位特異的変異誘発、インバースＰＣＲ、クンケルベースの変異誘発、カセット変異誘発、全体プラスミド変異誘発、ＡＸＭ 変異誘発、エラープローンローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、又はｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的変異誘発を使用して、無作為化を導入して、ライブラリーを生成し得る。幾つかの実施形態において、クンケルベースの部位特異的変異誘発が、使用される。幾つかの実施形態において、ＡＸＭ変異誘発が、使用される。ＡＸＭ変異誘発は、米国特許第９，６１７，５３７号、及び米国特許第９，４２２，５４９号において記載され、それぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態において、エラープローンローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）が、使用される。
[0140]幾つかの実施形態において、コンテキスト配列に結合するＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域は、ＰＴＭ結合ポケットを変更することなく、無作為化される。
[0141]幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対してスクリーニングされる。幾つかの実施形態において、このスクリーニングは、ＰＴＭを認識しない抗体の同定を可能にする。
インヒビター抗体の生成
[0142]実施形態において、インヒビター抗体を生成する方法が、提供される。インヒビター抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法により目的のペプチド、又はタンパク質を阻害することができる。例えば、本明細書における方法により産生されるインヒビター抗体は、立体阻害、アロステリック阻害及び／又は競合的阻害により阻害することができる。実施形態において、抗体は、立体インヒビターである。実施形態において、抗体は、アロステリックインヒビターである。実施形態において、抗体は、競合的阻害剤である。実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質は、酵素である。実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質は、膜スパンニングタンパク質である。実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）である。実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質は、細胞受容体である。細胞受容体は、任意の種類の細胞受容体であり得、例えば、実施形態において、細胞受容体は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、酵素結合受容体、又はリガンド開口型イオンチャンネル受容体である。目的のペプチド又はタンパク質を標的にするインヒビター抗体の産生方法は、任意の種類のＧＰＣＲに適用することができる。多数の種類のＧタンパク質結合受容体は、当該技術分野において公知である。例えば、ＧＰＣＲは、とりわけ、アデノシン受容体、接着ＧＰＣＲ、アドレナリン作動性受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、ヒスタミン受容体、代謝型グルタミン酸受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、嗅覚受容体、オピオイド受容体及びセロトニン受容体として見られる。実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質は、レプチン受容体、グルカゴン受容体、インスリン受容体、ＣＸＣＲ４、ＮＴＳＲ１、ＮＴＳＲ２及び受容体チロシンキナーゼから選択される。
[0143]実施形態において、インヒビター抗体は、抗イディオタイプ抗体である。インヒビター抗体は、任意の種類のイディオタイプを標的とするように構築され得る。実施形態において、インヒビター抗体は、ハーセプチン、及び／又は抗ＣＤ１９を阻害する。実施形態において、インヒビター抗体は、二重特異的抗体を阻害する。実施形態において、インヒビター抗体は、変性と天然ＩｇＧの両方に結合する。実施形態において、インヒビター抗体は、変性又は天然ＩｇＧのいずれかに結合する。
[0144]実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質へのインヒビター抗体を生成する方法は、負に荷電したアミノ酸を含むように修飾された目的の修飾されたペプチドを用意する工程、負に荷電したアミノ酸へとバイアスをかけた抗体ライブラリーに対する修飾されたペプチドをスクリーニングする工程、目的の修飾されたペプチドに結合する１個又は複数の抗体を単離する工程；及び１個又は複数の抗体の修飾を含まない目的のペプチドへの結合を決定し、これにより、目的のペプチドに結合する抗体を同定する工程を含む。
[0145]実施形態において、目的のペプチドへの抗体を産生する方法は、負に荷電したアミノ酸を含むように修飾された目的の修飾されたペプチドを用意する工程、負に荷電したアミノ酸へとバイアスをかけた抗体ライブラリーに対する修飾されたペプチドをスクリーニングする工程、目的の修飾されたペプチドに結合する１個又は複数の抗体を単離する工程；親和性成熟により、１個又は複数の抗体のクローン型のライブラリーを生成する工程；修飾を含まない目的のペプチドに対してクローン型のライブラリーをスクリーニングし、これにより、目的のペプチドに結合する抗体を同定する工程を含む。
[0146]実施形態において、修飾されたペプチドについての塩基配列を形成するペプチドは、目的のペプチド又はタンパク質の外部ドメイン及び／又は外部ドメインの周囲領域に対応する。実施形態において、修飾されたペプチドについての塩基配列を形成するペプチドは、目的のペプチド又はタンパク質の外部ドメインである。実施形態において、修飾されたペプチドについての塩基配列を形成するペプチドは、目的のタンパク質から得られる活性部位及び／又は活性部位の周囲領域である。実施形態において、目的のペプチド又はタンパク質は、酵素である。「周囲領域」により、外部ドメイン及び／又は活性部位から上流及び／又は下流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸を意味する。実施形態において、修飾されたペプチドは、１個又は複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）を、上で記載された目的のペプチド又はタンパク質から得られた塩基配列に導入することにより、産生される。実施形態において、修飾されたペプチドは、１個のアミノ酸を、目的のペプチド又はタンパク質から得られた塩基配列を導入することにより、産生される。「導入すること」により、次の：ｉ）天然の位置の既存のアミノ酸を別の選択されたアミノ酸で置換すること；ｉｉ）追加の選択されたアミノ酸を、選択された位置の配列に付加すること；又はｉｉｉ）配列由来の選択されたアミノ酸を取り除き、別のアミノ酸を、オリジナルの取り除かれたアミノ酸の位置と離れた配列における別々の位置に付加することのいずれか１つを意味する。実施形態において、修飾されたペプチドを合成して、負に荷電したアミノ酸を含む。実施形態において、抗イディオタイプ抗体を、ＣＤＲ Ｈ３及び／又はＬ３由来の塩基配列の使用を通じて構築して、修飾されたペプチドを生成する。実施形態において、ＣＤＲ Ｈ３配列を塩基配列として使用して、修飾されたペプチドを合成する。実施形態において、ＣＤＲ Ｌ３を塩基配列として使用して、修飾されたペプチドを合成する。実施形態において、ＣＤＲ Ｈ３とＬ３の両方を塩基配列として使用して、修飾されたペプチドを合成する。
[0147]幾つかの実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、リン酸化アミノ酸である。幾つかの実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、ホスホセリン（ＳＥＰ）、ホスホチロシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、ホスホセリン（ＳＥＰ）である。アミノ酸の等電点（ｐＩ）を、負に荷電したアミノ酸の選択におけるガイドとして使用することができる（上の表１）。負に荷電したアミノ酸は、塩基性ペプチドに導入され、これにより、修飾されたペプチドを形成する。約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸は、塩基性ペプチド内に導入され得る。実施形態において、負に荷電したアミノ酸を、塩基性ペプチド内の１つの部位に導入して、修飾されたペプチドを生じる。実施形態において、負に荷電したアミノ酸は、外部ドメイン又は活性部位に隣接して導入される。「隣接の」により、外部ドメイン及び／又は活性部位から上流又は下流の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸を意味する。
[0148]当該技術分野における任意の方法を使用して、候補抗体についてスクリーニングすることができる。幾つかの実施形態において、エマルジョンフォールセルベースライブラリースクリーニング方法が、使用される。実施形態において、エマルジョンホールセルベースライブラリースクリーニング方法は、遅延エマルジョン感染性（「ＤＥＩ」）である。ホールセルスクリーニング方法（例えば、ホールセルパニング）は、米国特許公開第２０１５−０３２２１５０号及び国際公開第２０１５／０８５０７９号において記載され、それぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0149]当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、インヒビター抗体を精製し得る。多数の抗体精製技術は、当該技術分野において入手可能である。例えば、抗体は、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇを使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができ、免疫血清のＩｇＧ分画を主にもたらす。続いて、又は代わりに、探した免疫グロブリンの標的である特異的な抗原、又はそのエピトープをカラムに固定して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的な抗体を精製してもよい。
[0150]実施形態において、アッセイを使用して、精製したインヒビター抗体の目的のペプチド又はタンパク質を結合し、及び／又は阻害する能力について試験する。実施形態において、細胞ベースのアッセイを使用して、精製したインヒビター抗体の結合及び／又は阻害する能力を試験する。他のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、及び／又は免疫細胞化学を使用して、精製したインヒビター抗体を試験することができる。
[0151]任意の抗体ライブラリーは、本明細書において開示される方法を用いて使用することができる。実施形態において、抗体ライブラリーは、負の荷電へとバイアスをかけた抗体ライブラリーである。実施形態において、抗体ライブラリーは、リン酸化バイアスの抗体ライブラリーである。
[0152]実施形態において、１個又は複数の抗体のクローン型のライブラリーは、当該技術分野において公知の手段により、変異され、成熟される。実施形態において、１個又は複数の抗体のクローン型のライブラリーは、親和性成熟により、変異され、成熟される。実施形態において、１個又は複数の抗体のクローン型のライブラリーは、ＡＸＭ変異誘発により成熟される（図７）。
[0153]実施形態において、修飾されたペプチドに対してスクリーニングされる抗体ライブラリーは、リン酸化アミノ酸（例えば、ホスホセリン（ＳＥＰ）又はホスホチロシン）を結合する予め規定された傾向を有する。実施形態において、修飾されたペプチドに対してスクリーニングされた抗体ライブラリーは、修飾した配列のコンテキスト（すなわち、コンテキスト配列）における特異的な配列に結合する一般的な様式を有する。実施形態において、ファージライブラリーを構築し、使用して、抗リン酸化ペプチド抗体を同定する。実施形態において、スクリーニングされるペプチドに導入されるリン酸化アミノ酸は、その配列における天然のアミノ酸を置換する。実施形態において、単離された抗体の指向進化アプローチが行われる。指向進化後、抗体は、天然の配列を認識することができるクローン型についてスクリーニングされる（例えば、スクリーニングされるペプチドにおける天然に存在するアミノ酸が、その配列におけるリン酸化されたアミノ酸を置換する場合）。
[0154]実施形態において、修飾されたエピトープについての塩基配列は、目的のペプチド又はタンパク質の外部ドメイン又は活性部位における又は隣接するおよそ１個毎、２個毎、３個毎、４個毎、５個毎、６個毎、７個毎、８個毎、９個毎、１０個毎、１１個毎、又は１２個毎のアミノ酸を体系的に「ゆっくり下がる」ことにより、選択される。実施形態において、修飾されたエピトープについての塩基配列は、目的のペプチド又はタンパク質の外部ドメイン又は活性部位におけるおよそ１個毎、２個毎、３個毎、４個毎、５個毎、６個毎、７個毎、８個毎、９個毎、１０個毎、１１個毎、又は１２個毎のアミノ酸を体系的に「ゆっくり下がる」ことにより、選択される。実施形態において、修飾されたエピトープについての塩基配列は、目的のペプチド又はタンパク質の外部ドメインにおけるおよそ１個毎、２個毎、３個毎、４個毎、５個毎、６個毎、７個毎、８個毎、９個毎、１０個毎、１１個毎、又は１２個毎のアミノ酸を体系的に「ゆっくり下がる」ことにより、選択される。実施形態において、修飾されたエピトープについての塩基配列は、目的のペプチド又はタンパク質の活性部位におけるおよそ１個毎、２個毎、３個毎、４個毎、５個毎、６個毎、７個毎、８個毎、９個毎、１０個毎、１１個毎、又は１２個毎のアミノ酸を体系的に「ゆっくり下がる」ことにより、選択される。実施形態において、修飾されたエピトープについての塩基配列は、目的のペプチド又はタンパク質の外部ドメインにおいて若しくは隣接する、又は活性部位において若しくは隣接するおよそ１個毎、２個毎、３個毎、４個毎、５個毎、６個毎、７個毎、８個毎、９個毎、１０個毎、１１個毎、又は１２個毎のアミノ酸を体系的に「ゆっくり下がる」ことにより、選択される。
ライブラリー構築、増幅及びスクリーニング
[0155]抗体ライブラリーは、任意の種類の抗体ライブラリーであり得る。抗体ライブラリーの例は、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ及びｍＲＮＡディスプレイを含む。幾つかの実施形態において、抗体ライブラリーは、ファージディスプレイである。
[0156]当該技術分野において公知の任意の種類のライブラリー増幅方法は、第２のライブラリーの増幅のため使用され得る。幾つかの実施形態において、目的の配列は、オリゴヌクレオチドの対を使用して増幅されてもよく、対のうち一方のオリゴヌクレオチドは、保護されたオリゴヌクレオチドであり、他方は、保護されていないオリゴヌクレオチドである。目的の配列は、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、等温性増幅、又はローリングサークル増幅のような増幅反応により、かかるオリゴヌクレオチド対を使用して増幅されてもよい。幾つかの実施形態において、ライブラリー増幅方法は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。幾つかの実施形態において、ライブラリー増幅方法は、エラープローンローリングサークル増幅である。ＲＣＡは、ライブラリーを約５０〜１５０倍（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、及び間の任意の値）増幅することができる。幾つかの実施形態において、ＲＣＡは、ライブラリーを約１００倍増幅することができる。幾つかの実施形態において、ＲＣＡ増幅ライブラリーは、直線化され、再度環状にされる。
[0157]抗体ライブラリーは、当該技術分野において公知の任意の適当な細胞に導入され得る。実施形態において、細胞は、古細菌細胞、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、又は真核生物の細胞である。実施形態において、細胞は、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞である。実施形態において、細胞は、大腸菌細胞又は出芽酵母細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は、昆虫細胞である。実施形態において、細胞株は、任意の電気又は化学的コンピテント細胞である。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、Ｃ６００、ＨＢ１０１、又はＴＧ１に形質転換される。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＴＧ１細胞に形質転換される。
[0158]幾つかの実施形態において、抗体ライブラリーは、多様な約１０７〜１０１４（すなわち、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、及び１０１４）個の固有の抗体を有する。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、多様な少なくとも１０８及び１０１２（すなわち、１０８、１０９、１０１０、１０１１、及び１０１２）を有する。
[0159]当該技術分野における任意の方法を使用して、候補抗体についてスクリーニングすることができる。幾つかの実施形態において、エマルジョンホールセルベースライブラリースクリーニング方法が、使用される。ホールセルスクリーニング方法（例えば、ホールセルパニング）は、米国特許出願公開第２０１５−０３２２１５０号及び国際公開第２０１５／０８５０７９号において記載され、それぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。ホールセルスクリーニング方法は、例えば、抗体ファージライブラリーを用いて形質導入されている大腸菌が、目的の抗原を提示する細胞又はビーズと一緒にインキュベートされる、エマルジョンの生成を含む。一晩のインキュベーションプロセス中、抗体ディスプレイファージは、大腸菌から分泌され、抗原を提示する細胞又はビーズに結合する。続く処理は、ファージに結合した標識された抗体の付加、及びホールセル又はビーズに提示された抗原に結合した抗体提示ファージを単離するための続くＦＡＣＳソーティングを含む。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、複数ラウンドのホールセルスクリーニングのため処理される。幾つかの実施形態において、ホールセルスクリーニングは、約３〜８回（すなわち、３、４、５、６、７、８）行われる。幾つかの実施形態において、ホールセルスクリーニングは、約３回行われる。幾つかの実施形態において、複数のラウンドのホールセルスクリーニングは、より特異的なエピトープ結合抗体の単離をもたらす。
遅延エマルジョン感染性（ＤＥＩ）：組換えバイオパニング
[0160]実施形態において、ホールセルパニングアプローチは、次の：ｉ）誘導可能なファージ結合部位を有し、表面にペプチド、タンパク質、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を提示する細菌細胞（例えば、大腸菌）を用意する工程；ｉｉ）細菌細胞が、１個の細菌細胞当たり１個のファージが存在するような比でバーコード配列識別子を含むファージ抗体ライブラリーと混合され、エマルジョン化され；ｉｉｉ）誘導可能なファージ結合部位の発現を誘導し、これにより、細菌細胞のファージ感染を可能にする工程；ｉｖ）ファージが感染した細菌細胞を成長させる工程、及びｖ）バーコード配列識別子を配列決定して、ファージによりコードされる抗体を同定する工程を含む。実施形態において、細菌細胞は、大腸菌細胞である。
[0161]背景として、Ｆ線毛は、大腸菌のＭ１３感染のための結合部位である。Ｆ線毛は、＜２２℃において成長させたＦ＋大腸菌において発現されない。ＤＥＩにおいて、細胞へのファージミドコード抗体「結合」は、Ｍ１３提示抗体と一晩１６℃において成長させた遺伝子型Ｆ＋大腸菌宿主の細菌細胞表面提示抗原の相互作用による。これらの表現形Ｆ−宿主は、Ｍ１３ファージＡｂライブラリーに対して１０：１（細胞：ファージ）比で混合される。所望の比は、１個の細菌細胞当たり結合した１個のファージを有することである。ファージより多くの細菌からなる比を有することにより、ポアソン分布に起因する制限が、克服される。抗体ライブラリー及び細胞ライブラリー混合物を洗浄して、結合していない、弱く結合したファージを取り除き、成長培地に再懸濁される。任意の結合したファージと共に単一の洗浄された細胞を、油中成長培地型エマルジョンにおいて乳化させる。細菌より多く、小さい微小滴を産生することにより、ポアソン分布を克服する。ＣＤＲ Ｈ２における３個のアミノ酸に起因するライブラリーがリン酸化に焦点が絞られていることは、その有効なサイズをおよそ８，０００倍（＝２０３）増大させ、ＤＥＩにおいてより小さなライブラリーを使用することを補償する。エマルジョン温度を、３７℃まで増大させて、（１）Ｆ線毛発現を誘導し、（２）細胞表面からのファージの分離を可能にし、（３）Ｆ線毛結合を介して、分離したファージの感染を可能にする。細胞内で、入ってくる抗体によりコードされるドナーファージミドは、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの仲介を通じて抗原によりコードされるアクセプタープラスミドを用いて組換える。クロラムフェニコール（ＣＡＭ）遺伝子を、ドナーファージミド及びアクセプタープラスミドの首尾よい組換えのため、活性化して、プラスミド同時組換え体を形成する。数時間後、エマルジョンは、破壊され、細胞を、一晩、ＣＡＭの存在下で成長させる。Ａｇ配列に物理的に結合したＡｂ遺伝子を今や有する、プール由来の組換えられたプラスミドが、単離される。個々のプラスミドの抗原及び抗体配列の対形成した末端の次世代ＤＮＡ配列決定（ＮＧＳ）及び複数バーコードスキームを使用して、ＣＡＭ抵抗性抗体：抗原対の全てを同定し、結合させる。
[0162]実施形態において、大腸菌細胞は、Ｆ＋大腸菌細胞である。実施形態において、Ｆ＋大腸菌細胞は、クロラムフェニコール（ＣＡＭ）遺伝子を含むアクセプタープラスミドを含有する。実施形態において、Ｆ＋大腸菌細胞を、約２２℃未満の温度（例えば、約１０．０℃、１０．５℃、１１．０℃、１１．５℃、１２．５℃、１３．０℃、１３．５℃、１４．０℃、１４．５℃、１５．０℃、１５．５℃、１６．０℃、１６．５℃、１７．０℃、１７．５℃、１８．０℃、１８．５℃、１９．０℃、１９．５℃、２０．０℃、２０．５℃、２１．０℃、２０．５℃）にて成長させる。実施形態において、Ｆ＋大腸菌は、ファージライブラリーと混合され、これにより、Ｆ＋大腸菌細胞を乳化する。実施形態において、乳化したＦ＋大腸菌細胞を、約３７℃の温度にて成長させ、続いて、クロラムフェニコールを培養液に導入する。実施形態において、感染し、成長させ、クロラムフェニコールにより発現したＦ＋大腸菌内に含有されるプラスミドを配列決定して、ファージによりコードされる抗体を同定する。
[0163]幾つかの実施形態において、方法は、検証工程をさらに含む。当該技術分野において公知の任意の方法を検証工程において使用して、目的の抗体を検証することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又は機能的アッセイは、抗体検証のため使用することができる。幾つかの実施形態において、検証工程は、高処理である。
[0164]幾つかの実施形態において、検証工程は、同定されたＰＴＭ、汎ＰＴＭ、非ＰＴＭ結合抗体が、ＰＴＭに対する立体インヒビターであるかどうかを決定する工程を含む。例えば、本明細書において提供される方法を使用して、目的のペプチド又はタンパク質を標的にする立体阻害性抗体を生成することができる。実施形態において、本明細書において記載される方法は、目的の酵素を阻害する立体阻害性抗体を生成する。立体阻害性抗体を生成する方法は、例えば、目的の酵素上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；酵素上のＰＴＭ部位に結合するＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；ライブラリーを目的の酵素に対してスクリーニングする工程及びＰＴＭ修飾の非存在下でＰＴＭ部位を認識する抗体を選択する工程；並びに酵素活性アッセイを行うことにより、立体阻害性抗体を選択する工程を含む。これらの方法について、任意の酵素が、立体抗体インヒビターのための標的であり得る。酵素活性を検出するか、又は定量するアッセイは、当該技術分野において公知である。任意のかかる酵素活性アッセイは、選択プロセスにおいて使用することができる。
リン酸化状態に特異的な抗体ライブラリーの設計
[0165]幾つかの実施形態において、リン酸化特異的な抗体ライブラリーの生成方法が、提供される。幾つかの実施形態において、汎リン酸化抗体ライブラリーの生成方法が、提供される。幾つかの実施形態において、非リン酸化抗体ライブラリーの生成方法が、提供される。
[0166]以下は、リン酸化翻訳後修飾に特異的である抗体ライブラリーを生成するための典型的なストラテジーである。
[0167]幾つかの実施形態において、リン酸化翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、任意の残基においてであり得る。幾つかの実施形態において、リン酸化は、セリン、スレオニン、チロシン及び／又はヒスチジン残基において生じる。幾つかの実施形態において、リン酸化は、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン及び／又はリジン残基において生じる。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＳｅｒである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＴｙｒである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＴｈｒである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＨｉｓである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＡｒｇである。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ部位は、ｐＬｙｓである。
[0168]幾つかの実施形態において、抗体を生成する方法は、目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程を含む。幾つかの実施形態において、ＰＴＭは、リン酸化である。幾つかの実施形態において、リン酸化結合ポケットが、同定される。
[0169]従前の研究は、リン酸化アミノ酸に結合する抗体の能力が、重／軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ Ｈ２又はＬ２）に依存し、リン酸化されたアミノ酸と接触させることを示唆した。さらなる研究は、リン酸化ペプチドに結合する傾向を有するリン酸化に焦点が絞られたライブラリーが、ＣＤＲ Ｈ２における天然のリン酸塩結合モチーフを用いて産生され得ることを示した。
[0170]無作為化、無関係のスクリーニングを通じて、抗Ｍｙｂ ｐＳｅｒ特異的なｓｃＦｖのＣＤＲ Ｈ２におけるアミノ酸が、リン酸化Ｍｙｂ１−２０ペプチドの結合に重要であることが示された。Ｌ２又はＨ２の選択は、コンテキスト配列の向きと相関するように思われる。これらの知見に基づき、リン酸塩結合部位が、局所モジュールとして設計され得る。
[0171]リン酸化抗体結合相互作用の構造解析は、リン酸化エピトープに関して、リン酸化領域が、ループ又は回転構造を有する直線モチーフを通常生じることを示した。理論により結び付けられる必要はないが、これは、恐らく、キナーゼの小さな基質結合ポケットに合う必要に起因する。したがって、異なるリン酸化領域の間の配列バリエーションは、実際に、比較的固有の二次構造に影響しない。
[0172]さらなる解析は、リン酸化エピトープ特異性が、恐らく、コンテキスト配列について最適な長さを要求することを示唆する。リン酸化特異的なＡｂは、リン酸化アミノ酸と周囲のコンテキスト配列の両方を認識する。守備よいリン酸化ペプチドＡｂは、リン酸化残基の上流及び／又は下流の約４〜５個外側の残基を通常認識し、これは、コンテキスト配列への過剰な結合が、リン酸化アミノ酸の関与を薄め、結果として、天然のペプチドよりリン酸化ペプチド特異性を損ない得ることを示唆している。
[0173]幾つかの実施形態において、コンテキスト配列の最適な長さは、リン酸化残基の上流又は下流の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の残基である。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列の最適な長さは、リン酸化残基の上流又は下流の約３、４、５、又は６個の外側の残基である。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列の最適な長さは、リン酸化残基の上流又は下流の約４又は５個の外側の残基である。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、翻訳後修飾の上流又は下流であり得る。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、翻訳後修飾の上流である。幾つかの実施形態において、コンテキスト配列は、翻訳後修飾の下流である。
[0174]まとめると、データは、コンテキスト配列の共通結合様式が調べられ得るなら、均一な構造、恐らく規定されたコンテキストの長さ、並びにリン酸塩結合部位の証明された設計が一緒になると、非常に焦点が絞られた知識に基づいたリン酸化状態の結合ライブラリーを設計可能にすることを示す。
[0175]幾つかの実施形態において、リン酸化翻訳後修飾のための結合ポケットは、ＣＤＲ Ｈ２領域及び／又はＣＤＲ Ｌ２領域である。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ Ｈ２領域及び／又はＣＤＲ Ｌ２領域の外側の領域は、無作為化される。ＣＤＲ Ｈ２領域及び／又はＣＤＲ Ｌ２領域の外側の任意の領域が、無作為化され得る。例えば、ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ３、又はフレームワーク領域が、無作為化され得る。幾つかの実施形態において、１個又は複数の無作為化された領域は、無作為ＣＤＲ Ｈ３、又はＬ３を含む。幾つかの実施形態において、ＰＴＭ結合ポケットは、ＣＤＲ Ｈ２領域を含み、１個又は複数の無作為化された領域は、無作為ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ３、及び／又はＣＤＲ Ｌ２を含む。
[0176]当該技術分野において公知の部位特異的変異誘発の任意の方法を使用して、リン酸化部位に隣接するコンテキスト配列に結合するリン酸化結合ポケットの外側の１個又は複数の領域を無作為化し得る。例えば、エラープローンＰＣＲ、プライマー伸長による部位特異的変異誘発、インバースＰＣＲ、クンケルベースの変異誘発、カセット変異誘発、全体プラスミド変異誘発、ＡＸＭ変異誘発、エラープローンローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、又はｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的変異誘発を使用して、無作為化を導入して、ライブラリーを生成し得る。幾つかの実施形態において、クンケルベースの部位特異的変異誘発が、使用される。幾つかの実施形態において、ＡＸＭ変異誘発が、使用される。幾つかの実施形態において、エラープローンローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）が、使用される。
[0177]幾つかの実施形態において、コンテキスト配列に結合するリン酸化結合ポケットの外側の１個又は複数の領域が、リン酸化結合ポケットを変化させることなく、無作為化される。
[0178]幾つかの実施形態において、ライブラリーは、リン酸化を含む目的のペプチド又はタンパク質に対してスクリーニングされる。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対してスクリーニングされる。幾つかの実施形態において、このスクリーニングは、リン酸化を特異的に認識する抗体の同定を可能にする。或いは、このスクリーニングは、リン酸化を認識しない抗体の同定を可能にする。或いは、このスクリーニングは、リン酸化を有し、有さないエピトープに結合する抗体の同定を可能にする。これらの後者の抗体は、エピトープのリン酸化状態に関して、特異的なエピトープに結合するので、「汎リン酸化」抗体である。
[0179]特異的な翻訳後修飾抗体複合体の既存の構造との比較と共に、機能的変異誘発及び構造モデリングの組合せである、このアプローチを使用して、候補ペプチド結合溝が、同定され得る。リン酸化ペプチド抗体複合体について、焦点が絞られたリン酸化ペプチドライブラリー設計についての候補として働き得る、ＣＤＲ Ｌ３及びＨ３の幾つかの規定された領域がホルスターとなった、ペプチド結合溝が同定された。
抗体
[0180]本開示の抗体は、複数特異的、例えば、二重特異的であってもよい。抗体は、哺乳類（例えば、ヒト又はマウス）、ヒト化、キメラ、組換え、合成産生されたか、又は天然で単離されたものであり得る。本開示の典型的な抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＡｓｅｃ）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｅｂ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、並びにＳＭＩＰ結合部分を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、抗体は、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖが、抗原結合を可能にする異なる向きで生じることを可能にする、例えば、柔軟なリンカーを含んでもよい。様々な実施形態において、抗体は、細胞質安定性ｓｃＦｖ又は細胞の内側の低減する環境においてその構造及び機能を保持する細胞内抗体であってもよい（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ及びＤｅＬｉｓａ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８５（１）：２９９〜３１１頁、２００９年を参照；参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、本明細書において記載される方法に従い、ＩｇＧ又はキメラ抗原受容体に変換される。実施形態において、抗体は、変性と天然のタンパク質標的の両方に結合する。実施形態において、抗体は、変性又は天然のタンパク質のいずれかに結合する。
[0181]ヒトを含む、大抵の哺乳類において、抗体全体は、ジスルフィド結合により結合された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を有する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）並びにＣＨ１とＣＨ２の間のヒンジ領域からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存される領域と共に分散された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域にさらに分割され得る。それぞれのＶＨ及びＶＬは、次の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端に整列された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。
[0182]抗体は、抗体の全ての公知の形態及び抗体様特性を有する他のタンパク質スキャフォールドを含む。例えば、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異的な抗体、１価の抗体、キメラ抗体、又はフィブロネクチン又はアンキリンリピートのような、抗体様特性を有するタンパク質スキャフォールドであり得る。抗体は、次のアイソタイプ：ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＡｓｅｃ）、ＩｇＤ、又はＩｇＥのいずれかを有し得る。
[0183]抗体フラグメントは、抗体からもたらされる１個又は複数のセグメントを含んでもよい。抗体からもたらされるセグメントは、特定の抗原に特異的に結合する能力を保持し得る。抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｅｂ、ｓｃＦｖ、又はＳＭＩＰであってもよい。抗体フラグメントは、例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、アフィボディー、ナノボディ、アプタマー、ドメイン抗体、直線性抗体、１本鎖抗体、又は抗体フラグメントから形成され得る様々な複数特異的な抗体のいずれかであってもよい。
[0184]抗体フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋結合により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント：ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント：抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるフラグメント；（ｖ）ｄＡｂフラグメント：ＶＨ及びＶＬドメインを含むフラグメント；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント：ＶＨドメインであるフラグメント；（ｖｉｉ）ｄＡｂフラグメント：ＶＬドメインであるフラグメント；（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｉｘ）１個又は複数の合成リンカーにより任意選択で結合され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、ＶＬ及びＶＨは、組換え方法を使用して、例えば、ＶＬ及びＶＨを単一タンパク質として発現されるのを可能にする合成リンカーにより、結合することができ、ＶＬ及びＶＨ領域対が、１価の結合部分（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する。抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を使用して得られてもよく、幾つかの場合では、インタクトな抗体として同じ方法において使用されてもよい。抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術又はインタクトな免疫グロブリンの酵素若しくは化学切断により、産生されてもよい。抗体フラグメントは、追加のＣ末端のアミノ酸、Ｎ末端のアミノ酸、又は個々のフラグメントを分けるアミノ酸の付加を含む、上で記載された抗体フラグメントのいずれかをさらに含んでもよい。
[0185]抗体は、第１の種からもたらされた１個又は複数の抗原決定領域又は定常領域及び第２の種からもたらされた１個又は複数の抗原決定領域又は定常領域を含むなら、抗体は、キメラとして言及され得る。キメラ抗体は、例えば、遺伝子操作により構築されてもよい。キメラ抗体は、異なる種（例えば、マウス及びヒト由来）に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントを含んでもよい。
[0186]抗体は、ヒト抗体であってもよい。ヒト抗体は、フレームワークとＣＤＲ領域の両方が、ヒト免疫グロブリン配列からもたらされる、可変領域を有する結合部分を指す。さらに、抗体が、定常領域を含有するなら、定常領域はまた、ヒト免疫グロブリン配列からもたらされる。ヒト抗体は、１個又は複数の配列バリエーション、例えば、変異のような、ヒト免疫グロブリン配列において同定されていないアミノ酸残基を含んでもよい。バリエーション又は追加のアミノ酸は、例えば、ヒト操作により、導入されてもよい。本開示のヒト抗体は、キメラではない。
[0187]抗体は、ヒト化であってもよく、抗体が、非ヒト免疫グロブリンから実質的にもたらされた１個又は複数の抗原決定領域（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）を含むか、又は抗体が、ヒト免疫グロブリン又は抗体から実質的にもたらされた少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含むように操作されることを意味する。抗体は、本明細書において記載される従来の方法を使用して、例えば、第１のベクターによりコードされる非ヒト抗体由来の抗原認識配列を、第２のベクターによりコードされるヒトフレームワークに挿入することにより、ヒト化であってもよい。例えば、第１のベクターは、非ヒト抗体（又はそのフラグメント）及び部位特異的な組換えモチーフをコードするポリヌクレオチドを含んでもよく、一方、第２のベクターが、第１のベクター上の部位特異的な組換えモチーフに相補的なヒトフレームワーク及び部位特異的な組換えをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。部位特異的な組換えモチーフは、組換え現象が、非ヒト抗体由来の１個又は複数の抗原決定領域のヒトフレームワークへの挿入をもたらし、これにより、ヒト化抗体をコードするポリヌクレオチドを形成するように、それぞれのベクターに位置してもよい。
[0188]ある特定の実施形態において、抗体は、ｓｃＦｖからＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に変換される。当該技術分野において、ｓｃＦｖフラグメントをＩｇＧに変換する様々な方法がある。ｓｃＦｖフラグメントをＩｇＧに変換する１つのかかる方法は、米国特許出願公開第２０１６０３６２４７６号において開示され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
結合親和性
[0189]抗体及び抗体フラグメントについての結合親和性は、当該技術分野において公知の様々な方法を通じて決定することができる。例えば、結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０、（１９８０年）のスキャッチャード解析により決定され得る。別の方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の割合を測定することを必要とし、割合は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方の向きで割合に等しく影響する幾何学パラメーターに依存する。したがって、「結合速度定数」（Ｋｏｎ）と「解離速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度の計算並びに結合及び解離の実際の割合により決定され得る。（Ｎａｔｕｒｅ、３６１：１８６〜８７頁、（１９９３年）を参照）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性と関連しない全てのパラメーターの解除を可能にし、解離定数Ｋｄと等しい。（一般に、Ｄａｖｉｅｓら、（１９９０年）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、５９：４３９〜４７３頁を参照）。
[0190]幾つかの実施形態において、翻訳後の特異的な抗体結合親和性は、Ｋｄ約１ｎＭである。幾つかの実施形態において、翻訳後の特異的な抗体結合親和性は、約１ｎＭのＫｄより高い。幾つかの実施形態において、抗体結合親和性は、約１〜５０ｎＭ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｎＭ、又は間の任意の値）のＫｄである。幾つかの実施形態において、抗体結合親和性は、約１〜１５ｎＭ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は間の任意の値）のＫｄである。
実施例１−特異的な翻訳後修飾のための抗体ペプチド結合溝の同定
[0191]本実施例は、特異的な翻訳後修飾に結合する抗体ペプチド結合溝の同定を記載する。本実施例において評価する特異的な翻訳後修飾は、リン酸化である。翻訳後修飾特異的な抗体クローン型の誘導を説明する１つの実施形態の方法を示す模式図を、図１において示す。
[0192]機能的変異誘発と構造モデリングの組合せ、並びにリン酸化ペプチドＡｂ複合体の既存の構造と比較を使用し、ＣＤＲ Ｌ３及びＨ３の幾つかの規定された領域がホルスターとなった、共有のペプチド結合溝を同定した。ＣＤＲ Ｌ３及びＨ３におけるこれらの制限した領域は、焦点が絞られたリン酸化ペプチドライブラリー設計のための候補として働き得る。
[0193]抗Ｍｙｂリン酸化セリン（ｐＳｅｒ）特異的なｓｃＦｖ（ＡＸＭ１２９３）のＣＤＲ領域の無作為化アラニン系統的変異導入法から得られたデータは、ＣＤＲ Ｈ２におけるアミノ酸残基は、リン酸化Ｍｙｂ１−２０ペプチドの結合に重要であることを示した（図４）。アラニンスキャニング結果（図４）及びＨ２がリン酸塩結合中心であるという知見に基づき、抗Ｍｙｂ ｐＳｅｒ特異的なｓｃＦｖ（ＡＸＭ１２９３）のＡｂ構造及びそのコグネイトリン酸化ペプチドとの複合体を、ロゼッタＡｂ３ソフトウエアを使用して、モデル化した。構造モデリング及びアラニン系統的変異導入法（図４）から得られた結果の解析から、Ｌ２及びＨ２を利用して、それぞれ、Ｃ末端又はＮ末端のコンテキスト配列を含むリン酸化ペプチドを標的にすることができると結論付けた（図４）。２つの他のリン酸化ペプチド−Ａｂ構造は、多様なリン酸塩結合部位（Ｈ２又はＬ２）を有するが、共通のコンテキスト配列結合モード、つまり、Ｈ３及びＬ３がペプチドにとってのホルスターとなるモードを共有することが決定されたが、これは、複合体モデルにおいても同様に観察される（図４）。さらなる検証を、変異誘発及び結晶学的方法を使用して行う。
実施例２−翻訳後修飾特異的抗体ライブラリーの設計及び産生
[0194]本実施例は、焦点が絞られたリン酸化セリン（ｐＳｅｒ）、リン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）、及びｐＳｅｒ／ｐＴｙｒ抗体ライブラリーの設計及び産生を記載する。予め解明した構造及び本明細書において得られたデータの解析から、リン酸化ペプチドの中心の結合領域を、Ｌ３、Ｈ３及びＨ２又はＬ２を含む三角形の領域に極限することができることを決定した。この相互作用の主要な多様性は、Ｌ３及びＨ３により関与し、一方、Ｈ２又はＬ２の選択は、リン酸塩結合及び恐らくペプチドの向きを示す。
[0195]ＡＸＭ１２９３のような、ｐＳｅｒ特異的である抗体を選択し、抗ｐＴｙｒ特異的、又は両方の抗ｐＳｅｒ／ｐ−Ｔｙｒ特異的である、追加の抗体クローンを選択する（図５を参照）。Ｌ３及びＨ３の一部を無作為化し、すなわち、特異的なペプチド／タンパク質との相互作用を仲介すると推定されるＬ３及びＨ３のＣＤＲループを無作為化し、一方、荷電していないｐＳｅｒ、ｐＴｙｒ又はｐＳｅｒ／ｐＴｙｒについての親和性を既に有するＣＤＲ Ｈ２は変化させずにおく。したがって、これは、ｐＳｅｒ抗体ライブラリーからｐＴｙｒ認識への単純なスイッチシフトをもたらし、Ｈ２領域が、ペプチドと実際に接触する計算的なモデルを支持することが、より重要である。この目的のため、ｐＴｙｒペプチドに対するライブラリーを得て、Ｌ３、Ｈ３及びＬ２上の残基を無作為化した。このライブラリーから得られたデータは、伝統的なライブラリーと比較して、ｐＴｙｒ−ペプチドに対する成功した割合を約束することを示す（図５）。
[0196]コンテキスト配列の側鎖が、中間のＬ３及びＨ３に主に結合することをさらに確認するために、ＣＤＲ Ｌ３及びＨ３における他の相互作用するアミノ酸を、アラニンスキャニングにより調べる。例えば、リン酸化ペプチドとＡｂの複合体を結晶化させることを含め、計算的モデルのさらなる確認及びペプチドと相互作用する残基の正確な位置の特定を行う。コンテキスト溝を囲む荷電したアミノ酸を変更することにより、バリアントライブラリーをまた作製して、バリアントライブラリーを産生する。これは、本発明者らが、首尾よくスクリーニングし得るペプチドの拡大を可能にする。
抗体ライブラリー設計
[0197]ＡＸＭ１２９３（抗Ｍｙｂ ｐＳｅｒ１１）ライブラリーについて、１２個の残基を、可能性のある相互作用する（４Åのペプチド内）残基並びにカバットデータベースにおける配列決定したヒトＡｂにおけるそれらの多様性に基づきＣＤＲ Ｌ３（コチアナンバリングにおけるＬ９３、Ｌ９４、Ｌ９５及びＬ９５Ａ）、並びにＨ３（コチアナンバリングにおけるＨ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ及びＨ１００Ｂ）において無作為化する。注目すべきは、Ｈ９５（ＡＸＭ１２９３におけるＡｓｐ）は、結合ポケットの負の電荷に主に関与し、結合エピトープの正の電荷を補完する。残基のセットを選択して、将来的な標的に対する電荷相補性を確実にする。ｐＳｅｒ又はｐＴｙｒペプチドを標的にする所定のＨ２領域を含む少なくとも３つ、最大６つのライブラリーを、並行して構築する。
[0198]ライブラリーを、修飾したｐＭＩＮＥＲＶＡファージミドシステムにおいて構築した（図６を参照）。ライブラリーを構築するために、ＡＸＭ変異誘発の修飾を使用した（図５）。ＡＸＭ変異誘発の修飾は、カバットデータベースにおいて選択したＣＤＲ位置における残基のクンケルベース部位特異的な変異誘発を使用する。ｓｃＦｖのライブラリーを、ｇｐＩＩＩコートタンパク質への遺伝子融合物としてバクテリオファージＭ１３の表面に提示する（図８）。構造モデルのガイダンスを用いないで、予備ライブラリーを設計したので、残基を含有する可能性のあるリン酸化ペプチドのみの無作為化を用いたより焦点が絞られたライブラリーは、恐らく、スクリーニング効率を増強する。ファージライブラリーのデータは、リン酸化に焦点が絞られた抗体ライブラリーを使用するとき、増強したバイオパニング結果を示した（以下の表２及び３を参照）。
Figure 2020534796
Figure 2020534796
[0199]組換え抗体ライブラリーを産生する追加の方法を使用することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの組換え抗体の産生方法もまた使用することができる（図１０及び図１４）。動物由来のリン酸化特異的な抗体のデータは、リン酸化に無関係又はセリン特異的な抗体を見出す際に、６つの試験ＲＡｂＭａクローンに対して約６６％の成功率を示す。
[0200]天然のものと類似する高度に多様で、緻密なＡｂライブラリーは、単一Ａｂフレームワークにおける多数の変異から首尾よく構築することができる。可能性のあるヒトＡｂレパートリーは、少なくとも１０１１であるが、いずれかの一時期に存在するＡｂ特異性の数は、個体におけるＢ細胞の総数により、並びにそれぞれの個体の抗原との遭遇により、制限され、いずれかの一時期においておよそ１０８の異なる特異性であると、予想する。これは、本明細書における１つの実施形態において記載する１００番目の多様性のライブラリーである。それ故、このライブラリーを用いて１ラウンドのバイオパニングを行うことにより、天然の選択を模倣し、結合Ａｂの多様なパターンを得ることができる。ライブラリーのサイズが、高親和性Ａｂの首尾よい単離に必須であるなら、高親和性は、Ａｂの首尾よい適用のため必ずしも予め必要ではない。これは、特異性、発現レベル及び安定性のような他の特性もまた重要であるためである。
[0201]Ａｂの親和性を、修飾した親和性成熟アプローチによりさらに増強することができる（図５）。この方法は、減少する量の抗原を用いたバリアント親和性選択を用いた、エラープローンＰＣＲによる、多様性のＡｂ遺伝子への導入を含む。親和性成熟プロセスは、より低い結合親和性を有する中程度のサイズの天然のファージライブラリーから選択されるＡｂの親和性を改善するため、又は診断又は免疫療法のような、ある特定の適用において使用されるべき「優れた」Ａｂを生成するのに有用である。Ｂ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ選択から得られた上限の親和性（１０−１０Ｍ）より、およそ１０倍高い親和性（１０−１１Ｍ）を有するファージＡｂを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟により作製したことを報告した。
実施例３−ライブラリーのスクリーニング
[0202]スクリーニング実験の陽性対照として、抗ｐＳｅｒ Ａｂ、ＡＸＭ１２９３を使用し、それは、使用するｐＳｅｒ含有ペプチドについての親和性およそ１×１０−７Ｍを有する。予備アラニンスキャニングデータは、Ｈ２残基が、リン酸化残基に結合し、ペプチドの主鎖と相互作用する計算モデルを支持する（図２）。データは、サイズ１０８のライブラリーでさえ、より大きな１０１０の焦点が絞られていないライブラリーよりリン酸化結合剤について濃縮されることを示す（図５）。
ファージディスプレイスクリーニング
[0203]翻訳後修飾を囲む特定配列コンテキストを有するｐＳｅｒ又はｐＴｙｒを認識するｓｃＦｖを選択するために、ライブラリーを、ｐＳｅｒ及びｐＴｙｒペプチドの収集物に対してスクリーニングする。例えば、Ａｋｔ１ ｐＳｅｒ４７３、Ｒｂ ｐＳｅｒ７８０、及びＣＲＥＢ ｐＳｅｒ１３３を、ｐＳｅｒライブラリーのスクリーニングのため使用し、Ｈｅｒ２ ｐＴｙｒ１２２２、Ｍｙｂ ｐＴｙｒ１１、及びＥｓｒ１ ｐＴｙｒ５３７を、ｐＴｙｒライブラリーのスクリーニングのため使用する。追加のペプチドもまた、さらなる対照としてスクリーニングすることができる。
[0204]リン酸基を欠く同じペプチドを競合として溶液に加えて、リン酸化ペプチドについての選択性であるｓｃＦｖを選択する。両方の標準的なファージディスプレイ（図８）により及びマイクロエマルジョンスクリーニングアプローチ（図９）を使用して、ライブラリーをスクリーニングする。クローンを、油中水滴型エマルジョンにおける別々のコンパートメント内の抗原に対して個別に調べるので、エマルジョンアプローチを使用して、結合剤のより多様なセットを回収することができる。
[0205]追加のライブラリーを生成し、スクリーニングし、コンテキスト特異的溝近くの電気的電荷が、変化する。
発見した抗体の予備解析及び抗体特徴決定
[0206]抗体は、ペプチドの末端のカルボキシレートに結合するので、
データの解析は、しばしば、ペプチドに対するＡｂが、ペプチド特異的であることを示す。カルボキシレートが、全長（ＦＬ）タンパク質において通常遠位にある場合、ペプチドのみの抗リン酸化アミノ酸結合剤は、最初の結合剤より５〜６個のアミノ酸長いペプチドに対する第２ラウンドのスクリーニングを回避することができる。
[0207]典型的には、スクリーニングから単離した４４０種以上の個々のクローンを、ｐＳｅｒ又はｐＴｙｒ含有ペプチド、それらの非リン酸化対応物並びに対照ペプチド及びタンパク質に対するファージＥＬＩＳＡにより解析する。バックグランドより＞５倍のＥＬＩＳＡシグナル、及び非リン酸化ペプチド誘導体との競合的ＥＬＩＳＡにおいて少なくとも２０％の阻害を有するクローンを、大腸菌において発現させ、例えば、金属アフィニティークロマトグラフィーのような、当該技術分野における方法により、精製する。
[0208]溶解性ｓｃＦｖｓ及びＩｇＧを、様々な方法により検証する。例えば、溶解物におけるタンパク質のリン酸化状態を、入手可能なときは、Ａｂｃａｍ又はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇのいずれかから市販されている既存のタンパク質特異的な抗ｐＳｅｒ又は抗ｐＴｙｒ Ａｂを使用して確認する。検証したｓｃＦｖを、ＩｇＧに変換し、遺伝子導入によりＣＨＯ細胞において発現させる（図６）。
実施例４−修飾特異的なクローン型（ＭＳＣ）の生成
[0209]本実施例は、とりわけ、修飾特異的なクローン型（ＭＳＣ）を生成する方法を記載する。本明細書において使用される、ＭＳＣは、数個のアミノ酸が異なり、同じエピトープの翻訳後修飾状態に差次的に結合する抗体である。本実施例において、記載するＭＳＣは、同じエピトープのリン酸化状態に差次的に結合する物である。
[0210]汎リン酸塩結合Ａｂ（すなわち、リン酸化部位における両方のリン酸化の状態への結合）を見出すために、部位特異的変異誘発を使用して、リン酸塩において相互作用することが決定されているＡｂリン酸化部位結合ポケットにおける構造上予想された及び実験で決定された部位において荷電していないアミノ酸（アラニン又はグリシンのいずれかを結合ポケットに）を置く。非リン酸塩結合（すなわち、リン酸化部位における修飾していないセリン又はチロシンのみへの結合）を見出すために、部位特異的変異誘発を使用して、リン酸化部位結合ポケットにおける構造上予想された及び実験で決定された部位において負に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸又はグルタミン酸のいずれか、結合ポケットにおいてリン酸塩を恐らく寄せ付けない）に置く。これらの変異したＡｂの特異的な進化を使用し、これらの変異したＡｂを、ペプチドにおけるリン酸化アミノ酸が、ここで修飾されていないペプチドに対してスクリーニングする。
ファージディスプレイスクリーニング、抗体特徴決定及び検証
[0211]Ａｂにおけるリン酸塩結合アミノ酸が特異的に荷電している（すなわち、ａｌａ、ｇｌｙ、ａｓｐ又はｇｌｕのいずれかに）こと以外、上のファージディスプレイスクリーニングのセクションにおいて記載した、同様の方法論を使用する。実験条件下で同定したヒットが存在しないなら、本発明者らは、スクリーニングストラテジーを変動させる。
[0212]抗体特徴決定のため、スクリーニングから単離した個々のクローンを、ｐＳｅｒ又はｐＴｙｒ含有ペプチドのいずれか及びそれらの非リン酸化対応物に対するファージＥＬＩＳＡにより解析する。抗体検証のため、溶解性ＭＳＣ ｓｃＦｖを、セリン又はチロシンリン酸化を含まない（及び含む）標的タンパク質を過剰発現する細胞溶解物に対するウエスタンブロットによりまず検証する（例えば、図１３及び１９を参照）。溶解物におけるタンパク質のリン酸化状態を、Ａｂｃａｍ及びＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから市販されている既存のタンパク質特異的な抗ｐＳｅｒ又は抗ｐＴｙｒ Ａｂを使用して確認する。例えば、図１９は、ノックアウト細胞株が入手可能である場合、４種の異なる細胞溶解物を産生することができる：１）野生型（ｗｔ）ヒト細胞溶解物、（２）ノックアウト（ＫＯ）細胞株溶解物、（３）ＳＥＰ抑制性大腸菌（ＳＥＰ）において発現したタンパク質Ｘ及び（４）野生型大腸菌株（ＳＥＲ）を示す。オルソロガスな、ホスホセリン−ＭＳＣ及びセリン特異的なＭＳＣ抗体が、図１９において見られるパターンを生じるなら、次に、ＭＳＣ抗体を見出すサポートを検証する。図１９において、タンパク質Ｘは、野生型においてリン酸化されない仮定する。検証したｓｃＦｖを、可変重鎖及び軽鎖遺伝子を本発明者らのｐＭＩＮＥＲＶＡベクターにクローニングし、ＣＨＯ細胞の一過性遺伝子導入によりそれらを発現させることにより、ＩｇＧに変換される（図６）。
実施例５−特異的リン酸化Ａｂクローン型（ＤＰＡＣ）
[0213]抗体リン酸塩結合部位を、局所モジュールとして設計し、リン酸化特異的な抗体をもたらす効率的な手段として使用し得る。本明細書において提示されるストラテジーは、抗体のＣＤＲ−Ｈ２が、リン酸化を好む、及びリン酸化特異的な結合活性について一定を保つ、リン酸化に焦点が絞られた濃縮ファージディスプレイ抗体ライブラリーを産生することである。このライブラリーをファージバイオパニングにおいて使用して、Ｍ１３ ｇｐＩＩＩタンパク質に提示した抗体を、予め特定したリン酸化アミノ酸を含有する合成ペプチドへと方向付ける。
予備ＤＰＡＣ状態の結果
[0214]ペプチドの２０対（すなわち、対は、Ｓｅｐ含有と天然の配列両方からなる）のセットを合成した。２０種のＳｅｐペプチドを、ＡＸＭ４０及びＡＸＭ４１ライブラリーを使用してスクリーニングした。結果を、以下の表４において示す。
Figure 2020534796
[0215]発見スクリーニングの「ヒット」を、非リン酸化天然配列に対して続いて試験した。次の３つの分類のヒットを観察した：（ｉ）リン酸化に無関連であり、Ａｂが、リン酸化と非リン酸化ペプチドの両方に等しく結合した、（ｉｉ）リン酸化特異的であり、これは、天然のペプチドより、＞１０倍良好にリン酸化ペプチドに結合した、及び（ｉｉｉ）リン酸化を好み、これは、リン酸化と非リン酸化ペプチドの両方に結合し、リン酸化ペプチドを＞５倍好んだ。リン酸化を好む候補は、既に：（１）天然の配列に結合すること、及び（２）リン酸化を好む候補は、リン酸塩により影響されるので、Ｓｅｐ近くに極限する可能性が最も高いと推定されることが理由で、リン酸化を好む候補を、まず調べた。リン酸化を好むものは、ここで、ＩｇＧに変換し、精製し、全長タンパク質に対して検証する。必要なら、これらの発見ヒットを、ＡＸＭ変異誘発により親和性成熟して、天然の配列に対する増大した結合親和性を有する抗体をもたらし得る。ＩｇＧに変換したｓｃＦｖ又はＦａｂをさらに検証する。
予備ＤＰＡＣ研究の概要
[0216]リン酸化ペプチドに結合する固有の傾向を有するリン酸化に焦点が絞られたライブラリーを、ＣＤＲ Ｈ２において天然のリン酸塩結合モチーフを用いて効率的に産生することができる。抗Ｍｙｂ Ｓｅｐ（Ｓｅｐ１１）特異的なｓｃＦｖ（ＡＸＭ１２９３）のＣＤＲ Ｈ２におけるアミノ酸は、リン酸化Ｍｙｂ１−２０ペプチドの結合に重要である（図１３）。Ｈ２が一定を維持し、Ｌ３、Ｈ３及びＬ２上の残基を無作為化した、幾つかのパイロットライブラリーを製造した。これらのパイロットライブラリーは、本発明者らの伝統的なライブラリー（一般に、類似のサイズのペプチドに対して＜５０％の成功率を生じる、表４を参照）と比較して、２０〜２５ｍｅｒのリン酸化したペプチドに対して有望な成功率（試験した１０のうち１０）を既に提示した。
図１５、パネルＡ及びＢは、ＤＰＡＣにより生成した抗ａｋｔ４７３抗体の別の例を示す。図１５（パネルＡ及びＢ）は、抗ａｋｔ４７３の発見及び発見成熟（「ＤｉｓＭａｔ」）を示す。本研究のため、ａｋｔ４７３部位に対応するリン酸化ペプチドを、リン酸化に焦点が絞られたライブラリーに対してスクリーニングし、リン酸化特異的なクローンを単離した。次に、本クローンを変異誘発し、修飾されていないペプチドに対して再スクリーニングした。
実施例５−抗酵素抗体立体インヒビターの設計
[0217]本実施例は、立体酵素インヒビターの産生を記載する。幾つかの実施形態において、立体酵素インヒビターを、細胞及び酵素ベースのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
[0218]タンパク質又はペプチドの特異的なアミノ酸に対する（又は少なくとも隣接する）組換え抗体を生成するのがしばしば困難である。タンパク質又はペプチドの特異的なアミノ酸への組換え抗体の生成を可能にする方法を、本明細書及び上の実施例において記載した。上の実施例において記載した通り、機能ベース構造モデル及びアラニンスキャニングを使用して、ＩｇＧ及びｓｃＦｖ Ａｂによるリン酸化アミノ酸及びコンテキスト配列結合についての一般的な様式を同定した。
[0219]タンパク質又はペプチドのリン酸化部位に対する抗体は、しばしば、これらのＡｂがリン酸化アミノ酸に結合しやすくする特定のＣＤＲ−Ｈ２生殖系列から生じる。これらのＡｂは、Ａｂの２つの領域を介して結合する：（１）「リン酸化特異的な」結合部位領域とみなし得る特異的なＣＤＲ−Ｈ２配列、及び（２）残りの５つのＣＤＲのうち１個又は複数を含む第２の領域が、「コンテキスト」配列に結合する。コンテキスト配列は、得られたＡｂが、リン酸化タンパク質又はペプチド抗原に特異的であるようにする。Ａｂライブラリーを作製し、これにより、特異的なリン酸化結合活性に関与するＣＤＲ−Ｈ２を、一定のアミノ酸配列に保ち得る。リン酸塩との相互作用に関与するＣＤＲ−Ｈ２における少なくとも３つの特異的なアミノ酸を用いる場合、これらのライブラリーは、従来のスクリーニングライブラリーより抗リン酸化アミノ酸結合についてほぼ１００００倍（２０３）濃縮されている。
[0220]本明細書における１つの方法は、ＣＤＲ−Ｈ２が、リン酸化特異的な結合活性について一定を保っている、リン酸化に焦点が絞られた濃縮ライブラリーを産生することである。このライブラリーを、ファージバイオパニングにおいて使用して、予め特定したリン酸化アミノ酸を含有するペプチドへと、Ｍ１３ ｇｐＩＩＩタンパク質に提示したＡｂを方向付ける。相補的なアプローチにおいて、タンパク質構造解析を使用して、酵素活性部位内の隣接する又は（恐らく）１個又は複数の表面暴露アミノ酸ループを規定する。これらのループ配列を含む合成ペプチドを、（１）天然の配列、及び（２）天然の配列の中心のアミノ酸が、ホスホセリン又はホスホチロシンのいずれかで置換されたペプチドから構成される対として合成する。１つの実施形態において、ループ選択は、中心のアミノ酸が、実際に、セリン又はチロシンのいずれかであるループへとバイアスをかける。これらのアミノ酸が、タンパク質表面でしばしば見られることを認める。抗リン酸化濃縮ライブラリーを、発見クローンをもたらすリン酸化含有ペプチドに対してまずバイオパニングする。したがって、指向進化を使用して、天然の配列に対して、抗リン酸化Ａｂを発生させる。最終的に、天然のリン酸化されていないコンテキスト配列に結合することができるこれらの発生したＡｂを、酵素活性を阻害するそれらの能力について試験し、必要なら、より高い親和性のため親和性成熟させる。
[0221]幾つかの実施形態において、この方法は、どのようなアミノ酸が、天然の配列に存在するかにかかわらず、中心のアミノ酸が、ホスホセリン又はホスホチロシンのいずれかで置換されているループを選択する工程をさらに含む。任意の１個のアミノ酸が、この方法を使用して、適当な結合剤を生じるのに失敗するなら、これは、幾つかのペプチドを任意の所定のタンパク質配列についてスクリーニングすることを可能にする。ペプチドにおける所定の位置の上流又は下流のリン酸化アミノ酸を動かすことにより、ループ特異的なＡｂを開発する増大した機会を可能にする。
[0222]抗酵素抗体立体インヒビターを作製する方法が、本明細書において記載される。この目的のため、リン酸化アミノ酸に結合する既存の傾向を有するＡｂフレームワークに基づくリン酸化に焦点が絞られた特異的ライブラリー及びコンテキスト配列に結合する一般的な様式を使用する。このリン酸化特異的なライブラリーを使用して、Ａｂ結合を、酵素の活性部位周囲の表面に暴露したループのアミノ酸配列を含むリン酸化修飾されたペプチドへと方向付ける。これは、生化学及び薬理学における有用性を有する可逆的なインヒビターの迅速な生成を可能にする。
[0223]立体インヒビター抗体を、ヒトトロンビンタンパク質に対して首尾よく産生した（図３）。この目的のため、トロンビン活性部位の周囲の選択したトロンビン配列の重複する部分に対応するペプチドを合成した。合成したペプチドを遺伝子操作して、ホスホセリン（ＧＧＧＳＧＧＳＷＧＥＧＣＤＲ（ｐＳｅｒ）ＧＫＹＧ）を組み込む。次に、ｓｃＦｖヒットを、天然の配列（下線）：ｑｍｇｉｖｓｗｇｅｇｃｄｒｄｇｋｙｇｆｙｔｈｖｆｒに対して成熟させた。示した４つのｓｃＦｖ結合剤のうち、３つ（図３、パネルａ、ｂ、及びｃ）が、トロンビン活性を阻害し、一方、選択したペプチド結合剤の１つ（図３、パネルｄ）はしなかった。
ライブラリーの設計、ライブラリー構築、リン酸化免疫原の設計、及びライブラリースクリーニング
[0224]ｐＳｅｒ、ｐＴｙｒ及びｐＳｅｒ／ｐＴｙｒライブラリーを設計し、上の実施例において記載した通り、構築する。次に、ｐＳｅｒ、ｐＴｙｒ及びｐＳｅｒ／ｐＴｙｒライブラリーを、リン酸化免疫原と接触させる。
[0225]幾つかの実施形態において、酵素標的は、次の所望の特性：（ｉ）市販又は精製したタンパク質を産生するのが比較的容易、（ｉｉ）酵素アッセイ（例えば、ジェルベース、蛍光ベース又は比色分析アッセイ）を行うのが比較的単純、（ｉｉｉ）公的データベースにおいて入手可能な構造情報、（ｉｖ）公知及び入手可能な基準インヒビター（例えば、立体）、及び（ｖ）セリン又はチロシンのいずれかを含有する活性部位に近くで隣接する表面暴露ループを有するものに焦点を絞る。幾つかの実施形態において、これらの特性の全て又はほぼ全てを有するタンパク質の分類は、ポリメラーゼ、制限酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ＡＴＰａｓｅ、ルシフェラーゼなどを含む。酵素の構造を使用して、表面ループを同定し、選択する。
[0226]上の実施例と同様に、抗体の親和性を、親和性成熟により濃縮し得る （図７）。スクリーニングプロセスのため、ライブラリーを、標準的ファージディスプレイ（図８）とマイクロエマルジョンスクリーニングアプローチ（図７）の両方を使用してスクリーニングする。
[0227]候補ｓｃＦｖを、必要に応じてＩｇＧに変換し得る（図６）。候補ｓｃＦｖのＩｇＧへのこの変換は、ＩｇＧにおけるｓｃＦｖ可変領域の２量体化の結果として生じる「親和性効果」に起因して結合親和性において４〜１０倍の増大を可能にする。
[0228]本明細書において記載されるファージ由来ＩｇＧ抗体を使用して生成した典型的な抗体を、図１２において提示する。例えば、図１２において示す通り、本明細書において記載される方法論に従ってファージ由来ＩｇＧ抗体からもたらされた抗体を、免疫組織化学適用（図１２、パネルＡ）、ウエスタンブロット適用（図１２、パネルＢ）、フローサイトメトリー適用（図１２、パネルＣ）、及びクロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈｉＰ）（図１２、パネルＣ）において検証した。
[0229]図１２、パネルＡは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ヒトニューロブラストーマ細胞株）細胞におけるミエリン塩基性タンパク質に対して構築した抗体の代表的な免疫組織化学適用を示す。細胞を、４％ホルムアルデヒド（１０分）を用いて固定し、０．１％トリトンＸ−１００を用いて５分間透過処理し、次に、０．１％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の１％ＢＳＡ／１０％正常ロバ血清／０．３グリシンを用いて１時間ブロッキングした。次に、細胞を、一晩、＋４℃にて、濃度５μｇ／ｍｌのａｂ２０９３２８とインキュベートし、次に、１／２０００希釈（緑色で示す）のロバ抗ヒト（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕ又は４８８）２次Ａｂを用いて検出した。核ＤＮＡを、ＤＡＲ（青色で示す）及び１／２５０希釈（赤色で示す）のアルファチューブリンに対するａｂ１９５８８９、マウスモノクローナル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕ又は５９４）を用いて標識した。
[0230]図１２、パネルＢは、抗ヒストンＨ２Ｂ抗体を使用した代表的なウエスタンブロットを示す。全てのレーン：０．２５μｇ／ｍｌの抗ヒストンＨ２Ｂ Ａｂ［ＩＧＸ４２２８Ｒ−１］（ａｂ２１３２２５）。レーン１：ＣＴＨ（仔ウシ胸腺ヒストン）０．５μｇ。レーン２：ＨｅＬａ（ヒト上皮癌腫細胞株）ホールセル溶解物２０μｇ。レーン３：ＨｅＬａ（ヒト上皮癌腫細胞株）核溶解物１０μｇ。レーン４：ＮＩＨ ３Ｔ３（マウス胚線維芽細胞株）ホールセル溶解物２０μｇ。レーン５：ＮＩＨ ３Ｔ３（マウス胚線維芽細胞株）核溶解物１０μｇ。レーン６：ヒストンＨ２Ｂ組換えタンパク質０．１μｇ。レーン７：ヒストンＨ３組換えタンパク質０．１μｇ。１／５００００希釈の２次ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）。ＥＣＬ技術を使用して開発。還元条件下で行う。推定バンドサイズ：１４ｋＤａ、観察したバンドサイズ：１７ｋＤａ。暴露時間：１分。このプロットを、ＭＥＳバッファー系下で４〜１２％Ｂｉｓ−トリスゲルを使用して行った。ゲルを、２００Ｖにて３５分間泳動し、その後、ニトロセルロース膜に３０Ｖにて７０分間移動させた。次に、膜を、１時間、３％牛乳を使用してブロッキングし、その後、ａｂ２１３２２５と一晩４℃にてインキュベートした。Ａｂ結合を、ＥＣＬ発生溶液ａｂ１３３４０６を使用して視覚化した。
[0231]図１２、パネルＣは、抗ＮＴＳＲ抗体を使用した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。簡単に述べると、ＧＰＣＲ ＮＴＳＲ１を過剰発言する細胞株（黒色）及び陰性対照ヌル細胞株（青色、上部、及び紫色、下部）を、フルオレセインＮＴＳＲ１リガンド（上部）又はｓｃＦｖ Ｅ１（下部）のいずれかと混合し、フローサイトメトリー解析の対象にした。
[0232]図１２、パネルＤは、ファージ由来ＩｇＧ抗体を使用した、代表的なクロマチン免疫沈降の結果（ＣｈＩＰ）を示す。簡単に述べると、クロマチンを、Ａｂｃａｍ Ｘ−ＣｈＩＰプロトコールに従い、ＨｅＬａ細胞から調製した。細胞を、ホルムアルデヒドを用いて１０分間固定した。ＣｈＩＰを、クロマチン２５μｇ、ａｂ２１３２８８ ２μｇ（青色）、及びタンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズ２０μｌを用いて行った。Ａｂをビーズ対照に加えなかった（黄色）。免疫沈降したＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎアプローチ）により定量した。プライマー及びプローブを、転写領域の最初のｋｂに位置させた。
実施例７：抗イディオタイプ及び酵素インヒビター抗体の設計
[0233]本実施例は、抗イディオタイプ抗体の生成を記載し、示す。本実施例はまた、ソルターゼ、トロンビン及びアミラーゼを阻害する酵素インヒビター抗体の生成を記載し、示す（図１１、パネルＤ）。概念の証明として、これらの酵素を選択したが、当業者が認識する通り、本明細書において提示する方法論をまた、当該技術分野において公知の標的化した他の酵素又は他の抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）に適用することができる。
[0234]抗イディオタイプ抗体を、選択した抗体（図１１、パネルＡ〜Ｃ）に対して構築した。抗イディオタイプ抗体と酵素インヒビター抗体の両方を、図２において描写するフロー図において示す同じワークフローを使用して、構築した。簡単に述べると、抗イディオタイプ抗体の生成のため、ＣＤＲ Ｈ３及びＬ３由来の塩基配列を選択して、別々の修飾したペプチドを生成した。その配列内にホスホセリンを含むように、修飾したペプチドを合成した。ファージライブラリーを、修飾したペプチドに対してスクリーニングし、選択した抗体のＣＤＲＨ３に特異的である抗体を単離し、これにより、抗イディオタイプ抗体を生成した。結合アッセイは、抗イディオタイプ抗体の結合を示す（図１１、パネルＡ〜Ｃ）。
[0235]本明細書において記載し、図２において描写する方法論を使用して、抗体をまた、次の酵素標的：ソルターゼ、トロンビン及びアミラーゼに対して生成させた。結合アッセイを、単離した抗体から得て、生成させた（すなわち、ソルターゼ、トロンビン、及びアミラーゼ）単離した抗体との接触の際に結合及び酵素阻害を確認した（図１１Ｄ）。
実施例８：遅延エマルジョン感染性（ＤＥＩ）：組換えバイオパニングストラテジー
[0236]図１６、パネルＡは、遅延エマルジョン感染性を説明する模式図を示す。
組換えバイオパニングストラテジー。簡単に、ＤＥＩバイオパニングストラテジーを、次の通り概説する。およそ１０４種の異なるＡｇの大腸菌表面ディスプレイＬｐｐ’ｏｍｐＡ融合ライブラリーを、１６℃にて成長させて、Ｆ線毛（細胞表面のＭ１３受容体）発現及びクローナルな拡大を抑制する。＞１０１０の複雑さのファージディスプレイＡｂライブラリーを、バルク溶液において細菌ライブラリーと、Ａｇ−Ａｂ相互作用が生じるのに十分な期間に合わせて、次に、洗浄して、結合していないファージを取り除く。トリプシン（加えた特異性及び増大した分離効率のためｇｐＩＩＩタンパク質からｇｐＩＩＩタンパク質を特異的に切断するため）を加え、細胞（及び任意の結合したファージ）を、混合物をボルテックスして、油中水滴型エマルジョンの個々の滴内に細胞を封入することにより、迅速にコンパートメント化する。エマルジョンを３７℃に移して、Ｆ線毛の発現及びファージ粒子の分離を誘導する。分離したファージを、誘導したＦ線毛を介して細菌に感染させる。エマルジョンを破壊し、細胞をＬＢ＋Ｃａｍプレートで成長させて、クローナルな拡大を妨げる。プール由来のプラスミドＤＮＡを単離する。ｓｃＦｖ遺伝子の５’側とエピトープの３’側の間のＤＮＡ領域を、ＰＣＲを使用して増幅する。次に、ＰＣＲ産物を、次世代配列決定により解析する。コンティグアセンブリ後、Ａｂとエピトープ定常領域の両方にコードしたバーコードを使用して、特異的なクローンを同定する。特異的なエピトープに対する抗体は、エピトープ特異的プライマーを使用して増幅することができる。特異的な抗体は、バーコード相補性プライマーの固有の対を使用して増幅することができる。特異的な抗体をまた、適当な発現系にサブクローニングすることができる。１つのバーコードを、ｓｃＦｖ遺伝子の５’末端に置き、第２のバーコードを、エピトープ遺伝子の３’に置く。
ＤＥＩ研究の概要
[0237]１８種のペプチドのセットを使用して、ＤＥＩをモデル化する。次世代配列決定（「ＮＧＳ」）及びバーコードスキームを使用して、数百万のＨｉＳｅｑ配列決定読み取り値を処理した。大腸菌におけるリン酸化に焦点が絞られたライブラリーの生成において、大腸菌細胞表面に非特異的に結合するファージを除去し大きく低減させた。実験におけるノイズを低減するために単一標的Ａｇ由来のヒットを、残りのＡｇの全ての組合せと比較することを含む生物情報学解析をまた、行った。単一のＡｇの全てについて同じライブラリーを使用して、複数のスクリーニングにより、標的Ｎと２つのタイプの非標的Ｎ分類配列（他の全てにおいて非特異的であり、濃縮した）の両方と結合するクローンのコンピューターでの視覚化を可能にした。
[0238]ＤＥＩと関連する細菌ディスプレイシステムの実施形態を、図１７において説明する。図１７において示す通り、ＤＥＩと関連する細菌ディスプレイシステムの１つの実施形態は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ細菌ディスプレイシステムである。
[0239]ＤＥＩシステムの予備観察は、成長温度が、Ｍ１３による感染能力に対する直接的効果を有することを示す（図１６、パネルＢ）。
[0240]ＤＥＩと関連する細菌ディスプレイシステムの実施形態を、図１７において説明する。
[0241]結果を、大腸菌の表面での複数の１８種の別々に提示したペプチドから得た。図１８（パネルＡ及びＢ）において示す通り、結果は、最初の１０種のペプチドについての１００万を超える抗体次世代配列決定読み取り値を示す。本研究から得たデータは、この解析の群の３つの「分類」：１）濃縮した標的１特異的ｓｃＦｖ；２）非特異的ｓｃＦｖ；及び３）濃縮した全ての他のｓｃＦｖを示した。
均等物及び範囲
[0242]当業者は、日常的な実験未満を使用して、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、又は解明することができる。本発明の範囲は、上の説明を制限することは意図しておらず、むしろ次の請求の範囲を説明するものである。
［関連出願］
[0001]本出願は、２０１７年８月４日に出願された、米国仮出願第６２／５４１，５３０号に基づく優先権を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (162)

  1. 翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態と無関係に翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を認識する抗体を生成する方法であって、
    目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；
    前記抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；
    前記ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合する前記ＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；
    ＰＴＭを含まない前記目的のペプチド又はタンパク質に対して前記ライブラリーをスクリーニングし、これにより、汎ＰＴＭ結合抗体を同定する工程
    を含む方法。
  2. 翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を認識する抗体を生成する方法であって、
    目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；
    前記抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；
    前記ＰＴＭと相互作用することが決定されている前記抗体の前記ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位において荷電していないアミノ酸を導入する工程；
    前記ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合する前記ＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；
    ＰＴＭを含まない前記目的のペプチド又はタンパク質に対して前記ライブラリーをスクリーニングし、これにより、汎ＰＴＭ結合抗体を同定する工程
    を含む方法。
  3. 前記ＰＴＭ部位が、天然に存在するＰＴＭ部位である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＰＴＭ部位が、遺伝子操作されたＰＴＭ部位である、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位が、部位特異的変異誘発により、目的のペプチド又はタンパク質に導入される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記部位特異的な変異誘発が、点変異、一連の点変異、欠損又は挿入を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位が、前記目的のペプチド又はタンパク質における１個又は複数のアミノ酸置換により導入される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位が、１個又は複数のアミノ酸の前記目的のペプチド又はタンパク質への挿入により導入される、請求項６に記載の方法。
  9. 前記目的のペプチド又はタンパク質に挿入された前記１個又は複数のアミノ酸が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記抗体が、修飾状態に関わらず、ＰＴＭ部位を認識する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記抗体が、修飾状態に依存して、ＰＴＭ部位を認識する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記修飾状態が、ＰＴＭの欠如である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＰＴＭ結合ポケット内の前記１個又は複数の部位が、構造上予想されたものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ＰＴＭ結合ポケット内の前記１個又は複数の部位が、実験で決定されたものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記荷電していないアミノ酸が、アラニン又はグリシンである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記荷電していないアミノ酸が、変異誘発により導入される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記変異誘発が、部位変異誘発又は無作為化変異誘発である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＰＴＭが、負に荷電している、正に荷電している、親水性である、及び／又は疎水性である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＰＴＭが、リン酸化である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ＰＴＭが、グリコシル化である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記グリコシル化が、シアリル化、アセチル化又はメチル化である、請求項２０に記載の方法。
  22. 翻訳後修飾の非存在下で、ＰＴＭ部位に特異的に結合する非ＰＴＭ結合抗体を生成する方法であって、
    目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；
    前記抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；
    前記ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合する前記ＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；
    ＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対して前記ライブラリーをスクリーニングし、これにより、非ＰＴＭ結合抗体を同定する工程
    を含む方法。
  23. 翻訳後修飾の非存在下で、ＰＴＭ部位に特異的に結合する非ＰＴＭ結合抗体を生成する方法であって、
    目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；
    前記抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；
    前記ＰＴＭと相互作用することが決定されている前記抗体の前記ＰＴＭ結合ポケット内の１個又は複数の部位において前記ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸を導入する工程；
    前記ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合する前記ＰＴＭ結合ポケットの外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；及び
    ＰＴＭを含まない目的のペプチド又はタンパク質に対して前記ライブラリーをスクリーニングし、これにより、非ＰＴＭ結合抗体を同定する工程
    を含む方法。
  24. 前記ＰＴＭ部位が、天然に存在するＰＴＭ部位である、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 前記ＰＴＭ部位が、遺伝子操作されたＰＴＭ部位である、請求項２２又は２３に記載の方法。
  26. 前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位が、部位特異的変異誘発により、目的のペプチド又はタンパク質に導入される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記部位特異的変異誘発が、点変異、一連の点変異、欠損又は挿入を含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位が、前記目的のペプチド又はタンパク質において１個又は複数のアミノ酸置換により導入される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位が、１個又は複数のアミノ酸の前記目的のペプチド又はタンパク質への挿入により導入される、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記目的のペプチド又はタンパク質に挿入される前記１個又は複数のアミノ酸が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸を含む、請求項３１に記載の方法。
  31. 前記ＰＴＭ結合ポケット内の前記１個又は複数の部位が、構造上予想されたものである、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ＰＴＭ結合ポケット内の前記１個又は複数の部位が、実験で決定されたものである、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＰＴＭが、負に荷電している、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＰＴＭが、リン酸化である、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ＰＴＭが、グリコシル化である、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記グリコシル化が、シアリル化である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、負に荷電したアミノ酸である、請求項２２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記負に荷電したアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＰＴＭが、正に荷電している、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ＰＴＭが、レチニリデンシッフ塩基形成又はアルギニル化である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、正に荷電したアミノ酸である、請求項３９又は４０に記載の方法。
  42. 前記正に荷電したアミノ酸が、リジン、アルギニン、又はヒスチジンである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、非標準的なアミノ酸である、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記非標準的なアミノ酸が、ホスホセリン、ホスホチロシン、ｐ−アジド−フェニルアラニン、ベンゾイル−フェニルアラニン、又はアセチル−リジンである、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、サプレッサーｔＲＮＡにより導入される、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ＰＴＭが、疎水性である、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、親水性である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記親水性アミノ酸が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、又はスレオニンである、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ＰＴＭが、親水性である、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、疎水性である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記疎水性アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、変異誘発により導入される、請求項２３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記変異誘発が、部位変異誘発又は無作為化変異誘発である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記コンテキスト配列が、前記ＰＴＭ部位の上流又は下流の３〜１５個の残基を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記コンテキスト配列に結合する前記ＰＴＭ結合ポケットの外側の前記１個又は複数の領域が、エラープローンローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により無作為化される、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記コンテキスト配列に結合する前記ＰＴＭ結合ポケットの外側の前記１個又は複数の領域が、前記ＰＴＭ結合ポケットを変化させることなく、無作為化される、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記候補汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーが、ファージディスプレイライブラリーである、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記候補汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーが、少なくとも１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、又は１０１２の多様性を有する、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記ライブラリーをスクリーニングする前記工程が、ホールセルパニングである、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記ホールセルパニングが、エマルジョンベースである、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記同定された汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を検証する工程をさらに含む、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記検証工程が、高処理である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記ＰＴＭが、リン酸化であり、前記高処理検証工程が、ホスホ−セリン又はホスホ−チロシンを、抑制可能なアンバー（ＵＡＧ）停止コドンに組み込み、これにより、汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を検証するためのリン酸化タンパク質を産生する細胞株の使用を含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記細胞株が、大腸菌である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記細胞株が、昆虫細胞株である、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記同定された汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体が、機能的アッセイにより検証される、請求項６１に記載の方法。
  67. 前記汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体を検証する前記工程が、ｓｃＦｖをＩｇＧに変換する工程を含む、請求項６１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記検証の工程が、前記同定された汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体が、ＰＴＭに対する立体インヒビター抗体であるかを決定することを含む、請求項６１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  69. 酵素に対する立体阻害性抗体を生成する方法であって、
    目的の酵素上のＰＴＭを特異的に認識する抗体を用意する工程；
    前記抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；
    前記酵素の前記ＰＴＭ部位に結合する前記ＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；
    前記ライブラリーを前記目的の酵素に対してスクリーニングする工程及びＰＴＭ修飾の非存在下で前記ＰＴＭ部位を認識する前記抗体を選択する工程；並びに
    酵素活性アッセイを行うことにより、立体阻害性抗体を選択する工程
    を含む方法。
  70. 酵素に対する立体阻害性抗体を生成する方法であって、
    目的の酵素上のＰＴＭ部位を遺伝子操作する工程；
    前記目的の酵素の前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位を特異的に認識する抗体を用意する工程；
    前記抗体のＰＴＭ結合ポケットを同定する工程；
    前記酵素の前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位に結合する前記ＰＴＭ結合ポケットの内側又は外側の１個又は複数の領域を無作為化することにより、候補汎ＰＴＭ結合抗体を含むライブラリーを生成する工程；
    前記ライブラリーを前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位を有さない前記目的の酵素に対してスクリーニングする工程及び前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位の非存在下で前記抗体を認識する前記抗体を選択する工程；
    並びに酵素活性アッセイを行うことにより、立体阻害性抗体を選択する工程
    を含む方法。
  71. 前記ＰＴＭが、天然に存在するＰＴＭ部位である、請求項６９に記載の方法。
  72. 前記ＰＴＭ部位が、遺伝子操作されたＰＴＭ部位である、請求項６９に記載の方法。
  73. 前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位が、部位特異的変異誘発により、前記目的の酵素に導入される、請求項７０又は７２に記載の方法。
  74. 前記部位特異的変異誘発が、点変異、一連の点変異、欠損又は挿入を含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位が、前記目的の酵素における１個又は複数のアミノ酸置換により導入される、請求項７３に記載の方法。
  76. 前記遺伝子操作されたＰＴＭ部位が、１個又は複数のアミノ酸の前記目的の酵素への挿入により導入される、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記目的の酵素に挿入された前記１個又は複数のアミノ酸が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 請求項６９〜７７のいずれか一項に記載の方法に従い生成された目的の酵素の立体インヒビターである抗体。
  79. 請求項６９〜７８のいずれか一項に記載の抗体を使用して、目的の酵素を阻害する方法。
  80. 請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法に従い生成された汎ＰＴＭ結合抗体又は非ＰＴＭ結合抗体。
  81. 目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する既存の抗体からもたらされる複数の抗体を含む汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリーであって、前記複数の抗体が、ＰＴＭ結合ポケット及び前記ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列に結合する１個又は複数の無作為化された領域を含む、汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  82. 前記ＰＴＭ結合ポケットが、前記ＰＴＭと相互作用することが決定されている１個又は複数の部位において荷電していないアミノ酸を含む、請求項８０又は８１に記載の汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  83. 前記荷電していないアミノ酸が、アラニン又はグリシンである、請求項８２に記載の汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  84. 前記ＰＴＭが、リン酸化である、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  85. 前記ＰＴＭが、グリコシル化である、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  86. 前記グリコシル化が、シアリル化である、請求項８５に記載の汎ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  87. 目的のペプチド又はタンパク質上のＰＴＭを特異的に認識する既存の抗体からもたらされる複数の抗体を含む非ＰＴＭ結合抗体ライブラリーであって、前記複数の抗体が、ＰＴＭ結合ポケット及び前記ＰＴＭ部位に隣接するコンテキスト配列を結合する１個又は複数の無作為化された領域を含み、前記ＰＴＭ結合ポケットが、前記ＰＴＭと相互作用することが決定されている１個又は複数の部位において前記ＰＴＭを寄せ付けないアミノ酸を含む、非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  88. 前記ＰＴＭが、負に荷電している、請求項８７に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  89. 前記ＰＴＭが、リン酸化である、請求項８８に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  90. 前記ＰＴＭが、グリコシル化である、請求項８８に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  91. 前記グリコシル化が、シアリル化である、請求項９０に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  92. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、負に荷電したアミノ酸である、請求項８７〜９１のいずれか一項に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  93. 前記負に荷電したアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項９２に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  94. 前記ＰＴＭが、正に荷電している、請求項８７に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  95. 前記ＰＴＭが、レチニリデンシッフ塩基形成又はアルギニル化である、請求項９４に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  96. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、正に荷電したアミノ酸である、請求項９４又は９５に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  97. 前記正に荷電したアミノ酸が、リジン、アルギニン、又はヒスチジンである、請求項９６に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  98. 前記ＰＴＭが、疎水性である、請求項８７に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  99. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、親水性である、請求項９８に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  100. 前記親水性アミノ酸が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、又はスレオニンである、請求項９９に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  101. 前記ＰＴＭが、親水性である、請求項８７に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  102. 前記ＰＴＭを寄せ付けない前記アミノ酸が、疎水性である、請求項１０１に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  103. 前記疎水性アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである、請求項１０２に記載の非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  104. 前記ＰＴＭが、リン酸化であり、前記既存の抗体が、リン酸化Ｓｅｒ（ｐＳｅｒ）及び／又はリン酸化Ｔｙｒ（ｐＴｙｒ）に結合する、請求項８０〜１０３のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  105. 前記ＰＴＭ結合ポケットが、ＣＤＲ Ｈ２領域及び／又はＣＤＲ Ｌ２領域を含む、請求項８０〜１０４のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  106. 前記１個又は複数の無作為化された領域が、前記ＰＴＭ部位の上流又は下流の３〜１５個の残基を含むコンテキスト配列に結合する、請求項８０〜１０５のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  107. 前記１個又は複数の無作為化された領域が、無作為ＣＤＲ Ｈ３、又はＬ３を含む、請求項８０〜１０６のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  108. 前記ＰＴＭ結合ポケットが、ＣＤＲ Ｈ２領域を含み、前記１個又は複数の無作為化された領域が、無作為ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ３、及び／又はＣＤＲ Ｌ２を含む、請求項８０〜１０７のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  109. 前記１個又は複数の無作為化された領域が、部位特異的変異誘発により生成されている、請求項８０〜１０８のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  110. 前記１個又は複数の無作為化された領域が、エラープローンＲＣＡにより生成されている、請求項８０〜１０８のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  111. 前記１個又は複数の無作為化された領域が、アラニン及び／又はヒスチジンスキャニングにより、生成されている、請求項８０〜１０８のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  112. 前記ライブラリーが、ファージディスプレイライブラリー、細菌ディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、及びｍＲＮＡディスプレイライブラリーからなる群から選択される、請求項８０〜１１１のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  113. 前記ライブラリーが、抗体フラグメントから選択される複数の抗体を含む、請求項８０〜１１２のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  114. 前記ライブラリーが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はＩｇＧから選択される複数の抗体を含む、請求項８０〜１１３のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  115. 前記ライブラリーが、ｓｃＦｖライブラリーである、請求項１１４に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  116. 前記ｓｃＦｖライブラリーが、Ｍ１３ ｓｃＦｖライブラリーである、請求項１１５に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  117. 前記ライブラリーが、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２より大きな多様性を有する、請求項８０〜１１６のいずれか一項に記載の汎ＰＴＭ結合又は非ＰＴＭ結合抗体ライブラリー。
  118. 目的のペプチドへの抗体を産生する方法であって、
    負に荷電したアミノ酸を含むように修飾された目的の修飾されたペプチドを用意する工程、
    前記修飾されたペプチドを、前記負に荷電したアミノ酸へとバイアスをかけた抗体ライブラリーに対してスクリーニングする工程、
    目的の前記修飾されたペプチドに結合する１個又は複数の抗体を単離する工程；及び
    前記１個又は複数の抗体の前記修飾を含まない前記目的のペプチドへの結合を決定し、これにより、前記目的のペプチドに結合する抗体を同定する工程
    を含む方法。
  119. 目的のペプチドへの抗体を産生する方法であって、
    負に荷電したアミノ酸を含むように修飾された目的の修飾されたペプチドを用意する工程、
    前記修飾されたペプチドを前記負に荷電したアミノ酸へとバイアスをかけた抗体ライブラリーに対してスクリーニングする工程、
    目的の前記修飾されたペプチドに結合する１個又は複数の抗体を単離する工程；
    親和性成熟により、前記１個又は複数の抗体のクローン型のライブラリーを生成する工程；
    前記修飾を含まない前記目的のペプチドに対して前記クローン型の前記ライブラリーをスクリーニングし、これにより、前記目的のペプチドに結合する抗体を同定する工程
    を含む方法。
  120. 前記負に荷電したアミノ酸が、リン酸化アミノ酸である、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
  121. 前記リン酸化アミノ酸が、ホスホセリン（ＳＥＰ）又はホスホチロシンである、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記リン酸化アミノ酸が、ホスホセリン（ＳＥＰ）である、請求項１２０又は１２１に記載の方法。
  123. 前記リン酸化アミノ酸が、ホスホチロシンである、請求項１２０又は１２１に記載の方法。
  124. 前記負に荷電したアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
  125. 前記負に荷電したアミノ酸が、前記目的のペプチド内の天然に存在するアミノ酸を置換する、請求項１１８〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記抗体ライブラリーが、ホスホバイアス抗体ライブラリーである、請求項１１８〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記ホスホバイアス抗体ライブラリーが、ファージディスプレイライブラリー、細菌ディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、又はｍＲＮＡディスプレイライブラリーから選択される、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記抗体ライブラリーが、ファージディスプレイライブラリーである、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記抗体ライブラリーが、抗体フラグメントから選択される複数の抗体を含む、請求項１１８〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記抗体ライブラリーが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はＩｇＧから選択される複数の抗体を含む、請求項１１８〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記抗体ライブラリーが、ｓｃＦｖライブラリーである、請求項１１８〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記ｓｃＦｖライブラリーが、Ｍ１３ ｓｃＦｖライブラリーである、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記抗体ライブラリーが、約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、若しくは１０１２又は１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、若しくは１０１より大きな多様性を有する、請求項１１８〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記抗体ライブラリーが、約１０１３、１０１２、１０１１、若しくは１０１０又は１０１３、１０１２、１０１１、若しくは１０１０未満の多様性を有する、請求項１１８〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記目的のペプチドに結合する前記抗体の親和性成熟をさらに含む、請求項１１８〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記親和性成熟が、指向進化により行われる、請求項１１９〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記親和性成熟が、前記修飾されたペプチドに結合する前記１個又は複数の抗体のＣＤＲ−Ｈ２及び／又はＣＤＲ−Ｌ２領域の外側の配列を無作為化する工程を含む、請求項１１９〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 前記親和性成熟が、エラープローンＰＣＲ変異誘発を含む、請求項１１９〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記スクリーニング工程のそれぞれが、ホールセル、細胞フラグメント、又は単離されたタンパク質で行われる、請求項１１８〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 前記スクリーニング工程のそれぞれが、ホールセルパニングを含む、請求項１１８〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記ホールセルパニングが、エマルジョンベースである、請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記エマルジョンベースのスクリーニングが、遅延エマルジョン感染性（ＤＥＩ）である、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記目的のペプチドが、目的のタンパク質のエピトープに基づく、請求項１１８〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記エピトープが、前記目的のタンパク質の外部ドメインである、請求項１４３に記載の方法。
  145. 前記エピトープが、直線性エピトープである、請求項１４３又は１４４に記載の方法。
  146. 前記エピトープが、立体構造又は不連続エピトープである、請求項１４３又は１４４に記載の方法。
  147. 前記目的のペプチドが、約５〜３０個のアミノ酸を含み、請求項１１８〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
  148. 前記目的のペプチドが、約１０〜２０個のアミノ酸を含む、請求項１１８〜１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記目的のペプチドが、前記目的のタンパク質の外部ドメインにおける３個毎、４個毎、５個毎、６個毎、７個毎、８個毎、９個毎、又は１０個毎のアミノ酸の周囲の配列を含む、請求項１１８〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記目的のペプチドが、前記目的のタンパク質の外部ドメインにおける５個毎のアミノ酸の周囲の配列を含む、請求項１１８〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
  151. 前記目的のペプチドが、グリコシル化部位を含まない、請求項１１８〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. 前記目的のタンパク質が、細胞表面受容体である、請求項１４３〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記細胞受容体が、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、酵素結合受容体、又はリガンド開口型イオンチャンネル受容体である、請求項１５２に記載の方法。
  154. 前記細胞受容体が、レプチン受容体、グルカゴン受容体、インスリン受容体、ＣＸＣＲ４、ＮＴＳＲ１、ＮＴＳＲ２又は受容体チロシンキナーゼである、請求項１５２に記載の方法。
  155. 前記抗体が前記目的のタンパク質に結合するかを試験する工程をさらに含む、請求項１４３〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
  156. 前記抗体が前記目的のタンパク質の機能を阻害するかを試験する工程をさらに含む、請求項１４３〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記目的のタンパク質の前記機能が、競合的阻害により前記抗体よって阻害される、請求項１５６に記載の方法。
  158. 前記目的のタンパク質の前記機能が、非競合的阻害により前記抗体によって阻害される、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記非競合的阻害が、アロステリック阻害である、請求項１５８に記載の方法。
  160. 前記目的のタンパク質の機能が前記抗体により増大されるかを試験する工程をさらに含む、請求項１４３〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
  161. 目的のタンパク質を阻害する抗体を産生する方法であって、
    目的のタンパク質由来の配列に基づきペプチドを合成する工程であって、前記配列が、負に荷電したアミノ酸を含むように修飾される、工程
    請求項１〜１６０のいずれか一項に記載の方法に従い、前記ペプチドに結合する抗体を同定する工程；及び
    前記抗体が、前記目的のタンパク質の機能を阻害するかを試験する工程
    を含む方法。
  162. 前記抗体が、前記目的のタンパク質を立体的に阻害するかを決定する工程をさらに含む、請求項１６１に記載の方法。
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