DE19503146A1 - Antigene und Antikörper zum Nachweis von Kollagen I - Google Patents
Antigene und Antikörper zum Nachweis von Kollagen IInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Antigene zur Herstellung von Antikörpern gegen N-Termni von
Kollagen Iα2-Ketten, ein Verfahren zur Herstellung von solchen Antigenen, Antikörper gegen
N-Termini von Kollagen Iα2-Ketten, welche durch Immunisierung mit einem erfindungs
gemäßen Antigen erhältlich sind, sowie die Verwendung solcher Antikörper zum Nachweis
von Kollagen.
Kollagen stellt ein wichtiges Strukturprotein im Bindegewebe von Haut, Knorpel und Knochen
dar. Bekannt sind 11 Typen, die jeweils aus drei Ketten bestehen. Jeder Typ setzt sich aus 3
verschiedenen Ketten zusammen, die als α1, α2 und α3 bezeichnet werden (E. Miller et al. in
Methods in Enzymology 144, Structural and Contractile Proteins, ed. L. Cunningham,
Academic Press Inc. 1987, p. 3-41). Eine charakteristische Eigenschaft des reifen Kollagens
bestimmter Gewebe, wie insbesondere Knochen oder Knorpel, ist die Quervernetzung von
nebeneinander liegenden Fasern durch Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin
(D. Fujimoto et al., J. Biochem 83 (1978), 863-867; D. Eyre et al., Ann. Rev. Biochem 53
(1984), 717-748 und D. Eyre, Methods in Enzymology 144 (1987), 115-139). Diese Quer
vernetzungen können als biochemischer Marker für den spezifischen Nachweis von Kollagen
genutzt werden (Z. Gunja-Smith et al., Biochem. J. 197 (1981), 759-762). Beim Abbau von
extrazellulärem Kollagen gelangen Hydroxylysylpyridinolin- oder Lysylpyridinolinderivate,
welche Peptidseitenketten enthalten oder freie Pyridinolin-Derivate mit Lysyl- oder Hydroxy
lysylresten, wie in der WO 91/10141 beschrieben, in Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin.
Der Nachweis dieser Verbindungen in Körperflüssigkeiten ergibt daher Hinweise auf den Ab
bau von extrazellulärem Kollagen, wie er z. B. bei der Osteoporose sowie infolge von Tumoren
des Knochengewebes auftritt. Zum Nachweis von solchen Hydroxylysyl- oder Lysylpyridino
linen mit Peptidseitenketten wurden in der WO 89/12824 monoklonale Antikörper beschrieben,
welche durch Immunisierung mit entsprechenden quervernetzten Kollagenfragmenten erhalten
wurden, die aus dem Urin isoliert werden können. Auch bei den in WO 91/08478 und
WO 92/21698 beschriebenen Verfahren erfolgt der Nachweis von Kollagen über einen Anti
körper gegen natürliche, d. h. in vivo erzeugte quervernetzte Abbauprodukte von Kollagen.
Ein Nachteil dieser aus natürlichen Quellen isolierten Peptide ist, daß keine sichere Quelle für
eine reproduzierbare Herstellung der Antigene oder Bindepartner im Test vorhanden ist. Ein
weiterer Nachteil der aus natürlichen Quellen isolierten Peptide ist die Gefahr einer Konta
mination mit infektiösem Material.
Definierte Antigene können z. B. durch chemische Synthese eines Peptids erhalten werden,
welches einem Epitop des Antigens entspricht. Werden hierfür kleine Peptide mit einem
Molekulargewicht von etwa 700-1500 D verwendet, so ist die Bindung an ein Trägermolekül
erforderlich, um ein Antigen mit immunogener Wirkung zu erhalten. Durch die Bindung an das
Trägermolekül darf dabei die Struktur des Epitops nicht verändert werden. Die Kupplung an
das Trägermolekül erfolgt daher bislang bevorzugt an den Enden der Peptidkette in aus
reichendem Abstand von dem vermuteten Epitopbereich (Laboratory Technics in Biochemistry
and Molecular Biology, Synthetic Polypeptides as Antigens, Editors R.H. Burdon und P.H.
van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford 1988, Seiten 95-100).
Ein Problem bei der chemischen Synthese eines definierten Antigens, das einem natürlichen
Abbauprodukt von quervernetztem Kollagen entspricht, stellt die aus der Quervernetzung
resultierende Hydroxylysyl- oder Lysylpyridinolin-Struktur dar, deren chemische Synthese
aufwendig ist.
Bisher wurde immer davon ausgegangen, daß es zum Nachweis von Kollagen oder Kollagen
abbauprodukten in einer Probe notwendig sei, die Quervernetzungsstrukturen an sich oder so
genannte quervernetzte Peptide, die durch die Quervernetzung der Hydroxylysyl- oder Lysyl
reste zustandekommen, nachzuweisen, da diese Hydroxylysyl- oder Lysylpyridinolinstruktur
charakteristisch für Kollagen ist. Beispiele für solche Nachweismethoden sind in der
WO 89/12824, WO 91/08478, WO 89/04491 und der WO 91/10141 beschrieben.
In DE 42 25 038 wurde erstmals gezeigt, daß zum Nachweis von Kollagen oder Kollagen
fragmenten auch lineare, nicht quervernetzte Peptidsequenzen und Antikörper eingesetzt
werden können. Als Immunogene wurden kurze Peptide, die einer linearen Teilsequenz von
Kollagen entsprechen, benutzt, die mindestens einen Lysinrest enthalten, das im natürlichen
Kollagenmolekül als Hydroxylysin vorliegt. Über die ε-Aminogruppe dieses Lysinrestes ist das
Peptid an ein Trägerprotein gebunden.
In der WO 94/03813 wurden ebenfalls synthetische lineare Peptide, die einer Sequenz des
nichthelikalen C- oder N-terminalen Bereichs von Kollagen entsprechen, als Antigene zur Her
stellung von Antikörpern gegen Kollagen oder Kollagenfragmente beschrieben. Als synthetische
lineare Peptide sind alle zusammenhängenden Aminosäuresequenzen des nichthelikalen C- oder
N-terminalen Bereichs von Kollagen geeignet. Diese Bereiche sind aus Chuetal., Nature 310,
337-340 (1984), Click et al., Biochemistry 9, 4699-4706 (1970), Morgan et al., J. Biol. Chem.
245, 5042-5048 (1970) und Bernard et al., Biochemistry 22, 5213-5223 (1983) bekannt.
Speziell wurden Peptide aus dem C-terminalen Bereich der α1-Kette von Kollagen offenbart.
Die mit diesen Immunogenen erhältlichen Antikörper können in Immunoassays zum Nachweis
von Kollagenabbauprodukten in Körperflüssigkeiten verwendet werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, diese Art der Immunoassays weiter zu ver
bessern und die hierzu notwendigen Einsatzstoffe wie Antikörper und Antigene weiter zu
optimieren. Die Antikörper müssen sich dadurch auszeichnen, daß sie die in Körperflüssig
keiten vorkommenden Kollagenabbauprodukte d. h. Kollagenfragmente spezifisch erkennen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Antikörper gegen Kollagenabbau
produkte aus Kollagen I in Körperflüssigkeiten, der spezifisch die Aminosäuresequenz Val-
Gly-Leu-Gly innerhalb Kollagen I oder von Fragmenten daraus erkennt. Diese Aminosäure
sequenz entspricht den Aminosäureresten 7 bis 10 des N-terminalen Endes der Kollagen Typ I
α2-Kette. Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß ein Immunoassay zum Nachweis
von Kollagenabbauprodukten bei Verwendung dieser Antikörper erstens die Kollagenabbau
produkte in den Körperflüssigkeiten sehr spezifisch und sensitiv nachweisen kann und daß ein
solcher Immunoassay eine sehr gute Korrelation zu einem Immunoassay aufweist, der Anti
körper gegen quervernetzte Kollagenabbauprodukte verwendet (WO 89/04491).
Die erfindungsgemäßen Antikörper erkennen die Aminosäuresequenzen Val-Gly-Leu-Gly
spezifisch. Hierunter ist zu verstehen, daß diese Aminosäuresequenz innerhalb der in den
Körperflüssigkeiten vorkommenden Kollagenabbauprodukten erkannt wird. Die dieser
Sequenz benachbarten Aminosäuren können von den Antikörpern miterkannt werden. Dies ist
jedoch keine Bedingung für die erfindungsgemäßen Antikörper, da bei einigen Kollagen
fragmenten diese Aminosäuren auch fehlen können. Entscheidend ist, daß die Antikörper das
durch die Sequenz Val-Gly-Leu-Gly charakterisierte Epitop innerhalb eines Kollagenbruch
stücks erkennen. Das insgesamt vom Antikörper gebundene Epitop kann um einige Amino
säuren länger sein, beispielsweise um 1-4 Aminosäuren. Besonders bevorzugte Antikörper er
kennen die Aminosäuresequenz 6-13 des N-terminalen Endes der Kollagen Typ I α2-Kette.
Die Antikörper können durch allgemein übliche Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise
können zur Immunisierung aus Körperflüssigkeiten aufgereinigte Kollagenbruchstücke, die die
N-terminalen Typ I α2-Kette beinhalten, wobei die Sequenz Val-Gly-Leu-Gly enthalten sein
muß, verwendet werden. Diese Kollagenbruchstücke können ebenfalls durch enzymatische
oder chemische Spaltung von Kollagen Typ I hergestellt werden. Die Antikörper, die gegen
diese mehr oder weniger stark definierten Peptide gebildet werden, müssen nach der Immuni
sierung durch ein geeignetes Screeningverfahren, ausgesucht oder aufgereinigt werden. Hierbei
wird die Reaktion der Antikörper gegen kurze Peptide, die die Sequenz Val-Gly-Leu-Gly be
inhalten, ausgetestet und genutzt.
Wesentlich einfacher und daher besonders bevorzugt ist die Herstellung der Antikörper durch
Immunisierung der Tiere mit einem synthetischen Peptid oder Peptid-Derivat, das eine Amino
säuresequenz entsprechend SEQ ID NO 1 oder einen Teilsequenz daraus, die mindestens die
Aminosäuresequenz Val-Gly-Leu-Gly umfaßt, beinhaltet. Bevorzugt enthält das synthetische
Peptid mindestens 6 Aminosäuren. Bei den neben den Aminosäuren der Sequenz Val-Gly-Leu-Gly
zusätzlich enthaltenen Aminosäuren werden bevorzugt die Aminosäuren N- oder/und C-terminal
dieser Sequenz angefügt, die auch in der Kollagen Typ I α2-Kette dieser Sequenz be
nachbart sind. Es können aber auch andere Aminosäuren angefügt werden. Wie allgemein
üblich werden die Peptide an einen immunogenen Träger beispielsweise Keyhole Limpet
Hemocyanine (KLH), Rinderserumalbumin oder Edestin zur Erhöhung der Immunantwort ge
koppelt. Bei den erfindungsgemäßen Antikörpern kann es sich um polyklonale sowie um
monoklonale Antikörper handeln, wobei monoklonale Antikörper bevorzugt sind.
Je nach ihrer Verwendung in verschiedenen Immunoassays zum Nachweis der Kollagenabbau
produkte können die Antikörper mit einer signalerzeugenden Substanz beziehungsweise
Markierungsgruppe, zum Beispiel Fluoreszenzmarkierungsgruppen,
(Elektro)chemilurnineszenzmarkierungsgruppen, Digoxin, Biotin oder radioaktive Gruppen,
gekoppelt sein. Im Falle von Immunoassays, bei denen eine feste Phase erforderlich ist, können
die Antikörper an diese direkt oder indirekt gekoppelt sein. Die Kopplung dieser Gruppen
beziehungsweise der festen Phase erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Verfahren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Peptide oder Peptid-Derivate, die die
Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz daraus, die mindestens
die Aminosäuresequenz Val-Gly-Leu-Gly aufweist, beinhalten. Die Aminosäuresequenzen sind
Teilbereiche aus den N-terminalen nicht-helikalen Ende der Kollagen Typ I α2-Kette. Die
Peptide oder Peptid-Derivate können als Immunogene zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Antikörper, als spezifische Bindepartner und als Standardmaterial in Immunoassays Ver
wendung finden. Die erfindungsgemäßen Peptide können durch bekannte Syntheseverfahren
mittels chemischer Methoden erzeugt werden, oder durch Klonierung und Expression einer für
diese Peptide kodierenden DNA-Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle auf gentechnische
Weise hergestellt werden.
Neben Peptiden betrifft die Erfindung ebenfalls Peptid-Derivate. Dieser Begriff umfaßt
Peptide, in denen eine oder mehrere Aminosäuren durch eine chemische Reaktion derivatisiert
worden sind. Beispiele sind insbesondere solche Moleküle, in denen das Backbone und/oder
freie Aminosäuregruppen derivatisiert worden sind. Die erfindungsgemäßen Peptid-Derivate
besitzen eine im wesentlichen äquivalente Spezifität und/oder Affinität der Bindung an die
erfindungsgemäßen Antikörper.
Unter Peptid-Derivate werden auch peptidmimetische Substanzen verstanden, die eine im
wesentlichen äquivalente Spezifität und/oder Affinität der Bindung an die erfindungsgemäßen
Antikörper wie die zuvor genannten Peptide aufweisen. Peptidmimetische Substanzen sind
Verbindungen, die Peptide in ihrer Wechselwirkung mit den Antikörpern ersetzen können und
gegenüber den nativen Peptiden eine erhöhte Stabilität aufweisen können. Methoden zur Her
stellung sind beschrieben bei Giannis und Kolter, Angew. Chem. 105 (1993), 1303-1326, Lee
et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993), 2006-2010 und Dorsch et al., Kontakte (Darmstadt)
(1993) (2), 48-56.
Je nach ihrer Verwendung als Immunogen zur Herstellung der Antikörper oder als Einsatzstoff
in Immunoassays, können die erfindungsgemaßen Peptide oder Peptid-Derivate an immuno
gene Träger, wie bereits oben beschrieben, signalerzeugende Substanzen beziehungsweise
Markierungsgruppen z. B. Fluoreszenzmarkierungsgruppen, Digoxin, Biotin oder radioaktive
Gruppen gekoppelt sein. Im Fall von Immunoassays, bei denen eine feste Phase erforderlich ist,
können die Peptide oder Peptid-Derivate direkt oder indirekt beispielsweise über eine Strept
avidin/Biotin Wechselwirkung an diese Festphase, beispielsweise Tubes, Kugeln, Latexpartikel
usw., gebunden sein. Die Kopplung erfolgt nach gängigen Verfahren.
Wie bereits angesprochen, können diese erfindungsgemäßen Peptide oder Peptid-Derivate zur
Herstellung von Antikörper verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern
gegen Kollagenabbauprodukte von Kollagen durch Immunisierung mit einem erfindungs
gemäßen Peptid oder Peptidderivat, das die Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO 1
oder eine Teilsequenz daraus, die mindestens die Aminosäuresequenz Val-Gly-Leu-Gly auf
weist, beinhaltet. Bevorzugt besitzt das Peptid oder Peptid-Derivat eine Länge von mindestens
6 Aminosäuren und ist an einen immunogenen Träger gekoppelt. Nach erfolgter Immuni
sierung werden die gewünschten Antikörper aus dem Serum der immunisierten Tiere nach be
kannten Verfahren isoliert. Vorzugsweise erfolgt die Isolierung des gewünschten Antikörpers
über Immunadsorption an einem an einen Träger, vorzugsweise Sepharose, gekoppeltes
Peptid, das die Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz daraus,
die mindestens die Aminosäuresequenz Val-Gly-Leu-Gly aufweist, beinhaltet.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler
Antikörper gegen quervernetztes Kollagen durch Immunisierung mit einem erfindungsgemäßen
Peptid oder Peptid-Derivat, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere,
Klonierung derjenigen immortalisierten Milzzellen, welche den gewünschten Antikörper
produzieren und Isolierung des Antikörpers aus den klonierten Zellen oder dem Kultur
überstand dieser Zellen.
Die Immunisierung erfolgt in den hierfür üblicherweise verwendeten Tieren, vorzugsweise
werden Mäuse oder Kaninchen verwendet.
Die Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere erfolgt nach dem Fachmann ge
läufigen Verfahren, wie z. B. der Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, Nature 256 (1975),
495-497) oder durch Transformation mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV-Transformation).
Zum Nachweis derjenigen immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper produ
zieren, wird eine Probe des Kulturüberstands in einem üblichen Immunoassay mit dem zur
Immunisierung verwendeten erfindungsgemäßen Peptid oder Peptid-Derivat inkubiert und
untersucht, ob ein Antikörper an dieses Peptid oder Peptid-Derivat bindet.
Die Konzentration von Abbauprodukten von Kollagen ist ein wichtiger diagnostischer Marker
für das Ausmaß einer Osteolyse. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen polyklonalen und mono
klonalen Antikörper ist es daher möglich, über die Bestimmung der Konzentration der Abbau
produkte von natürlichem Kollagen in Körperflüssigkeiten das Ausmaß einer Osteolyse zu
bestimmen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung eines erfindungsgemäßen
polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers zur Bestimmung der Osteolyse durch Inkubation
des Antikörpers mit einer Probe und Bestimmung der an den Antikörper bindenden Kollagen
abbauprodukte beziehungsweise ein Immunoassay zum Nachweis von Kollagen I oder
Kollagenfragmenten in einer Probe, wobei ein erfindungsgemäßer Antikörper verwendet wird.
Als Probe wird eine Körperflüssigkeit, in der sich Kollagenabbauprodukte befinden können,
vorzugsweise Serum, Plasma oder Urin eingesetzt.
Prinzipiell sind zum Nachweis alle gängigen immunologischen Verfahren geeignet. Vorzugs
weise erfolgt die Bestimmung der Bindung des Antikörpers an Kollagen I oder Kollagen
fragmente über einen kompetitiven Test. Beim kompetitiven Test kann die Inkubation der
Antikörper mit der Probe und mit dem zusätzlich enthaltenen erfindungsgemäßen Peptid oder
Peptid-Derivat sowohl gleichzeitig als auch sequentiell erfolgen. Dabei kompetieren die in der
Probe enthaltenen Kollagenfragmente bevorzugt mit dem erfindungsgemäßen Peptid oder
Peptid-Derivat um die Bindung an den Antikörper, so daß die Bindung des Antikörpers an das
erfindungsgemäße Hapten ein Maß für die Menge an Antigen in der Probe darstellt. Bei einem
heterogenen kompetitiven Immunoassay, bei dem eine Trennung der flüssigen von der festen
Phase erfolgt, kann sowohl der Antikörper oder das Peptid markiert beziehungsweise an die
feste Phase gebunden sein. Die genaue Menge an Antigen in der Probe kann dann in üblicher
Weise durch Vergleich mit einem in gleicher Weise behandelten Standard ermittelt werden.
Es können alle dem Fachmann bekannten kompetitiven Testformate zum Nachweis verwendet
werden. Beispielsweise kann der Nachweis über einen turbidimetischen Inhibitions Immuno
assay (TINIA) oder einen Latexpartikel Immunoassay (LPIA) erfolgen. Beim TINIA wird das
erfindungsgemäße Peptid oder Peptid-Derivat an einen Träger wie beispielsweise Dextran ge
bunden (EP-A 0 545 350). Dieses Polyhapten konkurriert mit dem in der Probe enthaltenen
Analyten um die Bindung an den Antikörper. Der gebildete Komplex kann turbidimetrisch oder
nephelometrisch bestimmt werden.
Beim LPIA werden Teilchen vorzugsweise Latexpartikel mit den erfindungsgemäßen Peptiden
beschichtet und mit dem erfindungsgemäßen Antikörper und der Probe vermischt. Die
Agglutination wird bei Vorliegen des Analyten in der Probe erniedrigt.
Ebenso geeignet zum Nachweis sind Enzym-Immunoassays (Wisdom, G. B., Clin. Chem. 22/8
(1976), 1243-1255 und M. Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Vol 18 (1980),
197-208), Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays (FPIA) (W. Dandliker et al., J. Exp.
Med. 122 (1965), 1029), die Enzyme Multiplied Immunoassay Technik (EMIT) (Gunzer et al.,
Kontakte in, 1980, 3-11 und K. Rubenstein, Biochemical and Biophysical Research
Communications 47 (1972), 846-851) oder die CEDIA-Technologie (Henderson et al., Clinical
Chemistry 32 (1986), 1637-41).
Es hat sich teilweise als vorteilhaft erwiesen, die Probe beziehungsweise das in dieser Probe
enthaltene Kollagen oder die Kollagenfragmente zu denaturieren und die Epitope so der
Bindung des Antikörpers besser zugänglich zu machen. Am geeignetsten wird die Probe vor
der Inkubation mit dem Antikörper mit dem Denaturierungsmittel für Proteine, die dem Fach
mann bekannt sind, vorbehandelt. Um die Beeinträchtigung der immunologischen Reaktion
zwischen der Probe und den spezifischen Antikörpern möglichst gering zu halten oder gänzlich
zu vermeiden, wird die denaturierte Probe vor der Inkubation mit dem Antikörper bevorzugt
noch verdünnt. Als Denaturierungsmittel sind alle dem Fachmann bekannten Mittel hierfür ge
eignet. Kaliumrhodanid (KSCN) in einer Konzentration von 2-6 M und Tetradecyltriäthyl
ammoniumbromid (TTAB) in einer Konzentration von 0,5-2 M haben sich als besonders
geeignet zur Denaturierung erwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Standardmaterial zur Erstellung einer Standard- oder
Eichkurve in einem Immunoassay zum Nachweis von Kollagen I oder Kollagen
fragmenten, dadurch gekennzeichnet, daß ein Peptid oder Peptid-Derivat enthalten ist, das die
Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz daraus, die mindestens
die Aminosäursequenz Val-Gly-Leu-Gly aufweist, beinhaltet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit dem Sequenzprotokoll
näher erläutert.
SEQ ID NO. 1 zeigt die Sequenz eines erfindungsgemäßen Peptids, das den Aminosäuren 1-13
des N-terminalen Endes der Kollagen Typ I α2-Kette entspricht. Xaa bedeutet Gln oder Pyr
(Pyroglutamin).
Die eine Teilsequenz der Aminosäuresequenz von Kollagen entsprechend SEQ ID NO 1
aufweisenden Peptide 1 (1 Gln-Tyr-Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly-Leu-Gly-Pro-Gly-13Pro)-Cys
(= CollIα2(1-13, 1 Gln)-Cys) und 2 (1 Pyr-Tyr-Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly-Leu-Gly-
Pro-Gly-13Pro)-Cys (= CollIα2(1-13,1 Pyr)-Cys) werden mittels Fluorenylmethyloxy
carbonyl-(Fmoc)-Festphasenpeptidsynthese an einem Labortec SP 640 Peptide Synthesizer
hergestellt. Dazu werden jeweils 4,0 Äquivalente von folgenden Fmoc-Aminosäure
derivaten verwendet:
Tyr mit tert.-Butyl-Schutzgruppe
Lys mit tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe
Cys mit S-tert.-Butyl-Schutzgruppe
Lys mit tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe
Cys mit S-tert.-Butyl-Schutzgruppe
Alle restlichen Aminosäurederivate (Gln, Pyr, Asp, Gly, Val, Leu, Pro) wurden ohne
Seitenketten-Schutzgruppe eingesetzt.
Die Aminosäuren oder Aminosäurenderivate werden in N-Methylpyrolidon gelöst.
Das Peptid wird an 3 g 4-(2,4′-Dimethoxyphenyl-Fmoc-Aminomethyl)-Phenoxy-Harz
(Tetrahedron Letters 28 (1987), 2107) mit einer Beladung von 0,87 mmol/g synthetisiert
(JACS 95 (1973), 1328). Die Kupplungsreaktionen werden bezüglich Fmoc-Aminosäure
derivat mit 4,4 Äquivalenten Dicylcohexylcarbodiimid und 4,8 Äquivalenten N-Hydroxy
benzotriazol in Dimethylformamid als Reaktionsmedium während 60 Minuten durchge
führt. Der Kupplungserfolg wird mittels Kaiser-Test (Anal. Biochem. 34 (1970), 595) an
dem mit Isopropanol gewaschenen Syntheseharz kontrolliert. Sofern sich hierbei ein noch
nicht vollständiger Umsatz ergibt, wird durch Nachkuppeln gemäß den oben angegebenen
Bedingungen, der Umsatz vervollständigt. Nach jedem Syntheseschritt wird die Fmoc-Gruppe
mittels 20%igem Piperidin in Dimethylformamid in 20 Minuten abgespalten. Die
Harzbeladung wird mittels UV-Absorption der freigesetzten Fulven-Gruppe nach jeder
Piperidinbehandlung ermittelt. Nach der Synthese beträgt die Beladung noch 0,68 mmol/g.
Die Freisetzung des Peptids vom Syntheseharz und die Abspaltung der säurelabilen
Schutzgruppen erfolgt mit 80 ml Trifluoressigsäure, 5 ml Ethandithiol, 2,5 g Phenol,
2,5 ml m-Kresol und 5 ml Wasser in 60 Minuten bei Raumtemperatur. Die Reaktions
lösung wird anschließend im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Diisopropylether auf
genommen, 1/2-2 Stunden kräftig gerührt und dann abfiltriert. Das Material wird dann
mittels einer Gelpermeationsschromatographie an Sephadex G15 vorgereinigt, wobei als
Elutionsmittel 0,5%ige Essigsäure verwendet wird. Das erhaltene Rohmaterial wird an
schließend abfiltriert und mittels einer präparativen HPLC an Nucleosil RP18 (Säule
40 mm × 250 mm 300 Å, 5 µm) über einen Gradienten von 100% Puffer A (Wasser,
01, %, Trifluoressigsäure) zu 100% Puffer B (60% Acetonitril, 40% Wasser, 0,1%
Trifluoressigsäure) in 120 Minuten isoliert. Die Identität des eluierten Materials wird
mittels Ionenspray Massenspektrometrie geprüft.
280 mg KLH-Lyophilisat werden in 15 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 gelöst,
eine Lösung von 7,35 mg MPS in 1 ml DMSO zugeben und 16 h bei Raumtemperatur ge
rührt. Anschließend wird zentrifugiert und der Überstand über eine AcA 202-Säule
(d = 5 cm; 1 = 25 cm; equilibriert mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) gereinigt.
Ausbeute: 129 mg KLH-MP (4,3 × 10-5 mmol); η = 3,59 mg/ml (bestimmt mit BCA-Test; BCA-Protein Assay Reagent, Pierce)
Ausbeute: 129 mg KLH-MP (4,3 × 10-5 mmol); η = 3,59 mg/ml (bestimmt mit BCA-Test; BCA-Protein Assay Reagent, Pierce)
Eine Mischung von 20,33 mg CollIα2(1-13, 1 Gln)-Cys und 20,08 mg CollIα2(1-13,
1 Pyr)-Cys werden in 1 ml H₂O gelöst und zur Lösung mit der MP-aktivierten KLH
gegeben. 16 h wird bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird zentrifugiert und der
Überstand über eine AcA 202-Säule (d = 5 cm; 1 = 25 cm, equilibriert mit 0,1 M Kalium
phosphatpuffer pH 7,0) gereinigt.
150 mg RSA werden in 10 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 gelöst, eine Lösung
von 11,6 mg MPS in 1 ml DMSO zugegeben und 16 h bei Raumtemperatur gerührt.
Anschließend wird die Lösung über eine AcA 202-Säule (d = 5 cm; 1 = 25 cm; equilibriert
mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) gereinigt.
Ausbeute: 121 mg RSA-MP (1,75 × 10-3 mmol); η = 3,78 mg/ml (bestimmt mit BCA-Test)
Ausbeute: 121 mg RSA-MP (1,75 × 10-3 mmol); η = 3,78 mg/ml (bestimmt mit BCA-Test)
Eine Mischung von 47,13 mg CollIα2(1-13, 1 Gln)-Cys und 46,53 mg CollIα2(1-13,
1 Pyr)-Cys wird in 3 ml H₂O gelöst und zur Lösung mit MP-aktiviertem RSA gegeben.
16 h wird bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Lösung über eine AcA 202-Säule
(d = 5 cm; 1 = 25 cm; equilibriert mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) ge
reinigt.
Ausbeute: 124 mg Immunogen; η = 2,59 mg/ml (bestimmt mit BCA-Test)
Ausbeute: 124 mg Immunogen; η = 2,59 mg/ml (bestimmt mit BCA-Test)
Die Peptide wurden mittels Fmoc (Fluorenyloxycarbonyl)-Festphasensynthese hergestellt.
Die Reaktionen wurden an einem multiplen Synthesizer der Firma Zinsser (SMP 360)
Peptidsynthesizer durchgeführt. Die Kupplungsreaktionen wurden bezüglich Fmoc-Aminosäure-Derivat
mit 2,4 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und 2,2 Äquivalenten
N-Hydroxybenzotriazol während 90 Minuten durchgeführt. Als Reaktionsmedium kam
Dimethylformamid zum Einsatz. Die Fmoc-Gruppe wurde mittels 20% Piperiden in DMF
in 10 und 20 Minuten abgespalten. 2,0 Äquivalente von den folgenden Aminosäure-Derivaten
kamen zum Einsatz: Cys (mit Trityl-Schutzgruppe), Glu (mit tert. Butyl-Ester-Schutzgruppe),
Gly, Phe, His (mit Trityl-Schutzgruppe), Ile, Lys (mit tert. Butyloxy
carbonyl-Schutzgruppe), Met, Trp, Tyr (mit tert. Butyl-Schutzgruppe).
Das Peptid wurde an 20 mg Rink-Harz (Polystyrol/1% Divinylbenzol) mit einer Ladung
von 0,50 mMol/g synthetisiert.
Die Freisetzung des Peptids erfolgt mit 1 ml Trifluoressigsäure, 50 µl Ethandithiol, 50 µl
m-Kresol, 25 µl Ethylmethylsulfid und 25 µl Wasser in 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Das Peptid wurde aus der Abspaltlösung mit Diethylether gefällt.
Zur Biotinylierung des Peptidantigens wurde ein Moläquivalent möglichst konzentriert
(Löslichkeit ist von der Aminosäuresequenz abhängig) in Argon-gesättigtem Kalium
phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 8,0) gelöst und mit 3 Äquivalenten D-Biotinyl-ε-amino
capronsäure-N-hydroxysuccinimidester gelöst in Argon-gesättigtem Dimethylformamid
(Lösung von 1 µmol Reagenz in 5 µl DMF) versetzt. Man rührte das Reaktionsgemisch
2 Stunden bei Raumtemperatur unter Agon. Das biotinylierte Produkt wird gewonnen
durch Abtrennen der niedermolekularen Bestandteile durch Gelfiltration über NAP-15
Fertigsäulen (Pharmacia) und anschließender Lyophilisation. Die Ausbeuten lagen
zwischen 40% und 90%. Als Analytik dienten für die Reinheit HPLC, HPCE und TLC,
für die Identität LSI-MS (Molpeak) und TLC mit spezifischen Anfärbreagentien
(p Dimethylaminozimtaldehyd auf Biotin) und Gehaltsbestimmung über Mikroanalyse.
12 Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden mit 100 µg Immunogen (CollIa2 (1-13, Gln/Pyr)-Cys-
KLH oder CollIα2 (1-13, Gln/Pyr)-Cys-RSA in komplettem Freundschem Adjuvans intra
peritoneal erstimmunisiert.
Nach 6 Wochen folgten drei weitere Immunisierungen intraperitoneal in monatlichen Ab
ständen. Dabei wurde jeder Maus 100 µg Immunogen in inkomplettem Freundschem Adjuvans
verabreicht.
Acht Tage nach der 4. Immunisierung erfolgte eine retroorbitale Blutentnahme, um Mausserum
für eine analytische Bewertung zu erhalten. Die Ergebnisse der Immunisierung mit dem Peptid,
das an KLH gekoppelt war, (CollIα2 (1-13, Gln/Pyr)-Cys-KLH) waren im Vergleich zum RSA
Trägerprotein besser. Zur weiteren Untersuchung wurde aus den 15 Mäusen, die mit dem
KLH-Immunogen immunisiert wurden, die 2 Mausseren 328/14 und 328/11 näher charakteri
siert (vergleiche Beispiel 3.1).
Drei Tage, zwei Tage und am letzten Tag vor der Fusion folgten weitere Immunisierungen
intravenös mit je 100 µg Immunogen in PBS-Puffer.
Mäuse wurden durch Genickbruch getötet und die Milzen steril entnommen. Die Milzzellen
wurden in RPMI 1640-Basismedium mittels einer Pinzette aus der Bindegewebshülle ausge
drückt. Die Zellsuspension wurde durch ein Stahlsieb gerieben und anschließend in einem
Zentrifugenröhrchen in RPMJ 1640-Basismedium bei 200 g zentrifugiert.
Milzzellen einer immunisierten Maus wurden mit P3×63Ag8-653 Myelomzellen (ATTCC-CRL
8375) im Verhältnis 1 : 5 gemischt und zentrifugiert (10 Minuten, 300 g, 4°C). Die Zellen
wurden noch einmal mit RPMI 1640-Basismedium gewaschen und bei 400 g in einem 50 ml
Spitzröhrchen zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekippt, das Zellsediment aufgelockert,
1 ml PEG (MG 4000, Merck) dazugegeben und durchpipettiert. Nach 1 Minute im Wasserbad
wurden bei Raumtemperatur 5 ml RPMI 1640-Basismedium in einem Zeitraum von 5-6
Minuten zugetropft, durchmischt, auf 50 ml mit Medium (RPMJ 1640 + 10% FKS) aufgefüllt
und anschließend 10 Minuten bei 400 g, 4°C zentrifugiert. Die sedimentierten Zellen wurden
im RPMI 1640-Medium + 10% FKS aufgenommen und in 24-well-Zellkulturplatten mit
5 × 104 Milzzellen pro well in 1 ml Selektionsmedium (100 mM Hypoxanthin, 1 µg/ml Azaserin
in RPMI 1640 + 10% FKS) ausgesät. (FKS = Fötales Kälberserum).
Nach 10 Tagen wurden diese Primärkulturen auf spezifische Antikörpersynthese getestet
(vergleiche Beispiel 3.3). Primärkulturen der entsprechenden Spezifität wurden mittels FACS
(Zellsorter) in 96-well-Zellkulturplatten kloniert. Als Wachstumszusatz zum Medium wurde
Interleukin 6 (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 1271172, 100 U/ml) zugegeben. Auf diese
Weise wurden 6 Hybridoma-Zellinien isoliert.
Mikrotiterplatten (Fa. Nunc) wurden mit Thermo-RSA-Streptavidin beschichtet und mit einer
Lösung aus 100 ng der jeweiligen biotinylierten Peptide pro ml PBS, 0,05% Tween 20
beladen (100 µl/well). Es handelt sich um folgende Peptide:
Coll I α2 (1-13, 1Gln), Coll I α2 (1-13, 1Pyr), ein 1 : 1 Gemisch aus dieses beiden Peptiden Coll I α2 (1-13, IGln, Pyr), Coll I α2 (1-8), Coll I α2 (2-9) . . . bis Coll I α2 (14-21).
Coll I α2 (1-13, 1Gln), Coll I α2 (1-13, 1Pyr), ein 1 : 1 Gemisch aus dieses beiden Peptiden Coll I α2 (1-13, IGln, Pyr), Coll I α2 (1-8), Coll I α2 (2-9) . . . bis Coll I α2 (14-21).
Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde zweimal mit PBS, 0,05% Tween 20
gewaschen. Die Mausseren 328/14 beziehungsweise 328/11 wurden 1 : 4000 in PBS, 0,05%
Tween 20 verdünnt, 100 µl dieser Lösungen wurden anschließend in die mit den Peptiden be
schichteten wells pipettiert und darauf folgend 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach
wurde 3× mit PBS, 0,05% Tween 20 gewaschen. Zum Nachweis der an das Peptid gebunde
nen Antikörper des jeweiligen Mausserums wurden 100 µl eines POD-markierten Fab-Fragments
eines polyklonalen Antikörpers aus Schaf gegen Maus-Fc-γ (Boehringer Mannheim,
Ident-Nr. 104 75 23) in einer Konzentration von 40 mU POD/ml PBS, 0,05% Tween zuge
geben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde 3× mit PBS, 0,05% Tween 20
gewaschen. Nach Zugabe von 100 µl/well des farbbildenden Reagenzes (ABTS®, Boehringer
Mannheim, Kat.-Nr. 12045 21 und 12045 30) wurde nach etwa 30 Minuten Inkubation bei
Raumtemperatur die Extinktion bei 450/490 nm in einem Mikrotiterplattenreader der Firma
SLT gemessen. Die Ergebnisse der Pepscan-Messung sind in der Fig. 1 dargestellt. Es ist deut
lich zu erkennen, daß die Mausseren an die kompletten Peptide entsprechend SEQ ID NO 1
binden. Die Bindung an das Peptidgemisch (Aminosäure 1 Gln:Pyr 1 : 1) ist geringer als an die
einzelnen Peptide. Die Pepscan-Analyse mit den Octapeptiden mit Sequenzen aus dem
N-terminalen Bereich der Kollagen I α2-Kette zeigt, daß alle Antikörper die Sequenz 7-10, das
heißt Val-Gly-Leu-Gly, erkennen. Diese Sequenz ist hauptsächlicher Bestandteil des für die
Bindung des Antikörpers verantwortlichen Epitops.
Mit den Antikörpern der Mausseren und einem Wandfixierten Peptid läßt sich ein Enzym-Immunoassay
nach dem Kompetitions-Prinzip aufbauen zur Messung von Collagen-Peptiden
im Urin, der eine gute Korrelation zum Osteomark®-Test der Firma Ostex aufweist.
Thermo-RSA-Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten wurden mit dem biotinylierten
Peptidgemisch Coll I α2 (1-13, 1 Gln/Pyr, 1 : 1 Gemisch) beschichtet (100 ng/ml PBS, 0,05%
Tween 20, davon 100 µl/well). Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde 2×
mit PBS, 0,05% Tween 20 gewaschen. Aus dem Peptidgemisch Coll I α2 (1-13, 1 Gln/Pyr)
wurden Verdünnungen mit PBS, 0,05% Tween 20 hergestellt in folgenden Konzentrations
bereichen: 0, 25, 50, 100, 250, 500 und 1000 ng/ml. Je well wurden 50 µl des jeweiligen
Standards und 50 µl der Mausserumverdünnung (Mausserum 328/11, 1 : 4000 verdünnt in PBS,
0,05% Tween 20) pipettiert und miteinander gemischt. Nach einstündiger Inkubation bei
Raumtemperatur wurde 3× mit PBS, 0,05% Tween 20 gewaschen und anschließend, wie im
Beispiel der Pepscan-Messungen beschrieben, mit POD gelabeltem Fab-Fragment eines poly
klonalen Antikörpers gegen Maus Fcγ und anschließender Farbreaktion das Meßsignal erzeugt.
Die Auftragung des Meßsignals gegen die Standardkonzentration ergibt die Standardkurve
(Fig. 2).
Statt der Standardverdünnungen wurden 50 µl Urin in den Test eingesetzt. Ansonsten erfolgte
die Testführung analog der Erstellung der Standardkurve. Die Konzentrationen der Probe
wurden an der Eichkurve abgelesen und anschließend auf den Creatininwert der Probe be
zogen. Die Creatinin-Bestimmung erfolgte mit der enzymatischen Bestimmungsmethode
Creatinin-PAP der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Best.-Nr. 1178652).
Zur Vergleichsmessung wurde der Test Osteomark® der Firma Ostex verwendet; die Be
zeichnung BCE bedeutet "bone collagen equivalents". Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 1 dargestellt:
In der Fig. 3 ist die Korrelation des erfindungsgemäßen Tests zum Osteomark® Test darge
stellt. Es ergab sich eine Korrelationskoeffizient von 0,925.
Die mit Myelomzellen fusionierten Milz-Zellen der Mäuse 328/11 und 328/14 wurden ausge
sät. Mit den Kulturüberständen 9/1 bis 9/12 (Maus 328/11) und 10/1 bis 10/4 (Maus 328/14)
wurde eine Pepscan-Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 und 5 dargestellt.
Die Testdurchführung entspricht dem Beispiel 3.1 mit folgenden Varianten:
Als Biotin-derivatisierte Peptide wurden nur die Peptide Coll I α2 (3-10) bis Coll I α2 (8-15)
eingesetzt. Anstelle der Mausseren wurden die Kulturüberstände 9-1 bis 9-12 beziehungsweise
10-1 bis 10-4 in unterschiedlichen Verdünnungsstufen (PBS, 0,05% Tween 20) eingesetzt.
Der Grad der Verdünnung ist der Abbildung zu entnehmen. Unter Verwendung der Anti
körperhaltigen Kulturüberstände wurden Standardkurven erstellt, Urin-Proben vermessen und
Korrelationen zum Knochenresorptionsmarker Osteomark® ermittelt. Als Beispiel für das
hierbei verwendete Prozedere wird ein EIA-Kompetitionstest mit den monoklonalen Anti
körpern des Kulturüberstandes 9-1 (Maus 328/11) beschrieben (Beispiel 3.4).
Thermo-RSA-Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten wurden mit dem biotinylierten Peptid
Coll I α2 (6-13) beschichtet (100 ng/ml PBS, 0,05% Tween 20, davon 100 µl/well). Nach
einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde 2× mit PBS, 0,05% Tween 20 gewaschen.
Aus dem Peptidgemisch Coll I α2 (1-13, 1 Gln/Pyr) wurden durch Verdünnen mit PBS, 0,05%
Tween 20 die folgende Konzentrationen hergestellt: 0, 50, 100, 200 ng/ml. Pro weil wurden
50 µl des jeweiligen Standards und 50 µl des Kulturüberstandes (1+1 verdünnt in PBS, 0,05%
Tween 20) pipettiert und gemischt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde
3× mit PBS, 0,05% Tween 20 gewaschen und anschließend, wie im Beispiel der Pepscan-Messungen
beschrieben, mit POD gelabeltem Fab-Fragment eines polyklonalen Antikörpers
gegen Maus Fcγ und anschließender Farbreaktion das Meßsignal erzeugt. Die Auftragung des
Meßsignals gegen die Standardkonzentration ergibt die Standardkurve, die in Fig. 6 dargestellt
ist.
Statt der Standardverdünnungen wurden 50 µl Urin in den Test eingesetzt. Ansonsten erfolgte
die Testführung analog der Erstellung der Standardkurve. Die Konzentration der Probe wurde
an der Eichkurve abgelesen und anschließend auf den Creatininwert der Probe bezogen. Für
die Creatinin-Bestimmung und den Test Osteomark® gilt das gleiche wie im Beispiel 3.2 er
wähnt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt. Die Korrelation zum
Osteomark®-Test ist in Fig. 7 dargestellt. Es ergab sich ein Korrelationskoefftzient von 0,972.
In der Tabelle 3 sind Daten für weitere Kulturüberstände zusammengefaßt. In allen Fällen
ergab sich eine sehr gute Korrelation zum Osteomark®-Test.
Claims (14)
1. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch die Aminosäuresequenz Val-Gly-Leu-Gly
innerhalb Kollagen I oder von Fragmenten daraus erkennt.
2. Antikörper gemäß Anspruch 1, erhältlich durch Immunisierung mit einem Peptid oder
Peptid-Derivat, das die Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO 1 oder eine Teil
sequenz daraus, die mindestens die Aminosäuresequenz Val-Gly-Leu-Gly umfaßt, be
inhaltet.
3. Antikörper gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Peptid-Derivat
mindestens 6 Aminosäuren lang ist.
4. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti
körper monoklonal sind.
5. Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1-3, in einem diagnostischen
Verfahren zur Bestimmung der Osteolyse.
6. Immunoassay zum Nachweis von Kollagen I oder Fragmente daraus, wobei mindestens ein
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1-4 verwendet wird.
7. Immunoassay gemäß Anspruch 6 nach dem Prinzip eines kompetitiven Immunoassays,
wobei zusätzlich ein Peptid oder Peptid-Derivat, das die Aminosäuresequenz entsprechend
SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz daraus, die mindestens die Aminosäuresequenz Val-Gly-Leu-Gly
umfaßt, beinhaltet.
8. Immunoassay gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen EIA,
CEDIA, FPIA, TINIA oder LPIA handelt.
9. Peptid oder Peptid-Derivat, das die Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO 1 oder
eine Teilsequenz daraus, die mindestens die Aminosäuresequenz Val-Gly-Leu-Gly umfaßt,
beinhaltet.
10. Peptid oder Peptid-Derivat gemäß Anspruch 9 zur Herstellung von Antikörpern, dadurch
gekennzeichnet, daß es an eine immunogene Trägersubstanz gekoppelt ist.
11. Verwendung eines Peptids oder Peptid-Derivats gemäß Ansprüchen 9 oder 10 zur Her
stellung von Antikörpern.
12. Verwendung eines Peptids oder Peptid-Derivats gemäß Anspruch 9 in einem Immuno
assay.
13. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen Kollagen I oder Fragmente daraus
durch Immunisierung geeigneter Tiere mit einem Antigen gemäß einem der Ansprüche 9
oder 10 und Isolierung des gewünschten Antikörpers aus dem Serum des Tieres.
14. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 4 durch Immuni
sierung eines geeigneten Tieres mit einem Antigen gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10,
Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen immor
talisierten Milzzellen, die die gewünschten Antikörper produzieren und Isolierung der
Antikörper aus den klonierten Zellen oder den Kulturüberständen dieser Zellen.
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1995103146 DE19503146A1 (de) | 1995-02-01 | 1995-02-01 | Antigene und Antikörper zum Nachweis von Kollagen I |
DE59505585T DE59505585D1 (de) | 1994-12-23 | 1995-12-19 | Antigene und Antikörper zum Nachweis von Kollagen I |
EP95120097A EP0718309B1 (de) | 1994-12-23 | 1995-12-19 | Antigene und Antikörper zum Nachweis von Kollagen I |
US08/576,039 US5821065A (en) | 1994-12-23 | 1995-12-21 | Immunoassay for the detection of collagen I |
JP7335319A JPH08233811A (ja) | 1994-12-23 | 1995-12-22 | I型コラーゲン検出用の抗原及び抗体 |
US08/678,552 US5763272A (en) | 1994-12-23 | 1996-07-09 | Hybridoma for producing antibody for collagen I |
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Publications (1)
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DE19503146A1 true DE19503146A1 (de) | 1996-08-08 |
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Family Applications (1)
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DE1995103146 Withdrawn DE19503146A1 (de) | 1994-12-23 | 1995-02-01 | Antigene und Antikörper zum Nachweis von Kollagen I |
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Country | Link |
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- 1995-02-01 DE DE1995103146 patent/DE19503146A1/de not_active Withdrawn
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