JPH08233811A - Ｉ型コラーゲン検出用の抗原及び抗体 - Google Patents

Ｉ型コラーゲン検出用の抗原及び抗体

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JPH08233811A
JPH08233811A JP7335319A JP33531995A JPH08233811A JP H08233811 A JPH08233811 A JP H08233811A JP 7335319 A JP7335319 A JP 7335319A JP 33531995 A JP33531995 A JP 33531995A JP H08233811 A JPH08233811 A JP H08233811A
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エシッヒ ウルリッヒ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 改善されたイムノアッセイ、及びその目的に
使用される抗体や抗原などの最適化された材料を提供す
る。 【解決手段】コラーゲン Iα2 鎖のＮ−末端に対する抗
体を製造するための抗原、このような抗原の製造方法、
本発明の抗原を使用して免疫化することによって得られ
た、コラーゲン Iα2 鎖のＮ−末端に対する抗体、コラ
ーゲンの検出のためのこれらの抗体の使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｉ型コラーゲンの
α２鎖のＮ末端に対する抗体を作製するための抗原、こ
うした抗原を作製する方法、本発明の抗原を使用して免
疫感作を行うことによって得られたＩ型コラーゲンのα
２鎖のＮ末端に対する抗体に関するものであり、また、
コラーゲンを検出するためのこうした抗体の使用に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】コラーゲンは、結合組織である皮膚、軟
骨及び骨の重要な構造タンパク質である。１１種のコラ
ーゲンが知られており、それぞれ、α１、α２及びα３
と称される３本の鎖から構成されている（E. Miller et
al. in methods in Enzymology 144, Structural and
Contractile Proteins, ed. L. Cunningham, Academic
Press Inc. 1987, p3-41）。ある種の組織、特に骨又は
軟骨の成熟コラーゲンの一つの特徴的な性質として、ヒ
ドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノールに
よって、隣接した繊維が架橋されていることが挙げられ
る（D. Fujimoto et al., J. Biochem 83 (1978), 863-
867、D. Eyre et al., Ann. Rev. Biochem. 53 (1984),
717-748、 およびD. Eyre, Methods in Enzymology 14
4 (1987), 115-139）。これらの架橋は、コラーゲンを
特異的に検出する際の生化学的標識として使用すること
ができる（Z. Gunja-Smith et al., Biochem. J. 197(1
981), 759-762）。細胞外コラーゲンが分解すると、Ｗ
Ｏ９１／１０１４１に記載されているように、ペプチド
側鎖を含むヒドロキシリシルピリジノリン若しくはリシ
ルピリジノリンの誘導体、またはリシル若しくはヒドロ
キシリシル残基を有する遊離ピリジノリン誘導体が、体
液、たとえば血液又は尿中に放出される。したがって、
体液中のこうした化合物を検出することによって、たと
えば骨粗鬆症の場合や骨組織の腫瘍の結果として生じる
細胞外コラーゲンの分解に関する情報を得ることができ
る。こうしたペプチド側鎖を有するヒドロキシリシル又
はリシルピリジノリンの検出については、ＷＯ８９／１
２８２４に、尿から単離された対応架橋コラーゲン断片
を使用して免疫感作を行うことによって得られたモノク
ローナル抗体が記載されている。ＷＯ９１／０８４７８
及びＷＯ９２／２１６９８に記載された方法でも、天然
に生じた、すなわちin vivo で生じたコラーゲンの架橋
分解生成物に対する抗体を介してコラーゲンを検出する
ことが記載されている。
【０００３】こうした天然のソースの単離ペプチドの欠
点としては、試験で使用する抗原又はその結合相手物質
を再現性をもって調製しうる信頼性の高いソースが存在
しないことが挙げられる。こうした天然のソースの単離
ペプチドの別の不利な点は、感染性物質が混入する危険
性があることである。配列のわかっている抗原は、抗原
のエピトープに対応するペプチドを化学的に合成するこ
とによって得ることができる。分子量が約７００−１５
００Ｄの小型のタンパク質を使用する場合には、担体分
子と結合させて、免疫原としての効果を有する抗原を得
る必要がある。担体分子を結合させることによって、エ
ピトープの構造に変化をきたすようなことがあってはな
らない。これまでのところ、担体分子は、エピトープ領
域であると推定されている領域から十分に離れた位置で
ペプチド鎖の端部と結合させるのが好適である（Labora
tory Technics in Biochemistry and Molecular Biolog
y, Synthetic Polypeptides as Antigens, Editors R.
H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amst
erdam, New York, Oxford 1988, pages 95-100）。
【０００４】架橋コラーゲンの天然分解生成物と対応す
る既知配列の抗原を化学合成するに際しての問題は、架
橋によって生じたヒドロキシリシル又はリシルピリジノ
リン構造にあり、これは、こうした構造を化学合成する
ことが困難だからである。今日まで、研究者は、試料中
のコラーゲン又はコラーゲン分解生成物を検出する際に
は、ヒドロキシリシル又はリシル残基の架橋によって生
じた架橋構造そのもの、すなわち、いわゆる架橋ペプチ
ドを検出することが必要であると考えてきた。これは、
こうしたヒドロキシリシル又はリシルピリジノリン構造
がコラーゲンに特徴的だからである。こうした検出方法
の例は、ＷＯ８９／１２８２４、ＷＯ９１／０８４７
８、ＷＯ８９／０４４９１、及びＷＯ９１／１０１４１
に記載されている。
【０００５】ドイツ国特許ＤＥ４２ ２５ ０３８によ
って、コラーゲン又はコラーゲン断片の検出に際して、
直鎖状の非架橋ペプチド配列及び抗体も使用可能なこと
がはじめて示された。使用された免疫原は、コラーゲン
の直鎖状の部分配列に対応し、天然のコラーゲン分子で
はヒドロキシリシンとして存在するリシン残基を少なく
とも１個含む短いペプチドである。このペプチドは、こ
のリシン残基のε−アミノ基を介して、担体分子に結合
されている。
【０００６】ＷＯ９４／０３８１３にも、コラーゲンの
非らせん状のＣ末端又はＮ末端領域の配列に対応する合
成直鎖状ペプチドが、コラーゲン又はコラーゲンの断片
に対する抗体を作製するための抗原として記載されてい
る。合成直鎖状ペプチドは、いずれも、コラーゲンの非
らせん状のＣ末端又はＮ末端領域の連続したアミノ酸配
列である。こうした領域は、Chu et al., Nature 310,
337-340 (1984)、Click et al., Biochemistry 9, 4699
-4706 (1970)、Morgan et al., J. Biol. Chem. 245, 5
042-5048 (1970)、およびBernard et al., Biochemistr
y 22, 5213-5223 (1983)より公知である。特に、コラー
ゲンのα鎖のＣ末端領域に見いだされるペプチドが開示
されている。こうした免疫原を用いて得られる抗体は、
イムノアッセイで、体液中のコラーゲン分解生成物を検
出する際に使用することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、この種のイムノアッセイを改善し、こうした目
的に使用される抗体や抗原などの材料を最適化すること
である。抗体は、体液中で生じるコラーゲンの分解生成
物、すなわち、コラーゲン断片を特異的に認識するとい
う事実によって区別される必要がある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明の主
題は、体液中のＩ型コラーゲンの分解生成物に対する抗
体であって、Ｉ型コラーゲン又はその断片中のアミノ酸
配列Val-Gly-Leu-Glyを特異的に認識するものである。
このアミノ酸配列は、Ｉ型コラーゲンのα２鎖のＮ末端
のアミノ酸残基７−１０に対応する。驚くべきことに、
コラーゲン分解生成物を検出するイムノアッセイでこの
抗体を使用すると、体液中のコラーゲン分解生成物が極
めて特異的かつ高感度で検出され、こうしたイムノアッ
セイが、架橋しているコラーゲン分解生成物を使用した
イムノアッセイ（ＷＯ８９／０４４９１）と極めて良好
な相関を示すことが、経験上示された。
【０００９】本発明の抗体は、アミノ酸配列Val-Gly-Le
u-Glyを特異的に認識し、すなわち、このアミノ酸配列
は、体液中に含まれるコラーゲン分解生成物中で認識さ
れる。この配列に隣接したアミノ酸も、この抗体で認識
することが可能である。しかし、コラーゲン断片によっ
ては、これらのアミノ酸が欠落していることもありうる
ので、このことは、本発明の抗体が満たすべき要件とは
いえない。ともかく重要なのは、コラーゲン断片内の、
配列Val-Gly-Leu-Glyを特徴とするエピトープを、抗体
が認識することである。抗体が結合するエピトープは、
アミノ酸いくつか分、たとえばアミノ酸１−４個分長く
てもよい。特に好適な抗体は、Ｉ型コラーゲンのα２鎖
のＮ末端のアミノ酸残基６−１３を認識する。
【００１０】抗体は、通常使用される方法で得ることが
できる。体液から免疫感作を行う際には、たとえば、Ｉ
型コラーゲンのα２鎖のＮ末端側の配列Val-Gly-Leu-Gl
yを含む部分を有する精製コラーゲン断片を使用するこ
とができる。これらのコラーゲン断片は、Ｉ型コラーゲ
ンを酵素的又は化学的に開裂させることによっても得る
ことができる。こうしたどちらかといえば正確に配列が
わかっているペプチドに対して形成された抗体について
も、免疫感作を行ってから適切なスクリーニング過程で
選択、精製を行う必要がある。そのためには、抗体が、
配列Val-Gly-Leu-Glyを含む短いペプチドと反応するこ
とを利用することができる。
【００１１】抗体の製造方法としてさらに簡単で、した
がってより好ましい方法は、配列番号１に対応するアミ
ノ酸配列、又は少なくともアミノ酸配列Val-Gly-Leu-Gl
yを含むその部分配列を含む合成ペプチド又はペプチド
誘導体で動物を免疫感作することである。合成ペプチド
は、６個以上のアミノ酸を含むことが好ましい。配列Va
l-Gly-Leu-Glyにさらに結合させるアミノ酸は、この配
列のＮ末端又はＣ末端に結合させるのが好ましく、ま
た、Ｉ型コラーゲンのα２鎖の中で上記配列と隣接して
いるものとするのが好ましい。しかし、他のアミノ酸を
結合させることも可能である。免疫原担体、たとえばキ
ーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ
血清アルブミン又はエデスチンにペプチドを結合させて
免疫応答を増大させることも好都合である。本発明の抗
体は、ポリクローナル抗体とすることも、モノクローナ
ル抗体とすることもできるが、モノクローナル抗体とす
るのが好適である。
【００１２】コラーゲン分解生成物を検出するにあたっ
ての各種アミノ酸の形態での使用に応じて、抗体は、上
述のシグナル発生物質又は標識基、たとえば蛍光標識
基、電気化学発光標識基、ジゴキシン、ビオチン又は放
射性の基に結合させることができる。固相が必要とされ
るようなイムノアッセイを行う場合には、抗体を、この
固相に直接又は間接的に結合することができる。これら
の基又は固相との結合は、当業者に公知の方法にしたが
って行ったものである。
【００１３】本発明のもう一つの主題は、配列番号１に
対応するアミノ酸配列、又は少なくともアミノ酸配列Va
l-Gly-Leu-Glyを含むその部分配列を含むペプチド又は
ペプチド誘導体である。このアミノ酸配列は、Ｉ型コラ
ーゲンのα２鎖のＮ末端側の非らせん状の末端部分に由
来する部分的領域である。このペプチド又はペプチド誘
導体は、本発明の抗体を作製するにあたっての免疫原と
して、特異結合相手物質として、またイムノアッセイの
標準物質として使用することができる。本発明のペプチ
ドは、化学的手順を使用した公知の合成方法によって生
成させることも、こうしたペプチドをコードするＤＮＡ
配列をクローニングし、適当な宿主細胞で発現させるこ
とによって生成することもできる。
【００１４】本発明は、ペプチドだけでなく、ペプチド
誘導体にも関する。ペプチド誘導体という用語は、化学
反応によって１つないし数個のアミノ酸が誘導体化され
たペプチドを包含するものである。例としては、特に、
主鎖および／または遊離アミノ酸基が誘導体化された分
子を挙げることができる。本発明のペプチド誘導体は、
本発明の抗体との結合に関して、本質的に同等な特異性
および／または親和性を有している ペプチド誘導体は、本発明の抗体との結合に関して、上
述のペプチドと本質的に同等な特異性および／または親
和性を示すペプチド様物質とすることもできる。ペプチ
ド様物質は、抗体と相互に作用する際にペプチドを代替
することができ、未変性のペプチドと比べると安定性が
高い化合物である。製造方法は、Giannis and Kolter,
Angew. Chem. 105 (1993), 1303-1326、Lee et al., Bu
ll. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993), 2006-2010 およびDor
sch et al, Kontakte (Darmstadt) (1993)(2), 48-56に
記載されている。
【００１５】抗体を調製する際の免疫原として使用する
のか、それともイムノアッセイでの材料として使用する
のかに応じて、本発明のペプチド又はペプチド誘導体
は、上述の信号発生物質又は標識基、たとえば蛍光標識
基、ジゴキシン、ビオチン、放射性の基である免疫原担
体に結合させることができる。固相が必要とされるよう
なイムノアッセイの場合には、ペプチド又はペプチド誘
導体を、こうした固相に直接結合したり、あるいはスト
レプトアビジン／ビオチン結合を介して間接的に結合し
たりすることができる。固相としては、チューブ、ビー
ズ、ラテックス粒子などが挙げられる。結合は、通常の
公知の方法で行うことができる。
【００１６】上述したように、本発明のペプチド又はペ
プチド誘導体は、抗体を調製するにあたって使用するこ
とができる。本発明のさらに別の主題は、配列番号１に
対応するアミノ酸配列、又は少なくともアミノ酸配列Va
l-Gly-Leu-Glyを含むその部分配列を含むペプチド又は
ペプチド誘導体で免疫感作を行うことによって、コラー
ゲン分解生成物に対する抗体を作製する方法である。好
適な態様では、ペプチド又はペプチド誘導体の長さはア
ミノ酸６個以上で、免疫原担体に結合されている。免疫
感作が終了したら、公知の方法にしたがって、免疫感作
動物から所望の抗体を単離する。所望の担体の単離は、
担体、好ましくはセファロースにペプチドを結合させた
ものへの免疫吸着によって行うのが好ましい。このペプ
チドは、配列番号１に対応するアミノ酸配列、又は少な
くともアミノ酸配列Val-Gly-Leu-Glyを含むその部分配
列を含んでいる。
【００１７】本発明の好適な主題は、本発明のペプチド
又はペプチド誘導体で免疫感作を行い、免疫感作した動
物の脾細胞を不死化し、所望の抗体を産生するこうした
不死化脾細胞をクローニングし、そしてクローニングし
た細胞又は培養細胞上清から抗体を単離することによっ
て、架橋コラーゲンに対するモノクローナル抗体を作製
する方法である。
【００１８】免疫感作は、通常入手しうる動物、好まし
くはマウス又はウサギを用いることによって実施する。
免疫感作動物の脾細胞は、当業者に公知の方法、たとえ
ばハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, Nature
256 (1975), 495-497 ）、又はエプスタイン−バールウ
イルスによるトランスフォーメーション（ＥＢＶトラン
スフォーメーション）によって不死化する。所望の抗体
を産生する不死化細胞を検出するために、免疫感作に使
用した本発明のペプチドとともに培養上清のサンプルを
通常のイムノアッセイのようにしてインキュベートし、
その後、試験を行って、このペプチド又はペプチド誘導
体に抗体が結合するか否かを観察する。
【００１９】コラーゲンの分解生成物の濃度は、骨の溶
解の程度に関する重要な診断マーカーとなる。本発明の
ポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いると、体
液中の天然コラーゲン分解生成物の濃度を測定すること
によって、骨の溶解の程度を測定することが可能とな
る。本発明のさらに別の主題は、抗体を試料とともに培
養して抗体に結合したコラーゲン分解生成物を測定する
ことによって、すなわち、本発明の抗体を使用して試料
中のＩ型コラーゲン又はコラーゲン断片を検出するイム
ノアッセイを実施することによって骨の溶解を測定する
ための、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の使用
である。
【００２０】試料は、コラーゲン分解生成物を含有する
体液、好ましくは血清、血漿又は尿である。基本的に
は、通常のイムノアッセイは、いずれも検出に適してい
る。好適な態様では、Ｉ型コラーゲン又はコラーゲン断
片への抗体の結合は競合法によって行う。競合法による
試験の際には、抗体を、試料及び本発明のペプチド又は
ペプチド誘導体とともに、同時に又は順次培養する。試
料中に含まれているコラーゲン断片が、好ましくは抗体
との結合について、本発明のペプチド又はペプチド誘導
体と競合し、その結果、本発明のハプテンとの抗体の結
合が試料中に含まれている抗原の量の指標となる。液相
を固相から分離するヘテロジニアスな競合イムノアッセ
イでは、抗体又はペプチドの双方を標識したり、固相に
結合させたりすることができる。試料中の抗原の正確な
量は、同様に処理した標準物質と比較することによって
通常の方法で測定することができる。
【００２１】当業者に公知の競合法による試験手順は、
いずれも検出のために使用することができる。検出は、
たとえば、比濁阻害イムノアッセイ（turbidimetric in
hibition immunoassay、ＴＩＮＩＡ）又はラテックス粒
子イムノアッセイ（latexparticle immunoassay、ＬＰ
ＩＡ）を使用して行うことができる。比濁阻害イムノア
ッセイを使用する場合には、本発明のペプチド又はペプ
チド誘導体をデキストランの如き担体に結合する（ＥＰ
−Ａ−０５４５３５０）。このポリハプテンは、抗体と
結合するために、試料中に含まれるアナライトと競合す
る。形成された複合体は、比濁分析によって測定するこ
とができる。
【００２２】ラテックス粒子イムノアッセイを用いる場
合には、粒子、好ましくはラテックス粒子を本発明のペ
プチドで被覆し、本発明の抗体及び試料と混合する。試
料中にアナライトが存在する場合には、凝集が低減する
ことになる。酵素イムノアッセイ（Wisdom, G.B. Clin.
Chem. 22/8 (1976), 1243-1255、およびM. Oellerich,
J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Vol. 18(1980), 197-
208）、蛍光分極イムノアッセイ（ fluorescence pola
rization immunoassay、ＦＰＩＡ）（W. Dandliker et
al., J. Exp. Med. 122(1965), 1029）、酵素増幅イム
ノアッセイ技術（enzyme-multiplied immunoassay tech
nology、ＥＭＩＴ）（Gunzer et al., Kontake III, 19
80, 3-11、およびK. Rubenstein, Biochemical and Bio
physical Research Communications 47(1972), 846-85
1）、又はＣＥＤＩＡ技術（Henderson et al., Clinica
l Chemistry 32(1986), 1637-41）も検出反応として適
当である。
【００２３】試料、すなわち試料中のコラーゲン又はコ
ラーゲン断片を変性して、エピトープと抗体とが結合し
やすいようにするのが多少なりとも有利であることも経
験上わかっている。抗体とともにインキュベートするに
先だって、試料を、当業者にとって公知のタンパク質変
性剤で処理しておくのが特に適当であることも経験上わ
かっている。試料と特異的抗体との免疫反応が進行する
間に干渉がなるべく、又はまったく生じないようにする
ためには、変性したプローブを再度希釈しておいてから
抗体とのインキュベーションを行う。変性剤としては、
当業者に公知のすべての変性剤を使用することができ
る。濃度が２Ｍ−６Ｍのロダン化カリウム（ＫＳＣＮ）
及び濃度が０．５Ｍ−２Ｍの臭化テトラデシルトリエチ
ルアンモニウム（ＴＴＡＢ）が、変性に際して特に好適
であった。
【００２４】本発明のさらに別の主題は、配列番号１の
アミノ酸配列、又は、少なくともアミノ酸配列Val-Gly-
Leu-Glyを含むその部分配列を含むペプチド又はペプチ
ド誘導体を含むことを特徴とするＩ型コラーゲン又はコ
ラーゲン断片を検出するイムノアッセイにおいて、標準
又は検量線を作成するために用いられる標準物質であ
る。
【００２５】以下に、手順を順を追って説明しつつ、本
発明をさらに詳細に例示する。配列番号１は、Ｉ型コラ
ーゲンα２鎖のＮ末端から第１〜13番目のアミノ酸に相
当する本発明のペプチドを示している。Xaa は Glnまた
はPyr（ピログルタミン）を意味している。
【００２６】
【発明の実施の形態】
実施例１ １．１ ペプチド合成 Labortec SP 640 ペプチド合成装置を使用し、フルオレ
ニルメチロキシ−カルボニル−（Fmoc）−固相ペプチド
合成によって、コラーゲンのアミノ酸配列の部分配列を
含み、配列番号１に相当するペプチド１（1Gln-Tyr-Asp
-Gly-Lys-Gly-Val-Gly-Leu-Gly-Pro-Gly-13Pro)-Cys(＝
CollＩα(1-13,1Gln)-Cys）およびペプチド２（1Pyr-Ty
r-Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly-Leu-Gly-Pro-Gly-13Pro)-C
ys(＝CollＩα(1-13,1Pyr)-Cys）を作成する。以下のFm
ocアミノ酸誘導体の4.0当量に相当する量を使用する： 第３級ブチル保護基を有するTyr 第３級ブチロキシカルボニル保護基を有するLys Ｓ−第３級ブチル保護基を有するCys 。
【００２７】それ以外のアミノ酸誘導体（Gln,Pyr,Asp,
Gly,Val,Leu,Pro ）はすべて側鎖保護基を含まないもの
を使用した。これらのアミノ酸またはアミノ酸誘導体を
Ｎ−メチルピロリドンに溶解する。４−（2',4'-ジメト
キシフェニル−Fmoc−アミノメチル）フェノキシ樹脂
（Tetrahedron Letters 28(1987),2107 ）3 g 上で、濃
度 0.87 mmol／樹脂 1 gを使用してペプチドを合成する
（JACS 95(1973),1328）。反応媒体としてジメチルホル
ムアミド中のジシクロヘキシルカルボジイミド4.4 当量
およびＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール 4.8当量を
使用して、Fmocアミノ酸誘導体のカップリング反応を60
分間実施する。イソプロパノールで洗浄した合成用樹脂
上でKaiser試験（Anal.Biochem. 34 (1970),595 ）を行
なって、カップリング反応の結果をモニターする。完全
な変換が達成されるまで、上記の条件下でカップリング
を反復する。各合成ステップ後、ジメチルホルムアミド
中20％ピペリジンを使用して、20分間にわたって、Fmoc
基を切断する。各ピペリジン処理後、放出されたフルベ
ン基のＵＶ吸収から、樹脂中の濃度を測定する。
【００２８】合成後においても、濃度は0.68 mmol/g で
ある。トリフルオロ酢酸 80 ml、エタンジチオール 5 m
l 、フェノール 2.5 g、ｍ−クレゾール 2.5 ml および
水 5ml を使用して、室温で60分、合成用樹脂からのペ
プチドの放出および酸不安定保護基の切断を実施する。
その後反応溶液を真空濃縮し、残渣を取り出してジイソ
プロピルエーテルに入れ、0.5〜2時間激しく撹拌し、そ
の後濾過する。次いで、Sephadex G15を使用し、0.5％
酢酸を溶離剤とするゲル浸透クロマトグラフィーによっ
てこの物質を予備精製する。その後、生成した粗物質を
濾過し、Nucleosil RP 18 （カラム 40mm × 250 mm 30
0Å，5μm ）上での100 ％試薬Ａ（水、0.1 ％トリフル
オロ酢酸）から100 ％試薬Ｂ（60％アセトニトリル、40
％水、0.1 ％トリフルオロ酢酸）までの勾配を使用した
120 分間の分取ＨＰＬＣによって単離する。イオンスプ
レー質量分析によって、溶離物質の同一性をチェックす
る。
【００２９】１．２ 免疫原の合成 マレインイミド−プロピオン酸−Ｎ−スクシンイミドエ
ステル（＝ＭＰＳ）を使用したＫＬＨの活性化 ＫＬＨ凍結乾燥物 280 mg を 0.1 Mリン酸カリウム緩衝
液（pH 7.0）15 ml に溶解する；その後ＤＭＳＯ 1 ml
中のＭＰＳ＝マレインイミド−プロピオン酸−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル 7.35 mg溶液を添加し、
室温で16時間撹拌する。続いて混合物を遠心分離し、Ａ
ｃＡ 202カラム（ｄ＝5 cm、ｌ＝25 cm；0.1 Mリン酸カ
リウム緩衝液（pH 7.0）で平衡化）を使用して上清を精
製する。
【００３０】収量：ＫＬＨ−ＭＰ 129 mg （4.3×10-5m
mol）；η＝3.59 mg/ml（ＢＣＡ Test ;ＢＣＡ Protei
n Assay Reagent,Pierce、によって測定） ＫＬＨ−ＭＰのColl Iα２（１−13、１Gln /Pyr）-Cys
との反応 Coll Iα２（１−13、１Gln ）-Cys 20.33 mg およびCo
ll Iα２（１−13、１Pyr）-Cys 20.08 mgの混合物を H
2O 1 mlに溶解し、ＭＰ活性化ＫＬＨに添加して溶解す
る。この混合物を室温で16時間撹拌する。続いて混合物
を遠心分離し、ＡｃＡ 202カラム（ｄ＝5 cm、ｌ＝25 c
m；0.1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）で平衡化）を
使用して上清を精製する。
【００３１】ＭＰＳによるＢＳＡの活性化 ＢＳＡ 150 mg を 0.1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH 7.
0）10 ml に溶解し、ＤＭＳＯ 1 ml 中のＭＰＳ 11.6 m
g溶液を添加し、混合物を室温で16時間撹拌する。続い
てＡｃＡ 202カラム（ｄ＝5 cm、ｌ＝25 cm；0.1 Mリン
酸カリウム緩衝液（pH 7.0）で平衡化）を使用して溶液
を精製する。
【００３２】収量：ＢＳＡ−ＭＰ 121 mg （1.75×103m
mol/l）；η＝3.78 mg/ml（ＢＣＡ試験によって測定） ＢＳＡ−ＭＰのColl Iα２（１−13、１Gln /Pyr）-Cys
との反応 Coll Iα２（１−13、１Gln ）-Cys 47.13 mg およびCo
ll Iα２（１−13、１Pyr）-Cys 46.53 mgの混合物を H
2O 3 mlに溶解し、ＭＰ活性化ＢＳＡに添加して溶解す
る。この溶液を室温で16時間撹拌する。続いてＡｃＡ 2
02カラム（ｄ＝5 cm、ｌ＝25 cm；0.1 Mリン酸カリウム
緩衝液（pH 7.0）で平衡化）を使用して溶液を精製す
る。
【００３３】収量：免疫原 124 mg ；η＝2.59 mg/ml
（ＢＣＡ試験によって測定） １．３ ＰＥＰＳＣＡＮ分析用ペプチドの合成 Fmoc（フルオレニルオキシカルボニル）固相合成を使用
して、ペプチドを生成した。Zinsser （ＳＭＰ360 ）製
多重合成装置中で反応を実施した。ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド1.1 当量およびＮ−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール 1.0当量を使用して、Fmocアミノ酸誘導体のカ
ップリング反応を90分間実施した。使用した反応媒体は
ジメチルホルムアミドである。ＤＭＦ中50％ピペリジン
を使用して、10および20分間にわたってFmoc基を切断し
た。以下のFmocアミノ酸誘導体の10.0当量を使用した：
Asp （第３級ブチルエステル保護基を有する）：Asp
（第３級ブチルエステル保護基を有する）、Gly、Lys
（第３級ブチルオキシカルボニル保護基を有する）、Me
t、Tyr（第３級ブチル保護基を有する）、Gln、Val、Le
u、Pro、Arg （ＰＭＣ保護基を有する）。
【００３４】Rink樹脂（ポリスチレン／１％ジビニルベ
ンゾール）20 mg を使用し、添加量0.50 mmol/gとして
ペプチドを合成した。この操作によって、配列番号２：
Gln,Tyr,Asp,Gly,Lys,Gly,Val,Gly,Leu,Gly,Pro,Met,Gl
y,Leu,Met,Gly,Pro,Arg,Gly,の Coll Iα2（1-21）配列
の中の８アミノ酸残基をそれぞれ含むペプチドが産生さ
れた。
【００３５】トリフルオロ酢酸 1 ml 、エタンジチオー
ル 50μl、チオクレゾール 50μl、チオアニソール 25
μlおよび水 25μlを使用して、室温で３時間かけてペ
プチドを放出させた。ジイソプロピルエーテルを使用し
て、切断用溶液からペプチドを沈殿させた。ペプチド抗
原をビオチニル化させるため、高度に濃縮したモル当量
（溶解度はアミノ酸配列によって異なる）をアルゴン飽
和リン酸カリウム緩衝液（0.1 mol/l,pH 8.0）に溶解
し、アルゴン飽和ジメチルホルムアミドに溶解したＤ−
ビオチニル−ε−アミノ−カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（ 5μl のＤＭＦ中１μmolの
試薬溶液）3 当量に添加した。その後、反応混合物をア
ルゴン雰囲気中室温で２時間撹拌する。ＮＡＰ-15 カラ
ム（Pharmacia ）上でゲル濾過して低分子量成分を分離
し、凍結乾燥することによってビオチニル化物を得た。
収率は40〜90％である。精製のためのＨＰＬＣ、ＨＰＣ
ＥおよびＴＬＣ、同定のためのＬＳＩ−ＭＳ（モルピー
ク）、並びに特異的染色剤（ビオチンに対するｐ−ジメ
チルアミノシンネモンアルデヒド）を使用したＴＬＣに
よって、分析を実施し、含有量を微量分析によって測定
した。
【００３６】実施例２モノクローナル抗体の調製 マウスの免疫 12週令のBalb／ｃマウスに最初、完全Freundアジュバン
ト中の免疫原（Coll Iα2 (１−13)、(1−13、Gln/Pyr)-C
ys-KLHまたは Coll Iα2(1−13、Gln/Pyr)-Cys-BSA）100
μgを用いて腹腔内に免疫した。
【００３７】６週間後、３回の追加免疫ステップを１ヵ
月間隔で腹腔内に実施した。各マウスに不完全Freundア
ジュバント中の免疫原 100μg を投与した。４回目の免
疫の８日後、分析用のマウス血清を得るため、眼窩後方
（retro-orbitally ）から血液を採った。ＢＳＡ担持タ
ンパク質に比較して、ＫＬＨに連結したペプチド（Coll
Iα2(1-13,Gln/Pyr)-Cys-KLH ）で免疫した結果の方が
良好だった。さらに試験をするため、ＫＬＨ免疫原で免
疫した15の利用し得る血清から２種のマウス血清、328/
14および328/11を選択し、さらに詳細に特徴づけを行っ
た 融合の３日前、２日前および前日にＰＢＳ緩衝液中の免
疫原 100μg の静脈投与による追加免疫を実施した。
【００３８】融合およびクローン化 脾臓細胞懸濁液の調製 無菌環境下でマウスの頸部を切って殺し、脾臓を取り出
した。ＲＰＭＩ1640基礎培地中でピンセットによって脾
臓細胞を結合組織から押し出した。細胞懸濁液をスチー
ル篩を通して圧搾し、続いてＲＰＭＩ1640基礎培地とと
もにチューブに入れ、200 gで遠心分離した。
【００３９】融合 免疫されたマウスの脾臓細胞とP3x63Ag8-653骨髄腫細胞
（ATCC-CRL8375）とを１：５の比率で混合し、遠心分離
した（10分、300g、4℃）。細胞をＲＰＭＩ1640基礎培
地で再度洗浄し、50 ml 細先チューブ（tip tube）に入
れて 400g で遠心分離した。上清をデカントし、細胞沈
殿物をほぐし、ＰＥＧ（MG4000,Merck）1mlを添加し、
ピペットを通した。ウォーターバス中に１分置いた後、
ＲＰＭＩ1640基礎培地 5 ml を室温で 5〜6 分かけて滴
下した；この溶液に培地（ＲＰＭＩ1640＋10％ＦＫＳ）
を混合して50 ml になるようにし、続いて 4℃、400gで
10分間遠心分離した。沈殿した細胞を取り出してＲＰＭ
Ｉ1640培地＋10％ＦＣＳ中に入れ、選択培地（ＲＰＭＩ
1640＋10％ＦＣＳ中 100 mM ヒポキサンチン、アザセリ
ン 1μg/ml）（ＦＣＳ＝ウシ胎児血清）1 mlを有する24
ウェルの細胞培養プレートに、１ウェル当たり脾臓細胞
5×104 になるように入れた。 10日後、これらの一次
培養物を特異的抗体合成について試験した（実施例３．
３参照）。対応する特異性を有する一次培養物を96ウェ
ルの細胞培養プレート中でＦＡＣＳ（セルソーター）を
介してクローン化した。この培地に増殖用添加剤として
インターロイキン−６（Boehringer Mannheim,Cat.No.1
271172,100 U/ml ）を添加した。こうして６種のハイブ
リドーマ細胞系を単離した。
【００４０】実施例３ ３．１ マウス血清中の Pepscan測定 マイクロタイタープレート（Nunc製）を熱ＢＳＡストレ
プトアビジンでコーティングし、ＰＢＳ ml 当たり各ビ
オチニル化ペプチド100 ng、0.05％ Tween 20（100 μl
/ウェル）溶液を添加した。以下のペプチドを使用し
た； Coll Iα2(1-13,1Gln),Coll Iα2(1-13,1Pyr),ａ１：こ
の２つのペプチドの混合物 Coll Iα2(1-13,1Gln,Pyr),Coll Iα2(1-8),Coll Iα2
(2-9)....Coll Iα2(14-21)まで。
【００４１】室温で１時間インキュベートした後、混合
物をＰＢＳ、0.05％Tween 20で２回洗浄した。マウス血
清328/14および328/11をＰＢＳ、0.05％Tween 20で1:40
00に希釈し、続いてこの溶液 100μl をペプチドでコー
ティングされたウェル中にピペットで入れ、室温で１時
間インキュベートした。続いてこの溶液をＰＢＳ、0.05
％Tween 20で３回洗浄した。ペプチドに結合した各マウ
ス血清の抗体の検出を実施するため、マウスＦｃ−γに
対するポリクローナルヒツジ抗体のＰＯＤ標識Fab断片
（Boehringer Mannheim,Cat.No.1047523）100μl（濃度
40 mU／ml ＰＢＳ、0.05％Tween 20）を添加した。室
温で１時間インキュベートした後、この溶液をＰＢＳ、
0.05％Tween 20で３回洗浄した。発色試薬（ＡＢＴＳ
（登録商標）、Boehringer Mannheim ,Cat.No.1204521
および1204530 ）100 μl/ウェルを添加し、室温で30分
インキュベートした後、SLT 製マイクロタイタープレー
ト読取り装置で450/490 nmにおける吸光度を測定した。
このPepscan 測定の結果を図１に示す。マウス血清が配
列番号１に相当する完全ペプチドに結合することが明白
に示されている。コラーゲン Iα2 鎖のＮ−末端部分か
らの配列を有する８ペプチドについてのPepscan 分析
は、すべての抗体が配列7-10、すなわちVal-Gly-Leu-Gl
y を認識することを示している。この配列は抗体への結
合を決定づけるエピトープの主成分である。
【００４２】３．２ ＥＩＡ競合試験 マウス血清の抗体および壁面に固定されたペプチドを使
用して、尿中のコラーゲンペプチドを測定するために、
競合原理に従った酵素イムノアッセイを設計することが
可能である。この試験はOstex によるOsteomark （登録
商標）試験と良好な相関性を示す。
【００４３】熱ＢＳＡストレプトアビジンでコーティン
グしたマイクロタイタープレートをビオチニル化ペプチ
ド混合物 Coll Iα2(1-13, 1Gln/Pyr,１：１の混合物）
（100 ng/ml ＰＢＳ，0.05％Tween 20、100μl／ウェル
の割合）でコーティングした。室温で１時間インキュベ
ートした後、溶液をＰＢＳ、0.05％Tween 20で２回洗浄
した。ペプチド混合物 Coll Iα2(1-13, 1Gln/Pyr)のＰ
ＢＳ、0.05％Tween 20による以下の濃度の希釈液を得
た；0,25,50,100,250,500 および1000 ng/ml。それぞれ
のウェルにこの各標準液 50μlおよび希釈マウス血清 5
0μlをピペットで入れ（マウス血清 328/11 、ＰＢＳ、
0.05％Tween 20中 1:4000 に希釈）、混合した。室温で
１時間インキュベートした後、溶液をＰＢＳ、0.05％Tw
een 20で３回洗浄し、続いてPepscan 測定の例で記載し
たように、マウスＦｃγに対するポリクローナル抗体の
ＰＯＤ標識Ｆａｂ断片を使用した測定シグナルを生成さ
せ、呈色反応させた。標準濃度に対する測定シグナルを
プロットして、標準曲線を得た（図２）。
【００４４】試料（尿）の測定 試験は、標準希釈液の代わりに尿 50μlを使用した。そ
の他の試験は標準曲線の場合と同様に実施した。試料の
濃度を検量線から読取り、続いて試料のクレアチニン値
と対照させた。クレアチニン値は、酵素による測定法で
あるBoehringerMannheim 製Creatinin-PAP 試験（Cat.N
o.1178652）を使用して測定した。
【００４５】Ostex 製 Osteomark（登録商標）試験との
比較測定を実施した。略語ＢＣＥは骨コラーゲン当量を
意味する。結果を以下の表１に示す：
【００４６】
【表１】
【００４７】 コラーゲンペプチド濃度［ng/ml］ クレアチニン濃度［μmol]に対照させたコラーゲン
ペプチド濃度［ng/ml］ クレアチニン濃度［nmol］に対照させた骨コラーゲ
ン当量濃度［pmol］ 図３は本発明の試験と Osteomark（登録商標）試験との
相関を示す。相関係数0.925が得られた。
【００４８】骨髄腫細胞と融合させたマウス脾臓細胞 3
28/11 および 328/14 を培地中にまいた。培養物上清 9
/1〜9/12（マウス 328/11 ）および 10/1〜10/4（マウ
ス 328/14 ）について Pepscan分析を実施した。結果を
図４および５に示す。試験操作は以下の変法以外は実施
例３．１に一致させた。 ３．３ 一次培養物におけるPepscan 測定 ビオチン誘導ペプチドとして、ペプチド Coll Iα2(3-1
0)〜Coll Iα2(8-15)のみを使用した。マウス血清に代
えて各種希釈度（ＰＢＳ、0.05％ Tween 20 ）の上清 9
-1〜9-12および 10-1〜10-4を使用した。
【００４９】希釈度は図中に示す。抗体含有培養上清を
使用して標準曲線を得た。尿試料を測定し、骨再吸収マ
ーカー Osteomark（登録商標）との相関性を測定した。
採用した操作のために使用した例は培養上清 9-1（マウ
ス 328/11 ）のモノクローナル抗体を使用したＥＩＡ競
合試験である（実施例３．４）。 ３．４ モノクローナル抗体を使用したＥＩＡ競合試験 熱ＢＳＡストレプトアビジンでコーティングしたマイク
ロタイタープレートをビオチニル化ペプチド Coll Iα2
(6-13)（100 ng/ml ＰＢＳ，0.05％Tween 20、100μl／
ウェルの割合）でコーティングした。室温で１時間イン
キュベートした後、溶液をＰＢＳ、0.05％Tween 20で２
回洗浄した。ペプチド混合物 Coll Iα2(1-13, 1Gln/Py
r)のＰＢＳ、0.05％Tween 20による以下の濃度の希釈液
を得た。0,50,100,200 ng/ml。それぞれのウェルにこの
各標準液 50μlおよび培養上清（ＰＢＳ、0.05％Tween
20中１＋１に希釈）50μl をピペットで入れ、混合し
た。室温で１時間インキュベートした後、溶液をＰＢ
Ｓ、0.05％Tween 20で３回洗浄し、続いてPepscan 測定
の例で記載したように、マウスＦｃγに対するポリクロ
ーナル抗体のＰＯＤ標識Ｆａｂ断片を使用した測定シグ
ナルを生成させ、呈色反応させた。標準濃度に対する測
定シグナルをプロットして、標準曲線を得た。これを図
６に示す。
【００５０】試料（尿）の測定 試験において、標準希釈液の代わりに尿 50μlを使用し
た。その他の試験は標準曲線の場合と同様に実施した。
試料の濃度を検量線から読取り、続いて試料のクレアチ
ニン値と対照させた。クレアチニン測定および Osteoma
rk（登録商標）試験に関しては、実施例３．２における
記述を適用する。結果を以下の表２に示す。Osteomark
（登録商標）試験との相関性を図７に示す。相関係数
0.972が得られた。
【００５１】
【表２】
【００５２】、およびについては表１参照。表３
はその他の培養上清についてのデータを示す。すべての
場合において、 Osteomark（登録商標）試験との極めて
良好な相関性が示された。
【００５３】
【表３】
【００５４】０時：最低標準値 200 ng/ml ：最高標準値 ｒ：相関係数
【００５５】
【発明の効果】本発明により、Ｉ型コラーゲン又はその
断片に含まれるアミノ酸配列Val-Gly-Leu-Gly を特異的
に認識する抗体及び該抗体を作製する方法が提供され
る。本発明の抗体は、骨の溶解を測定するための使用に
有用であり、また、Ｉ型コラーゲン又はその断片を検出
するためのイムノアッセイに用いることができる。
【００５６】さらに、本発明により、配列番号１のアミ
ノ酸配列、又は少なくともアミノ酸配列Val-Gly-Leu-Gl
y を有するその部分配列を含むペプチド又はペプチド誘
導体が提供される。かかるペプチド又はペプチド誘導体
は、抗体作製用、イムノアッセイ用に使用することがで
きる。
【００５７】
【配列表】
配列番号１ 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：
【００５８】
【化１】
【００５９】配列番号２ 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：
【００６０】
【化２】
【図面の簡単な説明】
【図１】Pepscan 測定の結果を示す図である。
【図２】マウスＦｃγに対するポリクローナル抗体のＦ
ａｂフラグメントを使用した測定シグナルの標準曲線を
示す図である。
【図３】図３は本発明の試験と Osteomark試験との相関
を示す図である。
【図４】骨髄腫細胞とマウス脾臓細胞との融合細胞につ
いて Pepscan分析を実施した結果示す図である。
【図５】骨髄腫細胞とマウス脾臓細胞との融合細胞につ
いて Pepscan分析を実施した結果示す図である。
【図６】マウスＦｃγに対するポリクローナル抗体のＦ
ａｂフラグメントを使用した測定シグナルの標準曲線を
示す図である。
【図７】尿の測定について、Osteomark試験との相関性
を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１２月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (72)発明者 ブリジット ドレーガー ドイツ連邦共和国 Ｄ−82327 トゥーツ ィング アム バレイスル 25番地 (72)発明者 ウルリッヒ エシッヒ ドイツ連邦共和国 Ｄ−82152 プラネッ グ ヨゼフ−フォン−ヒルシュ−シュトラ ーセ 51番地 (72)発明者 クリスタ ヒューブナー−パラズ オーストリア国 Ｄ−82327 トゥーツィ ング マリエンシュトラーセ 11番地 (72)発明者 エラスムス フーバー ドイツ連邦共和国 Ｄ−86923 フィニン グ エステー．ヴィリバルト 10番地

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｉ型コラーゲン又はその断片に含まれるア
    ミノ酸配列Val-Gly-Leu-Gly を特異的に認識することを
    特徴とする抗体。
  2. 【請求項２】配列番号１のアミノ酸配列、又は少なくと
    もアミノ酸配列Val-Gly-Leu-Glyを含むその部分配列を
    含むペプチド又はペプチド誘導体で免疫感作を行うこと
    によって得られる請求項１に記載の抗体。
  3. 【請求項３】上記のペプチド又はペプチド誘導体が、少
    なくともアミノ酸６個以上の長さを有することを特徴と
    する請求項２に記載の抗体。
  4. 【請求項４】抗体が、モノクローナル抗体であることを
    特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
  5. 【請求項５】骨の溶解を測定する診断過程における請求
    項１〜３のいずれか１項に記載の抗体の使用。
  6. 【請求項６】請求項１〜４に記載の少なくとも１種の抗
    体を用いる、Ｉ型コラーゲン又はその断片を検出するた
    めのイムノアッセイ。
  7. 【請求項７】競合イムノアッセイの原理に基づいてお
    り、さらに、配列番号１のアミノ酸配列、又は少なくと
    もアミノ酸配列Val-Gly-Leu-Gly を含むその部分配列を
    含むペプチド又はペプチド誘導体を用いる、請求項６に
    記載のイムノアッセイ。
  8. 【請求項８】ＥＩＡ、ＣＥＤＩＡ、ＦＰＩＡ、ＴＩＮＩ
    Ａ、又はＬＰＩＡであることを特徴とする請求項７に記
    載のイムノアッセイ。
  9. 【請求項９】配列番号１のアミノ酸配列又は少なくとも
    アミノ酸配列Val-Gly-Leu-Gly を含むその部分配列を含
    むペプチド又はペプチド誘導体。
  10. 【請求項１０】免疫原担体物質と組み合わせることを特
    徴とする、抗体作製用の請求項９に記載のペプチド又は
    ペプチド誘導体。
  11. 【請求項１１】請求項９又は１０に記載のペプチド又は
    ペプチド誘導体の、抗体を作製するための使用。
  12. 【請求項１２】イムノアッセイにおける、請求項９に記
    載のペプチド又はペプチド誘導体の使用。
  13. 【請求項１３】請求項９又は１０のいずれかに記載の抗
    原で適当な動物を免疫感作し、その動物の血清から所望
    の抗体を単離することによって、Ｉ型コラーゲン又はそ
    の断片に対する抗体を作製する方法。
  14. 【請求項１４】請求項９又は１０のいずれかに記載の抗
    原で適当な動物を免疫感作し、免疫感作した動物の脾細
    胞を不死化し、不死化した脾細胞のうちの所望の抗体を
    産生するものをクローニングし、クローニングした細胞
    又はこれら細胞の上清から抗体を単離することによっ
    て、請求項４に記載のモノクローナル抗体を作製する方
    法。
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Cited By (2)

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