WO2023182353A1 - 免疫学的検出方法及び免疫学的検出キット - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Definitions
- the present invention relates to an immunological detection method and an immunological detection kit.
- This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2022-050823 filed in Japan on March 25, 2022, the contents of which are incorporated herein.
- Type I procollagen-N-propeptide (hereinafter also referred to as “P1NP” or “PINP”) is a type I procollagen-N-propeptide (hereinafter also referred to as “P1NP” or “PINP”). It is a polypeptide with a molecular weight of approximately 35 kDa that is cleaved from the terminal side. PINP released into the blood is known to sensitively reflect early bone formation as a bone formation marker. Therefore, blood PINP concentration is useful for determining and monitoring the therapeutic effects of osteoporosis therapeutics such as PTH (parathyroid hormone) preparations and bisphosphonate drugs. In the measurement of PINP (total PINP), in addition to intact PINP as a trimer, a monomer may also be detected.
- PTH parthyroid hormone
- Type I procollagen-N-propeptide kits include, for example, procollagen Intact PINP (product name, manufactured by Fujirebio Co., Ltd., Non-Patent Document 1) and Excrusis (registered trademark) reagent total P1NP (product name , manufactured by Roche Diagnostics, Non-Patent Document 2) is on sale.
- WO 2005/000001 discloses a method and test kit for determining the presence of the amino-terminal propeptide of procollagen type I in an individual.
- Patent Document 2 discloses an assay method for an intact trimeric ⁇ 1-homotrimeric amino-terminal propeptide of type I procollagen or an intact classical heterotrimeric amino-terminal propeptide of type I procollagen, and in the assay method. Assay kits suitable for use are disclosed.
- Non-Patent Document 3 states that trimeric PINP and monomeric PINP have different clearance routes (trimeric: liver, monomeric: kidney), and in patients with renal disease, monomeric PINP cannot be cleared, resulting in a high level of clearance in the blood. It is disclosed that there is a tendency for the monomer concentration of
- Non-Patent Document 4 discloses that monomeric PINP reflects a degraded product of pN-collagen rather than a heat-denatured product of an intact propeptide.
- Intact PINP Procollagen Intact PINP (hereinafter abbreviated as "Intact PINP") described in Non-Patent Document 1 can detect only the trimer of the ⁇ chain of type I collagen N-terminal propetide.
- Intact PINP is a measurement kit based on radioimmunoassay and uses an antibody labeled with a radioactive isotope ( 125 I). Therefore, it is necessary to perform the measurement in a radiation controlled area, which is complicated and requires about 3 hours. Furthermore, because the half-life of the radioactive isotope (125I) is short at 59.4 days, the kit's shelf life is also short at 2 to 8 degrees Celsius, six weeks.
- total P1NP The Eclusis reagent total P1NP (hereinafter abbreviated as "total P1NP") described in Non-Patent Document 2 can detect trimers and monomers of the ⁇ chain of type I collagen N-terminal propetide.
- total P1NP is a measurement kit based on electrochemical immunoassay (ECLIA), and has become popular because it is easy to handle, does not require a radiation control area, and takes approximately 20 minutes to measure. There is.
- the kit also has a long shelf life of about 18 months at 2 to 8 degrees Celsius. The correlation between Intact PINP and total P1NP is good, and it is thought that there is no large difference in performance.
- the present invention has been made in view of the above circumstances, and is easy to handle and specifically (selectively) removes trimers in biological samples containing trimers and monomers of the ⁇ chain of PINP.
- One of the objects is to provide an immunological detection method and an immunological detection kit that can be used for measurement.
- An immunological detection method of trimeric type I collagen N-terminal propetide in a biological sample comprising: a first antibody that binds to a specific portion of the pro- ⁇ 1 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide; a second antibody that binds to a specific portion of the pro- ⁇ 2 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide;
- An immunological detection method using [2] The first antibody is labeled with a labeling substance, contacting the biological sample and the first antibody to form a first complex; contacting the first complex and the second antibody to form a second complex; Detecting a signal derived from the labeling substance;
- the immunological detection method according to [1] comprising: [3] The second antibody is labeled with a labeling substance, contacting the biological sample and the second antibody to form a first complex; contacting the first complex and the first antibody to form a second complex; Detecting a signal derived from the labeling substance;
- Sequence number 1 QEEGQVEGQD
- Sequence number 2 PDGSESPTDQETT
- the immune system according to any one of [1] to [4], wherein the primary structure of the specific portion of the pro- ⁇ 2 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide includes the sequence shown in SEQ ID NO: 3.
- Scientific detection method Sequence number 3: QSLQEETVRK [6]
- the immunological detection method according to any one of [1] to [5], wherein the first antibody reacts with a portion of the polypeptide consisting of the sequence shown by SEQ ID NO: 4.
- Sequence number 4 JSLQEETVRK [7] The immunological detection method according to [2] or [3], wherein the biological sample is at least one selected from the group consisting of blood, plasma, and serum. [8] The immunological detection method according to any one of [1] to [7], wherein at least one of the first antibody and the second antibody is a monoclonal antibody. [9] The immunological detection method is any one selected from the group consisting of electrochemiluminescence, latex agglutination immunoturbidimetry, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), [1] The immunological detection method according to any one of [8].
- An immunological detection kit for trimeric type I collagen N-terminal propetide in a biological sample comprising: a first antibody that binds to a specific portion of the pro- ⁇ 1 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide; a second antibody that binds to a specific portion of the pro- ⁇ 2 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide; Immunological detection kit, including: [12] The first antibody is labeled with a labeling substance, contacting the biological sample and the first antibody to form a first complex; contacting the first complex and the second antibody to form a second complex; detecting a signal derived from the labeling substance; The immunological detection kit described in [11].
- the second antibody is labeled with a labeling substance, contacting the biological sample and the second antibody to form a first complex; contacting the first complex and the first antibody to form a second complex; detecting a signal derived from the labeling substance;
- Any one of [11] to [13], wherein the primary structure of the specific portion of the pro- ⁇ 1 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide includes the sequence shown by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
- Sequence number 1 QEEGQVEGQD
- Sequence number 2 PDGSESPTDQETT
- the immune system according to any one of [11] to [14], wherein the primary structure of the specific portion of the pro- ⁇ 2 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide includes the sequence shown in SEQ ID NO: 3. Scientific detection kit.
- Sequence number 3 QSLQEETVRK [16]
- the immunological detection kit according to any one of [11] to [15], wherein the first antibody reacts with a portion of the polypeptide consisting of the sequence shown by SEQ ID NO: 4.
- Sequence number 4 JSLQEETVRK [17] The immunological detection kit according to [12] or [13], wherein the biological sample is at least one selected from the group consisting of blood, plasma, and serum. [18] The immunological detection kit according to any one of [11] to [17], wherein at least one of the first antibody and the second antibody is a monoclonal antibody. [19] Using any one immunological detection method selected from the group consisting of electrochemiluminescence, latex agglutination immunoturbidimetry, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), [11] to [18] ] The immunological detection kit according to any one of the above. [20] The immunological detection kit according to any one of [11] to [19], which does not detect monomers of type I collagen N-terminal propetide derived from renal disease patients.
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- an immunological detection method is easy to handle and can specifically (selectively) measure trimers in a sample containing trimers and monomers of the ⁇ chain of PINP. and an immunological detection kit.
- FIG. 2 is a schematic diagram illustrating specific parts of pro- ⁇ 1 chain and pro- ⁇ 2 chain.
- FIG. 2 is a schematic diagram illustrating the amino acid sequence with which antibody S24201 reacts. It is a graph showing the measurement results of osteoporosis patients and healthy subjects by ELISA. It is a graph showing the measurement results of osteoporosis patients and healthy subjects by ELISA. It is a graph showing the measurement results of osteoporosis patients and healthy subjects using commercially available reagents. It is a graph showing the measurement results of osteoporosis patients and kidney disease patients samples by electrochemiluminescence method. It is a graph showing the measurement results of osteoporosis patients and kidney disease patients samples by electrochemiluminescence method.
- the one-letter notation for amino acids is based on IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN), Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides Recommendations 1983, European Journal of Biochemistry, 1984, Vol. 138, p. follow the instructions in 9-37.
- the one-letter notation for "pyroglutamic acid” is "J”. Note that the amino acid sequence is written in the order of N-terminus ⁇ C-terminus.
- the term “detection” or “measurement” is used to include proof of the presence and/or quantification of trimeric type I collagen N-terminal propetide.
- the immunological detection method of the present invention is a method for immunologically detecting trimeric type I collagen N-terminal propetide in a biological sample, which comprises pro- ⁇ 1 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide.
- a first antibody that binds to a specific portion and a second antibody that binds to a specific portion of the pro- ⁇ 2 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide are used.
- the biological sample that can be used in the immunological detection method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample derived from a living body, but preferably a liquid sample such as a body fluid, and at least one sample selected from the group consisting of blood, plasma, and serum. species is more preferred, and any one selected from the group consisting of blood, plasma, and serum is even more preferred.
- the living body is preferably a human or a mammal (eg, mouse, guinea pig, rat, monkey, dog, cat, hamster, horse, cow, and pig), and more preferably a human.
- the biological sample may be one that was collected or prepared during the implementation of the present invention, or one that was collected or prepared in advance and stored.
- the biological sample may normally contain both a trimer and a monomer of type I collagen N-terminal propetide, or may contain only one of a trimer and a monomer, It is not necessary to include either a trimer or a monomer.
- the biological sample may be derived from a subject with decreased renal function.
- Subjects with decreased renal function include chronic kidney disease patients. Renal function can be evaluated, for example, by eGFR value (estimated glomerular filtration rate, unit: mL/min/1.73 m 2 ).
- Trimeric type I collagen N-terminal propetide is a polypeptide with a molecular weight of about 35 kDa that is cleaved from the N-terminal side when type I collagen is generated from the precursor type I procollagen, and ⁇ 1 with a molecular weight of about 15 kDa. It is a heterotrimer consisting of two chains (pro- ⁇ 1 chain) and one ⁇ 2 chain (pro- ⁇ 2 chain) with a molecular weight of approximately 5 kDa.
- the specific portion of the pro- ⁇ 1 chain is a portion with a specific primary structure (amino acid sequence) to which the first antibody binds.
- the primary structure (amino acid sequence) of the specific portion of the pro- ⁇ 1 chain includes, for example, QEEGQVEGQD (SEQ ID NO: 1) or PDGSESPTDQETT (SEQ ID NO: 2) shown in FIG.
- the specific portion of the pro- ⁇ 2 chain is a portion with a specific primary structure (amino acid sequence) to which the second antibody binds.
- the primary structure (amino acid sequence) of the specific portion of the pro- ⁇ 2 chain is, for example, QSLQEETVRK (SEQ ID NO: 3) shown in FIG. Examples include JSLQEETVRK (SEQ ID NO: 4) substituted with pyroglutamic acid residue).
- QSLQEETVRK SEQ ID NO: 3
- Examples include JSLQEETVRK (SEQ ID NO: 4) substituted with pyroglutamic acid residue).
- the N-terminal glutamine side chain is deamidated and condensed to an amino group to produce a cyclic pyroglutamyl residue, and type I collagen subunits also have a pyroglutamic acid residue at the N-terminus.
- the first antibody is not particularly limited as long as it binds to a specific portion of the pro- ⁇ 1 chain; Antibodies that bind to amino acid sequences) are preferred, such as anti-C1A1-01 antibodies and anti-C1A1-02 antibodies.
- the first antibody is a monoclonal antibody.
- Monoclonal antibodies can be produced, for example, by fusing B lymphocytes with immortalized cultured cells to form hybridomas. Monoclonal antibodies are preferable because they are specific and can be expected to produce significantly lower background signals than polyclonal antibodies.
- the anti-C1A1-01 antibody is an antibody prepared by using a peptide having a primary structure represented by SEQ ID NO: 5: QEEGQVEGQDC bound to a carrier protein, ovalbumin, as an immunogen by the method described in the Examples below.
- the hybridoma producing the antibody S24206R shown in Figure 1 was transferred to the National Institute of Technology and Evaluation (NITE), National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Center, Patent Microorganism Depositary (NPMD) (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) at NITE. It has been deposited as BP-03606 (deposit date: February 15, 2022).
- the anti-C1A1-02 is an antibody prepared by the method described in the Examples below using a peptide having a primary structure represented by SEQ ID NO: 6: PDGSESPTDQETTC bound to ovalbumin, a carrier protein, as an immunogen.
- the hybridoma producing antibody S24217 shown in Figure 1 has been deposited with NPMD as NITE BP-03607, and the hybridoma producing antibody S24219 has been deposited with NPMD as NITE BP-03608 (deposit date: February 15, 2022). Day).
- the second antibody is not particularly limited as long as it binds to a specific portion of the pro- ⁇ 2 chain, but for example, an antibody that binds to the primary structure (amino acid sequence) of QSLQEETVRK (SEQ ID NO: 3) shown in FIG. is preferable, and includes, for example, the anti-C1A2-01 antibody shown in FIG.
- the second antibody is a monoclonal antibody.
- Monoclonal antibodies can be produced, for example, by fusing B lymphocytes with immortalized cultured cells to form hybridomas. Monoclonal antibodies are preferable because they are specific and can be expected to produce significantly lower background signals than polyclonal antibodies.
- the anti-C1A2-01 is an antibody prepared by the method described in the Examples below using a peptide having a primary structure represented by SEQ ID NO: 7: JSLQEETVRKC bound to a carrier protein, ovalbumin, as an immunogen.
- the hybridoma producing antibody S24201 shown in FIG. 1 has been deposited at NPMD as NITE BP-03605. As shown in FIG. 2, the antibody S24201 reacts with both polypeptides having the primary structure (amino acid sequence) of QSLQEETVRK (SEQ ID NO: 3) and JSLQEETVRK (SEQ ID NO: 4).
- the detection method is not particularly limited as long as it is an immunological method, but any one selected from the group consisting of electrochemiluminescence, latex agglutination immunoturbidimetry, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is preferred. .
- At least one of the first antibody and the second antibody is preferably labeled with a labeling substance.
- the labeling substance include enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, biotin, avidin, colloidal gold particles, and colored latex.
- the following embodiment (1) or (2) is preferable.
- the first antibody is labeled with a labeling substance, the biological sample and the first antibody are brought into contact to form a first complex, and the first complex and the second antibody are brought into contact with each other. to form a second complex, and a signal derived from the labeling substance is detected.
- a method for detecting a signal derived from a labeling substance can be appropriately selected depending on each labeling substance.
- the immunological detection kit of the present invention is an immunological detection kit for trimeric type I collagen N-terminal propetide in a biological sample, and comprises pro- ⁇ 1 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide.
- the antibody includes a first antibody that binds to a specific portion, and a second antibody that binds to a specific portion of the pro- ⁇ 2 chain in the trimeric type I collagen N-terminal propetide.
- the biological sample, trimeric type I collagen N-terminal propetide, first antibody, and second antibody are as described in the immunological detection method of the present invention.
- the immunological detection kit of the present invention may further include a protocol, a detection device, an analysis device, and the like.
- the immunological detection kit of the present invention is preferable for implementing the above-described immunological detection method of the present invention.
- OVA ovalbumin
- C1A1-01: QEEGQVEGQDC SEQ ID NO: 5
- C1A1-02: PDGSESPTDQETTC SEQ ID NO: 6
- C1A2-01: JSLQEETVRKC (SEQ ID NO: 7)
- Uniprot ID: P08123, type I procollagen ⁇ 2, Q23-Asp32+Cys Q23 was converted to J.
- J represents pyroglutamic acid.
- OPD o-phenylenediamine dihydrochloride
- 1% BSA/PBST blocking solution
- 25 ⁇ L/well of an S24201 antibody solution diluted with 1% BSA/PBST to a concentration of 125 ng/mL was dispensed into each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
- sandwich ELISA A solid-phase antibody prepared at 5 ⁇ g/mL with PBS was dispensed onto an ELISA plate (50 ⁇ L/well) and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
- 1% BSA/PBST blocking solution
- a sample diluted 10 times with 1% BSA/PBST was dispensed (50 ⁇ L/well) and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
- Electrochemiluminescence method (1) Preparation of S24217 antibody solid-phase magnetic particle suspension 10 mg of magnetic particles with a diameter of 3 ⁇ m (manufactured by Sekisui Medical) were washed with PBS to remove the solution. A S24217 antibody solution diluted with PBS so that the absorbance at 280 nm was 0.5 was added to the magnetic particles and stirred at room temperature for 20 hours. The antibody solution was removed and the magnetic particles were washed three times with 1 mL of blocking solution (0.1% BSA, 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.01% Tween-20, 0.05% ProClin300, pH 7.2). 500 ⁇ L of blocking solution was added, and after stirring at room temperature for 16 hours, the solution was diluted to 0.5 mg/mL with the blocking solution to obtain an S24217 antibody solid phase magnetic particle suspension.
- blocking solution (0.1% BSA, 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.01% Tween-20
- ruthenium (Ru) complex-labeled S24201 antibody solution S24201 antibody was prepared in PBS to a concentration of 2.0 mg/mL, and while stirring, 20 equivalents of bis(2,2'- A small amount of ruthenium (II) bis(hexafluorophosphate) (hereinafter referred to as Ru complex NHS, manufactured by Tokyo Kasei) The mixture was dissolved in DMSO and added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes while shielded from light. While stirring, 2M glycine was added so that the molar ratio of glycine to Ru complex NHS was 2:1, and the mixture was stirred for 20 minutes while shielding from light.
- Ru complex NHS bis(2,2'- A small amount of ruthenium (II) bis(hexafluorophosphate)
- the Ru complex not bound to the antibody was removed from the resulting solution and diluted to 1 ⁇ g/mL with a blocking solution to obtain a Ru complex-labeled S24201 antibody solution.
- Electrochemiluminescence measurement For measurement, a fully automatic electrochemiluminescence immunoassay device Picolumi III (manufactured by Sekisui Medical) was used. 100 ⁇ L of a blocking solution containing mouse IgG and 5 ⁇ L of a measurement sample were added to a reaction tube. 25 ⁇ L of S24217 antibody solid phase magnetic particle suspension was added and reacted at 28° C. for 5 minutes. After BF separation using a BF separation solution specified by the device, 100 ⁇ L of Ru complex-labeled S24201 antibody solution was added and reacted for 3 minutes. After BF separation, the magnetic particles were suspended in a substrate (tripropylamine) solution specified by the device, and chemiluminescence generated by applying electricity at a predetermined location in the device was detected.
- a substrate tripropylamine
- Example 1 ⁇ Reactivity between the acquired anti- ⁇ 2 chain antibody and peptide>
- Example 2 ⁇ Measurement of specimens from osteoporosis patients and healthy individuals using ELISA> Sixteen samples from healthy individuals and 22 samples from osteoporosis patients without renal disease were used. A sandwich ELISA was performed using the antibody combinations in Table 3. The same specimen was also measured with procollagen Intact PINP and Ecrusis reagent total P1NP.
- Example 3 ⁇ Measurement of specimens from osteoporosis patients and renal disease patients using electrochemiluminescence method> Ten specimens derived from renal disease patients and seven specimens derived from osteoporosis patients were used. P1NP measurement values were determined by electrochemiluminescence using S24217 as a solid-phase antibody and S24201 as a Ru complex-labeled antibody, using serial dilutions of serum from patients with cancer bone metastasis with high P1NP values determined using the Ecrusis reagent total P1NP as a standard product. was calculated. The results are shown in FIGS. 6 and 7.
- Example 4 ⁇ Measurement of kidney disease patient specimens by ELISA> Three samples from healthy individuals, 10 samples from osteoporotic patients without kidney disease, and 75 samples from kidney disease patients were used. A sandwich ELISA was performed using the antibody combinations in Table 3. The same specimen was also measured with procollagen Intact PINP and Ecrusis reagent total P1NP.
- the correlation between the Ecrusis reagent total P1NP measurement value and the procollagen Intact PINP measurement value was particularly poor in samples from patients with severe renal disease.
- stage of renal disease chronic kidney disease
- eGFR unit: mL/min/1.73 m 2
- Stage 2 eGFR 60-89
- Stage 3a eGFR 45-59
- Stage 3b eGFR 30-44
- Stage 4 eGFR 15-29
- J represents pyroglutamic acid
- NPMD NITE BP-03606
- NPMD NITE BP-03608 NPMD NITE BP-03605
- NPMD is an acronym indicating the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan).
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Abstract
本発明により、生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出方法であって、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、を用いる、免疫学的検出方法が提供される。前記免疫学的検出方法は、取扱いが簡便であり、かつ、ＰＩＮＰのα鎖の三量体及び単量体を含む生体試料中の三量体を特異的（選択的）に測定できる。
Description
本発明は、免疫学的検出方法及び免疫学的検出キットに関する。
本願は、２０２２年３月２５日に、日本に出願された特願２０２２－０５０８２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０２２年３月２５日に、日本に出願された特願２０２２－０５０８２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
Ｉ型プロコラーゲン－Ｎ－プロペプチド（以下「Ｐ１ＮＰ」又は「ＰＩＮＰ」とも記す。）は、骨基質タンパク質の主要成分であるＩ型コラーゲンが前駆体のＩ型プロコラーゲンから生成される際にＮ末端側から切断される、分子量約３５ｋＤａのポリペプチドである。血中に放出されたＰＩＮＰは、骨形成マーカーとして、早期の骨形成を鋭敏に反映することが知られている。そのため、血中ＰＩＮＰ濃度は、ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ））製剤及びビスホスホネート系薬剤等の骨粗鬆症治療薬による治療効果の判定及びモニタリングに有用である。ＰＩＮＰ（ｔｏｔａｌ ＰＩＮＰ）の測定では、三量体としてのｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰに加え、単量体も検出されることがある。
Ｉ型プロコラーゲン－Ｎ－プロペプチドキット（一般名称）として、例えば、プロコラーゲン Ｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ（製品名、富士レビオ社製、非特許文献１）及びエクスクルーシス（登録商標）試薬 ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ（製品名、ロシュ・ダイアグノスティックス社製、非特許文献２）が販売されている。
特許文献１には、個人におけるプロコラーゲンタイプＩのアミノ末端プロペプチドの存在を決定するための方法及び試験キットが開示されている。
特許文献２には、Ｉ型プロコラーゲンのインタクトなトリマーのα１－ホモトリマー形アミノ末端プロペプチド又はＩ型プロコラーゲンのインタクトな古典型のヘテロトリマー形アミノ末端プロペプチドのアッセイ法及び前記アッセイ法において用いるのに適したアッセイキットが開示されている。
非特許文献３には、三量体ＰＩＮＰと単量体ＰＩＮＰはクリアランス経路が異なり（三量体：肝臓、単量体：腎臓）、腎疾患患者では単量体のクリアランスができず、血中の単量体濃度が高くなる傾向があることが開示されている。
非特許文献４には、単量体ＰＩＮＰがインタクトなプロペプチドの熱変性物よりもむしろｐＮ－コラーゲンの分解物を反映していることが開示されている。
富士レビオ株式会社、「Ｉ型プロコラーゲン－Ｎ－プロペプチドキット プロコラーゲン Ｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ」添付文書（第１３版）、２０２０年２月
ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、「Ｉ型プロコラーゲン－Ｎ－プロペプチドキット エクルーシス試薬（Ｒ） ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ」添付文書（第９版）、２０２１年３月
Ｋｏｉｖｕｌａ，Ｍ．－Ｋ．，外２名、"Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ （ＰＩＮＰ） ｉｎ ｓｅｒｕｍ"、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２年８月、第４５巻、第１２号、ｐ．９２０－９２７
Ｋｏｉｖｕｌａ，Ｍ．－Ｋ．，外７名、"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｏｔａｌ ａｎｄ ｉｎｔａｃｔ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＮ－ｃｏｌｌａｇｅｎ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ"、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１０年１月、第４７巻、第１号、ｐ．６７－７１
非特許文献１に記載のプロコラーゲン Ｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ（以下「Ｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ」と略記する。）は、Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドのα鎖の三量体のみを検出できる。Ｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰは、ラジオイムノアッセイ法に基づく測定キットであり、放射性同位体（１２５Ｉ）で標識した抗体を用いる。そのため、放射線管理区域で測定を行う必要があり、測定時間として約３時間を要するなど、煩雑である。また、放射性同位体（１２５Ｉ）の半減期が５９．４日と短いため、キットの有効期間も２～８℃で６週間と短くなっている。
非特許文献２に記載のエクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ（以下「ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ」と略記する。）は、Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドのα鎖の三量体及び単量体を検出できる。ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰは、電気化学免疫測定法（ＥＣＬＩＡ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）に基づく測定キットであり、放射線管理区画が不要で、測定時間が約２０分であるなど、取扱いが簡便であることから、普及している。また、キットの有効期間も２～８℃で約１８ヶ月と長くなっている。
Ｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰとｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰの相関は良好であり、性能の大きな差はないと考えられている。
非特許文献２に記載のエクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ（以下「ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ」と略記する。）は、Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドのα鎖の三量体及び単量体を検出できる。ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰは、電気化学免疫測定法（ＥＣＬＩＡ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）に基づく測定キットであり、放射線管理区画が不要で、測定時間が約２０分であるなど、取扱いが簡便であることから、普及している。また、キットの有効期間も２～８℃で約１８ヶ月と長くなっている。
Ｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰとｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰの相関は良好であり、性能の大きな差はないと考えられている。
しかし、腎疾患患者においては、Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドのα鎖の単量体のクリアランスができないため、ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰでは腎疾患患者由来の検体のＰＩＮＰ値が高く測定される。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、取扱いが簡便であり、かつ、ＰＩＮＰのα鎖の三量体及び単量体を含む生体試料中の三量体を特異的（選択的）に測定できる、免疫学的検出方法及び免疫学的検出キットを提供することを目的の一つとする。
［１］ 生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出方法であって、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、
を用いる、免疫学的検出方法。
［２］ 前記第１の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第１の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成する工程と、
前記第１の複合体と前記第２の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成する工程と、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する工程と、
を備える、［１］に記載の免疫学的検出方法。
［３］ 前記第２の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第２の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成する工程と、
前記第１の複合体と前記第１の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成する工程と、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する工程と、
を備える、［１］に記載の免疫学的検出方法。
［４］ 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分の一次構造が配列番号１又は配列番号２で示される配列を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
配列番号１：ＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤ
配列番号２：ＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴ
［５］ 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分の一次構造が配列番号３で示される配列を含む、［１］～［４］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
配列番号３：ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ
［６］ 前記第１の抗体がポリペプチドの配列番号４で示される配列からなる部分と反応する、［１］～［５］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
配列番号４：ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ
［７］ 前記生体試料が、血液、血漿及び血清からなる群から選択される少なくとも１種である、［２］又は［３］に記載の免疫学的検出方法。
［８］ 前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、［１］～［７］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
［９］ 前記免疫学的検出方法が、電気化学発光法、ラテックス凝集免疫比濁法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法からなる群から選択されるいずれか１種である、［１］～［８］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
［１０］ 腎疾患患者由来のＩ型コラーゲンＮ末端プロペチドの単量体を検出しない、［１］～［９］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
［１１］ 生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出キットであって、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、
を含む、免疫学的検出キット。
［１２］ 前記第１の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第１の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成し、
前記第１の複合体と前記第２の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成し、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する、
［１１］に記載の免疫学的検出キット。
［１３］ 前記第２の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第２の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成し、
前記第１の複合体と前記第１の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成し、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する、
［１１］に記載の免疫学的検出キット。
［１４］ 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分の一次構造が配列番号１又は配列番号２で示される配列を含む、［１１］～［１３］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
配列番号１：ＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤ
配列番号２：ＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴ
［１５］ 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分の一次構造が配列番号３で示される配列を含む、［１１］～［１４］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
配列番号３：ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ
［１６］ 前記第１の抗体がポリペプチドの配列番号４で示される配列からなる部分と反応する、［１１］～［１５］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
配列番号４：ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ
［１７］ 前記生体試料が、血液、血漿及び血清からなる群から選択される少なくとも１種である、［１２］又は［１３］に記載の免疫学的検出キット。
［１８］ 前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、［１１］～［１７］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
［１９］ 電気化学発光法、ラテックス凝集免疫比濁法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法からなる群から選択されるいずれか１種の免疫学的検出方法を用いる、［１１］～［１８］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
［２０］ 腎疾患患者由来のＩ型コラーゲンＮ末端プロペチドの単量体を検出しない、［１１］～［１９］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、
を用いる、免疫学的検出方法。
［２］ 前記第１の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第１の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成する工程と、
前記第１の複合体と前記第２の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成する工程と、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する工程と、
を備える、［１］に記載の免疫学的検出方法。
［３］ 前記第２の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第２の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成する工程と、
前記第１の複合体と前記第１の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成する工程と、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する工程と、
を備える、［１］に記載の免疫学的検出方法。
［４］ 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分の一次構造が配列番号１又は配列番号２で示される配列を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
配列番号１：ＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤ
配列番号２：ＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴ
［５］ 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分の一次構造が配列番号３で示される配列を含む、［１］～［４］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
配列番号３：ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ
［６］ 前記第１の抗体がポリペプチドの配列番号４で示される配列からなる部分と反応する、［１］～［５］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
配列番号４：ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ
［７］ 前記生体試料が、血液、血漿及び血清からなる群から選択される少なくとも１種である、［２］又は［３］に記載の免疫学的検出方法。
［８］ 前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、［１］～［７］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
［９］ 前記免疫学的検出方法が、電気化学発光法、ラテックス凝集免疫比濁法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法からなる群から選択されるいずれか１種である、［１］～［８］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
［１０］ 腎疾患患者由来のＩ型コラーゲンＮ末端プロペチドの単量体を検出しない、［１］～［９］のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
［１１］ 生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出キットであって、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、
を含む、免疫学的検出キット。
［１２］ 前記第１の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第１の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成し、
前記第１の複合体と前記第２の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成し、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する、
［１１］に記載の免疫学的検出キット。
［１３］ 前記第２の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第２の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成し、
前記第１の複合体と前記第１の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成し、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する、
［１１］に記載の免疫学的検出キット。
［１４］ 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分の一次構造が配列番号１又は配列番号２で示される配列を含む、［１１］～［１３］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
配列番号１：ＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤ
配列番号２：ＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴ
［１５］ 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分の一次構造が配列番号３で示される配列を含む、［１１］～［１４］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
配列番号３：ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ
［１６］ 前記第１の抗体がポリペプチドの配列番号４で示される配列からなる部分と反応する、［１１］～［１５］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
配列番号４：ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ
［１７］ 前記生体試料が、血液、血漿及び血清からなる群から選択される少なくとも１種である、［１２］又は［１３］に記載の免疫学的検出キット。
［１８］ 前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、［１１］～［１７］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
［１９］ 電気化学発光法、ラテックス凝集免疫比濁法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法からなる群から選択されるいずれか１種の免疫学的検出方法を用いる、［１１］～［１８］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
［２０］ 腎疾患患者由来のＩ型コラーゲンＮ末端プロペチドの単量体を検出しない、［１１］～［１９］のいずれかに記載の免疫学的検出キット。
本発明によれば、取扱いが簡便であり、かつ、ＰＩＮＰのα鎖の三量体及び単量体を含む検体中の三量体を特異的（選択的）に測定できる、免疫学的検出方法及び免疫学的検出キットが提供される。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明は後述する実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変形及び置換を加えることができる。
本発明において、アミノ酸の１文字表記は、IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)、Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides Recommendations 1983、European Journal of Biochemistry、1984年、第138巻、ｐ．9-37の記載に従う。ただし、「ピログルタミン酸」の１文字表記は「Ｊ」とする。なお、アミノ酸配列はＮ末端→Ｃ末端の順で記載する。
本発明において、抗体と抗原との反応性について、「反応する」、「認識する」、及び「結合する」は、同義の意味で用いられる。本開示の抗体とある化合物とが「反応しない」とは、ある化合物と実質的に反応しないことをいう。例えば、後述する実施例では、測定値が検出限界未満である場合に「反応しない」という。
本発明において、「検出」又は「測定」という用語は、三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの存在の証明及び／又は定量などを含める意味で用いられる。
［免疫学的検出方法］
本発明の免疫学的検出方法は、生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出方法であって、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、を用いる。
本発明の免疫学的検出方法は、生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出方法であって、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、を用いる。
〈生体試料〉
本発明の免疫学的検出方法において使用可能な生体試料は、生体由来の試料であれば特に限定されないが、体液等の液体試料が好ましく、血液、血漿及び血清からなる群から選択される少なくとも１種がより好ましく、血液、血漿及び血清からなる群から選択されるいずれか１種がさらに好ましい。前記生体としては、ヒト又は哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）が好ましく、ヒトがより好ましい。前記生体試料は、本発明の実施時に採取又は調製されたものでもよく、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。前記生体試料は、通常、Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの三量体及び単量体の両方を含んでいてもよいが、三量体及び単量体のいずれか一方のみを含んでいてもよく、三量体及び単量体のいずれも含まなくてもよい。
本発明の免疫学的検出方法において使用可能な生体試料は、生体由来の試料であれば特に限定されないが、体液等の液体試料が好ましく、血液、血漿及び血清からなる群から選択される少なくとも１種がより好ましく、血液、血漿及び血清からなる群から選択されるいずれか１種がさらに好ましい。前記生体としては、ヒト又は哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）が好ましく、ヒトがより好ましい。前記生体試料は、本発明の実施時に採取又は調製されたものでもよく、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。前記生体試料は、通常、Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの三量体及び単量体の両方を含んでいてもよいが、三量体及び単量体のいずれか一方のみを含んでいてもよく、三量体及び単量体のいずれも含まなくてもよい。
前記生体試料は、腎機能が低下している対象に由来するものであってもよい。腎機能が低下している対象としては、慢性腎臓病患者が挙げられる。腎機能は、例えば、ｅＧＦＲ値（推算糸球体濾過量、単位：ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）によって評価することができる。
ｅＧＦＲ≧９０ 正常
ｅＧＦＲ＝６０～８９ 軽度の腎機能低下
ｅＧＦＲ＝３０～５９ 中等度の腎機能低下
ｅＧＦＲ＝１５～２９ 高度の腎機能低下
ｅＧＦＲ＜１５ 末期腎不全
ｅＧＦＲ≧９０ 正常
ｅＧＦＲ＝６０～８９ 軽度の腎機能低下
ｅＧＦＲ＝３０～５９ 中等度の腎機能低下
ｅＧＦＲ＝１５～２９ 高度の腎機能低下
ｅＧＦＲ＜１５ 末期腎不全
〈三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド〉
三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドは、Ｉ型コラーゲンが前駆体のＩ型プロコラーゲンから生成される際にＮ末端側から切断される、分子量約３５ｋＤａのポリペプチドであり、分子量約１５ｋＤａのα１鎖（ｐｒｏ－α１鎖）２本と、分子量約５ｋＤａのα２鎖（ｐｒｏ－α２鎖）１本からなるヘテロ三量体である。
三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドは、Ｉ型コラーゲンが前駆体のＩ型プロコラーゲンから生成される際にＮ末端側から切断される、分子量約３５ｋＤａのポリペプチドであり、分子量約１５ｋＤａのα１鎖（ｐｒｏ－α１鎖）２本と、分子量約５ｋＤａのα２鎖（ｐｒｏ－α２鎖）１本からなるヘテロ三量体である。
前記ｐｒｏ－α１鎖の特定部分は、前記第１の抗体が結合する特定の一次構造（アミノ酸配列）を持つ部分である。前記ｐｒｏ－α１鎖の特定部分の一次構造（アミノ酸配列）としては、例えば、図１に示すＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤ（配列番号１）又はＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴ（配列番号２）が挙げられる。
前記ｐｒｏ－α２鎖の特定部分は、前記第２の抗体が結合する特定の一次構造（アミノ酸配列）を持つ部分である。前記ｐｒｏ－α２鎖の特定部分の一次構造（アミノ酸配列）としては、例えば、図１に示すＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ（配列番号３）又は配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端のＱ（グルタミン残基）をＪ（ピログルタミン酸残基）に置換したＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ（配列番号４）が挙げられる。生体中では、Ｎ末端のグルタミン側鎖の脱アミドとアミノ基への縮合が生じ、環状のピログルタミル残基を生じることが知られており、Ｉ型コラーゲンのサブユニットもＮ末端がピログルタミン酸残基となっている（佐藤健司，清野珠美、「食品中の修飾ペプチド－ピログルタミルペプチドの構造・機能」、Ｆｏｏｄｓ ＆ ｆｏｏｄ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｊｏｕｒｎａｌ、２０１７年、第２２２巻、第３号、ｐ．２１６－２２２）。
〈第１の抗体〉
前記第１の抗体は、前記ｐｒｏ－α１鎖の特定部分に結合するものであれば特に限定されないが、例えば、図１に示すＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤＣ（配列番号５）又はＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴＣ（配列番号６）の一次構造（アミノ酸配列）に結合する抗体が好ましく、例えば、抗Ｃ１Ａ１－０１抗体及び抗Ｃ１Ａ１－０２抗体が挙げられる。
前記第１の抗体は、前記ｐｒｏ－α１鎖の特定部分に結合するものであれば特に限定されないが、例えば、図１に示すＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤＣ（配列番号５）又はＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴＣ（配列番号６）の一次構造（アミノ酸配列）に結合する抗体が好ましく、例えば、抗Ｃ１Ａ１－０１抗体及び抗Ｃ１Ａ１－０２抗体が挙げられる。
前記第１の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、例えば、Ｂリンパ球と不死化した培養細胞とを融合し、ハイブリドーマを形成させることによって作成することができる。モノクローナル抗体は特異的であるため、ポリクローナル抗体よりもバックグラウンドシグナルが著しく低いことが期待できるため好ましい。
前記抗Ｃ１Ａ１－０１抗体は、配列番号５：ＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤＣで表される一次構造のペプチドにキャリアタンパク質であるオボアルブミンを結合させたものを免疫原として、後述する実施例の方法により調製した抗体である。図１に示す抗体Ｓ２４２０６Ｒを産生するハイブリドーマは、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）にＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０６として寄託されている（寄託日：２０２２年２月１５日）。
前記抗Ｃ１Ａ１－０２は、配列番号６：ＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴＣで表される一次構造のペプチドにキャリアタンパク質であるオボアルブミンを結合させたものを免疫原として、後述する実施例の方法により調製した抗体である。図１に示す抗体Ｓ２４２１７を産生するハイブリドーマは、ＮＰＭＤにＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０７として、抗体Ｓ２４２１９を産生するハイブリドーマは、ＮＰＭＤにＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０８として、それぞれ寄託されている（寄託日：２０２２年２月１５日）。
〈第２の抗体〉
前記第２の抗体は、前記ｐｒｏ－α２鎖の特定部分に結合するものであれば特に限定されないが、例えば、図１に示すＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ（配列番号３）の一次構造（アミノ酸配列）に結合する抗体が好ましく、例えば、図１に示す抗Ｃ１Ａ２－０１抗体が挙げられる。
前記第２の抗体は、前記ｐｒｏ－α２鎖の特定部分に結合するものであれば特に限定されないが、例えば、図１に示すＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ（配列番号３）の一次構造（アミノ酸配列）に結合する抗体が好ましく、例えば、図１に示す抗Ｃ１Ａ２－０１抗体が挙げられる。
前記第２の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、例えば、Ｂリンパ球と不死化した培養細胞とを融合し、ハイブリドーマを形成させることによって作成することができる。モノクローナル抗体は特異的であるため、ポリクローナル抗体よりもバックグラウンドシグナルが著しく低いことが期待できるため好ましい。
前記抗Ｃ１Ａ２－０１は、配列番号７：ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫＣで表される一次構造のペプチドにキャリアタンパク質であるオボアルブミンを結合させたものを免疫原として、後述する実施例の方法により調製した抗体である。図１に示す抗体Ｓ２４２０１を産生するハイブリドーマは、ＮＰＭＤにＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０５として寄託されている。
前記抗体Ｓ２４２０１は、図２に示すように、一次構造（アミノ酸配列）がＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ（配列番号３）、ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ（配列番号４）のいずれのポリペプチドにも反応する。
前記抗体Ｓ２４２０１は、図２に示すように、一次構造（アミノ酸配列）がＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ（配列番号３）、ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ（配列番号４）のいずれのポリペプチドにも反応する。
〈検出方法〉
検出方法は、免疫学的方法であれば特に限定されないが、電気化学発光法、ラテックス凝集免疫比濁法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法からなる群から選択されるいずれか１種が好ましい。
検出方法は、免疫学的方法であれば特に限定されないが、電気化学発光法、ラテックス凝集免疫比濁法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法からなる群から選択されるいずれか１種が好ましい。
検出のため、前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方は標識物質により標識されていることが好ましい。前記標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、金コロイド粒子、又は着色ラテックスなどが挙げられる。
本発明の検出方法では、以下の（１）又は（２）の態様が好ましい。
（１）前記第１の抗体を標識物質により標識し、前記生体試料と前記第１の抗体とを接触させて第１の複合体を形成し、前記第１の複合体と前記第２の抗体とを接触させて第２の複合体を形成し、前記標識物質に由来するシグナルを検出する。
（２）前記第２の抗体を標識物質により標識し、前記生体試料と前記第２の抗体とを接触させて第１の複合体を形成し、前記第１の複合体と前記第１の抗体とを接触させて第２の複合体を形成し、前記標識物質に由来するシグナルを検出する。
標識物質に由来するシグナルの検出方法は、それぞれの標識物質に応じて適宜選択することができる。
（１）前記第１の抗体を標識物質により標識し、前記生体試料と前記第１の抗体とを接触させて第１の複合体を形成し、前記第１の複合体と前記第２の抗体とを接触させて第２の複合体を形成し、前記標識物質に由来するシグナルを検出する。
（２）前記第２の抗体を標識物質により標識し、前記生体試料と前記第２の抗体とを接触させて第１の複合体を形成し、前記第１の複合体と前記第１の抗体とを接触させて第２の複合体を形成し、前記標識物質に由来するシグナルを検出する。
標識物質に由来するシグナルの検出方法は、それぞれの標識物質に応じて適宜選択することができる。
［免疫学的検出キット］
本発明の免疫学的検出キットは、生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出キットであって、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、を含む。
本発明の免疫学的検出キットは、生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出キットであって、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、を含む。
生体試料、三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド、第１の抗体、及び第２の抗体は、本発明の免疫学的検出方法において説明したとおりである。
本発明の免疫学的検出キットは、さらに、プロトコール、検出装置、解析装置等を含んでいてもよい。
本発明の免疫学的検出キットは、上述した本発明の免疫学的検出方法を実施するために好ましい。
以下では実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は後述する実施例に限定されるものではない。
１．免疫原の調製
下記ペプチドにキャリアタンパク質であるオボアルブミン（ＯＶＡ）を結合させたものを免疫原として調製した。
Ｃ１Ａ１－０１：ＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤＣ（配列番号５）
Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０２４５２，Ｉ型プロコラーゲンα１，Ｇｌｎ２３－Ａｓｐ３２＋Ｃｙｓ
Ｃ１Ａ１－０２：ＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴＣ（配列番号６）
Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０２４５２，Ｉ型プロコラーゲンα１，Ｐｒｏ９６－Ｔｈｒ１０８＋Ｃｙｓ
Ｃ１Ａ２－０１：ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫＣ（配列番号７）
Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０８１２３，Ｉ型プロコラーゲンα２，Ｑ２３－Ａｓｐ３２＋Ｃｙｓ
Ｑ２３をＪに変換した。配列番号７中、Ｊはピログルタミン酸を表す。
下記ペプチドにキャリアタンパク質であるオボアルブミン（ＯＶＡ）を結合させたものを免疫原として調製した。
Ｃ１Ａ１－０１：ＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤＣ（配列番号５）
Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０２４５２，Ｉ型プロコラーゲンα１，Ｇｌｎ２３－Ａｓｐ３２＋Ｃｙｓ
Ｃ１Ａ１－０２：ＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴＣ（配列番号６）
Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０２４５２，Ｉ型プロコラーゲンα１，Ｐｒｏ９６－Ｔｈｒ１０８＋Ｃｙｓ
Ｃ１Ａ２－０１：ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫＣ（配列番号７）
Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０８１２３，Ｉ型プロコラーゲンα２，Ｑ２３－Ａｓｐ３２＋Ｃｙｓ
Ｑ２３をＪに変換した。配列番号７中、Ｊはピログルタミン酸を表す。
（１）Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＯＶＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）に０．２ｍＬの精製水を添加し、１０ｍｇ／ｍＬの溶液とした。
（２）２ｍｇのペプチド（Ｃ１Ａ１－０１，Ｃ１Ａ１－０２）を０．２ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）にそれぞれ溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド溶液を得た。また、２ｍｇのペプチド（Ｃ１Ａ２－０１）を少量のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させた後、ＰＢＳを添加して３．３ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド溶液を得た。
（３）（１）と（２）で得た３種類のペプチド溶液をそれぞれ混合し、室温で２時間撹拌した。
（４）５００ｍＬのＰＢＳで２回透析し、Ｃ１Ａ１－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ２－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ１－０２－ＯＶＡ溶液を得た。
（２）２ｍｇのペプチド（Ｃ１Ａ１－０１，Ｃ１Ａ１－０２）を０．２ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）にそれぞれ溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド溶液を得た。また、２ｍｇのペプチド（Ｃ１Ａ２－０１）を少量のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させた後、ＰＢＳを添加して３．３ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド溶液を得た。
（３）（１）と（２）で得た３種類のペプチド溶液をそれぞれ混合し、室温で２時間撹拌した。
（４）５００ｍＬのＰＢＳで２回透析し、Ｃ１Ａ１－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ２－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ１－０２－ＯＶＡ溶液を得た。
２．抗体の取得
Ｃ１Ａ１－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ２－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ１－０２－ＯＶＡを免疫原とし、初回免疫はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２回目免疫以降はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１：１で混合して用いた。６週齢（♀）のＢａｌｂ／ｃマウス（日本クレア）又はＦ３４４／Ｊｃ１ラット（日本クレア）に、初回は４０μｇ、２回目以降は２０μｇの免疫原を２週間毎に皮下免疫した。免疫は８週間継続した。以下の手順で抗原固相化ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）を実施し、血中抗体力価を確認した。
Ｃ１Ａ１－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ２－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ１－０２－ＯＶＡを免疫原とし、初回免疫はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２回目免疫以降はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１：１で混合して用いた。６週齢（♀）のＢａｌｂ／ｃマウス（日本クレア）又はＦ３４４／Ｊｃ１ラット（日本クレア）に、初回は４０μｇ、２回目以降は２０μｇの免疫原を２週間毎に皮下免疫した。免疫は８週間継続した。以下の手順で抗原固相化ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）を実施し、血中抗体力価を確認した。
（１）９６穴プレートに、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調製したＣ１Ａ１－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ２－０１－ＯＶＡ、Ｃ１Ａ１－０２－ＯＶＡ溶液をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で２時間静置した。
（２）４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（ツイーン（登録商標）入りリン酸緩衝食塩水）で３回洗浄後、で１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（ブロッキング液）を分注し、室温で１時間静置した。
（３）ブロッキング液を除去後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで５００～１２１５００倍に希釈した各免疫動物の抗血清溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間静置した。
（４）抗血清溶液を除去し、４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで９５０００倍希釈したＧｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）又は１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで８５００倍希釈したＧｔ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間静置した。
（５）抗体溶液を除去し、４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、５０μＬ／ｗｅｌｌでＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩）発色液を分注し、室温で１０分間静置した。
（６）５０μＬ／ｗｅｌｌで停止液を分注し、反応停止後、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
（２）４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（ツイーン（登録商標）入りリン酸緩衝食塩水）で３回洗浄後、で１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（ブロッキング液）を分注し、室温で１時間静置した。
（３）ブロッキング液を除去後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで５００～１２１５００倍に希釈した各免疫動物の抗血清溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間静置した。
（４）抗血清溶液を除去し、４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで９５０００倍希釈したＧｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）又は１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで８５００倍希釈したＧｔ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間静置した。
（５）抗体溶液を除去し、４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、５０μＬ／ｗｅｌｌでＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩）発色液を分注し、室温で１０分間静置した。
（６）５０μＬ／ｗｅｌｌで停止液を分注し、反応停止後、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
十分な抗体力価上昇が確認できた個体について、解剖の１～３日前にＰＢＳで希釈した各種免疫原５０μｇを腹腔免疫した。その後、脾臓細胞、腸骨リンパ節細胞及び鼠径部リンパ節細胞を回収し、電気融合法によりミエローマ細胞ＳＰ２／０と融合した。融合細胞は９６穴プレートで培養し、融合から７又は８日後に培養上清を回収した。抗血清溶液を培養上清に替えて前記抗原固相化ＥＬＩＳＡを実施し、免疫原に反応する抗体を産生する細胞株を選択し、下記４クローンの抗体を得た。
３．競合ＥＬＩＳＡ
Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）に０．２ｍＬの精製水を添加し、１０ｍｇ／ｍＬの溶液とした。２ｍｇのＣ１Ａ２－０１ペプチドを少量のＤＭＳＯに溶解させた後、ＰＢＳを添加して３．３ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したペプチド溶液を得添加し、室温で２時間撹拌した。ＰＢＳで透析し、Ｃ１Ａ２－０１－ＢＳＡを得た。
９６穴プレートに、ＰＢＳで２５ｎｇ／ｍＬに調製したＣ１Ａ１－０２－ＢＳＡ溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で２時間静置した。４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（ブロッキング液）を分注し、室温で１時間静置した。ブロッキング液を除去後、０．３２～５０００ｎｇ／ｍＬの濃度で１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴに溶解したペプチドＣ１Ａ２－０２（ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ：配列番号４）又はペプチドＣ１Ａ２－０３（ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ：配列番号３）溶液２５μＬ／ｗｅｌｌと１２５ｎｇ／ｍＬの濃度に１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈したＳ２４２０１抗体溶液２５μＬ／ｗｅｌｌを分注し、室温で１時間静置した。ペプチド・抗体溶液を除去し４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで８０００倍希釈したＧｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間静置した。抗体溶液を除去し４００ μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、５０μＬ／ｗｅｌｌでＯＰＤ発色液を分注し、室温で１０分間静置した。５０μＬ／ｗｅｌｌで停止液を分注し、反応停止後、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）に０．２ｍＬの精製水を添加し、１０ｍｇ／ｍＬの溶液とした。２ｍｇのＣ１Ａ２－０１ペプチドを少量のＤＭＳＯに溶解させた後、ＰＢＳを添加して３．３ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したペプチド溶液を得添加し、室温で２時間撹拌した。ＰＢＳで透析し、Ｃ１Ａ２－０１－ＢＳＡを得た。
９６穴プレートに、ＰＢＳで２５ｎｇ／ｍＬに調製したＣ１Ａ１－０２－ＢＳＡ溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で２時間静置した。４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（ブロッキング液）を分注し、室温で１時間静置した。ブロッキング液を除去後、０．３２～５０００ｎｇ／ｍＬの濃度で１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴに溶解したペプチドＣ１Ａ２－０２（ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ：配列番号４）又はペプチドＣ１Ａ２－０３（ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ：配列番号３）溶液２５μＬ／ｗｅｌｌと１２５ｎｇ／ｍＬの濃度に１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈したＳ２４２０１抗体溶液２５μＬ／ｗｅｌｌを分注し、室温で１時間静置した。ペプチド・抗体溶液を除去し４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで８０００倍希釈したＧｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間静置した。抗体溶液を除去し４００ μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄後、５０μＬ／ｗｅｌｌでＯＰＤ発色液を分注し、室温で１０分間静置した。５０μＬ／ｗｅｌｌで停止液を分注し、反応停止後、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
４．先行試薬によるＰＩＮＰ値測定
外部委託によりプロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ（富士レビオ株式会社）及びエクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で検体を測定した。
外部委託によりプロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ（富士レビオ株式会社）及びエクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で検体を測定した。
５．サンドイッチＥＬＩＳＡ
（１）ＥＬＩＳＡ用プレートにＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した固相抗体を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で２時間静置した。
（２）ＰＢＳＴで３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（ブロッキング液）を分注し（１００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
（３）ブロッキング液を除去後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１０倍希釈した検体を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
（４）３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化したビオチン化抗体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに調製した溶液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
（４）３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＰＢＳで０．２μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で３０分間静置した。
（５）３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１０分間静置した。
（６）停止液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
（１）ＥＬＩＳＡ用プレートにＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した固相抗体を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で２時間静置した。
（２）ＰＢＳＴで３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（ブロッキング液）を分注し（１００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
（３）ブロッキング液を除去後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１０倍希釈した検体を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
（４）３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化したビオチン化抗体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに調製した溶液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
（４）３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＰＢＳで０．２μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で３０分間静置した。
（５）３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１０分間静置した。
（６）停止液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
６．電気化学発光法
（１）Ｓ２４２１７抗体固相磁性粒子懸濁液の調製
直径３μｍの磁性粒子（積水メディカル製）１０ｍｇをＰＢＳで洗浄し溶液を除去した。２８０ｎｍにおける吸光度が０．５になるようＰＢＳで希釈したＳ２４２１７抗体溶液を、磁性粒子に添加して室温で２０時間撹拌した。抗体溶液を除去し、１ｍＬのブロッキング液（０．１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で磁性粒子を３回洗浄した。５００μＬのブロッキング液を添加し、室温で１６時間撹拌後、ブロッキング液で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈してＳ２４２１７抗体固相磁性粒子懸濁液を得た。
（１）Ｓ２４２１７抗体固相磁性粒子懸濁液の調製
直径３μｍの磁性粒子（積水メディカル製）１０ｍｇをＰＢＳで洗浄し溶液を除去した。２８０ｎｍにおける吸光度が０．５になるようＰＢＳで希釈したＳ２４２１７抗体溶液を、磁性粒子に添加して室温で２０時間撹拌した。抗体溶液を除去し、１ｍＬのブロッキング液（０．１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．２）で磁性粒子を３回洗浄した。５００μＬのブロッキング液を添加し、室温で１６時間撹拌後、ブロッキング液で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈してＳ２４２１７抗体固相磁性粒子懸濁液を得た。
（２）ルテニウム（Ｒｕ）錯体標識Ｓ２４２０１抗体溶液の調製
Ｓ２４２０１抗体をＰＢＳで２．０ ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、撹拌しながら抗体モル数に対し２０等量のビス（２，２’－ビピリジン）［４’－メチル－４－（４－ＮＨＳ－４－オキソブチル）－２，２’ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）ビス（ヘキサフルオロホスファート）（以下、Ｒｕ錯体ＮＨＳ，東京化成製）を少量のＤＭＳＯに溶解して添加し、遮光して室温で３０分間撹拌した。撹拌しながら２ＭグリシンをグリシンとＲｕ錯体ＮＨＳのモル比が２：１になるよう添加し、遮光して２０分間撹拌した。ＰＢＳで平衡化したｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５を用いて、得られた溶液から抗体と結合していないＲｕ錯体を除去し、ブロッキング液で１μｇ／ｍＬに希釈してＲｕ錯体標識Ｓ２４２０１抗体溶液を得た。
Ｓ２４２０１抗体をＰＢＳで２．０ ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、撹拌しながら抗体モル数に対し２０等量のビス（２，２’－ビピリジン）［４’－メチル－４－（４－ＮＨＳ－４－オキソブチル）－２，２’ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）ビス（ヘキサフルオロホスファート）（以下、Ｒｕ錯体ＮＨＳ，東京化成製）を少量のＤＭＳＯに溶解して添加し、遮光して室温で３０分間撹拌した。撹拌しながら２ＭグリシンをグリシンとＲｕ錯体ＮＨＳのモル比が２：１になるよう添加し、遮光して２０分間撹拌した。ＰＢＳで平衡化したｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５を用いて、得られた溶液から抗体と結合していないＲｕ錯体を除去し、ブロッキング液で１μｇ／ｍＬに希釈してＲｕ錯体標識Ｓ２４２０１抗体溶液を得た。
（３）電気化学発光法測定
測定には、全自動電気化学発光免疫装置ピコルミＩＩＩ（積水メディカル製）を用いた。反応管にマウスＩｇＧが入ったブロッキング液１００μＬと測定試料５μＬを添加した。Ｓ２４２１７抗体固相磁性粒子懸濁液２５μＬを添加し２８℃で５分間反応させた。装置指定のＢＦ分離液によるＢＦ分離後、Ｒｕ錯体標識Ｓ２４２０１抗体溶液１００μＬを添加し３分間反応させた。ＢＦ分離後、装置指定の基質（トリプロピルアミン）溶液で磁性粒子を懸濁し、装置所定の場所にて電気を加えることで生じる化学発光を検出した。
測定には、全自動電気化学発光免疫装置ピコルミＩＩＩ（積水メディカル製）を用いた。反応管にマウスＩｇＧが入ったブロッキング液１００μＬと測定試料５μＬを添加した。Ｓ２４２１７抗体固相磁性粒子懸濁液２５μＬを添加し２８℃で５分間反応させた。装置指定のＢＦ分離液によるＢＦ分離後、Ｒｕ錯体標識Ｓ２４２０１抗体溶液１００μＬを添加し３分間反応させた。ＢＦ分離後、装置指定の基質（トリプロピルアミン）溶液で磁性粒子を懸濁し、装置所定の場所にて電気を加えることで生じる化学発光を検出した。
［実施例１］
〈獲得した抗α２鎖抗体とペプチドとの反応性〉
Ｓ２４２０１抗体と、免疫原であるＣ１Ａ２－０２ペプチド（ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ）、及び、一般的にＰ１ＮＰのα２鎖の配列の一部として知られているＣ１Ａ２－０３ペプチド（ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ）との反応性を競合ＥＬＩＳＡで確認した。表２に示すとおり、いずれのペプチドについても競合ペプチド濃度の上昇に応じてＥＬＩＳＡの吸光度が低下した。つまり、Ｓ２４２０１抗体は、Ｃ１Ａ２－０２ペプチド、及び、Ｃ１Ａ２－０３ペプチドいずれにも反応した。
〈獲得した抗α２鎖抗体とペプチドとの反応性〉
Ｓ２４２０１抗体と、免疫原であるＣ１Ａ２－０２ペプチド（ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ）、及び、一般的にＰ１ＮＰのα２鎖の配列の一部として知られているＣ１Ａ２－０３ペプチド（ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ）との反応性を競合ＥＬＩＳＡで確認した。表２に示すとおり、いずれのペプチドについても競合ペプチド濃度の上昇に応じてＥＬＩＳＡの吸光度が低下した。つまり、Ｓ２４２０１抗体は、Ｃ１Ａ２－０２ペプチド、及び、Ｃ１Ａ２－０３ペプチドいずれにも反応した。
［実施例２］
〈ＥＬＩＳＡによる骨粗鬆症患者・健常人検体測定〉
健常人由来の１６検体、腎疾患がない骨粗鬆症患者由来の２２検体を用いた。
表３の抗体組合せを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。同じ検体を、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ及びエクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰでも測定した。
〈ＥＬＩＳＡによる骨粗鬆症患者・健常人検体測定〉
健常人由来の１６検体、腎疾患がない骨粗鬆症患者由来の２２検体を用いた。
表３の抗体組合せを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。同じ検体を、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ及びエクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰでも測定した。
結果を図３～５に示す。抗体組合せ１によるＥＬＩＳＡ吸光度と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ測定値とのピアソンの積率相関係数ｒ＝０．９９０であった（図３）。抗体組合せ２によるＥＬＩＳＡ吸光度と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ測定値とのピアソンの積率相関係数ｒ＝０．９８１であった（図４）。エクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰによる測定値と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰによる測定値とのピアソンの積率相関係数ｒ＝０．９６２であった（図５）。したがって、いずれの抗体組合せのサンドイッチＥＬＩＳＡによる吸光度とプロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰの測定値との相関は良好であった。
［実施例３］
〈電気化学発光法による骨粗鬆症患者・腎疾患患者検体測定〉
腎疾患患者由来の１０検体、骨粗鬆症患者由来の７検体を用いた。エクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰで値付けしたＰ１ＮＰ高値の癌骨転移患者血清を系列希釈したものを標準品として用い、固相抗体にＳ２４２１７、Ｒｕ錯体標識抗体にＳ２４２０１を用いた電気化学発光法によりＰ１ＮＰ測定値を算出した。結果を図６、図７に示す。本発明の電気化学発光法による測定値とプロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰによる測定値の相関性は、ピアソンの積率相関係数ｒ＝０．８９４、ｙ＝０．９９７ｘ－３．９６であった。一方、エクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰによる測定値と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰによる測定値との相関性は、ピアソンの積率相関係数ｒ＝０．７７３、ｙ＝１．６４ｘ－１７．４であった。したがって、腎疾患患者検体を含む検体群を測定した場合においても、固相抗体にＳ２４２１７、Ｒｕ錯体標識抗体にＳ２４２０１を用いた電気化学発光法による測定値と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰによる測定値との相関は良好であった。
〈電気化学発光法による骨粗鬆症患者・腎疾患患者検体測定〉
腎疾患患者由来の１０検体、骨粗鬆症患者由来の７検体を用いた。エクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰで値付けしたＰ１ＮＰ高値の癌骨転移患者血清を系列希釈したものを標準品として用い、固相抗体にＳ２４２１７、Ｒｕ錯体標識抗体にＳ２４２０１を用いた電気化学発光法によりＰ１ＮＰ測定値を算出した。結果を図６、図７に示す。本発明の電気化学発光法による測定値とプロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰによる測定値の相関性は、ピアソンの積率相関係数ｒ＝０．８９４、ｙ＝０．９９７ｘ－３．９６であった。一方、エクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰによる測定値と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰによる測定値との相関性は、ピアソンの積率相関係数ｒ＝０．７７３、ｙ＝１．６４ｘ－１７．４であった。したがって、腎疾患患者検体を含む検体群を測定した場合においても、固相抗体にＳ２４２１７、Ｒｕ錯体標識抗体にＳ２４２０１を用いた電気化学発光法による測定値と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰによる測定値との相関は良好であった。
［実施例４］
〈ＥＬＩＳＡによる腎疾患患者検体測定〉
健常人由来の３検体、腎疾患がない骨粗鬆症患者由来の１０検体、腎疾患患者由来の７５検体を用いた。
表３の抗体組合せを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。同じ検体を、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ及びエクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰでも測定した。
〈ＥＬＩＳＡによる腎疾患患者検体測定〉
健常人由来の３検体、腎疾患がない骨粗鬆症患者由来の１０検体、腎疾患患者由来の７５検体を用いた。
表３の抗体組合せを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。同じ検体を、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ及びエクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰでも測定した。
結果を図８、図９に示す。抗体組合せ１によるＥＬＩＳＡ吸光度と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ測定値とのピアソンの積率相関係数は、全検体においてｒ＝０．８５０、ステージ４及び５の患者由来の検体においてｒ’＝０．８６８であった。抗体組合せ２によるＥＬＩＳＡ吸光度と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ測定値とのピアソンの積率相関係数は、全検体においてｒ＝０．９１３、ステージ４及び５の患者由来の検体においてｒ’＝０．９３５であった。いずれの抗体組合せにおいても、本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡによる吸光度とプロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰの測定値との相関は良好であった。
一方、図１０に示すように、エクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰによる測定値と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰによる測定値とのピアソンの積率相関係数は、全検体においてｒ＝０．７１５、ステージ４及び５の患者由来の検体においてｒ’＝０．５２８であった。エクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ測定値とプロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰの測定値との相関は重度腎疾患患者検体で特に不良であった。
一方、図１０に示すように、エクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰによる測定値と、プロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰによる測定値とのピアソンの積率相関係数は、全検体においてｒ＝０．７１５、ステージ４及び５の患者由来の検体においてｒ’＝０．５２８であった。エクルーシス試薬ｔｏｔａｌ Ｐ１ＮＰ測定値とプロコラーゲンＩｎｔａｃｔ ＰＩＮＰの測定値との相関は重度腎疾患患者検体で特に不良であった。
なお、腎疾患（慢性腎臓病）のステージとｅＧＦＲ（単位：ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）の関係は以下のとおりである。
ステージ１ ｅＧＦＲ≧９０
ステージ２ ｅＧＦＲ＝６０～８９
ステージ３ａ ｅＧＦＲ＝４５～５９
ステージ３ｂ ｅＧＦＲ＝３０～４４
ステージ４ ｅＧＦＲ＝１５～２９
ステージ５ ｅＧＦＲ＜１５
ステージ１ ｅＧＦＲ≧９０
ステージ２ ｅＧＦＲ＝６０～８９
ステージ３ａ ｅＧＦＲ＝４５～５９
ステージ３ｂ ｅＧＦＲ＝３０～４４
ステージ４ ｅＧＦＲ＝１５～２９
ステージ５ ｅＧＦＲ＜１５
［配列一覧］
※表４中、Ｊはピログルタミン酸を表す。
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０６
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０７
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０８
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０５
なお、ＮＰＭＤは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）を示すアクロニムである。
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０７
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０８
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３６０５
なお、ＮＰＭＤは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）を示すアクロニムである。
[規則26に基づく補充 18.04.2023]
Claims (20)
- 生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出方法であって、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、
を用いる、免疫学的検出方法。 - 前記第１の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第１の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成する工程と、
前記第１の複合体と前記第２の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成する工程と、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する工程と、
を備える、請求項１に記載の免疫学的検出方法。 - 前記第２の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第２の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成する工程と、
前記第１の複合体と前記第１の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成する工程と、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する工程と、
を備える、請求項１に記載の免疫学的検出方法。 - 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分の一次構造が配列番号１又は配列番号２で示される配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
配列番号１：ＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤ
配列番号２：ＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴ - 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分の一次構造が配列番号３で示される配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
配列番号３：ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ - 前記第１の抗体がポリペプチドの配列番号４で示される配列からなる部分と反応する、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
配列番号４：ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ - 前記生体試料が、血液、血漿及び血清からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２又は３に記載の免疫学的検出方法。
- 前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
- 前記免疫学的検出方法が、電気化学発光法、ラテックス凝集免疫比濁法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法からなる群から選択されるいずれか１種である、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
- 腎疾患患者由来のＩ型コラーゲンＮ末端プロペチドの単量体を検出しない、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
- 生体試料中の三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチドの免疫学的検出キットであって、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分と結合する第１の抗体と、
前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分と結合する第２の抗体と、
を含む、免疫学的検出キット。 - 前記第１の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第１の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成し、
前記第１の複合体と前記第２の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成し、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する、
請求項１１に記載の免疫学的検出キット。 - 前記第２の抗体は標識物質により標識されており、
生体試料と前記第２の抗体とを接触させ、第１の複合体を形成し、
前記第１の複合体と前記第１の抗体とを接触させ、第２の複合体を形成し、
前記標識物質に由来するシグナルを検出する、
請求項１１に記載の免疫学的検出キット。 - 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α１鎖の特定部分の一次構造が配列番号１又は配列番号２で示される配列を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の免疫学的検出キット。
配列番号１：ＱＥＥＧＱＶＥＧＱＤ
配列番号２：ＰＤＧＳＥＳＰＴＤＱＥＴＴ - 前記三量体Ｉ型コラーゲンＮ末端プロペチド中のｐｒｏ－α２鎖の特定部分の一次構造が配列番号３で示される配列を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の免疫学的検出キット。
配列番号３：ＱＳＬＱＥＥＴＶＲＫ - 前記第１の抗体がポリペプチドの配列番号４で示される配列からなる部分と反応する、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の免疫学的検出キット。
配列番号４：ＪＳＬＱＥＥＴＶＲＫ - 前記生体試料が、血液、血漿及び血清からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１２又は１３に記載の免疫学的検出キット。
- 前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の免疫学的検出キット。
- 電気化学発光法、ラテックス凝集免疫比濁法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法からなる群から選択されるいずれか１種の免疫学的検出方法を用いる、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の免疫学的検出キット。
- 腎疾患患者由来のＩ型コラーゲンＮ末端プロペチドの単量体を検出しない、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の免疫学的検出キット。
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|---|---|
| WO2023182353A1 true WO2023182353A1 (ja) | 2023-09-28 |
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|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/011204 WO2023182353A1 (ja) | 2022-03-25 | 2023-03-22 | 免疫学的検出方法及び免疫学的検出キット |
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|---|---|
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH08233811A (ja) * | 1994-12-23 | 1996-09-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Ｉ型コラーゲン検出用の抗原及び抗体 |
| JPH08291197A (ja) * | 1995-04-19 | 1996-11-05 | Orion Yhtymae Oy | Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドに対する抗体およびそれを用いるアッセイ法 |
| JPH09509736A (ja) * | 1993-09-17 | 1997-09-30 | オステオミーター・ビオテク・エー／エス | 体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラーゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途 |
| JPH10300749A (ja) * | 1997-04-28 | 1998-11-13 | Mitsubishi Chem Corp | コラーゲン断片を認識する抗体 |
| CN112326972A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-02-05 | 安徽理工大学 | 一种检测血清中完整pinp的化学发光定量检测试剂盒 |
-
2023
- 2023-03-22 WO PCT/JP2023/011204 patent/WO2023182353A1/ja unknown
Patent Citations (5)
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