JP3360826B2 - コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの検出用のイムノアッセイ - Google Patents

コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの検出用のイムノアッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコラーゲンの抗体の産生のための抗原、この
ような抗原の生産方法、本発明の抗原による免疫感作に
より得られるコラーゲンの抗体並びにコラーゲンの検出
のためのこのような抗体の使用に関する。
コラーゲンは、皮膚、軟骨及び骨の結合組織中の重要
な構造タンパク質を代表する。それぞれ３本の鎖を含む
11の型が知られている。それぞれの型は、α１、α２お
よびα３と称される１〜３本の異なる鎖を含む（E.Mill
erら、Methods in Enzymology 144における方法、構造
タンパク質および収縮性タンパク質、L.Cunningham,Aca
demicPress Inc.1987,3−41頁）。例えば、特定の骨ま
たは軟骨中の特定の組織の成熟コラーゲンの特徴的な性
質は、ヒドロキシリシルピリジノリンまたはリシルピリ
ジノリンによる隣接繊維の架橋である（D.Fujimotoら,
J.Biochem.83（1978）,863−867;D.Eyreら,Ann.Rev.Bio
chem.53（1984）,717−748およびD.Eyre,Methods in En
zymology 144における方法（1987）,115−139）。これ
らの架橋はコラーゲンの特異的検出のための生物マーカ
ーとして利用し得る（Z.Gunja−Smithら,Biochem.J.197
（1981）,759−762）。細胞外コラーゲンが分解される
場合、WO91/10141号明細書に記載されているようなヒド
ロキシリシルピリジノリンもしくはペプチド側鎖を含む
リシルピリジノリン誘導体またはリシル残基もしくはヒ
ドロキシリシル残基を有する遊離ピリジノリン誘導体
が、血液または尿の如き体液に侵入する。それ故、体液
中のこれらの化合物の検出は、例えば、骨粗しょう症に
おいて生じたり、また骨組織の腫瘍の結果として生じる
ような細胞外コラーゲンの分解を示す。尿から単離し得
る適当に架橋されたコラーゲンフラグメントによる免疫
感作により得られたペプチド側鎖を有するヒドロキシリ
シルピリジノリンまたはリシルピリジノリンの検出につ
きWO89/12824号明細書にモノクローナル抗体が記載され
ていた。WO91/08478号明細書に記載された方法において
は、コラーゲンは生体内で産生されたコラーゲンの天然
の、即ち、架橋された分解生産物の抗体によっても検出
される。
天然源から単離されたこれらのペプチドの欠点は、そ
の試験において抗原または結合パートナーの再現可能な
産生に信頼できる源がないことである。天然源から単離
されたペプチドの更に別の欠点は、感染性物質による汚
染のリスクである。
特定の抗原は、例えば、抗原のエピトープに相当する
ペプチドの化学合成により得られる。約700−1500Dの分
子量を有する小さいペプチドがこれに使用される場合、
免疫原作用を有する抗原を得るためにはキャリヤー分子
への結合が必要である。エピトープの構造は、このプロ
セスにおいてキャリヤー分子への結合により変化しては
ならない。それ故、以前、キャリヤー分子へのカップリ
ングが、推定エピトープ領域から適当な距離にあるペプ
チド鎖の末端で行われている（Laboratory Technics in
Biochemistry and Molecular Biology、抗原としての
合成ポリペプチド、編集者R.H.BurdonおよびP.H.van Kn
ippenberg,Elsevier,Amsterdam,New York,Oxford 1988,
95−100頁）。
架橋コラーゲンの天然分解産物に相当する特定の抗原
の化学合成における問題は、架橋により生じるヒドロキ
シリシルピリジノリンまたはリシルピリジノリン構造を
化学合成することが従来可能ではなかったことである。
それ故、本発明の目的は、競合イムノアッセイにおけ
るコラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの抗体の特
異的結合パートナーとして、またコラーゲンまたはコラ
ーゲンフラグメントの検出のための競合イムノアッセイ
において標準または較正曲線を作成するための標準物質
として使用するためのコラーゲンまたはコラーゲンフラ
グメントの抗体の産生のための特定の抗原を提供するこ
とであった。
従来、試料中のコラーゲンまたはコラーゲン分解産物
の検出のために、架橋結合構造そのものまたはヒドロキ
シリシル残基もしくはリシル残基の架橋により生成され
る所謂架橋ペプチドを検出することが必要であることが
常に推定されていた。何となれば、このヒドロキシリシ
ルピリジノリンまたはリシルピリジノリン構造はコラー
ゲンに特徴的であるからである。このような検出方法の
例が、WO89/12824号、WO91/08478号、WO89/04491号およ
びWO91/10141号に記載されている。
今、驚くことに、コラーゲンの非らせん線状Ｃ末端ま
たはＮ末端領域の配列に相当する合成線状ペプチドを含
む特定の抗原、結合パートナーまたは標準物質の使用が
上記の目的を達成するのに適することがわかった。イム
ノアッセイにおける結合パートナーとして、標準物質と
して、または抗体産生の免疫原として、合成線状ペプチ
ドを使用することの利点は、これらのペプチドが、天然
源からのペプチドとは対照的に、正確に特定された構造
で再現可能に生産し得ることである。更に、このような
短い合成ペプチドが使用されるイムノアッセイは、干渉
に対する低い感受性を示す。
それ故、本発明は、コラーゲンの非らせんの線状Ｃ末
端領域またはＮ末端領域の配列に相当する合成線状ペプ
チドを含む結合パートナーを、その合成線状ペプチドを
結合できる抗体および試料でインキュベートし、そして
結合パートナーへの抗体の結合を適当な方法で測定する
ことを特徴とする試料中のコラーゲンまたはコラーゲン
フラグメントの検出のための競合イムノアッセイに関す
る。
更に、本発明は、コラーゲンまたはコラーゲンフラグ
メントの検出のための競合イムノアッセイにおいて標準
または較正曲線を作成するための標準物質であって、コ
ラーゲンの非らせんの線状Ｃ末端領域またはＮ末端領域
の配列に相当する合成ペプチドを含む抗原を含むことを
特徴とする標準物質に関する。
更にまた、本発明は、コラーゲンの非らせんのＣ末端
領域またはＮ末端領域の配列に相当する合成線状ペプチ
ドを含むコラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの抗
体の産生のための抗原に関するものであり、また本発明
はこの抗原を使用して産生された抗体に関する。
コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域
の全ての連続アミノ酸配列は、合成線状ペプチドとして
適している。これらの領域は、Chuら,Nature 310,337−
340（1984）,Clickら,Biochemistry 9,4699−4706（197
0）,Morganら,J.Biol.Chem.245,5042−5048（1970）お
よびBernardら,Biochemistry 22,5213−5223（1983）に
より知られている。５〜25のアミノ酸、特に好ましくは
８〜20のアミノ酸を含むペプチドが使用されることが好
ましい。この場合、その配列が架橋の領域を含むことは
必要ではない。しかしながら、それはまた実際にこの領
域と重なることもできる。しかしながら、いかなる場合
にも、合成ペプチド中にはヒドロキシリシルピリジノリ
ンまたはリシルピリジノリン架橋結合はない。コラーゲ
ンのＣ末端領域からの合成ペプチドが最も好適であるこ
とがわかった。何となれば、非らせんのＣ末端領域はコ
ラーゲンの非らせんのＮ末端領域よりも大きいからであ
る。従って、この領域においては、Ｎ末端領域における
よりもより可能性のあるエピトープが利用できる。コラ
ーゲンのα１鎖のＣ末端領域からの配列番号１、２また
は３に示された配列を有するペプチドが特に好適であ
る。
コラーゲン分解産物の濃度は、骨溶解の程度に対する
重要な診断マーカーである。合成線状ペプチドの助けに
より、コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの検出
のための競合イムノアッセイを行うことが可能である。
驚くことに、これらのペプチドはこれらのコラーゲンフ
ラグメントの抗体に対し、天然試料、例えば、血漿、血
清または尿中で生じるコラーゲンフラグメントと非常に
良く競合し、従って、競合試験を可能にすることが判明
した。コラーゲンまたはコラーゲン分解産物のこのよう
な抗体は、例えば、フィンランドのオリオン・ディアグ
ノスチカ社（Orion Diagnostica Company）からのテロ
ペプチドICTP［125I］ラジオイムノアッセイキットにお
いて商業上利用できる。しかしながら、それらはまた本
発明に従って合成線状ペプチドにより産生し得る。
競合イムノアッセイにおける適用につき、合成線状ペ
プチドは、固相に結合した結合パートナーとして直接使
用でき、またはそれは第二成分にカップリングしていて
もよい。第二成分へのカップリングは、線状ペプチドの
Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を介して達成され
ることが好ましい。必要により、更にスペーサーがペプ
チドと第二成分の間に挿入し得る。第二成分は、例え
ば、ペプチドを固相に間接的にカップリングするのに利
用できる。この例は当業者には知られている。ペプチド
はウシ血清アルブミンにカップリングすることが好まし
く、そしてそのカップリング生成物をプラスチック管の
如き固相に吸着結合させる。また、ペプチドはビオチン
に共有結合し得る。次に、固相への付着はアビジンまた
はストレプトアビジンへの結合により達成され、これ
は、順に、固相に結合されている。また、第二成分は、
例えば、競合阻害免疫比濁法（TINIA）において幾つか
のペプチドのキャリヤーとして利用でき、この場合、幾
つかのペプチドは、例えば、アルブミン、免疫グロブリ
ン、β−ガラクトシダーゼ、EP−Ａ−O 545 350に記載
されているようなポリマー、例えば、ポリリシン分子も
しくはデキストラン分子またはラテックスの如き粒子に
カップリングしている。30〜40のペプチド分子がそれぞ
れのキャリヤー分子にカップリングされることが好まし
い。また、ペプチドは、標識に相当する成分にカップリ
ングし得る。これらの試験のあらゆる変形の例が当業者
に知られている。
試験操作において、抗体は試料および合成線状ペプチ
ドを含む結合パートナーと同時に、または連続してイン
キュベートし得る。続いて、結合された抗体または結合
されていない抗体の量を通常の方法で測定する。凝集試
験、例えば、TINIA、またはFPIA（蛍光偏光イムノアッ
セイ）（W.Dandlikerら,J.Exp.Med.122（1965）,102
9）、EMIT（酵素多重イムノアッセイ）（Gunzerら，
“コンタクト（Kontakte）III"（1980）,3−11）および
CEDIA技術（Hendersonら,Clinical Chemistry 32（198
6）,1637−1641）が、例えば、結合された抗体または結
合されていない抗体の量を測定するための競合試験の変
形として利用できる。本発明のペプチドは抗体への結合
に対して試料と競合する特定の結合パートナーとして使
用するのに特に適していることがわかった。配列番号
１、２または３に示された配列を有する合成線状ペプチ
ドが特に好ましい。
試料中の抗原の量の測定に相当する結合パートナーへ
の抗体結合の程度を測定した後、試料中の抗原の正確な
量を、同じ方法で処理された標準物質との比較により通
常の方法で測定し得る。
天然物質から単離されたコラーゲン分解産物が、標準
物質として使用し得る。しかしながら、これらは或る変
化により自然に特性決定される。本発明の合成線状ペプ
チドを含む抗原が、標準物質としてより適することがわ
かった。この標準物質の抗原は単にこのペプチドを含む
ことができ、または、例えば、ペプチドの水溶性を改良
するのに利用できる好適なキャリヤーにカップリングさ
れたこのペプチドを含むことができる。ペプチドの標準
物質およびキャリヤーを生成するためには、コラーゲン
の非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配列に相当
する線状ペプチドを合成し、そして好適なカップリング
方法によりそのＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸を
介してキャリヤー分子に結合させる。一つまたは幾つか
のペプチドがキャリヤー分子に結合し得る。必要によ
り、カップリングはスペーサーを介して達成し得る。凝
集試験の如き一定の目的のために、特に、本発明の抗原
の助けにより産生されなかったポリクローナル抗体が試
験に使用され、こうして幾つかのエピトープを通常認識
する場合には、異なる配列の本発明の幾つかのペプチド
をキャリヤー分子に結合することが有利であり得る。
コラーゲン分解産物の既に知られている抗体が、競合
イムノアッセイにおいて抗体として使用し得る。また、
本発明の線状合成ペプチドを含む抗原の助けにより得ら
れた抗体も好適である。
免疫感作に関して、コラーゲンの非らせんのＣ末端領
域またはＮ末端領域の一つまたは幾つかの配列に相当す
る線状合成ペプチドは、好適なキャリヤータンパク質、
例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清
アルブミンまたはエデスチンに結合させる必要がある。
これらの抗原または免疫原を産生するために、線状ペ
プチドを最初に通常の方法で化学合成する。続いて、合
成ペプチドをマエインイミド−ヘキサン酸−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルによりＮ末端アミノ基を介
して上記キャリヤータンパク質にカップリングする。驚
くことに、配列番号１、２または３に示された配列を有
する合成線状ペプチドは、競合試験操作に適する抗体の
産生に特に適することが判明した。
コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域
の配列に相当する合成線状ペプチドを含む本発明の抗原
を使用して、本発明のペプチドを認識するだけでなく、
体液中で生じるコラーゲンの分解産物をも認識する抗体
を得ることが可能である。
それ故、本発明はまた、本発明の抗原による免疫感作
そしてその免疫化された動物の血清からの所望の抗体の
既知の方法による単離によりコラーゲンまたはコラーゲ
ンフラグメントの抗体の生産方法にも関する。所望の抗
体は、キャリヤータンパク質、好ましくはセファロース
にカップリングした配列番号１、２または３に示された
配列を有するペプチドへの免疫吸着により単離すること
が好ましい。
本発明の好ましい主題は、本発明の抗原による免疫感
作、免疫化された動物の脾臓細胞の不死化、所望の抗体
を産生するそれらの不死化脾臓細胞のクローニングそし
てクローン化細胞またはこれらの細胞の培養上澄みから
の抗体の単離によってコラーゲンまたはコラーゲンフラ
グメントのモノクローナル抗体を産生する方法である。
免疫感作は、これに通常使用される動物中で行われ
る。マウスまたはウサギが使用されることが好ましい。
免疫された動物の脾臓細胞は、当業者に良く知られて
いる方法、例えば、ハイブリドーマ技術（Kohlerおよび
Milstein,Nature 256（1975）,495−497）またはエプス
タイン・バールウイルスによる形質転換（EBV形質転
換）により不死化する。所望の抗体を産生するそれらの
不活化された細胞を検出するために、培養上澄みの試料
を免疫感作に使用される本発明の抗原で通常のイムノア
ッセイにおいてインキュベートし、そして抗体がこの抗
原に結合するか否かを調べる。
加えて、本発明は本発明の方法により得られるポリク
ローナル抗体およびモノクローナル抗体に関する。
これらのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体は免疫感作に使用される本発明のハプテンと反応する
だけでなく、コラーゲン及び体液中に見られるコラーゲ
ンの天然分解産物とも良く反応する。
それ故、本発明の抗体は、コラーゲンまたはコラーゲ
ンフラグメントの測定につき上記した試験操作に使用し
得る。
それ故、更に本発明は、本発明のポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体を組織試料でインキュベート
し、そして抗体に結合しているコラーゲン分解産物を測
定することによる骨溶解の測定のためのその抗体の使用
に関する。
本発明を配列表と組み合わせて下記の実施例により更
に詳しく説明する。
配列番号１は、９のアミノ酸を含む本発明のペプチドの
配列を示し、Xaaは任意のアミノ酸を表す。
配列番号２は、16のアミノ酸を含む本発明のペプチドの
配列を示す。
配列番号３は、10のアミノ酸を含む本発明のペプチドの
配列を示す。
実施例１ ペプチド合成 配列表の配列番号２および３に示された配列を有する
コラーゲンのアミノ酸配列の部分配列を有するペプチド
を、ａ）ラボルテック（Labortec）SP640ペプチド合成
装置およびｂ）ジンサー・アナリティック（Zinsser An
alytic）SMPS350ペプチド合成装置によるフルオレニル
メチルオキシカルボニル（Fmoc）固相ペプチド合成によ
り調製する。
ａ）アセチル−Ser−Ala−Gly−Phe−Asp−Phe−Ser−P
he−Leu−Pro−Gln−Pro−Pro−Gln−Glu−Lys−アミド
（配列番号２）の生産 下記のFmoc−アミノ酸誘導体のそれぞれ4.0当量を記
載の順序で使用する。
tert. ブチルオキシカルボニル保護基を有するLys tert. ブチルエステル保護基を有するGlu Gln 側鎖保護基を有しないもの Pro 側鎖保護基を有しないもの Pro 側鎖保護基を有しないもの Gln 側鎖保護基を有しないもの Pro 側鎖保護基を有しないもの Leu 側鎖保護基を有しないもの Phe 側鎖保護基を有しないもの Ser tert.ブチルエステル保護基を有するもの Phe 側鎖保護基を有しないもの Asp tert.ブチルエステル保護基を有するもの Phe 側鎖保護基を有しないもの Gly 側鎖保護基を有しないもの Ala 側鎖保護基を有しないもの Ser tert.ブチルエステル保護基を有するもの アセチル 無水酢酸 アミノ酸またはアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリド
ンに溶解する。
そのペプチドを0.87ミリモル/gの装填量で４−（2',
4'−ジメトキシ−フェニル−Fmoc−アミノメチル）−フ
ェノキシ樹脂（Tetrahedron Letters 28（1987）,210
7）3gで合成する（JACS 95（1973）,1328）。そのカッ
プリング反応をFmoc−アミノ酸誘導体に関する反応媒体
としてのジメチルホルムアミド中で4.4当量のジシクロ
ヘキシルカルボジイミドおよび4.8当量のＮ−ヒドロキ
シベンゾトリアゾールを用いて60分間にわたって行う。
イソプロパノールで洗浄した合成樹脂をカイザー試験
（Anal.Biochem.34（1970）,595）によりカップリング
収率につき監視する。これが、その変換が未だ完結して
いないことを示す場合、その変換を上記の条件下で再カ
ップリングにより完結される。合成のそれぞれの工程後
にFmoc基をジメチルホルムアミド中の20％のピペリジン
により20分以内に開裂する。樹脂の装填量を遊離された
フルベン基のUV吸収によりそれぞれのピペリジン処理後
に測定する。合成後に、装填量は未だ0.68ミリモル/gで
ある。
合成樹脂からのペプチドの遊離および酸不安定保護基
の開裂を室温で60分以内にトリフルオロ酢酸80ml、エタ
ンジチオール5ml、フェノール2.5g、ｍ−クレゾール2.5
mlおよび水5mlを用いて行う。
続いて、その反応溶液を減圧で濃縮する。残渣をジイ
ソプロピルエーテルに吸収させ、1/2〜２時間激しく攪
拌し、次に濾過する。次にその物質を、溶解剤として0.
5％の酢酸を使用してセファデックスG15によるゲル透過
クロマトグラフィーにより予備精製する。続いて、得ら
れた粗物質を濾過し、100％の緩衝液Ａ（水、0.1％のト
リフルオロ酢酸）から100％の緩衝液Ｂ（60％のアセト
ニトリル、40％の水、0.1％のトリフルオロ酢酸）への
グラジエントを使用してヌクレオシル（Nucleosil）RP1
8（カラム40mm x 250mm、300Å、５μｍ）による分取HP
LCにより120分以内に単離する。溶解物質の同一性を高
速原子衝撃質量分光分析法（FAB−MS）により調べる。
ｂ）Ala−Gly−Phe−Asp−Phe−Ser−Phe−Leu−Pro−G
ln（配列番号３）の生産 ペプチドを、アドバンスト・ケムテック社からの４−
（2',4'−ジメトキシ−フェニル−Fmoc−アミノメチ
ル）フェノキシ樹脂SA5030 30mgで0.47ミリモル/gの装
填量を使用して調製した。下記のFmocアミノ酸誘導体の
それぞれを、ジメチルホルムアミドDMF中の140μモルの
１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびDMF中の10μ
モルのN,N−ジイソプロピルカルボジイミドと一緒にそ
れぞれの時に140μモルのアミノ酸誘導体を使用して固
相に結合されている合成すべきペプチドに２回カップリ
ングした。
Glu トリチル保護基を有するもの Ser tert.ブチル保護基を有するもの Asp tert.ブチル保護基を有するもの Pro | Leu | Phe ＞それぞれ、側鎖保護基を有しないもの Gly | Ala | カップリング期間は30分および40分であった。開裂期
間は20分であり、DMF中50％のピペリジンの溶液を用い
て行った。洗浄工程はDMFを用いてそれぞれの反応工程
後に８回行った。溶媒を濾過により除去した樹脂を処理
することによりペプチドを遊離し、これをジクロロメタ
ンおよびメタノールで洗浄し、90％のトリフルオロ酢
酸、３％のチオアニソール、３％のエタンジチオールお
よび３％のチオクレゾールで20分以内そして140分以内
で洗浄した。生産物を、溜めた濾液への冷ジイソプロピ
ルエーテル15mlの添加により沈殿させ、そして濾過によ
り単離した。残渣を50％の酢酸に溶解し、凍結乾燥し
た。HPLCにより79％の純度の白色凍結乾燥8mgを得た。
同一性を質量FAB−分光分析法により確認した。
実施例２ ペプチドの活性化 実施例1a）により合成したペプチドをマレインイミド
ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（MHS）
によるアシル化により活性化する。これに関して、ペプ
チド0.1ミリモルを0.1モル/lのリン酸カリウム緩衝液、
pH7.5 20mlに溶解し、ジオキサン6ml中0.1ミリモルのMH
Sの溶液と混合し、20℃で20分間攪拌する。続いて、pH
値を氷酢酸でpH4に調節し、その反応混合物を直ちに凍
結乾燥する。凍結乾燥物を水5mlに溶解し、100％のＡ
（水0.1％のトリフルオロ酢酸）から100％のＢ（99.9％
のアセトニトリル0.1％のトリフルオロ酢酸）への溶離
グラジエントを使用してウォーターズ・デルタ−パック
（Waters Delta−Pak）（商標）C18カラム（100Å、15
μm 50 x 300mm）による分取HPLCにより精製する。
実施例３ 活性化ペプチドをキャリヤータンパク質にカップリン
グすることによる免疫原の生産 キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血
清アルブミン（BSA）およびβ−ガラクトシダーゼ（βG
al）への活性化ペプチドのカップリングを記載する。実
施例２に従ってMHSで活性化したペプチドをカップリン
グするために、キャリヤータンパク質は遊離SH基を有す
ることが必要である。βGalは天然状態でこれらを既に
有しており、それ故、更なる前処理を必要としない。KL
HおよびBSAの場合、リシン残基のε−アミノ側鎖のNH2
基をＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオ
ネート（SATP）による処理により誘導体化し、こうして
SH基に変換する。
こうして、天然状態と較べてSH基の数が増加したキャ
リヤータンパク質を得る。これに関して、SATP 113.51m
g（ジオキサン10mlに溶解）を20分以内に0.1モル/lのリ
ン酸カリウム緩衝液pH8.5 500ml中のKLH1.39gの溶液に
滴下して添加する。20℃で30分間攪拌した後、その反応
溶液のpH値を0.1モル/lの水酸化ナトリウム溶液でpH8.5
に再度調節し、更に24時間攪拌する。続いてその溶液を
アミコンセル（膜YM10）の助けにより100mlに濃縮し、
それぞれの時に0.1モル/lのリン酸カリウム緩衝液pH8.5
/0.05モル/lの塩化ナトリウム３リットルに対し3 x 24
時間にわたって透析し、続いて凍結乾燥する。
Ｓ−アセチル保護基を開裂するために、KLH−SATP凍
結乾燥物481mgを0.1モル/lのリン酸カリウム緩衝液pH8.
5/0.05モル/lの塩化ナトリウム20mlに溶解し、新たに調
製した１モル/lのヒドロキシルアミン溶液0.5mlと混合
し、20℃で90分間攪拌する。
水4ml中の実施例２から得られた活性化ペプチド7.23
モルを誘導体化されたキャリヤータンパク質に添加し、
20℃で20時間攪拌する。続いて、その濁った溶液を0.1
モル/lのリン酸カリウム緩衝液pH8.5/0.05モル/lの塩化
ナトリウム１リットルに対し２回透析する。透析物を遠
心分離し、透明な上澄みをデカントし、凍結乾燥する。
実施例４ 線状フラグメントのポリクローナル抗体の産生 ５匹のヒツジをそれぞれの場合に既知の方法で実施例
３からの免疫原で免疫化した。免疫原は、コラーゲン型
Ｉのα鎖の配列中のアミノ酸番号892〜907に相当する配
列番号２に記載された配列を有するペプチドを含んでい
た。KLH又はβ−ガラクトシダーゼはキャリヤータンパ
ク質として利用した。これらの動物を完全フロイントア
ジュバント中の免疫原で１ケ月の間隔で免疫化した。投
与量は動物および免疫感作当たり500μｇであった。血
液試料を最初の免疫感作の４ケ月後に回収し、得られた
抗体をコラーゲンフラグメントとの反応につき試験し
た。
抗血清とコラーゲンフラグメントの反応を試験するため
のELISA 下記の物質および試薬を使用した。
マイクロタイタプレート:Maxisorp F96、ヌンク社 被覆緩衝液:50mMの炭酸ナトリウムpH9.6 0.1％のNaN3 インキュベーション緩衝液:10mMのリン酸ナトリウムpH
7.4 0.1％のトゥイーン20 0.9％のNaCl １％のウシ血清アルブミン 基質溶液:ABTS（商標）、ベーリンガー・マンハイムGmb
H、カタログNo.857424 2mg/mlのバニリンをその溶液に添加してシグ
ナルを増幅した。
洗浄液:0.1％のトゥイーン20 0.9％にNaCl タイタプレートのウェルを、被覆緩衝液中に10μg/ml
のコラーゲンフラグメントを含む溶液100μｌでそれぞ
れ満たした。コラーゲンフラグメントをEP−Ａ−050521
0号明細書中の指示に従ってプロテアーゼ消化により骨
からのヒトコラーゲンから生成した。振とうしながら室
温で１時間インキュベートした後、それを洗浄液で３回
洗浄した。
抗血清をインキュベーション緩衝液で1:4000に希釈
し、それぞれ100μｌをマイクロタイタプレートのウェ
ル中で室温で振とうしながら１時間インキュベートし
た。続いてウェルを洗浄液で３回洗浄した。
ホースラディッシュペルオキシダーゼとヒツジIgGのF
c部分のウサギ抗体の接合体をインキュベーション緩衝
液中12.5mU/mlの濃度に希釈し、マイクロタイタプレー
トのウェルを、その100μｌでそれぞれ被覆する。室温
で振とうしながら１時間インキュベートした後、そのタ
イタプレートを洗浄液で３回洗浄する。
基質溶液100μｌを添加し、そして発色が目視できる
ようになるまで（10〜60分）インキュベートする。吸光
度を405nmおよび492nmにおける示差測定として記録す
る。
これらの動物の殆どの血清は固相でコラーゲンフラグ
メントとの強い反応を示した。免疫化されていない動物
の血清は、同じ条件下で弱い測定シグナルを示したにす
ぎなかった。結果を表１に示す。
実施例５ 競合試験による体液中のコラーゲンおよびその分解産物
の測定 96ウェルマイクロタイタプレートのウェルをEP−A 03
44578号に従って４℃で一夜にわたってストレプトアビ
ジン（PBS中１μg/mlの溶液100μｌ）で被覆し、未だ遊
離している非特異的結合部位を室温で２時間にわたって
BSA（ウシ血清アルブミン、10mg/ml）300μｌによるイ
ンキュベーションによりブロックする。
実施例1b）に従って合成した配列番号３に示された配
列を有するデカペプチドを、Ｄ−ビオチニル−ε−アミ
ドカプロン酸−Ｎ−スクシンイミドエステル（ベーリン
ガーマイハイム、カタログNo.1008960）を使用して製造
業者の指示に従ってアミノ末端でビオチニル化する。ビ
オチニル化ペプチドをPBS、0.05％のトゥイーン20、１
％のBSAに10ng/mlの濃度で溶解し、ウェル当たり100μ
ｌの１時間のインキュベーションによりストレプトアビ
ジン被覆マイクロタイタプレートに結合する。続いて、
未結合のペプチドをPBS、0.05％のトゥイーン20で３回
洗浄することにより除去する。
それぞれの場合、試験すべき試料150μｌ（血清、血
漿または標準物質）を実施例４に従って本発明の抗体15
0μｌを用いて37℃で２時間（または４℃で一夜）イン
キュベートする。この混合物100μｌをそれぞれの場合
にマイクロタイタプレートのウェル中の結合デカペプチ
ドに添加し、37℃で60分間インキュベートする。このプ
ロセスにおいて、試料とのインキュベーション後に未だ
結合されていない抗血清の過剰の抗体のみが固定化デカ
ペプチドに結合し得る。
PBS/0.05％のトゥイーン20で３回洗浄した後、結合抗
体を抗ウサギ−IgG−POD接合体（ベーリンガーマンハイ
ムGmbH、カタログNo.1238850）およびABTS（商標）（1m
g/ml）によるその後のインキュベーションにより検出す
る。
164人の患者の血清を、本発明の試験（MTP競合試験）
を使用して測定した。これらの結果を、ラジオイムノア
ッセイ（RIA）を使用して測定したデータと比較した。
このRIA ICTP（フィンランドのオリオン・ディアグノス
チカからのテロペプチドICTP［125I］）は、酵素的消化
および生化学方法により生成され、単離される架橋コラ
ーゲンフラグメントをベースとする。本発明の方法がRI
A値と良く相関関係がある測定値を生じることが、今、
図１から明らかであり、これは、本発明の方法が臨床上
意味のあるデータを生じることを意味する。0.959の相
関係数を測定した。
配列表 （２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:9アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:1: （２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:16アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:2: （２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:10アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号:3:
フロントページの続き (72)発明者 フーバー，エラスムス ドイツ連邦共和国 ディー―86923 フ ィニンク エスティー． ヴィリバルト 10番地 (72)発明者 サイデル，クリストフ ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴ ァイルハイム スタインシュトラーセ ６ビー番地 (72)発明者 エシッグ，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国 ディー―82152 プ ラネーク ヨセフ―フォン ヒルシュ― シュトラーセ 51番地 (56)参考文献 特開 昭63−292061（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−503823（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 C07K 7/06 C07K 7/08 C07K 14/78

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】コラーゲンの非らせんのＣ末端領域または
    Ｎ末端領域の配列に相当する合成線状ペプチドを含む結
    合パートナーを、合成線状ペプチドと結合できる抗体お
    よび試料と共にインキュベートし、そして結合パートナ
    ーへの抗体の結合を適当な方法で測定することを特徴と
    する、試料中のコラーゲンまたはコラーゲンフラグメン
    トを検出するための競合イムノアッセイ。
  2. 【請求項２】コラーゲンまたはコラーゲンフラグメント
    を検出するための競合イムノアッセイにおいて標準曲線
    または較正曲線を作成するための標準物質であって、コ
    ラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配
    列に相当する合成線状ペプチドを含む抗原を含むことを
    特徴とする標準物質。
  3. 【請求項３】コラーゲンの非らせんのＣ末端領域または
    Ｎ末端領域の配列に相当する線状ペプチドを合成し、そ
    して好適なキャリヤー分子にスペーサーを介してそのＮ
    末端またはＣ末端アミノ酸によりカップリングすること
    を特徴とする、請求項２に記載の標準物質の調製方法。
  4. 【請求項４】コラーゲンまたはコラーゲンフラグメント
    に対する抗体を産生させるための抗原であって、コラー
    ゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配列に
    相当する合成線状ペプチドを含むことを特徴とする抗
    原。
  5. 【請求項５】コラーゲンの非らせんのＣ末端領域または
    Ｎ末端領域の配列に相当する線状ペプチドを合成し、そ
    してキャリヤータンパク質に、所望によりスペーサーを
    介して、そのＮ末端またはＣ末端アミノ酸によりカップ
    リングすることを特徴とする請求項４に記載の抗原の調
    製方法。
  6. 【請求項６】請求項４に記載の抗原により免疫し、免疫
    した動物の血清から目的の抗体を単離することにより得
    られるか、または免疫した動物の脾臓細胞を不死化し、
    目的の抗体を産生する不死化脾臓細胞をクローニング
    し、そしてそのクローン化細胞もしくはそれらの培養上
    澄みから抗体を単離することにより得られる、コラーゲ
    ンまたはコラーゲンフラグメントに対する抗体。
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