JP2703116B2 - コラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するためのイムノアッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ
−末端領域の配列に相当する合成直鎖状ペプチドを認識
する少なくとも一つの抗体を用いて試料中のコラーゲン
またはコラーゲン断片を検出するためのイムノアッセイ
に関する。ここにおいて試料は変性させることが望まし
い。

コラーゲンは皮膚、軟骨、および骨の結合組織におけ
る重要な構造タンパク質である。それぞれ３本の鎖から
なる11種のコラーゲンが知られている。それぞれのコラ
ーゲンはα１、α２、およびα３と称される１−３種類
の異なる鎖からなる（E.Millerら、Methods in Enzyolo
gy 144より、Structural and Contractile Proteins,L.
Cunningham編、Acodemic Press Inc.1987,p.3−41）。
特に骨や軟骨のような特定の組織の成熟コラーゲンに特
徴的な性質は、ヒドロキシリシルピリジノリンまたはリ
シルピリジノリンによる隣接する線維の架橋形成である
（D.Fujimotoら、J.Biochem.83（1978）,863−867;D.Ey
reら、Ann.Rev.Biochem.53（1984）,717−748およびD.E
yre,Methods in Enzymology 144（1987）,115−139）。
こうした架橋をコラーゲンの特異的検出のための化学的
なマーカーとして利用できる、（Z.Gunja−Smithら、Bi
ochem.J.197（1981）,759−762）。細胞外コラーゲンが
分解した場合、ペプチド側鎖を有するヒドロキシリシル
ピリジノリン若しくはリシルピリジノリン誘導体が、ま
たはリシル若しくはヒドロキシリシル残基を有する遊離
のピリジノリン誘導体が、血液や尿といった体液中に移
行する。したがって、体液におけるこうした化合物の検
出は、例えば骨粗鬆症の場合および骨組織の腫瘍の結果
として起こるような、細胞外コラーゲンの分解の指標と
なる。尿から単離できる適当な架橋コラーゲン断片を用
いた免疫によって得られるモノクローナル抗体が、上記
のようなペプチド側鎖を有するヒドロキシリシルピリジ
ノリンまたはリシルピリジノリン誘導体の検出のため
に、WO89/12824に記述された。また、WO91/08478に記載
された方法において、コラーゲン検査は、天然の、すな
わちin vivoで生じる、コラーゲンの架橋された分解産
物に対する抗体を利用する。

天然起源から分離される上記のようなペプチドの欠点
は、試験における抗原または結合パートナーを再現性よ
く生産するための信頼性のある起源が存在しないことで
ある。天然起源から分離されたペプチドのもう一つの欠
点は、感染性要素が混入する危険があることである。

例えば抗原のエピトープに相当するペプチドの化学合
成によって、特定の抗原を得ることができる。このよう
な目的で分子量約700−1500D程度の小さなペプチドを使
用する場合には、免疫原としての作用を有する抗原を得
るためにこのようなペプチドをさらに担体分子に結合さ
せる必要がある。この過程で、担体分子との結合によっ
てエピトープの構造が変化してはならない。したがっ
て、担体分子との結合は予想されるエピトープ領域から
十分離れたペプチド鎖の末端で予め行なっておく（Labo
ratory Technics in Biochemistry and Molecular Biol
ogy,Synthetic Polypeptides as Antigens,R.H.Burdon
およびP.H.van Knippenberg編、Elsevier,Amsterdam,Ne
w York,Oxford 1988,95−100ページ）。

架橋コラーゲンの天然分解産物に相当する特定の抗原
を化学合成するに際して問題となるのは、化学合成が非
常に複雑であるような架橋から生じるヒドロキシリシル
ピリジノリンまたはリシルピリジノリン構造である。

したがって、本発明の目的は、競合イムノアッセイに
おいてコラーゲンまたはコラーゲン断片に対する抗体の
特異的な結合パートナーとして使用するために、またコ
ラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するための競合イ
ムノアッセイにおいて標準曲線または検量線を確立する
ための標準物質として使用するために、コラーゲンまた
はコラーゲン断片に対する抗体を作成するための特定の
抗原を提供することである。

試料中のコラーゲンまたはコラーゲン分解産物を検出
するためには、架橋構造それ自体を、またはヒドロキシ
リシル若しくはリシル残基の架橋に由来する、いわゆる
架橋ペプチドを検出する必要があると以前から考えられ
ている。これは、こうしたヒドロキシリシルピリジノリ
ンまたはリシルピロジノリン構造がコラーゲンを特徴づ
けるためである。このような検出方法の例は、WO89/128
24,WO91/08478,WO89/04491およびWO91/10141に記載され
る。

驚くべきことに、コラーゲンの非らせんの直鎖状Ｃ−
末端またはＮ−末端領域の配列に対応する合成直鎖状ペ
プチドを含有する特定の抗原、結合パートナー、または
標準物質を使用するだけで上記の目的を達成できること
が明らかになった。イムノアッセイにおける結合パート
ナーとして、標準物質として、または抗体生産における
免疫原として、合成直鎖状ペプチドを使用する利点は、
天然起源のペプチドとは対照的に、合成ペプチドは正確
に定義された構造を再現して作成することができるとい
う点である。さらに、このような短い合成ペプチドを使
用するイムノアッセイは妨害を受けにくい。

このように、本発明は試料においてコラーゲンまたは
コラーゲン断片を検出するための競合イムノアッセイに
関するが、このイムノアッセイの特徴は、コラーゲンの
非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に対応す
る合成直鎖状ペプチドを含有する結合パートナーを、こ
の合成直鎖状ペプチドと結合可能な抗体および試料とと
もにインキュベートし、抗体と結合パートナーとの結合
を適当な方法で定量することである。

試料を変性させること、またはもっと適切に言うなら
ば試料中に存在するコラーゲンまたはコラーゲン断片を
変性させること、そしてそれによってエピトープが抗体
結合を受け入れやすくすることが特に有益であることが
判明した。最もよい方法は、試料を抗体とインキュベー
トする前に当業者に公知のタンパク質変性剤で前処理す
ることである。試料と特異抗体との免疫学的反応の妨害
を抑え、または完全に回避するために、変性させた試料
を抗体とともにインキュベートする前に、さらに希釈す
ることが望ましい。こうした目的のために当業者に知ら
れているあらゆる試薬が変性剤として適している。２−
6Mの濃度のチオシアン酸カリウム（KSCN）および0.5−2
Mの濃度の臭化テトラデシルトリエチルアンモニウム（T
TAB）が変性に特に適していることが判明した。

試料変性段階を導入することによって、未変性試料と
はごくわずかしか結合しない抗体を利用することが可能
になり、さらに言い換えれば、こうした抗体は変性試料
とは非常によく結合する。したがって、このような変性
段階を導入した結果、より多くの抗体がコラーゲンまた
はコラーゲン断片の診断用検査に利用可能である。

さらに本発明は、コラーゲンまたはコラーゲン断片を
検出するための競合イムノアッセイにおいて標準曲線ま
たは検量線を確立するための標準物質に関し、コラーゲ
ンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に対
応する合成ペプチドを含む抗原を含有するという特徴を
有する。

さらに同様に、本発明は、コラーゲンまたはコラーゲ
ン断片に対する抗体を生産するための、コラーゲンの非
らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に相当する
合成直鎖状ペプチドを含有する抗原、およびこうした抗
原を用いて生産される抗体に関する。

コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域
のあらゆる連続的なアミノ酸配列が、合成直鎖状ペプチ
ドとして適している。こうした領域は、Chuら、Nature
310,337−340（1984）,Clicら、Biochemistry 9,4699−
4706（1970）,Morganら、J.Biol.Chem.245,5042−5048
（1970）およびBernardら、Biochemistry 22,5213−522
3（1983）から公知である。５から25アミノ酸を含んで
なるペプチドを使用することが望ましく、特に８から20
アミノ酸を含むものが望ましい。この点について、上記
配列が架橋領域を含んでなる必要はないが、架橋領域と
オーバーラップすることも可能である。しかしながら、
ヒドロキシリシルピリジノリンまたはリシルピリジノリ
ン架橋が合成ペプチド中に存在することは決してない。
コラーゲンのＣ−末端領域由来の合成ペプチドが特に適
していることが判明したが、これはコラーゲンの非らせ
ん状Ｎ−末端領域よりも非らせん状Ｃ−末端の方が長い
ためである。したがってＮ−末端領域よりもＣ−末端領
域で、数多くの潜在的エピトープを利用することが可能
である。コラーゲンのα１鎖のＣ−末端領域に由来し、
配列番号1,2,3,または４に示す配列を有するペプチドが
特に適している。

コラーゲンの分解産物の濃度は、骨溶解の程度に関し
重要な診断上の目安となる。合成直鎖状ペプチドによっ
て、コラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するための
競合イムノアッセイを行なうことが可能となる。驚くべ
きことに、こうしたペプチドは、血漿、血清または尿と
いった天然試料中に存在するコラーゲン断片と、このよ
うなコラーゲン断片に対する抗体に関して非常によく競
合すること、したがってこうしたペプチドによって競合
試験が可能となることが明らかになった。コラーゲンま
たはコラーゲン分解産物に対する上記のような抗体は、
例えばOrion Diagnostica Company Finlandからテロペ
プチドICTP［¹²⁵I］ラジオイムノアッセイキットとして
市販されている。しかしながら、本発明にしたがって合
成直鎖状ペプチドを用いて上記抗体を作成することが可
能であり、望ましい。

競合イムノアッセイに用いるために、合成直鎖状ペプ
チドを固相に結合した結合パートナーとしてそのまま使
用することができるが、第２の成分と結合させることも
可能である。第２の成分との結合は、直鎖状ペプチドの
Ｎ−末端およびＣ−末端アミノ酸を介して行なうことが
望ましい。さらに、ペプチドと第２の成分との間にスペ
ーサーを挿入することができる。第２の成分は、例え
ば、ペプチドを間接的に固相に結合させるために機能す
ることができる。このような例は当業者に公知である。
ウシ血清アルブミンにペプチドを結合させ、その結合産
物を吸着作用によってプラスチック管のような固相に結
合させることが望ましい。また、ペプチドをビオチンに
共有結合させることも可能である。次に、予め固相に結
合したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させる
ことによって固相に付着させる。例えば、２以上のペプ
チドがアルブミン、イムノグロブリン、β−ガラクトシ
ダーゼ、ポリリシンのようなポリマー、またはEP−Ａ−
O 545 350に記載されたようなデキストラン分子、ある
いはラテックスのような粒子と結合するような競合比濁
阻止イムノアッセイ（TINIA）において、第２の成分は
２以上のペプチドの担体としても機能することができ
る。担体分子当り30から40のペプチド分子を結合するこ
とが望ましい。ペプチドを、標識を表す成分と結合する
こともできる。これらすべての検査変法の例は当業者に
公知である。

検査手順において、抗体を試料および合成直鎖状ペプ
チドを含有する結合パートナーと同時にまたは順次続け
てインキュベートすることができる。次に、結合した抗
体または非結合抗体の量を常法により定量する。例え
ば、使用する抗体それ自体を標識してもよく、このよう
な標識は結合または非結合抗体の測定標準として直接的
に機能する。例えば、上記抗体のFc部分に対するよう
な、結合または非結合抗体に対する第２の標識抗体を使
用することもできる。TINIAのような凝集試験、またはF
PIA（蛍光偏光イムノアッセイ）（W.Dandlikerら、J.Ex
p.Med.122（1965）,1029）、EMIT（エンザイムマルチプ
ライドイムノアッセイ）（Gunzerら、Kontakte III（19
80）,3−11）およびCEDIA法（Hendersonら、Clinical C
hemistry 32（1986）,1637−1641）が、例えば、結合ま
たは非結合抗体の量を測定するための競合試験の変法と
して機能することも可能である。本発明のペプチドが抗
体との結合について試料と競合する特定の結合パートナ
ーとして使用するのに特に適していることが判明した。
配列番号1,2,3または４に示す配列を有する合成直鎖状
ペプチドが特に望ましい。

どの程度の抗体が結合パートナーと結合したかを定量
した後、このような抗体の結合度合は試料中の抗原量の
指標となるので、同様に処理された標準物質と比較する
ことによって、常法により試料中の抗原の正確な量を定
量することができる。

天然材料から単離されたコラーゲン分解産物を標準物
質として使用することは可能である。しかしながら、こ
れらはある一定の内在的な可変性によって特徴づけられ
る。本発明の合成直鎖状ペプチドを含有する抗原の方
が、標準物質として適していると判明した。この場合、
標準物質の抗原は、上記ペプチドのみから構成されても
よく、または例えばペプチドの水溶性を高めるために機
能する適当な担体と結合した上記ペプチドからなっても
よい。ペプチドおよび担体を含んでなる標準物質を作成
するために、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ
−末端領域の配列に対応する直鎖状ペプチドを合成し、
適当な結合法によって、そのＮ−末端またはＣ−末端ア
ミノ酸を介して担体分子と結合させる。担体分子当り１
または２以上のペプチドを結合させることができる。結
合はスペーサーを介して行なうことも選択できる。凝集
試験のようなある一定の目的のために、異なる配列を有
する２以上の本発明のペプチドを担体分子に結合させる
ことは、特に、本発明の抗原を使って作成されずしたが
って通常２以上のエピトープを認識するポリクローナル
抗体を試験に使用する場合には、有益であると考えられ
る。

コラーゲン分解産物に対する既知の抗体を競合アッセ
イにおいて抗体として使用することができる。本発明の
直鎖状合成ペプチドを含有する抗原を用いて得られた抗
体は、特に適している。

免疫のために、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端また
はＮ−末端領域の１または２以上の配列に対応する直鎖
状合成ペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニ
ン、ウシ血清アルブミン、またはエデスチンのような適
当な担体タンパク質に結合することが望ましい。

このような抗原または免疫原を作成するために、まず
直鎖状ペプチドを常法により化学的に合成する。次に、
マレインイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルを用いて、合成ペプチドをＮ−末端アミノ基
を介して前記の担体タンパク質に結合させる。驚くべき
ことに、配列番号1,2,3または４に示す配列を有する合
成直鎖状ペプチドは競合試験法に適した抗体の生産に特
に適していることが明らかになった。

コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域
の配列に相当する合成直鎖状ペプチドを含有する本発明
の抗原によって、本発明のペプチドのみならず、体液中
に存在するコラーゲンの分解産物も認識する抗体を得る
ことが可能となる。

したがって、本発明はさらに、本発明の抗原によって
免疫し、そして免疫した動物の血清から求める抗体を公
知の方法により単離することによる、コラーゲンまたは
コラーゲン断片に対する抗体の生産方法に関する。求め
る抗体は、担体タンパク質、特にセファロースに結合し
た配列番号1,2,3または４に示す配列を有するペプチド
に対する免疫吸着によって単離することが望ましい。

本発明の望ましい主題は、本発明の抗原により免疫
し、免疫した動物の脾細胞を不死化させ、求める抗体を
産生する不死化脾細胞をクローニングし、およびクロー
ン化細胞から、またはクローン化細胞の培養上清から抗
体を単離することによって、コラーゲンまたはコラーゲ
ン断片に対する単クローン性抗体を生産する方法であ
る。

通常免疫に使用される動物により、免疫を行なう。マ
ウスまたはウサギの使用が望ましい。例えばハイブリド
ーマ法（KohlerおよびMilstein,Nature 256（1975）,49
5−497）のような当業者に公知の方法によって、または
エプスタイン−バール（Epstein−Barr）ウイルスによ
るトランスフォーメーション（EBVトランスフォーメー
ション）によって、免疫した動物の脾細胞を不死化す
る。求める抗体を生産する不死化細胞を検出するため
に、一般的なイムノアッセイとして培養上清試料を免疫
に使用した本発明の抗原とともにインキュベートし、抗
体がこの抗原と結合するかどうか調べる。

さらに本発明は、本発明の方法によって得られるポリ
クローナルおよびモノクローナル抗体に関する。

上記のようなポリクローナルおよびモノクローナル抗
体は、免疫のために使用した本発明のハプテンと反応す
るのみならず、コラーゲンとも、体液中に見いだされる
コラーゲンの自然分解産物ともよく反応する。試料中に
存在するコラーゲンまたはその断片は変性させることが
望ましく、それによってほとんどの場合、本発明の抗体
の結合が相当に向上する。

したがって、本発明の抗体をコラーゲンまたはコラー
ゲン断片の定量のための検査手順において使用すること
ができる。

それゆえ本発明はさらに、コラーゲンの非らせん状Ｃ
−末端またはＮ−末端領域の配列に対応する合成直鎖状
ペプチドを認識する少なくとも一つの抗体を用いて試料
中のコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するための
イムノアッセイであって、試料を変性させることを特徴
とするイムノアッセイに関する。本発明の直鎖状ペプチ
ドをさらに使用する上記の競合イムノアッセイが最も適
していることが判明した。本発明の抗体の使用は決して
競合イムノアッセイに限定されない。抗体はサンドイッ
チイムノアッセイのような他の検査形式にも使用するこ
とができる。現時点の技術水準で得られる抗体を、例え
ば上記のイムノアッセイにおける第２の抗体として使用
することができる。これら二つの抗体が同一の結合部位
について相互に競合しないよう注意することだけは必要
である。

さらに本発明は、抗体を組織試料とともにインキュベ
ートし、この抗体に結合するコラーゲン分解産物を定量
することによって骨溶解を定量するための、本発明のポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体の使用に関す
る。

本発明はさらに、第１の試薬中にはタンパク質変性剤
を含有し、これとは別に第２の試薬中にはコラーゲンの
非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に対応す
る合成直鎖状ペプチドを認識する抗体を含有する、試料
中のコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するための
組合せ試薬に関する。試薬は水性で、好ましくは緩衝化
された溶液の状態（この場合、免疫学的反応を妨害しな
い当業者に公知のあらゆる一般的な緩衝液を上記の緩衝
液として使用することができる）、または乾燥した、好
ましくは凍結乾燥した混合物の状態（水のような適当な
溶媒を添加することによってこの混合物を再構成するこ
とができる）で存在する。

また、妨害を減らす物質、タンパク質または界面活性
剤といった他の一般的な検査添加剤も含有することがで
きる。試薬の組合せはさらに、コラーゲンの非らせん状
Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に対応する合成直鎖
状ペプチドも抗体の結合パートナーとして含有する。合
成直鎖状ペプチドは担体と直接結合してもよく、または
固相との結合を仲介する第２の成分と結合してもよい。
こうしたペプチドは標識を表す成分と結合することも可
能である。

さらに、標準曲線または検量線を確立するための標準
物質が、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末
端領域の配列に対応する合成ペプチドを含む抗原を含有
する第３の試薬中に存在してもよい。

本発明は配列表とともに以下の実施例によってより詳
細に説明される。

配列番号１は、９アミノ酸からなる本発明のペプチド
の配列を示し、ここで、Xaaは不定のアミノ酸を表す。

配列番号２は、16アミノ酸からなる本発明のペプチド
の配列を示す。

配列番号３は、10アミノ酸からなる本発明のペプチド
の配列を示す。

配列番号４は、13アミノ酸からなる本発明のペプチド
の配列を示す。

実施例１ ペプチド合成 配列表の配列番号２および３に示すコラーゲンアミノ
酸配列の部分配列を有するペプチドを、フルオレニルメ
チルオキシカルボニル（Fmoc）固相ペプチド合成によっ
て、ａ）Labortec SP 640 ペプチド合成機、またはｂ）
Zinsser分析用SPMS 350 ペプチド合成機で合成する。

以下のFmocアミノ酸誘導体のそれぞれを4.0当量ず
つ、記載の順序で使用する： Lys 第三ブチルオキシカルボニル保護基を有する Glu 第三ブチルエステル保護基を有する Gln 側鎖保護基無し Pro 側鎖保護基無し Pro 側鎖保護基無し Gln 側鎖保護基無し Pro 側鎖保護基無し Leu 側鎖保護基無し Phe 側鎖保護基無し Ser 第三ブチルエーテル保護基を有する Phe 側鎖保護基無し Asp 第三ブチルエステル保護基を有する Phe 側鎖保護基無し Gly 側鎖保護基無し Ala 側鎖保護基無し アセチル 無水酢酸 アミノ酸またはアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリド
ンに溶解する。

0.87mmol/gの保持量を有する3gの４−（２′,4′−ジ
メトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）−フェノキシ
樹脂上で（Tetrahedron Letters 28（1987）,2107）ペ
プチドを合成する（JACS 95（1973）,1328）。Fmocアミ
ノ酸誘導体に関して4.4当量のジシクロヘキシルカルボ
ジイミドおよび4.8当量のＮ−ヒドロキシヘンゾトリア
ゾールを用いて、反応溶媒としてジメチルホルムアミド
中で、60分間カップリング反応を行なう。カップリング
収率はイソプロパノールで洗浄した合成用樹脂洗浄した
合成用樹脂上で、Kaiserテスト（Anal.Biochem.34（197
0）,595）によってモニターする。これが完全な変換を
示さない場合には、上記の条件で再カップリングさせて
変換を完了させる。合成の各段階の後で、ジメチルホル
ムアミド中20％のピペリジンを用いて20分以内にFmoc基
を切断する。樹脂の保持量は、各回のピペリジン処理
後、遊離されたフルベン基のUV吸収によって定量され
る。合成後、保持量はなお0.68mmol/gである。

ペプチドを合成用樹脂から遊離させ、酸に不安定な保
護基を80mlのトリフロロ酢酸、5mlのエタンジチオー
ル、2.5gのフェノール、2.5mlのｍ−クレゾールおよび5
mlの水を用いて室温で60分以内に切断する。

次に、反応溶液を減圧濃縮する。残留分をジイソプロ
ルエーテルにとり、0.5−２時間激しく撹拌した後、濾
過する。次にこれを、溶出剤として0.5％酢酸を用いてS
ephadex G15でのゲル濾過クロマトグラフィーによって
予備的に精製する。続いて、得られた粗精製標品を濾過
し、100％緩衝液Ａ（水、0.1％トリフロロ酢酸）から10
0％緩衝液Ｂ（60％アセトニトリル、40％水、0.1％トリ
フロロ酢酸）への濃度勾配を用いてNucleosil RP18（カ
ラム40mm ｘ 250mm 300オングストローム、５μｍ）
上で調製用HPLCによって120分以内に単離する。溶出さ
れた標品を高速原子緩衝質量分析（FAB−MS）によって
同定する。

0.47mmol/gの保持量を有する30mgの４−（２′,4′−
ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）−フェノキ
シ樹脂SA 5030（Advanced Chemtech Company製）上で、
ペプチドを合成する。下記のFmocアミノ酸誘導体のそれ
ぞれ140μmolを、２回、それぞれの場合についてジメチ
ルホルムアミドDMF中140μmolの１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾールおよびDMF中10μmolのN,N−ジイソプロピ
ルカルボジイミドとともに、構築されるべき固相−結合
ペプチドに結合させた： Glu トリチル保護基を有する Ser 第三ブチル保護基を有する Asp 第三ブチル保護基を有する Pro 側鎖保護基無し Leu 側鎖保護基無し Phe 側鎖保護基無し Gly 側鎖保護基無し Ala 側鎖保護基無し カップリング時間は30分および40分とした。切断時間
は20分とし、50％ピペリジンDMF溶液を用いて行なっ
た。洗浄段階は、DMFを用いて各反応段階後に８回行な
った。

予め濾過して溶媒を除去しジクロロメタンおよびメタ
ノールで洗浄しておいた樹脂を、90％トリフロロ酢酸、
３％チオアニソール、３％エタンジチオールおよび３％
チオクレゾールを含む1mlの溶液を用いて20分および140
分処理することによってペプチドを遊離させた。集めた
溶液に15mlの冷ジイソプロピルエーテルを添加すること
によって産物を沈澱させ、濾過によって単離した。残渣
を50％酢酸に溶解し、凍結乾燥した。HPLCによれば79％
の純度で8mgの白色凍結乾燥標品が得られた。FAB質量分
析によって同一性を確認した。

実施例２ ペプチドの活性化 マレインイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（MHS）によるアシル化によって、実施例1a）
にしたがって合成されたペプチドを活性化する。このた
めに、0.1mmolのペプチドを20mlの0.1mol/lリン酸カリ
ウム乾燥液（pH7.5）に溶解し、0.1mmolMHSを6mlジオキ
サンに溶解した溶液と混合し、20℃で20分間撹拌する。
次に、pH値を氷酢酸でpH4に調整し、反応混合物をただ
ちに凍結乾燥する。凍結乾燥標品を5mlの水に溶解し、1
00％Ａ（水、0.1％トリフルオロ酢酸）から100％Ｂ（9
9.9％アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸）への溶
離勾配を用いて、Waters Delta−Pak C18カラム（100
オングストローム、15μｍ 50x300mm）で、調整用HPLC
によって精製する。

実施例３ 活性化ペプチドを担体タンパク質に結合させることによ
る免疫原の作成 活性化ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン
（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）、およびβ−ガラ
クトシダーゼ（βGal）とカップリングさせることにつ
いて述べる。実施例２にしたがってMHSで活性化された
ペプチドをカップリングするために、担体タンパク質は
遊離のSH基を有する必要がある。β−Galは自然の状態
でこれを有しているため、さらに前処理する必要はな
い。KLHおよびBSAの場合には、リジン残基のε−アミノ
側鎖のNH₂基を、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル
チオプロピオン酸（SATP）で処理して誘導体化し、これ
によってSH基に変換する。

こうして、天然型と比較してSH基の増加した担体タン
パク質が得られる。このために、500mlの0.1mol/lリン
酸カリウム緩衝液（pH8.5）に溶解した1.39gのKLHに、1
13.51mgのSATP（10mlジオキサンに溶解）を20分間で滴
下して添加する。20℃で30分間撹拌した後、反応溶液の
pH値を0.1mol/l水酸化ナトリウムを用いてpH8.5に再調
整し、さらに24時間撹拌する。次に、溶液をAmiconセル
（メンブランYM10）によって100mlに濃縮し、3x24時
間、各回につき、31の0.1mol/lリン酸カリウム緩衝液
（pH8.5）/0.05mol/l塩化ナトリウムに対して透析した
後、凍結乾燥する。

Ｓ−アセチル保護基を切断するために、481mgのKLH−
SATP凍結乾燥標品を20mlの0.1mol/lリン酸カリウム緩衝
液（pH8.5）/0.05mol/l塩化ナトリウムに溶解し、直前
に調製した0.5mlの1mol/lヒドロキシルアミン溶液と混
合し、20℃で90分間撹拌する。

実施例２にしたがって得られた7.23molの活性化ペプ
チド（4ml水に溶解）を誘導体化した担体タンパク質に
加え、20℃で20時間撹拌する。次に、濁りの生じた溶液
を２回、11の0.1mol/lリン酸カリウム緩衝液（pH8.5）/
0.05mol/l塩化ナトリウムに対して透析する。透析物を
遠心分離し、透明な上清をデカントして、凍結乾燥す
る。

実施例４ 直鎖状コラーゲン断片に対するポリクローナル抗体の作
成 実施例３で得られた免疫原を用いて、５頭のヒツジを
それぞれ公知の方法により免疫した。この免疫原は、Ｉ
型コラーゲンのα鎖の配列のうちアミノ酸番号892から9
07に対応する、配列番号 ２に示す配列を有するペプチ
ドを含有していた。KLHまたはβ−ガラクトシダーゼ
は、担体タンパク質として機能した。フロイント完全ア
ジュバントに溶解した免疫原を用いて動物を一ヶ月間隔
で免疫した。用量は動物個体当り、免疫処置当り500μ
ｇとした。初回免疫から４カ月後に血液試料を採取し、
得られた抗体のコラーゲン断片との反応について調べ
た。

抗血清のコラーゲン断片との反応を検出するためのELIS
A 以下の材料および試薬を使用した： ミクロイタープレートMaxisorp F96,Nunc Company コーティング緩衝液:50mM炭酸ナトリウム（pH9.6）0.1
％NaN₃ インキュベーション緩衝液:10mMリン酸ナトリウム（pH
7.4） 0.1％Tween20 0.9％NaCl １％ウシ血清アルブミン 基質溶液:ABTS 、Boehringer Mannheim GambH,カタロ
グ番号857424 シグナルを増加させるために2mg/mlバニリン
を添加した。

洗浄溶液:0.1％Tween20 0.9％NaCl タイタープレートの各ウェルに、コーティング緩衝液
中に10μg/mlのコラーゲン断片を含有する溶液100μｌ
を容れた。コラーゲン断片は、骨起源のヒトコラーゲン
をEP−Ａ−O 505 210の説明にしたがってプロテアーゼ
消化することによって調製した。振盪しながら室温で１
時間インキュベートした後、洗浄溶液で３回洗浄した。

抗血清を1:4000にインキュベーション緩衝液で希釈
し、100μｌずつをミクロタイタープレートのウェル中
で振盪しながら室温で１時間インキュベートした。次
に、ウェルを洗浄溶液で３回洗浄した。

ヒツジ−IgGのFc部分に対するウサギ抗体と西洋ワサ
ビペルオキシダーゼとの複合体をインキュベーション緩
衝液で12.5mU/mlの濃度に希釈し、ミクロタイタープレ
ートの各ウェルに100μｌ上記を容れる。振盪しながら
室温で１時間インキュベートした後、タイタープレート
を洗浄溶液で３回洗浄する。

100μｌの基質溶液を添加して、透明な色が生じるま
でインキュベートする（10−60分）。405および492nmで
の測定の差異として、吸光度を測定する。

ほとんどの動物の血清が、固相上でコラーゲン断片と
の強い反応を示した。免疫しなかった動物の血清は同一
条件下で弱い測定シグナルしか示さなかった。結果を表
１に示す。

実施例３の免疫原によって、同様の方法によりマウス
を免疫し、抗血清を得た。三つの抗血清233/20、241/1
3、および242/2が特に適していた。抗血清223/20は、KL
Hに結合した配列番号 ４に対応するデカペプチドを用
いて免疫されたマウスから得られた。

抗血清241/13は、KLHに結合した16アミノ酸の長さの
配列番号 ２に対応するペプチドを用いて免疫されたマ
ウスから得られた。

抗血清244/2は、βGalに結合した16アミノ酸の長さの
配列番号 ２に対応するペプチドを用いて免疫されたマ
ウスから得られた。

実施例５ 競合試験による体液中のコラーゲンおよびその分解産物
の定量 96穴ミクロタイタープレートのウェルを、EP−Ａ−O
344 578のストレプトアビジン（PBS中１μg/mlの溶液を
100μｌ）を用いて４℃で一晩コーティングし、なお遊
離の非特異的結合サイトを300μｌのBSA（ウシ血清アル
ブミン、10mg/ml）とともに室温で２時間インキュベー
トすることによってブロックする。

実施例1b）にしたがって調製された、配列番号 ３に
示す配列を有するデカペプチドを、Ｄ−ビオチニル−ε
−アミドカプロン酸−Ｎ−スクシンイミドエステル（Bo
ehringer Mannheim,カタログ番号1008960）を用い、製
造業者の説明書にしたがって、そのアミノ末端でビオチ
ニル化する。ビオチニル化したペプチドを10ng/mlの濃
度でPBS、0.05％Tween20、１％BSAに溶解し、ウェル当
り10μｌを１時間インキュベートすることによって、ス
トレプトアビジンでコーティングしたミクロタイタープ
レートに結合させる。次に、未結合のペプチドをPBS,0.
05％Tween20で３回洗浄することによって除去する。

検査すべき試料（血清、血漿または標準物）の150μ
ｌを、それぞれ、実施例４で得られた本発明の抗体150
μｌとともに37℃で２時間（または４℃で一晩）インキ
ュベートする。この混合物100μｌをそれぞれ、ミクロ
タイタープレートのウェル内の結合したデカペプチドに
添加し、37℃で60分間インキュベートする。試料ととも
にインキュベートした後、なお結合していない抗血清の
抗体過剰分だけが、固定化されたデカペプチドと結合す
ることができる。

PBS/0.05％Tween20で３回洗浄後、結合した抗体を次
にウサギ抗−ヒツジIgG−POD複合体（Boehringer Mannh
eim GmbH）およびABTS （1mg/ml）とともにインキュベ
ートすることによって検出する。

164人の患者の血清を本発明の試験を用いて測定した
（MTP競合試験）。結果は、ラジオイムノアッセイ（RI
A）で定量されたデータと関連性があった。このRIA IC
TP（テロペプチドICTP［¹²⁵I］、Orion Diagnostica Co
mpany,Finnlandより入手）は、酵素的消化および生化学
的方法によって調製、単離された、架橋されたコラーゲ
ン断片に基づいている。第１図から、本発明の方法が結
果的にRIA値とよく相関する測定値を与えることが理解
され、このことは本発明の方法が臨床的に相応するデー
タを与えることを意味する。0.959の相関係数が決定さ
れた。

実施例６ コラーゲン由来のＣ−末端ペプチドの定量に関する変性
剤の影響 配列番号 ３に対応するビオチニル化されたデカペプ
チドを、実施例５に記載のようにストレプトアビジンで
コーティングしたミクロタイタープレートに結合させ
る。

別に、Risteli（1993）にしたがって調製されたコラ
ーゲンの断片であるＣ−末端テロペプチド（CTX）をミ
クロタイタープレート（Nunc,Maxisorb）の表面に吸着
させた。このために、１μg/mlのCTXを含有する溶液100
μｌをミクロタイタープレートの各ウェル内で４℃で一
晩インキュベートする。遊離の非特異的結合サイトを30
0μｌウシ血清アルブミン（10mg/mlPBS）とともに室温
で２時間インキュベートすることによってブロックす
る。

CTX溶液を試料として使用する。この試料をPBS溶液の
み（対照）、3Mチオシアン酸カリウム（KSCN）を含有す
るPBS、または１％臭化テトラデシルトリエチルアンモ
ニウム（TTAB）を含有する溶液のいずれかで前処理す
る。等量のCTX溶液および緩衝液溶液を混合し、１時間
インキュベートする。次に、混合物を0.05％Tween20
含有PBS溶液で1:10に希釈したが、これは変性剤を希釈
しないと抗体の免疫反応性に影響する可能性があるため
である。

このようにして前処理された試料100μｌを、デカペ
プチドまたはCTXのいずれか一方で上記のようにコーテ
ィングされたミクロタイタープレート中で、室温で１時
間、マウスポリクローナル抗体の溶液100μｌとともに
インキュベートする。結合しない抗体を0.05％Tween20
含有PBSで３回洗浄することによって除去した。ヒツ
ジ抗−マウスＦ（ab）−POD複合体（Boehringer Mannhe
im GmbH,カタログ番号1172808）およびABTS （1mg/m
l）を用いて、結合した抗体を検出した。

実施例４に記載したマウス223/20、241/31および242/
2から得られた抗血清を、使用前に0.05％Tween20 含有
PBSで1:2000に希釈して抗血清として使用した。

結果を表２にまとめて示す（測定吸光度）。変性剤の
ないPBS中のCTXはマウス血清242/2と有意な競合を示す
のみである。変性剤KSCNおよびTTABの使用は、あらゆる
場合に、たとえ変性剤なしでは有意な競合を示さなかっ
た抗血清との競合についても、激しい競合の増加をもた
らす。

配列表 （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:9アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:16アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）配列：配列番号:2: （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:10アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:3: （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:13アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:4:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ザイデル，クリストフ ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴ ァイルハイム，シュタインシュトラーセ ６ビー番地 (72)発明者 エシッグ，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国 ディー―82152 プ ラネッグ，ヨセフ―フォン―ヒルシュ― シュトラーセ 51番地 (56)参考文献 特開 昭61−172064（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−168372（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−261199（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−20126（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−116262（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−503823（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−504896（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／8195（ＷＯ，Ａ１) 欧州公開505210（ＥＰ，Ａ１)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｉ型コラーゲンの非らせん状Ｃ末端または
   Ｎ末端領域に対応する合成直鎖状ペプチドを含む一つの
   結合パートナーを、その合成直鎖状ペプチドと結合可能
   な抗体および試料とともにインキュベートし、抗体と結
   合パートナーとの結合を適当な方法で測定することを含
   んでなり、その際試料を変性させることからなる、試料
   中のＩ型コラーゲンまたはＩ型コラーゲン断片を検出す
   るための競合イムノアッセイ。
2. 【請求項２】合成直鎖状ペプチドがＩ型コラーゲンの非
   らせん状Ｃ末端領域の配列に対応する、請求項１に記載
   の競合イムノアッセイ。
3. 【請求項３】合成直鎖状ペプチドが５から25個のアミノ
   酸からなる、請求項１または２に記載の競合イムノアッ
   セイ。
4. 【請求項４】合成ペプチドが配列番号１、２、３または
   ４に示した配列に対応する、請求項１〜３のいずれか１
   項に記載の競合イムノアッセイ。
5. 【請求項５】抗体とインキュベートする前に試料を変性
   させる、請求項１に記載の競合イムノアッセイ。
6. 【請求項６】TTABまたはKCSNを変性剤として使用する、
   請求項１記載の競合イムノアッセイ。
7. 【請求項７】試料を変性させ、Ｉ型コラーゲンの非らせ
   ん状Ｃ末端またはＮ末端領域の配列に対応する合成直鎖
   状ペプチドを認識する少なくとも一つの抗体を用いて試
   料中のＩ型コラーゲンまたはＩ型コラーゲン断片を検出
   するためのイムノアッセイ。
8. 【請求項８】タンパク質変性剤を第１の試薬中に含有
   し、これとは別に第２の試薬中に、Ｉ型コラーゲンの非
   らせん状Ｃ末端またはＮ末端領域の配列に対応する合成
   直鎖状ペプチドを認識する抗体を含有する、試料中のＩ
   型コラーゲンまたはＩ型コラーゲン断片を検出するため
   の組合せ試薬。
9. 【請求項９】試薬が、さらにＩ型コラーゲンの非らせん
   状Ｃ末端またはＮ末端領域の配列に対応する合成直鎖状
   ペプチドを含有する、請求項８に記載の組合せ試薬。