JPH08509294A - コラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するためのイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に対応する合成直鎖状ペプチドを認識する抗体を用いて試料中のコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するためのイムノアッセイに関する。このアッセイにおいて、試料を変性させることが望ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 コラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するための イムノアッセイ 本発明は、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に相 当する合成直鎖状ペプチドを認識する少なくとも一つの抗体を用いて試料中のコ ラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するためのイムノアッセイに関する。ここ において試料は変性させることが望ましい。 コラーゲンは皮膚、軟骨、および骨の結合組織における重要な構造タンパク 質である。それぞれ３本の鎖からなる１１種のコラーゲンが知られている。それ ぞれのコラーゲンはα１、α２、およびα３と称される１−３種類の異なる鎖か らなる（E．Milleｒら、Methods in Enzymology 144より、Structural and Cont ractile Proteins，L．Cunningham編、Academic Press Inc．1987，p.3-41）。 特に骨や軟骨のような特定の組織の成熟コラーゲンに特徴的な性質は、ヒドロキ シリシルピリジノリンまたはリシルピリジノリンによる隣接する線維の架橋形成 である（D．Fujimotoら、J．Biochem．83（1978），863-867；D．Eyreら、Ann． Rev．Biochem．53（1984），717-748およびD．Eyre，Methods in Enzymology 14 4（1987），115-139）。こうした架橋をコラーゲンの特異的検出のための化学的 なマーカーとして利用できる（Z．Gunja-Smithら、Biochem．J．197（1981），7 59-762）。細胞外コラーゲンが分解した場合、ペプチド側鎖を有するヒドロキシ リシルピ リジノリン若しくはリシルピリジノリン誘導体が、またはリシル若しくはヒドロ キシリシル残基を有する遊離のピリジノリン誘導体が、血液や尿といった体液中 に移行する。したがって、体液におけるこうした化合物の検出は、例えば骨粗鬆 症の場合および骨組織の腫瘍の結果として起こるような、細胞外コラーゲンの分 解の指標となる。尿から単離できる適当な架橋コラーゲン断片を用いた免疫によ って得られるモノクローナル抗体が、上記のようなペプチド側鎖を有するヒドロ キシリシルピリジノリンまたはリシルピリジノリン誘導体の検出のために、WO 8 9/12824に記述された。また、WO 91/08478に記載された方法において、コラーゲ ン検査は、天然の、すなわちin vivoで生じる、コラーゲンの架橋された分解産 物に対する抗体を利用する。 天然起源から分離される上記のようなペプチドの欠点は、試験における抗原 または結合パートナーを再現性よく生産するための信頼性のある起源が存在しな いことである。天然起源から分離されたペプチドのもう一つの欠点は、感染性要 素が混入する危険があることである。 例えば抗原のエピトープに相当するペプチドの化学合成によって、特定の抗 原を得ることができる。このような目的で分子量約７００−１５００Ｄ程度の小 さなペプチドを使用する場合には、免疫原としての作用を有する抗原を得るため にこのようなペプチドをさらに担体分子に結合させる必要がある。この過程で、 担体分子との結合によってエピトープの構造が変化してはならない。したがって 、担体分子との結合は予想されるエピトープ領域から十分離れたペプチド鎖の末 端で予め行なっておく（Laboratory Technics in Biochemistry and Molecular Biology，Synthetic Polypeptides as Antigens，R．H．Burdon および P．H．van Knippenberg編、Elsevier，Amst erdam，New York，Oxford 1988，95-100ページ）。 架橋コラーゲンの天然分解産物に相当する特定の抗原を化学合成するに際し て問題となるのは、化学合成が非常に複雑であるような架橋から生じるヒドロキ シリシルピリジノリンまたはリシルピリジノリン構造である。 したがって、本発明の目的は、競合イムノアッセイにおいてコラーゲンまた はコラーゲン断片に対する抗体の特異的な結合パートナーとして使用するために 、またコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するための競合イムノアッセイに おいて標準曲線または検量線を確立するための標準物質として使用するために、 コラーゲンまたはコラーゲン断片に対する抗体を作成するための特定の抗原を提 供することである。 試料中のコラーゲンまたはコラーゲン分解産物を検出するためには、架橋構 造それ自体を、またはヒドロキシリシル若しくはリシル残基の架橋に由来する、 いわゆる架橋ペプチドを検出する必要があると以前から考えられている。これは 、こうしたヒドロキシリシルピリジノリンまたはリシルピロジノリン構造がコラ ーゲンを特徴づけるためである。このような検出方法の例は、WO 89/12824，WO 91/08478，WO 89/04491およびWO 91/10141に記載される。 驚くべきことに、コラーゲンの非らせんの直鎖状Ｃ−末端またはＮ−末端領 域の配列に対応する合成直鎖状ペプチドを含有す る特定の抗原、結合パートナー、または標準物質を使用するだけで上記の目的を 達成できることが明らかになった。イムノアッセイにおける結合パートナーとし て、標準物質として、または抗体生産における免疫原として、合成直鎖状ペプチ ドを使用する利点は、天然起源のペプチドとは対照的に、合成ペプチドは正確に 定義された構造を再現して作成することができるという点である。さらに、この ような短い合成ペプチドを使用するイムノアッセイは妨害を受けにくい。 このように、本発明は試料においてコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出 するための競合イムノアッセイに関するが、このイムノアッセイの特徴は、コラ ーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に対応する合成直鎖状ペ プチドを含有する結合パートナーを、この合成直鎖状ペプチドと結合可能な抗体 および試料とともにインキュベートし、抗体と結合パートナーとの結合を適当な 方法で定量することである。 試料を変性させること、またはもっと適切に言うならば試料中に存在するコ ラーゲンまたはコラーゲン断片を変性させること、そしてそれによってエピトー プが抗体結合を受け入れやすくすることが特に有益であることが判明した。最も よい方法は、試料を抗体とインキュベートする前に当業者に公知のタンパク質変 性剤で前処理することである。試料と特異抗体との免疫学的反応の妨害を抑え、 または完全に回避するために、変性させた試料を抗体とともにインキュベートす る前に、さらに希釈することが望ましい。こうした目的のために当業者に知られ ているあらゆる試薬が変性剤として適している。２−６Ｍの濃度のチオシアン酸 カリ ウム（ＫＳＣＮ）および０．５−２Ｍの濃度の臭化テトラデシルトリエチルアン モニウム（ＴＴＡＢ）が変性に特に適していることが判明した。 試料変性段階を導入することによって、未変性試料とはごくわずかしか結合 しない抗体を利用することが可能になり、さらに言い換えれば、こうした抗体は 変性試料とは非常によく結合する。したがって、このような変性段階を導入した 結果、より多くの抗体がコラーゲンまたはコラーゲン断片の診断用検査に利用可 能である。 さらに本発明は、コラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するための競合イ ムノアッセイにおいて標準曲線または検量線を確立するための標準物質に関し、 コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に対応する合成ペプ チドを含む抗原を含有するという特徴を有する。 さらに同様に、本発明は、コラーゲンまたはコラーゲン断片に対する抗体を 生産するための、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に 相当する合成直鎖状ペプチドを含有する抗原、およびこうした抗原を用いて生産 される抗体に関する。 コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域のあらゆる連続的なア ミノ酸配列が、合成直鎖状ペプチドとして適している。こうした領域は、Chuら 、Nature 310，337-340（1984），Clickら、Biochemistry 9，4699-4706（1970 ），Morganら、J．Biol．Chem．245，5042-5048（1970）およびBernardら、Bioc hemistry 22，5213-5223（1983）から公知である。５から２５アミノ酸 を含んでなるペプチドを使用することが望ましく、特に８から２０アミノ酸を含 むものが望ましい。この点について、上記配列が架橋領域を含んでなる必要はな いが、架橋領域とオーバーラップすることも可能である。しかしながら、ヒドロ キシリシルピリジノリンまたはリシルピリジノリン架橋が合成ペプチド中に存在 することは決してない。コラーゲンのＣ−末端領域由来の合成ペプチドが特に適 していることが判明したが、これはコラーゲンの非らせん状Ｎ−末端領域よりも 非らせん状Ｃ−末端の方が長いためである。したがってＮ−末端領域よりもＣ− 末端領域で、数多くの潜在的エピトープを利用することが可能である。コラーゲ ンのα１鎖のＣ−末端領域に由来し、配列番号１，２，３，または４に示す配列 を有するペプチドが特に適している。 コラーゲンの分解産物の濃度は、骨溶解の程度に関し重要な診断上の目安と なる。合成直鎖状ペプチドによって、コラーゲンまたはコラーゲン断片を検出す るための競合イムノアッセイを行なうことが可能となる。驚くべきことに、こう したペプチドは、血漿、血清または尿といった天然試料中に存在するコラーゲン 断片と、このようなコラーゲン断片に対する抗体に関して非常によく競合するこ と、したがってこうしたペプチドによって競合試験が可能となることが明らかに なった。コラーゲンまたはコラーゲン分解産物に対する上記のような抗体は、例 えばOrion Diagnostica Company FinlandからテロペプチドＩＣＴＰ［¹²⁵Ｉ］ラ ジオイムノアッセイキットとして市販されている。しかしながら、本発明にした がって合成直鎖状ペプチドを用いて上記抗体を作成することが可能であり、望ま しい。 競合イムノアッセイに用いるために、合成直鎖状ペプチドを固相に結合した 結合パートナーとしてそのまま使用することができるが、第２の成分と結合させ ることも可能である。第２の成分との結合は、直鎖状ペプチドのＮ−末端および Ｃ−末端アミノ酸を介して行なうことが望ましい。さらに、ペプチドと第２の成 分との間にスペーサーを挿入することができる。第２の成分は、例えば、ペプチ ドを間接的に固相に結合させるために機能することができる。このような例は当 業者に公知である。ウシ血清アルブミンにペプチドを結合させ、その結合産物を 吸着作用によってプラスチック管のような固相に結合させることが望ましい。ま た、ペプチドをビオチンに共有結合させることも可能である。次に、予め固相に 結合したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることによって固相に付 着させる。例えば、２以上のペプチドがアルブミン、イムノグロブリン、β−ガ ラクトシダーゼ、ポリリシンのようなポリマー、またはEP-A-O 545 350に記載さ れたようなデキストラン分子、あるいはラテックスのような粒子と結合するよう な競合比濁阻止イムノアッセイ（ＴＩＮＩＡ）において、第２の成分は２以上の ペプチドの担体としても機能することができる。担体分子当り３０から４０のペ プチド分子を結合することが望ましい。ペプチドを、標識を表す成分と結合する こともできる。これらすべての検査変法の例は当業者に公知である。 検査手順において、抗体を試料および合成直鎖状ペプチドを含有する結合パ ートナーと同時にまたは順次続けてインキュベートすることができる。次に、結 合した抗体または非結合抗体の量を常法により定量する。例えば、使用する抗体 それ自体を標識し てもよく、このような標識は結合または非結合抗体の測定標準として直接的に機 能する。例えば、上記抗体のＦｃ部分に対するような、結合または非結合抗体に 対する第２の標識抗体を使用することもできる。ＴＩＮＩＡのような凝集試験、 またはＦＰＩＡ（蛍光偏光イムノアッセイ）（W．Dandlikerら、J．Exp．Med．1 22（1965），1029）、ＥＭＩＴ（エンザイムマルチプライドイムノアッセイ）（ Gunzerら、KontakteIII（1980），3-11）およびＣＥＤＩＡ法（Hendersonら、Cl inical Chemistry 32（1986），1637-1641）が、例えば、結合または非結合抗体 の量を測定するための競合試験の変法として機能することも可能である。本発明 のペプチドが抗体との結合について試料と競合する特定の結合パートナーとして 使用するのに特に適していることが判明した。配列番号１，２，３または４に示 す配列を有する合成直鎖状ペプチドが特に望ましい。 どの程度の抗体が結合パートナーと結合したかを定量した後、このような抗 体の結合度合は試料中の抗原量の指標となるので、同様に処理された標準物質と 比較することによって、常法により試料中の抗原の正確な量を定量することがで きる。 天然材料から単離されたコラーゲン分解産物を標準物質として使用すること は可能である。しかしながら、これらはある一定の内在的な可変性によって特徴 づけられる。本発明の合成直鎖状ペプチドを含有する抗原の方が、標準物質とし て適していると判明した。この場合、標準物質の抗原は、上記ペプチドのみから 構成されてもよく、または例えばペプチドの水溶性を高めるために機能する適当 な担体と結合した上記ペプチドからなってもよい。 ペプチドおよび担体を含んでなる標準物質を作成するために、コラーゲンの非ら せん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に対応する直鎖状ペプチドを合成し、 適当な結合法によって、そのＮ−末端またはＣ−末端アミノ酸を介して担体分子 と結合させる。担体分子当り１または２以上のペプチドを結合させることができ る。結合はスペーサーを介して行なうことも選択できる。凝集試験のようなある 一定の目的のために、異なる配列を有する２以上の本発明のペプチドを担体分子 に結合させることは、特に、本発明の抗原を使って作成されずしたがって通常２ 以上のエピトープを認識するポリクローナル抗体を試験に使用する場合には、有 益であると考えられる。 コラーゲン分解産物に対する既知の抗体を競合アッセイにおいて抗体として 使用することができる。本発明の直鎖状合成ペプチドを含有する抗原を用いて得 られた抗体は、特に適している。 免疫のために、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の１ま たは２以上の配列に対応する直鎖状合成ペプチドを、キーホールリンペットヘモ シアニン、ウシ血清アルブミン、またはエデスチンのような適当な担体タンパク 質に結合することが望ましい。 このような抗原または免疫原を作成するために、まず直鎖状ペプチドを常法 により化学的に合成する。次に、マレインイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステルを用いて、合成ペプチドをＮ−末端アミノ基を介して前記の 担体タンパク質に結合させる。驚くべきことに、配列番号１，２，３または４に 示す配列を有する合成直鎖状ペプチドは競合試験法に適した抗体の 生産に特に適していることが明らかになった。 コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に相当する合成 直鎖状ペプチドを含有する本発明の抗原によって、本発明のペプチドのみならず 、体液中に存在するコラーゲンの分解産物も認識する抗体を得ることが可能とな る。 したがって、本発明はさらに、本発明の抗原によって免疫し、そして免疫し た動物の血清から求める抗体を公知の方法により単離することによる、コラーゲ ンまたはコラーゲン断片に対する抗体の生産方法に関する。求める抗体は、担体 タンパク質、特にセファロースに結合した配列番号１，２，３または４に示す配 列を有するペプチドに対する免疫吸着によって単離することが望ましい。 本発明の望ましい主題は、本発明の抗原により免疫し、免疫した動物の脾細 胞を不死化させ、求める抗体を産生する不死化脾細胞をクローニングし、および クローン化細胞から、またはクローン化細胞の培養上清から抗体を単離すること によって、コラーゲンまたはコラーゲン断片に対する単クローン性抗体を生産す る方法である。 通常免疫に使用される動物により、免疫を行なう。マウスまたはウサギの使 用が望ましい。例えばハイブリドーマ法（KｏhlerおよびMilstein，Nature 256 （1975），495-497）のような当業者に公知の方法によって、またはエプスタイ ン−バール（Epstein-Barr）ウイルスによるトランスフォーメーション（ＥＢＶ トランスフォーメーション）によって、免疫した動物の脾細胞を不死化する。求 める抗体を生産する不死化細胞を検出するために、一 般的なイムノアッセイとして培養上清試料を免疫に使用した本発明の抗原ととも にインキュベートし、抗体がこの抗原と結合するかどうか調べる。 さらに本発明は、本発明の方法によって得られるポリクローナルおよびモノ クローナル抗体に関する。 上記のようなポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、免疫のために使 用した本発明のハプテンと反応するのみならず、コラーゲンとも、体液中に見い だされるコラーゲンの自然分解産物ともよく反応する。試料中に存在するコラー ゲンまたはその断片は変性させることが望ましく、それによってほとんどの場合 、本発明の抗体の結合が相当に向上する。 したがって、本発明の抗体をコラーゲンまたはコラーゲン断片の定量のため の検査手順において使用することができる。 それゆえ本発明はさらに、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端 領域の配列に対応する合成直鎖状ペプチドを認識する少なくとも一つの抗体を用 いて試料中のコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するためのイムノアッセイ であって、試料を変性させることを特徴とするイムノアッセイに関する。本発明 の直鎖状ペプチドをさらに使用する上記の競合イムノアッセイが最も適している ことが判明した。本発明の抗体の使用は決して競合イムノアッセイに限定されな い。抗体はサンドイッチイムノアッセイのような他の検査形式にも使用すること ができる。現時点の技術水準で得られる抗体を、例えば上記のイムノアッセイに おける第２の抗体として使用することができる。これら二つの抗体が同一の結合 部位について相互に競合しないよう注意することだけ は必要である。 さらに本発明は、抗体を組織試料とともにインキュベートし、この抗体に結 合するコラーゲン分解産物を定量することによって骨溶解を定量するための、本 発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体の使用に関する。 本発明はさらに、第１の試薬中にはタンパク質変性剤を含有し、これとは別 に第２の試薬中にはコラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列 に対応する合成直鎖状ペプチドを認識する抗体を含有する、試料中のコラーゲン またはコラーゲン断片を検出するための組合せ試薬に関する。試薬は水性で、好 ましくは緩衝化された溶液の状態（この場合、免疫学的反応を妨害しない当業者 に公知のあらゆる一般的な緩衝液を上記の緩衝液として使用することができる） 、または乾燥した、好ましくは凍結乾燥した混合物の状態（水のような適当な溶 媒を添加することによってこの混合物を再構成することができる）で存在する。 また、妨害を減らす物質、タンパク質または界面活性剤といった他の一般的 な検査添加剤も含有することができる。試薬の組合せはさらに、コラーゲンの非 らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に対応する合成直鎖状ペプチドも抗 体の結合パートナーとして含有する。合成直鎖状ペプチドは担体と直接結合して もよく、または固相との結合を仲介する第２の成分と結合してもよい。こうした ペプチドは標識を表す成分と結合することも可能である。 さらに、標準曲線または検量線を確立するための標準物質が、コラーゲンの 非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列に 対応する合成ペプチドを含む抗原を含有する第３の試薬中に存在してもよい。 本発明は配列表とともに以下の実施例によってより詳細に説明される。 配列番号１は、９アミノ酸からなる本発明のペプチドの配列を示し、ここで、Ｘ aaは不定のアミノ酸を表す。 配列番号２は、１６アミノ酸からなる本発明のペプチドの配列を示す。 配列番号３は、１０アミノ酸からなる本発明のペプチドの配列を示す。 配列番号４は、１３アミノ酸からなる本発明のペプチドの配列を示す。 実施例１ ペプチド合成 配列表の配列番号２および３に示すコラーゲンアミノ酸配列の部分配列を有 するペプチドを、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）固相ペプチド合 成によって、ａ）Labortec SP 640 ペプチド合成機、またはｂ）Zinsser 分析用 SMPS 350 ペプチド合成機で合成する。 ａ）アセチル−Ser-Ala-Gly-Phe-Asp-Phe-Ser-Phe-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Gln-Gl u-Lys-アミド（配列番号 ２）の生産 以下のFmocアミノ酸誘導体のそれぞれを４．０当量ずつ、記載の順序で使用 する： Lys 第三ブチルオキシカルボニル保護基を有する Glu 第三ブチルエステル保護基を有する Gln 側鎖保護基無し Pro 側鎖保護基無し Pro 側鎖保護基無し Gln 側鎖保護基無し Pro 側鎖保護基無し Leu 側鎖保護基無し Phe 側鎖保護基無し Ser 第三ブチルエーテル保護基を有する Phe 側鎖保護基無し Asp 第三ブチルエステル保護基を有する Phe 側鎖保護基無し Gly 側鎖保護基無し Ala 側鎖保護基無し アセチル 無水酢酸 アミノ酸またはアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリドンに溶解する。 ０．８７ｍｍｏｌ／ｇの保持量を有する３ｇの４−（２'，４'−ジメトキシ フェニル−Fmoc−アミノメチル）−フェノキシ樹脂上で（Tetrahedron Letters 28（1987），2107）ペプチドを合成する（JACS 95（1973），1328）。Fmocアミ ノ酸誘導体に関して４．４当量のジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４．８ 当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて、反応溶媒としてジメチルホ ルムアミド中で、６０分間カップリング反応を行なう。カップリング収率はイソ プロパノールで洗浄した合成用樹脂 上で、Kaiserテスト（Anal．Biochem．34（1970），595）によってモニターする 。これが完全な変換を示さない場合には、上記の条件で再カップリングさせて変 換を完了させる。合成の各段階の後で、ジメチルホルムアミド中２０％のピペリ ジンを用いて２０分以内にFmoc基を切断する。樹脂の保持量は、各回のピペリジ ン処理後、遊離されたフルベン基のＵＶ吸収によって定量される。合成後、保持 量はなお０．６８ｍｍｏｌ／ｇである。 ペプチドを合成用樹脂から遊離させ、酸に不安定な保護基を８０ｍｌのトリ フロロ酢酸、５ｍｌのエタンジチオール、２．５ｇのフェノール、２．５ｍｌの ｍ−クレゾールおよび５ｍｌの水を用いて室温で６０分以内に切断する。 次に、反応溶液を減圧濃縮する。残留分をジイソプロピルエーテルにとり、 ０．５−２時間激しく撹拌した後、濾過する。次にこれを、溶出剤として０．５ ％酢酸を用いてSephadex G15でのゲル濾過クロマトグラフィーによって予備的に 精製する。続いて、得られた粗精製標品を濾過し、１００％緩衝液Ａ（水、０． １％トリフロロ酢酸）から１００％緩衝液Ｂ（６０％アセトニトリル、４０％水 、０．１％トリフロロ酢酸）への濃度勾配を用いてNucleosil RP18（カラム４ ０ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ ３００オングストローム、５μｍ）上で調製用ＨＰＬＣによっ て１２０分以内に単離する。溶出された標品を高速原子衝撃質量分析（FAB-MS） によって同定する。 ｂ）Ala-Gly-Phe-Asp-Phe-Ser-Phe-Leu-Pro-Gln（配列番号 ３）の合成 ０．４７ｍｍｏｌ／ｇの保持量を有する３０ｍｇの４−（２ '，４'−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）−フェノキシ樹脂SA 5030 （Advanced Chemtech Company製）上で、ペプチドを合成する。下記のFmocアミ ノ酸誘導体のそれぞれ１４０μｍｏｌを、２回、それぞれの場合についてジメチ ルホルムアミドＤＭＦ中１４０μｍｏｌの１−ヒドロキシベンゾトリアゾールお よびＤＭＦ中１０μｍｏｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドとともに、 構築されるべき固相−結合ペプチドに結合させた： Glu トリチル保護基を有する Ser 第三ブチル保護基を有する Asp 第三ブチル保護基を有する Pro 側鎖保護基無し Leu 側鎖保護基無し Phe 側鎖保護基無し Gly 側鎖保護基無し Ala 側鎖保護基無し カップリング時間は３０分および４０分とした。切断時間は２０分とし、５ ０％ピペリジンＤＭＦ溶液を用いて行なった。洗浄段階は、ＤＭＦを用いて各反 応段階後に８回行なった。 予め濾過して溶媒を除去しジクロロメタンおよびメタノールで洗浄しておい た樹脂を、９０％トリフロロ酢酸、３％チオアニソール、３％エタンジチオール および３％チオクレゾールを含む１ｍｌの溶液を用いて２０分および１４０分処 理することによってペプチドを遊離させた。集めた濾液に１５ｍｌの冷ジイソプ ロピルエーテルを添加することによって産物を沈澱させ、濾過によって単離した 。残渣を５０％酢酸に溶解し、凍結乾燥した。ＨＰ ＬＣによれば７９％の純度で８ｍｇの白色凍結乾燥標品が得られた。ＦＡＢ質量 分析によって同一性を確認した。 配列番号 ４のCys-Gly-Ser-Ala-Gly-Phe-Asp-Phe-Ser-Phe-Leu-Pro-Glnの 配列を有するペプチドも、同様の方法で合成した。 実施例２ ペプチドの活性化 マレインイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＨＳ）に よるアシル化によって、実施例１ａ）にしたがって合成されたペプチドを活性化 する。このために、０．１ｍｍｏｌのペプチドを２０ｍｌの０．１ｍｏｌ／ｌリ ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、０．１ｍｍｏｌＭＨＳを６ｍｌジ オキサンに溶解した溶液と混合し、２０℃で２０分間撹拌する。次に、ｐＨ値を 氷酢酸でｐＨ４に調整し、反応混合物をただちに凍結乾燥する。凍結乾燥標品を ５ｍｌの水に溶解し、１００％Ａ（水、０．１％トリフルオロ酢酸）から１００ ％Ｂ（９９．９％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）への溶離勾配を 用い ５０ｘ３００ｍｍ）で、調整用ＨＰＬＣによって精製する。 実施例３ 活性化ペプチドを担体タンパク質に結合させることによる免疫原の作成 活性化ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬ Ｈ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびβ−ガラクトシダーゼ（βＧａｌ ）とカップリングさせることについて述べる。実施例２にしたがってＭＨＳで活 性化されたペプチドをカップリングするために、担体タンパク質は遊離のＳＨ基 を有する必要がある。β−Ｇａｌは自然の状態でこれを有しているため、さらに 前処理する必要はない。ＫＬＨおよびＢＳＡの場合には、リジン残基のε−アミ ノ側鎖のＮＨ₂基を、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオン酸（ ＳＡＴＰ）で処理して誘導体化し、これによってＳＨ基に変換する。 こうして、天然型と比較してＳＨ基の増加した担体タンパク質が得られる。 このために、５００ｍｌの０．１ｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５ ）に溶解した１．３９ｇのＫＬＨに、１１３．５１ｍｇのＳＡＴＰ（１０ｍｌジ オキサンに溶解）を２０分間で滴下して添加する。２０℃で３０分間撹拌した後 、反応溶液のｐＨ値を０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８．５に 再調整し、さらに２４時間撹拌する。次に、溶液をAmiconセル（メンブランＹＭ １０）によって１００ｍｌに濃縮し、３ｘ２４時間、各回につき、３１の０．１ ｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）／０．０５ｍｏｌ／ｌ塩化ナト リウムに対して透析した後、凍結乾燥する。 Ｓ−アセチル保護基を切断するために、４８１ｍｇのＫＬＨ−ＳＡＴＰ凍結 乾燥標品を２０ｍｌの０．１ｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）／ ０．０５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムに溶解し、直前に調製した０．５ｍｌの１ｍ ｏｌ／ｌヒドロキシルアミン溶液と混合し、２０℃で９０分間撹拌する。 実施例２にしたがって得られた７．２３ｍｏｌの活性化ペプチド（４ｍｌ水 に溶解）を誘導体化した担体タンパク質に加え、２０℃で２０時間撹拌する。次 に、濁りの生じた溶液を２回、１ｌの０．１ｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ ｐＨ８．５）／０．０５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムに対して透析する。透析物を 遠心分離し、透明な上清をデカントして、凍結乾燥する。 実施例４ 直鎖状コラーゲン断片に対するポリクローナル抗体の作成 実施例３で得られた免疫原を用いて、５頭のヒツジをそれぞれ公知の方法に より免疫した。この免疫原は、Ｉ型コラーゲンのα鎖の配列のうちアミノ酸番号 ８９２から９０７に対応する、配列番号 ２に示す配列を有するペプチドを含有 していた。ＫＬＨまたはβ−ガラクトシダーゼは、担体タンパク質として機能し た。フロイント完全アジュバントに溶解した免疫原を用いて動物を一ヶ月間隔で 免疫した。用量は動物個体当り、免疫処置当り５００μｇとした。初回免疫から ４カ月後に血液試料を採取し、得られた抗体のコラーゲン断片との反応について 調べた。 抗血清のコラーゲン断片との反応を検出するためのＥＬＩＳＡ 以下の材料お よび試薬を使用した： ミクロタイタープレートMaxisorp F96，Nunc Company コーティング緩衝液：５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６） ０．１％ＮａＮ₃ インキュベーション緩衝液：１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．４） ０．１％Tween 20 ０．９％ＮａＣｌ １％ウシ血清アルブミン 洗浄溶液：０．１％Tween 20 ０．９％ＮａＣｌ タイタープレートの各ウェルに、コーティング緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの コラーゲン断片を含有する溶液１００μｌを容れた。コラーゲン断片は、骨起源 のヒトコラーゲンをEP-A-O 505 210の説明にしたがってプロテアーゼ消化するこ とによって調製した。振盪しながら室温で１時間インキュベートした後、洗浄溶 液で３回洗浄した。 抗血清を１：４０００にインキュベーション緩衝液で希釈し、１００μｌず つをミクロタイタープレートのウェル中で振盪しながら室温で１時間インキュベ ートした。次に、ウェルを洗浄溶液で３回洗浄した。 ヒツジ−ＩｇＧのＦｃ部分に対するウサギ抗体と西洋ワサビペルオキシダー ゼとの複合体をインキュベーション緩衝液で１２．５ｍＵ／ｍｌの濃度に希釈し 、ミクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌ上記を容れる。振盪しながら 室温で１時間インキュベートした後、タイタープレートを洗浄溶液で３回洗浄す る 。 １００μｌの基質溶液を添加して、透明な色が生じるまでインキュベートす る（１０−６０分）。４０５および４９２ｎｍでの測定の差異として、吸光度を 測定する。 ほとんどの動物の血清が、固相上でコラーゲン断片との強い反応を示した。 免疫しなかった動物の血清は同一条件下で弱い測定シグナルしか示さなかった。 結果を表１に示す。 実施例３の免疫原によって、同様の方法によりマウスを免疫し、抗血清を得 た。三つの抗血清２２３／２０、２４１／１３、および２４２／２が特に適して いた。抗血清２２３／２０は、ＫＬＨに結合した配列番号 ４に対応するデカペ プチドを用いて免疫されたマウスから得られた。 抗血清２４１／１３は、ＫＬＨに結合した１６アミノ酸の長さの配列番号 ２に対応するペプチドを用いて免疫されたマウス から得られた。 抗血清２４２／２は、βＧａｌに結合した１６アミノ酸の長さの配列番号 ２に対応するペプチドを用いて免疫されたマウスから得られた。 実施例５ 競合試験による体液中のコラーゲンおよびその分解産物の定量 ９６穴ミクロタイタープレートのウェルを、EP-A-O 344 578のストレプトア ビジン（ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの溶液を１００μｌ）を用いて４℃で一晩コーテ ィングし、なお遊離の非特異的結合サイトを３００μｌのＢＳＡ（ウシ血清アル ブミン、１０ｍｇ／ｍｌ）とともに室温で２時間インキュベートすることによっ てブロックする。 実施例１ｂ）にしたがって調製された、配列番号 ３に示す配列を有するデ カペプチドを、Ｄ−ビオチニル−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−スクシンイミドエ ステル（Boehringer Mannheim，カタログ番号１００８９６０）を用い、製造業 者の説明書にしたがって、そのアミノ末端でビオチニル化する。ビオチニル化し たペプチドを１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ、０．０５％Tween 20、１％ＢＳＡ に溶解し、ウェル当り１０μｌを１時間インキュベートすることによって、スト レプトアビジンでコーティングしたミクロタイタープレートに結合させる。次に 、未結合のペプチドをＰＢＳ，０．０５％Tween 20で３回洗浄することによって 除去する。 検査すべき試料（血清、血漿または標準物）の１５０μｌを 、それぞれ、実施例４で得られた本発明の抗体１５０μｌとともに３７℃で２時 間（または４℃で一晩）インキュベートする。この混合物１００μｌをそれぞれ 、ミクロタイタープレートのウェル内の結合したデカペプチドに添加し、３７℃ で６０分間インキュベートする。試料とともにインキュベートした後、なお結合 していない抗血清の抗体過剰分だけが、固定化されたデカペプチドと結合するこ とができる。 ＰＢＳ／０．０５％Tween 20で３回洗浄後、結合した抗体を次にウサギ抗− ヒツジＩｇＧ−ＰＯＤ複合体（Boehringer Mannh ベートすることによって検出する。 １６４人の患者の血清を本発明の試験を用いて測定した（ＭＴＰ競合試験） 。結果は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で定量されたデータと関連性があっ た。このＲＩＡ ＩＣＴＰ（テロペプチドＩＣＴＰ［¹²⁵Ｉ］、Orion Diagnosti ca Company，Finnlandより入手）は、酵素的消化および生化学的方法によって調 製、単離された、架橋されたコラーゲン断片に基づいている。第１図から、本発 明の方法が結果的にＲＩＡ値とよく相関する測定値を与えることが理解され、こ のことは本発明の方法が臨床的に相応するデータを与えることを意味する。０． ９５９の相関係数が決定された。 実施例６ コラーゲン由来のＣ−末端ペプチドの定量に関する変性剤の影響 配列番号 ３に対応するビオチニル化されたデカペプチドを 、実施例５に記載のようにストレプトアビジンでコーティングしたミクロタイタ ープレートに結合させる。 別に、Risteli（1993）にしたがって調製されたコラーゲンの断片であるＣ −末端テロペプチド（ＣＴＸ）をミクロタイタープレート（Nunc，Maxisorb）の 表面に吸着させた。このために、１μｇ／ｍｌのＣＴＸを含有する溶液１００μ ｌをミクロタイタープレートの各ウェル内で４℃で一晩インキュベートする。遊 離の非特異的結合サイトを３００μｌウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍｌＰＢ Ｓ）とともに室温で２時間インキュベートすることによってブロックする。 ＣＴＸ溶液を試料として使用する。この試料をＰＢＳ溶液のみ（対照）、３ Ｍチオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）を含有するＰＢＳ、または１％臭化テトラ デシルトリエチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）を含有する溶液のいずれかで前処理 する。等量のＣＴＸ溶液および緩衝液溶液を混合し、１時間インキュベートする 。 に希釈したが、これは変性剤を希釈しないと抗体の免疫反応性に影響する可能性 があるためである。 このようにして前処理された試料１００μｌを、デカペプチドまたはＣＴＸ のいずれか一方で上記のようにコーティングされたミクロタイタープレート中で 、室温で１時間、マウスポリクローナル抗体の溶液１００μｌとともにインキュ ベートする。結合 とによって除去した。ヒツジ抗−マウスＦ（ａｂ）−ＰＯＤ複合体（Boehringer Mannheim GmbH，カタログ番号１１７２８０８） 出した。 実施例４に記載したマウス２２３／２０、２４１／１３および２４２／２か ら得られた抗血清を、使用前に０．０５％Tween 結果を表２にまとめて示す（測定吸光度）。変性剤のないＰＢＳ中のＣＴＸ はマウス血清２４２／２と有意な競合を示すのみである。変性剤ＫＳＣＮおよび ＴＴＡＢの使用は、あらゆる場合に、たとえ変性剤なしでは有意な競合を示さな かった抗血清との競合についても、激しい競合の増加をもたらす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ザイデル，クリストフ ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴァ イルハイム，シュタインシュトラーセ ６ ビー番地 (72)発明者 エシッグ，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国 ディー―82152 プラ ネッグ，ヨセフ―フォン―ヒルシュ―シュ トラーセ 51番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域に対応する合成直鎖状 ペプチドを含む一つの結合パートナーを、その合成直鎖状ペプチドと結合可能な 抗体および試料とともにインキュベートし、抗体と結合パートナーとの結合を適 当な方法で測定する、試料中のコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するため の競合イムノアッセイであって、試料を変性させることを特徴とするイムノアッ セイ。 ２．合成直鎖状ペプチドがコラーゲンの非らせん状Ｃ−末端領域の配列に対応す る、請求項１記載の方法。 ３．合成直鎖状ペプチドが５から２５アミノ酸からなり、好ましくは８から２０ アミノ酸からなる、請求項１および２のいずれか１項記載の方法。 ４．合成ペプチドが配列番号１，２，３または４に対応する、請求項１から３の いずれか１項記載の方法。 ５．試料を抗体とインキュベートする前に変性させる、請求項１記載のイムノア ッセイ。 ６．ＴＴＡＢまたはＫＣＳＮを変性剤として使用する、請求項１記載のイムノア ッセイ。 ７．試料を変性させ、コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配 列に対応する合成直鎖状ペプチドを認識する少なくとも一つの抗体を用いて試料 中のコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するためのイムノアッセイ。 ８．タンパク質変性剤を第１の試薬中に含有し、これとは別に第２の試薬中に、 コラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端 領域の配列に対応する合成直鎖状ペプチドを認識する抗体を含有する、試料中の コラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するための組合せ試薬。 ９．試薬が、さらにコラーゲンの非らせん状Ｃ−末端またはＮ−末端領域の配列 に対応する合成直鎖状ペプチドを含有する、請求項８記載の組合せ試薬。