WO2005038458A1

WO2005038458A1 - 試料の前処理方法及びこれを利用する免疫学的測定方法

Info

Publication number: WO2005038458A1
Application number: PCT/JP2004/015261
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Ebinuma; Hirokazu Yago; Yuka Akimoto; Osamu Miyazaki; Takashi Kadowaki; Toshimasa Yamauchi
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.; Toudai Tlo, Ltd.
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2004-10-15
Publication date: 2005-04-28
Also published as: MXPA06004234A; DE602004020372D1; CA2542825C; AU2004282755A1; EP1681567B1; CN1864067A; CA2542825A1; JP4669929B2; KR101134605B1; ATE427490T1; EP1681567A4; KR20070001874A; JPWO2005038458A1; CN1864067B; EP1681567A1; AU2004282755B2; ES2323271T3

Abstract

種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的測定法により、簡便、迅速かつ正確に測定するための試料の前処理方法の提供。試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的に測定するためのアディポネクチン測定用試料の前処理方法であって、アディポネクチンを含む試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを作用させることを特徴とする、アディポネクチン測定用試料の前処理方法。

Description

明細書

試料の前処理方法及びこれを利用する免疫学的測定方法

技術分野

[0001] 本発明は、試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的測定法により、簡便、迅速かつ正確に測定するための前処理方法及びこれを利用するアディポネクチン総量の免疫学的測定方法に関する。

背景技術

[0002] アディポネクチン (非特許文献 1一 4)は、白色脂肪組織にお!、て特異的にかつ最も多く発現している分泌蛋白質のひとつで、 244個のアミノ酸より成る約 30kDaの C1 qファミリーに属する血漿蛋白質である。

[0003] アディポネクチンは、 N末端側のコラーゲン様ドメインと C末端側のグロブラー（glob ular:球状）ドメインからなる単量体力コラーゲン様ドメイン中の Gly— X— Yの繰り返し構造により、トリプルへリックスの 3量体を形成した構造をとつている。そして、血中では 3量体同士がさらに結合し、種々の多量体を形成して存在して!/ヽることが報告されて、る（以下、総称して「種々の多量体」 t 、うことがある）。

[0004] 近年、アディポネクチンはヒト血中に 5— gZmLという高濃度で存在し、様々な生理活性を有することが報告されて、る。特に平滑筋細胞の増殖を抑制することや単球の内皮細胞への接着を抑制することから、動脈硬化の抑制効果があるものと考えられている (非特許文献 5)。また、アディポネクチンを 2型糖尿病や脂肪萎縮性糖尿病の病態マウスに投与するとインスリン抵抗性と高 FFA (遊離脂肪酸)血症、高 TG (中性脂肪)血症が改善することから、インスリン感受性ホルモンとして糖尿病の改善効果が報告されている (非特許文献 6)。さらに、アディポネクチンの血中濃度が低値の腎不全患者群は心血管合併症発症率が高ぐ生存率が低下すること、インスリン抵抗性や 2型糖尿病を高頻度で発症するピマインディアンの研究にぉヽて、血中アディポネクチン高値群では 2型糖尿病発症が抑制されて、ることが報告されて!、る (非特許文献 7)。

[0005] これらの報告より、アディポネクチンは内臓脂肪の過剰蓄積とインスリン抵抗性発症を直接リンクさせる内分泌因子である可能性が示唆され、血中アディポネクチン濃度を測定することは、糖尿病や動脈硬化などの発症予測因子として、生活習慣病の良 Vヽ指標となる可能性が考えられて、る。

[0006] 種々の多量体が混在する血液試料にお!、てアディポネクチンの総量を測定する方法としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)の存在下に煮沸して、種々の多量体にお V、て立体構造上隠れて!/、た抗体の認識部位を露出させる処理を行った後、免疫学的測定を行う方法 (特許文献 1)が報告されている。し力しながら、この方法には、煮沸（100°C)処理のための装置が必要である点、煮沸処理に引き続いて免疫学的測定をする二つの工程を自動化することが実際上困難である点などの問題があった。

[0007] また、 LINCO RESEARCH, INC.力ら「HUMAN ADIPONECTIN RIA KIT (Cat. # HADP— 61HK)が市販されているものの、当該キットは、¹²⁵1で標識したマウスアディポネクチンとヒトアディポネクチンを競合させ抗アディポネクチンーポリクローナル抗体で捕捉する二抗体 ZPEG法を利用していることから、操作が煩雑であり、安全性、特異性や試薬の品質の面に問題がある。競合反応を原理とする本法の特異性を一定にするには、 ¹²⁵ιで標識したマウスアディポネクチン及び種々の多量体ヒトアディポネクチンに対する抗アディポネクチンポリクローナル抗体の反応性が一定である必要があるが、前述したように、生体試料中には種々の多量体が混在しており、また各多量体の存在割合も一定でないことから、アディポネクチンの総量を正確に測定できな、と、う問題を内包して、る。

[0008] さらに、 SDSや熱による変性処理をしていない状態の特定の立体構造を保持して V、るアディポネクチン (特許文献 2明細書中では天然型と称して、る）を認識するモノクローナル抗体とそれを利用した測定方法 (特許文献 2)も報告されているものの、試料中のアディポネクチンの存在形態（3量体がいくつ、どのように集まっているかなど）によって前記モノクローナル抗体との反応性が異なるため、各多量体の存在割合が一定でな!、生体試料中のアディポネクチンの総量は正確に測定できなヽと、う問題かあつた。

[0009] アディポネクチンの存在形態については、生体試料中のアディポネクチンについての検討ではないものの、リコンビナントのアディポネクチンを用いた検討がある。それによれば、低 pH、ジチオスレィトール (DTT)処理 (非特許文献 8)あるいは、トリプシン処理 (非特許文献 9)することでアディポネクチンの形態が変わると!、う報告がなされて、るが、処理後のアディポネクチンの免疫学的測定にっ、ての記載はな!/、。

[0010] 上記したように、試料中のアディポネクチン総量を免疫学的に測定するには、使用する抗体との反応性を各多量体（3量体及び 3量体同士がさらに結合した種々の多量体）間で一定にする前処理が必要であった力簡便でかつ、前処理に引き続いて免疫学的測定をする二つの工程を自動化することが可能な方法は提案されて!、なかつた o

特許文献 1：特開 2000 - 304748公報

特許文献 2：国際公開 WO03Z016906公報

非特許文献 l : Scherer P. E. , et al, J. Biol. Chem. 270, 26746-2674 9, 1995

非特許文献 2 : Hu E. , et al, J. Biol. Chem. 271, 10697-10703, 199 6

特許文献 3 : Maeda K. , et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.

221, 286-289, 1996

非特許文献 4 : Nakano Y. , et al, J. Biochem. 120, 803—812, 1996 非特許文献 5 : Ouchi N, et al, Circulation, 102, 1296-1301, 2000 非特許文献 6 :Yamautchi T, et al, Nature Med. 7, 941—946, 200 非特許文献 7 : Lindsay R. S, et al, Lancet, 360, 57—58, 2002 非特許文献 8 : Utpal B. Pajvani, et al. J. Biol. Chem. 278, 9073—9

085, 2003

非特許文献 9 : Fruebis, J, et al. Proc. Natil. Acad. Sci. 98, 2005 -2531, 2001

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 本発明の目的は、 3量体及び 3量体同士がさらに結合した種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的測定法により、簡便、迅速かつ正確に測定するための前処理方法及びこれを利用するアディポネクチン総量の免疫学的測定方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0012] 本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、 3量体及び 3量体同士がさらに結合した種々の多量体を還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つで処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ポリアタリルアミド濃度 2-15%) (以下 PAGE (2-15%)のように表記する）で解析したところ、処理前に存在した種々の多量体の染色バンドが消失もしくは減少するとともに、処理前に存在した染色バンドのいずれよりも低分子側に染色検出されるアディポネクチン由来変換物（以下、変換物という）の出現を確認した。そして、当該変換物が抗アディポネクチン抗体と反応性を有して、ること、及び抗アディポネクチン抗体を使用して当該変換物を測定できることを確認した。

[0013] 本発明者らは、上記知見をもとにさらに検討した結果、試料を還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む前処理剤で処理した後、免疫学的測定を行えば、試料を前処理剤とともに煮沸処理することなぐ種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチン総量を測定できることを見い出し本発明を完成した。

[0014] すなわち、本発明は、試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的に測定するためのアディポネクチン測定用試料の前処理方法であって、アディポネクチンを含む試料に対し、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸することなく作用させることを特徴とする、アディポネクチン測定用試料の前処理方法を提供するものである。

また、本発明は、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む、アディポネクチン総量の免疫学的測定用試料の前処理剤であつて試料を煮沸することなく前処理する前処理剤を提供するものである。

また本発明は、アディポネクチンを含む試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸することなく作用させた後、免疫学的にアディポネクチンを測定することを特徴とする、試料中のァディポネクチン総量の測定方法を提供するものである。

さらに本発明は、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む第一試薬とアディポネクチンを測定するための抗体を担持させた不溶性担体を含む第二試薬よりなるアディポネクチン総量の免疫学的測定試薬であって、試料と第一試薬の反応を煮沸することなく行うための免疫学的測定試薬を提供するものである。

発明の効果

[0015] 本発明によれば、種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチン総量を簡便、迅速かつ正確に測定することができる。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]ヒト血清中のアディポネクチンをウェスタンブロティング法により解析した図である。

[図 2]LTIA試薬とプロテアーゼ処理したアディポネクチンとの反応性を示した図である。

[図 3]ELISA試薬とプロテアーゼ処理したアディポネクチンとの反応性を示した図である。

[図 4]参考例 3においてヒト血清力も精製されたアディポネクチンを、 PAGE (2-15% )にて分離し、 CBBにより蛋白染色した泳動像の図である。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 前述したように、生体試料中のアディポネクチンには種々の多量体が存在し、しかも各多量体の存在割合 (比率）は一定でない。このため免疫学的測定の際、測定に使用する抗体と種々の多量体間の反応性が異なることが考えられるが、この場合、特定の多量体が測定されに《なることが考えられる。また、サンドイッチ免疫測定系において、測定試料中に 6量体と 3量体が一分子ずつ存在する場合を仮想すると、試料中には 9個の単量体が存在するが、測定結果としては、 3量体が 2分子存在する場合、 6量体が 2分子存在する場合などを測定結果の上では区別できないことが考えられる。いずれの場合も、アディポネクチンの総量を反映した測定結果を得ることはできない。また、 SDS共存下、煮沸して多量体を分解する前処理を利用した方法においては、アディポネクチン総量を反映した測定結果が得られるものの、前処理が煩雑であり、引き続いて免疫学的測定を行う、二つの工程を自動化することが困難である

[0018] 前記した知見より、本発明者らは、免疫学的測定の際、測定に使用する抗体と測定試料中の種々の多量体との反応性が一定となり、アディポネクチンの総量を反映した測定結果が得られるような一定の形態に、試料を煮沸することなぐ種々の多量体が変換されてヽれば、前記課題が解決できることを見出した。

[0019] 前記の目的にかなう測定試料中の種々のアディポネクチンの前処理方法として、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つをアディポネクチンを含む試料に加え、試料とともに煮沸することなく作用させる処理方法を挙げることができる。これらの前処理方法によって得られる変換物の性状は各前処理方法間で同一であっても、異なっていても良い。種々の多量体が、すべて単量体である場合、 3量体である場合、特定の多量体である場合などを含む。また、前処理により、ある分子量域に収束している変換物であっても良い。別の見方をすれば、免疫学的測定系を構築するために選ばれた抗体が一定の反応性で認識できる性状を有していれば良い。

[0020] 本発明に使用される試料としては、ヒト、サル、ャギ、ヒッジ、ゥサギ、マウス、ラット、モルモット及びその他の哺乳動物力得られた血液、尿などの体液、組織抽出液や組織由来の細胞の培養上清液などアディポネクチンの種々の多量体を含有する生体試料が挙げられる。このうち、糖尿病や動脈硬化性疾患に関する情報との関係で注目されて、る血液 (血清 ·血漿）が好適である。試料の採取方法は、アディポネクチン総量を測定する目的を考慮し、試料中に存在するアディポネクチンに影響を与えなヽ方法であれば使用することが可能である。

[0021] 本発明の前処理方法、前処理剤、免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬に使用される還元剤としては、アディポネクチンのジスルフイド結合を解離できる還元力を有し、免疫学的測定において実質的に影響を与えない物質であれば特に制限することなく使用することができる。例えば、 DTT (ジチオスレィトール）、 2—メルカプトエタノール、システアミン、チォグリセロールなどのチオールィヒ合物、水素化ホウ素化合物やホスフィン類などが挙げられる。使用する濃度は、所望の変換物が得られよう適宜選択して決定できる。例えばチオールィ匕合物の場合には、 DTTや 2—メルカプトエタノールを使用するのが好ましい。還元剤による処理の条件としては、 4一 60°C、 5分一 24時間が好ましい。

[0022] 酸又はその塩としては、種々の多量体のアディポネクチンの結合を解離することができる有機酸、無機酸であれば特に制限することなく使用することができる。例えば、酢酸、クェン酸、塩酸、ギ酸、酒石酸、シユウ酸などが挙げられる。使用する濃度は、所望の変換物が得られよう適宜選択して決定できるが、 1一 lOOOmMが好ましぐ 10 一 200mMがさらに好ましい。また、緩衝液として使用することもできる。緩衝液とした際の pHとしては、 pH4以下が好ましい。酸又はその塩による処理の条件としては、 4 一 60°C、 5分一 24時間が好ましい。

[0023] 界面活性剤としては、種々の多量体に作用し、免疫学的測定にぉ、てアディポネクチン総量を反映する形態に変化させうるものであって、アディポネクチンと特異抗体との反応性を維持することが出来るものであれば、イオン性又は非イオン性などの制限なく使用することができる。なかでも陰イオン性界面活性剤が好ましぐドデシル硫酸塩等のアルキル硫酸塩ゃドデシルベンゼンスルホン酸塩等のアルキルベンゼンスルホン酸塩などが好適である。これらの界面活性剤は、単独でも複数を組合わせて使用しても良い。使用濃度は、概ね 0. 01— 10%で使用されるが、 0. 1一 5%がさらに好ましい。酸又はその塩による処理と組み合わせて使用すると、さらに好ましい。

[0024] プロテアーゼとしては、種々の多量体に作用して、種々の多量体を免疫学的測定においてアディポネクチン総量を反映する形態に変化させうるプロテアーゼであれば特に制限することなく使用することができる。使用する濃度も、所望の変換物が得られよう適宜選択して決定できる。プロテアーゼの起源も、微生物由来、動物由来、植物由来など、特に制限はないが、好適には、バチルス属、ストレプトミセス属ゃァスぺルギルス属等の微生物由来のプロテアーゼが使用できる。バチルス属由来のプロテァーゼの市販品の例としては、 Protease typeX (シグマ社）、プロチン（Protin) AC 、プロチン（Protin) PC (ともに大和化成社）、プロテアーゼ S「ァマノ」（アマノエンザィム社)、スミチーム CP (新日本化学工業社)などが挙げられる。ストレプトミセス属由来のプロテアーゼの市販品の例としては、 Protease typeXIV (シグマ社）、プロナーゼ（ロシュ社)、ァクチナーゼ AS (科研製薬社)などが挙げられる。また、ァスペルギルス属由来のプロテアーゼの巿販品の例としては、プロテアーゼ A「ァマノ」、プロテアーゼ P「ァマノ」、ゥマミザィム（、ずれもアマノエンザィム社）、スミチーム MP (新日本化学工業社)などが挙げられる。これらプロテアーゼは遺伝子組み換え技術によつて得られるものであっても差し支えない。またィ匕学修飾を施されていても良い。生体試料のプロテアーゼによる処理の条件は、用いるプロテアーゼによって異なるが、リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、 4一 60°Cで、 5分一 24時間行うことが好ましい。プロテアーゼの使用濃度は、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね 0. 01— lOOmgZmlの範囲で使用される。

[0025] これら還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの使用方法にも特に制限はない。適宜単独又は組み合わせて使用することが可能である。例えば、還元剤や酸を、アディポネクチンを含む試料に作用させた後に、さらにプロテアーゼ処理を行なうことも可能である。また、これら還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの使用にあたっては、これらの物質がアディポネクチンに作用する環境を整えたり、これら物質の保存安定性の向上などを目的として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液などの緩衝成分、種々の多量体には作用しない界面活性剤、牛血清アルブミン (BSA)、ショ糖、防腐剤 (アジィ匕ナトリウムなど)、塩濃度調整剤 (塩ィ匕ナトリウムなど)などを適宜添加して使用しても良い。

[0026] 本発明の免疫学的測定方法に使用される抗体は、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを種々の多量体アディポネクチンに煮沸処理することなく作用させた後、アディポネクチン総量を測定可能なものであれば、特に制限なく使用できる。力かる抗体の内、ポリクローナル抗体は一定の形態となつたアディポネクチンに存在する複数のェピトープと特異的に結合する複数の抗体を含むポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体はアディポネクチンを適当な動物、例えば、ゥサギ、ャギ、ヒッジ、ゥマ、ゥシ、マウス、ラットなどの動物に、それ自体公知の手法によって免疫して得ることができる。一方、モノクローナル抗体は、一定の形態となったアディポネクチンに対して特異的に結合する 1種類以上の異なるモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、細胞融合技術分野において、それ自体公知の手法を適宜に選択し、また、それらを組み合わせてモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、該細胞株を利用して取得することができる。また、一定の形態となつたアディポネクチンに特異的に結合するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、 G oat human Acrp30 antibody (コスモノィォ社、 GTネエリ、 rabbit hu adipon ectin-PoAb (コスモバイオ社、 chemicon社）、 hu Acrp30— MoAb (藤沢薬品ェ業社、 BD社)、 Mouse a hu Adiponectin MoAb (コスモノィォ社、 chemicon社 )、抗ヒト ACRP30モノクローナル抗体 (AX773、 AX741、 Ne, Na、和光純薬工業社)など、アディポネクチンの形態に応じて適宜利用できる。

[0027] 本発明に使用される抗体を得るための抗原としては、常法に従い試料カゝら精製、単離したアディポネクチンを使用することができる。還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの少なくとも!/ヽずれかを含む前処理液で煮沸処理することなく処理したアディポネクチンを用いることもできる。また、該抗原はその蛋白質の遺伝子配列情報に基づき通常の遺伝子工学的手法により組み換え蛋白として製造することちでさる。

[0028] 本発明の免疫学的測定方法としては、一定の形態に変化させたアディポネクチンに対して特異的に結合する抗体を不溶性担体に結合させ、これによつて一定の形態に変化させたアディポネクチンを捕捉し、試料中に存在するアディポネクチンの有無の確認 (定性)又は定量する方法が使用され、なかでも、 LTIA (ラテックス免疫比濁法)、 ELISA (酵素免疫測定法)、 CLEIA (化学発光酵素免疫測定法)、 RIA (ラジオイムノアツセィ）などといった方法が挙げられる。このうち、 LTIAは一定の形態に変化させたアディポネクチンと特異的に結合する抗体を担持させた不溶性担体と一定の形態に変化させたアディポネクチンとを混合することにより一定の形態に変化させたアディポネクチンを介した不溶性担体の架橋 (凝集）が起こり、その結果生じる濁りを光学的に測定することでアディポネクチンの有無の確認 (定性)又は定量する方法であり、アディポネクチンを簡便、迅速かつ正確に測定するには好ましい。 [0029] 本発明に使用される不溶性担体としては、通常の免疫学的測定試薬に使用されェ業的に大量生産可能な有機系の不溶性担体が使用される。 LTIAにおいては抗体の吸着性に優れかつ生物学的活性を長期間安定的に保持できるポリスチレン系のラテックス粒子、 ELISAにお!/ヽてはポリスチレンなどの 96穴のマイクロプレートが好ましい。

[0030] 上記不溶性担体の表面に抗体を担持させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、担持 (感作)方法として不溶性担体表面に抗体を物理的に吸着させる方法や、官能基を有する不溶性担体表面に既知の方法である物理結合法や化学結合法により抗体を効率的に感作する方法が挙げられる。

[0031] 抗体を担持させた抗体不溶性担体と一定の形態に変化させたアディポネクチンとの反応は、抗原抗体反応が起こり得る条件であれば、その反応条件は特に限定されない。反応液としては、前処理した後の一定の形態に変化させたアディポネクチンとの抗原抗体反応が起こり得る溶液であればどのようなものでも良い。例えば、 pHを制御するための緩衝成分としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など、非特異反応を回避するための界面活性剤や塩ィ匕ナトリウムなど、安定ィ匕剤としてのゥシ血清アルブミン (BSA)、ショ糖、高分子多糖類など、反応性を制御する前記物質の他にデキストランなどの水溶性多糖類、前処理剤中の還元剤や酸を中和するための中和剤、プロテアーゼの不活性化剤などの添加剤を適宜溶解させても良い。

[0032] 前記した LTIAや ELISAにおける検出方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。 LTIAにおける不溶性担体の凝集程度を測定する方法は特に限定されなヽ。例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合は、既知濃度試料の濁度の程度と測定試料の濁度の程度との比較から、凝集の程度を目視によって判定することも可能である。また、該凝集を定量的に測定する場合は、簡便性及び精度の点からは、光学的に測定することが好ましい。凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法 (凝集塊の形成を濁度の増加として捕らえる）、粒度分布による測定法 (凝集塊の形成を粒度分布ないしは平均粒径の変化として捕らえる）、積分球濁度法 (凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が利用可能である。 ELISAにおける酵素標識抗体の酵素活性に由来する、基質と酵素の反応生成物を測定する方法は特に限定されない。例えば、酵素反応生成物固有の波長、例えば 492nmにおける吸光度として 96穴マイクロプレートリーダーで読み取ることが可能である。

実施例

[0033] 次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

[0034] 実施例及び試験例で用いた試薬及び材料は以下の通りである。

<試薬及び材料 >

a.抗体結合榭脂用洗浄液： 0. 5M NaCl を含む 0. 1M NaHCO— NaOH (

3

pH 8. 3)。

b.抗体結合榭脂用溶出液: 0. 1M Glycine— HC1 (pH 2. 5)。

c.抗体結合榭脂用中和液： 2M Tris-HCl (pH 8. 0)。

d.ラテックス：平均粒径 0. 2 μ mのポリスチレン粒子ラテックス（固形分 10% (w/v) 、積水化学工業社)。

e.抗体担持ラテックス調製用緩衝液： 20mM Tris-HCl (pH 8. 0)。

f.ブロッキング用緩衝液： 2% BSA を含む 20mM Tris-HCl (pH 8. 0)。 g. LTIA用緩衝液 (Rl) : 0. 15% BSA, 0. 15M NaCl を含む 20mM Tris- HCl (pH 8. 0)。

h. ELISA用プレート： 96穴マイクロプレート（NUNC社)。

i. ELISA用抗体感作溶液: PBS (pH 7. 4)。

j . ELISA用緩衝液： 1 % BSA, 0. 1 % Tween 20 を含む PBS (pH 7. 4

) o

k. Goat a human Acrp30 antibody :コスモバイオ社、 GT社、 Cat No. 4210

65 (抗ヒトアディポネクチンポリクローナル抗体の市販品）。

1. hu Acrp30— MoAb :藤沢薬品工業社、 BD Transduction Laboratories社、商品コード A12820 (抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体の市販品）。 m. Goat a rabbit IgG HRP標識抗体：コスモバイオ社、 capple社。

n. ELISA用洗浄液： 0. 05% Tween 20 を含む PBS (pH 7. 4)。

o. ELISA用緩衝液 2 : 1% BSA, 0. 05% Tween 20 を含む PBS (pH 7

. 4)。

[0035] 参考例 1. 大腸菌リコンビナントマウスグロブラーアディポネクチン (rMgAd)の調製

マウスアディポネクチンの遺伝子配列（NCBI accession # U37222)のグロブラードメイン配列（ 104—247残基相当）を 6 X His タグを含む pQE30ベクターの Ba mHI、 Hindlllに挿入し、大腸菌に組み込んだ。リコンビナントマウスグロブラーァディポネクチン (rMgAd)を発現した大腸菌からの rMgAdの精製は以下で行った。すなわち、大腸菌の可溶画分を Ni— NTAァガロース（QIAGEN社）に 4°C、 16時間添加して rMgAdを結合させた後、イミダゾールにより段階的に溶出させ、アディポネクチンを含む画分を回収し、 3日間 PBSで透析を行なった。得られた rMgAdの蛋白質濃度は、 Bio— Rad DC protein assay kit を用いて求めた。

[0036] 参考例 2. 抗 rMgAd抗体の調製

前記 1により得られた rMgAdの 50 μ gを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、 2匹のゥサギにそれぞれ 2週間おきに 6回免疫して抗血清を作製した。抗血清中の特異抗体 (IgG)の精製は、 Protein A榭脂を用いて常法により行なった（抗 rMgAd抗体）。

[0037] 参考例 3. ヒト血中由来アディポネクチン (mAd)の精製

前記参考例 2で作製した抗 rMgAd抗体 500mgを CNBr— activated Sepharos e 4B (アマシャムバイオサイエンス社） 50mLに結合させ抗 rMgAd抗体結合 Seph arose 4B榭脂を作製した。ヒト血清 2. 5Lを抗 rMgAd抗体結合 Sepharose 4B 榭脂に添加し、抗体結合榭脂用洗浄液で十分洗浄した後、抗体結合榭脂用溶出液でヒト血清アディポネクチン (mAd)画分を溶出し、溶出画分に抗体結合榭脂用中和液を 1Z10容量添カ卩して中和した。さらに中和した溶出画分を、 Protein A榭脂に添加し、 Protein A榭脂への非吸着画分を精製 mAdとして回収し、「ヒトアディポネクチン ELISAキット」（大塚製薬社）によりアディポネクチン含量を測定した。 [0038] 参考例 4. 抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体の作製

前記参考例 3で得た精製 mAd20 μ gを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、各 2匹のマウスに 2週間おきに 3又は 4回免疫を行った後、さらに細胞融合 3日前に再投与した。当該免疫したマウスより脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、 P3U1ミエローマ細胞と細胞融合を行った。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞の選択は、 ELISA法により mAdとの反応性の高いゥエルを選択し、ついで限界希釈法にて選択する常法により行なった。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体は、選択した融合細胞をプリスタン処理したマウス腹空内に投与し腹水として回収した。腹水力もの特異抗体 (IgG)の精製は、 Pro tein A榭脂を用いて常法により行なった。上記により認識番号； 64401—64411で識別される 11のモノクローナル抗体産生融合細胞とモノクローナル抗体が得られた。

[0039] 参考例 5. 抗体感作ラテックスの調製

ラテックス液 1容に抗体担持ラテックス調製用緩衝液 4容を混合し希釈ラテックス液を調製した。一方、抗 rMgAd抗体あるいは抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体 (64401)を lmgZmLとなるように抗体担持ラテックス調製用緩衝液で希釈し希釈抗体液を調製した。前記希釈ラテックス液 1容を攪拌しながら、前記 2種類の希釈抗体液 1容を別個に添加'混合し、さらに攪拌の後、ブロッキング用緩衝液 2容を追加添加し、攪拌を続けた。得られた抗体感作ラテックスそれぞれを抗 rMgAd抗体担持ラテックス原液及び抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（64401)担持ラテツタス原液とした。

[0040] (試験例 1)ヒト血清中の多量体アディポネクチンのウェスタンブロッテイングによる解析

健常者 8名力得た血清 0. 2 μ Lそれぞれを、 PAGE (2-15%)にて分離し、セミドライブロッテイングで PVDF膜に転写後、免疫染色を行なった。免疫染色の手順は以下である。先ず、転写後の膜を 5% スキムミルク及び 0. 1% NaNを含む PBS液（

3

pH7. 4)でブロッキングした後、 0. 1% Tween20 (pH7. 4)を含む PBS液で洗浄し、市販の抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（hu Acrp30— MoAb；藤沢薬品工業社、 BD Transduction Laboratories社） 1 gZmLを室温で 1時間反応させた。次いで、 0. 1% Tween20を含む PBS液 (pH7. 4)で十分に洗浄した後、 Vector ABC kit (Mouse) 及び DAB基質キット（フナコシ社）を用いて発色させた。以上の結果、主要なバンドとして 3種のバンドが染色検出された。これより血中に存在する種々の多量体アディポネクチンは、主に 3種類存在することが判明した（図 1)。これら 3種の染色バンドに相当するアディポネクチンを泳動像の上部（高分子側）から、「HMW— Ad」、「MMW— Ad」及び「LMW— Ad」画分とした。

[0041] 実施例 1 精製 mAdの還元剤、酸又はその塩及びプロテアーゼによる処理

参考例 3で得た精製 mAdを試料として、還元剤、酸又はその塩及びプロテアーゼを、単独又は組合せて作用させて処理し、精製 mAdの形態変化を観察した。

[0042] 1)還元剤、酸処理

精製 mAdを含む 50mM の各種緩衝液 (Tris— HC1 pH8. 5、酢酸ナトリウム p H3. 0及び pH4. 0)について、還元剤として 10mM DTT非添カ卩あるいは添カロの条件で、 37°Cで 60分間加温した。処理後の液を PAGE (2— 15%)にて分離し、 CB Bにより蛋白染色した。 Tris— HC1 pH8. 5、 DTT非添加（処理条件 1)の染色像を対照として、各処理条件における、 HMW— Ad、 MMW— Ad、 LMW— Ad各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した (表 1)。

[0043] その結果、還元剤非添加の処理条件では、 pH3. 0及び pH4. 0の酢酸ナトリウム緩衝液（処理条件 3、 5)において HMW— Ad画分の染色バンドが消失し、 MMW-A d画分の増加が確認された。還元剤添加の処理条件では、 pH3. 0及び pH4. 0の酢酸ナトリウム緩衝液（処理条件 4、 6)では、 HMW— Ad、 MMW— Ad、 LMW— Adの 3画分すベての染色バンドが消失するとともに、各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。 Tris-HCl (pH8. 5) (処理条件 2)では、各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された力 HMW— Ad画分が完全に消失しなかった。

[0044] 以上より、多量体アディポネクチン（HMW— Ad、 MMW— Ad、 LMW— Ad)に還元剤、酸又はその塩を作用させると、多量体アディポネクチンより新たな変換物が生じることが確認された。上記処理により生成した変換物は、 3量体アディポネクチンであると推定された。 [0045] [表 1]

(+) 二減少（++) =不変（+++) =増加又は変換物の生成を示す。

(-） =消失又は変換物の未生成を示す。

[0046] 2)プロテアーゼ処理

50mM リン酸緩衝液 (pH8. 0)に、精製 mAd及び各種プロテアーゼ（いずれも巿販品）を添加し、 37°Cで 60分間加温した。処理後の液を PAGE (2— 15%)にて分離し、 CBBにより蛋白染色した。 Tris— HC1 (pH8. 5)、 DTT非添カ卩（処理条件 1)の染色像を対照として、各処理条件における、 HMW— Ad、 MMW— Ad、 LMW— Ad 各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した (表 2)。

[0047] 処理条件 7— 9では、 HMW— Ad、 MMW— Ad、 LMW— Adの 3画分すベての染色バンドが消失するとともに、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。処理条件 10— 12では、 LMW— Ad及び MMW— Ad画分は消失し、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。このとき、 HMW— Ad画分の染色バンドに変化は見られなかった。

[0048] 以上より、多量体アディポネクチン（HMW— Ad、 MMW— Ad、 LMW— Ad)にプロテアーゼを作用させると、多量体アディポネクチンより新たな変換物を生じることが確認された。これら変換物の PAGE (2-15%)での染色バンドの検出位置は、作用させたプロテアーゼにより異なるものの、 30— 42kDaの範囲にあった。

また、処理条件 10— 12のプロテアーゼに関しては、酸又はその塩による処理を行ない、 HMW— Ad画分を MMW— Ad画分に変換させた後、プロテアーゼ処理を行うことで、すべての画分につ!、て新たな変換物への変換が可能であることがわ力つた。

[0049] [表 2] 処 ¾条件 7 8 9 1 0 1 1 1 2

Protease Protease フテア HfP「ァフ¾テアセ ΑΓ

フ ¾テアーセ^÷ ゴロチン AO ゥマミザィム

type K IV type X マノ」マノ」

^3 HMW-Ad ― ― ― ++ ++ ++ ァアイポ

ネクチン MMW-Ad

L W-Ad ― - 一 ― - 変換物 +++ +++ +++ +++ +++ +++

(+) =減少（++) =不変（+++) =増加又は変換物の生成を示す。

(-) = ^失又は変換物の未生成を示す。

[0050] 実施例 2 ラテックス試薬と各アディポネクチンとの反応性

プロテアーゼ処理した精製 mAdを、 ELISA用緩衝液で 1Z5、 1/25倍希釈し検体とした。また、参考例 5で調製したそれぞれのラテックス原液を抗体担持ラテックス調製用緩衝液で 1Z10倍に希釈したものを試薬 2として測定に用い、検体量： 10 L、試薬 1 (LTIA用緩衝液 (R1) )： 100 L、試薬 2： 100 μ L、測定波長： 570nm、測光ポイント： 18— 34の測定条件で生化学自動分析装置日立 7170形（日立製作所社)を用いて測定した。測定結果を図 2に示す。

[0051] 抗 rMgAd抗体及び抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（64401)のラテックス試薬それぞれが、プロチン（Protin)AC、 Protease TypeXのプロテア一ゼで処理したヒト血清アディポネクチンの濃度に依存して吸光度が変化した。

[0052] プロチン（Protin)AC、 Protease TypeXのプロテアーゼは多量体アディポネクチンを、抗 rMgAd抗体及び抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（64401)が認識する抗体認識部位を保持した状態で、新たな変換物に変換しうることが判明し、試料中のアディポネクチン総量を測定するための前処理に使用できることが確認された

[0053] 実施例 3 ELISA試薬と各アディポネクチンとの反応性

ELISA用プレートに Goat a human Acrp30 antibody又は抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（64401)を ELISA用抗体感作溶液で 1 μ g/m Lに希釈した後、感作した。 ELISA用緩衝液でブロッキング後、プロテアーゼ処理した mAdを ELISA用緩衝液で 1Z2、 1/20, 1/200倍希釈して得た検体を、室温で 1時間反応させた。 ELISA用緩衝液でプレートを洗浄後、 ELISA用緩衝液で 1Z 10000倍希釈した抗 rMgAd抗体液を室温で 1時間反応させた後、 ELISA用緩衝液でプレートを洗浄、 ELISA用緩衝液で 1Z1000倍希釈した Goat α rabbit IgG HRP標識抗体液を室温で 1時間反応させた。 ELISA用緩衝液でプレートを洗浄後、 TMB (テトラメチルベンチジン）と過酸ィ匕水素を用いた HRPの酵素反応により発色させ、 2N 硫酸を添加して反応を停止させた後、 450nmの吸光度を測定した。測定結果を図 3 に示す。

[0054] 抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（64401)と抗 rMgAd抗体の組合わせ及び Goat a human Acrp30 antibodyと抗 rMgAd抗体の組合わせの ELISA試薬は、プロチン（Protin)AC、 Protease TypeXのプロテアーゼで処理したヒト血清アディポネクチンの濃度に依存して吸光度が変化した。

[0055] プロチン（Ptotin)AC、 Protease TypeXのプロテアーゼは、多量体アディポネクチンを、 Goat a human Acrp30 antibody、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体 (64401)及び抗 rMgAd抗体が認識する抗体認識部位を保持した状態で、新たな変換物に変換しうることが判明し、試料中のアディポネクチン総量を測定するための前処理に使用できることが確認された。

[0056] (試験例 2)ヒト血中由来多量体アディポネクチンの解析

参考例 3に準じて新たに調製した精製 mAdを、 PAGE (2-15%)にて分離し、クマシーブリリアントブルー（CBB)により蛋白染色した（図 4)。さらに試験例 1と同様の操作〖こより、市販の抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（hu Acrp30— MoAb )を用いて免疫染色を行った。染色像を解析した結果、ヒト血清カゝら精製された多量体アディポネクチンは、試験例 1で確認された 3種類以外に、量的に少ないものの、もう 1種類検出され、少なくとも 4種類存在することが判明した。これら 4種の CBB染色バンドに相当するアディポネクチンを泳動像の上部（高分子側）から、「HMW— Ad」、「MMW— Ad」、「LMW— Ad」及び「ULMW— Ad」画分とした。

[0057] 実施例 4 精製 mAdの還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼによる処理

試験例 2で解析された精製 mAdを試料として、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼを、単独又は組み合わせて作用させて処理し、精製 mAdの形態変化を観察した。 [0058] 1) 還元剤、酸処理の組み合わせ

精製 mAdを含む lOOmM の各種緩衝液 (Tris— HC1 pH8. 5、クェン酸ナトリウム pH3. 0— 6. 0)について、還元剤として 10mM 2—メルカプトエタノール非添カロあるいは添カ卩の条件で、 37°Cで 30分間加温した。処理後の液を PAGE (2— 15%) にて分離し、 CBBにより蛋白染色した。 Tris-HCl pH8. 5、 2—メルカプトエタノール非添加（処理条件 13)の染色像を対照として、各処理条件における、 HMW— Ad、 MMW— Ad、 LMW— Ad、 ULMW— Ad各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した (表 3)。

[0059] その結果、還元剤非添加の処理条件では、 pH4. 0以上のクェン酸ナトリウム緩衝液（処理条件 15, 17, 19)において HMW— Ad画分の染色バンドがクェン酸ナトリウム緩衝液の酸性ィ匕と共に消失傾向示し、 MMW— Ad画分の増加が確認された。更に、 pH3. 0 (処理条件 21)では、 ULMW— Adより泳動距離が長い変換物である染色バンドが新たに認められた。一方、還元剤添加の処理条件では、 pH6. 0以上で（処理条件 14, 16)では、 HMW— Adの染色バンドが残存した力 pH5. 0及び 4. 0 の処理条件 18, 20では、すべての画分の染色バンドが消失し、 ULMW— Adとほぼ同じ位置に、ブロードな染色バンドが新たに認められた。又、 pH3. 0 (処理条件 22) では、処理条件 21とほぼ同じ位置に、ブロードな変換物のバンドが新たに認められた。

[0060] 以上より、多量体アディポネクチン（HMW— Ad、 MMW— Ad、 LMW— Ad及び UL MW-Ad)に還元剤、酸又はその塩を作用させると、多量体アディポネクチンより新たな変換物が生じることが確認された。処理条件 21で生成した変換物は 2量体、還元剤を添加した条件（14, 16, 18, 20)で生成した変換物は 3量体、さらに処理条件 22で生成した変換物は、 1量体であると、それぞれ推定された。さらに、染色バンド切り出しによる解析では、 ULMW— Adは 3量体、そして、 LMW— Adはアルブミンが結合している 3量体アディポネクチンであることが確認された。

[0061] [表 3]

(+) =減少 C++) =不変（+++) =増加又は変換物の生成を示す。

(-) = ί肖失又は変換物の未生成を示す。

[0062] 2)プロテアーゼ処理

50mM リン酸緩衝液 (pH8. 0)に、精製 mAd及び各種プロテアーゼ（いずれも巿販品）を lmgZmlとなるように添カ卩し、 37°Cで 60分間加温した。処理後の液を P AG E (2-15%)にて分離し、 CBBにより蛋白染色した。 Tris-HCl (pH8. 5)、 DTT非添加（処理条件 1)の染色像を対照として、各処理条件における、 HMW-Ad, MM W— Ad LMW— Ad及び ULMW— Adの各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した (表 4)。

[0063] 処理条件 23— 25では、 HMW-Ad, MMW— Ad LMW— Ad及び ULMW— Ad の 4画分すベての染色バンドが消失するとともに、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。処理条件 26— 28では、 ULMW— Ad LMW - Ad及び MMW - Ad画分は消失し、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。このとき、 HMW— Ad画分の染色バンドに変化は見られなかった。

[0064] 以上より、多量体アディポネクチン（HMW— Ad MMW— Ad LMW— Ad及び UL MW-Ad)にプロテアーゼを作用させると、多量体アディポネクチンより新たな変換物を生じることが確認された。これら変換物の PAGE (2-15%)での染色バンドの検出位置は、作用させたプロテアーゼにより異なるものの、 30— 42kDaの範囲にあつた。これらの変換物のゲル切り出しによるアミノ酸分析結果から、グロブラーアディポネクチンであることが判明している。

また、処理条件 26— 28のプロテアーゼに関しては、酸又はその塩による処理を行ない、 HMW— Ad画分を MMW— Ad画分に変換させた後、プロテアーゼ処理を行うことで、すべての画分につ!、て新たな変換物への変換が可能であることがわ力つた。

[0065] [表 4]

(+) =減少（++) =不変（+++) =増加又は変換物の生成を示す。

(-) =消失又は変換物の未生成を示す。

[0066] 実施例 5 酸処理、界面活性剤を組み合わせた血中アディポネクチン総量の測定

(1) 前処理液の調製

酸処理の条件として lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝液 (pH3. 0)を選び、ここに巿販されている各種界面活性剤を添加した。添加する界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤として、 SDS及びネオべレックス F65 (花王社製)、陽イオン性界面活性剤としては、コータミン 24P及びコータミン 86P (花王社製）、非イオン性界面活性剤としては、 Triton X— 100及び Tween 20を用いた。添加濃度は、 SDSが 2%である他は、すべて 0. 5%とした。

(2) 検体の処理

8名のボランティア力も採取された各血清検体 10 Lに、上述した各種前処理液を 490 L添加し十分に攪拌した後、煮沸しないで、 ELISA用緩衝液 2で 5250倍希釈した。効果を比較するため、前記各血清 10 しに、 50mM Tris— HCl (pH6. 8,

2%SDS)溶液 490 Lを前処理液として添加し十分に攪拌した後、煮沸処理し、 ELISA用緩衝液 2で 5250倍希釈し対照とした。濃度をもとめるための標準品として、試験例 2で解析された精製 mAdを、 50mM Tris— HCl (pH6. 8, 2%SDS)溶液にて煮沸処理し、 ELISA用緩衝液 2で希釈系列を作成したものを用いた。

(3) アディポネクチン総量測定

ELISA用プレートに抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（64405)を PBSで 5 gZmLに希釈した後、感作した。次に、 ELISA用緩衝液 2でブロッキング後、前記標準品及び血清処理液を添加し、室温で 1時間反応させた。 ELISA用洗浄液でプレートを洗浄後、 ELISA用緩衝液 2で 2000倍希釈した Biotin標識抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（64404)を室温で 1時間反応させた後、さらに、 ELISA 用緩衝液 2で 2000倍希釈した HRP— Avidinを添カ卩し、室温で 30分間反応させた。 ELISA用洗浄液でプレートを洗浄し、 OPD発色液（2mgZmlオルトフエ-レンジァミン塩酸塩、 0. 02%過酸化水素を含む、 250mMクェン酸緩衝液、 pH5. 0)により発色させ、停止液（1. 5N硫酸、 ImM EDTA— 2Na)を添加して反応を停止させた後、 492nmの吸収を測定した。標準品の発色値から、各前処理液による血清中のァディポネクチン総量（濃度）を換算し、 50mM Tris— HCl(pH6. 8, 2%SDS)溶液による煮沸処理した条件を対照にして、相関分析を行った (表 5)。

[0067] その結果、界面活性剤無添加の酸処理条件では、相関係数は良好であった力回帰式の傾きが 0. 45となり、対照の換算値に対して低値となっていることが確認された。界面活性剤を共存させた場合、相関係数が向上するとともに、対照の換算値に測定値が近似する傾向が確認された。特に、陰イオン性界面活性剤を共存させた場合、その効果は顕著であり、本発明の前処理方法を使用すれば、試料を煮沸することなぐ試料中のアディポネクチン総量の測定が可能であることが判明した。

[0068] [表 5]

(対照） 50 m Tris-HCI pH6.S (2% SDS)煮沸処理あり

Claims

請求の範囲

[I] 試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的に測定するためのアディポネクチン測定用試料の前処理方法であって、アディポネクチンを含む試料に対し、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つをカ卩え、試料とともに煮沸処理することなく作用させることを特徴とする、アディポネクチン測定用試料の前処理方法。

[2] 免疫学的に測定する方法が、抗アディポネクチン抗体を担持させた不溶性担体を利用する方法である請求項 1に記載の前処理方法。

[3] プロテアーゼが、微生物由来のプロテアーゼ又は遺伝子組み換え技術により得られたプロテアーゼである請求項 1又は 2に記載の前処理方法。

[4] 微生物が、バチルス属、ストレプトミセス属及びァスペルギルス属カもなる群より選ばれる微生物である請求項 3に記載の前処理方法。

[5] 還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む、アディポネクチン総量の免疫学的測定用試料の前処理剤であって、試料とともに煮沸処理することなく試料に作用させるための前処理剤。

[6] 免疫学的に測定する方法が、抗アディポネクチン抗体を担持させた不溶性担体を利用する方法である請求項 5に記載の前処理剤。

[7] プロテアーゼが、微生物由来のプロテアーゼ又は遺伝子組み換え技術により得られたプロテアーゼである請求項 5又は 6に記載の前処理剤。

[8] 微生物が、バチルス属、ストレプトミセス属及びァスペルギルス属カもなる群より選ばれる微生物である請求項 7項に記載の前処理剤。

[9] アディポネクチンを含む試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテァーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸処理することなく作用させた後

、免疫学的にアディポネクチンを測定することを特徴とする、試料中のアディポネクチン総量の測定方法。

[10] 免疫学的に測定する方法が、抗アディポネクチン抗体を担持させた不溶性担体を利用する方法である請求項 9に記載の測定方法。

[II] プロテアーゼが、微生物由来のプロテアーゼ又は遺伝子組み換え技術により得られたプロテアーゼである請求項 9又は 10に記載の測定方法。

[12] 微生物が、バチルス属、ストレプトミセス属及びァスペルギルス属カもなる群より選ばれる微生物である請求項 11に記載の測定方法。

[13] 還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む第一試薬とアディポネクチンを測定するための抗体を担持させた不溶性担体を含む第二試薬よりなるアディポネクチン総量の免疫学的測定試薬であって、試料と第一試薬の反応を煮沸することなく行う方法に用いられる該測定試薬。