KR20070001874A

KR20070001874A - 시료의 전처리방법 및 이를 이용한 면역학적 측정방법

Info

Publication number: KR20070001874A
Application number: KR1020067006994A
Authority: KR
Inventors: 히로유키 에비누마; 히로카즈 야고; 유카 아키모토; 오사무 미야자키; 타카시 카도와키; 토시마사 야마우치
Original assignee: 다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤; 토우다이 티엘오, 리미티드
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2004-10-15
Publication date: 2007-01-04
Also published as: JPWO2005038458A1; EP1681567A4; EP1681567B1; EP1681567A1; ATE427490T1; WO2005038458A1; MXPA06004234A; AU2004282755B2; JP4669929B2; CA2542825A1; AU2004282755A1; CN1864067A; CA2542825C; DE602004020372D1; CN1864067B; KR101134605B1; ES2323271T3

Abstract

본 발명은 각종 다량체가 혼재하는 생체 시료 중의 아디포넥틴의 총량을 면역학적 측정법에 의해, 간편, 신속하고 정확하게 측정하기 위한 시료의 전처리방법을 개시한다. 시료 중의 아디포넥틴의 총량을 면역학적으로 측정하기 위한 아디포넥틴 측정용 시료의 전처리방법이며, 아디포넥틴을 함유하는 시료에, 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나를 작용시킴을 특징으로 하는 아디포넥틴 측정용 시료의 전처리방법도 개시한다.

Description

시료의 전처리방법 및 이를 이용한 면역학적 측정방법 {METHOD OF PRETREATING SAMPLE AND IMMUNOLOGICAL ASSAY METHOD USING THE SAME}

본 발명은 시료 중에 존재하는 아디포넥틴의 총량을 면역학적 측정법에 의해, 간편, 신속하고 정확하게 측정하기 위한 전처리방법 및 이를 이용한 아디포넥틴 총량의 면역학적 측정방법에 관한 것이다.

아디포넥틴(비특허문헌 1∼4)은 백색 지방 조직 중에 특이적으로, 그리고 많이 발현되고 있는 분비 단백질의 하나로서, 244개의 아미노산으로 이루어진 약 30kDa의 C1q 패밀리에 속하는 혈장 단백질이다.

아디포넥틴은 N-말단 측의 콜라겐 유사의 도메인과 C-말단 측의 글로블러(globular: 구상) 도메인으로 이루어진 단량체가 콜라겐 유사 도메인중의 Gly-X-Y의 반복 구조에 의해, 트리플헤릭스의 3량체를 형성한 구조를 취하고 있다. 또한, 혈중에서 3량체끼리 다시 결합하여 각종 다량체를 형성하여 존재하고 있는 것이 보고되어 있다(이하, 총칭하여 "각종 다량체"라고 하기도 한다).

최근, 아디포넥틴은 사람 혈중에 5∼10㎍/㎖라는 고농도로 존재하며, 다양한 생리활성을 발휘하는 것이 보고되어 있다. 특히, 평활근 세포의 증식을 억제하고, 단구중 내피세포에 접착하는 것을 억제하는 것으로부터, 동맥 경화의 억제 효과가 있는 것으로 고려되고 있다(비특허문헌 5). 또한, 아디포넥틴을 2형 당뇨병이나 지방 위축성 당뇨병의 병태 마우스에 투여하면, 인슐린 저항성과 하이퍼-FFA(유리 지방산) 혈증, 하이퍼-TG(중성 지방) 혈증이 개선되는 것으로부터, 인슐린 감수성 호르몬으로서 기능하여 당뇨병의 개선 효과가 나타남이 보고되어 있다(비특허문헌 6). 더욱이, 아디포넥틴의 혈중농도가 낮은 신부전 환자군은 심혈관 합병증 발증율이 높고, 생존율이 낮고, 인슐린 저항성이나 2형 당뇨병을 고빈도로 발병하는 피마족(Pima tribe) 인디안의 연구에 있어서, 혈중 높은 아디포넥틴을 나타내는 군에서는 2형 당뇨병 발증이 억제됨이 보고되어 있다(비특허문헌 7).

이들 보고로부터, 아디포넥틴은 내장 지방의 과잉축적과 인슐린 저항성 발증을 직접 링크시키는 내분비 인자일 가능성이 시사된다. 따라서, 혈중 아디포넥틴은 당뇨병이나 동맥 경화 등의 발증 예측 인자로 고려되며, 이러한 아디포넥틴의 농도를 측정하는 것은 생활 습관에 관련된 병의 유용한 지표로 작용하는 것이 예측되고 있다.

각종 다량체가 혼재되어 있는 혈액 시료 중의 아디포넥틴의 총량을 측정하는 방법으로서는, 시료를 도데실황산나트륨(SDS)의 존재하에 비등하여 각종 다량체에서 입체 구조적으로 숨어 있는 항체의 인식 부위를 노출시킨 후, 면역학적 측정을 행하는 방법(특허문헌 1)이 보고되어 있다. 그러나, 이 방법은 비등(100℃) 처리를 위한 장치가 필요한 점, 비등 처리에 이어서 면역학적 측정을 해야 하는 2개의 공정을 자동화하는 것이 실제상 곤란한 점 등의 문제가 있다.

또한, LINCO RESEARCH, INC.에서 "HUMAN ADIPONECTIN RIA KIT(Cat. #HADP- 61HK)"라는 킷을 시판하고 있지만, 이 킷은 ¹²⁵I로 표지한 마우스 아디포넥틴과 사람 아디포넥틴을 경합시켜 항아디포넥틴 폴리클로날 항체에 포착되는 2항체/PEG법을 이용하고 있으므로, 이 킷의 조작이 번잡하고, 더욱이 안전성, 특이성 및 시약의 품질에 관한 문제가 남아있다. 경합 반응을 원리로 하는 이 방법의 특이성을 일정하게 하기 위하여는 ¹²⁵I로 표지한 마우스 아디포넥틴 및 각종 다량체 사람 아디포넥틴에 대한 항아디포넥틴 폴리클로날 항체의 반응성을 일정하게 할 필요가 있다. 그러나, 전술한 바와 같이, 생체 시료 중에는 각종 다량체가 혼재하고 있으며, 또한, 각 다량체의 존재 비율도 일정하지 않아 아디포넥틴의 총량을 정확하게 측정할 수 없다고 하는 문제를 내포하고 있다.

또한, SDS나 열에 의한 변성 처리를 하고 있지 않는 상태의 특정 입체구조를 유지하고 있는 아디포넥틴(특허문헌 2 명세서중에서는 천연 형이라고 칭하고 있다)을 인식하는 모노클로날 항체와 이를 이용한 측정방법(특허문헌 2)도 보고되어 있지만, 시료 중의 아디포넥틴의 존재 형태(3량체의 수, 3량체의 뭉쳐 있는 조건 등)에 따라 상기 모노클로날 항체와의 반응성이 다르기 때문에, 각 다량체의 존재 비율이 일정하지 않은 생체 시료중의 아디포넥틴의 총량을 정확하게 측정할 수 없는 문제가 있었다.

아디포넥틴의 구조 형태에 대해서는 생체 시료중의 아디포넥틴에 대한 검토는 아니기는 하지만, 리컴비난트 아디포넥틴을 이용한 검토가 있었다. 그것에 의하면, 낮은 pH, 디티오트레이톨(DTI) 처리(비특허문헌 8) 또는 트립신 처리(비특허문 헌 9)하여 아디포넥틴의 구조 형태가 변한다는 보고가 되어 있지만, 처리 후의 아디포넥틴의 면역학적 측정에 대한 기재는 없다.

전술한 바와 같이, 시료중의 아디포넥틴 총량을 면역학적으로 측정하기 위하여는 사용하는 항체와각 다량체(3량체 및 3량체끼리 다시 결합한 각종 다량체) 사이의 반응성을 일정하게 하는 전처리가 필요하다. 그러나, 전처리 및 면역학적 측정의 2개의 공정을 자동화하는 간편한 방법은 제안되어 있지 않았다.

특허문헌 1: 일본국 특허공개 제 2000-304748호 공보

특허문헌 2: 국제공개 WO03/016906 공보

비특허문헌 1: Scherer P. E., et al, J. Biol. Chem. 270, 26746-26749, 1995

비특허문헌 2: Hu E., et al, J. Biol. Chem. 271, 10697-10703, 1996

비특허문헌 3: Maeda K., et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 221, 286-289, 1996

비특허문헌 4: Nakano Y., et al, J. Biochem. 120, 803-812, 1996

비특허문헌 5: Ouchi N, et al, Circulation, 102, 1296-1301, 2000

비특허문헌 6: Yamauchi T, et al, Nature Med. 7, 941-946, 2001

비특허문헌 7: Lindsay R. S, et al, Lancet, 360, 57-58, 2002

비특허문헌 8: Utpal B. Pajvani, et al. J. Biol. Chem. 278, 9073-9085, 2003

비특허문헌 9: Fruebis, J, et al. Proc. Natil. Acad. Sci. 98, 2005-2531, 2001

본 발명의 목적은 3량체 및 3량체로 이루어진 각종 다량체가 혼재하는 생체 시료중의 아디포넥틴의 총량을 면역학적 측정법에 의해, 간편, 신속하고 정확하게 측정하기 위한 전처리방법 및 이를 이용하는 아디포넥틴 총량의 면역학적 측정방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 3량체 및 3량체로 이루어진 각종 다량체를 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나로 처리한 후, 폴리아크릴아미드겔 전기영동(폴리아크릴아미드 농도 2-15%)(이하, "PAGE (2-15%)"라 표기한다)으로 해석한 바, 처리 전에 존재한 각종 다량체의 염색 밴드가 소실 또는 감소함과 동시에 처리 전에 존재한 염색 밴드의 어느 것보다도 저분자량 측에 염색 검출되는 아디포넥틴 유래 변환물(이하, "변환물"이라고 한다)의 출현을 확인했다. 그리고, 본 발명자들은 이 변환물이 항아디포넥틴 항체와 반응성을 가지고 있으며, 이 변환물이 항아디포넥틴 항체를 사용하여 측정될 수 있음을 확인했다.

본 발명자들은 상기 발견을 기초로 하여 더 연구한 결과, 시료를 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 1개를 함유하는 전처리제로 처리한 후, 면역학적 측정을 행하면, 시료를 전처리제와 함께 비등 처리하지 않고, 각종 다량체가 혼재하는 생체 시료중의 아디포넥틴 총량을 측정할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 시료중의 아디포넥틴의 총량을 면역학적으로 측정하기 위한 아디포넥틴 측정용 시료의 전처리방법으로, 아디포넥틴을 함유하는 시료에 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나를 가하고, 이를 비등시키지 않고, 시료를 반응시킴을 특징으로 하는 아디포넥틴 측정용 시료의 전처리 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나를 함유하는, 아디포넥틴 총량의 면역학적 측정용 시료의 전처리제로서 시료를 비등시키지 않고, 전처리하는 전처리제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 아디포넥틴을 함유하는 시료에, 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나를 가하고, 시료와 함께 비등시키지 않고, 작용시킨 후, 면역학적으로 아디포넥틴을 측정하는 것을 특징으로 하는 시료중의 아디포넥틴 총량의 측정방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 1개를 함유하는 제 1시약과 아디포넥틴을 측정하기 위한 항체를 담지시킨 불용성 담체를 포함한 제 2시약으로 이루어진 아디포넥틴 총량의 면역학적 측정 시약으로, 시료와 제 1시약의 반응을 비등시키지 않고, 행하기 위한 면역학적 측정 시약을 제공하는 것이다.

[발명의 효과]

본 발명에 의하면, 각종 다량체가 혼재하는 생체 시료중의 아디포넥틴 총량을 간편, 신속하고, 정확하게 측정할 수가 있다.

[도 1] 사람 혈청중의 아디포넥틴을 웨스턴 블롯팅법에 의해 해석한 도이다.

[도 2] LTIA 시약과, 프로테아제 처리한 아디포넥틴과의 반응성을 나타낸 도이다.

[도 3] ELISA 시약과, 프로테아제 처리한 아디포넥틴과의 반응성을 나타낸 도이다.

[도 4] 참고예 3에 있어서 사람 혈청으로부터 정제된 아디포넥틴을 PAGE (2-15%)로 분리하고, CBB에 의해 단백 염색한 영동상의 도이다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

전술한 바와 같이, 생체 시료중의 아디포넥틴에는 여러 종류의 다량체가 존재하며, 각 다량체의 존재 비율은 일정하지 않다. 따라서, 면역학적 측정 시, 측정에 사용하는 항체와 각종 다량체 사이의 반응성이 다른 것이 고려되며, 특히, 특정 다량체가 측정되기 어려운 것으로 된다. 더욱이, 샌드위치 면역 측정계에 있어서, 측정 시료 중에 6량체와 3량체가 1분자씩 존재하는 경우를 가상하면, 시료 중에는 9개의 단량체가 존재하지만, 측정 결과로서는 3량체가 2분자 존재하는 경우, 6량체가 2분자 존재하는 경우 등을 측정 결과상에서는, 구별할 수 없는 것이 생각된다. 어느 경우도, 아디포넥틴의 총량을 반영한 측정 결과를 얻는 것은 가능하지 않다. 또한, SDS 공존하, 시료를 비등하여 다량체를 분해하는 전처리를 이용하는 방법은 아디포넥틴 총량을 반영한 측정 결과를 얻을 수 있지만, 이들 방법의 전처리가 번잡하고, 계속하여 면역학적 측정을 실시하는 2개의 공정을 자동화하는 것이 곤란하다

전술한 발견으로부터, 본 발명자들은 면역학적 측정 시, 측정에 사용하는 항체와 측정 시료중의 각종 다량체와의 반응성이 일정하게 되고, 아디포넥틴의 총량을 반영한 측정 결과를 얻어지도록 하는 일정한 형태로, 시료를 비등하는 일 없이, 각종 다량체가 변환되어 있으면, 전기 과제를 해결할 수 있음을 발견했다.

상기 목적에 맞는 측정 시료중의 각종 아디포넥틴의 전처리방법으로서, 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나를 아디포넥틴을 함유하는 시료에 가하고, 시료와 함께 비등하는 일 없이 작용시키는 처리방법을 들 수 있다. 이들 전처리방법에 의해 얻어지는 변환물의 성상은 각 전처리방법 사이 동일해도, 또는 달라도 좋다. 각종 다량체가 모두 단량체인 경우, 3량체인 경우, 특정의 다량체인 경우 등을 포함한다. 더욱이, 전처리에 의해, 어느 분자량 영역에 속하는 변환물이어도 좋다. 다시 말해서, 면역학적 측정계를 구축하기 위해서 선택된 항체가 일정한 반응성으로 인식할 수 있는 성상을 가지고 있으면 좋다.

본 발명에 사용되는 시료로서는 사람, 원숭이, 염소, 양, 토끼, 마우스, 랫트, 기니아 피그 및 그 외의 포유동물로부터 얻어지는 혈액, 뇨 등의 체액, 조직 추출액이나 조직 유래의 세포의 배양상청액 등 아디포넥틴의 각종 다량체를 함유하는 생체 시료를 들 수 있다. 이 중, 당뇨병이나 동맥 경화성 질환에 관한 정보와의 관계에서 주목받고 있는 혈액(혈청 · 혈중)이 바람직하다. 시료의 채취 방법은 아 디포넥틴 총량을 측정하는 목적을 고려해, 시료 중에 존재하는 아디포넥틴에 영향을 주지 않는 방법이면 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 전처리방법, 전처리제, 면역학적 측정방법, 면역학적 측정 시약에 사용되는 환원제로서는 아디포넥틴의 디술피드 결합을 해리할 수 있는 환원력을 가지며, 면역학적 측정에 있어서 실질적으로 영향을 주지 않는 물질이면, 특히 제한하지 않고, 사용할 수 있다. 예를 들면, DTT(디티오트레이톨), 2-메르캅토에탄올, 시스테아민, 티오글리세롤 등의 티올 화합물, 수소화붕소화합물이나 포스핀류 등을 들 수 있다. 사용하는 농도는 소망한 변환물을 얻을 수 있도록 적당히 선택하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 티올 화합물의 경우에는 DTT나 2-메르캅토에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 환원제에 의한 처리의 조건으로서는 4∼60℃, 5분∼24시간이 바람직하다.

산 또는 그의 염으로서는 각종 다량체의 아디포넥틴의 결합을 해리 할 수 있는 유기산, 무기산이면 특히 제한하는 일 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 아세트산, 시트르산, 염산, 포름산, 타르타르산, 옥살산 등을 들 수 있다. 사용하는 농도는 소망한 변환물을 얻을 수 있도록 적당히 선택해 결정할 수 있지만, 1∼1000mM이 바람직하고, 10∼200mM이 더 바람직하다. 또한, 완충액으로서는 사용할 수 있다. 완충액으로 했을 때의 pH로서는 pH 4 이하가 바람직하다. 산 또는 그의 염에 의한 처리의 조건으로서는 4∼60℃, 5분∼24시간이 바람직하다.

계면활성제로서는 각종 다량체에 작용하여 면역학적 측정에 있어서 아디포넥틴 총량을 반영하는 형태에 변화시킬 수 있는 것으로, 아디포넥틴과 특이 항체와의 반응성을 유지할 수가 있는 것이면, 이온성 또는 비이온성 등 제한 없이 사용할 수 있다. 그 중에서도 음이온성 계면활성제가 바람직하고, 도데실 술페이트 등의 알킬 술페이트나 도데실벤젠술폰산염 등의 알킬벤젠술폰산염 등이 바람직하다. 이들 계면활성제는 단독으로, 또는 복수를 조합하여 사용해도 좋다. 사용 농도는 대략 0.01∼10%에서 사용되지만, 0.1∼5%가 더 바람직하다. 산 또는 그의 염에 의한 처리와 조합하여 사용하면, 더욱 바람직하다.

프로테아제로서는 각종 다량체에 작용하여, 각종 다량체를 면역학적 측정에 있어서 아디포넥틴 총량을 반영하는 형태로 변화시킬 수 있는 프로테아제이면, 특히 제한하는 일 없이 사용할 수 있다. 사용하는 농도도, 소망한 변환물이 얻어질 수 있도록 적당히 선택하여 결정할 수 있다. 프로테아제의 기원도, 미생물 유래, 동물 유래, 식물 유래 등, 특히 제한은 없지만, 바람직하기로는 바칠루스속, 스트렙토미세스속이나 아스페르길루스속 등의 미생물 유래의 프로테아제가 사용될 수 있다. 바칠루스속 유래의 프로테아제의 시판품의 예로서는 Protease type X(Sigma); Protin AC, Protin PC(모두 Daiwa Kasei); Protease S "Amano"(Amano Enzyme Co.), Sumizyme CP(Shin Nihon Chemical Co., Ltd.) 등을 들 수 있다. 스트렙토마이세스속 유래의 프로테아제의 시판품의 예로서는 Protease type XIV(Sigma), Pronase(Rosche), Actinase AS(Kaken Seiyaku) 등을 들 수 있다. 또, 아스페르길루스속 유래의 프로테아제의 시판품의 예로서는 Protease A "Amano", Protease P "Amano", Umamizyme(모두 Amano Enzyme Co.사), Sumizyme MP(Shin Nihon Chemical Co., Ltd.) 등을 들 수 있다. 이들 프로테아제는 유전자 재조합 기 술에 의해 얻어지는 것이어도 지장 없다. 또한, 화학 수식을 시행한 것이어도 좋다. 생체 시료의 프로테아제에 의한 처리의 조건은 사용하는 프로테아제에 따라 다르지만, 인산, 트리스, 굿 등의 완충액 중, 4∼60℃에서, 5분∼24시간 행하는 것이 바람직하다. 프로테아제의 사용 농도는 반응 온도 및 반응 시간 등을 고려하여 결정되지만, 대체로 0.01∼100mg/㎖의 범위에서 사용된다.

이들 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제의 사용 방법에도 특히 제한은 없다. 적당 단독 또는 조합하여 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 환원제나 산을 아디포넥틴을 함유하는 시료에 작용시킨 후에, 다시 프로테아제 처리하는 것도 가능하다. 또, 이들 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제의 사용에 있어서는 이들 물질이 아디포넥틴에 작용하는 환경을 만들거나, 이들 물질의 보존 안정성의 향상 등을 목적으로 산 완충액, 글리신 완충액, 트리스 완충액, 굿 완충액 등의 완충 성분, 각종 다량체에는 작용하지 않는 계면활성제, 소혈청알부민(BSA); 자당; 방부제(아지드화나트륨 등), 염 농도 조정제(염화나트륨 등) 등을 적당 첨가해 사용해도 좋다.

본 발명의 면역학적 측정방법으로 사용되는 항체는 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 1개를 각종 다량체 아디포넥틴에 비등 처리하는 일 없이 작용시킨 후, 아디포넥틴 총량을 측정 가능한 것이면, 특히 제한 없이 사용할 수 있다. 이들 항체 중, 폴리클로날 항체는 일정한 형태로 된 아디포넥틴에 존재하는 복수의 에피도우프와 특이적으로 결합하는 복수의 항체를 함유하는 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 아디포넥틴을 적당한 동물, 예를 들 면, 토끼, 염소, 양, 말, 소, 마우스, 랫트 등의 동물에, 그 자체 공지의 수법에 의해 면역하여 얻을 수 있다. 한편, 모노클로날 항체는 일정한 형태로 된 아디포넥틴에 대해서 특이적으로 결합하는 1 종류 이상의 다른 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 세포 융합 기술분야에 있어, 그 자체 공지의 수법을 적당하게 선택하거나, 또는, 그것들을 조합하여 모노클로날 항체 산생 융합 세포주를 형성하고, 이 세포주를 이용하여 취득할 수가 있다. 또한, 일정 형태로 된 아디포넥틴에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체나 모노클로날 항체를 시판품으로서 입수하는 것도 가능하며, 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들면, Goat α human Acrp30 antibody(Cosmo Bio Co., Ltd., GT Co.), rabbit α hu adiponectin-PoAb(Cosmo Bio Co., Ltd., Chemicon Co.), hu Acrp30-MoAb(Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Co.), Mouse α hu Adiponectin MoAb(Cosmo Bio Co., Ltd., Chemicon Co.), 항사람 ACRP30 모노클로날 항체(AX773, AX741, Ne, Na, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 등, 아디포넥틴의 형태에 따라 적당히 이용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 항체를 얻기 위한 항원으로서는 통상의 방법에 따라 시료로부터 정제, 분리한 아디포넥틴을 사용할 수 있다. 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제의 적어도 어느 하나를 함유하는 전처리액으로 비등 처리하는 일 없이 처리한 아디포넥틴을 이용할 수 있다. 또한, 이 항원은 그의 단백질의 유전자 배열 정보에 의해 통상의 유전자 공학적 수법에 의해 재조합 단백으로서 제조할 수 있다.

본 발명의 면역학적 측정방법으로서는 일정 형태로 변화시킨 아디포넥틴에 대해서 특이적으로 결합하는 항체를 불용성 담체에 결합시키고, 이것에 의해 일정 형태로 변화시킨 아디포넥틴을 포착하고, 시료 중에 존재하는 아디포넥틴의 유무의 확인(정성) 또는 정량하는 방법이 사용되며, 그 중에서도, LTIA(Latex turbidimetric immunoassay), ELISA(enzyme immunoassay), CLEIA(chemiluminescent enzyme immunoassay), RIA(radioimmunoassay) 등의 방법을 들 수 있다. 이 중, LTIA는 일정 형태로 변화시킨 아디포넥틴과 특이적으로 결합하는 항체를 담지시킨 불용성 담체와 일정 형태로 변화시킨 아디포넥틴을 혼합함으로써 일정 형태로 변화시킨 아디포넥틴을 개재한 불용성 담체의 가교(응집)가 일어나고, 그 결과로 생기는 탁도를 광학적으로 측정함으로서 아디포넥틴의 유무의 확인(정성) 또는 정량하는 방법으로 아디포넥틴을 간편, 신속하고 정확하게 측정하는데 바람직하다.

본 발명에 사용되는 불용성 담체로서는 통상의 면역학적 측정 시약에 사용되며, 공업적으로 대량생산 가능한 유기계의 불용성 담체가 사용된다. LTIA에 대해 항체의 흡착성이 우수하고, 또한 생물학적 활성을 장기간 안정적으로 유지할 수 있는 폴리스티렌계의 라텍스 입자, ELISA에 대해 폴리스티렌 등의 96 웰 마이크로플레이트가 바람직하다.

상기 불용성 담체의 표면에 항체를 담지시키는 수법은 여러 가지 알려져 있으며, 본 발명에서 적당히 이용할 수 있다. 예를 들면, 담지(감작) 방법으로서 불용성 담체 표면에 항체를 물리적으로 흡착시키는 방법이나, 관능기를 가지는 불용성 담체 표면에 기존의 방법인 물리 결합법이나 화학 결합법에 의해 항체를 효율적으로 감작하는 방법을 들 수 있다.

항체를 담지시킨 항체 불용성 담체와 일정 형태로 변화시킨 아디포넥틴의 반응은 항원 항체 반응이 일어날 수 있는 조건이면, 그 반응 조건은 특히 한정되는 것은 아니다. 반응액으로서는 전처리한 후 일정 형태로 변화시킨 아디포넥틴과의 항원 항체 반응이 일어날 수 있는 용액이면 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들면, pH를 제어하기 위한 완충 성분으로서 인산 완충액, 글리신 완충액, 트리스 완충액, 굿 완충액 등, 비특이 반응을 회피하기 위한 계면활성제나 염화나트륨 등, 안정화제로서의 소혈청알부민(BSA), 자당, 고분자 다당류 등, 반응성을 제어하는 전기 물질 이외에 덱스트란 등의 수용성 다당류, 전처리제 중의 환원제나 산을 중화하기 위한 중화제, 프로테아제의 불활성화제 등의 첨가제를 적당히 용해시켜도 좋다.

전기한 LTIA나 ELISA에 있어서의 검출 방법으로서는, 예를 들면, 이하의 방법을 들 수 있다. LTIA에 있어서의 불용성 담체의 응집 정도를 측정하는 방법은 특히 한정되지 않는다. 예를 들면, 응집을 정성적 내지 반정량적으로 측정하는 경우는 기존 농도 시료의 탁도의 정도와 측정 시료의 탁도의 정도의 비교로부터, 응집의 정도를 목시에 의해 판정 하는 것도 가능하다. 또, 이 응집을 정량적으로 측정하는 경우는 간편성 및 정밀도의 점으로부터는 광학적으로 측정하는 것이 바람직하다. 응집의 광학적 측정법으로서는 공지의 방법이 이용 가능하다. 보다 구체적으로는 예를 들면, 소위 비탁법(응집괴의 형성을 탁도의 증가로서 잡는다), 입도 분포에 의한 측정법(응집괴의 형성을 입도 분포 내지는 평균 입경의 변화로서 잡는다), 적분구탁도법(응집괴의 형성에 의한 전방 산란광의 변화를 적분구를 이용하여 측정하고, 투과광 강도와의 비를 비교한다) 등의 여러 가지의 방식이 이용 가능하다. ELISA에 있어서의 효소 표지 항체의 효소 활성에 유래하는 기질과 효소의 반응 생성물을 측정하는 방법은 특히 한정되지 않는다. 예를 들면, 효소 반응 생성물 고유의 파장, 예를 들면 492nm에 있어서의 흡광도로서 96 웰 마이크로플레이트 리더로 읽는 것도 가능하다.

실시예

다음에 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하등 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 및 시험예에서 이용한 시약 및 재료는 이하와 같다.

<시약 및 재료>

a. 항체 결합 수지용 세정액: 0.5M NaCl를 함유하는 0.1M NaHCO₃-NaOH(pH 8.3).

b. 항체 결합 수지용 용출액: 0.M Glycine-HCl(pH 2.5).

c. 항체 결합 수지용 중화액: 2M Tris-HCl(pH 8.0).

d. 라텍스: 평균입경 0.2 ㎛의 폴리스티렌 입자 라텍스(고형분 10%(w/v), SEKISUI CHEMICAL CO., LTD.).

e. 항체 담지 라텍스 조제용 완충액: 20mM Tris-HCl(pH 8.0).

f. 블로킹용 완충액: 2% BSA를 함유하는 20mM Tris-HCl(pH 8.0).

g. LTIA용 완충액(R1): 0.15% BSA, 0.15M NaCl를 함유하는 20mM Tris- HCl(pH 8.0).

h. ELISA용 플레이트: 96 웰 마이크로 플레이트(NUNC).

i. ELISA용 항체 감작 용액: PBS(pH 7.4).

j. ELISA용 완충액: 1% BSA, 0.1 % Tween 20을 함유하는 PBS(pH 7.4.

k. Goat α human Acrp30 antibody: Cosmo Bio Co., Ltd., GT Co., Cat No. 421065(항사람 아디포넥틴 폴리클로날 항체의 시판품).

1. hu Acrp30-MoAb: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Transduction Laboratories, 상품 코드 A12820(항사람 아디포넥틴모노클로날 항체의 시판품).

m. Goat α rabbit IgG HRP 표지 항체: Cosmo Bio Co., Ltd., Capple 제품.

n. ELISA용 세정액: 0.05% Tween 20을 함유한 PBS(pH 7.4).

o. ELISA용 완충액 2: 1% BSA, 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS(pH 7. 4).

참고예 1. 대장균 리컴비난트 마우스 글로블러 아디포넥틴(rMgAd)의 조제

마우스 아디포넥틴의 유전자 배열(NCBI accession #U37222)의 글로블러 도메인 배열(104-247잔기 상당)을 6ㅧHis 태그를 함유하는 pQE30 벡터의 BamHI, HindIII에 삽입하고, 대장균에 삽입했다. 리컴비난트 마우스 글로블러 아디포넥틴(rMgAd)을 발현한 대장균으로부터의 rMgAd의 정제는 아래와 같이 행했다. 즉, 대장균의 가용획분을 Ni-NTA 아가로스(QIAGEN사)로 4℃, 16시간 첨가하여 rMgAd를 결합시킨 후, 이미다졸로 단계적으로 용출하여 아디포넥틴을 함유한 획분을 회수하 고, 3일간 PBS로 투석을 행했다. 얻어진 rMgAd의 단백질 농도는 Bio-Rad DC protein assay kit를 이용하여 구했다.

참고예 2. 항rMgAd 항체의 조제

상기 1에서 얻어진 rMgAd 50㎍을 등량의 프로이드의 컴플리트 아쥬번트와 혼합하여, 2 마리의 토끼에 각각 2주간 걸러서 6회 면역하여 항혈청을 제작했다. 항혈청 중의 특이 항체(IgG)의 정제는 Protein A 수지를 이용하여 통상의 방법에 의해 행했다(항rMgAd 항체).

참고예 3. 사람 혈중 유래 아디포넥틴(mAd)의 정제

상기 참고예 2에서 제작한 항rMgAd 항체 500mg을 CNBr-activated Sepharose 4B(Amersham Bioscience) 50㎖에 결합시켜 항rMgAd 항체 결합 Sepharose 4B 수지를 제작했다. 사람 혈청 2.5ℓ를 항rMgAd 항체 결합 Sepharose 4B 수지에 가하고, 항체 결합 수지용 세정액으로 충분히 세정한 후, 항체 결합 수지용 용출액으로 사람 혈청 아디포넥틴(mAd) 획분을 용출하고, 용출획분에 항체 결합 수지용 중화액을 1/10 용량 첨가하여 중화했다. 다시 중화한 용출획분을 Protein A 수지에 첨가하여 Protein A 수지에의 비흡착획분을 정제 mAd로서 회수하여 "human adiponectin ELISA kit"(Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)에 의해 아디포넥틴 함량을 측정했다.

참고예 4. 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체의 제작

상기 참고예 3에서 얻은 정제 mAd 20㎍을 등량의 프로이드의 컴플리트 아쥬번트와 혼합하고, 각 2마리의 마우스에 2주간 걸러서 3 또는 4회 면역을 행한 후, 다시 세포 융합 3일전에 재투여했다. 이 면역된 마우스로부터 비장세포를 적출하고, 폴리에틸렌글리콜을 이용한 통상의 방법에 의해, P3U1 미에로마 세포와 세포 융합을 행했다. 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체 산생 융합 세포의 선택은 ELISA법에 의해 mAd와의 반응성이 높은 웰을 선택하고, 이어서 한계 희석법으로 선택하는 통상의 방법에 의해 행했다. 항사람 아디포넥틴모노클로날 항체는 선택한 융합 세포를 푸리스탄 처리한 마우스 복강내에 투여하여 복수로서 회수했다. 복수로부터의 특이항체(IgG)의 정제는 Protein A 수지를 이용하여 통상의 방법에 의해 행했다. 상기에 의해 인식 번호; 64401-64411로 식별되는 11의 모노클로날 항체 산생 융합 세포와 모노클로날 항체가 얻어졌다.

참고예 5. 항체 감작 라텍스의 조제

라텍스액 1용에 항체 담지 라텍스 조제용 완충액 4용을 혼합하여 희석 라텍스액을 조제했다. 한편, 항rMgAd 항체 또는 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(64401)를 1mg/㎖가 되도록 항체 담지 라텍스 조제용 완충액으로 희석하여 희석 항체액을 조제했다. 상기 희석 라텍스액 1용을 교반하면서 상기 2 종류의 희석 항체액 1용을 별도로 첨가·혼합하고, 다시 교반한 후, 블로킹용 완충액 2용을 추가로 첨가하고, 교반을 계속했다. 얻어진 항체 감작 라텍스를 항rMgAd 항체 담지 라 텍스 원액 및 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(64401) 담지 라텍스 원액으로 했다.

(시험예 1) 사람 혈청중의 다량체 아디포넥틴의 웨스턴 블롯팅에 의한 해석

정상인 8명으로부터 얻은 혈청 0.2㎕ 각각을 PAGE (2-15%)로 분리하고, 세미-드라이 블롯팅으로 PVDF막에 전사한 후, 면역 염색을 행했다. 면역 염색의 순서는 이하와 같다. 먼저, 전사 후의 막을 5% 스킴 밀크 및 0.1% NaN₃를 함유하는 PBS액(pH 7.4)으로 블로킹한 후, 0.1% Tween 20(pH 7.4)을 함유하는 PBS액으로 세정하고, 시판 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(hu Acrp30-MoAb; Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Transduction Laboratories 사) 1 ㎍/㎖를 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 다음에, 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS액(pH 7.4)으로 충분히 세정한 후, Vector ABC kit(Mouse) 및 DAB 기질 킷(FUNAKOSI)을 이용하여 발색시켰다. 이상의 결과, 주요 밴드로서 3종의 밴드가 염색 검출되었다. 이것으로부터 혈중에 존재하는 각종 다량체 아디포넥틴은 주로 3종류 존재하는 것이 판명되었다(도 1). 이들 3종의 염색 밴드에 상당하는 아디포넥틴을 영동상의 상부(고분자측)로부터, "HMW-Ad", "MMW-Ad" 및 "LMW-Ad" 획분으로 명명했다.

실시예 1 정제 mAd의 환원제, 산 또는 그의 염 및 프로테아제에 의한 처리

참고예 3에서 얻은 정제 mAd를 시료로서 환원제, 산 또는 그의 염 및 프로테 아제를 단독 또는 조합하여 작용시켜 처리하고, 정제 mAd의 형태 변화를 관찰했다.

1) 환원제, 산처리

정제 mAd를 함유하는 50mM의 각종 완충액(Tris-HCl pH 8.5, 아세트산나트륨 pH 3.0 및 pH 4.0)에 대해 환원제로서 10mM DTT 비첨가 또는 첨가의 조건으로, 37℃에서 60분간 가온했다. 처리 후의 액을 PAGE (2-15%)로 분리하고, CBB로 단백 염색했다. Tris-HCl pH 8.5, DTT 비첨가(처리 조건 1)의 염색상을 대조로서 각 처리 조건에 있어서의, HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad 각 획분에 상당하는 밴드의 증감 및 새로운 변환물 밴드의 생성을 관찰했다(표 1).

그 결과, 환원제 비첨가의 처리 조건에서는 pH 3.0 및 pH 4.0의 아세트산나트륨 완충액(처리 조건 3, 5)에 있어서 HMW-Ad 획분의 염색 밴드가 소실하고, MMW-Ad 획분의 증가가 확인되었다. 환원제 첨가의 처리 조건에서는 pH 3.0 및 pH 4.0의 아세트산나트륨 완충액(처리 조건 4, 6)에서는 HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad의 3 획분 모든 염색 밴드가 소실됨과 동시에 각 획분의 변환물인 새로운 염색 밴드의 출현이 확인되었다. Tris-HCl (pH 8.5)(처리 조건 2)에서는 각 획분의 변환물인 새로운 염색 밴드의 출현이 확인되었지만, HMW-Ad 획분이 완전하게 소실하지 않았다.

이상부터, 다량체 아디포넥틴(HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad)으로 환원제, 산 또는 그의 염을 작용시키면, 다량체 아디포넥틴으로부터 새로운 변환물이 생기는 것이 확인되었다. 상기 처리에 의해 생성한 변환물은 3량체 아디포넥틴인 것으로 추정되었다.

[표 1]

처리조건	1	2	3	4	5	6
완충액 pH 환원제	Tris-HCl 8.5 -	Tris-HCl 8.5 첨가	아세트산-NaOH 3.0 -	아세트산-NaOH 3.0 첨가	아세트산-NaOH 4.0 -	아세트산-NaOH 4.0 첨가
다량체 HMW-Ad 아디포 MMW-Ad 넥틴 LMW-Ad 변환물	++ ++ ++ -	+ - - +++	- +++ ++ -	- - - +++	- +++ ++ -	- - - +++

(+)=감소, (++)=불변, (+++)=증가 또는 변환물의 생성을 나타낸다.

(-)=소실 또는 변환물의 미생성을 나타낸다.

2) 프로테아제 처리

50mM 인산 완충액(pH 8.0)에 정제 mAd 및 각종 프로테아제(모두 시판품)를 첨가하고, 37℃에서 60분간 가온했다. 처리 후의 액을 PAGE (2-15%)로 분리하고, CBB에 의해 단백 염색했다. Tris-HCl(pH 8.5), DTT 비첨가(처리 조건 1)의 염색상을 대조로 하여 각 처리 조건에 있어서의, HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad 각 획분에 상당하는 밴드의 증감 및 새로운 변환물 밴드의 생성을 관찰했다(표 2).

처리 조건 7∼9에서는 HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad의 3획분 모든 염색 밴드가 소실됨과 동시에 저분자량역에 각 획분의 변환물인 새로운 염색 밴드의 출현이 확인되었다. 처리 조건 10∼12에서는 LMW-Ad 및 MMW-Ad 획분은 소실되고, 저분자량역에 각 획분의 변환물인 새로운 염색 밴드의 출현이 확인되었다. 이 때, HMW-Ad 획분의 염색 밴드에 변화는 보이지 않았다.

이상으로부터, 다량체 아디포넥틴(HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad)에 프로테아제를 작용시키면, 다량체 아디포넥틴으로부터 새로운 변환물을 일으키는 것이 확인되었 다. 이들 변환물의 PAGE (2-15%)에서의 염색 밴드의 검출 위치는 작용시킨 프로테아제에 따라 다르지만, 30∼42kDa의 범위에 있었다.

또한, 처리 조건 10∼12의 프로테아제에 관해서는 산 또는 그의 염에 의한 처리를 행하고, HMW-Ad 획분을 MMW-Ad 획분으로 변환시킨 후, 프로테아제 처리를 행함으로써 모든 획분에 대해서 새로운 변환물로의 변환이 가능함을 알았다.

[표 2]

처리조건	7	8	9	10	11	12
프로테아제	Protease type XIV	Protease type X	Protin AC	Protease P "Amano"	Protease A "Amano"	Umamizyme
다량체 HMW-Ad 아디포 MMW-Ad 넥틴 LMW-Ad 변환물	- - - +++	- - - +++	- - - +++	++ - - +++	++ - - +++	++ - - +++

(-)=소실 또는 변환물의 미생성을 나타낸다.

실시예 2 라텍스 시약과 각 아디포넥틴과의 반응성

프로테아제 처리한 정제 mAd를 ELISA용 완충액으로 1/5, 1/25배 희석하여 검체로 했다. 또한, 참고예 5에서 조제한 각각의 라텍스 원고와 피고를 항체 담지 라텍스 조제용 완충액으로 1/10배에 희석한 것을 시약 2로서 측정에 이용하여 검체량: 10μL, 시약 1(LTIA용 완충액(R1)): 100㎕, 시약 2: 100㎕, 측정 파장: 570nm, 측광 포인트: 18-34의 측정 조건으로 생화학 자동분석장치 히타치 7170형(Hitachi Ltd.)을 이용하여 측정했다. 측정 결과를 도 2에 나타낸다.

항rMgAd 항체 및 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(64401)의 라텍스 시약 각각이 Protin(Protin) AC, Protease type X의 프로테아제, 그리고 처리한 사람 혈청 아디포넥틴의 농도에 의존하여 흡광도가 변화했다.

Protin(Protin) AC, Protease type X의 프로테아제는 다량체 아디포넥틴을, 항 rMgAd 항체 및 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(64401)가 인식하는 항체 인식부위를 유지한 상태에서 새로운 변환물로 변환할 수 있는 것이 판명되어 시료중의 아디포넥틴 총량을 측정하기 위한 전처리에 사용할 수 있음이 확인되었다

실시예 3 ELISA 시약과 각 아디포넥틴과의 반응성

ELISA용 플레이트에 Goat α human Acrp30 antibody 또는 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(64401)를 ELISA용 항체 감작 용액으로 1 ㎍/㎖에 희석한 후, 감작했다. ELISA용 완충액으로 블로킹한 후, 프로테아제 처리한 mAd를 ELISA용 완충액으로 1/2, 1/20, 1/200배 희석하여 얻은 검체를 실온에서 1시간 반응시켰다. ELISA용 완충액으로 플레이트를 세정한 후, ELISA용 완충액으로 1/10000배 희석한 항rMgAd 항체액을 실온에서 1시간 반응시킨 후, ELISA용 완충액으로 플레이트를 세정하고, ELISA용 완충액으로 1/1000배 희석한 Goat α rabbit IgG HRP 표지 항체액을 실온에서 1시간 반응시켰다. ELISA용 완충액으로 플레이트를 세정한 후, TMB(테트라메틸벤치딘)와 과산화수소를 이용한 HRP의 효소 반응에 의해 발색시키고, 2N 황산을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 450nm의 흡광도를 측정했다. 측정 결과를 도 3에 나타낸다.

항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(64401)와 항rMgAd 항체의 조합 및 Goat α human Acrp30 antibody와 항 rMgAd 항체의 조합의 ELISA 시약은 Protin(Protin) AC, Protease type X의 프로테아제, 그리고 처리한 사람혈청 아디포넥틴의 농도에 의존하여 흡광도가 변화했다.

Protin(Protin) AC, Protease type X의 프로테아제는 다량체 아디포넥틴을 Goat α human Acrp30 antibody, 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(64401) 및 항rMgAd 항체가 인식하는 항체 인식 부위를 유지한 상태에서 새로운 변환물로 변환할 수 있음이 판명되어, 시료중의 아디포넥틴 총량을 측정하기 위한 전처리에 사용할 수 있음을 확인되었다.

(시험예 2) 사람 혈중 유래 다량체 아디포넥틴의 해석

참고예 3에 준하여 새로 조제한 정제 mAd를 PAGE (2-15%)에서 분리하고, 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB)로 단백 염색했다(도 4). 이어서 다시, 시험예 1과 동일하게 조작하여 시판 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(hu Acrp30-MoAb)를 이용하여 면역 염색을 행했다. 염색상을 해석한 결과, 사람 혈청으로부터 정제된 다량체 아디포넥틴은 시험예 1에서 확인된 3종류 이외에, 양적으로 적기는 하지만, 또 다른 1종류가 검출되어 적어도 4종류가 존재하는 것이 판명되었다. 이들 4종의 CBB 염색 밴드에 상당하는 아디포넥틴을 영동상의 상부(고분자측)로부터, "HMW-Ad", "MMW-Ad", "LMW-Ad" 및 "ULMW-Ad" 획분으로 했다.

실시예 4 정제 mAd의 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제에 의한 처리

시험예 2에서 해석된 정제 mAd를 시료로 하여 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제를 단독 또는 조합하여 작용시켜 처리하여 정제 mAd의 형태 변화를 관찰했다.

1) 환원제, 산처리의 조합

정제 mAd를 함유하는 100mM의 각종 완충액(Tris-HCl pH 8.5, 시트르산나트륨 pH 3.0∼6.0)에 대해 환원제로서 10mM 2-메르캅토에탄올 비첨가 또는 첨가의 조건으로, 37℃에서 30분간 가온했다. 처리 후의 액을 PAGE (2-15%)로 분리하고, CBB로 단백 염색했다. Tris-HCl pH 8.5, 2-메르캅토에탄올 비첨가(처리 조건 13)의 염색상을 대조로서 각 처리 조건에 있어서의, HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad, ULMW-Ad 각 획분에 상당하는 밴드의 증감 및 새로운 변환물 밴드의 생성을 관찰했다(표 3).

그 결과, 환원제 비첨가의 처리 조건에서는 pH 4.0 이상의 시트르산나트륨 완충액(처리 조건 15, 17, 19)에 있어서 HMW-Ad 획분의 염색 밴드가 시트르산나트륨 완충액의 산성화와 함께 소실되는 경향을 나타내며, MMW-Ad 획분의 증가가 확인되었다. 또한, pH 3.0(처리 조건 21)에서는 ULMW-Ad보다 영동거리가 긴 변환물인 염색 밴드가 새롭게 확인되었다. 한편, 환원제 첨가의 처리 조건에서는 pH 6.0이상(처리 조건 14, 16)에서는 HMW-Ad의 염색 밴드가 잔존했지만, pH 5.0 및 4.0의 처리 조건 18, 20에서는 모든 획분의 염색 밴드가 소실하고, ULMW-Ad와 거의 같은 위치에, 브로드한 염색 밴드가 새롭게 확인되었다. 또한, pH 3.0(처리 조건 22)에 서는 처리 조건 21과 거의 동일한 위치에 브로드한 변환물의 밴드가 새롭게 확인되었다.

이상으로부터, 다량체 아디포넥틴(HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad 및 ULMW-Ad)에 환원제, 산 또는 그의 염을 작용시키면, 다량체 아디포넥틴으로부터 새로운 변환물이 생기는 것이 확인되었다. 처리 조건 21에서 생성된 변환물은 2량체, 환원제를 첨가한 조건(14, 16, 18, 20)에서 생성된 변환물은 3량체, 또한 처리 조건 22에서 생성된 변환물은 1량체인 것으로 추정되었다. 더욱이 염색 밴드를 잘라낸 해석에서는 ULMW-Ad는 3량체, 그리고, LMW-Ad는 알부민이 결합하고 있는 3량체 아디포넥틴인 것이 확인되었다.

[표 3]

처리조건		13	14	15	16	17	18	19	20	21	22
완충액		Tris-HCl		시트르산- NaOH		시트르산- NaOH		시트르산- NaOH		시트르산- NaOH
pH		8.5		6.0		5.0		4.0		3.0
환원제		-	첨가	-	첨가	-	첨가	-	첨가	-	첨가
다량체 아디포넥틴	HMW-Ad MMW-Ad LMW-Ad ULMW-Ad	++ ++ ++ ++	+ - - -	++ ++ ++ ++	+ - - -	+ +++ ++ ++	- - - -	- +++ ++ ++	- - - -	- - - -	- - - -
	변환물	-	+++	-	+++	-	+++	+++	+++	+++	+++

(-)=소실 또는 변환물의 미생성을 나타낸다.

2) 프로테아제 처리

50mM 인산 완충액(pH 8.0)에 정제 mAd 및 각종 프로테아제(모두 시판품)를 1 mg/㎖가 되도록 첨가하고, 37℃에서 60분간 가온했다. 처리 후의 액을 PAGE (2-15%)로 분리하고, CBB로 단백 염색했다. Tris-HCl (pH 8.5), DTT 비첨가(처리 조건 1)의 염색상을 대조로서 각 처리 조건에 있어서의, HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad 및 ULMW-Ad의 각 획분에 상당하는 밴드의 증감 및 새로운 변환물 밴드의 생성을 관찰했다(표 4).

처리 조건 23∼25에서는 HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad 및 ULMW-Ad의 4획분 모두 염색 밴드가 소실됨과 동시에, 저분자량역에 각 획분의 변환물인 새로운 염색 밴드의 출현이 확인되었다. 처리 조건 26∼28에서는 ULMW-Ad, LMW-Ad 및 MMW-Ad 획분은 소실하고, 저분자량역에 각 획분의 변환물인 새로운 염색 밴드의 출현이 확인되었다. 이 때, HMW-Ad 획분의 염색 밴드에 변화는 볼 수 없었다.

이상으로부터, 다량체 아디포넥틴(HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad 및 UL MW-Ad)에 프로테아제를 작용시키면, 다량체 아디포넥틴으로부터 새로운 변환물을 생성하는 것이 확인되었다. 이들 변환물의 PAGE (2-15%)에서의 염색 밴드의 검출 위치는 작용시킨 프로테아제에 의해 다르지만, 30∼42kDa의 범위에 있었다. 이들의 변환물을 잘라 내어 아미노산 분석한 결과, 글로블러 아디포넥틴인 것이 판명되어 있다.

또, 처리 조건 26∼28의 프로테아제에 관해서는 산 또는 그의 염으로 처리하여 HMW-Ad 획분을 MMW-Ad 획분으로 변환시킨 후, 프로테아제 처리를 행함으로서 모든 획분에 대해서 새로운 변환물로의 변환이 가능함을 알았다.

[표 4]

처리조건	23	24	25	26	27	28
프로테아제	Protease type XIV	Protease type X	Protin AC	Protease P "Amano"	Protease A "Amano"	Proteinase K
다량체 HMW-Ad 아디포 MMW-Ad 넥틴 LMW-Ad ULMW-Ad 변환물	- - - - +++	- - - - +++	- - - - +++	++ - - - +++	++ - - - +++	++ - - - +++

(+)=소실, (++)=불변, (+++)=증가 또는 변환물의 생성을 나타낸다.

(-)= 소실 또는 변환물의 미생성을 나타낸다.

실시예 5 산처리, 계면활성제를 조합한 혈중 아디포넥틴 총량의 측정

(1) 전처리액의 조제

산처리의 조건으로서 100mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 3.0)을 선택하고, 여기에 시판되고 있는 각종 계면활성제를 첨가했다. 첨가하는 계면활성제로서는 음이온성 계면활성제로서 SDS 및 Neoperex F65(KAO CORPORATION), 양이온성 계면활성제로서는 Cortamine 24P 및 Cortamine 86P(KAO CORPORATION), 비이온성 계면활성제로서는 Triton X-100 및 Tween 20을 이용했다. 첨가 농도는 SDS가 2%인 이외는 모두 0.5%로 했다.

(2) 검체 처리

8명의 발란티어로부터 채취된 각 혈청 검체 10 ㎕, 전술한 각종 전처리액을 490㎕ 첨가하고, 충분히 교반한 후, 비등하지 않고, ELISA용 완충액 2로 5250배 희석했다. 효과를 비교하기 위해, 전기 각 혈청 10㎕에 50mM Tris-HCl(pH 6.8, 2%SDS) 용액 490㎕를 전처리액으로서 첨가하고, 충분히 교반한 후, 비등 처리하고, ELISA용 완충액 2로 5250배 희석하여 대조로 했다. 농도를 구하기 위한 표준품으로서, 시험예 2에서 해석된 정제 mAd를 50mM Tris-HCl(pH 6.8, 2%SDS) 용액으로 비등 처리하여 ELISA용 완충액 2로 희석 계열을 작성한 것을 이용했다.

(3) 아디포넥틴 총량 측정

ELISA용 플레이트에 항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(64405)를 PBS로 5 ㎍/㎖로 희석한 후, 감작 했다. 이어서, ELISA용 완충액 2로 블로킹한 후, 상기 표준품 및 혈청 처리액을 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. ELISA용 세정액으로 플레이트를 세정한 후, ELISA용 완충액 2로 2000배 희석한 Biotin 표지항사람 아디포넥틴 모노클로날 항체(64404)를 실온에서 1시간 반응시킨 후, 다시 ELISA용 완충액 2로 2000배 희석한 HRP-Avidin을 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. ELISA용 세정액으로 플레이트를 세정하고, OPD 발색액(2 mg/㎖ o-페닐렌디아민 염산염, 0.02% 과산화수소를 함유하는 250 mM 시트르산 완충액, pH 5.0)으로 발색시키고, 정지액(1.5N 황산, 1 mM EDTA-2Na)을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 492 nm의 흡수를 측정했다. 표준품의 발색 값으로부터, 각 전처리액에 의한 혈청중의 아디포넥틴 총량(농도)을 환산하고, 50mM Tris-HCl(pH 6.8, 2%SDS) 용액에 의한 비등 처리한 조건을 대조로 하여 상관 분석을 행했다(표 5).

그 결과, 계면활성제 무첨가의 산처리 조건에서는 상관계수는 양호했지만, 회귀식의 기울기가 0.45로 되어, 대조 환산 값에 대해서 낮은 값으로 되어 있는 것이 확인되었다. 계면활성제를 공존시켰을 경우, 상관계수가 향상됨과 동시에 대조 환산 값에 측정값이 근사한 경향이 확인되었다. 특히, 음이온성 계면활성제를 공존시켰을 경우, 그 효과는 현저하고, 본 발명의 전처리방법을 사용하면, 시료를 비등하는 일 없이, 시료중의 아디포넥틴 총량의 측정이 가능한 것이 판명되었다.

[표 5]

(대조) 50 mM Tris-HCl pH 6.8(2% SDS) 비등처리

본 발명에 의하면, 각종 다량체가 혼재하는 생체 시료중의 아디포넥틴 총량을 간편, 신속하고, 정확하게 측정할 수 있다.

Claims

시료중의 아디포넥틴의 총량을 면역학적으로 측정하기 위한 아디포넥틴시정용 시료의 전처리방법으로며, 아디포넥틴을 함유하는 시료에 대해 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나를 가하고, 시료와 함께 비등 처리하지 않고, 작용시킴을 특징으로 하는 아디포넥틴 측정용 시료의 전처리방법.
제 1항에 있어서, 면역학적으로 측정하는 방법이 항아디포넥틴 항체를 담지시킨 불용성 담체를 이용함을 특징으로 하는 전처리방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 프로테아제가 미생물 유래의 프로테아제 또는 유전자 조작 기술에 의해 얻어진 프로테아제인 것을 특징으로 하는 전처리방법.
제 3항에 있어서, 미생물이 바칠루스속, 스트렙토미세스속 및 아스페르길루스속으로 이루어진 군에서 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는 전처리방법.
환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나를 함유하는 아디포넥틴 총량의 면역학적 측정용 시료의 전처리제이며, 시료와 함께 비등 처리하지 않고, 시료에 작용시키기 위한 전처리제.
제 5항에 있어서, 면역학적으로 측정하는 방법이 항아디포넥틴 항체를 담지시킨 불용성 담체를 이용하는 방법인 전처리제.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 프로테아제가 미생물 유래의 프로테아제 또는 유전자 조작 기술에 의해 얻어진 프로테아제인 전처리제.
제 7항에 있어서, 미생물이 바칠루스속, 스트렙토미세스속 및 아스페르길루스속으로 이루어진 군에서 선택된 미생물인 전처리제.
아디포넥틴을 함유하는 시료에 환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나를 가하고, 시료와 함께 비등 처리하지 않고 작용시킨 후, 면역학적으로 아디포넥틴을 측정하는 것을 특징으로 하는 시료중의 아디포넥틴 총량의 측정방법.
제 9항에 있어서, 면역학적으로 측정하는 방법이 항아디포넥틴 항체를 담지시킨 불용성 담체를 이용하는 방법인 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 프로테아제가 미생물 유래의 프로테아제 또는 유전자 조작 기술에 의해 얻어진 프로테아제인 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 11항에 있어서, 미생물이 바칠루스속, 스트렙토미세스속 및 아스페르길루스속으로 이루어진 군에서 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는 측정방법.
환원제, 산 또는 그의 염, 계면활성제 및 프로테아제 중의 적어도 하나를 함유하는 제 1시약과 아디포넥틴을 측정하기 위한 항체를 담지시킨 불용성 담체를 함유하는 제 ２시약으로 되는 아디포넥틴 총량의 면역학적 측정 시약이며, 시료와 제 1시약의 반응을 비등시키지 않고, 행하는 방법에 이용되는 측정시약.