CN103391946A

CN103391946A - 抗il28b抗体及使用该抗体的il28b的测定方法

Info

Publication number: CN103391946A
Application number: CN2012800066652A
Authority: CN
Inventors: 藤井信之; 白川贵志; 小见和也
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 2011-01-27
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2013-11-13
Also published as: WO2012102126A1; EP2669296A1; KR20140041435A; JP2012153664A; JP5821198B2; EP2669296A4

Abstract

本发明公开了能与白介素28A(IL28A)区分开来识别白介素28B(IL28B)的新型抗体。利用本发明的抗体，能区分作为分泌蛋白仅有7个残基不同的IL28A和IL28B，能特异性地检出、定量IL28B。期待IL28B作为事先预测聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法能否治疗HCV感染症的标记物。藉由本发明，能通过简便、迅速且廉价的免疫测定来测定IL28B，因此本发明对于HCV感染症的治疗现场也能作出贡献。

Description

抗IL28B抗体及使用该抗体的IL28B的测定方法

技术领域

本发明涉及与白介素28B特异性结合的抗体、以及使用该抗体的IL28B的测定方法。

背景技术

日本国的丙型肝炎病毒(HCV)感染者约有200万人，是日本国内最大的感染症。HCV一旦感染，就有6～8成会转成慢性肝炎，几乎不会自然治愈，大多会发展为肝硬化、肝癌，在日本的现状是每年约有2万5千人因肝癌而死亡。该HCV的根治治疗可通过聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法来根治，但现状是，在日本人中最多的Genotype 1型高病毒量的病例中只有约50％左右的根治，约20％的聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法完全无效。聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法有很高的频率会发生严重的副作用，并且价格非常高，因此特别是对完全无效的患者而言是一种负担。

聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法的治疗效果与白介素28B (IL28B)基因多态性有着很强的关联，而且有报道称，并用治疗没有效果的患者的IL28B基因表达水平显著地低(非专利文献１)，期待IL28B作为HCV治疗效果预测标记物。然而，现状是不存在IL28B特异性抗体，也不存在IL28B特异性测定方法及试剂盒。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4350950号

非专利文献

非专利文献1：Nature Genetics, vol. 41, No. 10, 2009, p.1105-1109。

发明内容

发明所要解决的课题

因此，本发明的目的在于提供能进行IL28B的免疫测定的新方法。

用于解决课题的手段

本发明人以重组IL28B作为免疫原，在抗体筛选中使用重组IL28B和重组IL28A来制备单克隆抗体，结果成功地取得了与IL28B结合而与IL28A实质上不结合的抗体。所得抗体的表位分析的结果发现，以IL28B的氨基酸序列中的aa97-136的区域作为表位，在将IL28B的第120位的G(甘氨酸）置换为IL28A的第120位的V(缬氨酸）的IL28B-G120V中无法确认到反应，发现该抗体能特异性地识别与IL28A不同的氨基酸、即IL28B的第120位的G。还发现，在该抗体与IL28B的结合中，第114位的D和第124位的D也很重要。此外，确立了使用该抗体以及以与该抗体不同的区域作为表位而与IL28B结合的抗体的夹心免疫测定的方法，使得可提供免疫测定试剂盒，从而完成了本发明。

即，本发明提供抗体或其抗原结合性片段，其与白介素28B通过抗原抗体反应而结合，与白介素28A实质上不结合。此外，本发明提供白介素28B的测定方法，该方法包括通过使用上述本发明的抗体或其抗原结合性片段的免疫测定来测定试样中的白介素28B的步骤。本发明还提供白介素28B的免疫测定试剂盒，其包括上述本发明的抗体或其抗原结合性片段。本发明还提供一种方法，该方法是预测聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法对HCV感染症的治疗效果的方法，包括通过上述本发明的方法来测定从HCV感染患者中分离的试样中的白介素28B、考察所述患者中的白介素28B表达量的步骤，其中，白介素28B的低水平的表达表示所述并用疗法没有效果的可能性高。

发明的效果

通过本发明，首次提供了能将IL28B和IL28A区分开识别的抗体。利用本发明的抗体，能区分作为分泌蛋白仅有7个残基不同的IL28A和IL28B，能特异性地检出、定量IL28B。已知聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法对HCV感染症的治疗效果与IL28B基因多态性有着很强的关联，该并用治疗没有效果的患者的IL28B基因表达水平显著地低，期待IL28B作为事先预测该并用疗法能否治疗HCV感染症的标记物。然而，基因多态性分析繁琐，需要时间，且价格高。藉由本发明，能通过简便、迅速且廉价的免疫测定来测定IL28B，因此对于HCV感染症的治疗现场也能作出贡献。

附图说明

[图1]表示IL28A和IL28B的氨基酸序列的比对。

[图2]表示对于实施例中制备的两种单克隆抗体IL28-308及IL28-402、通过固相ELISA来考察与IL28B、IL28A及IL29的反应性的结果。

[图3]表示通过实施例中确立的夹心ELISA来测定IL28B及IL28A的结果。

具体实施方式

如上所述，本发明的抗体与白介素28B(IL28B)通过抗原抗体反应结合，与白介素28A(IL28A)实质上不结合。下面有时将这样的结合性称为“与IL28B特异性结合”。此外，有时将该抗体称为“抗IL28B抗体”。

这里，“实质上不结合”是指：不与IL28A以能检出的水平结合(即与IL28A的结合在背景以下)，或者即使以能检出的水平结合，该结合的程度也极其微弱、且和与IL28B的结合相比明显更少，只能结合到只要是本领域技术人员就能判断其未与IL28B结合的程度。本发明的抗IL28B抗体优选为仅与IL28B结合、不与IL28A以能检出的水平结合的抗体。例如，通过ELISA考察了下述实施例中制备的抗体与IL28A的结合性，如果在通过该方法考察时只能以背景程度以下的水平检出结合，则可以判断不以能检出的水平结合。此外，本发明的抗IL28B抗体与IL29也实质上不结合，优选不以能检出的水平结合。

IL28A、IL28B及IL29本身是公知的蛋白质，在GenBank中也分别以登录号AY129148、AY129149、AY129150登录。这些已登录的序列示于序列表的序列编号1～6。序列编号4所示的IL28B的氨基酸序列中，第1～第25个氨基酸(aa1-25)的区域是信号肽，aa26-200的区域是作为成熟蛋白质分泌的区域。

[表1]

Figure 2012800066652100002DEST_PATH_IMAGE001

本发明中，任意的氨基酸残基的位置以包含信号肽的IL28B的全长200个残基的氨基酸序列为基准来表示。例如，IL28B的“第120个氨基酸”是指序列编号４所示的氨基酸序列中的第120位的氨基酸。该残基在除去了信号肽的成熟型IL28B中是自N末端起第95位。

IL28B是与IL28A及IL29同源性高的蛋白质。特别是IL28B和IL28A的同源性非常高，两者间的不同的氨基酸在全长200个残基中有8个残基，在分泌蛋白区域中有7个残基(图1)。本发明的抗体与如上所述同源性非常高的IL28A区分开，与IL28B特异性结合。

抗IL28B抗体优选与IL28B的aa97-136的区域内的表位结合。这里，“aa97-136的区域内的表位”的表述包括由aa97-136的区域的全长构成的表位、以及由aa97-136的区域内的部分区域构成的表位。下述实施例中制备的抗IL28B抗体与由IL28B的aa97-136构成的部分片段结合，与由IL28A的相同区域构成的部分片段不结合。此外，确认与IL28B及IL28A这两者结合的抗体以不同的区域作为表位。因此，以aa97-136的区域内的任意区域(全长或其一部分)作为表位的抗体是能与IL28B特异性结合的抗体。

抗IL28B抗体能识别IL28B中的特定的氨基酸残基。“识别氨基酸残基”是指与该残基本身或由该残基形成的抗原分子表面的部分结构结合，除了抗IL28B抗体与外露在IL28B分子表面的该残基结合的情况外，也包括虽然该残基本身位于分子结构的内部、但却是决定抗IL28B抗体所结合的IL28B分子表面的部分结构(也包括糖链结构等表面修饰)的重要的残基的情况。

例如，抗IL28B抗体识别IL28B的第120个氨基酸。第120个氨基酸在IL28B中是甘氨酸，而在IL28A中是缬氨酸。下述实施例中制备的抗IL28B抗体与将IL28B的第120个氨基酸置换为缬氨酸的IL28B突变体不结合，另一方面，与将IL28A的第120个氨基酸置换为甘氨酸的IL28A突变体结合。因此，该抗IL28B抗体是识别IL28B的第120个氨基酸的抗体。

此外，抗IL28B抗体除了第120个氨基酸外，也能识别第114个和第124个氨基酸。第114个和第124个氨基酸在IL28B和IL28A中均同为天冬氨酸，而下述实施例的抗IL28B抗体即使在将这些氨基酸残基置换了的情况下也不能结合。因此，这些残基也可能是构成抗IL28B抗体的表位的重要的残基。

本发明的抗体既可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，为了免疫测定等，优选重现性高的单克隆抗体。

本发明的抗IL28B抗体例如可以使用IL28B的分泌蛋白区域(序列编号4的aa26-200)作为免疫原、通过周知的杂交瘤法来制备。具体而言，例如通过周知的基因工程方法来制备除去了信号肽的成熟型IL28B，用其作为免疫原来免疫动物(人除外)，在该动物体内诱发抗体。从该动物回收脾细胞和淋巴细胞之类的抗体产生细胞，使其与骨髓瘤细胞等永生化细胞融合，从而能制成杂交瘤。使用IL28B和IL28A作为筛选抗原，从该杂交瘤中选择与IL28B结合、与IL28A不结合的杂交瘤，使其增殖，从而能从培养上清中得到抗IL28B单克隆抗体。

也能由本发明的抗体来制备抗原结合性片段。“抗原结合性片段”是指例如免疫球蛋白的Fab片段和F(ab')₂片段之类的、维持着该抗体与对应抗原的结合性(抗原抗体反应性)的抗体片段。众所周知这样的抗原结合性片段也能用于免疫测定，与原本的抗体同样有用。众所周知，Fab片段和F(ab')₂片段可通过用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶之类的蛋白分解酶对单克隆抗体进行处理而得。应予说明，抗原结合性片段不限定于Fab片段和F(ab')₂片段，可以是维持着与对应抗原的结合性的任意片段，也可以是通过基因工程方法制备的片段。此外，例如也可以使用通过基因工程方法使单链可变区(scFv: single chain fragment of variable region)在大肠杆菌内表达而得的抗体。scFv的制备方法也是周知的，可以提取如上所述制备的杂交瘤的mRNA，制备单链cDNA，用免疫球蛋白H链及L链的特异性引物进行PCR，将免疫球蛋白H链基因及L链基因扩增，用接头将它们连接，赋予合适的限制酶位点，导入质粒载体中，用其转化大肠杆菌，从大肠杆菌中回收scFv，从而制成scFv。这样的scFv也作为“抗原结合性片段”包括在本发明的范围内。

藉由使用本发明的抗体或其抗原结合性片段的免疫测定，能区分作为分泌蛋白仅有7个残基不同的IL28A和IL28B，能特异性地检出、定量IL28B。本发明也提供白介素28B的测定方法，该方法包括通过使用抗体或其抗原结合性片段的免疫测定来测定试样中的白介素28B的步骤。应予说明，本发明中，“测定”这一用语包括检出、定量、半定量。

免疫测定本身在本领域内是周知的，本发明的测定方法中可以采用任意一种。即，如果根据反应形式将免疫测定法分类，则有夹心法、竞争法、凝集法、蛋白质印迹法等，此外，如果根据标记来分类，则有酶联免疫分析、放射免疫分析、荧光免疫分析等，其中的任一种方法都包括在本发明所说的“免疫测定”中，本发明的测定方法中可以采用。虽无特别限定，但如果要例举具体例，则可以优选采用免疫沉淀、ELISA、免疫染色、免疫色谱等方法。从在医疗现场迅速、简便地检出IL28B的观点来看，更优选夹心ELISA、免疫色谱等夹心法。

各免疫测定中所需的试剂类也是周知的，除了所使用的抗体是本发明的抗体或其抗原结合性片段外，可以使用普通的免疫测定用试剂盒来进行免疫测定。即，本发明也提供用于实施本发明的测定方法的测定试剂盒，其包括上述本发明的抗体或其抗原结合性片段。抗体或其抗原结合性片段以外的试剂盒中包括的试剂种类可以与公知的普通的免疫测定用试剂盒相同。例如，本发明的测定试剂盒除了上述抗体或其抗原结合性片段外，还可以包括能作为样品稀释液或洗涤液等使用的缓冲液及操作说明书等。

对于试样无任何限定，只要是能含有IL28B的试样就都可以。既可以是从机体分离出来的来源于机体的试样，也可以是不来源于机体的试样(例如在实验室中通过基因工程方法制备的IL28B试样等)。例如，作为来源于机体的试样，可例举血液试样(全血、血浆、血清等)、细胞提取液、组织试样等，但不限定于此。机体无特别限定，有人、狗、猫、兔、小鼠、仓鼠等哺乳动物。

这些免疫测定法本身是周知的，无需在本说明书中说明，但如果要简单地记载，则例如在夹心法中，将与IL28B结合的抗体固定化于固相(固相化抗体)，使其与试样反应，洗涤后，使其与在与固相化抗体不同的位点与IL28B结合的经标记的抗体(标记抗体)反应，洗涤后，测定与固相结合的标记抗体。通过使用与IL28B特异性结合的抗IL28B抗体作为固相化抗体和标记抗体中的至少任一方，可将试样中的IL28B和IL28A区分开来测定。固相化抗体和标记抗体可以一方采用抗IL28B抗体、另一方采用与IL28A也能结合的抗IL28A/B抗体，或者也可以采用在彼此不同的位点与IL28B分子结合的两种抗IL28B抗体。抗IL28A/B抗体例如可通过在上述抗IL28B抗体的制备方法中的杂交瘤的筛选工序中选择产生与IL28A的IL28B这两者结合的抗体的杂交瘤而获得。固相化抗体和标记抗体可以都是多克隆抗体也可以都是单克隆抗体，从提高测定精度的观点来看，优选两者都是单克隆抗体。应予说明，免疫测定中，也可以使用该抗体的抗原结合性片段来代替抗体。

标记抗体的测定可通过测定来自标记物质的信号来进行。信号的测定方法根据标记物质的种类适当选择。例如为酶标记时，可以将该酶的底物添加至反应体系内，用吸光光度计或发光计测定通过酶反应而产生的显色或发光的量。对于以各种浓度含有IL28B的浓度已知的标准试样，可以用本发明的抗体或其抗原结合性片段来进行免疫测定，将来自标记的信号的量和标准试样中的IL28B浓度的相关关系作图，预先制成校正曲线，对IL28B浓度未知的受试试样进行同样的操作，测定来自标记的信号量，将测定值代入该校正曲线，从而定量受试试样中的IL28B。

固相化抗体和标记抗体这两者为单克隆抗体时，可通过尝试实际进行免疫测定来容易地考察单克隆抗体的组合是否是优选的。根据需要，可以进行抗体的识别位点的鉴定，考察是否识别不同的表位。抗体的识别位点的鉴定可通过本领域周知的常规方法来进行。如果要简洁地说明，则例如可以将作为对应抗原的IL28B蛋白用胰蛋白酶等蛋白质分解酶部分消化，使部分消化物溶液通过结合有欲考察识别位点的抗体的亲和柱，使消化物结合，接着使结合的消化物洗脱，进行常规方法的质谱，从而鉴定抗体的识别位点。

HCV感染症虽然可通过聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法来根治，但在日本人中最多的Genotype 1型高病毒量的病例中的根治率低，约20％的该并用疗法完全无效。近年来，有报道称，该并用治疗没有效果的患者中IL28B基因表达水平显著地低(非专利文献１)，认为IL28B可以用作HCV治疗效果预测标记物。即，可以对从HCV感染患者中分离的试样用本发明的方法测定IL28B，考察该患者中的IL28B表达量，根据该表达量测定值来事先预测HCV感染患者能否用聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法治疗。IL28B的低水平的表达表示该并用疗法没有效果的可能性高。

例如，可以针对并用疗法有效的已知的患者组考察IL28B表达量，预先确定“有效的基准值”，将HCV感染患者中的测定值与该有效的基准值进行对比，从而预测该HCV感染患者的并用治疗效果。与有效的基准值有显著差异的情况下(即与有效的基准值相比、测定值显著地低的情况下)，可以预测该患者的上述并用疗法没有效果，因此可以事先避免使用高价且副作用也多的上述并用疗法。与有效的基准值没有显著差异的情况下(即与有效的基准值相比、测定值不是显著地低的值的情况下)，可以预测该患者可通过上述并用疗法根治的可能性高，因此有助于作出积极应用上述并用疗法的判断。除了有效的基准值以外，也可以预先确定并用疗法没有效果的已知的患者组的IL28B表达量的平均值(无效的基准值)，将其与测定值进一步进行对比。

实施例

下面基于实施例对本发明进行更具体的说明。不过，本发明不限定于下述实施例。

1．抗人IL28B单克隆抗体的制备

使用重组人IL28B(rIL28B)作为免疫原。由以人IL28B的序列信息(序列编号3)为基础将寡聚DNA组合而成的DNA片段通过PCR来进行除去了信号肽的成熟型IL28B的cDNA(编码序列编号4中的aa26～aa200的区域的区域)的基因人工合成，纯化后，整合到公知的表达载体中，导入大肠杆菌，用柱回收、纯化而得到表达的rIL28B。用其免疫小鼠(腹腔内给药、给药量约20μg/只、免疫次数3～4次)，通过作为常规方法的杂交瘤法制备产生针对免疫原的抗体的杂交瘤。

抗体筛选通过ELISA和蛋白质印迹(Western blotting(WB))来实施。作为筛选抗原，使用通过常规方法用杆状病毒－昆虫细胞表达系统制备的重组人IL28B和重组人IL28A(均为不含信号肽的成熟型、分别为序列编号4和序列编号2中的aa26～aa200的区域)。抗原固相ELISA的具体步骤如下所示。

将重组IL28B或重组IL28A用PBS配制成0.5μg/ml，将该溶液以50μl/孔加入96孔试验板，于37℃包被1小时。用PBST洗涤后，以50μl/孔加入杂交瘤培养上清，于37℃反应1小时。用PBST洗涤后，以50μl/孔加入POD标记抗小鼠IgG抗体，于37℃反应1小时。用PBST洗涤后，用ABTS底物体系进行显色，用酶标仪测定A405nm的吸光度。

筛选出与重组IL28B反应、与重组人IL28A不反应的抗体，结果得到了多株对IL28B有特异性的单克隆抗体。也得到了多株与IL28B和IL28A两者都结合的抗体。对于所得抗体，通过WB确认反应性。结果的一部分示于下表2。

[表2]

2．IL28 mAb IL28-308及IL28-402的交叉反应性试验

使用结合有重组IL28B、IL28A、IL29的试验板来考察抗体的交叉反应性。重组IL29购自R&D systems公司(#1598-IL-025)。

将重组IL28B、重组IL28A或重组IL29用PBS配制成0.5μg/ml，将该溶液以100μl/孔加入96孔试验板，于37℃包被1小时。用PBST洗涤后，以250μl/孔加入1％脱脂牛奶-PBS，于37℃封闭1小时。将抗体用1％BSA-PBS稀释至200ng/ml，以100μl/孔添加，于37℃反应1小时。用PBST洗涤后，以100μl/孔加入POD标记抗小鼠IgG抗体，于37℃反应1小时，用PBST洗涤后，用ABTS底物体系进行显色，用酶标仪测定A405nm的吸光度。

结果示于图2。IL28-308与IL28B反应，与IL28A和IL29不反应(IL28B特异性抗体)。IL28-402与IL28B和IL28A反应，与IL29不反应(IL28特异性抗体)。

3．IL28 mAb IL28-308和IL28-402的表位分析

制备IL28B和IL28A的重组缺失突变体(deletion mutant)及点突变体(point mutant)，针对如上所述得到的IL28-308和IL28-402通过WB来分析抗体表位。点突变体是以成熟型的IL28A和IL28B之间的不同的7个氨基酸作为靶点，将IL28B的1个残基置换为IL28A型、或者将IL28A的1个残基置换为IL28B型来制备的。WB的结果示于下表3。

[表3]

Figure 2012800066652100002DEST_PATH_IMAGE003

IL28-308与IL28B反应，与IL28A不反应。该抗体与IL28B的aa97-136的区域反应，与IL28A的aa97-136的区域不反应。IL28B的aa97-136的区域中与IL28A不同的氨基酸是第120位的甘氨酸这1个残基，该残基在IL28A中为缬氨酸。考察与该残基的点置换突变体的反应性，结果IL28-308与IL28B G120V不反应，与IL28A V120G反应。应予说明，与IL28B的第120位相对应的IL29的氨基酸是谷氨酰胺，第120位的甘氨酸是IL28B的特异性的氨基酸。

除了IL28B的第120位的甘氨酸以外，与IL28A不同的氨基酸有6处，为第32位、第74位、第76位、第96位、第137位、第160位。如果考察与在这些部位置换为IL28A型的IL28B的点突变体(IL28B R32A、K74R、R76H、V96M、L137F和H160Y)的反应性，则IL28-308与这些置换突变体反应。

由这些结果可知，IL28-308在IL28B的aa97-136的区域内具有表位，识别第120位的甘氨酸。

另一方面，可知IL28-402与IL28B和IL28A反应，是以与IL28-308不同的区域(aa97-136以外的区域)作为表位的抗体。

4．IL28 mAb IL28-308的详细表位分析

将IL28B的第114位～第125位之间的氨基酸残基置换为丙氨酸，制成IL28B的丙氨酸点突变体，通过WB进一步详细分析抗体表位。WB的结果示于下表4。

[表4]

IL28-308除了置换突变体G120V以外，与D114A和D124A也不反应。由此可知，在抗体IL28-308与IL28B的结合中，除了第120位的G以外，第114位的D和第124位的D也很重要。

5．IL28 mAb IL28-402的表位分析

制备IL28B的重组缺失突变体，通过WB来分析抗体表位。结果示于表5。

[表5]

Figure 2012800066652100002DEST_PATH_IMAGE005

IL28-402与aa60-200区域不反应，与aa26-60区域反应。由此可知，抗体IL28-402是在IL28B的aa26-60的区域具有表位的抗体。

6．基于夹心ELISA的IL28B的测定体系的确立

在能获取的抗体中，预先对能纯化的抗体进行生物素标记，研究与各种IL28 mAb的夹心组合。作为标记抗体，使用IL28-308(抗B)、IL28-314(抗B)、IL28-402(抗A/B)这3株。此外，作为固相抗体，除了这3株以外，还使用IL28-302(抗B)、307(抗B)、316(抗A/B)。其结果是，确认标记402与302、307、308、314、316，标记308和标记314与402形成夹心。

接着，通过使用固相IL28-402和标记IL28-308的夹心ELISA来进行rIL28B和rIL28A的测定。将IL28-402用0.1M柠檬酸缓冲液(pH3.5)配制成10μg/ml，将该溶液以100μl/孔加入96孔试验板，于37℃包被1小时。用1％BSA-PBS封闭，用PBST洗涤后，以100μl/孔加入将rIL28B或rIL28A梯度稀释的抗原溶液，于37℃反应1小时。用PBST洗涤后，以100μl/孔加入生物素化IL28-308，于37℃反应1小时。用PBST洗涤后，以100μl/孔加入抗生物素蛋白链菌素结合碱性磷酸酶，于37℃反应1小时。用PBST洗涤后，用p-NPP底物体系进行显色，用酶标仪测定A405nm的吸光度。

结果示于图3。使用固相IL28-402和标记IL28-308的夹心ELISA能浓度依赖性地测定IL28B，实质上未确认到与IL28A的交叉反应。确认能确立IL28B特异性测定方法。

序列表

<110> FUJIREBIO INC.

<120> 抗IL28B抗体及使用该抗体的IL28B的测定方法

<130> PF446-PCT

<160> 6

<170> PatentIn 版本 3.1

<210> 1

<211> 734

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (53)..(655)

<223>

<400> 1

tgggtgacag cctcagagtg tttcttctgc tgacaaagac cagagatcag ga atg aaa 58

Met Lys

1

cta gac atg act ggg gac tgc acg cca gtg ctg gtg ctg atg gcc gca 106

Leu Asp Met Thr Gly Asp Cys Thr Pro Val Leu Val Leu Met Ala Ala

5 10 15

gtg ctg acc gtg act gga gca gtt cct gtc gcc agg ctc cac ggg gct 154

Val Leu Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu His Gly Ala

20 25 30

ctc ccg gat gca agg ggc tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tct 202

Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser

35 40 45 50

cca cag gag ctg cag gcc ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag 250

Pro Gln Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu

55 60 65

tcg ctt ctg ctg aag gac tgc agg tgc cac tcc cgc ctc ttc ccc agg 298

Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg

70 75 80

acc tgg gac ctg agg cag ctg cag gtg agg gag cgc ccc atg gct ttg 346

Thr Trp Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu

85 90 95

gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac 394

Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp

100 105 110

act gac cca gcc ctg gtg gac gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg 442

Thr Asp Pro Ala Leu Val Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu

115 120 125 130

cac cat atc ctc tcc cag ttc cgg gcc tgt atc cag cct cag ccc acg 490

His His Ile Leu Ser Gln Phe Arg Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr

135 140 145

gca ggg ccc agg acc cgg ggc cgc ctc cac cat tgg ctg tac cgg ctc 538

Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu

150 155 160

cag gag gcc cca aaa aag gag tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tct gtc 586

Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val

165 170 175

acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc 634

Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala

180 185 190

agt ggg gac ctg tgt gtc tga ccctcccacc agtcatgcaa cctgagattt 685

Ser Gly Asp Leu Cys Val

195 200

tatttataaa ttagccactt gtcttaattt attgccaccc agtcgctat 734

<210> 2

<211> 200

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp Cys Thr Pro Val Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Ala Ala Val Leu Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu His

20 25 30

Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser

35 40 45

Leu Ser Pro Gln Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu

50 55 60

Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe

65 70 75 80

Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Met

85 90 95

Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr

100 105 110

Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His

115 120 125

Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Phe Arg Ala Cys Ile Gln Pro Gln

130 135 140

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145 150 155 160

Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala

165 170 175

Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys

180 185 190

Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val

195 200

<210> 3

<211> 603

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(603)

<223>

<400> 3

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Met Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp Cys Met Pro Val Leu Val Leu Met

1 5 10 15

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Ala Ala Val Leu Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu Arg

20 25 30

ggg gct ctc ccg gat gca agg ggc tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc 144

Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser

35 40 45

ctg tct cca cag gag ctg cag gcc ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta 192

Leu Ser Pro Gln Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu

50 55 60

gaa gag tcg ctt ctg ctg aag gac tgc aag tgc cgc tcc cgc ctc ttc 240

Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe

65 70 75 80

ccc agg acc tgg gac ctg agg cag ctg cag gtg agg gag cgc ccc gtg 288

Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val

85 90 95

gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc 336

Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr

100 105 110

gct gac act gac cca gcc ctg ggg gat gtc ttg gac cag ccc ctt cac 384

Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His

115 120 125

acc ctg cac cat atc ctc tcc cag ctc cgg gcc tgt atc cag cct cag 432

Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu Arg Ala Cys Ile Gln Pro Gln

130 135 140

ccc acg gca ggg ccc agg acc cgg ggc cgc ctc cac cat tgg ctg cac 480

Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His

145 150 155 160

cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag gag tcc cct ggc tgc ctc gag gcc 528

Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala

165 170 175

tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt 576

Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys

180 185 190

gtt gcc agc ggg gac ctg tgt gtc tga 603

Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val

195 200

<210> 4

<211> 200

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp Cys Met Pro Val Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Ala Ala Val Leu Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu Arg

20 25 30

Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser

35 40 45

Leu Ser Pro Gln Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu

50 55 60

Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe

65 70 75 80

Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val

85 90 95

Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr

100 105 110

Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His

115 120 125

Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu Arg Ala Cys Ile Gln Pro Gln

130 135 140

Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His

145 150 155 160

Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala

165 170 175

Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys

180 185 190

Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val

195 200

<210> 5

<211> 856

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (98)..(700)

<223>

<400> 5

aattaccttt tcactttaca cacatcatct tggattgccc attttgcgtg gctaaaaagc 60

agagccatgc cgctggggaa gcagttgcga tttagcc atg gct gca gct tgg acc 115

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1 5

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10 15 20

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Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg

25 30 35

ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg agc ttc aag aag gcc agg 259

Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg

40 45 50

gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc agc tct 307

Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser

55 60 65 70

cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg gag 355

Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gln Val Arg Glu

75 80 85

cgc cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc ctg 403

Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu

90 95 100

gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt 451

Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu

105 110 115

cac acc ctg cac cac atc ctc tcc cag ctc cag gcc tgt atc cag cct 499

His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu Gln Ala Cys Ile Gln Pro

120 125 130

cag ccc aca gca ggg ccc agg ccc cgg ggc cgc ctc cac cac tgg ctg 547

Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu

135 140 145 150

cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag 595

His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu

155 160 165

gca tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg cga gac ctc aaa 643

Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys

170 175 180

tat gtg gcc gat ggg aac ctg tgt ctg aga acg tca acc cac cct gag 691

Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu

185 190 195

tcc acc tga caccccacac cttatttatg cgctgagccc tactccttcc 740

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200

ttaatttatt tcctctcacc ctttatttat gaagctgcag ccctgactga gacatagggc 800

tgagtttatt gttttacttt tatacattat gcacaaataa acaacaagga attgga 856

<210> 6

<211> 200

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys

20 25 30

Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala

35 40 45

Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys

50 55 60

Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg

65 70 75 80

Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala

85 90 95

Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp

100 105 110

Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu

115 120 125

Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly

130 135 140

Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu

145 150 155 160

Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu

165 170 175

Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg

180 185 190

Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr

195 200

Claims

1.抗体或其抗原结合性片段，其与白介素28B通过抗原抗体反应结合，与白介素28A实质上不结合。

2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其与白介素29实质上不结合。

3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合性片段，其与白介素28B的第97位～第136位氨基酸的区域内的表位结合。

4.权利要求3所述的抗体或其抗原结合性片段，其识别白介素28B的第120位氨基酸。

5.权利要求4所述的抗体或其抗原结合性片段，其还识别白介素28B的第114位和第124位氨基酸。

6.权利要求4所述的抗体或其抗原结合性片段，其与将第120位氨基酸置换为甘氨酸的白介素28A突变体结合，与将第120位氨基酸置换为缬氨酸的白介素28B突变体不结合。

7.权利要求1～6中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体是单克隆抗体。

8.白介素28B的测定方法，其包括通过使用权利要求1～7中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段的免疫测定来测定试样中的白介素28B的步骤。

9.权利要求8所述的方法，其中，所述免疫测定通过使用固定化于固相的固相化抗体和经标记的标记抗体的夹心法来进行，固相化抗体和标记抗体中的至少任一方使用权利要求1～7中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段。

10.白介素28B的免疫测定试剂盒，其包含权利要求1～7中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段。

11.权利要求10所述的试剂盒，其中，以固定化于固相的固相化抗体和经标记的标记抗体中的至少任一种形态含有所述抗体或其抗原结合性片段。

12.预测聚乙二醇干扰素+利巴韦林并用疗法对HCV感染症的治疗效果的方法，该方法包括通过权利要求8或9所述的方法来测定从HCV感染患者中分离的试样中的白介素28B、考察所述患者中的白介素28B表达量的步骤，其中，白介素28B的低水平的表达表示所述并用疗法没有效果的可能性高。