JP2999444B2

JP2999444B2 - 骨吸収速度の測定方法

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Publication number: JP2999444B2
Application number: JP10011978A
Authority: JP
Inventors: アール．エア，デイヴィッド
Original assignee: ワシントンリサーチファンデーション
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1998-01-07
Publication date: 2000-01-17
Anticipated expiration: 2015-01-17
Also published as: GR3030646T3; ATE179521T1; JP2002139492A; DE69025199D1; JP2782017B2; JPH09113510A; US5677198A; EP0682257B1; US5473052A; DE69033082D1; JP2999416B2; DE69034170T2; DE69034170D1; JPH05502223A; EP0682257A1; JP2000055915A; IE904344A1; EP0682256B1; DK0682257T3; DK0682256T3

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体中でのコラー
ゲンの分解を検出し、観察する方法に関する。更に詳し
くは、コラーゲンの分解により、生体内で生産される架
橋したテロペプチドを定量する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】本出願
は、１９８７年１１月６日に出願された米国出願第１１
８，２３４号の一部継続出願である、１９８９年１１月
１日に出願された米国出願第４４４，８８１号の一部継
続出願である。今日まで３種類の公知のクラスのコラー
ゲンが報告されている。クラスＩのコラーゲンは、タイ
プＩ、II、III 、Ｖ及びＸＩに細分類され、原線維を形
成することが知られている。これらのコラーゲンは、核
コラーゲン分子とこれに付加している、Ｎ−末端及びＣ
−末端プロペプチドから成る、プロコラーゲン分子とし
て合成される。コラーゲン合成中に生体内で自然に起こ
るプロペプチド除去の後、コラーゲン分子の残りの核
は、大部分が、三重らせんではない末端テロペプチド配
列を有する、三重らせん構造から成る。これらのテロペ
プチド配列は、コラーゲン原線維の分子間架橋点とし
て、細胞外で重要な機能を有している。

【０００３】本発明は、生体内でのコラーゲン分解によ
り製造される特異的架橋テロペプチドの分析に基づくコ
ラーゲン分解を検出する方法に関する。過去において、
種々の生物化学的マーカーを測定することにより生体内
のコラーゲン分解を観察するための分析法が開発されて
おり、マーカーのいくつかはコラーゲンの分解生成物で
あった。たとえば、ページェット病と結合した骨回転
は、骨コラーゲンの分解に続いて尿中に排泄せれたヒド
ロキシプロリンを含有する小さいペプチドを測定するこ
とにより観察されている。ルッセル等（Ｒｕｓｓｅｌｌ
ｅｔａｌ），Ｍｅｔａｂ．ＢｏｎｅＤｉｓ．
ａｎｄＲｅｌ．Ｒｅｓ．４及び５、２５５−２６２
（１９８１）；及びシンガー等（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｆ．
Ｒ．，ｅｔａｌ．，）、代謝骨病（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ＢｏｎｅＤｉｓｅａｓｅ）、Ｖｏｌ．２．（ｅｄ
ｓ．Ａｖｉｏｌｉ，Ｌ．Ｖ．ａｎｄＫａｎｅ，Ｓ．
Ｍ．），４８９−５７５（１９７８）、アカデミックプ
レス、ニューヨーク。

【０００４】他の研究者達は、関節疾患におけるコラー
ゲン分解の指標としての尿中の架橋化合物ピリジノリン
を測定している。背景及び例として、ウー及びエア（Ｗ
ｕａｎｄＥｙｒｅ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２
３：１８５０（１９８４）；ブラック等（Ｂｌａｃｋ
ｅｔａｌ．）；ＡｎｎａｌｓｏｆｔｈｅＲｈｅ
ｕｍａｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｓ、４８：６４１−６４
４；ロビンス等（Ｒｏｂｉｎｓｅｔａｌ．）；Ａｎ
ｎａｌｓｏｆｔｈｅＲｈｅｕｍａｔｉｃＤｉｓ
ｅａｓｅｓ、４５：９６９−９７３；及びサイベル等
（Ｓｅｉｂｅｌｅｔａｌ．）、ＴｈｅＪｏｕｒｎａ
ｌｏｆＲｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、１６：９６４
（１９８９）参照。本発明とは対照的に、何人かの先行
研究者は、体液からのペプチドを加水分解し、次いで個
々のヒドロキシピリジニウム残基の存在を捜した。それ
らの研究者は何れも、本発明のように、コラーゲンの分
解により生体内で自然に生産される、架橋を含むテロペ
プチドの測定を報告してはいない。

【０００５】英国特許出願ＧＢ２，２０５，６４３号
は、体内のタイプIII コラーゲンの分解が、体液中のタ
イプIII コラーゲンからのＮ−末端テロペプチドの濃度
を測定することにより定量的に決定されることを報告し
ている。この引例においては、架橋テロペプチド領域は
望ましくないことが報告されている。実際、この引例
は、テロペプチドを得るためには、架橋していないコラ
ーゲン源を使用することが必要であると報告している。
本発明のペプチドはすべて架橋している。コラーゲンの
架橋は、「コラーゲン架橋」と標題された、以下の項目
で詳細に記載する。

【０００６】ある種のプロコラーゲンペプチドを定量す
ることにより、コラーゲンの分解が測定できると記載さ
れた数多くの報告がある。本発明は、プロペプチドより
もテロペプチドを含むものであり、これら二者は、コラ
ーゲン分子中のそれらの位置及び生体内でのそれらの開
裂の時期により区別される。米国特許第４，５０４，５
８７号、米国特許第４，３１２，８５３号、ピエラルド
等（Ｐｉｅｒａｒｄｅｔａｌ．）、Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４１：１２７−１３
６（１９８４）；ニエメラ（Ｎｉｅｍｅｒａ）、Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ．，３１／８：１３０１−１３０４（１
９８５）；及びローデ等（Ｒｏｈｄｅｅｔａｌ．）、Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃ
ａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９：４５１−４５９
（１９７９）参照。

【０００７】米国特許第４，７７８，７６８号は、滑液
試料中のプロテオグリカン単量体またはその抗原性フラ
グメントを定量することを含む、関節軟骨に生ずる変化
を定量する方法に関する。この特許は、分解したコラー
ゲンから誘導される架橋したテロペプチドを検出するも
のではない。ドッジ（Ｄｏｄｇｅ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．，８３：６４７−６６１（１９８１）
は、ヒト及びウシタイプIIコラーゲンの、巻いていない
アルファー鎖及びシアナゲンブロミド処理によるペプチ
ドと特異的に反応するポリクローナル抗血清を利用する
タイプIIコラーゲンの分解を分析する方法を開示してい
る。含有されているペプチドは、本発明のような架橋し
たテロペプチドではない。

【０００８】ヒトタイプIII コラーゲン、ヒトプロａｌ
（II）コラーゲン、及びヒトタイプIII コラーゲンの全
体のプレプロａｌ（III ）鎖及び相当するｃＤＮＡクロ
ーンのアミノ酸配列がいくつかのグループの研究者らに
より研究されており決定されている。ロイドル等（Ｌｏ
ｉｄｌｅｔａｌ．）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２：９３８３−９３９４（１９
８４）；サンジョルジュ等（Ｓａｎｇｉｏｒｇｉｅｔ
ａｌ．）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａ
ｒｃｈ１３：２２０７−２２２５（１９８５）；バー
ルドウィン等（Ｂａｌｄｗｉｎｅｔａｌ．）、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６２：５２１−５２８（１９８
９）；及びアラ−コッコ等（Ａｌａ−Ｋｏｋｋｏｅｔ
ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６０：５０９
−５１６（１９８９）参照。これらの引例は、何れも、
生体内で分解した原線維コラーゲンの量を定量すること
ができる特別なテロペプチドの分解生成物の構造を特定
してはいない。

【０００９】上記した背景技術の情報にも拘らず、生体
内のコラーゲン分解を定量するための効果的で簡単な分
析方法が必要とされている。そのような分析法は、変形
性関節症（タイプIIコラーゲン分解）のようなヒトの病
状、及び脈管炎症候群（タイプIII コラーゲン分解）の
ような炎症性の障害を検出し観察するのに使用すること
ができる。

【００１０】親出願の米国出願第１１８，２３４号に記
載されているタイプＩコラーゲン分解の分析は、生体内
の骨吸収を検出し評価するのに利用することができる。
骨吸収の検出は、骨粗しょう症のような病気を観察し検
出するのに重要な因子であるかもしれない。骨粗しょう
症は人類における最も一般的な骨の病気である。主要な
骨粗しょう症は、骨折が起こり易くなると共に、骨格骨
量の正味量の急激な損失を引き起こす。米国において
は、１５００〜２０００万人の人が罹っていると予想さ
れる。その原因は骨を作り直す際の年令に依存する不均
衡、即ち、合成速度と骨組織の分解における不均衡であ
る。約１２０万人の骨粗しょう症に関連する骨折が、毎
年、年長者に起こり、約５３８，０００の背骨の圧縮骨
折、約２２７，０００のでん部骨折及びかなりの数の耳
の末梢骨の骨折が含まれている。でん部骨折の１２〜２
０％は致命的である。何故なら、それは重大な外傷及び
出血を引き起こし、生き残った半数の患者はナーシング
ホームによる療養を必要とする。骨粗しょう症に関連す
る障害に要する総額は、現在、毎年、少なくとも７０億
ドルである（バーネス（Ｂａｒｎｅｓ，Ｏ．Ｍ．）、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２３６：９１４（１９８７））。

【００１１】骨粗しょう症は、平均して、閉経後の１０
年間で彼女らの骨の１５％を失う閉経後の女性に最も一
般的なものである。この病気は、また、年長の男性及び
若い無月経の女性競技者にも生ずる。骨粗しょう症の主
要で、かつ増加する、社会的及び経済的な重要性にも拘
わらず、患者及び正常人の骨吸収の速度を測定するのに
有用な方法はない。この病気を観察する際の主要な困難
は、骨吸収速度を測定する特別の分析法が欠如している
ことである。

【００１２】骨量を測定する方法は、しばしば、中性子
活性分析により身体全体のカルシウム量を、または得ら
れた骨の無機物質を光子吸収技術により測定することに
頼っている。これらの測定は、骨の量が減少するかどう
かの長期間の結果のみを与えることができる。カルシウ
ムのバランスを摂取及び放出を比較することにより測定
することは冗長で、信頼性が低く、骨無機物が長い期間
に失われているかどうかを間接的に評価するだけであ
る。減少した骨の量及び変化した骨の代謝を評価するの
に、現在、有用な他の方法としては、選択された骨の位
置（手首、踵骨、等）での定量的操作放射測定及び腸骨
稜生体組織検査の組織形態測定が挙げられる。前者は単
一骨中の特定点の骨無機物量のおおよその値を与える。
組織形態測定は、新たに付着した骨の縫合線と吸収表面
の間のバランスを半定量的評価として与える。

【００１３】分解した骨の全身からの排出について２４
時間の間の尿を分析することは、より有効であろう。無
機物の研究（例えば、カルシウムバランス）は、これを
信頼性高くまたは容易に行うことができない。骨吸収は
無機物及び有機マトリックスの分解を伴っているので、
体液中の新たに分解した骨の生成物のための特別の生物
化学的マーカーは、理想的な指標となるであろう。幾つ
かの可能な有機指標が試験されている。例えば、コラー
ゲンに対し非常に制限されたアミノ酸で、骨及び他の全
ての結合組織の主要組織タンパク質であるヒドロキシプ
ロリンが尿中に排泄される。その排泄速度は、ある条件
においては増加することが知られており、上記したよう
に、骨の回転が非常に増大する代謝骨疾患であるページ
ェット病で顕著である。この理由から、尿のヒドロキシ
プロリンは、コラーゲン分解のアミノ酸マーカーとして
広範囲に使用されている。上記に引用したシンガー等
（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｆ．Ｒ．ｅｔａｌ．）（１９７
８）。

【００１４】米国特許第３，６００，１３２号には、コ
ラーゲン代謝の変動を観察するために、血清、尿、腰椎
液及び他の細胞間液のような体液中のヒドロキシプロリ
ンの定量方法が開示されている。特に、この発明者は、
ページェット病、マーファン症候群、骨形成不全症、コ
ラーゲン組織及び矮小発育症における腫瘍性成長等の病
理学的条件下において、生物学的液体中のヒドロキシプ
ロリン量によって測定されるように、増加したコラーゲ
ンの同化作用または異化作用が定量できることを注記し
ている。この発明者は、ヒドロキシプロリンを、それを
過酸化水素及びＮ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミ
ドにより酸化してピロール化合物とし、次いで、ｐ−ジ
メチル−アミノ−ベンズアルデヒド中で比色定量するこ
とにより測定している。

【００１５】ページェット病の場合には、増加した尿の
ヒドロキシプロリンは、恐らく、大部分が骨の分解から
きているが、ヒドロキシプロリンは、しかしながら、一
般的には特異的な指標として使用することができない。
尿中の多くのヒドロキシプロリンは、新しいコラーゲン
合成（かなりの量の新たに作られたタンパク質は、分解
され、組織線維の中に導入されることなく排泄される）
から、及びヒドロキシプロリンを含有するある血液タン
パク質ならびに他のタンパク質の転換からくるのかもし
れない。更に、タンパク質の分解から派生する遊離のヒ
ドロキシプロリンの約８０％は、肝臓中で代謝され、尿
中には決して出現しない。キビリコ（Ｋｉｖｉｒｉｋ
ｏ，Ｋ．Ｉ．）、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｏｎｎｅｃ
ｔ．ＴｉｓｓｕｅＲｅｓ．５：９３（１９７０）
及びヴァイス及びクライン（Ｗｅｉｓｓ，Ｐ．Ｈ．ａｎ
ｄＫｌｅｉｎ，Ｌ．）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．４８：１（１９６９）。

【００１６】共にコラーゲンタンパク質に固有である、
ヒドロキシリジン及びそのグリコシド誘導体は、コラー
ゲン分解のマーカーとして、ヒドロキシプロリンよりも
より正確であると考えられている。しかしながら、ヒド
ロキシプロリンについて上記したのと同じ理由で、ヒド
ロキシリジン及びそのグリコシド誘導体は、おそらく骨
吸収のマーカーとしては同様に非特異的であろう。クレ
ーン及びシモン（Ｋｒａｎｅ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄＳｉ
ｍｏｎ，Ｌ．Ｓ．）、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２２：１８５（１９８１）。

【００１７】コラーゲンに独特のアミノ酸に加えて、オ
ステオカルシン、またはそれらの分解生成物のような種
々の骨マトリックスの非コラーゲンタンパク質は、骨代
謝を測定することを目的とした免疫分析の基礎を形成し
ている。プライス等（Ｐｒｉｃｅ，Ｐ．Ａ．ｅｔａ
ｌ．）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６６：８
７８（１９８０）及びガンバーグ等（Ｇｕｎｂｅｒｇ，
Ｃ．Ｍ．ｅｔａｌ．）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，１０７：５１６（１９８４）。しかしながら、骨
から派生した非コラーゲンタンパク質は、可能性として
は骨代謝活性の有用なインデックスではあるけれども、
それら自身、骨吸収の定量的な尺度を提供しそうにはな
いと言うことが明らかである。オステオカルシンの血清
中濃度は、例えば、正常と代謝骨病の両者で非常に広く
変動する。その濃度は、骨格の骨の高回転の状態で上昇
するが、しかし、これが増加した骨の合成または骨の分
解から引き起こされているかどうか明らかではない。ク
レーン等（Ｋｒａｎｅ，Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．）、Ｄ
ｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：１８５（１
９８１）、プライス等（Ｐｒｉｃｅ，Ｐ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６６：
８７８（１９８０）；及びガンバーグ等（Ｇｕｎｂｅｒ
ｇ，Ｃ．Ｍ．ｅｔａｌ．）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．，１０７：５１６（１９８４）。

【００１８】（コラーゲン架橋）脊椎動物コラーゲンの最も遺伝学的なタイプの重合体
は、通常の機能のためにアルデヒドを介在させた架橋の
形成が必要である。コラーゲンアルデヒドはリジルオキ
シダーゼの作用により、幾つかの特異的なリジンまたは
ヒドロキシリジン側鎖から誘導される。種々の二、三及
び四官能性架橋アミノ酸は、新たに形成されたコラーゲ
ン重合体の内部でそれらのアルデヒドの自発的な分子間
及び分子内反応により形成される。架橋残基の種類は組
織タイプにより特異的に変わる（エア等（Ｅｙｒｅ，
Ｄ．Ｒ．ｅｔａｌ．）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，５３：７１７−７４８（１９８４））。

【００１９】架橋の二つの基本的な経路が、縞模様の
（６７ｎｍ繰り返し）原線維コラーゲンについて分類す
ることができ、一つはリジンアルデヒドに基づくもので
あり、他はヒドロキシリジンアルデヒドに基づくもので
ある。リジンアルデヒド経路は成人の皮膚、角膜、強
膜、及びラットの尾腱で優勢であり、そしてまた他の柔
らかい結合組織にしばしば生ずる。ヒドロキシリジン経
路は骨、軟骨、靱帯、殆どの腱及び体の殆どの内部結合
組織で優勢である、エア等（Ｅｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ
ａｌ．）、（１９７４）上記参照。操作経路は、リジン
残基が、アルデヒド残基がリジルオキシダーゼにより後
に形成される、テロペプチド部位でヒドロキシル化され
るかどうかにより支配される（バーネス等（Ｂａｒｎｅ
ｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．，１３９：４６１（１９７４））。

【００２０】リジンアルデヒド経路上の成熟した架橋ア
ミノ酸の化学構造は知られていないが、ヒドロキシピリ
ジニウム残基はヒドロキシリジン経路で完成した生成物
として同定されている。両者の経路において、及び殆ど
の組織において、中間体であるボロヒドリドで還元しう
る架橋残基は、新たに形成されたコラーゲン成熟物とな
って消失し、それらが比較的短いライフの中間体である
ことを示唆している（ベイレイ等（Ｂａｉｌｅｙ，Ａ．
Ｊ．ｅｔａｌ．）、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１６：
８６（１９７１））。例外は骨と象牙質であり、そこで
は還元性残基が生存中かなりの濃度で存続しており、一
部では明らかに、新たに作られたコラーゲン線維の急速
な無機化がそれ以上の自発架橋相互作用を阻害するから
である（エア（Ｅｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．）、Ｉｎ：Ｔｈｅ
ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙｏｆ
ＭｉｎｅｒａｌｉｚｅｄＣｏｎｎｅｃｔｉｖｅＴｉ
ｓｓｕｅｓ，（Ｖｅｉｓ，Ａ．ｅｄ．）５１−５５頁
（１９８１）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ、
及びウォルターズ等（Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｃ．ｅｔａ
ｌ．）、Ｃａｌｃ．Ｔｉｓｓ．Ｉｎｔｌ．，３５：
４０１−４０５（１９８３））。

【００２１】３−ヒドロキシピリジニウム架橋の二つの
化学式が同定されている（式１及び２）。

【００２２】

【化４】

【００２３】

【化５】

【００２４】両者の化合物は本来蛍光性であり、同一の
励起及び発光スペクトル特性を有する（フジモト等（Ｆ
ｕｊｉｍｏｔｏ，Ｄ．ｅｔａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７
６：１１２４（１９７７）及びエア（Ｅｙｒｅ，Ｄ．
Ｒ．）、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：
５０（１９８１））。それらのアミノ酸は、逆相ＨＰＬ
Ｃ及び蛍光検定を用いることにより、良好な感度で組織
の加水分解物から直接に分離し、分析することができ
る。エア等（Ｅｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．）、Ａｎａｌｙｔｅ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７：３８０−３８８（１９８
４）。本発明はアミノ酸よりも特殊なペプチドを定量す
ることを含むものであることに注目すべきである。成長
する動物において、それらの成熟した架橋体が、無機化
されたコラーゲンにおいてよりも骨コラーゲンの無機化
されていない留分中により集中しているであろうことが
報告されている（バーンズ等（Ｂａｎｅｓ，Ａ．Ｊ．，
ｅｔａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１３：１９７５（１９
８３））。しかしながら、若いウシまたは成人のヒトの
骨についての他の研究はこの概念を支持していない、エ
ア（Ｅｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．）、Ｉｎ：ＴｈｅＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙｏｆＭｉｎｅｒ
ａｌｉｚｅｄＴｉｓｓｕｅｓ，（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｗ．
Ｔ．ｅｄ．）１０５頁（１９８５），ＥｂｓｃｏＭ
ｅｄｉａＩｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂ
ａｍａ。

【００２５】ヒト尿中のコラーゲンヒドロキシピリジニ
ウム架橋体の存在は、長いペプチドの単離工程及び従来
のアミノ酸分析を用いて、グンジャ−スミス及びボウセ
ック（Ｇｕｎｊａ−Ｓｍｉｔｈ，Ｚ．ａｎｄＢｏｕｃ
ｅｋ，Ｒ．Ｊ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．，１９７：７５
９−７６２（１９８１））により報告されている。その
際彼らは架橋体のＨＰ形態のみに気づいている。ロビン
ス（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｓ．Ｐ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．，
２０７：６１７−６２０（１９８２））は、ウシ血清ア
ルブミンに接合した遊離アミノ酸に対する活性化したポ
リクローナル抗体を有する、尿中のＨＰを測定するため
の酵素結合免疫分析について報告している。この分析法
は、関節炎と共に生ずる増大した関節破壊を観察するた
めの指標を提供することを意図しており、ロビンスによ
れば、ピリジノリンが骨コラーゲンにおけるよりも、軟
骨におけるほうが遥かに多く行き渡っていることを見出
したことに基づいている。より最近の酸素結合免疫分析
を含む研究において、ロビンスは、リジルピリジノリン
がウシ血清アルブミンに共有結合しているピリジノリン
に対する抗血清に対して反応しないことを報告している
（ロビンス等（Ｒｏｂｉｎｓｅｔａｌ．，Ａｎｎ．
Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４５：９６９−９
７３（１９８６））。ロビンスの軟骨破壊の尿指標は、
軟骨から主に派生するヒドロキシリジルピリジノリン
が、関節軟骨吸収（即ち、分解）の速度に比例する濃度
で、尿中に見出されたという発見に基づいている。原理
的には、この指標は、全身の軟骨損失を測定するために
使用することができる。しかしながら、骨吸収について
の情報は、全く得られない。それ故、ヒトの全身の骨吸
収速度を測定することのできる方法が求められている。
そのような方法で最も有用なものは、体液、特に尿に適
用できるものである。方法は感度が良くなければなら
ず、即ち、１ピコモル以下まで定量でき、且つ、種々の
治療（例えば、エストロゲン）の効果が評価できるよう
に、２４時間の骨吸収速度を迅速に測定できなければな
らない。

【００２６】

【課題を解決するための手段】本発明は、患者及び健常
人の体液中の特異的に架橋したテロペプチドの存在を発
見したことに基づいている。これらのテロペプチドは、
生体内で、コラーゲンの分解及びリモデリング（再造
形）の間に製造される。「テロペプチド」の語は、ここ
では広い意味に使用され、例えば、コラーゲンのテロペ
プチド領域と結合する連鎖を有し、コラーゲンの三重ら
せん構造と結合する残基またはペプチドと架橋してもよ
い、架橋ペプチドを意味する。一般に、ここに開示され
ているテロペプチドは、コラーゲンのテロペプチド全体
構造よりもより少ないアミノ酸残基を有するであろう。
典型的には、本発明のテロペプチドは、ピリジニウム架
橋により結合している二つのペプチドから成り、また、
ピリジニウム架橋によりコラーゲン三重らせん構造の残
基またはペプチドに更に結合している。ここに開示され
たこれらのテロペプチドの構造により、当業者には、そ
れらが生体内以外の、例えば、合成的に製造できるであ
ろうということが理解されよう。それらのペプチドは、
一般に、精製された形態で、例えば、実質的に不純物、
特に他のペプチドを含まない形態で供給される。

【００２７】本発明は、３−ヒドロキシピリジニウム架
橋を有し、コラーゲン分解により誘導される特殊なポリ
ペプチドの液体中の濃度を定量するものである。本発明
に開示されている方法は、１９８７年１１月６日に出願
された米国特許出願第１１８，２３４号に開示されてい
る生体内での骨の絶対吸収速度を定量するためのものと
類似のものである。それらの方法は、骨コラーゲン吸収
から誘導される３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有す
るテロペプチドの体液中での濃度を定量するものを含む
ものである。代表的な分析法において、患者の体液はコ
ラーゲンから誘導される３−ヒドロキシピリジニウム架
橋を有するテロペプチドに特異的な免疫学的結合パート
ナーと接触される。体液はそのまま使用してもよく、或
いは接触工程の前に精製してもよい。この精製工程はカ
ートリッジ吸着及び溶出、分子篩クロマトグラフィー、
透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィー及びこれらの組合
わせを含む一般的工程の幾つかを使用することにより達
成してもよい。

【００２８】体液中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋
を有するペプチド断片の濃度を定量する他の代表的の態
様は、電気化学的滴定、自然蛍光分光、及び紫外吸収を
含むものである。電気化学的滴定は、更に精製すること
なく体液を直接測定することができる。しかしながら、
これが、過剰量の汚染物質の存在のために不可能である
ならば、体液は電気化学的滴定の前に、先ず精製され
る。電気化学的滴定の前の適当な精製方法としては、透
析、イオン交換クロマトグラフィー、アルミナクロマト
グラフィー、分子篩クロマトグラフィー、ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィー及びイオン交換吸着及び溶
出が挙げられる。

【００２９】３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含有す
る体液の蛍光分析測定は、コラーゲン分解（そして、そ
れ故、もし、タイプＩのペプチドが定量されるのであれ
ば、骨吸収）を定量するもう一つの方法である。蛍光測
定分析は、更に精製することなく体液を直接測定するこ
とができる。しかしながら、ある種の体液、特に尿につ
いては、蛍光測定分析に先立って体液の精製を行うこと
が好ましい。この精製工程は、水溶液に対して尿のよう
な体液の一定量を透析することから成り、それにより非
透析物（保持物）中に保持されている部分的に精製され
たペプチド断片を生成する。この非透析物は次いで凍結
乾燥され、イオン結合対溶液中に溶解され、そしてアフ
ィニティークロマトグラフィーカラムで吸着される。ク
ロマトグラフィーカラムはイオン結合対溶液の一定量で
洗浄し、その後、ペプチド断片は溶出液により溶出され
る。これらの精製したペプチド断片は次いで加水分解さ
れ、加水分解物はクロマトグラフィーにより分離され
る。クロマトグラフィーによる分離は、高速液体クロマ
トグラフィーまたはマイクロボア高速液体クロマトグラ
フィーの何れかにより行われる。

【００３０】本発明は、体液から得てもよい、他のヒト
ペプチドを実質的に含まない、コラーゲン分解物から誘
導されるポリペプチドと同一の構造を有するペプチドを
含むものである。このペプチドは、少なくとも一つの３
−ヒドロキシピリジニウム架橋、特に、リジルピリジノ
リン架橋またはヒドロキシリジルピリジノリン架橋を含
み、典型的には内因性プロテアーゼ及び／またはペプチ
ダーゼの作用により、三重らせん構造からの一もしくは
それ以上の残基と結合するコラーゲンのテロペプチド領
域から誘導されるものである。タイプＩテロペプチドに
ついての情報も、米国特許出願第１１８，２３４号に最
初に記載されている。

【００３１】他の本発明の態様は、ピリジニウム環が完
全なもの及び開裂しているものの、ここに記載したペプ
チドの分析を含むものである。ピリジニウム環の幾つか
の開裂が生体内で起こることが推測されるので、完全な
及び開裂したピリジニウム環の両者を検出する分析法
が、コラーゲン分解のより正確な評価に導いてくれるか
もしれない。本発明のこの態様に関連して、完全なまた
は開裂したピリジニウム環を含む個々のペプチドに対す
る特異的結合パートナーが分析に使用される。ペプチド
の両方のタイプ（完全なまたは開裂したピリジニウム環
を含有するペプチド）を認識する個々の特異的結合パー
トナーが使用される。一方、完全なピリジニウム環を含
むペプチド及びピリジニウム環が開裂しているペプチド
の相違を識別する特異的結合パートナーをもまた使用す
ることができる。

【００３２】（タイプＩコラーゲンから誘導される架橋テロペプチド
の構造）骨タイプＩコラーゲンのＮ−末端（アミノ末端）テロペ
プチド構造から誘導される３−ヒドロキシピリジニウム
架橋を有する特異的テロペプチドは、以下のアミノ酸配
列を有する：

【００３３】

【化６】

【００３４】式中、K-K-K はヒドロキシリジルピリジノ
リンまたはリジルピリジノリンであり、そしてGln はグ
ルタミンまたはピロリドンカルボン酸である。

【００３５】本発明は、ここに記載したペプチドに対す
る全ての特異的結合パートナーをも一般に含むものであ
る。「特異的結合パートナー」は、本発明のペプチドに
結合することが可能な分子である。この言葉に含有され
るものは、抗体（モノクローナル及びポリクローナ
ル）、抗体の抗原−結合断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ
（ａｂ’）２断片）、単鎖抗原−結合分子、等の免疫学
的結合パートナーであり、ハイブリドーマまたはｒＤＮ
Ａテクノロジーの何れかによりつくられるものである。

【００３６】本発明は、３−ヒドロキシピリジニウム架
橋（完全なピリジニウム環及び開裂したものの両者）を
有する上記したコラーゲンペプチドに特異的なモノクロ
ーナル抗体を産生する、融合した細胞ハイブリッド（ハ
イブリドーマ）を含む。本発明は、更に、融合した細胞
ハイブリッドにより産生されたモノクローナル抗体、及
び検出可能なマーカーと結合したそれら抗体（並びにそ
れらの結合断片、例えば、Ｆａｂ）を含むものである。
検出可能なマーカーの例としては、酵素、発色団、蛍光
団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）、補酵素、酵素阻害
剤、化学発光物質、常磁性金属、スピンラベル、及び放
射性同位体が挙げられる。そのような特異的結合パート
ナーは、一方、配位子−結合パートナー複合体（例え
ば、アビジン−ビチオン）の一つの部材と結合してもよ
く、その場合、検出可能なマーカーは、複合体の捕捉的
部材と結合することにより供給することができる。

【００３７】本発明はまた体液中のコラーゲン分解によ
り誘導される３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有する
ペプチドの量を定量するのに有用な試験キットをも含む
ものである。このキットは、ここに開示した、分解した
コラーゲンから誘導されるペプチドに対する特異的結合
パートナーを含む。試験キットの特異的結合パートナー
は、上記したように、検出可能なマーカーまたは配位子
−結合パートナー複合体の部材と結合してもよい。

【００３８】

【発明の実施の形態】

（タイプIIコラーゲンテロペプチド：参考）タイプIIコラーゲンペプチドの核ペプチド構造は、ＨＰ
残基により結合した３つのペプチド配列の１若しくはそ
れ以上の末端の付加的なアミノ酸またはアミノ酸配列を
有する、より大きいペプチド成分として、体液中に見出
されるであろう。図１は、三重−らせん配列に結合する
タイプIIコラーゲンテロペプチドが如何にして、生体内
において、タンパク質分解酵素のペプシン及びトリプシ
ンを用いてヒトの資源から産生されるかを示す。核ペプ
チド構造、特にらせん構造からアミノ酸を失ったより小
さい断片もまた体液中に生ずる。一般に、核ペプチド構
造からのアミノ酸の付加または削除には、１から約３の
アミノ酸が含まれるであろう。付加的なアミノ酸は一般
に、生体内で自然に生ずるタイプIIコラーゲンテロペプ
チド配列によって定量されるであろう。例として、以下
の構造を有するペプチドは、

【００３９】

【化７】

【００４０】尿からクロマトグラフにより単離でき、他
の構造：

【００４１】

【化８】

【００４２】もまた、単離されるであろう。更に、核構
造のグリコシル化した変異体及びそのより大きい及びよ
り小さい変異体が生じるであろうし、そこではガラクト
ース残基またはグルコシルガラクトース残基がＨＰ架橋
残基の側鎖水酸基に付加している。図５及び図６に示し
たグラフのそれぞれのピークは、本発明の目的のために
定量されるであろう特異的構造の架橋断片に相当する。

【００４３】これらの構造は、ふたつのａ１（II）Ｃ−
テロペプチド及び三重−らせん構造の残基８７の間に形
成される分子架橋部位におけるヒトタイプIIコラーゲン
原線維中のそれらの起源の部位に一致しており、それに
ついての公知の配列は次のとおりである：

【００４４】

【化９】

【００４５】単離されたペプチド断片は、体内のタイプ
IIコラーゲン原線維のタンパク分解生成物を示す。ＨＰ
残基を含有する核構造は、更なるタンパク分解に対し抵
抗性があり、タイプIIコラーゲン分解の量の定量的測定
を提供する。コラーゲンタイプIIは、成人骨格中の関節
の硝子質軟骨中に存在する。例えば、ペプチド構造中の
エピトープを認識するモノクローナル抗体による、体液
中のコラーゲンタイプIIテロペプチドの定量は、全身の
軟骨分解またはリモデリング（再造形）の定量的測定を
提供する。好ましい態様において、本発明は、この種の
テロペプチドの少なくとも一つのものの尿中への排泄速
度を定量することにより、ヒトにおける軟骨組織の分解
の分析法を含む。そのような分析法は、例えば、（１）骨関節炎の早期診断指示薬として、異常に高い軟
骨分解速度を有する個体を成人ヒト患者から篩い分け
る；（２）骨関節炎及びリウマチ関節炎の患者における軟骨
代謝に有効な抗関節炎の薬剤の効果を監視する；または（３）骨関節炎及びリウマチ関節炎を伴う患者の変性関
節病の進行及びそれらの種々の治療処方に対する応答を
監視するために使用される。

【００４６】骨関節炎は、関節の接合された軟骨の変性
病である。その初期の段階では、それは非常に非炎症性
である（即ち、リウマチ関節炎とは明確に区別され
る）。それは単一の病気ではなく、種々の因子（例え
ば、遺伝的素因、機械的使い過ぎ、関節先天異常または
先行障害等）から引き起こされる関節欠陥の後期を表し
ている。関節の軟骨の分解は、骨関節炎の中心的進行性
特徴である。放射線写真検査に基づく骨関節炎の出現率
は、１８〜２４歳の年齢群の４％から７５〜７９歳の年
齢群の８５％までである。現在、この病気は、痛みと軟
骨の進行した浸食の放射線写真または他の画像による兆
候によってのみ診断可能である。上記した分析法は、温
和な兆候の患者における進行した軟骨分解の早期の証拠
を検出し、より進行した患者の病気の進行を監視し、そ
して医薬または他の治療の効果を監視する手段として使
用できる。

【００４７】正常な若い成人（成熟した骨格の）におい
ては、軟骨のコラーゲンの分解は恐らく非常にわずかで
ある。尿中（並びに血液及び関節液体中の）の軟骨コラ
ーゲンの断片を測定することが可能な試験は、全身の及
び個々の関節の軟骨の「健康度」を判断するのに非常に
有用である。上記したタイプIIコラーゲン−特異的ペプ
チド分析法はこれを達成できるであろう。長期的には、
そのような分析は、関節が磨り減った個々人を見分ける
ための型にはまった診断篩い分けになり得よう。それら
は骨関節炎のより良い治療薬を熱心に探究している全て
の主要な医薬会社によって、現在、評価されている、所
謂、軟骨防御医薬の次の世代のものによる、予防治療に
おける早期の目標となり得よう。関節の軟骨が破壊され
る他の病気には：リウマチ関節炎、幼年性リウマチ関節
炎、強直脊椎炎、乾せん関節炎、ライター症候群、再発
性多発性軟骨炎、低背痛症候群、及び他の感染性の関節
炎が含まれる。ここに述べたタイプIIコラーゲン−特異
的分析法は、骨関節炎に関連して上記したように、それ
らの病気の診断と監視及び治療に対するそれらの応答を
評価するために使用することができる。

【００４８】（タイプIII コラーゲンテロペプチド：参考）先に指摘したように、体液中に存在するであろうヒトタ
イプIII コラーゲンテロペプチドは、以下の親構造式中
に具体的に示したような核構造を有すると予測される。

【００４９】

【化１０】

【００５０】式中、Hyl-Hyl-Hyl はヒドロキシリジルピ
リジノリンである。

【００５１】タイプIIペプチドとの類似性により、タイ
プIII コラーゲンペプチドは、核構造のグリコシル化さ
れた形態で生ずるであろう。例えば、ガラクトース残基
またはグリコシルガラクトース残基は、例えば水酸基を
介して、核構造に付加され得る。タイプIII コラーゲ
ンペプチドの架橋残基は、３−ヒドロキシピリジニウム
残基として示される、ヒドロキシリジルピリジノリンで
ある。タイプIIテロペプチド構造は、第一にヒドロキシ
リジルピリジノリン架橋残基を有することが見出されて
いる。しかしながら、タイプIIコラーゲンペプチドは、
タイプIIコラーゲンのＮ−末端テロペプチド領域から誘
導されるが、タイプIII コラーゲンペプチドは、少なく
とも一つの架橋残基が存在する限り、タイプIII コラー
ゲンのＮ−末端またはＣ−末端の何れかから誘導され
る。

【００５２】タイプIII コラーゲンは、タイプＩコラー
ゲンと連携して、多くの結合組織に存在する。それは特
に血管壁中、皮膚中及び、例えば、リウマチ関節炎のよ
うな炎症性関節病において、その加速された回転が観察
されるであろう関節の滑液膜中に集中している。上記し
たように、架橋したタイプIII コラーゲンペプチドを定
量することによるタイプIII コラーゲン分解の特異的分
析は、種々の炎症性疾患を、恐らくは脈管炎症候群への
特殊な応用を含めて、検出し、診断し、そして監視する
ために使用することができる。骨タイプＩ及び軟骨タイ
プIIコラーゲンの分解速度を測定するための分析法に関
連して、そのような分析法は、結合組織の破壊または病
理学的過程において引き起こされる種々の退行性及び炎
症性疾患を伴う患者用の識別診断手段として使用でき
る。

【００５３】（タイプII及びタイプIII コラーゲンテロペプチドの単
離：参考）一般的工程：骨格成長の急速期にある正常青年から尿を集める。疎水
性の相互作用キャリアー及びイオン交換キャリアーの選
択的なカートリッジへの吸着並びに分子篩、イオン交換
及び逆相ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィー工程を含む
が、これらには限定されないクロマトグラフィー工程の
列を用いて、個々のペプチドを単離する。ＨＰ（及びＬ
Ｐ）残基を含有する架橋ペプチドをカラムクロマトグラ
フィーの間にそれらの自然蛍光（Ｅｘｍａｘ２９７
ｎｍ〈ｐＨ４，Ｅｘｍａｘ３３０ｎｍ，〉ｐＨ６；
Ｅｍｍａｘ３９０ｎｍ）により検出する。具体的な
単離工程は以下の実施例において提供される。

【００５４】具体例：水で５倍に希釈し、トリフルオロ酢酸を２％（ｖ／ｖ）
に調整した新鮮な尿（４℃）を、Ｃ−１８疎水性カート
リッジ（８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで予め湿し、
次いで水で洗浄したウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）製Ｃ
−１８セプ−パック（Ｓｅｐ−ｐａｋ））に通した。保
持されたペプチドを水で洗浄し、次いで３ｍｌの２０％
（ｖ／ｖ）アセトニトリルで溶出し、この溶出液を等容
積の０．１ＭＮＨ_４ＨＣＯ_３を加えることによ
り、０．０５ＭＮＨ_４ＨＣＯ_３、１０％（ｖ／ｖ）
アセトニトリルに調整した。この溶液を、１０ｍｌの
０．１ＭＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル
次いで１０ｍｌの水で洗浄したＱＭＡ−セプ−パック
（ウォーターズ）を通し、そしてペプチドを次いで３ｍ
ｌの１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で溶出し、スピー
ド−バック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）（サヴァント（Ｓａ
ｖａｎｔ）製）で乾燥した。

【００５５】ペプチドは、三つのクロマトグラフィーの
工程で分別した。第一の工程は、１０％（ｖ／ｖ）酢酸
で溶出したバイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ−１０
（バイオ・ラド・ラボ（ＢｉｏＲａｄＬａｂｓ）、
２．５ｃｍ×９０ｃｍ）のカラムでの分子篩クロマトグ
ラフィーであり、図２に示したように溶出液のＨＰ蛍光
を監視した。図２において、Ｙ軸は３９０ｎｍ（２９７
ｎｍ励起）での相対的蛍光発光であり、Ｘ軸は留分番号
である。留分の量は４ｍｌである。IIとして示した留分
は、架橋コラーゲンタイプIIテロペプチドに富んでい
る。架橋コラーゲンタイプＩテロペプチドは、III 及び
IVで示した留分中に含有されている。IIを溜めている全
ての留分（タイプIIコラーゲン架橋ペプチドに富んでい
る）を合わせ、凍結乾燥し、０．０２Ｍトリス／ＨＣ
１、１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、ｐＨ７．５で均
衡にし、図２に示したものと同一の緩衝液を用いて０〜
０．５Ｍ勾配のＮａＣｌで溶出するＤＥＡＥ−ＨＰＬＣ
カラム（ＴＳＫ−ＤＥＡＥ−５ＰＷ、７．５ｍｍ×７．
５ｍｍ、バイオ・ラド・ラボ）でのイオン交換クロマト
グラフィーにより分別した。

【００５６】図３は、３９０ｎｍ（３３０ｎｍ励起）で
の蛍光発光に対する溶出時間を描いたものである。架橋
コラーゲンタイプIIテロペプチドは、主にIVとして示し
た部分の中に見出される。図４は、分での溶出時間の関
数としての２２０ｎｍにおける吸光度を描いたものであ
る。IVの溜分はタイプIIコラーゲン架橋ペプチドを含有
する。個々のペプチドは、次いで、IVの溜分から逆相Ｈ
ＰＬＣによりＣ−１８カラム（アクアポア（Ａｑｕａｐ
ｏｒｅ）ＲＰ−３００、２５ｃｍ×４．６ｍｍ、ブラウ
ンリー・ラボ（Ｂｒｏｗｎ−ｌｅｅＬａｂｓ）製）
で、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸中、０〜３０
％（ｖ／ｖ）勾配のアセトニトリルで溶出することによ
り、分別した。図５は、溶出時間の関数としての３９０
ｎｍ（２９７ｎｍ励起）での相対蛍光強度を描いたもの
である。特異的ペプチドと連携したピークは図５に示さ
れている。図６は、時間の関数としての２２０ｎｍでの
相対吸光度を示す。ＨＰ架橋残基を含有するタイプIII
コラーゲンの架橋ペプチド断片は、健常人の尿から、ま
たは、血管系の炎症性疾患を伴う患者の尿から、同様に
組み合わせた工程により単離される。

【００５７】（タイプＩコラーゲンテロペプチド）本発明のこの側面は、吸収された骨コラーゲンから誘導
されるリジルピリジノリン（ＬＰ）及びヒドロキシリジ
ルピリジノリン（ＨＰ）ペプチド断片（即ち、ここで使
用されるテロペプチド）が、代謝されずに尿中に排泄さ
れるという発見に基づいている。本発明は、また、他の
如何なる結合組織もかなりの水準のＬＰを含んではおら
ず、成熟した骨コラーゲン中のＨＰとＬＰの割合が、ヒ
トの一生において比較的一定に維持されるという発見に
も基づいている。

【００５８】図７は、年齢によるヒトの骨の皮質及び海
綿体の骨中のＨＰ及びＬＰの濃度を比較している。骨コ
ラーゲン中のＨＰ及びＬＰ架橋の濃度は１０〜１５歳で
最大に達し、そして成人の一生をとおしてかなり一定に
維持される。さらに、ＨＰとＬＰの比は、図８に示した
ように、一生を通じて殆ど変化せず、約３．５：１で一
定に維持されることを示している。これらの基本データ
は、骨コラーゲン中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋
が比較的一定に維持され、そしてそれ故、骨コラーゲン
の分解により派生する体液が、骨吸収の絶対速度に比例
する濃度で３−ヒドロキシピリジニウム架橋ペプチド断
片を含有するであろうことを示している。ＬＰは、
骨コラーゲンに独特の３−ヒドロキシピリジニウム架橋
体であるので、骨吸収の絶対速度を定量する方法は、そ
の最も簡単な形態において、体液中の３−ヒドロキシピ
リジニウム架橋そして好ましくはリジルピリジノリン
（ＬＰ）架橋を含有するペプチド断片の濃度を定量する
ことに基づいている。

【００５９】この発明においてタイプＩテロペプチドに
使用されている、「定量する」によって意味されるもの
は、分光測光、重量測定、容量測定、比色測定、免疫測
定、電位差測定、または電流測定方法等を含むがそれら
には限定されない如何なる適当な方法により、一定量の
体液中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含有するペ
プチド断片の濃度を測定することである。適当な体液
は、尿、血清及び滑液である。好ましい体液は尿であ
る。尿のペプチドの濃度は、尿の容量が増加するのに伴
い減少するので、尿が選択された体液である場合には、
例えば、２４時間という固定された時間の期間内に採取
された尿を合わせた全量から一定量を分析することが好
ましい。この場合、骨吸収または骨分解の絶対速度は、
２４時間の期間で計算される。一方、尿のペプチドは、
クレアチニンのような尿中に見出されるマーカー物質に
対する相対的な割合として測定することができる。この
場合、コラーゲン分解及び骨吸収の尿指標は、尿の容積
とは独立のものなる。

【００６０】本発明の一つの実施態様として、尿のよう
な体液中に見出されるリジルピリジノリン架橋を含有す
るペプチド断片に対し特異的なモノクローナルまたはポ
リクローナル抗体が産生される。タイプＩテロペプチド
断片は如何なる患者の体液からも単離されるであろう
が、しかしながら、これらのペプチドは、ページェット
病の患者からまたは急速に成長している青年から単離さ
れることが、彼らのタイプＩペプチド断片が高濃度であ
ることから好ましい。タイプII及びタイプIII テロペプ
チドは如何なる患者の体液からも単離されるが、タイプ
IIまたはタイプIII コラーゲン分解を伴う病気に罹って
いる患者からまたは急速に成長している青年から容易に
得られる。

【００６１】（タイプＩコラーゲンテロペプチドの単離）活性ページェット病の患者からの尿を、低多孔性透析チ
ューブ（〈３，５００分子量除外、スペクトロポア（Ｓ
ｐｅｃｔｒｏｐｏｒｅ）製）により４℃で４８時間、大
部分の溶質を除くために透析した。これらの条件下で、
対象とするペプチドは殆ど保持されていた。凍結乾燥し
た非透析質を、次いで、バイオ−ゲルＰ２（２００−４
００メッシュ、９０ｃｍ×２．５ｃｍ）のカラムで１０
％酢酸により室温で２００ｍｇ毎の留分として溶出し
た。架橋ペプチドを合わせた溶出液の領域は、集めた留
分の２９７ｎｍ励起／３９５ｎｍ発光での蛍光を測定す
ることにより決定し、この留分を凍結乾燥した。この物
質をバイオ−ゲルＰ−４（２００−４００メッシュ、９
０ｃｍ×２．５ｃｍ）のカラムで１０％酢酸で溶出する
ことにより更に分別した。

【００６２】二つの隣接した留分の溜りは、上記のよう
に溶離液の蛍光を監視することにより分けた。より早い
留分は、骨タイプＩコラーゲンの三重らせん体から誘導
される第三の配列に結合する骨タイプＩコラーゲンのａ
１(Ｉ）鎖のＣ−末端テロペプチド構造から誘導され
る、二つのアミノ酸配列を有するペプチド断片に富んで
いる。これらの三つのペプチド配列は、３−ヒドロキシ
ピリジニウムにより架橋している。重複するより後の留
分は、３−ヒドロキシピリジニウム架橋を介して結合し
ている骨タイプＩコラーゲンのＮ−末端テロペプチド構
造から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチド断片に
富んでいる。

【００６３】個々のペプチドは、次いで、ＴＳＫＤＥ
ＡＥ−５−ＰＷカラム（バイオ・ラド７．５ｃｍ×７．
５ｍｍ）によるイオン交換ＨＰＬＣにより、１０％（ｖ
／ｖ）アセトニトリルを含有する、ｐＨ７．５の０．０
２Ｍトリス−ＨＣｌ中でＮａＣｌの勾配（０〜０．２
Ｍ）で溶出することにより、上記したように得られた二
つの留分のそれぞれから分別される。Ｎ−末端テロペプ
チド及びＣ−末端テロペプチドに基づく架橋ペプチド
は、０．０８Ｍ及び０．１５ＭＮａＣｌの間で一連の
３〜４の蛍光ピークを示して溶出される。Ｃ−末端テロ
ペプチドに基づく架橋ペプチドが、最初に一連の蛍光ピ
ークをもって溶出され、そして主要な及び微小なＮ−末
端テロペプチドに基づく架橋ペプチドが特徴的なピーク
をもって勾配の終わりのほうで溶出される。それらはそ
れぞれ集められ、凍結乾燥し、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣカ
ラム（ビダック（Ｖｙｄａｃ）２１８ＴＰ５４、２５ｃ
ｍ×４．６ｍｍ）で、０．０１Ｍトリフルオロ酢酸中、
アセトニトリル：ｎ−プロパノール（３：１ｖ／ｖ）
の勾配（０〜１０％）で溶出することによりクロマトグ
ラフィーを行った。約１００−５００μｇの３−ヒドロ
キシピリジニウム架橋を含有する個々のペプチド断片
が、ページェット病患者の尿を２４時間１回集めたもの
からこの工程により単離された。

【００６４】主要な単離ペプチドのアミノ酸組成は、回
収されたアミノ酸の全数化学量論により、純度及び分子
サイズを確認した。エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解による
Ｎ−末端配列の分析により、タイプＩコラーゲンの公知
の架橋点の配列に相当する基本的核構造及びアミノ酸組
成の整合を確認した。ａ２（Ｉ）鎖のＮ−末端テロペプ
チドは、恐らくは公知のようにＮ−末端グルタミンがピ
ロリドンカルボン酸に環化したことによって、配列分析
することができなかった。

【００６５】上記の工程により得られるＮ−末端テロペ
プチドの典型的な溶出外形を図９に示す。得られた主要
なペプチド断片は、（Ａｓｘ）_２（Ｇｌｘ）_２（Ｇ
ｌｙ）_５Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒのアミノ酸
組成を有している。ここで、Ａｓｘはアミノ酸Ａｓｐま
たはＡｓｎであり、Ｇｌｎはアミノ酸ＧｌｎまたはＧｌ
ｕである。このペプチドの配列は、以下の式３によって
示される。上記により、逆相ＨＰＬＣにより分別される
Ｃ−末端テロペプチドに基づく架橋ペプチドは図１０に
示した。この図から理解できるように、これらのペプチ
ドは、それぞれが３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含
む一連のＣ−末端テロペプチドに更に分別される。図１
０に示した主要なペプチドは、上記のように分析され、
（Ａｓｐ）_５（Ｇｌｕ）_４（Ｇｌｙ）_１０（Ｈｉ
ｓ）_２（Ａｒｇ）_２（Ｈｙｐ）_２（Ｈｌａ）_５の
アミノ酸組成を有することが見出された。このペプチド
の配列は、以下の式４で示される。図１０に小さなピー
クとして現れる他のＣ−末端テロペプチドに基づく架橋
ペプチドは、式４で示した構造に対するアミノ酸付加及
び削除を表していると思われる。これらの小さなピーク
に含まれる如何なるペプチドも、以下に述べる免疫原と
して使用するのに適当である。

【００６６】

【化１１】

【００６７】

【化１２】

【００６８】

【化１３】

【００６９】式中、K-K-K はＨＰまたはＬＰ架橋を表
し、Gln はグルタミンまたはピロリドンカルボン酸を表
す。

【００７０】コラーゲン分解により体液中にそれらが存
在することにより、上記構造により表されるペプチドの
等価物は、そのペプチド構造に幾つかの変化があるもの
をも含む。そのような変種の例としては、Ｎ及びＣ末端
への１〜３のアミノ酸付加体並びに１〜３の末端アミノ
酸除去体が挙げられる。例えば、式３に相当するが、Ｎ
−末端アスパラギン酸残基のアミノ末端にチロシン残基
が付加しているペプチドは、ヒト尿中からは比較的少な
い量で検出されている。骨吸収から誘導される式４で示
される分子のより小さいペプチド断片は、尿中に特に顕
著である。これらは、図１０に見られるようにＣ−末端
テロペプチド留分の小さいピークとして見出され、アミ
ノ酸組成及び配列分析により同定することができる。

【００７１】（ペプチド定量工程の実施例）Ａ．ペプチド定量用免疫学的工程生理学的液体から得ら
れた骨コラーゲンに由来するペプチド断片と特異的に結
合することができる免疫学的結合パートナーは、当業界
においてよく知られている方法により製造することがで
きる。これらのペプチド断片を単離するための好ましい
方法は上記した。ここで使用する免疫学的結合パートナ
ーという語は、テロペプチドと結合することが可能な抗
体及び抗体断片を意味する。ここに開示したペプチドと
特異的に結合するモノクローナル及びポリクローナル抗
体の両者及びそれらの等価物は、当業界で公知の方法に
より製造される。例えば、キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌ
ｌ，Ａ．Ｍ．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３
（１９８４））参照。単離された上記ペプチドまたはそ
れらの等価物に対する抗体を製造することは可能であ
る。しかしながら、これらのペプチド断片の分子量は一
般に５，０００未満なので、ハプテンを担体分子に接合
することが好ましい。適当な担体分子としては、それら
に限定されないが、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミ
ン、サイログロブリン、及び陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）が挙げられる。好ましい担体はサイログロブリン及
びＫＬＨである。

【００７２】当業界では、ハプテンの配向は、それが担
体タンパク質に結合する際に、抗血清の特異性に関して
臨界的に重要であることがよく知られている。更に、全
てのハプテン−タンパク質接合体が等しく免疫原として
成功するわけではない。担体タンパク質への特別なハプ
テンを結合させるためのプロトコールの選択は、それ
故、選択した尿のペプチド断片のアミノ酸配列に依存す
る。例えば、式３で示されるペプチドを選択する場合に
は、好ましいプロトコールは、このハプテンを陣笠貝ヘ
モシアニン（ＫＬＨ）、または他の適当な担体にグルタ
ルアルデヒドにより、結合させることを含む。もう一つ
のプロトコールは、ペプチドをＫＬＨとカルボジイミド
により結合させることである。これらのプロトコール
は、好ましいエピトープ（「好ましいエピトープの特
性」の標題のもとに以下において記載する）を、感作し
た脊椎動物抗体産生細胞（例えば、Ｂリンパ球）に生じ
させることを確実にするのを助ける。他のペプチドは、
その源に基づき、異なった結合プロトコールが必要であ
る。従って、数多くの結合試薬が適宜、使用される。こ
れらとしては、限定されないが、カルボジイミド、グル
タルアルデヒド、混合無水物、並びにホモ２官能及びヘ
テロ２官能試薬（例えば、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）１９
８６−８７カタログ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ参照）が挙げられ
る。好ましい結合試薬としては、カルボジイミド及びｍ
−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（ＭＢＳ）等のヘテロ２官能試薬が挙げられ
る。

【００７３】ハプテンを担体分子に結合する方法は、当
業界では知られている。例えば、ここで引用したチャー
ド（Ｃｈａｒｄ，Ｔ．，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａ
ｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ６
（１９８７）ＰａｒｔｚＥｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．
Ｙ．）参照。ハプテン担体分子免疫原に対するモノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体の何れもが製造するこ
とができる。しかしながら、モノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ）を製造することが好ましい。この理由から、免疫化
はマウスで行うことが好ましい。マウスでの免疫化プロ
トコールは、通常、アジュバント（補助剤）を含む。適
当なプロトコールの例としては、チャード（Ｃｈａｒ
ｄ，Ｔ）（１９８７）（上記参照）に記載されている。
免疫化マウスの脾臓細胞を取り出し、均質にし、その
後、ポリエチレングリコールの存在下に癌細胞と融合
し、コラーゲンから派生するペプチド断片に特異的なモ
ノクローナル抗体を産生する融合細胞ハイブリッドを製
造した。そのようなペプチドの例としては、上記した式
で表されるものが挙げられる。適当な癌細胞には、ミエ
ローマ（骨髄腫）、ヘパトーマ（肝癌）、カルシノーマ
（癌腫）及びザルコーマ（肉腫）細胞が含まれる。スク
リーニングのプロトコール、選択したハイブリッド細胞
の成長プロトコール及び選択されたハイブリッド細胞に
より産生されるモノクローナル抗体の収穫を含む、この
工程はガルフレ及びミルスタイン（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．
ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．，７３：１（１９８１））に詳しく記載され
ている。好ましい予備的なスクリーニングのプロトコー
ルは、骨コラーゲン吸収により誘導され、３−ヒドロキ
シピリジニウム架橋を含有するペプチド断片を固相放射
免疫分析で使用することを含む。好ましいモノクローナ
ル抗体が記載されている特徴的な例を以下に挙げる。

【００７４】組み替えＤＮＡ技術を利用する方法は、ま
た、モノクローナル抗体を組み立てるのに適合させるこ
とができる。これらの方法は、常套手段により発現ライ
ブラリーとプライマーを構築することによって達成さ
れ、（例えば、ウィリアム・ヒューズ等（Ｗｉｌｌｉａ
ｍＤ．Ｈｕｓｅｅｔａｌ．）、″Ｇｅｎｅｒａｔ
ｉｏｎｏｆａＬａｒｇｅＣｏｍｂｉｎａｔｉｏ
ｎａｌＬｉｂｒａｒｙｏｆｔｈｅＩｍｍｕｎｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅｉｎＰｈａｒ
ｇｅＬａｍｂｄａ″，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２
７５−１２８１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１９８９参
照、またサストリー等（Ｌ．Ｓａｓｔｒｙｅｔａ
ｌ．）″ＣｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅＩｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅｉｎＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｆｏｒＧｅｎｅｒａｔ
ｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＣａｔａｌｙｔ
ｉｃＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏ
ｎｏｆａＨｅａｖｙＣｈａｉｎＶａｒｉａｂｌ
ｅＲｅｇｉｏｎ−ＳｐｅｃｉｆｉｃｃＤＮＡＬｉｂ
ｒａｒｙ″，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８６：５７２８−５７３２，Ａｕｇｕ
ｓｔ１９８９参照；またミケーレ・アルティング・ミ
ース等（ＭｉｃｈｅｌｌｅＡｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ
ｅｔａｌ．）、″ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏ
ｄｙＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＬｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ
ＲａｐｉｄＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｔｏＨｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ″，ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ３：１−９，Ｊａ
ｎｕａｒｙ１９９０参照）、またはこの目的に有用な
市販のキット（即ち、Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから）を購入する
ことにより、達成することができる。端的には、この実
施態様において、ｍＲＮＡがＢ細胞個体群から単離さ
れ、そしてλ免疫Ｚａｐ（Ｈ）及びλ免疫Ｚａｐ（Ｌ）
ベクター（媒介体）中で重鎖及び軽鎖免疫グロブリンｃ
ＤＮＡの発現ライブラリーをつくるために利用される。
これらのベクターは、個々に篩分けされまたは共に発現
され、Ｆａｂフラグメントまたは抗体を形成する（ヒュ
ーズ等（Ｈｕｓｅｅｔａｌ．）、またサストリー等
（Ｓａｓｔｒｙｅｔａｌ．）前出参照）。陽性のプ
ラクは、続いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのモノク
ローナル抗体断片の高水準発現を可能とする非溶解性の
プラスミドに変換される。

【００７５】本発明において使用されるモノクローナル
抗体または他の免疫学的結合パートナーは、特別なタイ
プのコラーゲンテロペプチドに特異的であることが好ま
しい。例えば、タイプIIまたはタイプIII コラーゲン分
解テロペプチドの分析は、タイプＩ、タイプII及びタイ
プIII ペプチドを区別できることが好ましい。しかしな
がら、ある場合には、そのような選択性は必要がないで
あろう、例えば、もし、患者が一つのタイプのコラーゲ
ンの分解に罹っているのではなく、分析対象とされたタ
イプのコラーゲン分解に罹っているかどうか疑われてい
る場合である。タイプＩ、タイプII及びタイプIII 系列
のテロペプチド間のアミノ酸配列が異なるので、交差反
応は重大な度合いでは起こらない。実際、ハイブリドー
マは、対象とする架橋テロペプチドに特異的な（及び他
の二つのコラーゲンタイプへの親和性に欠ける）モノク
ローナル抗体を産生する脾臓融合クローンのスクリーニ
ングの間に選択することができる。単離されたペプチド
構造の配列の相違に基づき、そのような特異性は完全に
実現できる。そのようなハイブリドーマのスクリーニン
グに適した親のタイプＩ、II及びIII コラーゲンのペプ
チド断片は、ヒトの骨、軟骨及び他の組織から製造で
き、そして体液から単離した個々の架橋ペプチド抗原と
適合するように免疫化されたマウスからのクローンをス
クリーンするのに使用される。

【００７６】上記の工程、またはそれと等価の工程で製
造された免疫学的結合パートナー、特にモノクローナル
抗体は、上記した３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有
するペプチドの濃度を定量するための種々の免疫測定法
に使用される。これらの免疫測定法は、検出可能なマー
カーと結合したモノクローナル抗体または抗体断片から
なることが好ましい。適当な検出可能なマーカーの例と
しては、それらには限定されないが、酵素、補酵素、酵
素阻害剤、発色団、蛍光団、化学発光物質、常磁性金
属、スピンラベル、及び放射性核種が挙げられる。テロ
ペプチドを定量するために適当な標準的免疫測定法の例
としては、それらには限定されないが、酵素結合免疫吸
着測定（ＥＬＩＳＡ）（イングヴァール（Ｅｎｇｖａｌ
ｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０（１９
８０））、放射免疫測定（ＲＩＡ）、及び「サンドウィ
ッチ」免疫放射測定（ＩＲＭＡ）が挙げられる。

【００７７】その最も簡単な形態において、これらの免
疫分析測定法は、単に体液を３−ヒドロキシピリジニウ
ム架橋を有するコラーゲンテロペプチドに特異的な免疫
学的結合パートナーと接触させることにより、骨吸収ま
たはコラーゲン分解の絶対速度を定量するのに使用する
ことができる。上記した免疫学的分析は、直接未処理の
体液（例えば、尿、血液、血清、または滑液）に行うこ
とが好ましい。場合によっては、汚染物質が分析を阻害
するかもしれないので、体液の部分的な精製を必要とす
る。部分的精製法としては、それらに限定されないが、
カートリッジ吸着及び溶出、分子篩クロマトグラフィ
ー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びそれらの
組み合わせが挙げられる。

【００７８】本発明に使用するのに適当な試験キット
は、上記したように製造されたモノクローナル抗体のよ
うな特異的結合パートナーを含み、それは体液中に見出
されるコラーゲン分解に由来するペプチド断片と特異的
に結合するものである。この試験キットの特異的結合パ
ートナーは、上記したタイプの検出可能なマーカーと結
合したものであることが好ましい。２若しくはそれ以上
の結合パートナー、特に免疫学的結合パートナー、のパ
ネルを含有する試験キットが意図されている。そのよう
な試験キットのそれぞれの結合パートナーは、他のタイ
プのコラーゲンから由来するテロペプチドと実質的に交
差反応しないことが好ましいであろう。例えば、タイプ
IIコラーゲンと特異的に結合する免疫学的結合パートナ
ーは、タイプＩまたはタイプIII コラーゲンテロペプチ
ドの何れとも交差反応しないことが好ましい。多少（例
えば、５〜１０％）の交差反応は許容できる。他の試験
キットとしては、ピリジニウム環（それは、ＯＨ−置換
されていてもよい）を含む架橋を有するコラーゲン−由
来テロペプチドに対する第一の特異的結合パートナー、
及び例えば、光分解により、ピリジニウム環が開裂して
いる以外は第一のテロペプチドと同一の構造を有するテ
ロペプチドに対する第二の特異的結合パートナーを含ん
でいてもよい。

【００７９】（ｉ）モノクローナル抗体の製造以下は、上記式３に基づくペプチド免疫原に対するモノ
クローナル抗体の製造例である。式３（骨コラーゲン分
解を示す）のペプチドに富んだ留分を、逆相及び分子篩
クロマトグラフィーを用いて青年のヒトの尿から調製し
た。このペプチドを、グルタルアルデヒドを用いて、通
常の工程によって、陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）と接
合させた。マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）にこの接合体（５０
−７０μｇ）を、先ず、完全フロイントアジュバント中
において、皮下注射することにより免疫し、次いで、３
週間の間隔で不完全フロイントアジュバント中、腹腔内
に（２５μｇ）投与した。試験血液が、ＥＬＩＳＡフォ
ーマットを用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合
した式３のペプチド（以下において、Ｐ１と言及する）
に対する高い力価を示した後に、選択したマウスに、殺
菌したＰＢＳ中の低濃度（５μｇ）の免疫原を静脈注射
することにより投与した。３日後、個々のマウスの脾臓
からの細胞を、通常の細胞融合技術を用いてマウスミエ
ローマ細胞と融合させた。９６−ウェルのプレートの個
々のウェルで増殖したハイブリドーマクローンの上清
を、最初に、ＢＳＡに接合した粗Ｐ１製剤を用いて、反
応性モノクローナル抗体について分別した。限界希釈に
よる型通りのクローニングの後、個々のハイブリドーマ
で産生された抗体は、ＥＬＩＳＡ分析を用いた抗原スク
リーニングパネルに対して特性化される。これらの抗体
は、ＢＳＡに接合したＰ１（式３）及びＰ２（式７）の
ペプチドである。ＢＳＡと接合したＰ１がプラスチック
ウェルにプレートアウトされている場合、抑制分析が使
用され、抗体は有効な抗原の溶液で予めインキュベート
される。第２の抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ、Ｈ
ＲＰに接合したヤギ抗−マウスＩｇＧ）は、適当な基質
を用いた発色に使用される。Ｐ１ペプチドとの高い結合
親和性を有する望ましいモノクロナール抗体が同定され
た。腹水液製造に使用される場合、抗体は、２，００
０，０００倍希釈で最適色領域での抑制分析において機
能する（このことは、結合定数が、１０^−９〜１０
^{− １１}Ｍ^{− １}の範囲、おそらくは約１０
^{− １０}Ｍ^{− １}であることを示している）。Ｅ
ＬＩＳＡフォーマットにおいて、抗体は、如何なる濃縮
または清浄工程を経ることなく健常人の尿中に存在する
Ｐ１を検出し、そして測定することが可能であった。こ
の好ましいモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マは、寄託番号ＨＢ１０６１１のもとにメリーランド２
０８５２、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３
０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ）に寄託されている。このハイブリドーマは
以下において１Ｈ１１として示されており、それが産生
するモノクローナル抗体は以下においてＭａｂ−１Ｈ１
１として示されている。サンドウィッチ分析は、また、
Ｐ１−特異的モノクローナル抗体及び接合Ｐ１に対する
ウサギで培養されたポリクローナル抗血清を用いて機能
することがわかった。Ｐ１−特異的モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗血清、その結合断片、等は何れ
も、標準ＥＬＩＳＡ及び他の免疫分析プロトコルを用い
る検出可能な仕様で、尿からのＰ１と特異的に結合する
ために使用することができる。

【００８０】（ｉｉ）好ましいエピトープの特性抗体ＭＡｂ−１Ｈ１１によって認識されるエピトープ
は、Ｐ１の構造中に体現されている。エピトープは、純
粋なＰ１中で、及びＰ１構造（例えば、Ｐ１のＮ−末端
アスパラギン酸残基を介してチロシン残基に結合したＰ
１）を含有する、或るより大きいペプチド中に認識され
る。エピトープは、ペプチドＰ１の構造中に体現された
二つのテロペプチドの両方の化学的特徴を含んでいる。
ヒトａ１（Ｉ）及びａ２（Ｉ）Ｎ−テロペプチド配列と
適合するように合成され、ウシ血清アルブミンと結合す
るようにＣ−末端システィンを付加したペプチド（即
ち、ＹＤＥＫＳＴＧＧＣ及びＱＹＤＧＫＧＶＧＣ）は、
ＭＡｂ−１Ｈ１１によっては認識されなかった。このこ
とは、プレートアウトしたＰ１（図１３参照）に対し、
競合する、または直接、結合パートナーとしてＢＳＡに
接合し、プレートアウトした遊離のペプチドを使用する
ＥＬＩＳＡにより示される。図１３に言及すると、検出
可能なマーカーの４５０ｎｍにおける吸光度を、遊離Ｐ
１ペプチドの濃度に対してプロットしている。遊離Ｐ１
の量が増大するに従い、固定（プレートアウト）された
Ｐ１に結合した検出可能なマーカーの量は減少する。比
較として、ａ２（Ｉ）及びａ１（Ｉ）Ｎ−テロペプチド
は、ＭＡｂ−１Ｈ１１との如何なる重大な競合結合も殆
どないことを示している。更に、Ｎ−末端アスパラギン
酸にチロシン残基を有するＰ１のより大きい形態は、Ｐ
１より低い収率ではあるが、ＭＡｂ−１Ｈ１１への結合
親和力により尿中から回収された。Ｐ１エピトープを有
する他のやや大きいペプチドも回収されたが、より少な
い量であった。抗体は、Ｐ１中の架橋の性質について、
即ち、ヒドロキシリジルピリジノリン（ＨＰ）かリジル
ピリジノリン（ＬＰ）かどうかについて選択的ではなか
った。アガロースに結合したＭＡｂ−１Ｈ１１から成る
アフィニティカラムで尿から単離したペプチドの分析か
ら判断すると、明らかに等しい親和性で、ＨＰ−含有及
びＬＰ−含有形態の両方が結合した。骨コラーゲンから
の酸加水分解により作られるか、または尿中に自然に存
在する、遊離の架橋アミノ酸である、ＨＰ及びＬＰは、
ＭＡｂ−１Ｈ１１により認識されなかった。

【００８１】紫外光（長紫外光）によるペプチドＰ１中
の３−ピリジノール環の光分解開環の後にも、特異的抗
体結合は、恐らくは、残された個々のペプチドがお互い
に架橋したままであるために、影響されなかった。実験
を以下のように行った。ＨＰ及びＬＰを完全に破壊する
ことが示された（ＲＰ−ＨＰＬＣの特性蛍光ピークの蛍
光の損失による証拠に基づき）条件を用いて、遊離アミ
ノ酸または不溶性ペプチドの何れか及び完全タンパク質
鎖として、Ｐ１の調製物は照射された（長波長の設定−
ミネラライト（Ｍｉｎｅｒａｌｉｇｈｔ）ＵＶＳＬ−
２５ランプ（Ｕｌｔｒａ−ＶｉｏｌｅｔＰｒｏｄｕｃ
ｔｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＧａｂｒｉｅｌ，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ）。この溶液は、照射されていない全く同
一物質の対照溶液を用いて、ＭＡｂ１Ｈ１１に対する
結合を分析した。１Ｈ１１のＥＬＩＳＡによる結果は、
Ｐ１に対する結合に本質的な損失がないことを示し、環
の開裂がエピトープに重大な影響を与えていないことを
意味している。ＵＶ照射の条件下（ｐＨ９）、環を開く
ための単結合の開裂の方が、環の窒素及びその側結合手
を除去するための二重結合の開裂よりも起こり得ること
が予測される。比較のために、エア（Ｅｙｒｅ，Ｄ．，
Ｍｅｔ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４４：１５５−１３９
（１９８７））参照。

【００８２】ＭＡｂ−１Ｈ１１により認識されるエピト
ープは、それ故、それらに結合している三価の架橋アミ
ノ酸により付与される立体的特徴と共に、図１４に枠で
示したように、二つのテロペプチド配列に体現されてい
る、少なくとも化学的及び構造的特徴の組合せから作ら
れている。ａ２（Ｉ）Ｎ−テロペプチド配列であるＱＹ
ＤＧＫは、エピトープの特に重要な部分である。ＭＡｂ
−１Ｈ１１により認識されるエピトープが完全なピリジ
ニウム環に存在しないという事実は、予測されない発見
である。生体内及び通常の取り扱い条件下試験管内の何
れでも開環が起こるのであれば、おそらく、完全ピリジ
ニウム環を有する対象ペプチドの定量分析では、骨吸収
が低く評価されるであろう。予備的な観察は、対象とす
るペプチド中のピリジニウム環の分解が、たとえ冷凍し
たとしても、特に、尿中及び／または尿試料中において
起こることを示唆している。従って、本開示に基づく分
析は、相対的に、より正確であると考えられる。二つの
態様が考えられる：即ち目的とするペプチドの閉じた及
び開いた環の態様の両者を認識する、単一の特異的結合
パートナーが使用されるか、或いは、閉じた及び開いた
環のエピトープをそれぞれ区別しうる、二つの結合パー
トナーが使用される。

【００８３】目的とするペプチドの閉じた及び開いた環
の形態の差を識別する特異的結合パートナーは、そのよ
うな特異的結合パートナーを得るための工程中に適当な
スクリーニング工程を導入することにより得ることがで
きる。例えば、Ｐ１ペプチドの開環体に特異的に結合す
るモノクローナル抗体を得るために、モノクローナル抗
体の候補のライブラリーは、それらの開鎖ピリジノリン
環を有するＰ１と結合する能力を有し（例えば、紫外光
照射により）、及びそれらの完全ピリジノリン環を有す
るＰ１と結合し得ないことから分別することができる。
そのようなスクリーニング工程に有用な開環及び完全環
ペプチドは、上記したＲＰ−ＨＰＬＣのような公知の精
製技術で得ることができる。

【００８４】更なる実験は、エピトープがヒトの骨コラ
ーゲン中に存在しているが、広範囲にわたるタンパク質
分解の後にのみ、ＭＡｂ−１Ｈ１１にさらされ、そして
結合されることを示した。かくして、細菌性のコラゲナ
ーゼにより脱灰されたヒト骨コラーゲンから製造された
ペプチドはＭＡｂ−１Ｈ１１に結合され、図１４に示さ
れたように、らせん位置のＮ−テロペプチドから由来す
ることが示されている。一つの形態は、ａ１（Ｉ）残基
９２８−９３３から明らかに由来するヘキサペプチドの
ＧＩＫＧＨＲ（Ｐ１中の非テロペプチドＫ結合手に代え
て）を含んでいた。他の形態は、ａ２（Ｉ）鎖から由来
するヘキサペプチドと等価であるが明白に区別されるも
のであった。ペプシン、ＣＮＢｒ、またはトリプシンで
溶解されたヒト骨コラーゲンの断片は、競合阻害剤とし
て使用される場合のＥＬＩＳＡ法においても、或いはＳ
ＤＡ−ポリアクリルアミド電気泳動の後のウエスタン・
ブロットによっても、ＭＡｂ−１Ｈ１１によっては認識
されず、これらの溶解剤がＭＡｂ−１Ｈ１１によって認
識されるエピトープを製造しないことを示している。

【００８５】Ｂ．ペプチド分析用電気化学的工程上記したペプチドを分解するための他の方法は、３−ヒ
ドロキシピリジニウム架橋を有するペプチドの物理的性
質を測定することから成る。そのような物理的性質の一
つは、電気化学的検出による。この方法は、尿のような
体液の一定量を、３−ヒドロキシピリジニウム環を含有
するペプチドの検出に適当な酸化−還元電位に平衡をと
った電気化学的検出器に注入することから成る。３−ヒ
ドロキシピリジニウム環は、フェノールであり、可逆酸
化反応を受け、そしてそれ故、電気化学的検出器（例え
ば、モデル５１００Ａクーロケム（Ｃｏｕｌｏｃｈｅ
ｍ）、エサ（Ｅｓａ、４５ＷｉｇｇｉｎｓＡｖ
ｅ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から市販）は、本ペプ
チドの濃度を定量するのに適当な、高度に望ましい機器
である。二つの基本的な形態の電気化学的検出器が、現
在市販されている：アンペア測定（例えば、ＢｉｏＡｎ
ａｌｙｔｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ）とクーロン測定
（ＥＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ０１７
３０）である。共に本発明において適当に使用される
が、しかし、後者の系は本来的により高感度であり、そ
れ故、カラム流出液において分析すべき分子の完全な酸
化または還元が達成されるので好ましい。さらに妨害物
質を選択的に酸化または還元するために、スクリーニン
グまたは保護電極を分析電極の「上流」に配置すること
ができ、それにより選択性を非常に改良することができ
る。本質的には、分析電極の電圧は、試料分子の酸化還
元電位に変えられ、一若しくはそれ以上の前処理セル
が、試料中の妨害物を破壊するために配置される。

【００８６】好ましい分析方法において、標準電流／電
圧曲線は、最適な感度を設定するための適正な電圧を決
定するために、リジルピリジノリンまたはヒドロキシリ
ジルピリジノリンを含有する標準ペプチドについて確立
される。この電圧は、汚染物質からの妨害を最小にし、
感度を最適化するために、体液に応じて修正される。電
気化学的検出器及びそれらを使用するための最適条件
は、当業者によく知られている。体液の複合混合物は、
しばしば、妨害なく電気化学的検出器により直接分析さ
れる。従って、多くの患者にとって、体液の前処理は必
要としない。しかしながら、ある場合には、妨害化合物
が測定の信頼性を減ずるかもしれない。そのような場合
には、体液（例えば、尿）の前処理が必要であろう。

【００８７】従って、発明の他の実施態様において、体
液は精製されたペプチド断片を電気化学的に滴定するに
先立ち、先ず精製される。精製工程は、種々の方法によ
って行われ、限定されないが、透析、イオン交換クロマ
トグラフィー、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキ
シアパタイトクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラ
フィーまたはそれらの組合せが挙げられる。好ましい精
製のプロトコールにおいて、２４時間尿試料の測定され
た一定量（２５ｍｌ）を、大部分の汚染蛍光溶質を除去
するために、低多孔性透析チューブで透析される。非透
析物を、次いで、凍結乾燥し、１％ヘプタフルオロ酪酸
（ＨＦＢＡ）のイオン対溶液に再溶解し、そしてペプチ
ドがウォーターズ・セプ−パックＣ−１８カートリッジ
に吸着される。このカートリッジは、次いで、５ｍｌの
１％ＨＦＢＡで洗浄し、更に１％ＨＦＢＡ中、５０％メ
タノール３ｍｌで溶出される。

【００８８】精製の他の好ましい方法は、測定した一定
量の尿をイオン交換フィルターに吸着させ、そして吸着
フィルターを緩衝した溶出液で溶出することから成る。
３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプチド断片
を含有する溶出留分は、次いで、分析のために集められ
る。精製の更に他の好ましい方法は、分子篩クロマトグ
ラフィーを用いる。例えば、尿の一定量を、バイオ・ゲ
ル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ２またはセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２０カラムにかけ、次いで、１００
０−５０００ダルトン領域に溶出した留分を集める。当
業者にとっては、上記方法の組合せが３−ヒドロキシピ
リジニウム架橋を有するペプチド断片を単離するため
に、尿または他の体液を精製し、または部分的に精製す
るために使用されることは明白であろう。上記工程によ
り得られた精製し、または部分的に精製したペプチド断
片は、更に追加の精製工程を行ってもよく、更に部分的
に精製した状態で直接処理または分析してもよい。追加
の精製工程は、増大した感度が望ましい場合には、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはマイクロボ
アＨＰＬＣを用いることにより、部分的に精製されたペ
プチド断片を分別することを含む。これらのペプチド
は、次いで、電気化学的滴定により定量される。好まし
い電気化学的滴定法は、電気化学的検出器（クーロケ
ム、モデル５１００Ａ）の検出セルの酸化還元電位を、
純粋ＨＰで最高信号となるよう調整することからなる。
検出器は、次いで、部分的に精製したペプチドを分別す
るために使用されるＣ−１８ＨＰＬＣカラムからの流出
液を監視するために使用される。

【００８９】Ｃ．ペプチド定量用蛍光分析工程ここで記載する３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有す
るペプチドの濃度を定量する好ましい方法は、これらの
ペプチドの天然の蛍光特性を測定することである。３−
ヒドロキシピリジニウム架橋以外の天然に存在する蛍光
物質を殆ど含まないそれらの体液については、体液を更
に精製することなく、直接蛍光分析が行われる。この場
合、ペプチドはＨＰＬＣで分別され、ＨＰ及びＬＰアミ
ノ酸残基の自然の蛍光を２９７ｎｍで励起し、３９５ｎ
ｍで測定する。ここで引例として導入されたエア等（Ｅ
ｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ａｎａｌｙｔｅ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：３８０（１９８４））に実質
的に記載されている。

【００９０】本発明によれば、尿の蛍光分析を行うこと
が好ましい。尿は、しかしながら、通常、蛍光分析を行
う前に除去されなくてはならない、かなりの量の自然に
生ずる蛍光汚染物質を含有している。従って、尿試料
は、上記の電気化学的分析で述べたように、先ず、部分
的に精製されなければならない。この部分的に精製され
た尿試料は、次いで、上記したように、蛍光測定法によ
る分析を行うことができる。一方、部分的に精製した尿
試料又は他の体液中のＨＰ及びＬＰ架橋ペプチドは、上
記したエア（Ｅｙｒｅ，ｅｔａｌ．（１９８４））に
記載されているように、６ＭＨＣ１中、約１０８℃で
おおよそ２４時間加水分解することができる。この工程
は、「トリペプチド」ＨＰ及びＬＰ架橋のリジン前駆体
に連結しているアミノ酸を加水分解し、式１及び２で示
される遊離のＨＰ及びＬＰアミノ酸を生ずる。これらの
小さい「トリペプチド」は、次いで、上記した技術、好
ましくはＨＰＬＣで分別され、そして自然の蛍光が測定
される。（Ｅｘ２９７ｎｍ，Ｅｘ３９０ｎ
ｍ）。

【００９１】任意に、体液（好ましくは、尿）は、アセ
トニトリル／メタノール５〜１０％ｖ／ｖを添加した
後、Ｃ−１８逆相アフィニティカートリッジに直接通さ
れる。非残留物は水酸化テトラブチルアンモニウム等の
カチオン性イオン対試薬により、０．０５〜０．１０Ｍ
に調整され、そして第二のＣ−１８逆相カートリッジを
通される。この第二のカートリッジからの蛍光ペプチド
を含有する洗浄した残留物は、アセトニトリル：水（ま
たはメタノール：水）で溶出され、乾燥され、そして蛍
光ペプチドは、溶離液中の０．０１Ｍトリフルオロ酢酸
のようなアニオン性イオン対試薬を用いて、逆相ＨＰＬ
ＣまたはマイクロボアＨＰＬＣにより分析される。

【００９２】図１１は、健常人の尿からのペプチド断片
の加水分解物を、自然の蛍光により逆相ＨＰＬＣによっ
て分別した溶出図を示す。与えられた成分の周りの統合
された領域の測定は、試料中のその成分の濃度を測定す
るために使用される。健常人尿及びページェット病患者
の尿から見出されるＨＰ：ＬＰの比は、図１２のよう
に、共に、約４．５：１である。これは、骨それ自身に
見出される４：１の比よりも若干高い（エア等（Ｅｙｒ
ｅ，ｅｔａｌ．，１９８４））。尿中に見出される高
い比は、尿中のＨＰ留分の一部が、食物のような骨以外
の源から、或いはコラーゲン分解の他の源、即ち、軟骨
の異化作用からきていることを示している。この理由の
ために、骨からのみ由来するＬＰを骨吸収の絶対的指標
を提供するものとして使用することが好ましい。しかし
ながら、リウマチ関節炎のような過剰の軟骨分解がない
場合または骨が急速に吸収される場合には、ＨＰまたは
ＨＰプラスＬＰの組合せを骨吸収の指標としてもよい。

【００９３】本発明を好ましい実施態様に関連して記載
したけれども、先の明細書を読んだ後の当業者は、ここ
に掲載した主題の種々の変更、等価な置換及び交換を行
うことができるであろう。よって、本発明はここに特別
に記載した以外の方法によっても行うことができる。従
って、本特許による保護は、添付した特許請求の範囲及
びその均等物によってのみ限定される。

【図面の簡単な説明】

【図１】タイプIIコラーゲンとテロペプチド源を提案し
た図である。記載した二つのテロペプチドが図１に示し
た一つのコラーゲン分子または二つのコラーゲン分子か
ら来るものかは確立されていない。

【図２】架橋したテロペプチドの分子篩クロマトグラフ
ィーによる精製中に得られた、相対蛍光度（２９７ｎｍ
励起；３９０ｎｍ発光）に対する留分番号を示してい
る。架橋したタイプIIコラーゲンテロペプチドは、図中
IIで示した留分中に含まれている。

【図３】イオン交換ＨＰＬＣ（ＤＥＡＥ−５ＰＷ）中
の、相対蛍光度（３３０ｎｍ励起；３９０ｎｍ発光）に
対する留分の溶出時間を示す。架橋したタイプIIコラー
ゲンテロペプチドは、図中IVで示した留分中に含まれて
いる。

【図４】同一のクロマトグラムで、吸光度（２２０ｎ
ｍ）に対する分での溶出時間を示す。

【図５】逆相ＨＰＬＣ中の、相対蛍光度（２９７ｎｍ励
起；３９０ｎｍ発光）に対する留分の溶出時間を示す。
架橋したタイプIIコラーゲンテロペプチドは、示したよ
うに溶出している。バー（−）で示した留分は、ペプチ
ドの配列及び組成物分析によればｇｌｙ（Ｇ）及びｐｒ
ｏ（Ｐ）残基を保持しているか失っているかを示してい
た。

【図６】逆相ＨＰＬＣ中での吸光度（２２０ｎｍ）を溶
出時間の関数として示す。

【図７】年齢によるヒトの骨の皮質及び海綿体の骨中の
ＨＰ及びＬＰの濃度を比較したものである。

【図８】年齢の関数としてのＨＰとＬＰの架橋モル比を
示すものである。

【図９】架橋タイプＩコラーゲンＮ−テロペプチドの逆
相ＨＰＬＣ分離中の、溶出容積の関数としての相対蛍光
度（２９７ｎｍ励起；＞３７０ｎｍ発光）を示す。

【図１０】架橋タイプＩコラーゲンＣ−テロペプチドの
逆相ＨＰＬＣ分離中の、溶出容積の関数としての相対蛍
光度（２９７ｎｍ励起；＞３７０ｎｍ発光）を示す。

【図１１】架橋タイプＩコラーゲンＣ−テロペプチドに
ついての、溶出時間の関数としての相対蛍光度（２９７
ｎｍ励起；＞３８０ｎｍ発光）を示す。

【図１２】架橋タイプＩコラーゲンテロペプチドについ
ての、溶出時間の関数としての相対蛍光度（２９７ｎｍ
励起；＞３８０ｎｍ発光）を示す。

【図１３】代表的なモノクローナル抗体ＨＢ１０６１１
と：Ｐ１ペプチド（ここでは式３白ヌキ四角）；ａ２
（Ｉ）Ｎ−テロペプチド（ＱＹＤＧＫＧＶＧＣ、黒菱
形）；及びａ１（Ｉ）Ｎ−テロペプチド（ＹＤＥＫＳＴ
ＧＧＣ、黒四角）との結合実験の結果を示す。

【図１４】脱灰されたヒト骨コラーゲンのＮ−テロペプ
チド領域の構造の一部を示す。Ｐ１ペプチド（式３）は
箱の中に囲われている；それは骨吸収と関係するエピト
ープを含有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/02 15/00 Ｃ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/50 C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/577 C07K 14/78 C07K 16/18 C12N 5/10 C12N 15/02

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】体液サンプル中の骨Ｉ型コラーゲンのア
ミノ末端テロペプチド構造に由来し、次の一般式３で示
される構造からなる第一のペプチド断片、【化１】（上記式中、K-K-K はヒドロキシリジルピリジノリン又
はリジルピリジノリンを表し、Gln はグルタミン又はピ
ロリドンカルボン酸を表す）及び架橋アミノ酸のピリ
ジニウム環が開裂している以外は、第一のペプチド断片
と同じものである第二のペプチド断片の両者の濃度を定
量することを含む骨吸収速度の測定方法。
【請求項２】体液が、尿、血液、血清または滑液である
請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】体液を第一及び／又は第二のペプチドに対
して特異的な結合パートナーの少なくとも１つと接触さ
せることを含む、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】体液を第一のペプチドに対して特異的な結
合パートナー及び第二のペプチドに対して特異的な結合
パートナーと接触させることを含む請求項２に記載の測
定方法。
【請求項５】さらに、体液を接触させる前に、体液を精
製することを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の
測定方法。
【請求項６】精製工程が、カートリッジ吸着及び溶出、
分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミ
ナクロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフィーからなる群から選択されたものである請求
項５に記載の測定方法。
【請求項７】体液サンプル中のつぎの一般式３で示さ
れる構造からなる第一のアミノ末端Ｉ型コラーゲンテロ
ペプチド【化２】（上記式中、K-K-K はヒドロキシリジルピリジノリン又
はリジルピリジノリンを表し、Gln はグルタミン又はピ
ロリドンカルボン酸を表す）及び架橋アミノ酸のピリ
ジニウム環が開裂している以外は、第一のテロペプチド
と同じものである第二のコラーゲンテロペプチドの両者
の存在又は濃度を測定することを含む骨吸収測定方法。
【請求項８】つぎの一般式３で示される構造からなる
第一のアミノ末端Ｉ型コラーゲンテロペプチド【化３】（上記式中、K-K-K はヒドロキシリジルピリジノリン又
はリジルピリジノリンを表し、Gln はグルタミン又はピ
ロリドンカルボン酸を表す）及び架橋アミノ酸のピリ
ジニウム環が開裂している以外は、第一のテロペプチド
と同じものである第二のコラーゲンテロペプチドに結合
する免疫学的結合パートナーの少なくとも１つを含む骨
吸収測定用キット。