JP3448295B2 - 血清ピリジニウム架橋物アッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の分野 本発明は、ヒトの血液流体サンプル中でペプチド遊離
のピリジニウム架橋物（pyridinium crosslinks）のレ
ベルをアッセイすることにより、ヒト被験体の骨コラー
ゲン分解を評価する方法に関する。

2.参考文献 Black,D.,ら.,Anal.Biochem.169:197−203（1988）． Black,D.,ら.,Annals of Rheumatic Diseases 48:641
−644（1989）． Brown,J.P.,ら.,Lancet 1091−1093（1984）． Campbell,A.,Monoclonal Antibody and Immunosensor
Technology,Elsevier（1991）． Daniloff,Y.,ら.,Connect.Tissue.Res.27:187（199
2）． Eyre,D.R.,ら.,Anal.Biochem.137:380−388（198
4）． Eyre,D.R.,ら.,FEBS ２:337−341（1987）． Fujimoto,D.,ら.,J.Biochem.83:863−867（1978）． Fujimoto,D.,ら.,J.Biochem.94:167−173（1983）． Gosling,J.,Clin.Chem.36（８）:1408（1990）． Gunja−Smith,Z.,ら.,Biochem.J.197:759−762（198
1）． Harlow,E.,ら,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Lab（1988）． Henkel,W.,ら.,Eur.J.Biochem.165:427−436（198
7）． Macek,J.,ら.,Z.Rheumatol.46:237−240（1987）． Ogawa,T.,ら.,Biochem.Biophys.Res.Commune.107:125
1−1257（1982）． Robins,S.P.,Biochem J.207:617−620（1982a）． Robins,S.P.,in“Collagen in Health and Disease"
（Weiss,J.B.,et al.,eds.）pp.160−178,Churchill Li
vingstone,Edinburgh（1982b）． Robins,S.P.,Biochem.J.215:167−173（1983）． Robins,S.P.,ら.,Ann.Rheumatic Dis.45:969−973（1
986）． Robins,S.P.,ら.,Biochim.Biophys.Acta.914:233−23
9（1987）． Segel,I.,Biochemical Calculations,John Wiley and
Sons,（1976）． Seibel,ら.,J.Rheumatol 16:964−970（1989）． Wong,S.S.,Chemistry of Protein Conjugation and C
ross−Linking,CRC Press,Boca Raton,Florida（199
1）． 3.発明の背景 ヒトには、高レベルの骨吸収、および骨形成と骨吸収
との間のバランス異常を特徴とする様々な症状がある。
これらのうちより一般的な症状の中には、骨粗鬆症、パ
ジェット病、および、良性と悪性の骨腫瘍の進行およ
び、例えば、前立腺または胸部の初期腫瘍から骨細胞へ
移行した転移性癌の進行に関連する症状がある。コラー
ゲン代謝の変化に関連する他の症状としては、骨軟化
症、くる病、子供の成長異常、腎性骨形成異常症、およ
び薬剤誘導性骨減少症が挙げられる。骨代謝の不規則性
は、しばしば、甲状腺治療の副作用から生じたり、そし
て原発性甲状腺機能低下症および甲状腺中毒ならびにク
ッシング病のような甲状腺状態それ自体から生じたりす
る。

骨吸収障害または骨形成と骨吸収との間のバランス異
常を特徴とする他の症状は、尿中のピリジニウム架橋物
のレベルの変化により検出され得ることが認識されてい
る（Robins,1982b;Macek;Black）。架橋物は、その中心
に３−ヒドロキシピリジニウム環を有する化合物の形を
取っている。３−ヒドロキシピリジニウム環中の環内窒
素は、リジンまたはヒドロキシリジンのε−アミノ基に
由来する（Fujimoto,1978;Robins,1982a;Gunja−Smith;
Ogawa;Eyre）。

尿中に見出されるピリジニウム架橋化合物は、４つの
一般的なクラスに分類される：（１）約400ダルトンの
分子量を有す天然型遊離架橋物（Fujimoto）、（２）約
550ダルトンと1,000ダルトンとの間の分子量を有すグリ
コシル化架橋物および架橋物ペプチド形（Robins,198
3）、（３）1,000ダルトンと3,500ダルトンとの間の分
子量を有する架橋物ペプチド形（Robins,1983,1984,198
7;Henkel;Eyre）、および（４）3,500ダルトンより大き
い分子量を有する架橋物ペプチド形。正常な成人におい
て、これらの形は、尿の全架橋物の約38％（１）、40％
（２）、15％（３）、および７％（４）の割合を占める
（Daniloff）。正常な成人の尿において、遊離の架橋物
の約80％はピリジノリン（またはPyd）であり、その環
内窒素はヒドロキシリジン残基に由来している。そして
遊離の架橋物の約20％は、デオキシピリジノリン（また
はDpd）であり、その環内窒素はリジン残基に由来して
いる。このPyd/Dpdの割合は、尿中の架橋物のうち他の
３つのクラスに大体当てはまる。より大きな分子量の架
橋物は、酸加水分解により遊離の架橋物に変換され得る
（Fujimoto,1978）。

尿中のピリジニウム架橋物の測定方法が提案された。
これらの方法のうちの１つは、HPLCにより分離される加
水分解されたPydのピークを定量することにより、加水
分解された全Pyd、すなわち、尿中の架橋物の広範な加
水分解により生成されるPydを測定することを含む（Fuj
imoto,1983）。加水分解された全Pydと年齢との間の関
係は、加水分解された全Pyd/クレアチニンの比として、
これらの研究者により決定された。そこでは、クレアチ
ンレベルは、尿の濃度および骨格量に対する架橋物のレ
ベルを標準化するのに用いられる。この比率は子供の尿
では高く、そして成人期を通して相対的に一定であり、
老齢期ではわずかに増加する。このことは、老齢期にお
いて観察される骨量の損失に対応すると推測される。

慢性関節リウマチの患者の加水分解された尿中の全架
橋物のレベルの上昇に関する研究は、この疾患の診断方
法として示唆された（Black,1989）。慢性関節リウマチ
の患者の加水分解された全架橋物のレベル（クレアチニ
ンに対する、HPLCにより測定された全架橋物の比として
表される）は、コントロールと比較して、第５因子によ
り上昇した。しかし、加水分解された全Dpdではなく、
加水分解された全Pydのみが、測定可能な増加を示し
た。

加水分解された尿を用いたより広範な研究において、
Seibelらは、排泄物において、慢性関節リウマチおよび
変形性関節症の両方におけるコントロールに対して、骨
特異性の加水分解された全Pydおよび全Dpdの架橋物の顕
著な増加を示した。加水分解された全Pydの最も顕著な
増加は、慢性関節リウマチの患者に見られた（Seibe
l）。

Patersonら（Br.J Cancer（1991）64:884−886）は、
加水分解された尿中で測定された加水分解された全Pyd
およびDpdが、骨に対する転移性癌の広がりを検出する
のに有用であり得ることを報告している。

加水分解されたサンプルから架橋物をHPLC定量するこ
とを包含するアッセイ法（ここで示したアッセイ法のよ
うな）は、実施するのに比較的時間と費用がかかり、そ
して骨代謝障害の治療の広範囲なスクリーニングまたは
モニタリングに対しては実用的ではない。

イムノアッセイはまた、尿の架橋物の測定に対して提
案される。米国特許第4,973,666号および同第5,140,103
号および国際特許出願番号WO 91/08478は、骨コラーゲ
ンに関連する特定のペプチド連結ピリジニウム種を尿中
に検出することによって、骨吸収を測定するアッセイを
開示している。これらは、パジェット病、すなわち高い
割合で骨の形成および破壊が起こることが知られている
病気にかかっている患者の尿から得られる。このアッセ
イは、特異的なペプチド断片または伸長部を含む架橋化
合物と、架橋物ペプチドに対して調製された抗体との免
疫特異的結合に依存する。アッセイされる架橋物ペプチ
ドの濃度が尿の全架橋物に関係しているのかどうか、そ
してどのように関係しているのかは、明らかでない。

Robinsは、加水分解されたPydに特異的な抗体を使用
することによって、尿中のピリジノリンを測定する技術
を記載した（Robins,1986）。この方法は、抗体が、Pyd
の加水分解された形に特異的であることが見出されたと
いう限界を有し、試験される尿サンプルが加水分解条件
下で最初に処理されることを必要とする。加水分解処理
は、アッセイの時間および費用を増加させ、そして他の
天然型ピリジニウム架橋物の測定を予め除外する。

PCT国際公開第WO 91/10141号は、加水分解されていな
い尿サンプル中の天然型でペプチド遊離のピリジノリン
またはデオキシピリジノリンのレベルを測定することに
よって、ヒト被験体における骨コラーゲン分解を評価す
る方法を開示している。この方法は、尿サンプルの分析
に基づく初期の方法より改良されている。なぜなら、こ
の方法は、以前用いられていた加水分解によるサンプル
の前処理を省いているからである。

血液流体サンプル中のピリジニウム架橋物種のレベル
を測定することによって、ヒト被験体における骨コラー
ゲン分解のレベルをアッセイすることが望ましい。この
ようなアッセイは、種々の血清分析物をアッセイするよ
うに設計された自動臨床分析システムに統合され得る。
この方法はまた、例えば、デオキシピリジノリン／クレ
アチニンの比を決定することによって、サンプル容量の
変化に対して、測定されたレベルを補正する必要がない
という利点を有する。

4.発明の要旨 本発明は、１つの局面において、ヒト被験体における
骨吸収障害の存在をスクリーニングする方法を包含す
る。この方法では、血液流体サンプルを被験体から得、
そして抗体と反応させて、抗体とサンプル中のこのよう
なピリジニウム架橋物との間で免疫複合体を形成する。
この抗体は、天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デオ
キシピリジノリン、または天然型遊離のピリジノリンお
よびデオキシピリジノリンの両方からなる群から選択さ
れるピリジニウム架橋物と免疫特異的に反応可能であ
る。形成された免疫複合体の量を測定して、サンプル中
の選択されたピリジニウム架橋物の濃度を決定した。決
定された濃度が、（ｉ）5nMの天然型遊離ピリジノリ
ン、（ii）1nMの天然型遊離デオキシピリジノリン、ま
たは（ii）6nMの天然型遊離のピリジノリンとデオキシ
ピリジノリンとの複合物、より上である場合、被験体
は、このような骨吸収障害を有することを示す。血液流
体サンプルは、例えば、血清または血漿であり得る。

この方法によりスクリーニングされる骨吸収障害は、
尿中の加水分解されたピリジノリン架橋物のレベルの上
昇を特徴とする障害を包含する。

この方法における抗体は、モノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体であり得、そして好ましくは選択さ
れたピリジニウム架橋物に関して少なくとも５×10⁷/M
の結合定数を有する。

１つの実施態様では、この方法において用いられる抗
体は、選択されたピリジニウム架橋物と、分子量が1,00
0ダルトンより大きい尿のピリジニウムペプチドとに対
して、約5:1より大きい反応比を有する。関連する実施
態様では、抗体は、選択されたピリジニウム架橋物と、
分子量が1,000ダルトンより大きい尿のピリジニウムペ
プチドとに対して、約10:1より大きい、そしてより好ま
しくは20:1より大きい反応比を有する。

特定の実施態様では、抗体は、天然型遊離ピリジノリ
ンに特異的であり、そして天然型遊離ピリジノリンと天
然型遊離デオキシピリジノリンとに対して、約5:1より
大きい反応比を有する。第二の実施態様では、モノクロ
ーナル抗体は、天然型遊離デオキシピリジノリンに特異
的であり、そして天然型遊離デオキシピリジノリンと天
然型遊離ピリジノリンとに対して、約25:1より大きい反
応比を有する。別の実施態様では、モノクローナル抗体
は、天然型遊離ピリジノリンおよび天然型遊離デオキシ
ピリジノリンの両方に特異的であり、そして天然型遊離
ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリンとに対
して、約2:1と1:2との間の反応比を有する。

さらに一般的には、天然型遊離ピリジノリンと天然型
遊離デオキシピリジノリンとに対する反応比は、5:1よ
り大きく、1:25より小さく、この間の全ての比率を含ん
でいる。

１つの好ましい実施態様では、サンプルは、抗体の存
在下で、選択されたピリジニウム架橋物でコーティング
された固体支持体と接触し、この固体支持体は、抗体に
結合するためのサンプル中のこのような選択された架橋
物と競合させるのに効果的である。抗体とサンプル中の
選択されたピリジニウム架橋物との間で形成された免疫
複合体の量は、固体支持体に結合した抗体の量を測定す
ることにより、間接的に測定される。

別の好ましい実施態様では、サンプルは、外因性のリ
ポーター標識された、またはリポーター標識可能な選択
されたピリジニウム架橋物の存在下で、選択された量の
ピリジニウム架橋物でコーティングされた固相支持体と
接触する。これは、サンプルからの選択されたピリジニ
ウム架橋物が、支持体上に固定された抗体に結合するた
めに、外因性の架橋物と競合する条件下で行われる。

この方法は、コラーゲン分解のレベルの上昇に関連す
る症状の治療をモニタリングするために用いられる。こ
れは、このような治療の間、選択されたピリジニウム架
橋物の濃度の変化をモニタリングすることにより行われ
る。

関連する局面では、本発明は、骨吸収速度に異常を有
する転移性症状へと進行する可能性を含む、または有す
るヒト癌の状態をモニタリングする方法を包含する。こ
の方法では、血液流体サンプルを被験体から得、そして
天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デオキシピリジノ
リン、または天然型遊離のピリジノリンおよびデオキシ
ピリジノリンの両方からなる群から選択されるピリジニ
ウム架橋物と免疫特異的に反応し得る抗体を反応して、
抗体とサンプル中のこのようなピリジニウム架橋物との
間で免疫複合体を形成する。形成される免疫複合体の量
を測定して、サンプル中の選択されたピリジニウム架橋
物の濃度を決定する。決定されたピリジニウム架橋物の
濃度が、（ｉ）5nMの天然型遊離ピリジノリン、（ii）1
nMの遊離デオキシピリジノリン、および（ii）6nMのピ
リジノリンとデオキシピリジノリンの複合物、より上で
ある場合、癌に関連する骨吸収速度の異常性（骨におけ
る転移の可能性を示唆している）が示される。

この方法は、癌の治療の間、選択されたピリジニウム
架橋物の濃度の変化をモニタリングすることによって、
コラーゲン分解を起こすことを特徴とする癌の治療をモ
ニタリングするために用いられ得る。

別の局面では、本発明は、ヒト被験体における骨コラ
ーゲン分解のレベルをアッセイする方法を包含する。こ
の方法では、血液流体サンプルを被験体から得、そして
天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デオキシピリジノ
リン、または天然型遊離のピリジノリンおよびデオキシ
ピリジノリンの両方からなる群から選択されるピリジニ
ウム架橋物と免疫特異的に反応し得る抗体と反応させ、
そしてここで抗体は、上記の選択された架橋物に対して
少なくとも10⁸/Mの結合定数を有し、その結果、抗体と
サンプル中のこのようなピリジニウム架橋物との間で免
疫複合体を形成する。形成された免疫複合体の量を測定
して、サンプル中の選択されたピリジニウム架橋物の濃
度を決定する。決定された濃度が、（ｉ）5nMの天然型
遊離ピリジノリン、（ii）1nMの天然型遊離デオキシピ
リジノリン、または（ii）6nMの天然型遊離のピリジノ
リンとデオキシピリジノリンとの複合物、より上である
場合、被験体は、このような骨吸収障害を有することが
示される。

上記の方法について、低い閾値が、骨分解のレベルの
上昇が見られる個体を同定する可能性を増大させるため
に用いら得ることが認められる−−例えば、天然型遊離
ピリジノリンを検出するためには、約3nMの値；天然型
遊離デオキシピリジノリンを検出するためには、約0.5n
Mの値、そして天然型遊離のピリジノリンおよびデオキ
シピリジノリンの複合濃度を検出するためには、約3.5n
Mの値が用いられ得る。

別の実施態様では、本発明は、上記の選択されたピリ
ジウム架橋物に関する少なくとも10⁸/Mの親和定数を有
する抗体を包含する。１つの実施態様では、抗体は、選
択されたピリジニウム架橋物と、分子量が1,000ダルト
ンより大きい尿のピリジニウムペプチドとに対して、約
3:1より大きい、そして好ましくは約5:1より大きい反応
比を有する。

別の局面では、本発明は、上記の方法に用いられる診
断キットを包含する。この方法は、上記のような抗体
と、血液流体サンプルからの選択されたピリジニウム架
橋物と抗体との反応により形成される免疫複合体の量を
検出するための検出手段とを包含する。

天然型遊離ピリジノリンを検出するためには、この方
法に用いられるキットは、好ましくは、少なくとも約1n
M、より好ましくは少なくとも0.5nMの血中ピリジノリン
濃度（「閾値濃度」）を検出するために効果的である。
天然型遊離デオキシピリジノリンを検出するためには、
キットは、好ましくは、少なくとも約0.1nM、より好ま
しくは少なくとも約0.05nMの血中デオキシピリジノリン
濃度を検出するために効果的である。ピリジノリンとデ
オキシピリジノリンとの複合濃度を検出するためには、
閾値濃度は、好ましくは1.1nM、より好ましくは0.6nMで
ある。

１つの実施態様では、このキットの検出感度は、選択
された範囲で選択されたピリジニウム架橋物の濃度の検
出を可能にする。その範囲は、例えば、ピリジノリンに
対して１〜10nM、またはデオキシピリジノリンに対して
0.1〜10nMである。

以下の発明の詳細な説明を添付の図と共に読むと、本
発明のこれらおよび他の目的および特徴は、さらに十分
に明らかになる。

図面の簡単な説明 図1A〜1Cは、本発明の１つの実施態様を実施する工程
を示す； 図２は、血液流体サンプル中のピリジノリン（Ｎ−Py
d）を検出するのに適した抗体の滴定曲線である； 図３は、血液流体サンプル中のデオキシピリジノリン
（Ｎ−Dpd）を検出するのに適した抗体の滴定曲線であ
る； 図４は、正常な被験体（コントロール）（第１欄）、
原発性上皮小体機能亢進症の患者（第２欄）、骨軟化症
の患者（第３欄）、カルシウム代謝障害の患者（第４
欄）、および骨粗鬆症の患者（第５欄）からの血清サン
プル中で測定されたＮ−Dpdの濃度を示す； 図５は、コントロールの健康な患者および癌患者にお
いて、本発明に従って測定された血清Pydの濃度を示
す。

発明の詳細な説明 I.定義 本明細書中で使用される以下の用語は、次の定義を有
する： 「Pyd」または「ピリジノリン」または「遊離ピリジ
ノリン」は、以下のＩで示される架橋物化合物を示し、
ここで、環内のＮは、ヒドロキシリジル残基のεアミノ
基に由来し、そして「Dpd」または「デオキシピリジノ
リン」または「遊離デオキシピリジノリン」は、以下の
IIで示される架橋物化合物を示し、ここで、環内の窒素
は、リジル残基のεアミノ基に由来する。

「遊離架橋物」は、化合物ＩまたはIIあるいは両者の
混合物のいずれかを示し、すなわち、これらは、ペプチ
ドまたはグリコシル基が全く結合していない。

「グリコシル化ピリジノリン」または「glyco−Pyd」
は、化合物Ｉのグリコシル化体を示し、ここで、グリコ
シル基は、Pydの脂肪族ヒドロキシル基に共有結合す
る。同定された２つのglyco−Pyd架橋物は、Gal−Pydお
よびGlc・Gal−Pydであり、これらは、それぞれ、以下
のIIIおよびIVで示されるアセタールを含む。

「Pyd−ペプチド」または「ピリジノリン−ペプチ
ド」は、化合物Ｉのペプチド誘導形を示し、ここで、こ
の化合物の３つのアミノ酸残基の１つまたはそれ以上
が、ペプチド結合を介して、さらなるアミノ酸残基に結
合している。同様に、「Dpd−ペプチド」または「デオ
キシピリジノリン−ペプチド」は、化合物IIのペプチド
誘導形を示し、ここで、この化合物の３つのアミノ酸残
基の１つまたはそれ以上が、ペプチド結合を介して、さ
らなるアミノ酸残基に結合している。

「ピリジニウム−ペプチド」は、Pyd−ペプチドおよ
びDpd−ペプチドの混合物を示す。

「1000ダルトンより大きい分子量を有するPyd−ペプ
チド」または「Pyd−ペプチド（MW＞1000）」は、1,000
の分子量にカットオフされた透析膜により保持されるPy
d−ペプチドを示す。

「Pyd架橋物」は、遊離形またはペプチド−誘導形の
いずれかの化合物Ｉを含むピリジニウム架橋物を示す。
Pyd架橋物は、Pyd、glyco−PydおよびPyd−ペプチドを
包含する。同様に、「Dpd架橋物」は、遊離形またはペ
プチド−誘導形のいずれかの化合物IIを含むピリジニウ
ム架橋物を示す。「Dpd架橋物」には、DpdおよびDpd−
ペプチドを包含する。

「ピリジニウム架橋物」は、遊離形および／またはペ
プチド結合形の化合物Ｉおよび／またはIIを含むピリジ
ニウム架橋物を示す。

「全Pyd」あるいは「Ｔ−Pyd」は、Pydに対するPyd架
橋物を加水分解することにより生成される加水分解され
た全Pydを示す。同様に、「全Dpd」あるいは「Ｔ−Dp
d」は、Dpdに対するDpd架橋物を加水分解することによ
り生成される加水分解された全Dpdを示す。

「加水分解されたPyd」あるいは「Ｈ−Pyd」は、6Nの
HCl中にて110℃で16時間Pyd架橋物を加水分解すること
により生成されるPydを示す。同様に、「加水分解され
たDpd」あるいは「Ｈ−Dpd」は、6NのHCl中にて110℃で
16時間Dpd架橋物を加水分解することにより生成されるD
pdを示す。

「天然型Pyd」あるいは「Ｎ−Pyd」は、加水分解の条
件を受けていないPydを示す。同様に、「天然型Dpd」あ
るいは「Ｎ−Dpd」は、加水分解の条件を受けていないD
pdを示す。

「天然型遊離」あるいは「天然型ペプチド遊離」は、
上記で示される構造ＩまたはII（あるいは両方）を有
し、加水分解の条件を受けていないピリジニウム化合物
を示す。

「血液流体」は、血液から得られる無細胞の液体およ
びその画分、例えば、血清あるいは血漿を示す。

「検出限界」は、ネガティブのサンプル（すなわち、
選択されたピリジニウム架橋物を欠いているサンプル）
と判別可能である選択されたピリジニウム架橋物の濃度
を示す。さらに詳細には、検出限界は、ネガティブのサ
ンプルで見られるシグナルと、少なくとも２標準偏差だ
け異なるシグナルを生じる選択されたピリジニウム架橋
物の選択された濃度である。従って、約0.05nMの天然型
遊離デオキシピリジノリンの検出限界は、少なくとも0.
05nMの天然型遊離デオキシピリジノリンの濃度を検出す
る能力を意味する。実際の検出限界は、規定の限界より
低い。例えば、本実施例において、0.05nMの規定の検出
限界のアッセイは、0.02nMの実際の検出限界を有し得
る。

「検出感度」は、特定のアッセイの手順により確実に
測定され得る分析物の濃度の範囲を示す。従って、0.1
〜10nMの範囲で天然型遊離ピリジノリンの濃度を検出し
得る検出感度は、アッセイの手順が、0.1nMの分析物の
濃度を検出し得、そして0.1〜10nMの範囲で分析物の濃
度の差を検出し得ることを意味する。このアッセイの実
際の検出範囲は、規定の範囲より広い。例えば、本実施
例において、0.1〜10nMの範囲での検出感度を有すアッ
セイ法は、0.05〜20nMの範囲で分析物の濃度を検出し、
そして判別し得る。

II.抗体試薬の調製 このセクションでは、選択された天然型遊離ピリジニ
ウム架橋物（Ｎ−Pyd、Ｎ−Dpdのいずれか、または両
方）に特異的であるモノクローナルおよびポリクローナ
ル抗体（「抗体試薬」）の生産を述べる。１つの実施態
様では、抗体は、選択された天然型遊離ピリジニウム架
橋物と、分子量が1,000ダルトンより大きい尿のピリジ
ニウムペプチドとに対して、約3:1より大きい、そして
好ましくは約5:1より大きい反応比を有する。

この抗体が天然型遊離ピリジノリンを結合するための
ものである特定の実施態様では、抗体は、好ましくは、
天然型遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノ
リンとに対して、約5:1より大きい、好ましくは約20:1
より大きい、そしてより好ましくは約100:1より大きい
反応比を有する。

この抗体が天然型遊離デオキシピリジノリンを結合す
るためのものである別の特定の実施態様では、抗体は、
好ましくは、天然型遊離デオキシピリジノリンと天然型
遊離ピリジノリンとに対して、約5:1より大きい、好ま
しくは約25:1より大きい、そしてより好ましくは約100:
1より大きい反応比を有する。

この抗体が天然型遊離ピリジノリンおよび天然型遊離
デオキシピリジノリンの両方を結合するためのものであ
る第三の特定の実施態様では、抗体は、好ましくは、天
然型遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリ
ンとに対して、約2:1と1:2との間の反応比を有する。

本発明の抗体試薬は、好ましくは、選択されたピリジ
ニウム種（Ｎ−PydまたはＮ−Dpd）に対する約５×10⁷/
Mより大きい結合親和定数を有する。

A.免疫原 抗体試薬の生産に用いられる免疫原は、担体分子、す
なわち典型的には、キーホールリンペットヘモシアニン
（KLH）のような担体タンパク質と結合したDpdまたはPy
dである。

Pydは、天然型Pyd（Ｎ−Pyd）または加水分解されたP
yd（Ｈ−Pyd）であり得る。同様に、Dpdは、天然型Dpd
（Ｎ−Dpd）または加水分解されたDpd（Ｈ−Dpd）であ
り得る。Ｎ−DpdまたはＮ−Pydを得るためには、尿中の
他のピリジニウム化合物からのＮ−DpdまたはＮ−Pydの
粗分離は、実施例２に記載されるように、尿の分画によ
り行われ得る。簡単に言えば、尿の濃縮物をSephadex
Ｇ−10カラムにかけ、そして全ピリジニウムを含有する
画分を溶出する。次いで、溶出液を、クエン酸ナトリウ
ムで平衡化したホスホセルロースのカラムにかけ、そし
て塩で溶出させて単一ピークの遊離架橋物を得る。この
サンプルは、加水分解の条件を受けていないので、ピー
クは、Ｎ−DpdおよびＮ−Pydの形態（「遊離架橋物」）
だけでなく、上記のGal−PydおよびGlc−Gal−Pydを包
含するglyco−Pydも含む。次いで、さらなる精製は、標
準的な方法、例えば、スルホン化ポリスチレンビーズ上
でのイオン交換またはHPLCを用いることによって都合良
く行われる。この分離のための典型的なプロトコルは、
例えば、Blackら、1988、Seibelら、1989に見られ、そ
して実施例２において詳述されている。

あるいは、例えば、Blackら、1988に記載のように、
加水分解されたPydまたはDpdは、骨コラーゲンまたは尿
中のピリジニウム架橋物の酸加水分解により生成され、
精製される。

PydまたはDpdの担体タンパク質へのカップリングは、
典型的には、二官能性カップリング剤を用いて、標準的
なカップリング法により行われる。この二官能性のカッ
プリング剤は、標準的な方法に従って、一方のカップリ
ング末端にてPydまたはDpdの遊離カルボキシル基の１つ
とアミド結合を形成し、他方のカップリング末端にて担
体タンパク質とアミド結合またはエステル結合またはジ
スルフィド結合を形成する。

あるいは、好ましい実施態様では、PydまたはDpdは、
例えば、EDC（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−
３−エチルカルボジイミド）のような水溶性カルボキシ
ル活性化剤の存在下で、さらに公知の方法に従って、タ
ンパク質に直接カップリングされ得る。後者の方法は実
施例３において説明され、この実施例３は、EDC活性化
によるキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）へのD
pdのカップリングを記載している。担体タンパク質をペ
プチド抗原で誘導するための一般的なカップリング反応
は、Harlow（1988）、pp.77−87、およびWong（1991）
に示される。

B.モノクローナル抗体試薬 モノクローナル抗体試薬を調製するために、上記の免
疫原が、マウスのような動物を免疫化するために用いら
れる。抗原特異的リンパ球が不朽化のためにその動物か
ら得られ得る。適切と認められたある種の動物は、Jack
son Laboratory（Bar Harbor,MN）から入手可能な「自
己免疫」MRL/MpJ−lprマウスである。

Ｎ−Pydに特異的な抗体が望まれるところに、Pyd免疫
原が典型的に用いられる。同様に、Ｎ−Dpdに特異的な
抗体が望まれるところに、Dpd免疫原が典型的に用いら
れる。PydおよびDpdの両方を認識する抗体は、Pyd免疫
原またはDpd免疫原を用いて得られ得る。

B.1 Ｎ−Pydモノクローナル抗体。Ｎ−Pydに特異的
なモノクローナル抗体試薬を生産するために、実施例４
で概説されるように、マウスは、Ｈ−Pyd−KLH免疫原の
一連の注射を用いて免疫化され得る。初期免疫化して約
８週間後、脾臓細胞が採取され、そしてP3X63Ag8.653ミ
エローマ細胞系と融合される。うまくいった融合産物の
選択は、公表された方法（一般的に、Harlow,pp.196−2
12を参照のこと）により、調整されたＳ−DMEM培地中の
HATにおいて行われ得る。次いで、うまくいった融合産
物は、実施例８に記載のイムノアッセイ形式と同様の競
合性イムノアッセイ形式を用いて、Ｎ−Pydとの免疫反
応性についてスクリーニングされる。Ｎ−Pydとの高い
結合親和性を示す細胞系は、限界希釈によりサブクロー
ニングされ、そしてＮ−Pydに対して高い結合親和性を
有する抗体の産生に対してさらにスクリーニングされ
る。上記の手順により得られ、そしてＮ−Pydに対して
高い抗体親和性を有するサブクローニングされたある種
の細胞系は、本明細書中では、Mab−XXV−3G6−3B11−1
A10と名付けられた。この細胞系のサンプルは、America
n Type Culture Collection、12301 Parklawn Dr.、Roc
kville MD 20852）に寄託され、そしてATCC番号HB11089
として受託された。

抗体試薬を生産するために、ハイブリドーマ細胞系
は、以下の材料および方法のセクションに記載されるよ
うに追加されたDulbecco改変Eagle培地（DMEM）のよう
な適切な培地（Harlow,pp.247−270）中で増殖させられ
る。モノクローナル抗体（「Mabs」）は、公表された方
法（Harlow pp.271−318）により、培地から採取され、
濃縮され、そして保存され得る。

上記のように、本発明の重要な特徴は、尿中のより大
きな分子量のピリジニウム架橋物に比較してのＮ−Dpd
およびＮ−Pydの抗体試薬の特異性である。Ｎ−Pyd、Ｎ
−Dpd、および他の尿のピリジニウム架橋物の抗体試薬
の相対的特異性が、実施例10に詳述されるように、Ｎ−
Pydに対する競合性結合アッセイにより決定され得る。

簡単に言えば、種々の精製された架橋物サンプル（Ｎ
−PydおよびＮ−Dpd、ならびに等モル（各150μＭ）の2
0種の一般アミノ酸を含有するアミノ酸混合物を含む）
は、Ｎ−Pydを結合している固相支持体上で抗体試薬の
限定量と反応する。この反応は、サンプル中のピリジニ
ウム架橋物が、抗体と結合するために、支持体に結合し
たＮ−Pydと競合する条件下で行なわれる。固体支持体
への抗体の結合程度は、抗体試薬に対するサンプルの架
橋物の相対的反応性の評価基準を提供する。

実施例10で概説される手順に従って、Ｎ−Pyd、Ｎ−D
pd、Pydペプチド（MW＞1,000）、およびアミノ酸混合物
（20種の一般アミノ酸の各150μＭ）と、細胞系Pyd XXV
−3G6−3B11−1A10からのモノクローナル抗体との結合
レベルが試験された。各サンプルの見かけのPyd濃度
が、精製されたＮ−Pydを用いて作成した検量線を用い
て決定された。各サンプルの反応性％は、全Ｈ−Pydに
ついてHPLCにより決定されたサンプル中の全Pyd架橋物
濃度に対しての（×100）、あるいはＮ−Dpdサンプルの
場合には、全Ｈ−DpdについてHPLCにより決定された全D
pd架橋物濃度に対しての（×100）、見かけの濃度（上
記のＮ−Pyd検量線を用いて測定される）の比として計
算された。結果を表１に示し、ここで、Ｎ−Pydとの反
応性を100％と定義した。

示されるように、モノクローナル抗体試薬は、Ｎ−Dp
dに比較してＮ−Pydに対する高い選択性を有し、天然型
遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリンと
に対して、約3:1より大きい、そしてこの場合には5:1よ
り大きい反応比を示す。この試薬はまた、試験されたピ
リジニウム−ペプチド形（全Pyd含有量を定量する）よ
りもＮ−Pydに対して選択的であり、分子量が1,000ダル
トンより大きいピリジノリンペプチドに対して、約100:
1より大きい反応比を示す。さらに、この試薬は、試験
されたアミノ酸混合物と最小の交差反応性（＜１％）を
示す。

さらに一般的には、Ｎ−Pydに対して特異的なMab試薬
は、天然型遊離ピリジノリン（Ｎ−Pyd）とPyd−ペプチ
ド（MW＞1000）とに対して、上記のアッセイにより測定
されるように、5:1より大きい、好ましくは10:1より大
きい、より好ましくは25:1より大きい、そしてこの場合
には、100:1より大きい反応性を有する。

B.2 Ｎ−Dpdモノクローナル抗体。Ｎ−Dpdに対して
特異的なモノクローナル抗体試薬を生産するために、Ｎ
−Pyd Mabを得る上記の手順が用いられ得（但し、Dpd−
KLHを免疫原として用いることを除く）、そして免疫応
答スクリーニングがＮ−Dpdに対するアッセイで行われ
る。この手順により１つのサブクローニングした細胞系
を得、そしてＮ−Dpdに対して高い抗体親和性を与える
この細胞系は、本明細書中でMab−Dpd−II−7B6−1F4−
1H11と呼ばれる（実施例５を参照のこと）。

抗体試薬は、Ｎ−Pyd Mabに関する上記と同様の一般
的な手順により、ハイブリドーマ細胞系から調整され、
そして保存される。

Ｎ−Dpd、Ｎ−Pyd、および他の尿のピリジニウム架橋
物に対する抗体試薬の相対的な特異性は、上記の方法
（セクションB.1）により決定され得るが、しかしＮ−D
pdを結合させた固相支持体を用いる。

実施例10で概説した手順に従って、Ｎ−Dpd、Ｎ−Py
d、Dpdペプチド（MW＞1,000）、およびアミノ酸混合物
（20種の一般アミノ酸の各150μＭ）のモノクローナル
抗体（細胞系Mab−Dpd−II−7B6−1F4−1H11由来）への
結合レベルを試験した。各サンプルの見かけのDpd濃度
が、精製されＮ−Dpdを用いて作成した検量線を用いて
決定された。各サンプルの反応性％は、全Ｈ−Dpdにつ
いてHPLCにより決定されたサンプル中の全Dpd架橋物濃
度に対しての（×100）、あるいはＮ−Pydサンプルの場
合には、全Ｈ−PydについてHPLCにより決定された全Pyd
架橋物濃度に対しての（×100）、見かけのＮ−Dpd濃度
（上記のＮ−Dpd検量線を用いて測定される）の比とし
て計算された。結果を表２に示し、ここで、Ｎ−Dpdの
反応性を100％と定義した。

示されるように、モノクローナル抗体試薬は、Ｎ−Py
dに比較してＮ−Dpdに対する高い選択性を有し、天然型
遊離デオキシピリジノリンと天然型遊離ピリジノリンと
に対して、約100:1より大きい反応比を示す。この試薬
はまた、試験されたピリジニウム−ペプチド形（Dpd含
有量を定量する）よりもＮ−Dpdに対して選択的であ
り、分子量が1,000ダルトンより大きいデオキシピリジ
ノリンペプチドに対して、約3:1より大きい、そして好
ましくは約5:1より大きい反応比を示す。さらに、試薬
は、試験されたアミノ酸混合物と最小の交差反応（＜１
％）を示す。

さらに一般的に、Dpdに対して特異的なMab試薬は、天
然ピリジノリン（Ｎ−Dpd）およびDpdペプチド（MW＞10
00）に対して、上記のアッセイにより測定されたよう
に、約5:1より大きい、好ましくは10:1より大きい、さ
らに好ましくは25:1より大きい、そしてこの場合では、
100:1より大きい反応性を有する。

B.3 ほぼ同等の親和性を有するＮ−PydおよびＮ−Dp
dを結合させるモノクローナル抗体。ほぼ同等の親和性
を有するＮ−PydおよびＮ−Dpdを結合させるモノクロー
ナル抗体試薬を生産するために、Ｎ−Pyd MabおよびＮ
−Dpd Mabを得る上記の手順が用いられ得る。免疫原
は、Pyd−KLHまたはDpd−KLHであり得、そして免疫応答
スクリーニングがＮ−PydおよびＮ−Dpdに対する別々の
アッセイで行われる。上記手順により、Ｈ−Dpd−KLHを
免疫原として用いて、１つのサブクローニングされた細
胞系を得、そしてＮ−DpdおよびＮ−Pydの両方に対して
高い抗体親和性を与えるこの細胞系は、本明細書中でMa
b Pyd/Dpd−Ｖ−6H2−2H4−1E4と呼ばれる（実施例６を
参照のこと）。

抗体試薬は、Ｎ−Pyd Mabに関する上記と同様の一般
的な手順により、ハイブリドーマ細胞系から調整され、
そして保存される。

Ｎ−Dpd、Ｎ−Pyd、および他の尿のピリジニウム架橋
物に対する抗体試薬の相対的な特異性は、上記の手順
（セクションB.1およびB.2）により決定され得る。この
場合では、Pyd/Dpd−Ｖ−6H2−2H4−1E4細胞系を用いて
生産される抗体について、各サンプルの反応性％は、全
Ｈ−DpdについてHPLCにより決定されたサンプル中の全D
pd架橋物濃度に対しての（×100）、あるいはＮ−Pydサ
ンプルの場合には、全Ｈ−PydについてHPLCにより決定
された全Pyd架橋物濃度に対しての（×100）、見かけの
Ｎ−Dpd濃度（上記のＮ−Dpd検量線を用いて測定され
る）の比として計算された。結果を表３に示し、ここ
で、Ｎ−Dpdの反応性を100％と定義した。

示されるように、モノクローナル抗体試薬は、1:1に
近い交差反応比で、ほぼ同等の親和性を有するＮ−Dpd
およびＮ−Pydを認識する。この試薬はまた、試験され
たピリジニウム−ペプチド形（PydおよびDpdペプチドの
両方）よりもＮ−Dpdに対して選択的であり、分子量が
1,000ダルトンより大きいピリジニウムペプチドに対し
て、約3:1より大きい、そしてこの場合では、9:1より大
きい反応比を示す。さらに、試薬は、試験されたアミノ
酸混合物と最小の交差反応性（５％）を示す。

さらに一般的に、Pyd/Dpd特異性Mab試薬は、天然型遊
離ピリジノリン（Ｎ−Pyd）および天然型遊離デオキシ
ピリジノリン（Ｎ−Dpd）に対して、約2:1および1:2の
間の反応性を有する。

C.ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体の調製は従来技術により行われ、
その従来技術は、当該技術分野で公知の免疫学的プロト
コル、例えば、Harlow、pp.93−115に従って、ウサギま
たはマウスのような適切な哺乳動物の被験体に免疫原を
注射することを包含する。典型的には、ウサギにアジュ
バントに入れた免疫原を皮下注射し、そしてブースター
免疫を２〜３週間毎に皮下または筋肉注射により行う；
マウスには同様のスケジュールに従って腹腔内注射し得
る。血液は、時々、例えば各免疫化注射の１〜２週間後
に採取される。抗血清を滴定し、標準免疫沈降法（Harl
ow,pp.423−470）により、Ｎ−PydまたはＮ−Dpdに関し
て抗体形成を決定し得る。ウサギにおけるポリクローナ
ル抗体を生産するための１つの方法を、実施例11で詳細
に述べる。

ポリクローナル抗血清に対する結合親和性定数を公知
の方法（例えば、免疫沈降法またはELISAアッセイを用
いたスキャッチャード（Scatchard）分析による;Campbe
ll,Segelを参照のこと）により決定し得、そして選択さ
れたピリジニウム種に対して特異的な抗血清中の抗体の
結合親和性定数の平均を示す。ウサギVI−８から得たポ
リクローナル抗体は、スキャッチャード分析により決定
したように、約１×10⁸のＮ−Pydに対する結合定数を有
する。

選択されたピリジニウム種および他のピリジニウム架
橋物に対する抗体試薬の相対的な結合特異性は、上記お
よび実施例14に詳述するように、競合性結合アッセイに
より決定され得る。表４は、ウサギVI−８から得た抗Py
d抗血清の相対的な結合特異性を示し、ここで、Ｎ−Pyd
との反応性を100％と定義する。

示されるように、抗体試薬は、Ｎ−Pydに対して特異
的であり、Ｎ−Dpdとは10％未満の交差反応性、Pydペプ
チド（MW＞1000）とは５％未満の交差反応性、そしてア
ミノ酸混合物とは中程度（〜12％）の交差反応性である
ことを示す。本発明の１つの局面に従って、ポリクロー
ナル抗体試薬は、選択した天然型遊離ピリジニウム種
（Ｎ−Pyd、Ｎ−Dpd、または両方）および分子量が1,00
0ダルトンより大きい尿のピリジニウムペプチドに対し
て、上記の抗原−競合アッセイにより測定されるよう
に、3:1より大きい、そして好ましくは約5:1より大きい
反応性を有する。

III.イムノアッセイキット 別の局面では、本発明は、ヒト被験体での骨コラーゲ
ン分解レベルのアッセイで使用するための診断キットを
包含する。このキットは、上記のセクションに記載した
タイプの抗体試薬を含み、それは、天然型遊離デオキシ
ピリジノリンに対して好ましくは約５×10⁷/Mより大き
い、そしてさらに好ましくは８×10⁸/Mより大きい結合
定数を有する。このキットはまた、抗体試薬と選択され
たピリジニウム架橋物との反応により形成される免疫複
合体の量を検出するための検出手段を含み、この検出手
段は、血液流体サンプル中の選択された架橋物のレベル
の測定に効果的である。

説明の目的のために、サンプル中でのＮ−Pyd測定に
ついてのこのようなキットの特定の実施態様を図1A〜1C
中の10で示す。キットの固相支持体12は、結合剤が吸着
され得るか、または化学的に結合され得る表面を有す
る。化学的に誘導可能な基またはタンパク質吸着に効果
のある表面を有する、種々のガラスおよびポリマー樹脂
の支持体が利用可能である。１つの好ましい実施態様で
は、キットは、96アッセイウェルのマイクロタイタープ
レートを提供し、そこでウェルの表面は、キット中で固
相支持体表面を形成する。

キット10中の結合剤は、Ｎ−Pydであり、図中ではPyd
（Ｎ）分子により16で示される。この結合剤は、固相
（この場合、96ウェルマイクロタイタープレートの各ウ
ェル）に、最初にブタ血清アルブミン−ビオチン複合体
（図1A中の複合体18）をウェル表面に吸着させ、そして
次に、Ｎ−Pyd−ストレプトアビジン複合体（複合体2
0）を吸着されたビオチンに結合させることにより、結
合される。

このキット中の抗体試薬は、図1Bおよび1C中の22で示
され、そして上記セクションに記載のポリクローナルま
たはモノクローナル試薬を包含する。図1Bに示されると
おり、サンプル中のピリジニウム架橋物（26で示される
Ｎ−Pyd架橋物）は、抗体試薬と結合するための表面結
合したＮ−Pydと競合する。抗体試薬とサンプル架橋物
との反応により形成される免疫複合体は、この図の28で
示される。

このキット中の検出試薬（検出手段）は、リポーター
標識二次抗体であり、図1C中の24で示され、固体支持体
に結合したＮ−Pydにそれ自身結合する抗体試薬との結
合が効果的である。リポーター標識した抗体（酵素標識
抗体のような）は、市販されているか、またはすでに種
々のリポーター部分について容易に構成される（Harlo
w,pp.319−358）。酵素標識した抗体での１つの好まし
い酵素は、アルカリホスファターゼであり、これは、ｐ
−ニトロフェニルホスフェート基質と反応し、405nmで
強い吸収ピークを有する有色の産物を生産し得る。

リポーター標識二次抗体は、典型的には、抗IgG抗体
（抗ウサギIgG抗体または抗マウスIgG抗体のような）で
ある。抗ウサギIgG抗体では、キット中のポリクローナ
ル抗体試薬が、免疫したウサギから得られる。抗マウス
IgG抗体では、抗体試薬がマウスモノクローナル抗体で
ある。ここで、抗体試薬（上記のようにＮ−Pydと免疫
反応する）は、「リポーター標識可能」である。それ
は、抗体試薬がリポーター標識二次抗体との反応により
標識され得るためである。リポーター標識可能な抗体試
薬の他の例は、ビオチンまたはストレプトアビジンで標
識した抗体を包含し、それは検出目的のために、リポー
ター標識したストレプトアビジンまたはビオチン標識し
た相手と反応し得る。

別の実施態様では、検出試薬は、酵素のようなリポー
ターで標識された抗Pyd抗体試薬それ自身であり得る。

このキット中の検出手段はまた、リポーター標識抗体
中のリポーターの検出のために必要とされる必要な基質
などを含む。

別のキットの実施態様では、支持体に結合される結合
剤は、セクションIIに記載したような抗Pyd抗体試薬で
ある。抗体は、種々の公知の方法により固体支持体に結
合され得る。これらの公知の方法は、標準的な方法に従
って、化学的誘導体化、または支持体結合プロテインＡ
または抗IgG抗体による抗体の高親和性結合を包含す
る。このキットは、ピリジノリン試薬をさらに含み得、
それは、支持体上の抗体試薬への結合について、サンプ
ル中の天然型遊離ピリジノリンとの競合に効果的であ
る。検出目的のために、ピリジノリン試薬は、ピリジノ
リンに共有結合したリポーター標識を含み得る（すなわ
ち、試薬は、リポーター標識ピリジノリンであり得
る）。この形式を有する模範的なキットの調製および使
用を実施例11〜13で説明する。

あるいは、ピリジノリン試薬は、リポーター標識可能
であり、すなわちピリジノリン試薬は、例えば、対応す
るリポーター標識ストレプトアビジンまたはビオチン分
子による認識のために、ビオチンまたはストレプトアビ
ジンのような薬剤と複合体化したPydを包含する。

別の一般的な実施態様では、このキットは、サンプル
のピリジノリンが溶液中で直接的に検出され得るような
均一のアッセイのために設計される。

本発明のキットが多くの他のアッセイ形式に適応され
得ることは認識され得る。他のアッセイは、例えば、放
射性トレーサー、結合カップリング酵素、蛍光、化学発
光、またはEMIT配置（Gosling）に基づく形式を包含す
る。

従って、別の好ましい実施態様では、このキット中の
検出手段は、放射活性リポーター基を含み、これは抗体
試薬と天然型遊離Pydとの反応により形成される免疫複
合体の量に比例して放射活性シグナルを生産するのに効
果的である。

このキットは、Ｎ−Pydのアッセイに関して上記で説
明しているが、このキットが、Ｎ−Dpdに特異的な抗体
試薬を用いてＮ−Dpdを測定するのに用いられるか、ま
たはほぼ同等の親和性を有するＮ−PydおよびＮ−Dpdを
結合させる抗体試薬を用いてＮ−PydおよびＮ−Dpdの合
計を測定するのに用いられる場合に、同様の形式が用い
られ得ることが、認識され得る。

Ｎ−Pydの検出について、このキットは、1nMまたはそ
れ未満、好ましくは0.5nM、そしてさらに好ましくは0.2
nMのＮ−Pydについての検出限界を有する。図２は、実
施例13に記載したイムノアッセイ形式で行ったＮ−Pyd
の滴定曲線を示し、これは表４で特徴付けられたウサギ
VI−８から得たポリクローナル抗血清を用いた。この図
からわかるように、このキットは、約0.2nMの感度を提
供し、一方で、10nMを越える範囲のＮ−Pydの信頼性の
ある測定も提供する。

Ｎ−Dpdの検出について、このキットは、好ましくは
0.1nMまたはそれ未満、好ましくは0.05nM、そしてさら
に好ましくは0.02nMのＮ−Dpdについての検出限界を有
する。図３は、実施例９に記載したイムノアッセイ形式
で行ったＮ−Dpdの滴定曲線を示し、これは上記のハイ
ブリドーマ細胞系13D4から得たモノクローナル抗体を用
いた。この図からわかるように、このキットは、約0.02
〜0.05nMの検出限界を提供し、一方で、約10nMまでの範
囲のＮ−Dpdの信頼性のある測定も提供する。

このキットの検出限界は、このアッセイにおいて、正
常を上回ると考えられる範囲でのピリジニウム架橋物レ
ベルだけを検出し、一方で、一般に正常とされるレベル
の中に含まれるピリジニウム架橋物レベルが、検出され
ないように、選択され得ることが認識される。

IV.イムノアッセイ法 本発明は、「発明の要旨」と題した上記のセクション
で概説したように、ヒト被験体の骨コラーゲンの損傷レ
ベルをアッセイする方法を提供する。

血液流体サンプルを、サンプルのアッセイに先立っ
て、好ましくは前処理して干渉する可能性のある物質を
除く。このような前処理は、トリクロロ酢酸沈澱により
達成され得、ここで、このサンプルは、50％のトリクロ
ロ酢酸と10:1で混合し、次いで遠心分離して沈澱を取り
除く。あるいは、このサンプルをプロテインＡカラムを
通すかまたはStaphylococcus aureusの細胞（例えば、P
ANSORBIN細胞、Calbiochem,San Diego,CAより入手可
能）と接触させて免疫グロブリンなどを除く。好ましい
前処理の工程においては、サンプルを濾過して、約30kD
aより大きい分子量を有するサンプルの成分を除く。こ
のような濾過は、Centricon−30濾過装置（Amicon,Mas
s）を用いる遠心分離により達成され得る。

上記セクションIIIで示したように、サンプルと抗体
試薬との反応は、種々の構成を用いて固相形式で行われ
得、あるいは、均一アッセイ形式で行われ得る。

実例となる目的のため、イムノアッセイ法を、実施例
９に従って、特に血清中の天然型遊離デオキシピリジノ
リンをアッセイするためのアッセイ形式に関して記載す
る。ここで、固体支持体は、表面に付着した抗Dpd抗
体、および支持体に結合した抗Dpd抗体に結合するため
にサンプル由来の天然型遊離デオキシピリジノリンと競
合し得る細胞外酵素で標識したデオキシピリジノリンを
有する。本方法は他の固相または均一アッセイ形式にど
のように適応させられ得るかは認識され得る。

本方法の典型的な実施態様では、既知の容量、例えば
100μｌ、の濾過されたまたは沈澱した血清サンプル
を、抗Dpd抗体でコーティングした固体支持体、例え
ば、実施例８で調製したようにマイクロタイタープレー
トのウェルに添加する。サンプルの添加に続いて既知の
容量、代表的には50〜200μｌ、のリポーター標識Dpdを
既知の希釈濃度に添加する。実施例９では、リポーター
標識Dpdは、アルカリホスファターゼ−Dpd複合体、すな
わち、酵素標識Dpdである。次いで、固体支持体表面上
の混合物を、好ましくは抗Dpd抗体がサンプルのDpdおよ
び酵素標識されたDpdと結合するための平衡を達成する
のに有効な条件で、インキュベートする。実施例９で詳
しく述べる方法においては、インキュベーションは４℃
で一晩行う。

インキュベーションの後、支持体を再度洗浄して非特
異的な結合物質を除き、そして支持体に結合した酵素の
程度を、酵素基質を添加して変換された基質を分光光度
計で測定することにより決定する。詳細は実施例９に記
載する。

代表的なアッセイでは、濃度を上昇させたＮ−Dpdを
含むＮ−Dpd標準物を、Ｎ−Dpdの検量線を得るためにい
くつかのウェルに２組ずつ添加する。次いで最大40サン
プルを残ったウェルに２組ずつ添加し、そしてその後そ
れらのウェルを上記の様にアッセイする。検量線は、サ
ンプルに対するピリジニウムの架橋物の値をＮ−Dpd濃
度によって決定するために用いられる。

V.用途 上記のイムノアッセイ法、抗体試薬、および本発明の
キットは、ヒト被験体のコラーゲン損傷活性のレベルを
アッセイするには有効である。

一般に、本発明は一般的に骨コラーゲン損傷状態に関
連してPydおよびDpdの血液レベルが上昇することを検出
するのに有効である。このような状態は、例えば骨粗鬆
症、パジェット病、甲状腺機能低下症、変形性関節症、
および慢性関節リュウマチを含み得る。天然型遊離ピリ
ジニウム架橋物レベルの増大を含む他の状態は、種々の
形態の転移性の癌を含み、それらは骨組織に定着する
か、またはそうでなければ骨の代謝を変化させる。

血清Dpdレベルの上昇を検出するための本発明の方法
の使用を図４に示し、これは健康な（コントロール）患
者の血清サンプル中（第１欄）、ならびに原発性上皮小
体亢進症（第２欄）、骨軟化症（第３欄）、カルシウム
代謝障害（第４欄）、および骨粗鬆症（第５欄）の患者
の血清サンプル中で測定したＮ−Dpdレベルを示す。こ
の研究は、ハイブリドーマ細胞系13D4（上記表２を参照
のこと）由来の抗体を用いて実施例９に記載のアッセイ
プロトコルを用いて行った。

図からわかるように、コントロールグループのＮ−Dp
dレベルは約0.2nMと0.5nMとの間であり、平均レベル
（±標準偏差）は0.33±0.07nMであった。原発性上皮小
体亢進症グループは、約0.4nMと1.4nMとの間のレベルを
示し、一人は約4.2nMを示した（平均値＝1.4nM）。骨軟
化症グループは、約0.5nMと2.6nMとの間のレベル（平均
値1.2nM）を示し；カルシウム代謝障害グループは、約
0.4nMと1.4nMとの間のレベル（平均値0.9nM）を示し；
骨粗鬆症グループは、約0.3nMと1.1nMとの間のレベル
（平均値0.6nM）を示した。

全体としての罹患グループの図４のデータは、これら
の患者のコラーゲン損傷の増加と一致している。結果
は、約0.8nMを越える血清Ｎ−Dpdレベル、より好ましく
は約0.5nMを越える血清Ｎ−Dpdレベルが、このような患
者のコラーゲン損傷の増加の有用な指標であることを示
す。

図５は、健康な患者のグループ（グループ１）からの
血清サンプルで測定したＮ−Pydレベルと、骨転移が定
着あるいは疑わしい癌患者のグループからのサンプルで
測定したレベルとを比較する。この研究は、表４で特徴
付けられたウサギVI−８由来の抗体を用いて、実施例13
に記載のアッセイプロトコルを用いて行った。図からわ
かるように、コントロールグループのＮ−Pydレベル
は、約1nMと3nMとの間であり、平均レベル（±標準偏
差）は1.7±0.4nMであった。一方、癌のグループは、約
2nMと13nMとの間のレベルであり、一人の患者は約23nM
というレベルを示したが、これらの患者のコラーゲン損
傷の増加と一致した。この結果は、約5nMを越える血清
Ｎ−Pydレベル、より好ましくは約3nMを越えるレベル
が、このような患者のコラーゲン損傷の増加の有用な指
標であることを示す。

上述より、本発明の目的がどのようにして適合される
かが認識され得る。血液流体サンプルを用いることによ
って、本アッセイ法は、天然型遊離ピリジニウム架橋物
レベルの測定を血液サンプルを用いた他の臨床試験と統
合することを可能にする。この方法はまた、サンプルが
尿サンプル（例えば、尿のクレアチニンの測定）の場
合、必要とされるサンプル容量のばらつきの補正を省
く。このアッセイは、抗体試薬を用いるので、上記のよ
うな多くの簡便で速やかなアッセイ形式に適合させ得
る。本発明は、患者におけるコラーゲン分解の増加の検
出および種々のコラーゲン病状の治療の経過のモニター
に用いられ得る。

以下の実施例は、抗体試薬の生成法および本発明によ
るアッセイ法を示す。実施例は、例証することを意図
し、発明の範囲をいかなる方法によっても制限しない。

実施例 材料および方法 雌の自己免疫性のMRL/MpJ−lprマウスをJackson Labo
ratory,Bar Harbor,Maineより購入した。

マウス非分泌性P3X63Ag8.653ミエローマ細胞、および
マウス単球マクロファージ細胞系P388D1（IL−１）およ
びJ774A.1は、American Type Culture Collection（ATC
C）,Rockville,Marylandより購入した。

アジュバントRibiおよびRibi（CWS）は、RIBI Immuno
chem Research,Inc.,Hamilton,Montanaより購入した。5
0％ PEG 1500（ポリエチレングリコール1500、水中50％
（w:v））は、Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indi
anaより購入した。HATおよびHTは、Sigma Chemical Com
pany,St.Louis,Missouriより購入した。

Dulbeccoの改変イーグル培地（DMEM）、NCTC−109、
およびゲンタマイシンは、Gibco,GrandIsland,New York
より購入した。ウシ胎児クローン血清は、Hyclone Labo
ratories,Inc.,Logan,Utahより購入した。オキサロ酢酸
およびインスリンは、Sigma Chemical Companyより購入
した。Ｓ−DMEMを以下のように処方し、ここで％は最終
培地における最終容量％を示す:DMEM（80％）、NCTC−1
09（10％）、ウシ胎児クローン血清（10％）、オキサロ
酢酸（1mM）、Ｌ−グルタミン（2mM）、ゲンタマイシン
（50μg/ml）、およびインスリン（10μg/ml）。

調整培地の調製のため、マウス単球細胞系P388D1（IL
−１）、または、その代わりとして細胞系J774A.1を、
Ｓ−DMEM培地で、１週間に２回、1:4で分割しながら、
生育させた。３日毎に組織培養上清を0.2ミクロンのフ
ィルターで濾過し、4mMのＬ−グルタミンを追加した。
得られた濃縮調整培地を、Ｓ−DMEMの20％増補として用
い、ハイブリドーマ細胞を培養した。

他に指示のない限り、PBSは、0.01Mリン酸および150m
M NaCl,pH7を含む緩衝液として定義する。

実施例１ 架橋物のHPLC測定 PydおよびDpdのHPLC分析を、本質的にはBlack（198
8）に記載のように行った。簡単に説明すると、尿サン
プルをブタノールおよび氷酢酸と4:1:1（v:v:v）の混合
物に調整し、CF1セルロース（Whatman）のカートリッジ
にのせ、次いで4:1:1（ブタノール：酢酸：水）の緩衝
液で洗浄した。遊離の架橋物のみが保持された。遊離の
架橋物を、水でCF1セルロースから溶出した。溶出した
物質を、1ml/分で分配される水−アセトニトリル（３−
17％、10分間）の勾配を用い、295nmにおける蛍光物質
の励起および395nmにおける放出をモニターして、C18逆
相カラム（Rainin,C18−80−200−C3）で分析した。移
動相には、0.1％ HFBAを含んだ。

尿の架橋物の総計は、尿サンプルを110℃のHCl（6N）
中で16時間加水分解し、次いで上記のようなCF1前処理
とHPLC分析とを行うことにより測定した。HPLCの分離か
ら、加水分解されたPydおよびDpdの画分を得、その画分
からＴ−PydおよびＴ−Dpdを定量した。

実施例２ 架橋物の精製 ヒトの尿を、3000ダルトン分子カットオフフィルター
（Fil ton Co.）で40psiの背圧をかけて濾過した。次い
で濾液を凍結乾燥し、0.2M酢酸を用いて当初の容量の1/
20に再構成した。

次いで、濃縮した尿を0.2M酢酸で平衡化したSephadex
Ｇ−10 2.6×95cmカラムにかけた。カラム物質からの
溶出を、上記のように遊離のPydおよびDpdについて分析
した。遊離の架橋物を含む画分を一緒にプールし、pHを
2.0に合わせて、１×18cmの陽イオン交換カラム（Lacar
te Co.,UK）にかけ、0.1Mクエン酸ナトリウム、pH4.2で
平衡化した。

次いで、イオン交換カラムから0.1Mクエン酸ナトリウ
ム、pH4.2を用いてglyco−Pyd、Pyd、およびDpdを共溶
出した。集めた画分を上記のようにHPLC分析により架橋
物の存在について分析した。特異的な架橋物を含む画分
（glyco−Pyd、Pyd、およびDpd）を一緒にプールして、
2.5×10cmの逆相C18カラム（Waters）にかけ、続いてそ
れを0.1％のHFBAを含むアセトニトリルの２−20％の勾
配を用いて展開した。分離した画分（glyco−Pyd、Py
d、およびDpd）を、集めて凍結乾燥により濃縮した。乾
燥した残渣を0.2M酢酸で再構成し、４℃で保存した。最
終物質の純度は、重量分析および元素分析により測定し
た。

尿の架橋物−ペプチドは、ヒトの尿を、1000ダルトン
分子量カットオフ透析膜（Spectra−Por）を用いて、十
分に透析することにより調製した。ペプチド画分のＴ−
PydおよびＴ−Dpd架橋物の含有量は、ペプチドサンプル
を6NのHClで110℃で16時間加水分解し、次いでPydおよ
びDpdについてHPLC分析することにより測定した。

調製量のＨ−PydおよびＨ−Dpdを、Blackら（1988）
によって記載されたように加水分解して粉末化したウシ
またはヒツジの骨から得た。

実施例３ 免疫原の調製 以下の手順は、天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離
デオキシピリジノリンまたはその両方に対するモノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体を入手するためにどの
ようにして免疫原が調製され得るかを示す。以下のＡお
よびＢにおける手順は、Pyd免疫原に関して記載する;Dp
d免疫原も同様に調製するが、Pydの代わりにDpdを用い
る。

A.Pyd−BSA免疫原 0.1M MES、pH5.0中に9mgのウシ血清アルブミン（BS
A）および3.8mgのPydを含む3.1mlの溶液に、88mgのEDC
を含む0.88mlの水溶液を添加した。混合液を室温で４時
間反応させ、その後リン酸緩衝生理食塩水pH7.0（PBS）
に対して十分に透析した。UVおよび蛍光測定は、アルブ
ミン１モル当たり5.8モルのピリジノリンが置換されて
いることを示した。

B.Pyd−KLH免疫原 pHを５±0.5に合わせた乾燥Ｈ−Pyd（6mg）の水溶液
（200μｌ）に、PBS中のキーホールリンペットヘモシア
ニン（KLH）の10mg/ml溶液を2ml添加した。混合液に30m
gの固体１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エ
チルカルボジイミド（EDC、Pierce）を添加し、10分
後、別に30mgのEDCを添加し、室温で４時間反応を続け
た。次いで反応混合液を、PBSに対し十分に透析し、そ
の後Pyd−KLH免疫原を回収して保存した。

実施例４ 抗Pydモノクローナル抗体の調製 A.免疫化プロトコル 雌の５週齢の自己免疫MRL/MpJ−lprマウスを、以下の
プロトコルを用いて免疫化した： 融合の日に、免疫化したマウスをCO₂ガスで屠殺し、
マウスから脾臓を切り出して、予め37℃に暖めた5mlの
無血清DMEM培地を含む培養皿に置いた。脾臓に付着した
脂肪組織を除去した後、脾臓を5mlの無血清DMEM培地で
洗浄した。次いで脾臓を小さな断片に切断し、7mlの無
血清DMEM培地を含む細胞ホモジナイザーに入れ、細胞を
ホモジナイズして細胞懸濁液を作製した。

B.融合プロトコル 以下の工程を室温で行った。

脾臓細胞懸濁液（無血清DMEM培地中〜２×10⁸細胞）
および対数増殖期のP3X63Ag8.653ミエローマ細胞（無血
清DMEM培地中〜７×10⁷細胞）を別々に400×ｇで10分間
遠心分離した。得られた細胞ペレットを、50mL容量の遠
沈管内で無血清DMEM培地（10ml）で一緒にして懸濁し、
次いで400×ｇで10分間遠心分離した。上清を完全に除
き、そして遠沈管を軽くたたいて細胞ペレットをほぐし
た。

細胞融合のため、50％ PEG 1500の溶液（4ml）を、ピ
ペットにより穏やかに混合させながら90秒間にわたって
管に滴下した。次に、無血清DMEM（4ml）を１分間にわ
たって滴下した。次いでＳ−DMEM（40ml）を穏やかに混
合させながら２分間にわたって添加し、その後、ピペッ
トにより混合液をさらに2.5分間混合した。得られた混
合液は、400×ｇで10分間遠心分離した。上清を完全に
除去した後、細胞を、320mlの20％のP388D1調整Ｓ−DME
M培地中のHATに懸濁した。細胞懸濁液を16枚の96ウェル
組織培養プレートに、200μl/ウェルで入れ、次いで、
７％ CO₂を含む雰囲気中で37℃でインキュベートした。
細胞混合液は、第３日および第７日に古い培地を100μl
/ウェル除去し、150μl/ウェルのHAT培地（第３日）ま
たはHT培地（第７日）のいずれかを添加して飼養した。
ウェルは、融合後７〜10日でスクリーニングの準備がで
きた。

C.抗Ｎ−Pydモノクローナル抗体の産生のためのハイブ
リドーマのスクリーニング うまくいった融合産物を、実施例12および13に記載し
たＮ−Pydイムノアッセイ形式を用いて免疫応答性に関
してスクリーニングした。Ｎ−Pydへの結合に高い親和
性を示した細胞系を、限界希釈によりサブクローニング
し、Ｎ−Pydに高い結合親和性を有する抗体の産生のた
めにさらにスクリーニングした。Ｎ−Pydに対し高い抗
体親和性を与えるサブクローニングされた細胞系の一つ
を、本明細書中ではMab Pyd−XXV−3G6−3B11−1A10と
呼ぶ。この細胞系により産生された抗体の特異性を、上
記表１に示す。

実施例５ 抗Dpdモノクローナル抗体の調製 抗Dpdモノクローナル抗体を、実施例４に記載の手順
で、実施例３において調製されたDpd−KLH免疫原を用い
て調製した。マウスの免疫化プロトコルは、実施例４に
おいてと同じであったが、Ribiの代わりにRibi（CWS）
をアジュバントとして用いたこと、およびマウス１匹当
たり100μｇの代わりに75μｇのDpd免疫原を第４の免疫
化工程（融合から18日後）で用いたことを除く。

うまくいった融合産物を、実施例９に記載したＮ−Dp
dイムノアッセイ形式を用いて免疫応答性に関してスク
リーニングした。Ｎ−Dpdへの結合に高い親和性を示し
た細胞系を、限界希釈によりサブクローニングし、Ｎ−
Dpdに高い結合親和性を有する抗体の産生のためにさら
にスクリーニングした。Ｎ−Dpdに対し高い抗体親和性
を与えるサブクローニングされた細胞系の一つを、本明
細書中ではMab Dpd−II−7B6−1F4−1H11と呼ぶ。この
細胞系により産生された抗体の特異性を、上記表２に示
す。

実施例６ Ｎ−PydおよびＮ−Dpdの両方に対して特異的なモノクロ
ーナル抗体の調製 Ｎ−PydおよびＮ−Dpdの両方に対して特異的なモノク
ローナル抗体を、実施例５の手順で、免疫原としてＨ−
Dpd−KLH（実施例３）を用いて調製した。うまくいった
融合産物を、実施例９に記載したＮ−Dpdイムノアッセ
イ形式を用いて免疫応答性に関してスクリーニングし
た。Ｎ−Dpdへの結合に高い親和性を示した細胞系を、
限界希釈によりサブクローニングし、Ｎ−PydおよびＮ
−Dpdの両方に高い結合親和性を有する抗体の産生のた
めにさらにスクリーニングした。Ｎ−PydおよびＮ−Dpd
の両方に対し高い抗体親和性を与えるサブクローニング
された細胞系の一つを、本明細書中ではMab Pyd/Dpd−
Ｖ−6H2−2H4−1E4と呼ぶ。この細胞系により産生され
た抗体の特異性を、上記表３に示す。

実施例７ アルカリホスファターゼ−Dpd複合体 アルカリホスファターゼ−Ｈ−Dpd複合体は、ビス
（スルホスクシンイミジル）スベリン酸（BSSS）を結合
剤として用いて調製した。簡単に言うと、前の晩に４℃
でPBS中で透析した7.1mg/mlのアルカリホスファターゼ
（AP,3mg,1 40,000MW,ε＝0.963mg/mL^-1cm^-1）（Biozym
e Laboratories,San Diego,CA）溶液425μＬを、0.1Mリ
ン酸緩衝液、pH7.5中の11mg/mLのＨ−Dpd（ε＝4933M^-1
cm^-1）溶液24μＬと混合して、得られた混合液の容量を
PBSで500μＬに合わせた。

次いで500μｌの10mMグリシン（0.1Mリン酸緩衝液、p
H7.5中）を添加することにより反応を停止させ、混合液
を、光を遮って室温でさらに２時間インキュベートし
た。次いで、反応を停止した混合液を４℃で暗くして、
PBSを４回交換して透析した（各2Lずつ、４時間お
き）。

透析液中でのDpd対APの化学量論は、分光光度計によ
り326nmおよび280nmでの吸光度を測定して決定した。Dp
d対APの比は、代表的には1:1から2:1であった。AP−Ｈ
−Dpd複合体の酵素的活性は、標準APアッセイの天然型A
Pの活性の％として決定した。

実施例８ 抗Dpd抗体でコーティングしたプレートの調製 96ウェルのELISAプレートを以下のようにコーティン
グした。0.05％のNaN₃を含むPBS中に３μg/mlのウサギ
抗マウスIgGを含む200μｌの溶液を各ウェルに添加し、
次いでプレートを室温で18〜24時間インキュベートし
た。インキュベーション後、１ウェル当たり300μｌず
つ３回、洗浄用緩衝液（0.3％ Tween 20を含むPBS）を
用いて洗浄した。最後の洗浄でウェルを吸引した後、10
0mMリン酸塩、150mM NaCl、0.05％ Tween −20、0.05
％ NaN₃、0.1％ウシ血清アルブミン、および10ng/mlマ
ウス抗Dpdモノクローナル抗体（13D4）、pH7を含む150
μｌの捕獲溶液を各ウェルに添加した。プレートを室温
で18〜24時間インキュベートした。インキュベーション
が完結した後、各ウェルを上記のように洗浄用緩衝液で
３回洗浄した。ウェルを最後に吸引した後、10％スクロ
ース、100mMリン酸塩、150mM NaCl、および0.05％ NaN₃
（pH7）を含む250μｌの保存溶液を各ウェルに添加し
て、プレートを室温で１時間インキュベートした。その
後保存溶液を吸引によって除き、プレートを37℃、10％
以下の湿度で18〜24時間置いた。コーティングされたプ
レートは、乾燥剤のパックと一緒にホイルで密封し、室
温で保存した。

実施例９ 血清Dpdのイムノアッセイ Ｎ−Dpdの標準溶液および血清サンプルを２組ずつ試
験した。標準溶液は代表的には0.05％ NaN₃および10mg/
mLウシ血清アルブミンを含む10mM PBS中の０、0.05、0.
1、0.2、0.4、1.0、3.0、および9.0nMのＮ−Dpdからな
るものであった。

400μｌの各標準溶液または血清サンプルアリコート
に40μｌの50％ v:vトリクロロ酢酸（TCA）水溶液を添
加した。そして得られた混合物を短時間ボルテックスに
かけ、10,000rpmで５分間遠心分離した。各遠沈管から
上清を集めて（300μｌ）、3NのNaOHでpHを7.0±0.5に
合わせた。

実施例８からの抗Dpd抗体でコーティングしたプレー
トの各ウェルに、100μｌのTCA沈澱した標準または血清
サンプル、および50μｌのDpdアルカリホスファターゼ
溶液（〜75ng/mL Dpd−AP複合体、100mM PBS、0.7％ウ
シ血清アルブミン、0.3％スクロース、7mM Tris、0.15m
M MgCl₂、0.05％ Tween −20、および0.05％アジドを
含む）添加した。プレートを４℃で一晩インキュベート
した後、0.05％ NaN₃および0.05％ Tween −20を含むP
BSでウェルを洗浄した。

各ウェルに残ったDpdアルカリホスファターゼ複合体
を、各ウェルに150μＬの基質溶液（1Mジエタノールア
ミン中のｐ−ニトロフェニルホスフェート2mg/mL、pH1
0、1mM MgCl₂を含む）を添加し、室温で１時間インキュ
ベートし、50μＬの3N NaOHを添加することにより酵素
反応を停止し、そして405nmでのウェルの光学密度をVma
xリーダー（Molecular Devices Corp.）を用いて読みと
ることによりアッセイした。各血清サンプルのDpd架橋
物濃度は、Ｎ−Dpd標準溶液を用いて作成した検量線と
の比較により決定した。

実施例10 抗体試薬の結合選択性 Ｎ−Pyd、Ｎ−Dpd、およびピリジニウム−ペプチド
（MW＞1000）を、上記のように尿サンプルから単離し
た。ピリジニウム−ペプチド画分のアリコートを加水分
解し、画分中の架橋物をＨ−PydおよびＨ−Dpdに変換し
た。Ｎ−PydおよびＨ−Pyd調製物中のPydの濃度、Ｎ−D
pdおよびＨ−Dpd調製物中のDpdの濃度、およびピリジニ
ウム−ペプチド調製物中のDpdの濃度を、実施例１にお
けるようにHPLCにより決定した。さらに、PBS中に各150
μＭずつの20個の一般アミノ酸の等モル混合物を含むア
ミノ酸溶液を調製した。

天然型架橋物調製物およびアミノ酸混合物のアリコー
ト（50μｌ）を、２組ずつ抗Dpd抗体でコーティングし
たマイクロタイターウェル（実施例８）に添加し、そし
て各ウェルをＮ−Dpdについて実施例９におけるように
アッセイしたが、この際50μＬではなく100μＬのDpd−
AP複合体溶液を用いた。２つのサンプルの光学密度読み
取り値（405nm）を平均し、そしてこれらの値から、各
サンプルの見かけのＮ−Dpd濃度を、精製Ｎ−Dpdによっ
て作成した検量線を用いて決定した。各サンプルの反応
％は、全Ｈ−DpdについてHPLCにより決定したサンプル
中の全Dpd架橋物濃度に対する見かけのＮ−Dpd濃度（上
記のＮ−Dpd検量線を用いて測定した）の比として計算
した（×100）。精製Ｎ−Dpdについて決定した相対的な
反応性を、任意に100％とし、そして他の架橋物調製物
（およびアミノ酸混合物）の反応性を、100に対するパ
ーセンテージとして表した。本アッセイにより得た結果
を、上記表２に示す。

実施例11 抗ピリジノリン抗血清の調製 免疫化のためにニュージーランド白ウサギ（全部で59
羽）を，以下の表６に指示するように免疫化プロトコル
に従って８グループに分けた。免疫化の用量は、200μ
ｇのPyd−BSA（実施例3A）、低ハプテンPyd−BSA免疫原
（Pyd−BSAに関する実施例3Aのように調製されるが、よ
り低いPyd:BSAの化学量論による）、またはPyd−KLH
（実施例3B）であり、これを1.0mlのPBSに入れ、1.0ml
のRibiアジュバント（Ribi ImmunoChemical Research,I
nc.）と混合した。初回免疫は、多数の部位で皮下注射
により行い、そして次のブースター免疫を、３週間の間
をおいて筋肉注射することにより与えた。抗血清を各免
疫化の10日後に採集した。

採集の際に、各抗血清を、実施例13に記載したアッセ
イ形式を用いてPyd結合親和性について試験した。簡単
にいうと、血清由来の抗Pyd抗体の固体支持体に固定さ
れたPydへの結合を、アルカリホスファターゼで標識し
たヤギの抗ウサギIgG抗体試薬を用いて検出した。

免疫化した動物は、それらの抗血清が次のパラグラフ
でさらに定義する以下の基準を満たした場合、飼育し続
けた：アミノ酸（AA）＜20％、Pyd−ペプチド＜10％、
力価＞5000、および０から25nMのPydシグナルの分離＞
全変化シグナルの10％。

最も強い反応性抗血清のプロフィールを以下の表７に
示す。これらは、実施例13に記載のアッセイ形式を用い
て測定した。第１の欄は、ウサギ抗血清の由来する免疫
化プログラムを示す。第２の欄は、分析のためにプール
した採血を示す。「力価」と書いてある欄は、イムノア
ッセイ中で、Pyd−ネガティブ（Pydの存在無し）の光学
密度読み取り値が1.2〜1.6を達成するのに必要な各抗血
清の希釈度を示す。「アミノ酸（AA）」と書いてある欄
は、各抗血清と実施例７に記載のアミノ酸混合物との交
差反応性を示す。「Pyd−pep.＞1000MW」と書いてある
欄は、各抗血清とPyd−ペプチド（＞1000MW）との交差
反応性を示す。最後の欄は、Pydサンプルの0nMと25nMと
の間の分離を全変化シグナルの画分として示した。

示されるように、ウサギIII−３、Ｖ−４、およびVI
−８は、0nM〜25nMのＮ−Pydから著しいシグナルの変化
を示した。最も高い活性を持つ血清（VI−８）を選択
し、本明細書中に記載するＮ−Pydアッセイに用いた。

実施例12 Pydでコーティングしたマイクロプレートの調製 ビオチンで標識したオボアルブミンおよびストレプト
アビジン−Pyd複合体をマイクロプレートコーティング
に用いた。オボアルブミンのビオチン化は、400μｌの
ジメチルホルムアミドに10mgのビオチン−Ｘ−2,4−ジ
ニトロフェノール−Ｘ−Ｌ−リジン、スクシンイミジル
エステル（Molecular probes）を入れたものを、150mg
のオボアルブミンを含むPBS溶液10mlに添加することに
より行った。混合物を室温で２時間反応させ、次にG25
カラムクロマトグラフィーにかけた。分光測光分析は、
オボアルブミン１モル当たり２個のビオチンが置換され
ていることを示した。

Ｈ−Pydのストレプトアビジンへの複合体化は、チオ
ール化したストレプトアビジンを結合剤SMCCを介してＨ
−Pydに結合させることにより達成した。チオール化し
たストレプトアビジンは、Ｎ−スクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP、Pierce）
との反応により以下のように調製した。5mgのストレプ
トアビジンがPBSに入った溶液0.75mlに、260μｇのSPDP
を含むジメチルホルムアミド21μＬを添加した。混合物
を室温で１時間反応させ、次いでPBSに対して透析し
た。SPDP標識ストレプトアビジンは、ジチオスレイトー
ルを最終濃度が10mMになるよう添加することにより還元
した。室温で１時間インキュベートした後、チオール化
したストレプトアビジンを、Ｇ−25カラムにかけて精製
した。

Ｈ−Pyd−ストレプトアビジンを形成するために、ジ
メチルホルムアミド（４μｌ）中に180μｇのスクシン
イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（SMCC、Pierce）を含む溶液
を、100μｌのPBS中に0.5mgのチオール化したストレプ
トアビジンと50μｇのＨ−Pydとを含む溶液に添加し
た。混合物を室温で３時間反応させ、次いでPBSに対し
て透析した。得られたPyd−ストレプトアビジンの分光
測定分析は、ストレプトアビジン１当量当たり１当量と
２当量との間のピリジノリンが結合していることを示唆
した。

96ウェルのELISAプレートの各ウェルを、以下のよう
にＮ−Pydでコーティングした。各ウェルに、PBS中3.8
μg/mlのビオチン−オボアルブミン溶液150μｌを添加
し、次に２〜８℃で一晩インキュベートした。マイクロ
プレートをPBSで洗浄し、1mg/mlのオボアルブミン200μ
ｌを添加して室温で一晩インキュベートすることにより
ブロックした。次いでマイクロプレートをPBSで２回洗
浄した。ストレプトアビジン−Pyd複合体は、ビオチン
への結合を媒介するストレプトアビジンを介して固定さ
れる。PBS中100μg/mlのストレプトアビジン−Pydを含
む150μｌの溶液を、ビオチン−オボアルブミンでコー
ティングしたマイクロプレートの各ウェルに添加した。
室温で１時間インキュベートした後、プレートをPBSで
２回洗浄した。残った液体は、対流式オーブン内で37℃
で一晩乾燥させることにより、マイクロプレートから除
いた。

実施例13 ポリクローナル抗体試薬を用いるPydのイムノアッセイ 上記表４および７で特徴づけられたウサギポリクロー
ナル抗体VI−８、および実施例12に記載のＮ−Pydでコ
ーティングしたマイクロタイタープレートを用いて、以
下のイムノアッセイを行った。

Ｎ−Pydの標準溶液および血液血清サンプルを２組ず
つ試験した。標準溶液は、アッセイ緩衝液（150mM NaCl
を含む100mMリン酸ナトリウムpH7中0.05％ NaN₃、0.05
％ Tween 20、および0.1％ BSA）中の0nM、0.2nM、0.6
nM、2.0nM、6.0nM、および24nM N−Pydからなるもので
あった。血清サンプルを、アッセイの前に、Centricon
−30（Amicon,Mass.）濾過装置を通して濾過した。

サンプルまたは標準（25μl/ウェル）を添加した後、
アッセイ緩衝液で20,000倍に希釈したVI−８抗血清を12
5μl/ウェルで添加し、次いでアッセイプレートを４℃
で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で30
0μl/ウェルで３回洗浄した後、150μl/ウェルのヤギ抗
ウサギIgG−アルカリホスファターゼ複合体（アッセイ
緩衝液で1:1000希釈）を添加し、プレートを室温で１時
間インキュベートした。次いでウェルを洗浄緩衝液で３
回洗浄した。

各ウェルに、150μＬの酵素基質溶液（1mM MgCl₂を含
む1.0MジエタノールアミンpH9.8に入った2mg/mLのｐ−
ニトロフェニルホスフェート（Sigma））を添加した。
室温で１時間インキュベートした後、50μｌの3.0NのNa
OHを各ウェルに添加して酵素反応を停止した。次いで40
5nmでの光学密度をVmaxリーダー（Molecular Devices C
orp.）を用いて測定した。

２つのサンプルの光学密度の読み取り値（405nm）を
平均し、そしてＮ−Pyd標準からの平均読み取り値を用
いてＮ−Pyd濃度に対するOD読み取り値の検量線を作成
した。この曲線から、各血清サンプル中の遊離Ｎ−Pyd
架橋物濃度を決定した。

実施例14 ポリクローナル抗体試薬の結合選択性 Ｎ−Pyd、Ｎ−Dpd、およびピリジニウム−ペプチド
（MW＞1000）を、上記のように尿サンプルから単離し
た。ピリジニウム調製物のアリコートを加水分解し、画
分中の架橋物をＨ−PydおよびＨ−Dpdに変換した。Ｎ−
PydおよびＨ−Pyd調製物中のPyd濃度、Ｎ−DpdおよびＨ
−Dpd調製物中のDpd濃度、およびピリジニウム−ペプチ
ド調製物中のPyd濃度を、実施例１に記載のようにHPLC
により決定した。さらにPBS中に各150μＭずつの20個の
一般アミノ酸の等モル混合物を含むアミノ酸溶液を調製
した。

天然型架橋物調製物およびアミノ酸混合物のアリコー
ト（50μｌ）を、２組ずつPydでコーティングしたマイ
クロタイターウェルに添加し、そして各ウェルを実施例
13におけるようにピリジノリンについてアッセイした。
２つのサンプルの光学密度読み取り値（405nm）を平均
し、そしてそれらの値から、各サンプルの見かけのＮ−
Pyd濃度を、精製Ｎ−Pydによって作成した検量線を用い
て決定した。各サンプルの反応％は、全Ｈ−Pydについ
てHPLCにより決定したサンプル中の全Pyd架橋物濃度に
対する見かけの濃度（上記のＮ−Pyd検量線を用いて測
定した）の比として計算した（×100）。精製Ｎ−Pydに
ついて決定した相対的な反応性を、任意に100％とし、
そして他の架橋物調製物（およびアミノ酸混合物）の反
応性を、100に対するパーセンテージとして表した。本
アッセイにより得た結果を、上記表４および７に示す。

本発明を特定の実施態様に関して記載するが、種々の
変化および改変を、本発明から逸脱することなく行い得
ることは認識されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／０３７，６０２ (32)優先日 平成５年３月26日(1993．3．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／１４０，２８４ (32)優先日 平成５年10月20日(1993．10．20) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ゴメッツ，バルタザール，ジュニア アメリカ合衆国 カリフォルニア 94538，フレモント，グリマー ブール バード 40390 (56)参考文献 特表 平４−501002（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−500818（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／010141（ＷＯ，Ａ１) 国際公開91／008478（ＷＯ，Ａ１) 国際公開94／003814（ＷＯ，Ａ１) ＣＡＬＣＩＦＩＥＤ ＴＩＳＳＵＥ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ，1993年, Ｖｏｌ．52，Ｎｏ．ＳＵＰ１，Ｓ92 ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲ Ｙ，1993年 ４月，Ｖｏｌ．39，Ｎｏ. ４，ｐ614−618 ＢＲＩＴＩＳＨ ＪＯＵＲＮＡＬ Ｏ Ｆ ＣＡＮＣＥＲ，1991年，Ｖｏｌ. 64，Ｎｏ．５，ｐ884−886 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/577

Claims (22)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト被験体の骨コラーゲン損傷レベルをア
   ッセイする方法であって、尿中の加水分解されたピリジ
   ノリン架橋物のレベルの上昇により特徴付けられる骨吸
   収障害の存在をスクリーニングするために、 該被験体から血液流体サンプルを得る工程、 該サンプルを、天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デ
   オキシピリジノリン、または天然型遊離ピリジノリンお
   よび天然型遊離デオキシピリジノリンの両方からなる群
   より選択されるピリジニウム架橋物と免疫特異的に反応
   し得る抗体と反応させる工程、 該反応により、該抗体と該サンプル中のそのような天然
   型遊離ピリジニウム架橋物との間に免疫複合体を形成さ
   せる工程、 形成された該免疫複合体の量を測定し、そして該測定に
   より、該サンプル中のそのような選択された天然型遊離
   ピリジニウム架橋物の濃度を決定する工程、および 決定された濃度が、（ｉ）5nMの天然型遊離ピリジノリ
   ン、（ii）1nMの天然型遊離デオキシピリジノリン、ま
   たは（ii）6nMの混合された天然型遊離のピリジノリン
   およびデオキシピリジノリン、より高い場合、該被験体
   がそのような骨吸収障害を有すると同定する工程、 を包含する方法。
2. 【請求項２】前記抗体が、前記選択された架橋物に対し
   て少なくとも５×10⁷/Mの結合定数を有する、請求項１
   に記載の方法。
3. 【請求項３】前記抗体がモノクローナル抗体である、請
   求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】前記モノクローナル抗体が、天然型遊離ピ
   リジノリンに対して特異的である、請求項３に記載の方
   法。
5. 【請求項５】前記モノクローナル抗体が、天然型遊離デ
   オキシピリジノリンに対して特異的である、請求項３に
   記載の方法。
6. 【請求項６】前記モノクローナル抗体が、天然型遊離ピ
   リジノリンおよびデオキシピリジノリンの両方に対して
   特異的である、請求項３に記載の方法。
7. 【請求項７】前記抗体が、ポリクローナル抗体である、
   請求項２に記載の方法。
8. 【請求項８】前記ポリクローナル抗体が、天然型遊離ピ
   リジノリンに対して特異的である、請求項７に記載の方
   法。
9. 【請求項９】前記抗体が、前記選択されたピリジニウム
   架橋物および分子量が1,000ダルトンより大きい尿のピ
   リジニウムペプチドに対して、約5:1より大きい反応比
   を有する、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】前記サンプルが、血清または血漿サンプ
    ルである、請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記得る工程が、前記反応工程前に、約
    30kDaより大きい分子量を有する血清または血漿成分を
    除く工程を包含する、請求項10に記載の方法。
12. 【請求項１２】前記得る工程が、前記反応工程前にトリ
    クロロ酢酸沈澱可能な血清または血漿サンプル成分を除
    く工程を包含する、請求項10に記載の方法。
13. 【請求項１３】前記抗体が固体支持体に付着し、該反応
    工程が、前記サンプル中のそのような選択されたピリジ
    ニウム架橋物と前記抗体に結合することに関して効果的
    に競合するリポーター標識されたピリジニウム架橋物存
    在下で行われ、そして形成された前記免疫複合体の量
    が、該固体支持体に結合したリポーター標識されたピリ
    ジニウム架橋物の量を測定することにより間接的に測定
    される、請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】前記抗体がリポーター標識されている；
    選択された量の前記選択された架橋物が、前記固体支持
    体に固定されている；そして該反応工程が、該固定され
    た架橋物が該抗体と結合することに関して前記サンプル
    由来のそのような選択された架橋物と競合することに効
    果的であるように行われ、そして形成された前記免疫複
    合体の量が、該固体支持体に結合したリポーター標識さ
    れた抗体の量を測定することにより間接的に測定され
    る、請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】骨吸収率の異常を含む転移状態への進行
    を包含するかまたはその可能性を有するヒトの癌の状態
    をモニタリングする方法であって、 被験体から血液流体サンプルを得る工程、 該サンプルを、天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デ
    オキシピリジノリン、または天然型遊離ピリジノリンお
    よび天然型遊離デオキシピリジノリンの両方からなる群
    より選択されるピリジニウム架橋物と免疫特異的に反応
    し得る抗体と反応させる工程、 該反応により、該抗体と該サンプル中のそれらの天然型
    遊離ピリジニウム架橋物との間に免疫複合体を形成させ
    る工程、 形成された該免疫複合体の量を測定し、そして該測定に
    より、該サンプル中のそのような選択された天然型遊離
    ピリジニウム架橋物の濃度を決定する工程、および 該決定された濃度が、（ｉ）5nMの天然型遊離ピリジノ
    リン、（ii）1nMの天然型遊離デオキシピリジノリン、
    および（ii）6nMの混合された天然型遊離のピリジノリ
    ンおよびデオキシピリジノリン、より高い場合、該被験
    体が骨障害を有すると同定する工程、 を包含する方法。
16. 【請求項１６】そのような癌の治療をモニタリングする
    のに用いるためであり、前記同定する工程が、癌の治療
    中における前記選択された架橋物濃度の変化を決定する
    工程をさらに包含する、請求項15に記載の方法。
17. 【請求項１７】前記抗体が、前記選択された架橋物に対
    して少なくとも５×10⁷/Mの結合定数を有するモノクロ
    ーナル抗体である、請求項15に記載の方法。
18. 【請求項１８】前記抗体が、前記選択された架橋物に対
    して少なくとも５×10⁷/Mの結合定数を有するポリクロ
    ーナル抗体である、請求項15に記載の方法。
19. 【請求項１９】前記サンプルが、血清または血漿サンプ
    ルである、請求項15に記載の方法。
20. 【請求項２０】前記得る工程が、前記反応工程前に、約
    30kDaより大きい分子量を有する血清または血漿成分を
    除く工程を包含する、請求項19に記載の方法。
21. 【請求項２１】前記得る工程が、前記反応工程前にトリ
    クロロ酢酸沈澱可能な血清または血漿サンプル成分を除
    く工程を包含する、請求項19に記載の方法。
22. 【請求項２２】前記抗体が、前記選択されたピリジニウ
    ム架橋物および分子量が1,000ダルトンより大きい尿の
    ピリジニウムペプチドに対して、約5:1より大きい反応
    比を有する、請求項15に記載の方法。