JPH04160364A - 動物オステオカルシンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は動物オステオカルシンの測定方法及び動物オス
テオカルシンのＮ末端側のアミノ酸配列等に特異的な認
識部位を有する抗体に関する。

（ロ）従来技術 オステオカルシンは、ｂｏｎｅ　ｇｌａ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　（ＢＧＰ）と称される、ビタミンに依存性の骨カル
シウム結合性タンパクである。殊にヒト・オステオカル
シンは５８００の分子量を有し、４９のアミノ酸より構
成されている比較的小さいタンパクである。

このタンパクは、オステオブラスト（骨芽味）から産生
され、骨の非コラーゲンタンパクの構成成分の約２０％
を占めている。このタンパクにはγ−ｅａｒｂＯＸ３１
ｇＪ’ｉ＋ｔａｍｉｅ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｌｅｓ　
（Ｇｌａ）があり、ハイドロキシアパタイトと強いアフ
イニテイがあり、それゆえに骨マトリックス形成に重要
な役割を有しているものと推定されている。

このオステオカルシンは、最初ニワトリ及び牛の骨から
見い出された（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｅａｄ、　Ｓ
ｃｉ。

ＵＳＡ　Ｖｏｉ、　７２．　Ｎｏ、１０　ｐｐ３９２５
−３９２９　（Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９７５）及び同Ｖｏ
１．７３．　Ｎｏ、５．　ｐｐ１４４７−１４５１　（
Ｍａｙ　１９７６）］。

次いでヒト・オステオカルシンが分離されそのアミノ酸
配列も決定された［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒ＠ａｔ　ｏｆＢｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ、２５
５．　　Ｎｏ、１８．　　ｐｐ８６８’ｒ８６９１　（
１９８０）］。この文献には、ヒト・オステオカルシン
のアミノ酸配列がウシ（Ｃａｌｆ）及びメカジキ（Ｓｗ
ｏｒｄｆｉｓｈｌのオステオカルシンのアミノ酸配列と
対比して示され、これらのオステオカルシンはかなり類
似した構造であることが示されている。

一方、ヒト・オステオカルシンやその他の動物のオステ
オカルシンについては、下記の報告がなされている。

ヒト・オステオカルシンの測定法は、以下の通りである
。

（１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ
、　ＵＳＡ　Ｖｏｌ、７７、　Ｎｏ、４゜ｐｐ２２３４
−２２３８　（１９８０）；Ｐ、Ａ、　Ｐｒ１ｃｅらは
、この文献において、ウシ・オステオカルシンに対する
ウサギ抗体を用いてラジオイムノアッセイ法によるヒト
プラズマ中のヒト・オステオカルシンの測定について報
告し、このウサギ抗体は、ウシ・オステオカルシンのＣ
末端領域を認識していることも報告している。　　　　
− （２）　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｖｏｌ、
６６、　　ｐｐ８７８−８８３　（１９８０）　：Ｐ、
Ａ、　Ｐｒ１ｃｅらは、この文献において、前記文献と
同様にウシ・オステオカルシンに対するウサギ抗体を用
いて、ラジオイムノアッセイ法により、ヒトプラズマ中
のヒト・オステオカルシンを測定し、骨の病気の患者は
、健常人と比べてオステオカルシン量が増加しているこ
とを認めている。

（３）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｖｏｌ
、７１．　　ｐｐ１３１６−１３２１＋１９８３）　； Ｐ、Ｄ、　Ｄｅｌｍａｓらは、この文献において、女性
の年令とオステオカルシンの量の関係を調べ、年令の増
加と共にオステオカルシンの増加が認められることを示
している。この文献においては、ヒト・オステオカルシ
ンの測定は、前記（１）のＰ、Ａ、　Ｐｒ１ｃｅらと同
じウサギ抗体を使用する方法で行ったことが記載されて
いる。

（４）　Ｂｏｎｅ　６．９−１３　（１９８５）：Ｂ、
Ｄ、　Ｃａｔｈｅｒｗｏｏｄら、健常人における年令と
オステオカルシンの量について調べ、年令の増加と共に
少しずつ減少していることを報告している。そしてこの
文献の方法では、ヒト・オステオカルシンのＣ末端の３
７〜４９のアミノ酸配列のペプチドを合成し、このペプ
チドを用いて抗体を調製し、得られた抗体を利用して競
合法によるラジオイムノアッセイにより、ヒト・オステ
オカルシンを測定している。

（５）日本特許公開昭６３−２０９５９６号及び量子１
−１６０４９３号公報； これらの特許公報には、ウシのオステオカルシンに対す
るいくつかのモノクローナル抗体及びその利用について
記載され、殊にＣ末端４５（Ｐｈｅ）〜４９　（Ｖａｔ
）を認識するモノクローナル抗体及び中間のアミノ酸領
域２１　（Ｇｌｅｅ〜３０　（Ａｓｐ）を認識するモノ
クローナル抗体を用いて、サンドイッチ法によるヒト・
オステオカルシンの測定方法について記載されている。

したがって、この方法も、ウシとヒトのオステオカルシ
ンの共通アミノ酸配列を利用して、ウシ・オステオカル
シンに対する抗体を用いて測定系を構成し、ヒトの血中
系の測定系を行っていることになる。

また、ラット・オステオカルシンの測定に関しては、文
献的には、はとんど報告がない力釈次の記載が最近ある
。

（６）　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１９９０　Ａ
ｕｇ、１２７（２）、　ｐ５８８−９４゜Ｍ、Ｓ、　Ｎ
ａｎｅｓらは、Ｃ末端側のＢＧＰペプチドを免疫して得
られた抗体により競合法を用いたＲＩＡを構成している
。

上記のアプローチは、大きく２つに分けられる。

１つは、測定を目的とした例えば、ヒト・オステオカル
シンに対して、構造の類似したウシ・オステオカルシン
を免疫して得られた抗体を用いて測定する。またもう一
方は、オステオカルシンの１部分を合成し、それに対す
る抗体を作成し、これを用いて測定系を組むことである
。

後者を、さらに進歩させるアプローチとして、我々はオ
ステオカルシン構造特異的な測定法を出願したく国際出
願ＰＣＴ／ＪＰ９０１００１５５号）。すなわち、ヒト
の完全分子オステオカルシン、またフラグメント分子オ
ステオカルシンの測定系をＮ末端側１〜２０残基のアミ
ノ酸配列、Ｃ末端側３６〜４９残基のアミノ酸配列の合
成ペプチドを作成し、それらの抗体を用いて非常にヒト
分子特異性の高い測定系を構成した。

（ハ）発明が解決しようとする課題 しかしながら、従来の測定法を構成する技術では、以下
のような問題をかかえていた。すなわち、オステオカル
シンはＧｌａ残基が存在し、このＧｌａ残基は、容易に
合成しないことである。Ｇｌａは、ヒト・オステオカル
シン分子には２１．２４位に、他の動物のオステオカル
シン分子には１７．２１．２４位にあり、主にＮ末端側
のアミノ酸配列中に存在する。このＧｌａは、Ｃａをキ
レートし、本来のオステオカルシンの生理活性の主役を
担い、しかもオステオカルシン自体の立体構造に大きく
寄与するといわれている。それゆえに、従来のオステオ
カルシン測定系のアプローチのペプチド合成技術では、
このＮ末端部分の合成を行っていなかった。なぜなら、
Ｇｌａ基を合成えず他のアミノ酸で置換してしまえば、
大きく立体構造が異なる危険が考えられた。

従来の技術の中では、前述のように唯一、本発明者らが
、ヒトのＮ末端側１〜２０残基のアミノ酸配列（以下、
ｒＮ１〜２０残基」という）の合成ペプチドを用いてヒ
ト・オステオカルシンに対する反応性の高い測定系を構
成しているにすぎながった。しかしながら、ヒト分子や
他の動物分子を、抗体を用いて種特異的な測定系を構成
しようとする場合、オステオカルシンのＮ末端は非常に
魅力的なアミノ酸配列をしている。なぜならば、最も種
間のアミノ酸配列が異なる部分がＮ末端だからである。

また、オステオカルシンＮ末端に対する抗体とＣ末端に
対する抗体を用いて、オステオカルシンを免疫学的には
さむことによりのみ、完全分子型オステオカルシンを測
定しうろことになる。

その点でも種特異的なＮ末端側のアミノ酸配列中に認識
部位を有する抗体を得ることは、種特異的な測定におい
てその意義が大きい。

仁）課題を解決するための手段 そこで、本発明者らは、かかる従来技術の課題を鑑みて
、鋭意研究した結果、ヒト・オステオカルシンのＮ末端
側１〜２５残基のアミノ酸配列において２１Ｇｌａ　、
　”ＧｌａをいずれもＧｌｕにおきかえたペプチドを合
成し、また、他の動物オステオカルシンノアミノ酸配列
では、１７Ｇｌａ、”Ｇｌａ、　　　’”Ｇｌａをそれ
ぞれＧｌｕにおきがえてペプチドを合成し、これらを抗
原（免疫源）として動物に免疫　′して得られた抗体が
それぞれのオステオカルシンを種特異的に認識すること
、及びそれらの抗体を用いることにより、ヒト・オステ
オカルシンや他の動物のオステオカルシンをそれぞれ高
感度に測定することができることを知見して本発明に到
達したものである。

すなわち本発明は、サンドイッチ法による免疫学的測定
方法において、固相抗体と標識抗体のいずれか一方の抗
体として動物オステオカルシンのＮ末端側のアミノ酸配
列領域中に特異的な認識部位を有する抗体（Ｎ末端抗体
）を用い、他方の抗体として動物゛由来オステオカルシ
ンのＣ末端側のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位
を有する抗体（Ｃ末端抗体）を用いることを特徴とする
測定方法である。

また本発明は、免疫学的測定方法において抗体として動
物オステオカルシンのＮ末端側アミノ′酸配列領域中を
特異的に認識する抗体（Ｎ末端抗体）を用いることを特
徴とする測定方法である。

さらにまた本発明は、動物オステオカルシンのＧｌａ残
基がＧｌｕ残基でおきかえられているＮ末端側１〜２０
残基のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有する
抗体、 動物オステオカルシンのＧｌａ残基がＧｌｔｌ残基でお
きかえられているＮ末端側１〜２５残基のアミノ酸配列
領域中に特異的な認識部位を有する抗体、及び 動物オステオカルシンのＣ末端側の３６〜４９又は３６
〜５０残基のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を
有する抗体である。

本発明において動物オステオカルシンとはヒトを含むう
′ット、マウス等のオステオカルシンをいい、かかる動
物オステオカルシンのＧｌａ残基がＧ１１残基でおきか
えられているＮ末端側１〜２０残基のアミノ酸配列領域
中に特異的な認識部位を有する抗体としては、例えば第
２図に示されたＮ末端側１〜２０残基のアミノ酸配列領
域中に特異的な認識部位を有するラット・オステオカル
シンや、マウス・オステオカルシンに対する抗体が、ま
た同様にＮ末端側１〜２５残基のアミノ酸配列領域中に
特異的な認識部位を有する抗体としては、例えば第１図
、第３図に示されなＮ末端側１〜２５残基のアミノ酸配
列領域中に特異的な認識部位を有するヒト・オステオカ
ルシン、ラット・オステオカルシンやマウス・オステオ
カルシンに対する抗体が、さらにまたかかる動物オステ
オカルシンのＣ末端側３６〜５０残基のアミノ酸配列領
域中に特異的な認識部位を有する抗体としては、例えば
第４図及び第９図に示されたＣ末端側４３〜５０残基の
アミノ酸配列領域中、又は同４３〜４９残基のアミノ酸
配列領域中に特異的な認識部位を有するラット・オステ
オカルシンおよびヒト・オステオカルシンや、マウス・
オステオカルシンに対する抗体があげられる。　次に、
例えば本発明の動物オステオカルシンのＮ末端側のアミ
ノ酸配列領域中等に特異的な認識部位を有する抗体を作
成する具体的方法について説明する。

Ａ、抗原の作成 抗原としては、ヒト・オステオカルシンを含む動物オス
テオカルシンや酵素的に切断して得られる動物オステオ
カルシンのアミノ酸配列を有するペプチド、あるいは合
成ペプチドを用いることができるが、ここでは、■ヒト
Ｎ末端１〜２５残基Ｇｌｕ変換ペプチド（ＨＯｓｔ　−
Ｎ（２５））■ラットＮ末端１〜２０残基Ｇｌｕ変換ペ
プチド（ＲＯｓｔ−Ｎ（２０）ｌ及び■ラットＮ末端１
〜２５残基Ｇｌｕ変換ペプチド（ＲＯｓｔ−Ｎ（２５）
）について説明する。

１１　　Ｎ末端ペプチド■、■、■の合成ヒトおよび他
の動物オステオカルシンのＧｌｕ変換配列のＮ末端に、
各々システィンを加えたアミノ酸配列を、第１〜３図に
各々示した。ＡＢＩ社ペプチド合成機を用いてこれらの
ペプチドを合成しな。

以下これらのペプチドをＨｏ５ｔ　−Ｎ２５．　ＲＯｓ
ｔ　−Ｎ２０．　ＲＯｓｔ−Ｎ２５と略称する。なお以
下の操作により抗体を作成する力釈抗原としてのオステ
オカルシンと結合しうる範囲内であれば、上記の免疫源
としてのアミノ酸配列の変更は許容される。

２）　抗原＜Ｈ＋）Ｓｔ　−ＮＩ２５）、　ＲＯｓｔ　
−Ｎｆ２０）。

ＲＯｓｔ　　Ｎ（２５）ｌの作成 １）で得られた３種のペプチドを免疫源とする方法は、
以下の３通りが考えられる。■Ｐｖｐなどの合成高分子
との物理的混合（合成高分子への吸着）、■キャリヤ蛋
白（ＫＬＨ又はＢＳＡ等）との化学結合、あるいは■リ
ポソーム、菌体等の粒子との結合（物理吸着又は化学的
結合）がある。

３）　免疫方法〈抗体の作成） 上記２）で調製した免疫源を動物（羊、山羊。

兎、ラット、マウス又はトリ等）に免疫する、免疫に際
してはフロイント完全アジュバントやフロイント不完全
アジュバント、Ａｌ（ＯＨ）３等が用いられる。抗体価
上昇後、抗体を含んだ血清を採取し、抗体を精製する。

また、モノクローナル抗体の採取の場合には、抗原を適
当な動物に免疫しく例えばマウス、ラット、ウサギ等）
、抗原刺激リンパ球を得、細胞融合を行い、クローン化
ハイブリドーマを取得し、モノクローナル抗体を採取す
る。

また、本発明のモノクローナル抗体を用いて、免疫学的
方法によりヒトを含む動物オステオカルシン又はそのフ
ラグメントを特異的かつ恐度よく測定することができる
。

例えば、ＥＩＡとしては「酵素免疫測定法」く第２版、
石川栄治他著、医学書院１９８２）などに記載されてい
るそれ自体公知の方法を用いることができる。サイドイ
ッチ法及び競合法によるＥＩＡが代表的例である。

サイドイッチ法によるＥＩＡでは、ヒトを含む動物オス
テオカルシンに対する一方の工程く第１抗体）を適当な
不溶性担体く例えばプラスチック容器〉に固定化する（
以下これを“固相抗体“′という）。ついで不溶性担体
と測定しようとする試薬又は検体試料との非特異的結合
を避けるために適当な物質（例えば牛血清アルブミン）
で不溶性担体の表面を被覆する。

このようにして得られた第１抗体が固定化された不溶性
担体を検体試料と一定時間及び温度で接触させ反応させ
る。この間に固相抗体く第１抗体）と検体試料中のヒト
を含む動物オステオカルシンが結合する。ついで適当な
洗浄液で洗った後、適当な標識物質（例えば酵素〉で標
識したヒト・オステオカルシンに対する他方の抗体（第
２抗体）の溶液〈例えば水溶液）を不溶性担体における
固相抗体に結合したヒトを含む動物オステオカルシンと
一定時間及び温度で接触させ第２抗体と反応させる。こ
れを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上の固相抗
体とヒトを含む動物オステオカルシンを介して結合して
存在する鏑２抗体に標識された標識物質の量を測定する
。

なお上記反応は、固相抗体、標識抗体及びヒトを含む動
物オステオカルシンを含有する検体試料を同時に混合し
、一定時間及び温度でこれら三者を同時に接触させて反
応させることもできる。

かくしてその値から検体試料中のヒトを含む動物オステ
オカルシンの量を算出することができる。

通常、サンドイッチ法では、第１抗体と第２抗体とが互
いに結合部位の異なる抗体を組合せて用いられるが、本
発明の実施例で示すごとく、同一のポリクローナル抗体
を用いた場合でも驚くべき高感度で測定系が構成できる
（フラグメントサンドイッチ測定系〉。

競合法としては、例えば固相に固定した抗原と測定すべ
き抗原と叫対し一定量の標識抗体を競争的に反応させて
固相抗原・標識抗体複合体を形成せしめ、洗浄操作の後
固相に結合した標識抗体の標識物質の量を測定する方法
や、固相に抗体を固定し標識抗原と測定すべき抗原とを
競争的に反応させて固相抗体・標識抗原複合体を形成せ
しめ、洗浄操作の後固相に結合した標識抗原の標識物質
の量を測定する方法が挙げられる。

サンドイッチ法及び競合法のそれぞれにおいて、抗体を
ＩｇＧに限らずペプシンで消化して得られなＦ（ａｂ’
１２、Ｆ（ａｂ’）２を還元して得られたＦａｂ’及び
抗体をパパインで消化して得られなＦａｂなとの、抗原
に結合する抗体フラグメントを抗体として、また、これ
らを標識して標識抗体として使用することができる。

また、本発明においてヒトを含む動物オステオカルシン
としては完全分子型のヒトを含む動物オステオカルシン
のみならず、そのフラグメントであるＮ末端領域を有す
るペプチドをも含む測定系が可能である。

本発明のヒトを含む動物オステオカルシンの免疫学的測
定方法等に使用される不溶性担体としては、例えばポリ
スチレン、ポリエチレン、ボリプｔＶピレン、ポリエス
テル、ポリアクリロニトリル、弗素樹脂、架橋デキスト
ラン、ポリサッカライドなどの高分子、その他紙、ガラ
ス、金属、アガロース及びこれらの組合せなどを例示す
ることができる。

また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状、球状
、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管などの種
々の形状であることができる。

また、標識抗体の標識物質としては、酵素、蛍光物質、
発光物質及び放射性物質等を使用するのが有利で−ある
。酵素としては、ペルオキシダーゼ。

アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
、蛍光物質としてはフルオレッセインインチオシアネー
ト、フィコビリプロティン等、発光物質としてはインル
シノール、ルシゲニン等、そして放射性物質としては１
２５ｉ　、　　１３１Ｊ　、　１４ｃ。

３Ｈ等を用いることができるが、これらは例示したもの
に限らず、免疫学的測定法に使用し得るものであれば、
他のものでも使用できる。

標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するた
めに基質、必要により発色剤が用いられる。

酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質と
してＨ２Ｏ２を用い、発色剤として２．２′−アジノジ
−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニ
ウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、０−フェ
ニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３．３’、
５．５″−テトラメチルベンジジン等、酵素にアルカリ
フォスファターゼを用いる場合は基質として０−ニトロ
フェニルフォスフェート等、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン−ジー
（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリ
フェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等を用いること
ができる。

′本発明においては、検体として例えば血清、血漿、尿
またはこれらの同等物を用いることができる。

本発明の測定方法は前述のとおりであるが、がかる測定
方法を実施する際の測定試薬及び測定用のキットを、前
記した測定方法におけるそれぞれの抗体及びそのフラグ
メントの組合せを使用した固相抗体及び標識抗体を基本
として構成できる。

すなわち、測定試薬は前記それぞれの測定方法における
固相抗体及び／または標識抗体とからなる。また測定用
のキットは、これら測定試薬と、更に必要な溶解剤；洗
浄剤；酵素を標識物質として用いる場合には基質及び反
応停止剤等からなる。

本発明の抗体又はそのフラグメントは、本発明の測定方
法、更には上記測定試薬及び測定用のキットに限らず、
当該抗体等を好ましくは固相上に結合して、動物オステ
オカルシンの分離精製や免疫吸着体として用いることが
できる。

（ホ）発明の効果 本発明の抗体は、ヒトを含む動物オステオカルシンに対
してそれぞれ特異的に結合する。従って、この抗体を用
いることにより、ヒト・オステオカルシン、ラット・オ
ステオカルシン等と高特異的。

高感度に測定することが可能となり、これらの測定をす
ることにより前者はヒトの骨代謝系の異常疾患の診断・
治療に、また後者は骨代謝系の薬剤開発において病態モ
デルとしてよく用いられるラット等の治療薬効果判定等
に有用に用いられる。

以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明する。

実施例１　（ラット・オステオカルシンＮ末端側１〜２
０残基のアミノ酸配列領域中に認識部位を有するポリク
ラローナル抗体の作成） （Ａ）ラット・オステオカルシンＮ末端側１〜２０残基
のペプチドの合成 ラット・オステオカルシンのＮ末端側に特異的なアミノ
酸配列１〜２０残基及び２１残基目にシスティンを入れ
た、第２図で示すペプチドを合成した。

合成についてはＡＢＩ社ペジペプチド合成機いた。ペプ
チドの名称をＲＯｓｔ　−Ｎ　（２０）とした。

（Ｂ）抗原（ＲＯｓｔ　−Ｎ、（２０）とキャリヤータ
ンパクの結合体）の作成 キーホール　リンペット　ヘモシアニン（ＬＫＨ）をキ
ャリヤータンパクとし、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸
）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）によりＫＬ
ＨをＭＢＳ化した。一方、ＲＯｓｔ　−Ｎ（２０）を２
−メルカプトエタノールによりＳＨ基をフリーにし、Ｍ
ＢＳ（［：、ＫＬ）（にＲＯｓｔ−Ｎ　（２０）を滴下
しながら反応溶液をｐＨ６，０〜６．５に保ちつつ反応
させた。３時間反応後、透析し、得られた生成物を抗原
として用いた。

（Ｃ）ポリクローナル抗体の作成 ＲＯｓｔ　−Ｎ（２０）のＫＬＨ結合体を５００　μｇ
　、／　１ｓｈｏｔにて家兎に免疫をしな。

２週間間隔で６回免疫後、抗体価が上昇したため採血を
し、抗体をプロティンＡ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅで精製
し、目的とする抗体を得な。

実施例２（ラット・オステオカルシンＣ末端側４３〜５
０残基のアミノ酸配列領域中に認識部位を有するポリク
ローナル抗体の作成）（Ａ）ラット・オステオカルシン
Ｃ末端側４３〜５０残基のペプチドの合成 ラット・オステオカルシンのＣ末端側に特異的なアミノ
酸配列４３〜５０残基を有する第４図で示すペプチドを
ＡＢＩ社ペジペプチド合成機いて合成した。このペプチ
ドの名称をＲＯｓｔ−Ｃ（８）とした。

（Ｂ）抗原＜ＲＯｓｔ−Ｃ（８）とキャリヤータンパク
の結合体）の作成 ＲＯｓｔ　−Ｃ（８）とＫＬＨとを同重量ずつ結合し、
カルボジイミド（ＤＣＣ）を反応させ、ＲＯｓｔ　−Ｃ
（８）とＫＬ）Ｉの結合体を作成した。

得られた生成物をＨＰＬＣのゲル濾過を用いて生成した
。

（Ｃｌポリクローナル抗体の作成 ＲＯｓｔ　−Ｃ（８）のＫＬＨ結合体を、５００μｇ／
ｌ　５ｈｏｔにて家兎に免疫した。以後は実施例１と同
様にして、目的とする抗体を得た。

実施例３（ラット・オステオカルシンＮ末端側１〜２５
残基のアミノ酸配列領域中に認識部位を有するポリクロ
ーナル抗体の作成）（Ａ）ラット・オステオカルシンＮ
末端側１〜２５残基のペプチドの合成 ラット・オステオカルシンのＮ末端側に特異的なアミノ
酸配列１〜２５残基および２６残基目にシスティンを入
れた、第３図で示すペプチドを合成した。

合成についてはＡＢＩ社ペジペプチド合成機いた。この
ペプチドの名称をＲＯｓｔ　−Ｎ（２５）とした。

（Ｂ）抗原（ＲＯｓｔ　−ＮＯ２５）　ヤリャータンパ
クの結合体）の作成 ＫＬＨをキャリヤータンパクとし、ＭＢＳによりＭＢＳ
化した。一方ＲＯｓｔ　−Ｎ（２５）を２−メルカプト
エタノールによりＳＨ基をフリーにし、ＢＭＳ化ＫＬＨ
にＲＯｇｔ　−Ｎ　（２５）を滴下しながら反応溶液を
ｐＨ６，０〜６，５に保ちつつ反応させた。３時間反応
後、透析し、得られた生成物を抗原として用いた。

（Ｃ）ポリクローナル抗体の作成 ＲＯｓｔ−Ｎ（２５＋＜７）ＫＬＨ結合体を５００．ｕ
ｇ／１ｓｈｏｔにて家兎に免疫しな。

２週間間隔で６回′免疫後、抗体価が上昇したため採血
をし、抗体をプロティンＡ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅで精
製し、目的とする抗体を得な。

実施例４（完全ラット・・オステオカルシン測定系の構
成〉 （Ａ）抗ＲＯｓｔ−Ｃ（８）抗体（Ｆ（ａｂ’）２のＨ
ＲＰ標識化； 前記実施例２により得られた抗ＲＯｓｔ　−Ｃ（８）抗
体の２．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液溶液１仁ｌＩＭの酢
酸緩衝液（ｐＨ４゜２１１００μｇと、４０Ｍｇのペア
シンを２０Ｍｇの同緩衝液に溶解して加え、３７℃、４
時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳにて平衡化したセ
ファデックス０２５カラム（φ２　ａｍ　Ｘ　４５ｃｍ
　）を用いて分離しＰ（ａｂ’）２を採取した。

得られた抗ＲＯｓｔ　　Ｃ（８）　Ｆ（ａｂ’　＋２の
１　ｍｙ　／　ｍｍ１０１ＯＩリン酸０．１５Ｍ　　Ｎ
ａ１ｌ　（ｐＨ７，４）溶液２ｍｌに、ＭＢＳＩＯ■／
ｍｌの濃度のジメチルホルムアミド溶液５０μｍを添加
し、２５℃の温度で３００分間反応せた。次いでセファ
デックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリ
ン酸Ｍ衝液＜０．１ＭＰＢ）（ｐ）１６．０）でゲル濾
過を行い、マレイミド化抗体と未反応ＭＢＳとを分離し
た。

一方、ＨＲＰの１０ｍｇ　／　ｍｌの０．１　ＭＰＨ（
ｐ）１６．５）溶液２ｍｌにＳ−アセチルメルカプト無
水コハク酸の６０■／　ｍｌジメチルホルムアミド溶液
１２０μｍｌを加え、２５℃で２時間反応させた。次に
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液＜ｐＨ７，０）を８（１０
μｌ　、０．１　ＭＥＤＴＡ１６０　、ｔｃＪ！　、１
Ｍヒドロキシルアミン１．６ｍＭを加え、０℃で４分間
反応させた。その後、反応液をコロジオンバッグに入れ
、０．１　ＭＰＢ　＜ｐＨ６，ｏ）、５ｍ　ＭＥＤＴＡ
含有溶液を用いて、４℃で３日間透析し、チオール化Ｈ
ＲＰを得た。

次に、マレイミド化抗体２■とチオール化ＨＲＰ４■と
を混合し、コロジオンバッグを用いて水冷下に４〜１０
■／　ｍｌの蛋白濃度になるまで濃縮し、１５〜２０℃
で一夜放置した。その液を、ウルトロゲルＡＣＡ４４（
ＬＫＢ社）を充填したカラムでゲル濾過し、ＨＲＰ［識
抗ＲＯｓｔ　−Ｃ（８Ｊ　Ｆ（ａｂｌｚを得た。

（Ｂ）抗体固定化ビーズの調製： ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ＞をよく洗浄してか
ら、抗ＲＯｓｔ　−Ｎ（２０）及び抗ＲＯｓｔ　−Ｎ（
２５）抗体の２０Ｍｇ　／　ｍｌの濃度を有するＰＢＳ
溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄
し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液中に
、４℃の温度で１昼夜放置してポストコーティング処理
をして、抗ＲＯｓｔ　−Ｎ（１２０）　、抗ＲＯｓｔ　
−Ｎ（２５）抗体固定化ビーズを得た。

（Ｃ）測定系の構成； （Ｂ）で調製した、抗ＲＯｓｔ　−Ｎ（２０）抗体固体
化ビーズ１個とくオクタワラＹ、　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ
ｌＲｉｓｅａｒｃｈ　Ｖｏｌ、２．　ｐ４４２−４４６
．　１９８１）に準じて精製したラット・オステオカル
シン（標準物質）を０〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲で含有す
る１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍ　　ＴＢＳ　（ｐＨ８，０
）　２００μｇと（Ａ）で作成したＨＲＰ標準抗体の１
％ＢＳＡ含有０．０５Ｍ　　ＴＢＳ（ｐＨ８，０）溶液
２００μρとを試験管に添加して、２５℃の温度で２時
間インキュベートした。次に試験管内の溶液を吸引除去
した後、０．０５Ｍ　　ＴＢＳ＜ｐＨ８，０）で線状し
てから、３．３’　、　５．５’　−テトラメチルベン
ジン塩酸塩０．０２％Ｈ２Ｏ２２，５ｍＭを含有する０
、１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４ｊ）を０゜４ｍ
１ずつ各試験管に加え、２５℃の温度で３００分間反応
せた後、反応停止剤としてＩＮ硫酸水溶液を１ｍ１ずつ
加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光
光度計を用いて４５０ｎｍの波長における吸収強度を測
定し、これを標準物質濃度０〜１０ｎｇ／ｍｌに対応し
てプロットすることにより検量線を作成した。（第５図
） 実施例５（完全ラット・オステオカルシン及びフラグメ
ントラット・オステオカルシンの合計量の測定系の構成
） ＋Ａ＋サンドイッチ法 実施例４（Ｂ）で調製した抗ＲＯｓｔ　−Ｎ（２５）抗
体を固定したビーズと、前記実施例１で作成した抗ＲＯ
ｓｔ　−Ｎ　（２０）抗体を実施例４（Ａ）の方法と同
様にして調製したＨＲＰ標識ＲＯｓｔ　−Ｎ（２０）Ｆ
（ａｂ’）２と、ラット・オステオカルシンの０〜１０
ｎｇ／ｌｒ＋Ｉを含有する溶液とを用いて、実施例４（
Ｃ）と同様な方法でラット・オステオカルシン濃度と吸
光度との関係を求め第６図に示した。この結果から本発
明の測定方法を用いれば０．０２ｎｇ／ｍｌまで、精度
よくラット・オステオカルシンのＮ末端フラグメントを
測定可能であることがわかる。

（Ｂ）競合法 実施例４で調製した抗ＲＯｓｔ　−Ｎ（２０１抗体を固
定したビーズと、実施例４の方法と同様にして調製しな
ＨＲＰ標識ＲＯ５ｔ　−Ｎ　（２０）ペプチドを含有す
る溶液と、既知の濃度のＲＯｓｔ　−Ｎ（２０ｆペプチ
ドを添加し、Ｎ末端ペプチド濃度と吸光度との関係を求
め、第７図に示しな。

実施例６（ラット血清のオステオカルシンの測定）実施
例４，５によって確立しな「完全う・・・ト・オステオ
カルシン」及び［完全う・・ノド・オステオカルシン及
びフラグメント・ラット・オステオカルシン合計量」の
測定系を用いて（ａ）ラットＳｈａｍ群、（ｂ）ラット
Ｃｏｎｔｒｏ１群（○ＶＸ＋）（Ｃ）う’７トＤ■３投
与群（ＯＶＸ”　＋ＶＤ３　）　　（１−Ｌ　Ｅｘ　、
／ｍｌ　）について、その血清中のラット・オステオカ
ルシン値を測定した。

その結果を第８（ａ）　　＜完全ラット・オステオカル
シン測定系）及び第８（ｂｌ　　（フラグメント・ラッ
ト・オステオカルシン測定系）図に示す。第８（ａ）図
及び第８（ｂ）図から（ａ＞群に対して＋ｂ）群が上昇
し、また、Ｖ　Ｄ　３投与によって（Ｃ）群はさらに高
値を示し、本測定法が実際のう・ント血中のオステオカ
ルシンを測定できることが明らかである。

実施例７くヒト・オステオカルシンＮ末端側１〜２５残
基のアミノ酸配列領域中に認識部位を有するポリクロー
ナル抗体の作成） （Ａ）ヒト・オステオカルシンＮ末端側１〜２５残基の
へプチドの合成 ヒト・オステオカルシンのＮ末端に特異的なアミノ酸配
列１〜２５残基および２６残基目にシスティンを入れた
、第１図で示すペプチドを合成した。

合成についてはＡＢＩ社ペジペプチド合成機いた。この
ペプチドの名称をＨｏ５ｔ　−Ｎ（２５）としな。

（Ｂ）抗原（Ｈｏｓｔ　−Ｎ（２５）とキャリヤータン
パクの結合体）の作成 ＫＬＨをキャリヤータンパクとし、ＭＢＳによりＫＬＨ
をＢＭＳ化した。一方、Ｈｏ５ｔ　−Ｎ（２５）を２−
メルカプトエタノールによりＳＨ基をフリーにし、ＭＢ
Ｓ化ＫＬＨにＨｏ５ｔ　−Ｎ（２５１を滴下しながら反
応溶液をｐＨ６，０〜６．５に保ちつつ反応させた。３
時間反応後、透析し、得られた生成物を抗原として用い
た。

（Ｃ）ポリクローナル抗体の作成 Ｈｏ５ｔ−Ｎ（２５）のＫＬＨ結合体を５００μｇ／１
ｓｈｏｔにて家兎に免疫した。

２週間間隔で６回免疫後、抗体価が上昇したなめ採血を
し、抗体をプロティンＡ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅで精製
し、目的とする抗体を得な。

実施例８（ヒト・オステオカルシンＣ末端側４３〜４９
残基のアミノ酸配列領域中に認識部位を有するポリクロ
ーナル抗体の作成） （Ａ）ヒト・オステオカルシンＣ末端４３〜４９残基の
ペプチドの合成 ヒト・オステオカルシンＣ末端に特異的なアミノ酸配列
４３〜４９残基を有する第９図に示すペプチドをＡＢＩ
社ペジペプチド合成機いて合成した。

このペプチドの名称をＩ（Ｏｓｔ−Ｃ（７）としな。

（Ｂ）抗原＜Ｈｏ５ｔ−Ｃ（７）とキャリアータンパク
の結合性）の作成 Ｈｏ５ｔ　−Ｃ（７）とＫＬＨとを同重量ずつ混合し、
ＤＣＣを反応させ、Ｈｏ５ｔ−Ｃ（７）とＫＬＨの結合
体を作成した。

得られた生成物をＨＰＬＣのゲル濾過を用いて生成した
。

（Ｃ）ポリクローナル抗体の作成 Ｈｏ５ｔ−Ｃ（７）のＫＬＨ結合体を、５００μｇ／ｌ
　５ｈｏｔにて家兎に免疫し、以後は実施例１と同様に
して、目的とする抗体を得た。

実施例９（完全ヒト・オステオカルシン測定系の構成） （Ａ）抗Ｈｏ５ｔ−Ｃ（７）抗体Ｐ（ａｂ’）２のＨＲ
Ｐ標識化； 実施例４．ｉＡ）に準じて標識化を行いＨＲＰ標識抗Ｈ
ｏ５ｔ　−Ｃ（７）　Ｆ（ａｂ’）２を得た。

（Ｂ）抗体固体化ビーズの調製； 実施例４．（Ｂ）に準じて、固定化を行い、抗ＨＯｓｔ
　−Ｎ（２５）抗体固定化ビーズを得た。

（Ｃ＞測定系の構成くサンドイッチ法〉１実施例４．（
Ｃ）に準じて測定系を構成し、作成した検量線を第１０
図に示す。

＜Ｄ）検体の測定； （Ｃ）の測定系を用いてＨ）副甲状腺機能く原発性及び
二次性）亢進症、（ｉｉ）正常人（２０〜４０代及び老
人）についてその血清中のヒト・オステオカルシン値を
測定した。

その結果を第１１図に示した。第１１図から（ｉｉ）群
に対して（ｉｉ群は上昇し、本測定系が実際のヒト血中
のオステオカルシンを測定できることが明らかである。

実施例１０（フラグメント・ヒト・オステオカルシン測
定系の構成） （Ａ）抗Ｈｏ５ｔ　−Ｎ（２５）抗体のＨＲＰ標識化；
実施例４．（Ａ）に準じて標識化を行いＨＲＰ標識抗Ｈ
Ｏ５ｔ　−Ｎ（２５）抗体を得な。

（Ｂ）抗体固定化ビーズの調製； 実施例４．（Ｂ）に準じて、抗Ｈｏ５ｔ　−Ｎ　（２５
）抗体固定化ビーズを得た。

（Ｃ１測定系の構成（競合法）； 実施例５．（Ｂ）に準じて測定系を構成し、作成した検
量線を第１２図に示す。

第１２図から非常に高感度なフラグメント測定法が得ら
れたことが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例７において合成したヒト・オステオカ
ルシンＮ末端側１〜２５残基のペプチド（ＨＯ５ｔ　−
Ｎ　（２５）　）を示す。 第２図は、実施例１において合成しなう・ｙト・オステ
オカルシンＮ末端側１〜２０残基のペプチド（ＲＯｓｔ
−Ｎ（２０））を示す。 第３図は、実施例３において合成したラット・オステオ
カルシンＮ末端側１〜２５残基のペプチド（ＲＯｓｔ−
Ｎ（２５））を示す。 第４図は、実施例２において合成したラット・オステオ
カルシンＣ末端側４３〜５０残基のペプチド（ＲＯｓｔ
　−Ｃ（＆ｌ）を示す。 第５図は、実施例４（Ｃ）において作成した完全ラット
・オステオカルシン測定系の検量線を示す。 第６図は、実施例５（Ａ）において作成したサンドイッ
チ法による完全及びフラグメント・ラット・オステオカ
ルシン合計量の測定系の検量線を示す。 第７図は、実施例５（Ｂ）において作成した競合法によ
る完全及びフラグメント・ラット・オステオカルシン合
計量の測定系の検量線を示す。 第８図は、実施例６におけるラット血清のオステオカル
シンの測定結果について、実施例４および５の完全ラッ
ト・オステオカルシン測定系を用いた場合（ａ＞及びフ
ラグメント・オステオカルシン測定系を用いた場合（ｂ
）をそれぞれ示す。 第９図は、実施例８において合成したヒト・オステオカ
ルシンＣ末端４３〜４９残基のペプチド（ＨＯｓｔ　−
Ｃ（７）’）を示す。 第１０図は、実施例９において作成した完全ヒト・オス
テオカルシンの測定系の検量線を示す。 第１１図は、実施例９におけるヒト血中のオステオカル
シンの測定結果を示す。 第１２図は、実施例１０において作成したフラグメント
・ヒト・オステオカルシンの測定系の検量線を示す。 第１図 第２図 第３図 −Ｃｙｓ　−Ｇｌｕ　−Ｌｅｕ　−Ｃｙｓ第４図 Ｌｙｓ　−Ａｒｇ　−ＩＩｅ　−Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ　−
Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｔ第９図 Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｐｈｅ　−Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ　−
Ｐｒｏ　−Ｖａ１第５図 フシト＾ステオカルンン（ｎｇ／ｍＬ）フットオスが才
力）レンツ（ｎｏ／ｍｌ）第８図（ａ） Ｓｈａｍ　　　　Ｃｏｎｔｒｏｌ　　　　ＶＤ３第８図
（ｂ） （ＯＶＸ−）（（〕％〆ｘ１１ノ（ＯＶＸ％ＶＤｓｌ（
ａ）（ｂ）（ｃ） 第１０図 ０　　０．Ｑｌ、２５　　　　　　　Ｐ、ｔ　　　　　
　　　　　　　　　３０３／　　　　　　　ＦＸ￥オフ
７オカルンン（ｎｇ／ｍｌ）第１ｊ図 イス７オカルソン（ｎｇＡηＩ） 手続補正書 １．事件の表示 特願平　２　−　２８４１８８　　号 ２、発明の名称 動物オステオカフレシンの測定方法 （３００）帝人株式会社 ゝ−ノー１．− （１）明細書の１特許請求の範囲」を別紙のとおりに訂
正する。 以上 〈別紙） 特許請求の範囲 １、　サンドイッチ法による免疫学的測定方法において
、固相抗体と標識抗体のいずれか一方の抗体として動物
オステオカルシンのＮ末端側のアミノ酸配列領域中に特
異的な認識部位を有する抗体（Ｎ末端抗体〉を用い、他
方の抗体として動物由来オステオカルシンのＣ末端側の
アミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有する抗体（
Ｃ末端抗体）を用いることを特徴とする測定方法。 ２、　該Ｎ末端抗体が動物オステオカルシンのＧｌａ残
基をＧｌｕ残基におきかえたＮ末端側のアミノ酸配列領
域中に特異的な認識部位を有する抗体である請求項１記
載の測定方法。 ３、　該Ｎ末端抗体が、動物オステオカルシンのＮ末端
側１〜２５のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有す
る抗体であることを特徴とする請求項１記載の測定方法
。 ４、　該Ｎ末端抗体が、動物オステオカルシンのＮ末端
側１〜２０のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有す
る抗体であることを特徴とする請求項１記載の測定方法
。 ５、　該Ｃ末端抗体が、動物オステオカルシンのＣ末端
側３６〜５０のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有
する抗体であることを特徴とする請求項１記載の測定方
法。 ６、　該動物オステオカルシンの動物が、ヒト、ラット
又はマウスであることを特徴とする請求項１記載の測定
方法。 ７、　該標識抗体が抗体のＦ（ａｂ’）２又はＦａｂ’
分画であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。 ８、　免疫学的測定方法において抗体として動物オステ
オカルシンのＮ末端側アミノ酸配列を特異的に認識する
抗体（Ｎ末端抗体）を用いることを特徴とする測定方法
。 ９、　該Ｎ末端抗体が動物オステオカルシンのＧｌａを
ＧｌｕにおきかえたＮ末端側のアミノ酸配列に特異的な
認識部位を有する抗体であることを特徴とする請求項８
記載の測定方法。 １０゜゛該免疫学的測定方法が固相抗体と標識抗体を用
いるサンドイッチ法によるものであることを特徴とする
請求項８記載の方法。 １１、該標識抗体が抗体のＦ（ａｂ’）２．　Ｆａｂ’
分画であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。 １２、該免疫学的測定方法が競合法によるものであるこ
とを特徴とする請求項８記載の測定方法。 １３、該Ｎ末端抗体が、動物オステオカルシンのＮ末端
側１〜２５のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有す
る抗体であることを特徴とする請求項８記載の測定方法
。 １４、該Ｎ末端ｉｔが動物オステオカルシンのＮ末端側
１〜２０のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有する
抗体であることを特徴とする請求項８記載の測定方法。 １６、動物オステオカルシンのＧｌａ残基がＧｌｕ残基
でおきかえられているＮ末端側１〜２０残基のアミノ酸
配列領域中に特異的な認識部位を有する抗体。 Ｈ１動物オステオカルシンのＧｌａ残基がＧｌｕ残基で
おきかえられているＮ末端側１〜２５残基のアミノ酸配
列領域中に特異的な認識部位を有する抗体。 旦、動物オステオカルシンのＣ末端側の３６〜４９又は
３６〜５０残基のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部
位を有する抗体。 旦、該動物オステオカルシンの動物がヒト、ラットもし
くはマウスである請求項１６〜１８のいずれか１項に記
載の抗体。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サンドイッチ法による免疫学的測定方法において、
   固相抗体と標識抗体のいずれか一方の抗体として動物オ
   ステオカルシンのＮ末端側のアミノ酸配列領域中に特異
   的な認識部位を有する抗体（Ｎ末端抗体）を用い、他方
   の抗体として動物由来オステオカルシンのＣ末端側のア
   ミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有する抗体（Ｃ
   末端抗体）を用いることを特徴とする測定方法。 ２、該Ｎ末端抗体が動物オステオカルシンのＧｌａ残基
   をＧｌｕ残基におきかえたＮ末端側のアミノ酸配列領域
   中に特異的な認識部位を有する抗体である請求項１記載
   の測定方法。 ３、該Ｎ末端抗体が、動物オステオカルシンのＮ末端側
   １〜２５のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有する
   抗体であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。 ４、該Ｎ末端抗体が、動物オステオカルシンのＮ末端側
   １〜２０のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有する
   抗体であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。 ５、該Ｃ末端抗体が、動物オステオカルシンのＣ末端側
   ３６〜５０のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有す
   る抗体であることを特徴とする請求項１記載の測定方法
   。 ６、該動物オステオカルシンの動物が、ヒト、ラット又
   はマウスであることを特徴とする請求項１記載の測定方
   法。 ７、該標識抗体が抗体のＦ（ａｂ′）＿２又はＦａｂ′
   分画であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。 ８、免疫学的測定方法において抗体として動物オステオ
   カルシンのＮ末端側アミノ酸配列を特異的に認識する抗
   体（Ｎ末端抗体）を用いることを特徴とする測定方法。 ９、該Ｎ末端抗体が動物オステオカルシンのＧｌａをＧ
   ｌｕにおきかえたＮ末端側のアミノ酸配列に特異的な認
   識部位を有する抗体であることを特徴とする請求項８記
   載の測定方法。 １０、該免疫学的測定方法が固相抗体と標識抗体を用い
   るサンドイッチ法によるものであることを特徴とする請
   求項８記載の方法。 １１、該標識抗体が抗体のＦ（ａｂ′）＿２、Ｆａｂ′
   分画であることを特徴とする請求項１１記載の測定方法
   。 １２、該免疫学的測定方法が競合法によるものであるこ
   とを特徴とする請求項８記載の測定方法。 １３、該Ｎ末端抗体が、動物オステオカルシンのＮ末端
   側１〜２５のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有す
   る抗体であることを特徴とする請求項８記載の測定方法
   。 １４、該Ｎ末端が動物オステオカルシンのＮ末端側１〜
   ２０のアミノ酸配列中に特異的な認識部位を有する抗体
   であることを特徴とする請求項８記載の測定方法。 １５、動物オステオカルシンのＧｌａ残基がＧｌｕ残基
   でおきかえられているＮ末端側１〜２０残基のアミノ酸
   配列領域中に特異的な認識部位を有する抗体。 １６、動物オステオカルシンのＧｌａ残基がＧｌｕ残基
   でおきかえられているＮ末端側１〜２５残基のアミノ酸
   配列領域中に特異的な認識部位を有する抗体。 １７、動物オステオカルシンのＣ末端側の３６〜４９又
   は３６〜５０残基のアミノ酸配列領域中に特異的な認識
   部位を有する抗体。 １８、該動物オステオカルソンの動物がラットもしくは
   マウスである請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の
   抗体。