JPH0723891B2 - 変性されたタンパク質分析物、とくにＨｂ Ａ▲下１▼Ｃの免疫アツセイ、およびそれに対する抗体 - Google Patents

変性されたタンパク質分析物、とくにＨｂ Ａ▲下１▼Ｃの免疫アツセイ、およびそれに対する抗体

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JPH0723891B2
JPH0723891B2 JP60240703A JP24070385A JPH0723891B2 JP H0723891 B2 JPH0723891 B2 JP H0723891B2 JP 60240703 A JP60240703 A JP 60240703A JP 24070385 A JP24070385 A JP 24070385A JP H0723891 B2 JPH0723891 B2 JP H0723891B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、あるタンパク質を抗体試薬と結合する方法、
例えば、免疫アッセイの実施においてなされるような前
記方法に関する。とくに、本発明は抗体、その断片など
をタンパク質およびポリペプチド中の特定の線状ペプチ
ドエピトープに結合することに関する。本発明は、分析
的に意味のあるタンパク質、例えば、Hb A1cとして知
られているヘモグロビンのグリコシル化された形態の決
定において有用である。個体の血液中のヘモグロビンの
グルコシル化の程度の決定は、糖尿病のグルコースレベ
ルの調節の有用な指数を提供する。さらに、Hb A1c中
のグリコシル化Ｎ−末端ペプチド残基を特異的に認識す
るモノクナロール抗体が提供される。
タンパク質、とくに分析的に意味のあるタンパク質に結
合する抗体の特異性を改良することは絶えず必要とされ
ている。生物学的試料、例えば、血液の特異性検出は、
タンパク質の接近可能な独特の結合部位またはエピトー
プへ向けられる抗体試薬を得る能力により限定される。
特定のタンパク質の特異的検出のために最も望ましいエ
ピトープが抗体試薬への結合のために接近不可能である
か、あるいは限定された接近可能性をもつだけである場
合が存在する。
糖尿病の患者の血液試料中のHb A1cとして知られてい
るヘモグロビンのグリコシル化された形態の決定は一例
である。ヘモグロビンはアミノ酸の４つまでの鎖（サブ
ユニット）から構成されたタンパク質のテトラマーであ
り、鎖の各々は約143単位でありかつ約64,000の合計分
子量を有する。この分子の１端（ベーターサブユニット
のNH2−末端）に、グルコースと反応しうるバリン単位
が存在する。ヘモグロビンのグルコシル化は、グルコー
スおよびバリンのアルファーアミノ基に随伴する非酵素
的反応により起こる。反応成分間のシッフ塩基の生成
後、グルコースは１−デオキシフルクトーバリンを形成
するアマドリ転位を行う。この複合体は共有結合であり
かつ本質的に非可逆的である。グルコシル化反応は、反
応成分、例えば、ヘモグロビンおよびグルコースの濃度
により支配される。正常（糖尿病ではない）個体におい
て、合計のヘモグロビンのほぼ３％はグルコシル化され
ている。ベーター鎖のＮ−末端上の１−デオキシフルク
ト−バリンをもつヘモグロビンテトラマーは、グルコシ
ル化されているまたはA1cヘモグロビンとして識別され
る。
糖尿病患者におけるグルコースレベルは血液中のグルコ
ースレベルに直接依存してグルコシル化の速度を増加さ
せるために十分に高く、そして糖尿病の状態のひどさを
反映する。ヘモグロビンでは、A1cレベルは約５〜12％
に上昇する。ヘモグロビンの循環寿命は約120日である
ので、グルコシル化ヘモグロビンの測定はその期間につ
いて平均のグルコースレベルを反映する値を与えるであ
ろう。特に、グルコース分が高い食事は高いグルコシル
化ヘモグロビンまたは血清アルブミンレベルにおいて反
映されないであろう。こうして、グルコシル化ヘモグロ
ビン分の測定は平均の循環グルコースレベルのより正し
い状況を与え、こうして患者の病気の状態のより正しい
状況を与える。
米国特許第4,247,533号は、Hb A1cに対する抗体がHb
A1cの注射により特別のヒツジにおいてレイズされ（rai
sed）かつグルコシル化されていないヘモグロビンで吸
収されて、Hb A1cとグルコシル化されていないHbとの
間を区別するポリクローナル抗体を形成したと報告され
ている分析技術を開示している。次いで、抗体は試料中
のグルコシル化ヘモグロビンの比率を決定する試験のた
めの基準を形成する。しかしながら、試験は適当な特異
性を獲得するために適当な免疫化ヒツジと抗体吸収を必
要にする。したがって、特定のポリクローナル抗体を生
産することは経費がかかりかつ困難である。この吸収の
アプローチにより生産される抗体調製物は、力価および
親和性が低いことが報告されている。このアプローチの
再現性はまた問題を有する。なぜなら、ヒトヘモグロビ
ンの臨床的試料の分析のための使用を記載する最近の報
告は存在しない。
Hb A1cに対して特異的な抗体を得る他の試みは、米国
特許第4,478,744号に記載されている。これらの研究者
は、正常のヘモグロビン分子の代わりに合成ペプチドの
免疫原を免疫化剤として使用した。この物質を、通常血
液流中にHb A1cをもたない動物、例えば、ヒツジに注
射した。この合成ペプチドの免疫原は、Ｎ−末端ヘモグ
ロビン配列中に最初の４〜10アミノ酸の間に相当するア
ミノ酸配列を有するグルコシル化ペプチド残基から構成
されていた。下に報告する引き続く研究により、合成ペ
プチド免疫原に対してレイズされたヒツジポリクローア
ル抗血清は、グルコシル化形態、Hb A1cに対する検出
可能な特異性をもたないことが確認されている。
したがって、問題のタンパク質への抗体試薬の特異的結
合を可能とする抗体試薬および結合条件を設計するため
のアプローチを開発する必要はまだ満足されていない。
グルコシル化タンパク質、例えば、Hb A1cのような特
定のタンパク質の決定のための免疫アッセイを、先行の
研究者は案出することができなかったことが明らかであ
る。
定義 アミノ酸 略号 アルギニン Arg アスパラギン Asp グルタミン酸 Glu リジン Lys セリン Ser アスパラギン Asn グルタミン Gln グリシン Gly プロリン Pro スレオニン Thr アラニン Ala ヒスチジン His システイン Cys メチオニン Met バリン Val イソロイシン Ile ロイシン Leu チロシン Tyr フェニルアラニン Phe トリプトファン Trp 特定のタンパク質への高度に特異的な免疫結合は、前記
タンパク質中の線状ペプチドエピトープに対する抗体試
薬を形成し、そして前記タンパク質を十分に変性してそ
の中の線状ペプチドエピトープを露出するかあるいは露
出を増加した後、前記抗体試薬を前記タンパク質と接触
させることによって達成できることが今回発見された。
標的とされる線状ペプチドエピトープは、一般原則とし
て、少なくとも２つ、通常15より少ないアミノ酸単位か
らなる。エピトープはペプチド鎖のＮ−またはＣ−末端
に現れることができ、あるいはタンパク質中のペプチド
鎖に沿って現れることができ、そしてペプチドではない
基および側鎖、例えば、炭水化物、例えば、モノ−、オ
リゴ−、および多糖基、リン酸塩、脂質、硫酸塩、カル
バミル、スルホキシドなど、およびタンパク質の主鎖へ
共有結合することを発見することができる他の化学的基
を包含する基で変性することができる。このような基
は、後翻訳修飾（post−translational modificatio
n）により付加することができるものを包含し、前記修
飾は酵素が仲介するものであるか、酵素でない化学的反
応の結果であることができ、それゆえ環境的露出により
引き起こされるタンパク質中で自然に起こりうる修飾を
包含する。抗体試薬は、通常、免疫原担体物質、通常問
題のタンパク質と異る物質へ結合した線状ペプチドエピ
トープからなる合成ペプチドに対してレイズされるであ
ろう。モノクローナルでありかつ線状ペプチドエピトー
プに対して高い特異性について選択される抗体を得るた
めの体細胞の交雑技術を用いることがとくに好ましいで
あろう。
タンパク質の変性は、タンパク質の有意量を溶液中に維
持しながら、抗体の結合のために選択されたペプチドエ
ピトープを露出するか、あるいはその露出を増加する本
質的に任意の方法で達成することができる。物理的処理
または化学的処理、後者はタンパク質の消化を含む、を
最適な変性条件の選択に利用できる。必要な変性の程度
は、各タンパク質についてかつ得られる免疫結合の意図
する用途の各々、例えば、所望の免疫アッセイの条件に
ついて本質的に経験的に決定されるであろう。変性の効
果は、少なくとも選択されたペプチドエピトープが存在
するタンパク質の区域を実質的に直線化しかつそれを抗
体試薬への結合に十分な取囲む水性媒体へそれを露出す
ることである。
本発明は、タンパク質がその自然状態にあるとき、免疫
結合に対して実質的に接近不可能であるか、あるいはそ
のための制限された接近可能性を有する線状ペプチドエ
ピトープに、抗体試薬を結合させることによって、タン
パク質を決定する免疫アッセイの実施およびキットの調
製を可能とする。とくに、グルコシル化タンパク質、例
えば、グルコシル化ヘモグロビンおよびアルブミン、と
くに血液のような生物学的流体中のHb A1cの高度に特
異的な決定のための手段が提供される。Hb A1c中に現
れる合成グルコシル化Ｎ−末端ペプチド残基に対してレ
イズされたモノクローナル抗体は、ヘモグロビンのグル
コシル化ベータ−サブユニット中のこのような残基へ特
異的に結合することがわかった。抗体は慣用のモノクロ
ーナル技術に従い種々の方法で調製することができる。
原理的には、免疫原担体へ化学的に結合した所望のＮ−
末端ペプチド残基からなる合成的に誘導された免疫原に
対する抗体を調製し、前記グルコシル化ペプチドは少な
くとも２つ、好ましくは約５〜15のHb A1cに対応する
アミノ酸単位を有する。得られる抗体はグルコシル化合
成ペプチドおよびヘモグロビンA1c分子中の対応する露
出されたエピトープに対して特異的である。
ポリペプチドまたはタンパク質は、溶液中で３次元の構
造を形成するアミノ酸の直線の配列として存在する。タ
ンパク質のこの３次元構造の自発的獲得を制御する因子
は、次のものを包含する： １、 ＣαおよびＣ′炭素原子のまわりの制限された回
転（ψ結合の回転）およびＮ−Ｃα窒素−炭素結合のま
わりの制限された回転（φ結合の回転）を有するペプチ
ド結合の平坦な構造。この制限された回転はペプチド結
合のまわりの運動を制限しかつ可能な立体配座を減少す
る。
２、 すべてのシス−ポリペプチドは側鎖の原子のため
の利用可能な立体配座の空間をきびしく制限するであろ
うから、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）はトランス配向を有す
る。
３、 ペプチドの主鎖および側鎖の異る官能基間の相互
作用はポリペプチドの３次元の折りたたみの原因とな
り、そしてこれらの相互作用の合計はタンパク質がこの
立体配座を保持するエネルギーを提供する。
これらの相互作用は、次のものを包含する： （ａ） 分散力−ここで振動する双極子が隣接原子間を
結合して、２つの原子間の吸引力を生成する。これらの
力は電子の外殻の反発により反作用を受ける（すなわ
ち、２つの原子が同一空間を占めることができない）。
（ｂ） 水素結合−ここで水素原子の全体の電子の外殻
は、水素が拘束される原子（水素受容体）上にシフトす
る。
（ｃ） 静電力−ここで異る型の原子は非対称電子分布
を有し、これにより反対電荷をもつ原子と相互作用しう
る部分的電荷をもつ。この相互作用は、簡単な双極子相
互作用であることができ、あるいは塩橋として存在する
ことができる。
（ｄ） ジスルフィド結合−システインアミノ酸のSH基
間の前記ジスルフィド結合はタンパク質の立体配座を安
定化する。ジスルフィド結合は、前述の分散力、水素結
合および静電力により開始されるタンパク質の３次元の
折りたたみに対して二次的である。
４、 タンパク質と水性の環境との間の相互作用は、水
溶性タンパク質のセルフアセンブリーの有機化に強力な
効果を有する。極性の水分子はタンパク質の表面上の疎
水性基を溶媒和し、そして分子の内部の中へ疎水性アミ
ノ酸側鎖を埋込む上で熱力学的に有利である（その結
果、水分子は同様な疎水性環境中に存在する）。既知の
タンパク質の最近の研究において、疎水性アミノ酸Ph
e、Leu、Ile、Val、TrpおよびTyrは中性または極性アミ
ノ酸よりも多い埋没された表面積を有する［サイエンス
（Science）229:834−838,1985）］。
タンパク質の表面の表面上の残基の多くは疎水性である
ことおよび埋没される残基は極性であるか、あるいは帯
電していさえすることができることにも注意すべきであ
る。埋没された極性基はタンパク質の内部の水素結合の
要件を満足し、そしてすべての内部の極性基の90％程度
に多くは水素結合に関与する。同様に、タンパク質の内
部中の帯電したアミノ酸塩橋中に最も含まれやすい。
タンパク質の立体配座は、次のような構造の階層に分割
することができる： １、 一次構造はポリペプチドの線状アミノ酸配列であ
る。
２、 二次構造は、ポリペプチド鎖が水素結合により安
定化される形態をいう。
３、 三次構造は、ポリペプチド鎖のその３次元構造へ
のポリペプチド鎖の折りたたみである。この構造は水素
結合、静電相互作用、疎水性相互作用により、およびジ
スルフィド結合により安定化される。
４、 四次構造は、２つのポリペプチド鎖が相互作用す
るとき、形成される構造をいう。相互作用の型は、三次
構造についてのものと同一である。
前述のポリペプチドとポリペプチドとの相互作用および
ポリペプチドと水性環境との相互作用は、自然タンパク
質分子の複雑な折りたたみおよび生ずる３次元構造の原
因である。この折りたたみの情報は、ポリペプチドのア
ミノ酸配列（一次構造）中に暗号化される。多くの場合
において、自然タンパク質は物理的または化学的変性に
より完全に変性されることができ（二次構造、三次構造
および四次構造の欠損により証明される）そして変性剤
を除去すると、構造および機能が自然タンパク質と区別
されえない分子に再び折りたたまれるであろう［アドバ
ンシズ・イン・プロテイン・ケミストリー（Adv.Rrot.C
hem.）29:205−229,1975;ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Journal of Biol.Chem.）25
1:3154−3157,1976］。
折りたたみ過程はエネルギー的に有利であり、そして得
られる自然３次元の立体配座はその最小エネルギー状態
にある（かあるいは少なくともそれに近い）。ポリペプ
チドの３次元の立体配座への折りたたみの結果、あるア
ミノ酸は分子の表面上において懸濁溶媒中に自由に接近
可能であり、一方他のアミノ酸は埋込まれておりかつ溶
媒へ接近不可能である。この概念は大量の生物学的デー
タにより、およびまたタンパク質の内部のアミノ酸に対
するタンパク質の表面上のアミノ酸の化学的反応性の差
により支持される。
３次元の立体配座は決して剛性の構造ではない。前述の
相互作用のほとんどは比較的弱く、そして絶えず破壊し
かつリフォームされつつある（しかしながら、一度に合
計の結合のほんのわずかの百分率が破壊されるだけであ
る）。最小の相互作用をもつペプチドセグメントはより
大きい数の相互作用をもつペプチドセグメントよりも大
きい移動性をもつことを期待できるであろう。より大き
い移動性をもつセグメントはより大きい数の立体配座を
もつことができ、それらの１つは抗体と相互作用するこ
とができる。自然タンパク質のこれらの移動性部分は最
も抗原性である部分であることが示唆された［ネイチャ
ー（Nature）312:127−124,1984］。
抗原と抗体との間の相互作用は、タンパク質構造を安定
化するものと同一である（すなわち、水素、静電的、疎
水性結合）。特異的でありかつ十分に親和性である相互
作用のためには、２つの相互作用する表面の相補性およ
び反対に帯電した基の適当な並置を維持して塩橋、水素
結合の供与体および受容体および疎水性ポケットを形成
することが必要である［アニュアル・リビューズ・オブ
・イムノロジー（Ann.Rev.Immunol.）1:87−117,198
3］。相補性が変化したとき（例えば、アミノ酸の置
換）、抗原に対する抗体の親和性は劇的に変更されう
る。
抗原上の接触部位は２つの群（１）直線または連続（se
quential）のものおよび立体配座のものに分解すること
ができる［アニュアル・リビューズ・オブ・イムノロジ
ー（Ann.Rev.Immunol.）2:67−101,1984］。
直線または連続の決定基（以下「決定因子」ともいう）
は、ほぼ２〜25の範囲のアミノ酸、通常10より少ないア
ミノ酸を有するタンパク質配列の単一の直線のセグメン
ト上に全体の抗原決定因子が存在するものである。
立体配座の決定因子は、配列上で距離をもって存在する
ペプチドの部分がタンパク質の抗原の３次元の折りたた
みにより密接に接触しているものである。したがって、
抗原決定因子またはエピトープはタンパク質の抗原の１
より多い部分から形成されている。例えば、リゾチーム
およびリゾチームに対するモノクローナル抗体を用いる
Ｘ回折の研究により、その抗体はリゾチームと位置29−
37および116−129において接触することが示された。こ
れらのアミノ酸は配列上で分離されているが、リゾチー
ム分子の表面上においてほぼ20×25Aの連続的バッチ（p
atch）を形成し、そして抗体結合部位の多数の原子と相
互作用する［ネイチャー（Nature）313:156−158,198
5］。また、立体配座の決定因子を認識する抗体はタン
パク質の変性された形態を認識しないであろうというこ
とがいえる。
抗タンパク質抗体を発生するための免疫化の慣用の手順
において、自然または半自然のタンパク質を動物に注射
し、この動物は時間が経過すると免疫原に対する免疫グ
ロブリンを生産する。ポリクローナル抗血清は、連続お
よび立体配座の両者の抗原決定因子を認識する抗体を含
有する可能性が最も強い。これらの決定因子は、自然タ
ンパク質の表面上に位置する可能性が最も強い。例え
ば、インフルエンザのウイルスの赤血球凝集素の膜の糖
タンパク質は４つの主要な抗原決定因子を有し、それら
の３つは糖タンパク質の表面に対して局在化されている
［ネイチャー（Nature）289:366−373および373−378,1
981］。
合成ペプチドまたは自然分子からの小さいペプチドを免
疫原として使用すると、得られる応答は連続の決定因子
（およびペプチドが到達できる限定された数の立体配
座）に対するもののみであることができる。自然タンパ
ク質（合成ペプチドと同一の配列を有する）へ結合を有
する抗体応答を生成する免疫原として合成ペプチドを使
用する試みにおいて、研究者らはいくつかの極性アミノ
酸を有する区域について自然タンパク質の配列を通して
サーチすることによって、免疫原を最初に設計した［Re
v−サイエンス（Science）229:932−940,1985］。これ
らの配列は自然タンパク質の表面上に存在する可能性が
統計学的により大きいため、抗体分子との反応に有利に
働くであろう。しかしながら、これらの親水性残基は疎
水性ペプチドよりも免疫原性に劣り、それゆえ他の合成
された免疫原は、これらの疎水性配列が表面の抗原上に
露出されることを希望して、疎水性に基づいたことが、
また、考えられた。両者の場合において、これらの方法
により生産される抗体の高い比率は見掛上自然の抗原と
反応し、これにより合成ペプチドが自然タンパク質の表
面上において見出されうる配列に相当するかぎり、合成
ペプチドに対してレイズされる抗体は自然抗原と反応性
であることが示唆される［ネイチャー（Natue）229:592
−596,1982］。見掛上自然のタンパク質と反応するタン
パク質内に埋込まれると理解すべきペプチドに相当する
ある種の合成ペプチドに対して生産される抗体について
の報告がいくつか存在する（PNAS 80:4949−4953,198
3）。この観察にどんな機構が原因となっているか明ら
かでない。
本発明に従い、自然タンパク質を目的をもって変性して
最適に連続または線状の抗原決定因子を露出して、この
ような決定因子に対して生産された抗体と相互作用する
ようにさせる。とくに、真に自然の抗原を含有する新鮮
な試料を必要とするアッセイにおいて、抗原の変性は絶
対の要件であろう。自然のタンパク質のエピトープが表
面にあるいはその付近に存在し、したがって抗体の相互
作用のために部分的に露出されると、変性はその移動性
を増加しかつそれが獲得することができる可能な立体配
座の数を増加することができ、これにより抗体−抗原相
互作用を促進する。
多くの存在する免疫アッセイのフォーマットは、低濃度
の洗浄剤、例えば、トリトンおよびツイーン−20の使用
を包含して、古典的な抗体抗原反応における反応成分の
非特異的吸着を防止し、生物学的膜からタンパク質を解
離させ、あるいは脂質タンパク質からの脂質を解離して
脱脂質されたタンパク質の均質試料を提供する［バイオ
ヘミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochem.Biop
hys.Acta）620:447−453,1980;クリニカル・ケミストリ
ー（Clin.Chem.）28:199−204,1981］。本発明の表現さ
れた目的は、物理的および／または化学的変性剤を使用
して自然タンパク質の二次的、三次的および四次的構造
を変性することによりタンパク質抗原のタンパク質また
は糖タンパク質の決定因子を露出することである。次い
で、露出されたペプチドエピトープは開放され、そして
合成ペプチドの立体配座をとることができ、それに対し
て抗体が生産された。
抗体試薬の立体的接近は、任意の効果的方法において得
ることができる。無傷のタンパク質中のエピトープの露
出は、物理的または化学的変性または消化により少なく
ともエピトープの区域において達成されると理解され
る。このような変性または消化はエピトープの区域に位
置することができるか、あるいはタンパク質の三次、お
よびさらに二次構造のより一般的な、あるいは実質的に
完全な変性、あるいはタンパク質の部分的または完全な
消化を含むことができる。
変性は種々の方法で達成することができ、このような方
法は物理的手段、例えば、熱、音波処理、高いもしくは
低いpHによるタンパク質の慣用の処理および、好ましく
は、消化または溶液中のチャオトローピック剤（chaotr
opic agent）もしくはチャオトロープ（chaotrope）と
の相互作用による化学的変性を包含する。有用なチャオ
トローピック剤は、次のものを包含するが、これらに限
定されない：グアニジン、尿素、および種々の洗浄剤、
例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および他のも
の（これらに限定されない）、例えば、デオキシコレー
トそしてある種の胆汁酸塩類、３−（３−コラミドプロ
ピル）−ジメチル−アンモニオル−プロパンスルホネー
ト、有機溶媒、例えば、メタノール、プロパノール、ア
セトニトリルおよびある種の塩類、例えば、チオシアン
酸カリウム、非イオン性洗浄剤、例えば、トリトンＸ、
ツイーン、ノニデント（nonidet）NP−40およびオクチ
ル−グルコシド類は、また、タンパク質変性剤として機
能することができる。ジスルフィド結合を還元する試薬
（例えば、メルカプトエタノールまたはジチオスレイト
ール）を含有させて、変性過程を有効に促進することが
できる。化学的手段と物理的手段または化学的手段と化
学的手段の組み合わせ（例えば、グアニジンおよび熱、
グアニジンおよびSDS、またはグアニジンおよびジチオ
スレイトール）を使用すると、タンパク質の変性は最も
効果的に達成することができる。とくに、強いチャオト
ロープ、例えば、グアニジンは最も好ましい。もちろ
ん、タンパク質の実質的の凝集、不溶性化または沈殿を
生じさせて、露出されら無意味の量が抗体結合のために
溶液に接近可能となるような変性条件は回避されるであ
ろう。有意量のタンパク質は溶液または懸濁液の中に残
留して、有用な免疫結合を得るようにしなくてはならな
い。可溶化の必要性の程度は、意図するまたは所望の結
合の環境に依存するであろう。
得られる水性混合物におけるタンパク質の有意量の変性
に十分な濃度で存在するチヤオトロープ水溶液を特定の
試験試料と組み合わせることにより、その試料中の目的
タンパク質の有意量を変性して抗体結合性のペプチドエ
ピトープを露出することができる。全血がHb A1cの決
定における試料である場合、チャオトロープは、また、
赤血球を溶解し、Hbを開放しかつプロテアーゼを不活性
化する役目をする。グアニジンの場合において、混合物
中の濃度は好ましくは約１モルよりも大きく、約３モル
の濃度はとくに有用である。変性過程は混合物を短時間
加熱することによって有意に加速される。37℃以下の温
度において、チャオトロープによる変性は１〜数時間を
要することがあり、これに対して50℃以上の温度におい
て、十分な変性は一分以内で達成することができる。抗
体および引続いて混合物に添加すべき他のタンパク質試
薬の変性を防止するために、試料−チャオトロープの混
合物を、通常、別の工程として、あるいは試薬溶液の添
加により、希釈し、希釈のレベルはチャオトロープがこ
のような試薬の変性に実質的に無効であり、しかも問題
のタンパク質の有意な正常化を防止することによりエピ
トープの暴露を保存するようなレベルである。グアニジ
ンについて、これは好ましくは約1.0モル以下の濃度へ
の希釈を必要とし、約0.3モルはとくに好ましい。
消化のために本発明において使用するタンパク質加水分
解酵素の非制限的例は、トリプシン、キモトリプシン、
プロリン特異的エンドプロテアーゼ、ペプシンおよびパ
パインを包含する。免疫アッセイの実施において、タン
パク質加水分解酵素の阻害剤を、既知のように、アッセ
イ混合物に十分な量で添加してタンパク質のアッセイ剤
の消化を防止する。
本発明は、本質的にいかなる所望のタンパク質にも適用
することができ、このようなタンパク質は低分子量を有
するもの、例えば、5000ダルトン以下のもの（ここで使
用するとき、タンパク質という用語はそれらの分子量の
ためポリペプチドと呼ぶことができる化合物を包含す
る）ならびに数10万以上の分子量を有するものを包含す
る。タンパク質の代表的な部類は、プロタミン類、ムコ
タンパク質類、糖タンパク質類、グルブリン類、アルブ
ミン類、リンタンパク質、ヒストン類、リポタンパク
質、クロモタンパク質、およびヌクレオタンパク質を包
含する。本発明のとくに有利な面は、医学および獣医学
の診断学の分野におけるような問題のタンパク質の結合
の特異性および検出の改良への一般的アプローチを提供
するということである。本発明は、高度の免疫原性なら
びに抗体結合の特異性および親和性を与えることができ
るエピトープのためのタンパク質中のそうでなけれ接近
不可能であるかあるいは未知の線状ペプチド断片をクリ
ーニングする機会を提供する。したがって、本発明の応
用は、特定のタンパク質を抗体試薬に結合しようとする
場合および前記タンパク質のための変性条件をそれ自体
与える場合を包含する。
本発明は、とくに、特定のタンパク質分析物（また、本
明細書では「分析物」を「被検体」とも称する）の特異
的決定のための免疫アッセイおよびキットへの適用可能
である。本発明は、新しい有用な線状ペプチドエピトー
プを発見しかつ問題のタンパク質中のこようなエピトー
プの接近可能性を増加する機会を提供する。それは生物
学的または分析学的意味のある非ペプチド修飾により特
徴づけられるタンパク質の検出においてとくに適用する
ことができる。本発明の方法は、抗体試薬を設計しかつ
結合条件を確立して、特徴づけるエピトープが自然タン
パク質中の抗体結合へ接近不可能であるかあるいは限定
されたそれへの接近可能性のみをもつ場合において、タ
ンパク質の特異的検出を成功させあるいは改良すること
を可能とする機会を提供する。とくに医学および診断学
の分野において、このようなタンパク質の例はそれら自
体を示唆し、そしてグルコシル化タンパク質、例えば、
グルコシル化ヘモグロビン（例えば、Hb A1c）および
グルコシル化アルブミンを包含するであろう。本発明
は、さらに、より特異的でありおよび／またはタンパク
質の通常露出された部分に対する抗体の形成および結合
に利用可能であるものよりも高い結合親和性を有するタ
ンパク質中のエピトープの発見において応用できる。所
望のウマ動物を適当に変性された形態のタンパク質また
はその断片で免疫化することにより、得られる免疫応答
を所望の特異性および／または親和性を示す抗体につい
て検査することができる。この応用の拡張は、細胞分析
物、例えば、血球、およびバクテリアおよびウイルスを
包含する微生物などの特異的検出においてである。表面
タンパク質抗原への抗体の結合により提供される検出の
特異性を改良することが望ましい場合において、表面タ
ンパク質および／または細胞内のタンパク質を変性して
改良された抗体応答を捜すことにより内部のエピトープ
を検査することができる。
試験試料またはアッセイ媒質中のタンパク質分析物を変
性して、線状ペプチドエピトープに対して特異性である
本発明の抗体試薬を使用するタンパク質分解物の免疫ア
ッセイ決定は、本質的にいかなる慣用の技術に従うこと
もできる。このような技術は、免疫拡散、免疫電気泳
動、凝集技術、および補体固定、ならびにより普通に用
いられている技術、例えば、放射線免疫アッセイおよび
非同位元素法のような特異的に検出可能な標識の使用を
包含する。本発明を用いるタンパク質分析物の免疫アッ
セイの実施は、含まれる水性試験試料を処理してその中
のこのようなタンパク質の有意量を効果的に変性して所
望の線状ペプチドエピトープを露出し、変性された試料
を抗体試薬と接触させ、そしてこのようなタンパク質へ
の抗体試薬の結合を決定する必須工程を含む。決定工程
は、もちろん、含まれる基本的免疫アッセイ技術に従っ
て変化するであろう。この決定を実施する普通の技術は
標識試薬の使用を包含し、そして前記標識試薬は分析物
または抗体試薬のいずれかと相互作用しかつ分析物と抗
体試薬との間の免疫複合体の形成を示し、あるいはこの
ような形成と拮抗（compete）させる方法で使用され
る。
後者の技術は広い種々のフォーマットで、例えば、標識
結合試薬をつくって抗体試薬への結合について調製分析
物と競争（「拮抗」ということもある）させる拮抗的結
合フォーマットで実施することができる。抗体試薬へ結
合する標識試薬、またはそのように結合しない標識試薬
からなる遊離種の量は、適当に測定され、そして試料中
のタンパク質分析物（被検体）の量に関数的に関係ずけ
ることができる。本発明の抗体試薬はタンパク質分解物
中の線状エピトープへ向けられるので、標識試薬は変性
されたタンパク質または変性されたその断片の標識付け
された形態、あるいは、好ましくは、アミノ酸の線状エ
ピトープ配列からなるペプチド残基の標識付けされた形
態であることができる。後者の好ましい試薬は入手可能
な合成ペプチドの方法および装置により調製することが
でき、そしてタンパク質分子それ自体の単離、精製およ
び変性を必要としない。
タンパク質分析物の他の有用な免疫アッセイ技術は、サ
ンドイッチ技術として知られたものである。この方法に
おいて、２組の抗体試薬を使用し、それらの一方は標識
付けされており、そして他方はタンパク質分析物へ結合
された究極的に標識付けされた第１抗体試薬を結合しな
いものから分離するために適合するであろう。標識付け
されない第２抗体試薬は、典型的には、この分野におい
て知られているように、固定化された形態または固定化
可能な形態である。
放射線免疫アッセイにおいて、遊離種および結合種は物
理的に区別するかあるいは分離して標識を測定するよう
にしなくてはならない。なぜなら、標識により発生され
る信号は両者の種において性質的に同一であるからであ
る。このような技術は、相分離を必要とするので、不均
質としてこの分野において知られている。他の不均質免
疫アッセイ技術が知られており、その例は酵素標識免疫
アッセイ（時にはELISA技術と呼ばれる）（米国特許第
3,654,090号参照）および蛍光免疫アッセイ（米国特許
第4,201,763号、米国特許第4,133,639号および米国特許
第3,992,631号参照）である。
かなり最近において、多数の免疫アッセイ技術が開発さ
れた。それらは結合相手、例えば、抗体による標識試薬
の結合時に検出可能な信号が変調される標識の使用によ
り分離工程を排除する。このような技術は均質として知
られるようになり、そして利用可能であるとき、分離が
不必要でありかつ放射性同位元素が含まれないので、本
発明における使用に好ましい。いくつかのこのような技
術は蛍光のクェンチング（quenching）および増大（米
国特許第4,160,016号参照）、エネルギー伝達免疫アッ
セイ（米国特許第3,996,345号参照）および二重抗体立
体障害免疫アッセイ（米国特許第3,935,074号および米
国特許第3,935,943号参照）である。とくに好ましい均
質免疫アッセイは、酵素−触媒反応に参加する標識を用
いるものである。例は基質−標識免疫アッセイ（米国特
許第4,279,992号および米国特許第1,552,607号参照）、
補欠分子族（FAD）−標識免疫アッセイ（米国特許第4,2
38,565号参照）、酵素モジュレーター−標識免疫アッセ
イ、例えば、障害剤標識を使用するもの（米国特許第4,
134,972号および米国特許第4,273,866号参照）および酵
素−標識免疫アッセイ（米国特許第3,817,837号参照）
である。
本発明の抗体試薬は、問題の特定のタンパク質中の線状
ペプチドエピトープについてのその特異的結合親和性に
より特徴づけられる。したがって、ここで使用すると
き、用語「抗体試薬」はこのようなペプチドエピトープ
について特異的である抗体結合部位を含むいかなる方法
で得られる物質をも意味する。したがって、このような
表現は抗体全体ならびにそれらの適当な断片または多官
能化形態を包含する。抗体全体の形態にあるとき、それ
は既知の免疫グロブリン、例えば、IgG、IgMなどの鋼お
よび亜鋼に属することができる。ペプチドエピトープに
ついて特異的結合親和性を保持するこのような免疫グロ
ブリンのいずれの断片、例えば、従来Fab、Fab′および
Ｆ（ab′）２として知られているIgGの断片をも使用す
ることができる。さらに、免疫グロブリンの凝集体、ポ
リマー、誘導体、複合体、および雑種またはそれらの断
片も適当ならば使用することができる。
抗体試薬の免疫グロブリン源は、利用可能な方法、例え
ば、慣用の抗血清およびモノクローナル技術において得
ることができる。抗血清はよく確立された手順、例え
ば、動物、例えば、マウス、ウサギ、モルモットなどを
適当な免疫原で免疫化する手順によって得ることができ
る。免疫グロブリンは、また、体細胞の交雑により得る
こともでき、このようにして得られるものはモノクロー
ナル抗体と普通に呼ばれている。
モノクローナル抗体試薬は特に好ましい。ハイブリドー
マ細胞系統をレイズしてタンパク質全体に対するよりは
むしろタンパク質分子の線状ペプチドエピトープ部分に
対してのみ抗体を生産し、そしてこのような細胞系統お
よびそれらの抗体をスクリーニングして所望のエピトー
プと選択的に反応するモノクローナル抗体を同定しかつ
単離する。
このような抗体を生産する１つの方法において、天然に
産出する線状ペプチドエピトープ配列に相当しかつそれ
からなる、タンパク質鎖の断片をタンパク質担体へ結合
しそして実験動物に注入して免疫応答を引き出す。ある
いは、免疫原はタンパク質またはその断片の直線化また
は変性された形態からなることができる。リンパ球、例
えば、免疫化動物からの脾細胞を骨髄腫細胞と融合して
ハイブリドーマを生産し、これを培養しかつモノクロー
ナル抗体の生産についてスクリーニングする。モノクロ
ーナル抗体をペプチドエピトープに対して選択的である
ものについてスクリーニングし、そして特定の細胞系統
をクローニングして、それ以上の量のモノクローナル抗
体の生産に使用する。
実験動物、例えば、BALB/cマウス、ラットなどにおける
合成ペプチド免疫原に対する抗体を生産するために、所
望のエピトープからなるペプチドを生産しかつ天然に産
出するタンパク質から単離するか、あるいは化学的に合
成しかつ精製する。このようなタンパク質の断片は所望
のエピトープの重要なアミノ酸単位のすべてを含み、そ
して追加のアミノ酸単位を含むことができ、それらの一
部またはすべては問題のタンパク質のアミノ酸配列に相
当してもよい。
エピトープ含有ペプチド断片が最適に抗原性であること
を確保するために、それを複数で免疫原担体物質へ結合
することが有利であることがある。免疫原担体物質はペ
プチド残基への結合に利用可能である官能基を有する従
来知られたもののいずれから選択することもできる。多
くの場合において、担体はタンパク質またはポリペプチ
ドであるが、十分な大きさおよび免疫原性を有する他の
物質、例えば、炭水化物、多糖、リポ多糖、核酸などを
同様に使用することができる。大部分について、免疫原
タンパク質およびポリペプチドは4,000〜10,000,000、
好ましくは15,000より大きく、通常50,000を越える分子
量を有するであろう。一般に、動物種から採取したタン
パク質は、他の種の血液流中に導入したときに免疫原で
あろう。とくに有用であるタンパク質はアルブミン類、
グロブリン類、ヘモシアニン類、グルテリン類などであ
る。慣用の免疫原担体物質およびそれへハプテンを結合
する技術に関する技術状態については、次の文献を参照
することができる：パーカー（Parker），生物学的に活
性な化合物の放射線免疫アッセイ（Radioimmunoassay
of Biologically Active Compound），プレンチス−
ホール（Prentice−Hall）［エングルウッド・クリッフ
ス（Englewood Cliffs），米国ニュージャージ州,1976
年］；バトラー（Butler），ジャーナル・オブ・イムノ
ロジカル・メッソッド（J.Immunol.Meth.）7:1−24（19
74）；ウェインリブ（Weinryb）およびシュロッフ（Shr
off），ドラッグ・メタボリズム・リビューズ（Drug M
etab.R ev.）10:271−283（1974）；ブラーフトン（Br
oughton）およびストロング（Strong），クリニカル・
ケミストリー（Clin.Chem.）22:726−732（1976）；お
よびプレイフェアー（Playfair）ら，ブリティッシュ・
メディカル・ブレチン（Br.Med.Bull.）30:24−31（197
4）。
所定の免疫原担体物質へ結合するエピトープの数は、担
体上の有効結合部位の数によってのみ制限され、そして
ある種の高分子量の合成ポリペプチド、例えば、ポリリ
ジンの場合において数1000程度に高くなることができ
る。特定の担体上のエピトープの密度は担体の分子量お
よび有効結合部位の密度に依存する。最適のエピトープ
密度は、免疫原の合成の容易さおよび再現性および抗体
の応答を考慮すると、含まれる担体上の有効結合基の約
10％〜約50％の間に入る。
ペプチド断片は慣用の結合法により担体物質へ結合され
る。断片中の自然アミノ酸上の官能基または断片の化学
的修飾により導入される官能基を通常使用して、担体上
の官能基へ直接にあるいは二官能性結合剤を介して結合
する。担体への明瞭な結合を得るために単一の独特に反
応性の官能基を有するように、ペプチド断片を設計する
ことが好ましいであろう。
とくに、本発明は、今回、生物学的流体、例えば、全血
の中のグルコシル化ヘモグロビンの高度に特異的な免疫
アッセイ決定のための手段を提供する。Hb A1c中に現
れる合成グルコシル化Ｎ−末端ペプチド残基に対してレ
イズされたモノクローナル抗体は、ヘモグロビンのグロ
コシル化ベータ−サブユニット中のこのような残基に特
異的に結合することがわかった。抗体は慣用のモノクロ
ナール技術に従い種々の方法で調製することができる。
免疫原担体へ化学的に結合した所望のグリコシル化Ｎ−
末端ペプチド残基からなる合成的に誘導された免疫原に
対する抗体が調製され、前記グルコシル化ペプチドはHb
A1cに相当するアミノ酸単位を少なくとも２つ、好ま
しくは約５〜15有する。得られるモノクローナル抗体は
グルコシル化合物ペプチドおよびヘモグロビンA1c分子
についての対応する露出したエピトープに対して特異的
である。
ヒト血液中に存在するHb A1cに対して特異的なモノク
ローナル抗体は、合成ペプチド免疫原で免疫化した動物
から採取したリンパ球と骨髄腫細胞との融合から誘導さ
れるハイブリドーマにより分泌される。合成ペプチド免
疫原は、好ましくは次の式をもつであろう： ［Glyco−（NH）Val−His− −AA−Ｒ−］ｎ−Carrier 式中、Glyco−（NH）Valは非酵素的にグルコシル化され
たバリン残基を表わし、Hisは自然ベーターサブユニッ
トHb配列の２番目のアミノ酸残基を表し、AAは結合ある
いは１または２以上のアミノ酸残基であり、Ｒは適当な
結合基であり、Carrierは免疫原担体物質であり、そし
てｎ（エピトープ密度）は平均１ないしCarrier上の有
効結合部位の数である。結合基Ｒは任意の所望の結合試
薬から成ることができ、そしてAAはヒトヘモグロビンの
ベーターサブユニットの炭水化物を担持するＮ−末端に
相当する１または２以上の追加のアミノ酸残基を含むこ
とができる。例えば、−AA−はロイシン単位で開始する
次のアミノ酸配列またはその任意の連続的断片から選択
することができる： −Leu−Thr−Pro−Glu−Glu−Lys− さらに、結合基Ｒは正常のヒトヘモグロビン中に存在し
ない追加のアミノ酸単位から成ることができるが、前記
アミノ酸単位は便利にはペプチド合成法により付加する
ことができかつ担体物質への結合のために有用な官能基
として働くことができる。とくに有用な結合基は−Tyr
−Tyr−Cysであり、これは担体物質へグルコシル化ペプ
チド単位を制御して結合するための固有のチオール基を
提供する。
本発明のモノクローナルHb A1c抗体は、主として、ヒ
トヘモグロビンのベータ−サブユニットのＮ−末端ペプ
チド配列のグルコシル化形態を結合するためのその特異
性によって特徴づけられる。このグルコシル化残基はHb
A1cの区別されうる構造上の特徴である。本発明の抗
体は、グルコースと末端アミンとの間の反応生成物のア
マドリ転位時に形成する１−デオキシフルクトシル炭水
化物単位を最小限含むエピトープまたは決定部位と、自
然Hb A1c配列に相当する位置においてHb A1cのＮ−末
端配列のアミノ酸単位の少なくとも１つからなるそれか
ら延びるペプチド配列とを必要とする。このエピトープ
を特徴づけるペプチド配列中の他のアミノ酸単位は、自
然Hb A1c配列中に現れるものと同一であるかあるいは
異ることができる。このようにして、このエピトープは
抗体との少なくとも２つの接触部位または結合部位によ
り特徴づけられ、前記部位はグルコシル化Ｎ−末端Hb
A1c配列に対して独特である。好ましくは、抗体は次の
式のグルコシル化ペプチド残基と特異的に結合するであ
ろう： Glyco−（NH）Val−His−AA− 式中、Glyco−（NH）ValおよびAAは上に定義した通りで
ある。とくに好ましいモノクローナル抗体は、AAの性質
に無関係にグルコシル化ジペプチド残基について特異的
であることがわかった。より大きい長さのグルコシル化
ペプチド配列を必要とする特異性をもつ抗体がまた得ら
れ、この場合、AAはヒトヘモグロビンのベータ−サブユ
ニットのＮ−末端に相当する１〜12、好ましくは１〜６
アミノ酸の配列である。モノクローナル抗体のこのよう
な特異性は、Hb A1cの露出したグルコシル化Ｎ−末端
ペプチド残基の特異的な検出を可能とし、ヘモグロビン
およびヒト血液流にもともと存在する他のタンパク質お
よびペプチドの上の他のグルコシル化エピトープを実質
的排除する。
自然Hb A1c分子上のグルコシル化Ｎ−末端ペプチド残
基は、アッセイすべき試料中のタンパク質の適当な変性
または消化により本発明のモノクローナル抗体またはそ
の断片に接近可能とされる。先行技術の試みが失敗した
特異的抗体を得ることにおける本発明の成功についての
基本的仮説をここで説明するが、その正当性は本発明の
発明性に対して臨界的であると解釈すべきではない。
ヒトヘモグロビンのベータ−サブユニットのＮ−末端配
列はマウスヘモグロビンの対応する配列に非常に類似
し、最初の４つのアミノ酸は同一である。第２に、マウ
スヘモグロビンはヒトヘモグロビンとほぼ同程度にグル
コシル化されている。こうして、自然ヒトヘモグロビン
分子において、ベータ−サブユニットのＮ−末端配列は
マウスにより異質であると見られず、そして免疫応答は
期待されないであろう。これは先行技術の研究者らの論
理であり、彼らはそれに応じて非常に異るヘモグロビン
タンパク質配列をもち、かつ免疫応答を得ることを希望
して、グルコシル化されない動物（ヒツジ）を選択し
た。しかしながら、本発明によると、グルコシル化Ｎ−
末端残基を合成ペプチド免疫原の形態でマウス免疫系に
暴露すると、マウスが免疫学的に応答することができる
形状でエピトープが提示されることが明らかにされた、
体細胞のクローニング技術により、高度に特異的な抗体
を分泌するハイブリドーマを単離することができる。分
泌された抗体は、自然ヘモグロビン分子中のグリコシル
化Ｎ−末端ペプチド残基へ、それが抗体上の結合部位と
の相互作用のために十分に露出された場合、結合するで
あろう。エピトープの露出の方法を以下詳述する。
詳しくは、ハイブリドーマ細胞系統を作出して全体のタ
ンパク質よりはむしろヘモグロビン分子のグルコシル化
部分に対してのみ抗体を生産し、そしてこのような細胞
系統およびそれらの抗体をスクリーニングして、その後
グルコシル化Hb A1cエピトープと選択的に反応するで
あろうモノクローナル抗体を同定しかつ単離する。
このような抗体で生産するために、天然に産出するグル
コシル化ペプチド配列に相当する、タンパク質鎖の断片
をタンパク質担体へ結合し、そして実験動物に注入して
免疫応答を引き出す。免疫化動物からの脾細胞のような
リンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生産
し、これを培養しかつモノクローナル抗体の生産につい
てスクリーニングする。モノクローナル抗体をグルコシ
ル化ペプチドエピトープに対して選択的なものについて
スクリーニングし、そして特定の細胞系統をクローニン
グして追加量のモノクローナル抗体の生産に使用する。
実験室の動物、例えば、BALB/cマウス、ラットなどの中
に抗体を生産するために、グルコシル化ヘモグロビン断
片を天然に産生するヒトヘモグロビンから生成しかつ単
離するか、あるいは化学的に合成しかつ精製しなくては
ならない。ヘモグロビン断片は１−デオキシフルクトー
ス残基および少なくとも２つ、好ましくは３、４、５ま
たはそれより多いヘモグロビンのベータ−サブユニット
のＮ−末端（バリン−ヒスチジン）に相当するアミノ酸
残基を含むべきである。有利には、それは約５〜15、好
ましくは約７〜10単位を含む。
グルコシル化ペプチド断片が最適に免疫原性であること
を確保するために、それを有利には担体物質へ結合する
ことができ、この担体物質は大きい免疫原分子、例え
ば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリン
ペットヘモシアニン（Keyhole limpet hemo cyani
n）（KLH）からなる。この断片は、また、グルコース−
バリン反応の自然の転位付加物を有すべきであり、この
付加物は単離された天然に産出するヘモグロビン断片の
場合におけるように、最初から存在することができ、あ
るいは、好ましくは、合成ペプチドの合成の間にあるい
はそのペプチドを大きいタンパク質担体へ結合する前に
そのペプチド上に形成することができる。担体は断片の
抗原性を破壊しない方法で添加することができる。
グルコシル化断片は天然に産出するHb、例えば、A1cの
化学的または酵素的消化により生産することができる。
この断片は担体へ古典的結合手順を使用して、例えば、
グルタルアルデヒドまたはカーボジイミドを使用して結
合することができ、そして複合体を免疫原として使用す
ることができる。
既知のヘモグロビン配列の一部を化学的に合成する好ま
しい方法は、１または２以上のアミノ酸単位（正常の配
列中に存在しない）を付加してその抗原性および結合性
質を最適化することを含む。この場合において、最後の
単位はチオール（SH）基を有し、これによりそれを配位
子へ慣用法により、例えば、二官能性結合試薬、例え
ば、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−スルホスクシンイミ
ドエステル（MBS）との反応により結合することができ
る。
好ましい実施態様に従い、８単位NH2−バリン−ヒスチ
ジン−ロイシン−スレオニン−プロリン−グルタミン酸
−グルタミン酸−リジン−COOHを有する合成Hb断片のリ
ジン端へ、チロシン、チロシンおよびシステインを付加
して、11−単位のシステイン−末端ペプチドを得た。
これは慣用法でグルコースとの非酵素的反応によりグル
コシル化することができる。その後、グリコペプチドを
大きい担体へ結合して抗原を生産し、これを投与して抗
体を生産する。グルコース化ペプチドエピトープに対す
る抗体を生産する動物からのリンパ球を次に慣用法で融
合してハイブリドーマを生産し、そしてこれをクローニ
ングし、そして所望の規格のモノクローナル抗体を生産
するものをさらにサブクローニングする。グルコシル化
されないHbと対照的に、モノクローナル担体がグルコシ
ル化エピトープに対して最大の選択性を示す１または２
以上の細胞系統を、次いで、増殖しそして抗体を収穫す
る。このようなモノクローナル抗体の技術については、
次の文献を参照することができる：リンパ球のハイブリ
ドーマ類（Lymphocyte Hybridomas），メルチャーズ
（Melchers）ら編，スプリンガー−ベルラグ（Springer
−Verlag）（ニューヨーク1987）；ネイチャー（Natur
e）266:495（1977）；サイエンス（Science）208:692
（1980）；およびメソッズ・イン・エンジモロジー（Me
thods in Enzymology）74（部Ｂ）:3−46（1981）。
次いで、抗体を慣用法に従い既知量のグルコシル化Hbを
含有する血液試料と反応させ、そして反応の程度を較正
標準と比較してグルコシル化の程度を決定することがで
きる。読出しは、蛍光により、免疫アッセイなどによ
り、適当な読むことができる基をモノクローナル抗体へ
既知の方法に従い、Hb A1c中のグルコシル化エピトー
プについてのそれらの結合力を損失せずに、結合するこ
とを介して実施することができる。
あるいは、試薬の試験ストリップに基づくアッセイを実
施することができ、ここでカルボキシル基を有する物
質、例えば、カルボキシメチル−セルロースを木材また
はプラスチックのストリップ上に被覆する。次いで、こ
のストリップを溶解しかつ変性した未知の血液試料中に
浸漬し、これによりグルコシル化されているかあるいは
されていないヘモグリビンを吸着する。次いで、このス
トリップを、Hb A1cエピトープとの結合を妨害しない
部位において標識付けされた（例えば、酵素、蛍光、コ
ファクターなどで）適当なモノクローナル抗体の溶液中
に浸漬する。結合した抗体の量をストリップ上の標識の
量により決定し、そしてこれは既知の試料中のグルコシ
ル化Hbの量の指標である。標識の取り付けおよびその読
出しは慣用方法に従い実施する。
上の式中の結合基Ｒは本質的に任意の便利な安定構造で
あることができる。このような結合基Ｒは通常１〜20個
の炭素原子を有し、水素を排除し、かつ異種原子、例え
ば、窒素、酵素、およびイオウを含む脂肪族鎖の形態で
あろう。グルコシル化残基は種々の基、例えば、メチレ
ン、エーテル、チオエーテル、イミノなどを介して結合
して結合鎖Ｒを形成することができる。当業者は広い種
類の結合基を有し、その中から選択して免疫原をつくる
ことができるであろう。通常、グルコシル化ペプチドは
担体分子中の適当な基への結合反応において活性である
官能基、例えば、アミノ、カルボキシル、チオール、ヒ
ドロキシル、またはマレイミドが末端基を形成するよう
に調製されるであろう。
次の実施例により、本発明をさらに説明する。
実施例１ Hb A1c中のグリコペプチドエピトープに対する抗体の
調製および特性づけ ａ）8N−末端単位のベータ−ヘモグロビン＋２単位のチ
ロシン＋１単位のシステインからなる11−アミノ酸ペプ
チドを、グッテ（Gutte）、B.およびR.B.メリフィール
ド（Merrifield）；ジャーナル・オブ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサイアティ（J.Am.Chem.Soc.）,91:2,501（1
969）に従い合成して、次のペプチドを得た： NH2−バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン−プ
ロリン−グルタミン酸−グルタミン酸−リジン−チロシ
ン−チロシン−システイン−COOH。
このペプチドをグルコシル化するため、200mgのこの精
製したペプチドを20mlの無水ピリジン中の0.25モルのグ
ルコースと48時間室温において暗所で反応させる。この
混合物を真空乾燥する。得られるシロップを20ミリモル
のリン酸カリウム、pH2.95中に再懸濁し、そしてHPLCに
より精製する。
グリコペプチド（具体的には、グルコペプチド）を含有
する分画を0.1モルの酢酸トリエチルアンモニウム、pH
8.5中に溶解し、そしてアフィゲル（Affigel）−601ボ
ロネート親和性樹脂［バイオラド（Biorad）］のクロマ
トグラフィーにかけ、これによりグルコペプチドを選択
的に吸着させる。この樹脂を0.1モルの酢酸トリエチル
アンモニウムpH8.5で洗浄し、そしてグリコペプチドを
0.1モルの酢酸トリエチルアンモニウムpH8.5で溶離す
る。溶離液を凍結乾燥する。
生成物を1mlの水中に再懸濁し、500倍モルの過剰のジチ
オスレイトールと反応させ（システインのSH基を回復
し）そして還元されたペプチドをHPLCにより再精製し、
そして凍結乾燥する。このグリコペプチドを−20℃にお
いてN2中でさらに使用するまで貯蔵する。
ｂ）KLH−MBS複合体（conjugate）、ラーナー（Lerne
r）、Ｒら、プロシ−ディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）78:3403（1981）に以前に記載された、を（ａ）の
生成物と２倍モル比のグリコペプチド対マレイミドにお
いて担体上で50ミリモル濃度（mM）（以下、明細書中
「ミリモル」との表示はミリモル濃度を意味する）のリ
ン酸カリウムpH7.2中で１時間室温において反応させ
る。
ｃ）（ｂ）における溶液を同体積のフロイントの完全ア
ジュバントと混合して油中水型エマルジョンを形成し、
そして200μｇの複合体をBALB/cByマウスに注入する。
マウスを30日および60日において二次免疫し、殺し、そ
して脾臓をケラー（Ｋhler）およびミルシュタイン
（Milstein），ネイチャー（Nature）,256:495（1975）
に従う融合に使用し、多数のハイブリドーマを生産す
る。ハイブリドーマをスクリーニングして、グリコシル
化ペプチドエピトープに対して特異的であるモノクロー
ナル抗体を生産する。
A1c特異的モノクローナル抗体についてのスクリーニン
グをELISAフォーマットを使用して実施し、ここで抗体
をポリスチレンのマイクロタイター板（microtiter pl
ate）［リンブロ（Linbro）］上に吸着させる。抗原は
精製されたヒトA1cおよびグルコシル化されていないA0
ヘモグロビンである。A1cを赤血球溶血物から２つの異
るクロマトグラフィー手順により精製する。第１精製
は、ピアース・ケミカル・カンパニー（Prerce Chemic
al Co.,Rockford,Illinois,U.S.A.製品番号42,000）に
記載されるようなボロネート親和性樹脂上にグルコシル
化ヘモグロビンを結合させることから成る。典型的に
は、１〜5gのヘモグロビン100mlのボロネート樹脂へ適
用し、そして結合した（糖ヘモグロビン）分画をピアー
ス・ケミカル・カンパニー、グルコテスト・ブレチン
（GlybcoTest bulletin）、製品番号42,000に記載され
るように溶離する。溶離されたグリコヘモグロビン分画
を、マクドナルド（McDonald）、M.ら，ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）,2
53:2327−2332（1987）に記載されるようにして、低イ
オン強度の緩衝液中で平衡化し、そしてイオン交換樹脂
のクロマドグラフィーにかける。A1c「ピーク」を等電
点電気泳動（isoelectric focusing）によりおよびチ
オバルビツル酸を使用する炭水化物分析により分析し、
その結果、精製された物質が炭水化物をもつと共に、等
電点が正常のA0ヘモグロビンと異なる点で超純粋A1Cヘ
モグロビンを前記精製がもたらしたことを確認する。同
様にA0ヘモグロビンは、ボロネート親和性樹脂へ結合し
ない性質およびイオン交換クロマトグラフィー精製にお
けるA0「ピーク」としてイオン交換によるクロマトグラ
フィーによって精製される。純粋なA1cおよびA0ヘモグ
ロビンを、４℃において一夜別々のマイクロタイター板
［２μg/100マイクロリットルPBS/ウェル（well）］上
に吸着する。板をPBS中の１％のBSA中で室温においてブ
ロッキングし、次いでPBS中で４回洗浄する。各ハイブ
リドーマ細胞系統からの上澄みをA1cおよびA0板に添加
し、室温において60分間インキュベーションする。板を
PBS中で４回洗浄し、そして二次抗体［ウサギ抗マウス
−IgG−ペルオキシダーゼ、マイルス・ラボラトリーズ
・インコーボレーテッド（Miles Laboratories,Inc.,E
lkhart,Indiana U.S.A.）、PBS中の１％BSA中の1:5000
希釈］を適用し、そして室温において60分間インキュベ
ーションする。この板をPBS中で４回洗浄し、そして200
マイクロリットルの基質溶液を添加する（24.3ミリモル
のクエン酸、pH5.3、2.2ミリモルのｏ−フェニレンジア
ミンおよび5.2ミリモルの過酸化水素を含有する）。こ
の反応を20分後50マイクロリットルの８モルのH2SO4の
添加により停止し、そしてペルオキシダーゼ反応の生成
物を492nmにおいて読む。
ヘモグロビンに対する抗体を生産する200の出発ハイブ
リドーマから、９はA1cに対して特異的であるとして同
定され、これに対して191はA1cおよびグルコシル化され
ないヘモグロビンの両者と反応する。予備免疫化マウス
血清はELISA手順によりA0またはA1cに応答する検出可能
な抗体をもたないので、主要な免疫応答はA0およびA1c
に共通に所有されている８ペプチド配列に対するもので
ある。合成ペプチド免疫原はヘモグロビン配列の８アミ
ノ酸残基から成るので、主要マウス免疫応答はペプチド
に対して向けられ、炭水化物には向けられない（200ハ
イブリドーマのうち191はA0およびA1cの両者と反応す
る）。期待されるように、免疫マウス血清は、また、A0
およびA1cの両者と反応性の抗体と広範な交差反応性を
有し、これによりハイブリドーマがA1cに対して反応性
であるがA0に対して反応性でないことについてスクリー
ニングされないかぎり、A1cに対する特異性は得られな
いことが示唆される。A1cヘモグロビンに対する抗体を
生産する好ましいハイブリドーマおよびA0ヘモグロビン
に対する抗体を生産しない好ましいハイブリドーマは、
それぞれATCC HB 8639およびATCC HB 8669と表示さ
れて1984年1011日および1985年７月10日にATCCに受託さ
れた。
ｄ）抗体への結合についてA1c拮抗するペプチドの同
定： グルコシル化11−アミノ酸親ペプチドGlyco−Val−His
−Leu−Thr−Pro−Glu−Glu−Lys−Tyr−Tyr−Cys（グ
リコペプチド１） を酵素消化により、次のペプチド類を発生させる： すべてのペプチド断片をHPLCにより精製し、そしてアミ
ノ酸配列により定量する。前記親ペプチドのチロシン消
化は、 Glyco−Val−His−Leu−Thr−Pro−Glu−Glu−Lys（グ
リコペプチド２） を生産する。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、 Glyco−Val−His−Leu−Thr−Pro（グリコペプチド３） を生産する。ペプチドGlyco−Val−His−FAD（グリコペ
プチド４）（ここでジペプチドをN6−アミノヘキシルFA
Dに結合し、次いでグルコシル化される）は、カリコお
よびジョンソンへの米国特許第4,255,566号によりつく
られ、そしてアメス・ディビジョン，マイル・スラボラ
トリーズ（Ames Division,Miles Laboratories,Inc.,
Elkhart,Indiana U.S.A.）のキン・イップ（Kin Yi
p）博士およびR.バックラー（Buckler）博士により提供
される。
典型的な拮抗アッセイにおいて、100μｌのPBS−7.2ミ
リモルのNa2HPO4、2.8ミリモルのNaH2PO4、127ミリモル
のNaCl、pH中の各ペプチドの８ナノモル〜８ピコモルを
100μｌのモノクローナル細胞上澄み液とともに60分間
室温においてインキュベーションする。この混合物を１
μｌのA1cヘモグロビン／ウェルで被覆されたポリスチ
レンのマイクロタイター板に添加する。ペプチドを抗体
と拮抗させると、抗体は固定化A1cへ自由に結合しな
い。この板をPBSで４回洗浄する。第２抗体（セイヨウ
ワサビのペルオキシダーゼと結合したウサギ抗マウスIg
G）を30分間添加し、そして板をPBS中で洗浄する。基質
（ｏ−フェニレンジアミン2.2ミリモル）および過酸化
水素（0.012％）を添加し、そして生成した生産物を492
nmにおいて測定する。生産物の量は拮抗の程度を反映
し、例えば、生産物なしは拮抗するペプチドが固定化A1
cへの結合に対して抗体を完全にブロック（block）した
ことを示す。結果は、Glyco−Val−His−FADを包含する
前述のグリコペプチドのすべて４種類が有効な拮抗体で
あることを示す。抗体の１つ、Ab−４、はA1cへの結合
に対してグリコペプチド１〜４により完全にブロックさ
れる（第１図〜第３図参照）。他の抗体、Ab−３、はグ
リコペプチド１〜３によりブロックされるが、グリコペ
プチド４によりブロックされない（第１図〜第３図参
照）。
炭水化物を欠損するペプチドは拮抗阻害を示さず、これ
により炭水化物がエピトープの必須成分でありかつA1c
ヘモグロビンの抗体の認識について特異性を提供するこ
とを示唆する（第１図参照）。
実施例２ Hb A1cについての拮抗的免疫アッセイ この拮抗的免疫アッセイ（competitive immunoassay）
は、溶解全血中のA1cと固定化抗体への結合について拮
抗するハプテン−標識の固定量の使用に基づく（実施例
５に記載するように）。抗体はA1cおよびハプテンの両
者を認識するので、試験試料中のA1cのレベルは抗体へ
結合するハプテンの量を決定する。抗体は固定化される
ので、すべての結合しない反応部分は簡単な洗浄工程に
より除去される。次いで、結合した標識を測定し、そし
てもとの血液試料中のA1cの定量について標準と比較す
る。
全血を試験試料として使用するアッセイを開発し、そし
てこれを下記の工程に分割することができる： （１）ヘモグロビンの溶解または細胞変性 最終のアッセイは0.3マイクロリットルより少ない全血
を必要とするので、精確にピペットで取ることのできる
血液［フィンガー・スティック（finger stick）また
は全血からの５〜50μｌ］を変性溶液（３モルのグアニ
ジンHCl、10ミリモルのトリス−HCl ｐ H7.5）中に希
釈し、２〜15分間56℃に加熱する。より低い温度も有効
であるが、追加の時間を試料の変性に必要とするであろ
う。この変性は（ａ）試料が抗凝固剤中で調製されない
場合、凝血機構を不活性化する；（ｂ）赤血球を溶解す
る；（ｃ）プロテアーゼ、酵素などを変性し、そしてヘ
モグロビン上のA1cエピトープを最適に露出する；
（ｄ）試料を非無菌的に調製しかつ取扱う（例えば、フ
ィンガー・ステイックからの血液）場合でさえ、変性さ
れた血液試料中の微生物の生長を減菌または阻害するよ
うに思われる；および（ｅ）最終のアッセイに影響を及
ぼさないで室温において数日間貯蔵することができる。
（２）希釈および拮抗 変性された全血のアリコートを、ハプテン−標識を含有
する緩衝液の４倍体積中にピペットで入れる。これは効
果的にヘモグロビンを希釈してアッセイに適当な濃度に
し、そして変性物を低濃度に希釈して抗体または酵素の
活性を安定化する。次いで、抗体を被覆したビーズを特
定した時間の間添加し、その間抗体はA1cヘグロビンま
たはハプテン−HRPに結合する。
（３）洗浄および読み 拮抗的インキュベーションに引続いて、ビーズを洗浄
し、そして標識を適当な基質の添加後読む。次いで、信
号を標準および決定したものと全血血液試料中に存在す
るA1cの量と比較する。
使用したアッセイの詳細を下に要約する： ビーズの被覆手順 ポリスチレンビーズ［0.635cm（1/4インチ）の直径、鏡
面仕上げ（specular finish）］をプリーシジョン・ボ
ール・カンパニー（Preciion Ball Company,Chicago,
Illinois,U.S.A.）から入手する。ロットを同一試料の
多数回の免疫アッセイの決定における最低の変動を提供
するビーズについてスクリーニングする。被覆の前に、
ビーズを無水メタノールで洗浄し、次いで水で洗浄す
る。メタノールの洗浄は、同一試料の多数回の決定につ
いて変動の補正を有意に低下させるように思われた。次
いで、抗体溶液（0.2モルのホウ酸ナトリウムpH8.5、0.
02％のアジ化ナトリウム中の５μｇ抗体/100μｌ）を添
加してビーズを湿潤させ、そしてビーズを４℃において
一夜回転させた。次いで、ビーズを洗浄し、0.02％のア
ジ化ナトリウムを含有するPBS中１％のBSAでブロックす
る。典型的には、500〜1000個のビーズを一度に被覆
し、そして１週間使用し、抗体活性の損失の証拠は存在
しない。放射性抗体を用いる被覆は、0.5μg/ビーズの
抗体の結合を示す。
これらのビーズは比較的高い量の蛋白質を結合する性質
をもつため、これらのビーズをこの免疫アッセイにおい
て使用する。ポリスチレン上への蛋白質の疎水性吸収は
便利であるが、蛋白質がポリスチレン、官能化樹脂、ま
たはシリカへ共有結合するいくつかの手順の１つを代わ
りに使用できることは確かである。また、ポリスチレン
は管またはキャベットの形であることもできる。
作業のプロトコール（protocol）は、次に要約する通り
である： （ａ）50μｌの全血を1.0mlの変性溶液（３モルのグア
ニジンHCl、10ミリモルのトリスpH7.5）中に希釈し、56
℃に15分間加熱し、再び100μｌを1.0mlの変性剤中に希
釈する。
（ｂ）50μｌの上の溶液を0.5mlのハプテン−HRP含有リ
ン酸緩衝化生理食塩溶液（PBS）pH7.5へ添加する。イン
キュベーション、洗浄および酵素反応を48ウェルのポリ
スチレン組織培養板により都合よく実施される。
（ｃ）抗体被覆ビーズを添加し、そして30分間周囲温度
において揺動しながらインキュベーションする。
（ｄ）ビーズを緩衝液（PBS）で洗浄する（通常３〜1ml
の交換）。
（ｅ）ｏ−フェニレンジアミン基質および過酸化水素を
添加する。
（ｆ）20分後、この反応を停止しそして20分後生産物を
読む。上のアッセイを使用して、後述の臨床的データを
確立する。グリコペプチド１を使用する拮抗を第５図に
示す。正常の供与体および糖尿病の供与体の評価を第６
図に示す。ボロネートの親和性決定を、ピアース・ケミ
カル・カンパニー（Pierce Chemical Co.）（グリコ
テスト、製品番号45,000）に精確に記載するように実施
する。
実施例３ A1cエピトープの最適な露出 ヒトA1cエピトープの最適な反応性は、エピトープを抗
体結合部位へ露出する手順または試薬を使用する自然ヘ
モグロビン（全血または溶血物中）の処理後に見られ
る。エピトープの最適な露出は、物理的変性（熱、音波
処理など）により、古典的変性剤を含む化学的手順（尿
素、グアニジン、SDS、プロテアーゼ）により、あるい
は物理的手順および化学的手順の組み合わせにより達成
することができる。全血（50μｌ）を３モルのグアニジ
ン塩酸塩、10ミリモルのトリス−HCl、pH7.4の1mlの溶
液へ添加し、そして56℃に１分以上加熱する。得られる
試料はA1cエピトープについての引続く免疫アッセイに
おいて最適にはたらく。この溶液を10倍に緩衝液中に希
釈し、効果的にグアニジンは0.3モルに希釈され、この
濃度は、正常抗体−抗原相互作用および酵素活性へ、な
んらかの影響を及ぼしたとしても、それがほんのわずか
であり、引続く免疫アッセイへの適当な媒質を提供す
る。
実施例２の拮抗的免疫アッセイを用いる。全血試料を3.
0モル濃度（明細書中、モルとの表示はモル濃度を意味
する）のグアニジン中に20℃、37℃または56℃において
０〜320分間入れる。結果（第７図）は時間とともに20
℃または37℃においてエピトープが露出され、こうして
ハプテン−HRP複合体と効果的に拮抗することを示す。5
6℃において、エピトープは５分後に最高に露出され、
最も早い点がこのアッセイにおいて決定される。この結
果は、自然ヘモグロビンA1cテトラマー中において、エ
ピトープは埋込まれ、接近不可能であり、そして線状合
成グリコペプチド−HRP複合体と拮抗しないことを示
す。しかしながら、ヘモグロビンA1cが変性されると、
新しく露出されるエピトープは線状グリコペプチド−酵
素複合体について効果的な拮抗体となる。
実施例４ 抗体特異性−ヒツジポリクローナル応答対マウスモノク
ローナル応答−の比較 ヒツジ（sheep）を、フロインド完全アジュバント中
で、実施例１（ｂ）のグリコペプチド−KLH複合体（4m
g）で免疫化（５部位に筋肉内注射）する。二次免疫注
射を同時に30日後および60日後に実施する。60日の二次
免疫はフロイント不完全アジュバント中で実施する。予
備免疫血清、および免疫血清を、実施例１（ｃ）に記載
するように、ELISAアッセイにおいてそのA1cおよびA0の
特異性について力価決定する。結果（第７図参照）は、
合成グリコペプチドが免疫応答をヒトヘモグロビンに対
して刺激するが、免疫グロブリン類がA1cについて特異
的でないことを示す。これと対照的に、A1cについての
マウスモノクローナル抗体は、同一アッセイにおいて測
定したとき（実施例1CのELISAアッセイ−第８図参
照）、A1cについて非常に特異的である。ヒツジ抗血清
からのA1cについて特異的である抗体を免疫親和性精製
する試みは成功しなかった。
実施例５ ハプテン標識複合体の調製 グリコペプチド１（HRP）の複合体を調製した。15mgの
セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（HRP）を10×モル
過剰のMBS（実施例1b参照）と50ミリモルのリン酸ナト
リウム、１ミリモルのEDTA、pH7.0中で反応させること
により、ハプテン−HRPを調製した。MBS−HRP複合体を
ゲル濾過（上の緩衝液を使用する）により精製し、そし
て0.34mgのグリコペプチドハプテン（ペプチド１）を添
加した。最後のハプテン−HRP複合体をHPLCのゲル濾過
により精製し、そして実施例３の拮抗的免疫アッセイに
おいて1:1000〜1:100,000の希釈で使用した。
実施例６ Hb A1cのストリップ免疫アッセイ ａ）0.1モルのホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5中の実施
例１（ｃ）のモノクローナル抗体を、200倍モル過剰の
蛍光性イソチオシアネート（FITC）と混合し、そして室
温において30分間反応させた。蛍光標識モノクローナル
抗体はゲル濾過により精製することができる。
ｂ）COOHを有するストリップ（ポリスチレン、セルロー
スなど）を0.5mlの未知の変性溶血物、pH7.5中に浸漬す
る。ストリップを緩衝液でpH7.5においてすすぎ、そし
て緩衝化溶液中の（ａ）の蛍光性モノクローナル抗体中
に５分間室温において浸漬する。このストリップを再び
すすぎ、そしてこのストリップの蛍光の程度は未知の試
料中のHb A1cの程度を示す。
実施例７ 試薬ストリップのモノクローナル抗体の結合および免疫
アッセイにおけるその使用 ワットマン＃１瀘紙（7cm）を20mlの氷冷Ｄ−H2O中に入
れ、そしてこの溶液のpHを５モルのNaOHで10.5〜11.5に
調節する。溶液を活性化により連続的に監視し、そして
pHを５モルのNaOHの滴下により10.5〜11.5に維持する。
小さい撹拌棒を、瀘紙を含有するビーカーの底に配置す
る。次いで、ビーカーを氷を充填したペトリ皿内に入
れ、これを磁気撹拌機上に配置する。1gの個体BrCNをビ
ーカーに添加し、そしてこれを撹拌しながら20分間イン
キュベーションする（氷上）。瀘紙を溶液から取り出
し、そして溶液100mlの氷冷蒸留水（ｄ−H2O）中で洗浄
する。次いで、それを氷冷0.2モルのNa2HPO4−クエン酸
緩衝液、pH6.8中で洗浄する。抗体（0.2モルのNa2HPO4
−クエン酸緩衝液、pH6.8中の1mg/ml）添加し、そして
抗体の結合を１時間進行させる。エタノールアミン（１
ミリモルの溶液の10ml）を添加して未反応部位をブロッ
クし（15分間）そしてリン酸緩衝化生理食塩溶液（PB
S、10ミリモルのNa2HPO4、140ミリモルのNaCl、pH7.5）
で洗浄して未反応成分を除去する。
この試薬ストリップを、A1cヘモグロビンについて抗体
結合の標識成分を含有する標準化量の未知の変性溶血物
中に浸漬する。便利な拮抗体は、セイヨウワサビのペル
オキシダーゼ（ハプテン−HRP）へ共有結合したグリコ
ペプチド（グリコペプチド１）である。ストリップを除
去し、そしてPBSで洗浄する。ストリップへ結合したヘ
モグロビンの量を測定し（この量は試料中のA1cと逆比
例する）そしてA1cヘモグロビンを標準試料と比較する
ことにより定量することができる。
実施例８ A1cについての酵素結合免疫溶媒アッセイ固定体積の変
性欠席溶血物（100μｌ）を、ポリスチレンのマイクロ
タイター板へ添加し、そして室温において60分間反応さ
せる。この板を0.05％のツイーン−20（PBST）中で４回
洗浄する。モノクローナル抗体（セイヨウワサビのペル
オキシダーゼ結合）をPBST中に添加し（100μｌ、１μg
/ml）、そして室温において30分間反応させる。過剰の
抗体を４回PBSTで除去する。PBS中の基質（ｏ−フェニ
レンジアミン、2.2ミリモル）およびH2O2（0.012％）を
添加し、そして反応生成物を492nmにおいて測定する。
カラー濃度は、標準値と比較したとき、溶血物中に存在
するA1cの量を反映する。
実施例９ A1cについての放射線アッセイ 100マイクロリットルの変性血液の溶解物（220ナノモル
のヘモグロビン）を７ナノモルのヨウ素化 Glyco−Val−His−Leu−Thr−Pro−Glu−Glu−Lys−Tyr
−Tyr−Cys（500,000cpm/7ナノモル）と混合する。血液
溶解物が正常の（ほぼ３％）A1cヘモグロビンを含有す
るとき、モノクローナル抗体をグルコシル化ペプチドの
50％と結合するために十分な量で添加する。より高いヘ
モグロビンA1c値はペプチドについて拮抗し、これによ
り抗体により結合された計数の合計数を減少させる。抗
体は第２抗体（ウサギ抗マウスIgG）で免疫沈殿させる
ことにより、あるいはプロテインＡ被覆粒子上に吸着さ
せることにより回収することができる。抗体へ結合した
ヨウ素化ペプチドは、ガンマ同位元素カンウターで定量
することができ、そして、標準物質と比較したとき、血
液溶解物中に存在するA1cの量を反映する。
【図面の簡単な説明】
図面はHb A1cの免疫検出に関する上の実施例中に記載
する実施例からのデータを表わすグラフである。 第１図は、グリコペプチド１（ペプチド１）によるA1c
へのAb−３の結合の阻害を表わすプロットである。抗体
をグリコペプチドとともに予備インキュベーションした
後、A1c被覆マイククロタイター板へ移した。A1cへ結合
するモノクローナル抗体を二次抗体−酵素を使用して検
出した。結果を阻害百分率として第１図にプロットし、
ここで０％の阻害は対抗物質を使用しないで得られる値
である。○−○線は炭水化物を欠く同一ペプチドからの
ものであり、炭水化物が抗体結合に必須であることを示
す。すべての点は３回の反復実験の測定値の平均であ
る。 第２図は、グリコペプチド３（ペプチド３）によるA1c
へのAb−３の結合の阻害を表わすプロットである。対抗
実験は第１図について記載したようにして実施した。 第３図は、グリコペプチド４（ペプチド４）によるA1c
の結合についてのAb−３およびAb−４の阻害を表わすプ
ロットである。対抗実験は第１図について記載したよう
にして実施した。 第４図は、最適アッセイ条件を用いる典型的な標準曲線
である。正常の供与体からの全血（3.83％のA1c）を使
用するHPLCイオン交換により測定して、12.66％のA1cを
有する糖尿病患者からの変性全血を異る比を用いて全血
標準を調製した。すべての点は３回の反復実験の測定値
の平均である。 第５図は、合成のペプチド標準を使用する標準曲線であ
る。アッセイは第４図について記載するようにして実施
したが、異る量の合成グリコペプチドを対抗物質として
使用した。３回の反復実験のすべての値をプロットし
た。 第６図は、免疫アッセイ法と供与体のホウ酸塩親和性法
との比較を表わすプロットである。３回の反復実験の平
均値を免疫アッセイの座標にプロットする。 第７図は、変化する変性条件下にHb A1cエピトープの
露出を明らかにするプロットである。 第８図は、実施例１（ｂ）の合成グリコペプチドでヒツ
ジを免疫化する結果を表わすプロットである。 第９図は、マウスのモノクローナル抗体がA1cヘモグロ
ビンについて特異的であることを明らかにするプロット
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ 8310−2Ｊ 33/577 Ａ 9015−2Ｊ (31)優先権主張番号 ７７９７３１ (32)優先日 1985年９月27日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 審判番号 平5−23268 (72)発明者 ビンセント・マーチエシ アメリカ合衆国コネチカツト州06437ギル フオード・プロスペクトアベニユー 179 (72)発明者 ウオーレス・ヘイ アメリカ合衆国コネチカツト州06473ノー スヘブン・キニピアクアベニユー 189 (56)参考文献 特開 昭58−205854（ＪＰ，Ａ)

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】水性試験試料における特定の糖タンパク質
    被検体を測定するためのものであって、前記試験試料を
    前記のような特定のタンパク質中の糖質修飾線状ペプチ
    ドエピトープに結合する特異的抗体試薬と接触させ、そ
    して前記タンパク質への前記抗体試薬の結合量を測定す
    る免疫アツセイ方法において、最初に前記試験試料をそ
    の中の前記タンパク質の有意量を変性するように処理
    し、前記抗体試薬と結合する線状ペプチドエピトープを
    露出するかまたはその露出量を増大させることを特徴と
    する方法。
  2. 【請求項２】前記糖タンパク質被検体が、ヘモグロビン
    A1Cまたはグルコシル化アミブミンである特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】前記試験試料が、前記タンパク質被検体を
    著しく凝集または沈殿させない条件下で処理される特許
    請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】前記試験試料が、前記エピトープを露出さ
    せるかまたはその露出量を増大させるためにチヤオトロ
    ピツク剤で処理される特許請求の範囲第１〜３項のいず
    れかに記載の方法。
  5. 【請求項５】前記試験試料が、前記エピトープを露出さ
    せるかまたはその露出量を増大させるためにタンパク質
    分解酵素で処理される特許請求の範囲第１〜３項のいず
    れかに記載の方法。
  6. 【請求項６】前記試験試料が、前記エピトープを露出さ
    せるかまたはその露出量を増大させるためにチオシアン
    酸カリウムで処理される特許請求の範囲第１〜３項のい
    ずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】前記タンパク質被検体が、マイクロタイタ
    ープレートに吸着されている特許請求の範囲第１〜３項
    のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】前記抗体試薬が、モノクローナル抗体であ
    り、かつ（ａ）免疫原性担体物質へ結合した前記糖質修
    飾線状ペプチドエピトープの残基を含む合成ペプチド免
    疫原、または（ｂ）前記糖タンパク質の変性物もしくは
    消化物で動物を免疫化することから誘導される特許請求
    の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】測定すべき前記特定の糖タンパク質被検体
    がHb A1Cであり、前記試験試料が血液であり、そして
    前記抗体試薬がヒトヘモグロビンのベーターサブユニツ
    ト中のグルコシル化Ｎ−末端ペプチド配列へ特異的に結
    合するモノクローナル抗体または抗体結合部位を含む前
    記モノクローナル抗体の断片である特許請求の範囲第１
    〜８項のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】水性試験試料における特定の糖タンパク
    質被検体を測定するためのものであって、前記のような
    特定のタンパク質中の糖質修飾線状ペプチドエピトープ
    に結合する特異的抗体試薬を含んでなる免疫アツセイキ
    ツトにおいて、さらに、前記試料との接触によってその
    中の前記タンパク質の有意量を変性し、前記抗体試薬と
    結合するための前記線状ペプチドエピトープを露出また
    はその露出量を増大できる化学的物質を含むことを特徴
    とする免疫アツセイキツト。
  11. 【請求項１１】前記糖タンパク質被検体が、ヘモグロビ
    ンA1Cまたはグルコシル化アルブミンである特許請求の
    範囲第10項記載のキツト。
  12. 【請求項１２】前記化学的物質が、前記タンパク質被検
    体を著しく凝集または沈殿するものでない特許請求の範
    囲第10項または第11項記載のキツト。
  13. 【請求項１３】前記化学的物質が、チヤオトロピツク剤
    である特許請求の範囲第10項または第11項記載のキツ
    ト。
  14. 【請求項１４】前記化学的物質が、チオシアン酸カリウ
    ムである特許請求の範囲第10項または第11項記載のキツ
    ト。
  15. 【請求項１５】前記抗体試薬が、（ａ）免疫原性担体物
    質へ結合した前記糖質修飾線状ペプチドエピトープの残
    基を含む合成ペプチド免疫原、または（ｂ）前記糖タン
    パク質の変性物もしくは消化物で動物を免疫化すること
    から誘導される特許請求の範囲第10〜14項のうずれかに
    記載のキツト。
  16. 【請求項１６】前記糖質修飾線状ペプチドエピトープの
    標識化形態のものをさらに含む特許請求の範囲第10〜15
    項のいずれかに記載のキツト。
  17. 【請求項１７】測定すべき前記特定のタンパク質被検体
    がHb A1Cであり、前記試験試料が血液であり、そして
    前記抗体試薬がヒトヘモグロビンのベーターサブユニツ
    ト中のグルコシル化Ｎ−末端ペプチド配列への特異的に
    結合するモノクローナル抗体または抗体結合部位を含む
    前記モノクローナル抗体の断片である特許請求の範囲第
    10〜16項のいずれかに記載のキツト。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010507092A (ja) * 2006-10-18 2010-03-04 ビオメリュー Ｐｖｌ産生黄色ブドウ球菌のインビトロにおける診断方法
WO2010067612A1 (ja) * 2008-12-11 2010-06-17 積水メディカル株式会社 糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK145385D0 (da) * 1985-03-29 1985-04-01 Novo Industri As Monoklonalt antistof til immunkemisk analyse
US5206144A (en) * 1985-03-29 1993-04-27 Novo Industri A/S Determination of glycated (glycosylated) hemoglobin in blood
US4797473A (en) * 1986-06-25 1989-01-10 Regents Of The University Of Minnesota Monoclonal antibodies to unreduced, nonenzymatically-glycated proteins
US5173422A (en) * 1986-08-22 1992-12-22 Miles Inc. Monoclonal antibodies specific for human glycoalbumin
US4822747A (en) * 1986-12-09 1989-04-18 Miles Inc. Polyacrylamide gel particles having hapten moieties bound thereto as immunoassay reagent
JPS63273472A (ja) * 1987-04-30 1988-11-10 Asahi Breweries Ltd 新規抗体とそれを用いたヒトヘモグロビンの検出
US4970171A (en) * 1987-11-09 1990-11-13 Miles Inc. Denaturant reagents for convenient determination of hemoglobin derivatives in blood
US4847209A (en) * 1987-11-09 1989-07-11 Miles Inc. Latex agglutination immunoassay in the presence of hemoglobin
DE3806198A1 (de) * 1988-02-04 1989-08-17 Boehringer Mannheim Gmbh Immunogen und seine verwendung zur gewinnung von antikoerpern gegen hba(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)c(pfeil abwaerts)
IL94724A (en) * 1989-07-13 1994-02-27 Miles Inc Decomposition of red blood cells and denaturation of hemoglobin by the use of lithium salts
US5484735A (en) * 1989-08-23 1996-01-16 Northwestern University Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids
DE4206932A1 (de) * 1992-03-05 1993-09-09 Boehringer Mannheim Gmbh Immunologische methode zur bestimmung eines haemoglobinderivates
JP2596322B2 (ja) * 1992-06-10 1997-04-02 富士レビオ株式会社 総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンの割合の測定方法
AU661207B2 (en) * 1992-11-17 1995-07-13 Boehringer Mannheim Gmbh Simultaneous determination of HbA1c and haemoglobin variants with a glycation analogus to HbA1c
EP0711415B1 (de) * 1993-07-28 1998-07-22 Boehringer Mannheim Gmbh Immunoassay zum nachweis von kollagen typ i oder kollagenfragmenten davon
JP3269765B2 (ja) * 1995-12-14 2002-04-02 富士写真フイルム株式会社 ヘモグロビン誘導体の免疫学的測定方法及びその方法に用いる処理試薬
AU753701B2 (en) * 1997-04-21 2002-10-24 Glycozyme, Inc. Determination of recombinant glycosylated proteins and peptides in biological fluids
JPH10332693A (ja) * 1997-05-29 1998-12-18 Tokuyama Corp 被検体の前処理方法
US6455047B1 (en) 1997-09-19 2002-09-24 Serex, Inc. Methods to improve immunogenicity of antigens and specificity of antibodies
AU9549798A (en) * 1997-10-21 1999-05-10 Cranfield University Affinity ligands, their production and use
JPH11258238A (ja) * 1998-03-10 1999-09-24 Tokuyama Corp 免疫学的凝集測定用試薬キット
WO2000008460A1 (fr) * 1998-08-07 2000-02-17 Sekisui Chemical Co., Ltd. Procede de determination d'hemoglobines
JP2002005936A (ja) * 2000-06-26 2002-01-09 Shino Test Corp 酵素免疫測定法による測定試薬及び測定方法
US7109309B2 (en) 2000-07-14 2006-09-19 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Peptide fructose and protein conjugate with the same
JP4318458B2 (ja) * 2001-04-26 2009-08-26 ダコ デンマーク アクティーゼルスカブ ｐａｎ特異的モノクローナル抗体
ES2330465T3 (es) 2006-02-03 2009-12-10 Mtm Laboratories Ag Procedimiento para realizar un inmunoensayo desnaturalizante.
EP2032979B1 (en) * 2006-06-06 2018-07-18 Roche Diagnostics GmbH Differential hemolysis of a whole blood sample
EP2156182B1 (en) * 2007-06-06 2010-10-06 Roche Diagnostics GmbH Detection of an analyte in a sample of hemolyzed whole blood
WO2010067611A1 (ja) 2008-12-11 2010-06-17 積水メディカル株式会社 ヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域に対する抗体
US10670615B2 (en) 2015-12-04 2020-06-02 Polymer Technology Systems, Inc. Systems and methods for interference correction from hemoglobin variants
JP6811581B2 (ja) * 2016-10-25 2021-01-13 福井県 人血検査方法及び人血検査用キット
US20210389306A1 (en) 2018-09-28 2021-12-16 Sekisui Medical Co., Ltd. Glycated hemoglobin (%) assay method
US20200284807A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Victor Manneh Saturation binding ratiometric assay

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4247533A (en) * 1978-05-01 1981-01-27 The Rockefeller University Hemoglobin A1c radioimmunoassay
GB1580318A (en) * 1978-05-06 1980-12-03 Univ Rockefeller Antibodies active against human hemoglobin a1c
JPS5610254A (en) * 1979-07-07 1981-02-02 Wako Pure Chem Ind Ltd New rheumatism factor measuring reagent
US4478744A (en) * 1982-01-25 1984-10-23 Sherwood Medical Company Method of obtaining antibodies
JPS58205854A (ja) * 1982-05-25 1983-11-30 Mihama Hisaharu 潜血反応検査用の固定化抗体
US4629692A (en) * 1982-12-06 1986-12-16 Miles Laboratories, Inc. Immunoassay for nonenzymatically glucosylated proteins and protein fragments an index of glycemia
DE3439610A1 (de) * 1984-10-30 1986-04-30 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Immunogene, verfahren zu deren herstellung sowie damit gewonnene antikoerper gegen glykosiliertes haemoglobin
DK145385D0 (da) * 1985-03-29 1985-04-01 Novo Industri As Monoklonalt antistof til immunkemisk analyse

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010507092A (ja) * 2006-10-18 2010-03-04 ビオメリュー Ｐｖｌ産生黄色ブドウ球菌のインビトロにおける診断方法
WO2010067612A1 (ja) * 2008-12-11 2010-06-17 積水メディカル株式会社 糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法
JP5574977B2 (ja) * 2008-12-11 2014-08-20 積水メディカル株式会社 糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法

Also Published As

Publication number Publication date
DK167825B1 (da) 1993-12-20
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