ES2330465T3 - Procedimiento para realizar un inmunoensayo desnaturalizante. - Google Patents

Procedimiento para realizar un inmunoensayo desnaturalizante. Download PDF

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Matthias Herkert
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Abstract

Un procedimiento para ejecutar un inmunoensayo desnaturalizante de uno o más analitos en disolución comprendiendo las etapas de i) solubilizar una muestra corporal obtenida de un sujeto mamífero en un medio de muestra que comprende SDS de 0,1% a 1% como agente desnaturalizante; ii) calentar posteriormente el medio de muestra que contiene dicha muestra hasta una temperatura superior a 70ºC durante un periodo de tiempo; iii) almacenar la muestra en el medio de muestra, y iv) ejecutar un inmunoensayo sobre dicha muestra en el medio de muestra, en el que la etapa del antígeno de captura se realiza directamente a partir de dicho medio de muestra que contiene el analito y el SDS 0,1%-1%.

Description

Procedimiento para realizar un inmunoensayo desnaturalizante.
La presente invención se refiere a un procedimiento de inmunoensayo desnaturalizante de proteínas en disolución, El procedimiento comprende las etapas de solubilizar una muestra corporal obtenida de un sujeto mamífero en un medio de muestra que comprende del 0,1% al 1% de SDS como agente desnaturalizante; ii) posteriormente calentar dicho medio de muestra que contiene una muestra hasta una temperatura superior a al menos 70ºC durante un periodo de tiempo; iii) almacenar los uno o más analitos calentados en el medio de muestra; y iv) llevar a cabo un inmunoensayo desnaturalizante, en el que la etapa de captura de antígeno se lleva a cabo en el medio de muestra que contiene el uno o más analitos y de 0,1 a 1% de SDS.
Antecedentes de la invención
En el diagnóstico médico una etapa crucial con influencia en los resultados de un procedimiento diagnóstico aplicado es el almacenamiento y trasporte de la muestra. Esto es especialmente cierto debido al hecho de que los analitos a detectar en una muestra corporal pueden estar sometidos a degradación o a otro tipo de influencias durante el trasporte y almacenamiento. Con el fin de asegurar una determinación precisa de los analitos relevantes para el diagnóstico, se debe mantener la integridad de dichos analitos en las muestras hasta la realización del análisis.
En la técnica, una solución para superar los problemas de estabilidad de los analitos busca evitar cualquier trasporte y almacenamiento de las muestras implementando puntos para sistemas de ensayos cuidadosos que permitan el análisis de muestras corporales directamente en el sitio dónde se presta atención al paciente, en dónde se ha obtenido la muestra. Sin embargo, estas soluciones se ven limitadas respectivamente por las tecnologías analíticas a utilizar. En el caso de procedimientos analíticos complejos que necesiten instrumental de laboratorio, se deben encontrar formas que permitan el transporte y almacenamiento de las muestras sin interferencias sobre la integridad de los analitos.
Una forma de permitir el trasporte de muestras corporales es conservar las células contenidas en las muestras y permitir de esta forma el examen citológico o histológico basado en células de la muestra material. Ejemplos de disoluciones de conservación para exámenes citológicos comprenden el Medio Universal de Recogida de Digene (documento WO9931273), la Disolución PreservCyt® de Cytyc® (documento EP0511930), o la disolución Surepath® Cytorich®. Estos medios están diseñados para conservar tanto la morfología coma la integridad de las proteínas celulares para permitir el examen citológico de las muestras celulares conservadas. Todas estas disoluciones de conservación comprenden alcoholes como fijadores. Hablando en general, la conservación de los analitos en dichos procedimientos se consigue por adición de sustancias químicas conservantes. En los casos en los que la integridad celular deja de ser necesaria para el procedimiento de diagnóstico, la integridad de los analitos en disolución puede conseguirse de forma análoga por adición de sustancias químicas conservantes. La desventaja principal de esta solución es que los conservantes son a menudos sustancias tóxicas que perjudican a los laborantes y pueden dañar el medio ambiente en caso de vertido. Adicionalmente, las necesidades de eliminación de residuos, así como el coste de dicha eliminación de residuos aumentan cuando se usan aditivos químicos para la estabilización de muestras.
Una solución adicional para resolver el problema de la estabilidad de analitos en muestras corporales es la refrigeración o congelación de las muestras corporales durante el transporte y almacenamiento. Se sabe que las sustancias biológicas se pueden conservar mediante refrigeración durante un cierto periodo de tiempo, y que i se puede aplicar la congelación de material biológico por debajo de -20ºC para la conservación en almacenamientos a largo plazo. Esta solución, sin embargo, presenta la desventaja del consumo de energía y representa un inconveniente para el transporte. No siempre se puede asegurar durante el transporte el mantenimiento de la refrigeración o las temperaturas inferiores a -20ºC. Esto se convierte en un problema grave en los casos en los que la estabilidad de un analito no se ha demostrado bajo determinadas condiciones de temperatura. Por tanto, el procedimiento de la presente invención implica una etapa de calentamiento que proporciona una manera sencilla para estabilizar muestras para transporte y almacenamiento sin la necesidad de añadir conservantes o necesitar refrigeración.
El documento EP 0 185 870 enseña un procedimiento para llevar a cabo un inmunoensayo desnaturalizante, en el que se usa docecilsulfato de sodio como agente desnaturalizante. El documento también enseña combinaciones de agentes desnaturalizantes y calefacción de disoluciones de la muestra durante la etapa de desnaturalización.
Adicionalmente, si la etapa de calentamiento se lleva a cabo en un medio que comprende agentes desnaturalizantes puede contribuir a la reproducibilidad y precisión de las etapas analíticas posteriores. Si la etapa de calentamiento se lleva a cabo por ejemplo en presencia de docecilsulfato de sodio que interactúa con las proteínas de la muestra respectiva, se obtiene una estructura desnaturalizada de las proteínas. Esta estructura desnaturalizada puede en algunos casos ser una ventaja para una determinación reproducible y cuantitativa de las proteínas en disolución.
En la técnica, se usan procedimientos de bioensayo para desnaturalizar proteínas en el caso del Sistema Laemmli en la electroforesis en gel de poliacrilamida con desnaturalización en presencia de SDS (conocido como SDS PAGE). En este caso, las muestras que contienen proteínas también se calientan en presencia de SDS para permitir la desnaturalización de las proteínas y posteriormente se separan por tamaños en una etapa electroforética. El objetivo de la desnaturalización en este procedimiento es la desnaturalizar la proteína para permitir una linealización completa de las proteínas junto con la carga homogénea de las proteínas con iones SDS. Esto asegura que las proteínas, a diferencia de sus formas nativas, muestran una carga eléctrica que es proporcional al tamaño global de las moléculas. El procedimiento global permite la separación de las moléculas por tamaños.
La presente invención se basa en los hallazgos del inventor de que se pueden estabilizar analitos en muestras corporales solubilizadas calentando la disolución de la muestra durante un periodo de tiempo determinado permitiendo de esta manera el uso directo de la muestra en el inmunoensayo. Según la presente invención el calentamiento puede por ejemplo llevarse a cabo en un medio de muestra adecuado. El procedimiento según la presente invención supera los inconvenientes de los procedimientos conocidos en la técnica. El procedimiento encontrado por los inventores no utiliza conservantes químicos que puedan perjudicar a los animales, a los seres humanos o al medio ambiente, y no impone la necesidad de refrigeración o mantenimiento de otras condiciones consumidoras de energía en el procedimiento global de transporte y almacenamiento.
El efecto de la desnaturalización de las proteínas durante la etapa de calentamiento permite una determinación precisa de las proteínas contenidas en las muestras usando los bioensayos desnaturalizantes. A diferencia de los procedimientos conocidos en la técnica el inmunoensayo desnaturalizante es detección inmunoquímica directamente desde la disolución de la muestra empleando una sonda de detección fijada en fase sólida que se une de manera específica a la proteína contenida en la muestra. En el procedimiento global no está necesariamente comprendida una etapa electroforética. El objetivo y efecto de la desnaturalización en el contexto de este procedimiento no se debe por tanto a la generación de una carga eléctrica homogénea dependiente del tamaño de las proteínas, sino que en parte se debe a la linealización y por tanto a la accesibilidad mejorada de los epitopos antigénicos contenidos en las proteínas.
Breve descripción de la invención
La presente invención se basa en los hallazgos de los inventores mostrados en la siguiente memoria descriptiva de la invención y ejemplificados en los ejemplos proporcionados en el presente documento de que los analitos en disoluciones de muestras corporales que se habían desnaturalizado por tratamiento con SDS pueden someterse directamente a inmunoensayo sin dilución posterior.
Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para inmunoensayo desnaturalizante de proteínas en disolución, en el que al menos una etapa del inmunoensayo se lleva a cabo en presencia del agente desnaturalizante en una concentración que permite mantener el estado desnaturalizado de una analito.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1
Estabilidad de p16^{INK4a} en muestras solubilizadas
Representación gráfica de los niveles de pl61NK4a determinados en muestras procedentes de cérvix de útero humano usando un ELISA. Las muestras cervicales se i solubilizaron en un medio de muestra y posteriormente se incubaron durante varios días a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas de cada muestra para determinación de los niveles de p16^{INK4a} en el día 1 (inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 2, día 3 y día 7. El gráfico 1 muestra los niveles de p16^{INK4a} determinados en 7 muestras en diferentes momentos temporales y muestra por tanto la inestabilidad de p16^{INK4a} contenida en las muestras del paciente en particular bajo las condiciones dadas. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
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Figura 2
Estabilidad de p16^{INK4a} en muestras solubilizadas tras el tratamiento térmico
Representación gráfica de los niveles de p16^{INK4a} determinados en muestras procedentes de cérvix de útero humano usando un ELISA. Las muestras cervicales solubilizaron en un medio de muestra, se trataron térmicamente en un baño de agua durante 15 min a 95ºC y posteriormente se incubaron durante varios días a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas de cada muestra para determinación de los niveles de p16^{INK4a} en el día 1 (inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 2, día 5 y día 8. El gráfico muestra los niveles de p16^{INK4a} determinados en muestras de 11 pacientes distintos y muestra la estabilidad de p16^{INK4a} tras el tratamiento térmico. Para detalles adicionales, véase el
Ejemplo 1.
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Figura 3
Impacto de la duración del tratamiento térmico sobre la estabilidad de p16^{INK4a} en muestras solubilizadas tras un tratamiento térmico
Representación gráfica de las concentraciones de p16^{INK4a} determinadas en muestras procedentes de cérvix de útero humano usando un ELISA. Se incubaron 14 muestras cervicales diferentes hasta 45 min por encima de 95ºC, Se tomaron 4 alícuotas consecutivas tras 15 min, 25 min, 35 min y 45 min desde el inicio del tratamiento térmico, Las concentraciones de p16^{INK4a} se determinaron por duplicado a i partir de cada alícuota por separado, usando el ELISA de p16^{INK4a}, Se muestran tanto la concentración promedio, incluyendo las barras de error de 7 determinaciones como el coeficiente de variación entre 4 determinaciones. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
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Figura 4
Impacto de la temperatura aplicada durante el tratamiento térmico sobre la estabilidad de p16^{INK4a} en muestras solubilizadas tras el tratamiento térmico
Representación gráfica de los niveles de p16^{INK4a} determinados en muestras procedentes de cérvix de útero humano usando un ELISA. Una combinación mezclada de varias muestras que dieron positivo para p16^{INKa} se dividió en 4 alícuotas que bien se dejaron sin tratamiento o bien se incubaron durante 10 min a 80ºC, 90ºC, 99ºC, respectivamente. Se tomaron alícuotas el día 1 (inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 3, día 6 y día 8. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
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Figura 5
Estabilidad de gCatenina en seis muestras solubilizadas
Representación gráfica de los niveles de gCatenina determinados en muestras procedentes de cérvix de útero humano usando un ELISA, 3 muestras cervicales se solubilizaron en medio de muestra inmediatamente tras la obtención de las muestras y posteriormente se incubaron durante varios días a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas en el día 1 (inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 2, día 5 y día 6. Se representan gráficamente los niveles de gCatenina determinados en cada muestra usando un ELISA. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
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Figura 6
Estabilidad de gCatenina en siete muestras solubilizadas tras tratamiento térmico
Representación gráfica de los niveles de gCatenina determinados en muestras procedentes de cérvix de útero humano usando un ELISA. Se solubilizaron 7 muestras cervicales en medio de muestra inmediatamente tras la obtención de las muestras, se trataron térmicamente en un baño de agua durante 15 min a 95ºC y posteriormente se incubaron durante varios días a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas en el día 1 (inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 2, día 4, día 8, día 10 y día 15. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
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Figura 7
Estabilidad de Ep-CAM en siete muestras solubilizadas
Representación gráfica de los niveles de Ep-CAM determinados en muestras procedentes de cérvix de útero humano usando un ELISA. Se solubilizaron 6 muestras cervicales en medio de muestra inmediatamente tras la obtención de las muestras, y posteriormente se incubaron durante varios días a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas en el día 1 (inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 3, día 5 y día 7. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
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Figura 8
Estabilidad de Ep-CAM en siete muestras solubilizadas tras tratamiento térmico
Representación gráfica de los niveles de Ep-CAM determinados en muestras procedentes de cérvix de útero humano usando un ELISA. Se solubilizaron 7 muestras cervicales en medio de muestra inmediatamente tras la obtención de las muestras, se trataron térmicamente en un baño de agua durante 15 min a 95ºC y posteriormente se incubaron durante varios días a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas en el día 1 (inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 2, día 5 y día 6. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
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Figura 9
ELISA de 16^{INK4a} en presencia de SDS al 0,5% y Triton al 3%
Representación de los niveles de p16^{INK4a} medidos en un ELISA procedente de muestras que contienen Triton X100 al 3% y SDS al 0,5%. Se aplicó a muestras con anormalidades en el epitelio del cérvix uterino informadas citológicamente. El gráfico muestra la DO medida en el ELISA correlacionada con el diagnóstico citológico disponible. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1a.
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Figura 10
Niveles de p16^{INK4a} determinados en muestras de pacientes mediante ELISA y LIA ambos realizados en presencia de SDS al 0,3%
Representación gráfica de los niveles de p16^{INK4a} determinados en muestras procedentes de cérvix de útero humano usando los inmunoensayos ELISA y LIA. Los inmunoensayos se llevaron a cabo en presencia de SDS al 0,3% para ambos tipos de ensayos. 12 muestras cervicales se solubilizaron inmediatamente en medio de muestra que comprendía SDS al 0,3%. Las muestras contendidas en el medio de muestra se aplicaron directamente al inmunoensayo. Ambos tipos de inmunoensayo demostraron la detección niveles de proteína p16^{INK4a} en presencia de una concentración elevada de SDS. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 2.
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Figura 11
Niveles de p16^{INK4a} determinados en muestras de pacientes mediante ensayo de flujo lateral realizado en presencia de SDS al 0,3%
Tabla que representa los datos obtenidos en especímenes citológicos e histológicos procedentes de pacientes en correlación con la representación de los resultados obtenidos cuando se aplica la disolución de muestra que comprende SDS al 0,3% y Triton X100 al 1% directamente a la tira reactiva de flujo lateral. Puede verse que en el formato de ensayo de tira reactiva puede detectarse la correspondencia entre p16^{INK4a} y varias lesiones displasias en pacientes por la generación de una banda específica. Esto demuestra que el formato de tira reactiva se puede aplicar según la presente invención en presencia de agentes desnaturalizantes. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 3.
Descripción detallada de la invención
Los procedimientos de examen médico van acompañados o apoyados por lo general en el ensayo de analitos contenidos en muestras corporales. Dichos analitos pueden por ejemplo ensayarse mediante procedimientos químicos en un laboratorio clínico.
La expresión analito tal como se usa en el contexto de la presente invención se referirá a moléculas que se pueden detectar en el transcurso de un procedimiento de ensayo analítico. En algunas realizaciones de la presente invención los analitos son por ejemplo ácidos nucleicos así como moléculas de (poli)péptido. Dichos analitos comprenden por tanto por ejemplo ARN (ARNm, ARNhn, etc.), ADN (ADNc, ADN genómico, etc.), proteínas, polipéptidos, proteoglicanos, glicoproteínas y los respectivos fragmentos de estas moléculas.
En algunas realizaciones de la presente invención los analitos son moléculas de especial relevancia para la detección de enfermedades en mamíferos. Enfermedades según la presente invención pueden comprenden cualquier tipo de dolencias médicamente relevantes que comprenden, pero que no se limitan a dolencias neoplásicas, inflamatorias, infecciosas, degenerativas, genéticas, proliferativas y vasculares así como dolencias cancerosas premalignas y malignas. En algunas realizaciones de la invención las dolencias cancerosas premalignas y malignas pueden comprender trastornos neoplásicos como tumores. Los tumores pueden comprender tumores de cabeza y cuello, tumores del tracto respiratorio, tumores del tracto anogenital, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del sistema urinario, tumores del sistema reproductor, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema central y periférico, tumores de la piel y sus apéndices, tumores de los tejidos blandos y huesos, tumores del sistema linfopoyético y hematopoyético. Los tumores pueden comprender por ejemplo neoplasmas tales como tumores benignos y malignos, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas o displasias. En una realización particular, el tumor es por ejemplo cáncer de la cabeza y el cuello, cáncer del tracto respiratorio, cáncer del tracto anogenital, cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer del sistema urinario, cáncer del sistema reproductor, cáncer del sistema endocrino, cáncer del sistema central y periférico, cáncer de la piel y sus apéndices, cáncer de los tejidos blandos y huesos, cáncer del sistema linfopoyético y hematopoyético.
Los tumores del tracto anogenital pueden comprender cáncer de la piel perineal y escrotal, cáncer cervical, cáncer de la vulva, cáncer de la vagina, cáncer del pene, cáncer del ano, etc. El cáncer cervical puede comprender lesiones escamosas, lesiones glandulares u otros tumores epiteliales. Las lesiones escamosas comprenden, por ejemplo, neoplasias cervicales intraepiteliales (displasia leve, moderada y grave), carcinoma in-situ, carcinoma de células escamosas (por ejemplo, queratinizante, no queratinizante, verrucoso, verrugoso, papilar, tipo linfoepitelioma). Las lesiones glandulares pueden comprender hiperplasias atípicas, adenocarcinoma in-situ, adenocarcinoma (tal como, por ejemplo, mucinoso, endometroide, de células trasparentes, adenoma maligno, papilar, adenocarcinoma seroso o mesonéfrico). Otros tumores epiteliales pueden comprender carcinoma adenoescamoso, carcinoma con células tipo vidrio esmerilado, carcinoma adenoide quístico, carcinoma adenoide basal, tumor carcinoide, carcinoma de células pequeñas y carcinoma no diferenciado. Para una información más detallada, consultar "Kurman, R., Norris, H., y col., Tumors of the Cervix, Vagina, and Vulva, Atlas of Tumor Pathology, 1992, AFIP", cuyo contenido se incorporaría al presente documento por referencia.
Los tumores gastrointestinales pueden comprender cáncer de colon, cáncer del colon ascendente, del colon descendente, del colon transversal, del sigmoideo, del recto, cáncer del intestino delgado, cáncer del yeyuno, cáncer del duodeno, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de hígado, cáncer de la vesícula, cáncer del sistema biliar, cáncer pancreático, etc. Una revisión comprehensiva de las lesiones gastrointestinales se proporciona en "Hamilton Sr, Aaltonen LA (Eds.): World Health Organization Classification of Tumors, Pathology and Genetics of Tumors of the Digestive System, IARC Press: Lyon 2000", que se incorporaría al presente documento por referencia.
Los tumores del tracto respiratorio pueden comprender cualquier dolencia maligna del tracto respiratorio tales como, por ejemplo, cáncer de pulmón, los alvéolos, los bronquiolos, el árbol bronquial y el bronquio, el espacio nasofaríngeo, la cavidad oral, la faringe, la cavidad nasal y el seno paranasal, Cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células escamosas, carcinoma de pulmón de células pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón adenoescamoso, tumor carcinoide del pulmón, tumor del mesotelioma de la glándula bronquial (malignante). Una revisión de los tumores del tracto respiratorio se puede encontrar en Colby TV, y col.: Tumors of the Lower Respiratory Tract, Atlas of Tumor Pathology, Serie Tercera, Fascículo 13, AFIP: Washington 1995'', que se incorporaría al presente documento por referencia.
Los tumores del sistema urinario pueden comprender cáncer de vejiga, cáncer de riñón, de la pelvis renal, cáncer de los uréteres y cáncer de la uretra, etc. Los tumores del sistema reproductor pueden comprender cáncer y etapas precursoras del mismo en ovarios, útero, testículo, próstata, epidídimo, etc.
Las moléculas de especial relevancia para la enfermedad que se pueden usara como analitos según la presente invención pueden ser moléculas que se pueden usar para la detección de la presencia o ausencia de dicha enfermedad. Las moléculas pueden ser indicadoras de la presencia o ausencia de de la enfermedad de diferentes maneras. Dichas maneras pueden comprender niveles de expresión alterados (por ejemplo disminuidos, aumentados, alterados local o temporalmente) así como expresión de moléculas con características alteradas. Dichas características alteradas pueden comprender cualquier tipo de moléculas modificadas. Dichas modificaciones comprenden modificaciones de la secuencia de las moléculas (tales como mutaciones, delecciones, inserciones, etc.) así como otro tipo de modificaciones de las moléculas (tales como por ejemplo modificaciones químicas, fosforilaciones, glicosilaciones, derivatización, defosforilación etc.).
En algunas realizaciones de la presente invención los analitos pueden por ejemplo ser moléculas marcadoras del cáncer o marcadores tumorales. Los analitos se pueden seleccionar entre un grupo que comprende marcadores de la proliferación celular, marcadores característicos de la apoptosis, marcadores de epitopos de la superficie celular, marcadores asociados con una infección vírica o actividad vírica en células (por ejemplo marcadores de la infección por el virus del papiloma humano de alto riesgo seleccionados entre un grupo que comprende HPV16, HPV18, HPV31, HPV 33, HPV35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV56, HPV 58, HPV 59, HPV 66 y HPV 68), marcadores característicos de la diferenciación celular etc. En algunas realizaciones preferidas los analitos son inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina.
Los analitos pueden por ejemplo comprender moléculas derivadas de proteínas seleccionadas entre un grupo que comprende p13.5, p14, p15, p16 (también denominada como p16^{INK4a}), p19, p21, p27, p53, pRb, p14ARF, ciclina A, ciclina B, ciclina E, MDM-2, CDC2, Id1, osteopontina, GRP, dipeptidasa renal, her2/neu, receptor de TGFbII, Citoqueratinas, (por ejemplo citoqueratina 8, citoqueratina 10, citoqueratina 18), antígenos de mucina (MUC1, MUC2, Tn, STn), EpCAM y gCatenina, receptor de concanavalina A, GalNac-transferasa, oligosacariltransferasa, lectinas (ConA, WGA, PNA, UEA I, DBA, SBA, SNA), placofilina, vimentina, antígenos CD (por ejemplo CD3, CD16, CD18, CD4, CD8, CD56, CD19, CD20), marcadores asociados a HPV por ejemplo derivados de los genes de HPV L1, L2, E1, E2, E4, E5, E6 o E7, CDC6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, proteína quinasa CDC7, Dbf4, proteína fosfatasa CDC14, CDC45 y MCM10, Ki67, Ki-S2, PCNA, una helicasa, una topoisomerasa, Topo2alpha, factores de transcripción, miembros de la familia de E2F, Brn-3a, Brn-3b o POLD etc.
Los analitos pueden ser moléculas que se han detectado en forma cualitativa, semicuantitativa e igualmente cuantitativa. Un valor cuantitativo puede por ejemplo representarse en términos de una concentración. Un valor semicuantitativo se puede expresar en términos de una escala de niveles, por ejemplo niveles indetectables, niveles bajos, niveles intermedios, niveles elevados, o de cualquier otro modo adecuado. El nivel de analito se puede también representar en términos de un parámetro dependiente tal como la intensidad de una señal generada en un formato de ensayo en respuesta a la presencia de una molécula marcadora. Para la expresión de la intensidad de la señal en ensayos tanto semicuantitativos como cuantitativos se pueden usar unidades relativas para la expresión de las cantidades de analito determinadas. Las unidades relativas usadas se pueden denominar de cualquier manera tal como por ejemplo unidades por ml de muestra (U/ml). Dichas unidades pueden estar directamente relacionadas con la concentración molar real de los analitos según se mide en una disolución pero también pueden ser unidades arbitrarias aplicables en el formato de ensayo respectivo.
Los analitos se detectan mediante inmunoensayo según la presente invención. Inmunoensayo según la presente invención es cualquier detección inmunoquímica de un analito. Dicha detección inmunoquímica puede comprender en algunas realizaciones ensayos en los que se usan uno o más sondas o anticuerpos para capturar las moléculas de analito y posterior detección del complejo sonda/anticuerpo con analito. Dicha reacción puede tanto llevarse a cabo en disolución o fijada a una fase sólida. Los expertos en la técnica conocen inmunoensayos adecuados. Dichos ensayos pueden comprender ELISA y diferentes tipos de otros inmunoensayos. Dichos inmunoensayos pueden comprender pero no limitarse a por ejemplo inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos, tales como EIA, ELISA, RIA, ECLIA, LIA, ensayos de flujo lateral, ensayos de flujo en pistón, tiras inmunocromatográficas, etc. Los inmunoensayos para uso en la invención pueden ser inmunoensayos tanto competitivos como no competitivos. En algunas realizaciones en los inmunoensayos se pueden emplear anticuerpos o sondas fijados a fases sólidas. Las fases sólidas pueden comprender diferentes realizaciones de sustancias sólidas tales como superficies planares, partículas (incluyendo micro y nanopartículas, o partículas incluso más pequeñas). En algunas realizaciones, las partículas se pueden proporcionar en forma de esferas, perlas, coloides, o similares.
La fijación de los reactivos a la fase sólida en un kit de ensayo y otro dispositivo para diagnóstico in vitro se puede llevar a cabo mediante fijación directa o mediante fijación indirecta. La fijación directa se puede llevar a cabo mediante enlace covalente, enlace no covalente, asociación o adsorción a las superficies. La fijación indirecta se puede llevar a cabo enlazando el anticuerpo a agentes que están directamente ligados a fases sólidas. Entre los agentes ligantes se incluyen avidina, estreptavidina, biotina, digoxigenina, anticuerpos, o similares.
El inmunoensayo puede comprender una o más reacciones adicionales con agentes detectores que bien reconozcan los analitos o preferiblemente reconozcan las sondas usadas para reconocer a los analitos. La reacción de detección puede comprender además una reacción indicadora que indique el nivel de los analitos.
Los sistemas de detección pueden ser por ejemplo sistemas cromogénicos, sistemas por luminiscencia (electroluminescencia, bioluminescencia, fotoluminescencia, radioluminescencia, quimioluminescencia, electroquimioluminescencia), sistemas basados en fluorescencia, sistemas de detección basados en conductividad, radiación (luz, UV, rayos X, gamma etc.), resonancia de plasmón (por ejemplo resonancia de plasmón superficial SPR) o cualquier otro procedimiento conocido.
Según la presente invención, la muestra corporal solubilizada contenida en el medio de muestra puede aplicarse directamente como espécimen para la realización del inmunoensayo. En algunas realizaciones de la presente invención durante el inmunoensayo pueden estar presentes elevadas concentraciones de detergentes. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente invención, el inmunoensayo puede ser un inmunoensayo que sea específicamente tolerante a las condiciones de desnaturalización. En algunas realizaciones de la invención los inmunoensayos son tolerantes a concentraciones de SDS superiores al 0,1%, en una realización preferida los inmunoensayos son tolerantes a concentraciones de SDS superiores al 0,3%. En otra realización preferida los inmunoensayos son tolerantes a concentraciones de SDS superiores al 1%.
La detección de los analitos se lleva a cabo preferentemente usando una o más "sondas" (que se usa de forma intercambiable con el término "agentes ligantes" en la presente invención) para la detección del analito. La sonda puede ser por ejemplo un anticuerpo que se una específicamente con el analito. El término "anticuerpo" en todas sus formas gramaticales hace referencia en el contexto de la presente invención a moléculas de unión con antígeno incluyendo, pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales y policlonales, fragmentos de anticuerpos, epitopos de unión con antígeno, mini-anticuerpos, peptidomiméticos con propiedades de unión con antígeno, anticalinas y anticuerpos bioespecíficos. En general, la detección del analito debe comprender la detección de la presencia o ausencia o el nivel de los analitos.
La expresión "muestra corporal" tal como se usa en el presente documento comprende cualquier muestra corporal de cualquier tipo y naturaleza. Ejemplos de dichas muestras corporales son secreciones, frotis, lavados, fluidos corporales, semen, muestras celulares y tisulares, sangre, moco cervical, esputo, orina, heces. líquido cerebroespinal (denominado brevemente "líquido" en el presente documento), bilis, secreciones gastrointestinales, linfa, médula ósea, aspirados y biopsias de órganos tales como biopsias de aguja o con 5 sacabocados y aspirados con aguja (fina). En particular, el moco cervical, frotis y biopsias están indicados cuando se trata de la detección de cánceres anogenitales, por ejemplo cánceres cervicales. El término biopsias tal como se usa en todo este documento comprenderá todo tipo de biopsias conocidas de los expertos en la técnica. Así, las biopsias usadas en el contexto de la presente invención pueden comprender por ejemplo muestras resecadas de tumores, muestras tisulares preparadas por medios endoscópicos o biopsias de órganos con sacabocados o con aguja. Las biopsias comprenden especímenes obtenidos mediante varias procedimientos diferentes tales como biopsias con bisturí, LEEP (escisión electroquirúrgica con asa, por sus siglas en inglés) biopsias, etc. Las muestras corporales según la presente invención en algunas realizaciones de la invención pueden referirse a especímenes que comprenden material celular obtenido del cuerpo humano. Dichas muestras pueden por ejemplo comprender especímenes que son adecuados para uso en examen citológico. Los ejemplos son muestras de frotis, muestras para citología de líquido y moco cervical.
Las muestras para citología de líquidos pueden comprender cualquier tipo de muestra para citología de líquidos que comprenda por ejemplo muestras celulares o tisulares conservadas en cualquier medio estandarizado para recogida, almacenamiento o transporte de muestras, conocido de las personas expertas en la técnica tales como por ejemplo medios de conservación comercialmente disponibles (disolución de formalina, "PreservCyt" o "CytoLyt" de Cytyc, "Medio Universal de Recogida" de Digene, "Cytorich" de Tripath Imaging, etc.). Alternativamente, los medios de conservación de células para citología de muestras líquidas pueden contener una mezcla de uno o más compuestos seleccionados entre un i grupo que comprende alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos, iones o sublimados metálicos, éteres, etc. Para la conservación de componentes celulares. Los alcoholes incluyen metanol, etanol, (n- o i-) propanol, (n-, i- o t-) butanol o alcoholes superiores ramificados o no 1 ramificados. Los aldehídos incluyen formaldehido, acetaldehído, glutaraldehído, etc. Se pueden usar cetonas como acetona. Los ácidos para uso en medios normalizados para muestras incluyen ácidos orgánicos (ácido acético, ácido tricloroacético, ácido salicílico, ácido pícrico) o ácidos inorgánicos tales como por ejemplo ácido crómico. Las disoluciones estándar de muestra pueden comprender metales tales como plata, cobre, cromo, mercurio, osmio, uranio. Las disoluciones de sales tales como acetato de uranilo, cromato de potasio, sulfato de amonio, etc. pueden también ser componentes de los medios de conservación. En las realizaciones preferidas, los especímenes para citología líquida son especialmente adecuados para detección inmunoquímica posterior de analitos de proteína en las muestras.
En algunas realizaciones de la presente invención la muestra corporal se puede obtener a partir de un dispositivo usado para obtener un espécimen de ensayo en otro procedimiento antes de desechar dicho dispositivo. Los dispositivos pueden por ejemplo comprender cualquier tipo de cepillo, escobilla, espátula, hisopo, etc. Dichos dispositivos comprenden por ejemplo los hisopos fabricados en Dacron®, algodón, o cualquier otra fibra adecuada, cepillos tales como el cepillo endocervical, sistema Medscand para muestreo cervical, CervexBrush®, CervexBrush Combi^{TM} de Rovers Medical Systems, N.V., Cytobrush@ de Medscand Medical AB y el Cervical Cell Sampler^{TM} de Digene Corp.
En algunas realizaciones la muestra corporal según la presente invención se obtiene de los dispositivos tras obtener material de muestra para otro procedimiento de ensayo. Por ejemplo, se puede usar el dispositivo de muestreo para preparación de una muestra convencional de moco cervical y posteriormente puede ponerse en contacto con un medio de muestra según la presente invención. Alternativamente, el dispositivo de muestreo puede usarse también para la preparación de cualquier tipo de muestra para citología de líquido y puede ponerse en contacto con el medio de muestra según la presente invención con posterioridad. En el caso de muestras para citología de líquido los inventores pretenden también que parte de la muestra para citología de líquido también se pueda usar para ponerse en contacto con el medio de muestra y solubilizarse para el análisis mediante un inmunoensayo desnaturalizante.
Poner en contacto el dispositivo de muestreo con un medio de muestra puede comprender sumergir el dispositivo de muestreo en un vial que contiene el medio de muestra. En algunas realizaciones, el dispositivo de muestreo se sumerge en el medio hasta cubrir completamente con el medio de muestra la parte del dispositivo de muestreo que se ha puesto en contacto con el cuerpo humano. Tras sumergir el dispositivo de muestreo en el medio de muestra, el dispositivo se puede hacer girar en el medio. Alternativamente, el medio junto con el dispositivo de muestreo se pueden agitar o someterse a vortización. En algunos casos, el dispositivo de muestreo puede ponerse en contacto con el medio de muestra de manera que el dispositivo o parte del dispositivo se guarde o permanezca dentro del medio de muestra durante un periodo de tiempo para permitir la disolución completa de las células o restos celulares. En algunos casos, el dispositivo de muestreo puede por ejemplo calentarse junto con el medio de muestra.
En general, la ejecución del inmunoensayo puede tener lugar inmediatamente después de que la muestra corporal haya entrado en contacto con el medio de muestra o puede tener lugar tras un cierto periodo de tiempo. En algunas realizaciones de la invención el inmunoensayo se ejecuta directamente cuando se ha completado, o se cree que se ha completado, la lisis de la muestra corporal. En algunas realizaciones adicionales de la invención, tras completarse la lisis de la muestra corporal la disolución de muestra se almacena durante un periodo de tiempo que puede oscilar entre minutos y semanas. En una realización preferida, el tiempo entre la lisis de la muestra corporal en el medio de muestra y la ejecución del inmunoensayo es un periodo de tiempo no inferior a 1 minuto y no superior a 90 días, en una realización aún más preferida, el periodo de tiempo no es inferior a 1 hora y no es superior a 14 días y en otra realización preferida el periodo de tiempo no es superior a 7 días. En algunas realizaciones el tiempo puede ser incluso del orden de años.
Las muestras corporales según la presente invención pueden ponerse en contacto con un medio de muestra inmediatamente tras -la obtención de las muestras o incluso después de transcurrir un determinado lapso de tiempo. Durante ese tiempo, las muestras corporales pueden por ejemplo refrigerarse, congelarse o conservarse en una disolución conservante celular. Los procedimientos para dicha conservación celular mediante congelación o refrigeración son conocidos por las personas expertas en la técnica.
Según la presente invención se puede usar una muestra corporal para la detección de uno o más analitos mediante análisis inmunoquímico. La detección de los analitos se puede ejecutar en un único ensayo o en múltiples ensayos diferentes. En algunas realizaciones de la invención según esto únicamente se usa una alícuota de la muestra corporal completa para la determinación de un único analito a partir de la muestra corporal.
Los términos "solubilizado" o "solubilización" tal como se usan en el contexto de la presente invención significan que los componentes de una muestra corporal se han puesto en contacto con un medio de muestra y se han disuelto al menos en parte en el medio de muestra y posteriormente los componentes de la muestra corporal están representados al menos en parte por los componentes de la disolución.
El término "medio de muestra" tal como se usa en el contexto de la presente invención puede ser cualquier líquido conocido de los expertos en la técnica adecuado para la solubilización de componentes celulares o de células completas. El medio de muestra puede, por ejemplo, ser disoluciones orgánicas o acuosas de agentes caotrópicos tales como por ejemplo urea, GuaSCN, formamida, o detergentes tales como detergentes aniónicos (por ejemplo SDS, N-lauril sarcosina, desoxicolato de sodio, alquil-aril sulfonatos, sulfatos de alcohol (graso) de cadena larga, sulfatos y sulfonatos de olefina, sulfatos y sulfonatos de alfaolefina, monoglicéridos sulfatados, éteres sulfatados, sulfosuccinatos, sulfonatos de alcano, ésteres de fosfato, isetionatos de alquilo, ésteres de sacarosa), detergentes catiónicos (por ejemplo cloruro de cetil trimetilamonio), detergentes no fónicos (por ejemplo Tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100, NP-40, Igepal CA-630, N-Octil-Glucósido) detergentes no iónicos o anfóteros (por ejemplo CHAPS, 3-dodecildimetilamoniopropano-1-sulfonato, óxido de laurildimetilamina) y/o hidróxidos alcalinos tales como por ejemplo NaOH o KOH. En algunas realizaciones el medio de muestra puede comprender también ácidos inorgánicos o ácidos orgánicos como componentes tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido fosfórico etc. En algunas realizaciones, cuando la lisis de las células se puede conseguir sin usar detergentes, se pueden usar como disolventes disoluciones hiper o hipotónicas o tampones o simplemente agua o un líquido orgánico. Cualquier líquido que sea adecuado para solubilizar los componentes celulares de las muestras corporales en todo o en parte puede considerarse como un medio de muestra según se usa en el presente documento. De esta manera, el medio de muestra según se usa en el presente documento puede necesitar o no contener sustancias tamponantes o tener capacidad tampón.
En general, se puede usar cualquier líquido adecuado como medio de muestra de la presente invención. El líquido puede ser orgánico o inorgánico y puede ser un líquido puro, una mezcla de líquidos o una disolución de sustancias en el líquido y puede contener sustancias adicionales para potenciar las propiedades del disolvente. En algunas realizaciones, cuando la lisis de las células se puede conseguir sin usar detergentes, se pueden usar como disolventes disoluciones hiper o hipotónicas o tampones o simplemente agua o un líquido orgánico. Cualquier líquido que sea adecuado para solubilizar los componentes celulares de las muestras corporales en todo o en parte puede considerarse como un medio de muestra según se usa en el presente documento. De esta manera, el medio de muestra según se usa en el presente documento no necesita contener sustancias tamponantes o tener capacidad tampón. Sin embargo, en algunas realizaciones de la invención la muestra media puede tener capacidad tampón y puede contener sustancias tamponantes.
En una realización, el medio de muestra se diseña de manera que se solubilicen las células, restos celulares, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos y el resto de biomoléculas potencialmente presentes en la mezcla bruta. En realizaciones adicionales de la presente invención, el disolvente se puede diseñar para asegurar la solubilización diferencial de componentes específicos de la muestra corporal, dejando sin solubilizar otros componentes.
El medio de muestra para solubilizar la muestra corporal según la presente invención puede comprender adicionalmente uno o más agentes para evitar la degradación de los componentes contenidos en las muestras brutas. Dichos componentes pueden por ejemplo comprender inhibidores de enzimas tales como inhibidores de la proteinasa, inhibidores de la ARNsa, inhibidores de la ADNsa, etc. En una realización de la presente invención, la muestra se lisa directamente en la forma obtenida de los ensayos individuales. Los inhibidores de la proteinasa pueden comprender, por ejemplo, inhibidores de las serina proteinasas, inhibidores de las cisteína proteinasas, inhibidores de las aspártico proteinasas, inhibidores de las metaloproteinasas, inhibidores de las proteinasas ácidas, inhibidores de las proteinasas alcalinas, o inhibidores de las proteinasas neutras. En algunas realizaciones de la presente invención se puede conseguir la inhibición de enzimas por medios químicos tales desnaturalización de las enzimas mediante concentración de sal, pH, agentes caotrópicos, o similares.
En algunas realizaciones de la invención, con el fin de obtener resultados óptimos en el ensayo, el pH de un medio de muestra a aplicar directamente al sistema de ensayo es prácticamente neutro. En realizaciones adicionales el pH del medio de muestra está comprendido en el intervalo entre 4 y 10. En algunas otras realizaciones, el pH está comprendido entre 5 y 9. En una realización preferida, el pH está comprendido entre 6 y 8. En una realización más preferida, el pH está comprendido entre 6,5 y 7,5.
Los ejemplos de agentes desnaturalizantes para medios de muestra y/o para desnaturalizar analitos según la presente invención se pueden seleccionar por ejemplo entre las sustancias dadas en la Tabla 1.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
1
Todas las concentraciones dadas en porcentaje (%) en toda la memoria descriptiva de esta invención se refieren a peso porcentual en volumen (%p/v).
El medio de muestra según la presente invención comprende en realizaciones preferidas un agente desnaturalizante. Dicho agente desnaturalizante puede seleccionarse entre un grupo que comprende detergentes o agentes caotrópicos.
En algunas situaciones, los analitos se pueden degradar en las muestras solubilizadas y por tanto no se pueden detectar. Esto es particularmente cierto si las muestras se transfieren directamente a un medio de lisis y se almacenan en el mismo durante un determinado periodo de tiempo antes de una preparación adicional. Para evitar la degradación, el medio de muestra puede comprender adicionalmente uno o más agentes que evitan la degradación de los componentes contenidos en las muestras brutas. Dichos componentes puede comprender por ejemplo inhibidores de enzimas tales como inhibidores de la proteinasa, inhibidores de la ARNsa, inhibidores de la ADNsa, etc. Los inhibidores pueden por ejemplo comprender inhibidores de la proteinasa seleccionados entre las composiciones dadas en la Tabla 2.
TABLA 2
2
A efectos de estabilización, el medio de muestra puede también comprender proteína voluminosa (por ejemplo albúmina tal como albúmina de suero bovino o albúmina de suero de ternera, lecitina de soja, u otras proteínas voluminosas) para competir en la degradación con las proteínas de la muestra. Las proteínas voluminosas pueden por ejemplo estar presentes en combinación con inhibidores de la proteinasa o se pueden añadir en lugar de los inhibidores de la proteinasa. En algunas realizaciones el medio de muestra se puede seleccionar para que sea compatible con el rendimiento del ensayo (por ejemplo ELISA), de manera que las muestras solubilizadas puedan aplicarse directamente al ensayo. En algunas realizaciones, el medio de muestra puede igualmente comprender sustancias que inhiban la actividad microbiana. Dichas sustancias pueden comprender por ejemplo sustancias microbicidas o microestáticas. Dichas sustancias comprenden por ejemplo azida de sodio, proclina, 5-Bromo-5-Nitro-1,3-Dioxano, 2-Metil-4-Isotiazolin-3-ona, 5-Cloro-2-Metil-4-Isotiazolin-3-ona y compuestos que contienen mercurio (por ejemplo timerosal). Para la estabilización global de los analitos en el medio de muestra según la presente invención se aplica una etapa de calentamiento. Un medio de muestra según la presente invención en algunas realizaciones puede también comprender uno o más agentes desnaturalizantes. Dichas combinaciones pueden comprender los agentes desnaturalizantes desvelados en el presente documento en cualquier combinación adecuada.
Calentar, tal como se usa en el contexto de la presente invención se referirá a un procedimiento de someter el medio de muestra que contiene la muestra corporal solubilizada a temperaturas elevadas en relación a la temperatura ambiente y puede corresponder a calentar a cualquier temperatura por debajo o por encima del punto de ebullición de un medio de muestra particular. Calentar puede por ejemplo comprender someter a temperaturas de 30 a 150º C. En algunas realizaciones calentar comprende someter a temperaturas superiores a 50ºC. En una realización preferida de la invención calentar se referirá a someter a temperaturas entre 70ºC y 130ºC. En otra realización preferida, calentar comprende someter a temperaturas entre 95 y 110ºC.
En el contexto de la presente invención el calentamiento se lleva a cabo durante un periodo de tiempo que permita que los analitos contenidos en la muestra corporal se estabilicen de manera óptima en el medio de muestra. El periodo de tiempo necesario para esto puede variar, y depende del tipo de muestras. Los tiempos de calentamiento (tiempos eficaces de incubación) a una temperatura dada se pueden elegir para que estén comprendidos entre 5 y 30 minutos. En una realización preferida de la invención el tiempo de incubación está entre 10 y 27 minutos. En otra realización preferida, el tiempo de incubación está entre 15 y 25 minutos. El tiempo total de calefacción a una temperatura dada debe diferenciarse del tiempo para la incubación de la disolución de la muestra a una temperatura dada. El tiempo de calentamiento (tiempo eficaz de incubación) anteriormente proporcionado se referirá al tiempo en el que la disolución de la muestra se caliente en un dispositivo de calentamiento que comprende el periodo de tiempo durante el cual la temperatura de la disolución de la muestra se equilibra con la temperatura de incubación final. Éste es por lo general más largo que el periodo de tiempo para incubación a la temperatura de incubación deseada una vez que la disolución de la muestra se ha equilibrado con la temperatura de incubación. Para una mera incubación a la temperatura de destino se considera suficiente un periodo de tiempo entre 1 minuto y 30 minutos para los procedimientos según la presente invención. En una realización preferida de la presente invención se usa para calentar un periodo de tiempo de 3 a 15 minutos. En algunas realizaciones de la invención son suficientes periodos de tiempo entre 5 y 12 minutos. Los tiempos de incubación dados son fuertemente dependientes del dispositivo de calentamiento usado así como del tipo de vial y del medio de muestra usado. Por tanto, el periodo de tiempo necesario para la incubación puede exceder o ser más corto que el periodo de tiempo dado anteriormente. Las personas expertas en la técnica saben determinar el periodo de tiempo necesario para incubar una disolución de muestra incubada a temperatura ambiente que se ha introducido en un dispositivo de calentamiento ya caliente para permitir una incubación de la disolución de la muestra a la temperatura de incubación deseada durante el periodo de tiempo planificado. Los dispositivos de calentamiento para ejecutar el procedimiento de la presente invención pueden ser cualquier dispositivo de calentamiento que se pueda aplicar para calentar una disolución de muestra en un laboratorio durante un periodo de tiempo fijo. En general, los dispositivos de calentamiento están equipados con un termostato que se puede ajustar para mantener una temperatura preseleccionada. Dichos dispositivos de calentamiento pueden por ejemplo comprender baños de agua, hornos de microondas y bloques calefactores. En algunas realizaciones de la invención el dispositivo de calentamiento está equipado con un temporizador que permite al usuario controlar fácilmente el tiempo de incubación. De otra manera, el usuario puede usar un temporizador externo (tal como por ejemplo un despertador) para controlar el tiempo de incubación.
Desnaturalizar un analito o la desnaturalización de un analito tal como se usan en el contexto de la presente invención se referirán a cualquier tipo de alteración del analito o a la alteración del analito respecto de su estado nativo. En algunas realizaciones de la invención dicha alteración respecto de su estado nativo puede comprender cualquier tipo de perturbación de la estructura nativa o natural primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de un analito (proteína).
Un aspecto de la presente invención corresponde a un bioensayo desnaturalizante. Un bioensayo desnaturalizante en el contexto de la presente invención es un ensayo inmunoquímico que está diseñado para detectar la presencia o ausencia y/o el nivel de un analito contenido en una disolución de muestra. Dicho bioensayo es preferiblemente un ensayo en el que la detección del analito se lleva a cabo en una fase líquida o usando reactivos fijados a una fase sólida. En cualquier caso, un bioensayo desnaturalizante según la presente invención se caracteriza por al menos una etapa de la reacción inmunoquímica que se lleva a cabo en la presencia de agentes desnaturalizantes. A diferencia de la situación en un bioensayo desnaturalizante según la presente invención, en SDS-PAGE únicamente se lleva a cabo la electroforesis en gel bajo condiciones desnaturalizantes y se lleva a cabo posteriormente la detección inmunoquímica, una vez que los agentes desnaturalizantes se han eliminado por lavado. Un ejemplo de un bioensayo desnaturalizante según la presente invención es por ejemplo un ELISA en sándwich en el que la etapa de captura del antígeno se lleva a cabo directamente a partir de la disolución de la muestra que contiene el analito y el agente desnaturalizante. En este caso la disolución de la muestra que comprende un agente desnaturalizante se pone en contacto con una fase sólida fijada directamente sobre un analito particular. Se lleva a cabo La captura del analito por el anticuerpo de captura y el agente desnaturalizante se elimina por lavado únicamente tras dicha etapa. La ventaja de dicho procedimiento es que los cambios conformacionales presentes en el analito desnaturalizado se mantienen durante la etapa de captura y de esta manera puede tener lugar la interacción de la sonda o el anticuerpo con el analito desnaturalizado. Esto puede conducir en algunos casos a una precisión mejorada de la detección del analito. Especialmente cuando se han empleado epitopos lineales de un analito para la generación de sondas o anticuerpos, se puede mejorar la detección de dichos analitos mediante dichos anticuerpos si la reacción inmunoquímica se lleva a cabo en condiciones
desnaturalizantes.
Sin embargo, en la técnica existe el prejuicio de que altas concentraciones de agentes desnaturalizantes interfieren con la reacción inmunoquímica y por tanto no puede tener lugar la unión con el antígeno de una manera adecuada, si por ejemplo está presente SDS en la disolución en incubación. Los inventores han encontrado ahora que dichas concentraciones elevadas de agentes desnaturalizantes pueden tener un impacto positivo sobre la ejecución de una reacción de detección inmunoquímica bajo determinadas circunstancias según se ha descrito anteriormente.
Los inmunoensayos desnaturalizantes según la presente invención pueden comprender pero no limitarse a por ejemplo inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos, tales como EIA, ELISA, RIA, ECLIA, LIA, ensayos de flujo lateral, ensayos de flujo pistón, tiras inmunocromatográficas, ensayos de aglutinación en látex etc.
Los inmunoensayos para uso como inmunoensayos desnaturalizantes en la invención pueden comprender inmunoensayos tanto competitivos como no competitivos. En algunas realizaciones se pueden emplear en los inmunoensayos anticuerpos o sondas fijados a fases sólidas. Las fases sólidas pueden comprender diferentes realizaciones de sustancias sólidas, tales como superficies planares, partículas (incluyendo micro y nanopartículas o incluso partículas más pequeñas). En algunas realizaciones, las partículas se pueden proporcionar en forma de esferas, perlas, coloides o similar.
La fijación de los reactivos a la fase sólida en un kit de ensayo o en un dispositivo para diagnóstico in vitro se puede llevar a cabo mediante fijación directa o mediante fijación indirecta. La fijación directa se puede llevar a cabo mediante enlace covalente, enlace no covalente, asociación o adsorción a superficies. La fijación indirecta se puede llevar a cabo mediante el enlace del anticuerpo a agentes que están ellos mismos directamente fijados a fases sólidas. Los agentes ligantes incluyen, por ejemplo, avidina, estreptavidina, biotina, digioxingenina, anticuerpos o similares.
Los inmunoensayos pueden comprender una o más reacciones con agentes de detección que bien reconocen los analitos o preferiblemente reconocen las sondas usadas para reconocer los analitos. La reacción de detección puede comprender además una reacción indicadora que indique el nivel de los analitos.
Los sistemas de detección puede ser por ejemplo sistemas cromogénicos, sistemas luminiscentes, sistemas (electroluminescencia, bioluminescencia, fotoluminescencia, radioluminescencia, quimioluminescencia, electroquimioluminescencia), sistemas basados en fluorescencia, sistemas de detección basados en conductividad, radiación (luz, UV, rayos X. gamma etc.), resonancia de plasmón (poro ejemplo resonancia de plasmón superficial SPR) o cualquier otro procedimiento conocido.
Los agentes desnaturalizantes usados para dicho bioensayo desnaturalizante pueden en algunas realizaciones de la invención formar parte del medio de muestra en el que se introduce la muestra corporal para almacenamiento y transporte antes del análisis. En otras realizaciones, el agente desnaturalizante se pone en contacto con las proteínas del analito en una muestra justo antes de la etapa de desnaturalización. Los agentes desnaturalizantes usados para el bioensayo desnaturalizante que se desvelan en el presente documento pueden comprender por ejemplo agentes caotrópicos tales como por ejemplo urea, GuaSCN, formamida, detergentes tales como detergentes aniónicos (por ejemplo SDS, N-lauril sarcosina, deoxicolato de sodio, alquil-aril sulfonatos, sulfatos de alcohol (graso) de cadena larga, sulfatos y sulfonatos de olefina, sulfatos y sulfonatos de alfaolefina, monoglicéridos sulfatados, éteres sulfatados, sulfosuccinatos, alcanosulfonatos, ésteres fosfato, isetionatos de alquilo, ésteres de sacarosa), detergentes catiónicos (por ejemplo cloruro de cetil trimetilamonio), detergentes no fónicos (por ejemplo Tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100, NP-40, Igepal CA-630, N-Octil-glucósido) o detergentes anfóteros (por ejemplo CHAPS, 3-Dodecil-dimetilamonio-propane-1-sulfonato, óxido de laurildimetilamina) e hidróxidos alcalinos tales como por ejemplo NaOH o KOH. En algunas realizaciones los agentes desnaturalizantes pueden comprender también ácidos inorgánicos u orgánicos coma componentes tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido fosfórico, etc.
Según la presente invención pueden estar presentes concentraciones elevadas de detergentes durante el l inmunoensayo. En algunas realizaciones de la invención los inmunoensayos toleran concentraciones de SDS superiores al 0,1%, en una realización preferida los inmunoensayos toleran concentraciones de SDS superiores al 0,3%. En otra realización preferida los inmunoensayos toleran concentraciones de SDS superiores al 1%. En algunas realizaciones de la invención el inmunoensayo puede tolerar una concentración de Triton X 100 de menos del 0,1% hasta al menos el 3%.
Los ejemplos proporcionados a continuación son indicados para ilustrar la materia sujeto de la invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Los expertos en la técnica pueden realizar algunas variaciones de los ejemplos según se han proporcionado. Los ejemplos por tanto proporcionan un alcance limitado de las realizaciones de los procedimientos de la invención detallada aquí. Basándose en los ensayos comprehensivos realizados por los inventores, los inventores creen que los procedimientos desvelados se pueden transferir con facilidad a otros analitos y otros agentes desnaturalizantes sin alterar los efectos positivos de los procedimientos inventivos tal como se detallan en el presente documento.
Ejemplos Ejemplo 1 Estabilización de las proteínas p16^{INK4a} Ep-Cam y Gamma Catenina en muestras procedentes del cérvix uterino
Se determinaron los niveles de la proteína p16^{INK4a} en especímenes cervicales que se habían obtenido con un dispositivo de muestreo cervical estándar. Se sometieron 11 muestras a una etapa de calentamiento según la invención desvelada en el presente documento, y se analizaron para los niveles de p16^{INK4a} tras almacenamiento tras un determinado periodo de tiempo tras lo anterior; otras 7 muestras se usaron directamente para análisis de la muestras para los niveles de proteína p16^{IN14a} mediante la técnica de ELISA.
Preparación y estabilización de la muestra
Para los presentes ejemplos, las muestras de la paciente fueron recogidas por ginecólogos usando un cepillo endocervical o un Cervex-Brush Combi (Rovers Medical Devices). Tras preparación de los especímenes procedentes del cepillo endocervical para PAP-moco cervical convencional, el cepillo endocervical que contenía material residual de muestra se insertó en un vial de recogida de muestra (por ejemplo Vial PP de Sarstedt) conteniendo 5 ml de tampón PST (tampón PST: Triton X100 al 1%, SDS al 0,3%, y solución salina tamponada con fosfato; la solución salina tamponada con fosfato contenía Proclin300 como conservante para la estabilización del tampón antes del uso). Se retiró el mango del cepillo, y la punta del cepillo se dejó dentro del vial de recogida de la muestra. El vial de recogida de la muestra con material de muestra y el cepillo de recogida se trató térmicamente durante un periodo de tiempo de 2 horas tras la recogida de la muestra, durante 15 min a 95ºC en un baño de agua, alternativamente se puede usar para la etapa de tratamiento térmico 25 min a 100ºC en un bloque de calefacción.
Se usó un bloque de calefacción con termostato y orificios del tamaño adecuado para viales NeoLab Cat. Nº 2-2503). La muestra se almacenó sin otra manipulación adicional (sin centrifugación, cepillo dentro del vial) a temperatura ambiente durante hasta 14 días hasta el análisis de la muestra mediante ELISA como sigue:
Ejecución del ELISA
Los niveles y/o concentraciones de p16^{INK4a} se determinaron por medidas duplicadas tomando 100 \mul de muestra/determinación. Se midieron los niveles de p16^{INK4a} por ejemplo a 1 día, 2 días, 5 días y 6 días tras el i inicio del almacenamiento de las muestras a temperatura ambiente. Cada punto de datos es un promedio de 2 medidas (coeficientes de variación inferior al 10%).
Se usaron placas ELISA revestidas con un anticuerpo clonado mtm E6H4 específico de p16^{INK4a} para la detección por ELISA de p16^{INK4a}, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de la muestra de células lisadas. A efectos de calibración del ensayo, se incluyeron diferentes concentraciones de la proteína recombinante p16^{INK4a} (0 \mug/ml, 50 \mug/ml, 100 \mug/ml, 200 \mug/ml, 400 \mug/ml, 800 \mug/ml) en el ensayo. Las muestras se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente.
Después se realizaron 3 etapas de lavado usando un lavador ELISA automático. Se usó un anticuerpo clonado secundario mtm D7D7 específico de la proteína p16^{INK4a} conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) para la detección en el sistema de sándwich ELISA. Se añadieron 100 \mul de la disolución de D7D7-HRP a cada pocillo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación se realizaron 3 etapas de lavado usando un lavador ELISA automático. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de TMB-substrato. Las placas ELISA se incubaron a 25ºC durante exactamente 15 min en la oscuridad. A continuación la reacción se detuvo por adición de 80 \mul de H_{2}SO_{4} 2,5 M. En los 5 min siguientes a la detención de la reacción, se determinó la DO a 450 nm, Tras la evaluación de los resultados, cada muestra devolvió un valor para la DO. Usando una curva de calibración basada en las muestras de calibración incluidas en el ensayo, la DO se transformó en unidades relativas/ml.
Se determinaron Ep-CAM y gCatenina procedentes de muestras análogas usando un sándwich ELISA específico basado en las siguientes parejas de anticuerpos: HEA-125 (German Cáncer Research Center) y MK1-410 (BioVendor) para Ep-CAM, 10F8 (mtm laboratories) y 4C12 (mtm laboratories) para gCatenina.
Resultados
Los niveles de p16^{INK4a} medidos en los especímenes cervicales se recogen tanto en forma de DO (todos los datos de una muestra se obtuvieron por tanto usando una sola placa ELISA) o en unidades/ml. Los niveles medidos en una muestra respectiva en diferentes puntos temporales se muestran en la fig. 1 para muestras no tratadas con calor y en la fig. 2 para muestras tratadas con calor.
Los datos mostrados en la fig. 1 demuestran que hay una pérdida significativa de la señal de p16^{INK4a} detectable en el ELISA si la muestra se almacena a temperatura ambiente durante un periodo de varios días. Esto indica que se produce una degradación de la proteína analito p16^{INK4a} en la muestra. En la fig. 2 se puede ver que no hay pérdida de la señal durante el periodo de tiempo completo ensayado para las muestras que se habían sometido al tratamiento térmico. Por tanto, el nivel de p16^{INK4a} procedente de especímenes de muestras cervicales que se habían obtenido tras tratamiento térmico queda estabilizado durante el tiempo de almacenamiento total.
Con el fin de determinar si el nivel de p16^{INK4a} en los especímenes de muestras se ve afectado por la variación del procedimiento de tratamiento térmico, se tomaron 4 alícuotas consecutivas de 14 muestras diferentes incubadas como sigue:
- Alícuota 1 tomada tras 15 min a 100ºC
- Alícuota 2 tomada tras 25 min a 100ºC
- Alícuota 3 tomada tras 35 min a 100ºC
- Alícuota 4 tomada tras otros 10 min a 105ºC (la duración total del tratamiento térmico fue de 45 min).
La concentración de p16^{INK4a} se determinó por duplicado en cada alícuota separadamente usando la p16-ELISA. La concentración promedio, incluyendo las barras de error de 4 determinaciones, así como el coeficiente de variación entre 4 determinaciones, se proporcionan en la fig. 3. Se establece 4 U/ml como límite de detección en las presentes circunstancias. Los resultados de este experimento no muestran diferencias visibles en los niveles de p16^{INK4a} medidos dependiendo del tiempo de incubación aplicado para el tratamiento térmico respecto del intervalo de periodos de tiempo aplicado. Esto demuestra que se puede aplicar un amplio intervalo de periodos de tiempo. El aumento en la duración o incluso el aumento en la temperatura de tratamiento térmico de las muestras no interfiere con la determinación del analito usando la p16-ELISA.
Usando una combinación de muestras de varios pacientes, y realizando el tratamiento térmico durante 10 min a 80ºC, 90ºC o 99ºC, se puede demostrar que la estabilización es dependiente de la temperatura de tratamiento térmico. Una alícuota de estas muestras combinadas se dejó sin tratar y se usó como control. Como se muestra en la fig, 4, la combinación de muestras de pacientes es inestable cuando no se somete a tratamiento térmico y queda estabilizada a las temperaturas de tratamiento. La estabilización observada es mejor cuando el tratamiento térmico se realiza a una temperatura superior a 90ºC.
Los resultados de la determinación de los niveles de gCatenina en 3 muestras de pacientes no sometidas a tratamiento térmico y 7 muestras de pacientes sometidas a tratamiento térmico se muestran en las figs. 5 y 6, respectivamente. De los resultados de los inventores se puede ver que la gCatenina queda estabilizada en el tampón PST tras el tratamiento térmico.
Se muestran en las figs. 7 y 8, respectivamente, resultados análogos para la determinación de los niveles de Ep-CAM en 6 muestras de pacientes no sometidas a tratamiento térmico y 7 muestras de pacientes sometidas a tratamiento térmico. Los resultados de los inventores indican que Ep-CAM también queda estabilizada en el tampón PST tras el tratamiento térmico.
Se llevó a cabo la determinación de p16^{INK4a} a partir de alícuotas tomadas de las mismas muestras de pacientes en las que se determinaron Ep-Cam y gCatenina. La determinación en el caso presente se llevó a cabo usando diferentes placas ELISA para cada analito. Sin embargo, es posible generar placas ELISA en las que se pueda llevar a cabo la determinación de dos o más analitos en una única placa.
En resumen, los resultados de los experimentos detallados muestran que una temperatura aplicada durante el tratamiento térmico es bien tolerada por encima de 90ºC durante al menos 5 min en las condiciones dadas. La extensión adicional de la duración del tratamiento hasta 45 min no altera los analitos. Además, los resultados muestran que se puede conseguir la estabilidad de los analitos p16, gCatenina y Ep-CAM para almacenamiento a temperatura ambiente durante al menos 6 días. La estabilización observada no es específica de la proteína, como se observa para 3 proteínas diferentes.
Los resultados también demuestran que todos los analitos ensayados en el experimento se pueden detectar en un inmunoensayo, en el que la primera etapa de incubación se lleva a cabo en presencia de SDS al 0,3% y Triton X100 al 1%.
Puede reseñarse adicionalmente que el procedimiento de tratamiento térmico da como resultado una normalización del procedimiento de extracción de p16^{INK4a} procedente de células presentes en la muestra del paciente. Debido a la presencia del cepillo, que se deja en el vial durante el tratamiento térmico, se consigue una lisis eficaz de las células y una solubilización homogénea de los analitos. El riesgo de pérdida de material dejado en el cepillo se reduce en gran medida.
Ejemplo 1a
Inmunoensayo desnaturalizante de la proteína p16^{INK4a} en muestras procedentes del cérvix uterino
En una variación del protocolo anteriormente mostrado los inventores llevaron a cabo varios experimentos con diferentes tiempos de calentamiento y diferentes composiciones del medio de muestra. Se introdujo un dispositivo de muestreo cervical (Cytobrush) que contenía un hisopo cervical en un tubo de ensayo de 1,5 ml que contenía 700 \mul de tampón de lisis (PBS con Triton X100 al 3%; SDS al 0,5%). Se cortó el mango y el tubo cerrado se sometió a vortización durante 30 s a temperatura ambiente. A continuación, se retiró el cepillo. El tubo de ensayo se calentó durante 30 min a 95ºC. Se pipetearon 100 \mul de lisado por pocillo en una placa de 96 pocillos revestida de anticuerpo (clon E6H4) p16^{INK4a} de captura. La detección se llevó a cabo con anticuerpo biotinilado para detección específica de p16^{INK4a} y conjugado estreptavidina-HRP. Se usó DAB como sustrato. Los resultados se muestran en la fig. 9. Puede verse que p16^{INK4a} se detectó en un ensayo ELISA en presencia de concentraciones de agentes desnaturalizantes (SDS al 0,5% y Triton X100 L 3%). Adicionalmente, hay una correlación entre los valores elevados de p16^{INK4a} (indicadores de una sobreexpresión de p16^{INK4a}) y la presencia de una anormalidad en el tejido ensayado citológicamente confirmada.
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Ejemplo 2 Ejecución de inmunoensayos desnaturalizantes para 16^{INK4a} usando las técnicas ELISA y LIA
Se determinaron los niveles de la proteína p16^{INK4a} en especímenes cervicales que se habían obtenido mediante un dispositivo estandarizado de muestreo cervical. 12 muestras se sometieron a una etapa de calentamiento según la invención desvelada en el presente documento, y se analizaron para los niveles de p16^{INK4a} mediante las técnicas ELISA y LIA en presencia de elevadas concentraciones de detergente.
La preparación y estabilización de la muestra y el ELISA se realizaron como se ha mostrado en el Ejemplo 1.
Ejecutando el LIA
Se revistieron Dynabeads M-280 usando el procedimiento normalizado de revestimiento de Dynal con el clon mtm E6H4 de anticuerpo especifico de p16^{INK4a} y se almacenó a una concentración de 5 mg/ml en tampón de almacenamiento. El clon de anticuerpo mtm D7D7 especifico de p16^{INK4a} se marcó con isoluminol mediante un procedimiento normalizado. El ensayo se ejecutó con el analizador DiaSorin Liaison®. Se añadieron 200 \mul de muestra de la muestra de células lisadas a 100 \mul de solución de trazador (anticuerpo monoclonal D7D7 anti-p16^{INK4a} marcado con isoluminol en PBS 10 mM pH 7,4. 1% BSA) y 20 \mul de partículas magnéticas revestidas de anticuerpo. Tras 10 min de incubación a 37ºC, las partículas se separaron con un imán y se lavaron tres veces con el sistema® Wash/System Liquid de Liaison. Tras la tercera etapa de lavado, las partículas se separaron de nuevo, y se eliminó el sobrenadante. Se generó la señal quimioluminiscente por inyección de dos soluciones de estímulo listas para uso (kit de iniciación de Liaison®). A efectos de calibración del ensayo, se incluyeron en el ensayo diferentes concentraciones de proteína recombinante p16^{INK4a} (0 \mug/ml, 50 \mug/ml, 100 \mug/ml, 200 \mug/ml, 400 \mug/ml. 800 \mug/ml).
Resultados
Los niveles de p16^{INK4a} medidos en los especímenes cervicales se muestran en Unidades/ml.
Los datos mostrados en la fig. 10 muestran únicamente diferencias menores en los niveles de p16^{INK4a} medidos en ambos tipos de ensayo. El experimento prueba de esta manera que las técnicas ELISA y LIA se pueden usar para detectar el analito en presencia del agente desnaturalizante en una concentración (SDS al 0,3%) que permita soportar el estado desnaturalizado de la proteína analito.
Los inventores demostrarían en experimentos adicionales (no se muestran los datos) que tanto el ensayo ELISA como el ensayo LIA pueden ejecutarse igualmente para la detección de varios analitos (incluyendo p16m4a gCatenina, Ep-Cam. HPV E7, CA19-9, MCM-2 y CDC-6) que incluso pueden detectarse de forma reproducible en presencia de concentraciones significativamente mayores de agentes desnaturalizantes. Por ejemplo se podría realizar con éxito un ensayo en presencia de SDS al 1%. Alternativamente, se usó con éxito una concentración de Triton X100 al 3% en un formato ELISA para la detección de analitos. En estos casos, los inventores observarían una mejora en la reproducibilidad de los resultados generados en el análisis de las muestras en el inmunoensayo en caso de que un agente desnaturalizante esté presente durante el ensayo, en comparación con los casos en que se omitieron los agentes desnaturalizantes. Esto indica que los agentes desnaturalizantes en el intervalo de concentraciones detallado en el presente documento son adecuados para potenciar el rendimiento y especialmente la reproducibilidad de los procedimientos de detección inmunoquímica.
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Ejemplo 3 Detección de Neoplasia Cervical Intraepitelial en un formato de Ensayo de flujo lateral
9 hisopos cervicales (las condiciones de lisis fueron similares a las del Ejemplo 1) se sometieron a ensayo PAP convencional y a lisis en una detección posterior basada en flujo lateral de la sobreexpresión del inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina p16^{INK4a} en disoluciones preparadas a partir de las células contenidas en los hisopos. El ensayo de flujo lateral se ejecutó como sigue:
Lisis celular
Las muestras de hisopos cervicales se transfirieron a un vial de recogida de muestra (SCV) contendiendo 5 ml de tampón PST. El vial de recogida de muestra se incubó en el baño de agua durante 15 min a 95ºC. El vial de recogida de muestra se enfrió hasta temperatura ambiente, y 4 ml del sobrenadante se transfirieron sin centrifugación a un tubo nuevo. Según el caso, el sobrenadante se puede almacenar a -20ºC.
Ejecución del ensayo de flujo lateral Aplicacíon del anticuerpo de captura a la membrana
Disoluciones de almacenamiento del clon mtm E6H4 específico de p16^{INK4a} y proteína recombinante p16^{INK4a} se diluyeron en TBS (conteniendo albúmina de suero bovino al 1%) para dar una disolución de manchado lista para uso con una concentración final de anticuerpo de 1 mg/ml y una concentración de p16^{INK4a} recombinante de 10 \mug/ml. Las disoluciones listas para uso se mancharon sobre una membrana de nitrocelulosa a 30 \mul/30 cm. Se unieron mechas Schleicher&Schuell a un extremo de la nitrocelulosa, y las tiras reactivas se secaron durante 15 min a 37ºC. A continuación se dejaron equilibrar a temperatura ambiente y se cortaron en tiras reactivas de 4 mm de anchura.
Incubacíon con las muestras
Se añadieron 2 \mul de anticuerpo específico de p16^{INK4a} (clon mtm D7D7), conjugado con oro coloidal (tamaño de partícula de 40 nm; DO 44) 44) a 100 \mul de cada lisato de muestra (comprendiendo SDS al 0,3% y Triton al 1%), se mezclaron bien y se transfirieron a un pocillo de microvaloración. Las tiras reactivas, revestidas con el anticuerpo de captura clon E6H4 como el anticuerpo de captura y p16^{INK4a} recombinante como línea de control positivo se añadieron al pocillo, se humedeció la muestra y ejecutó hasta finalización. La señal se lee mientras la tira reactiva sigue estando húmeda.
Resultados
Los resultados se muestran en la fig. 11. Es visible que en el formato de ensayo de los inventores las 3 muestras clasificadas como PAP IVa mediante manchado PAP del correspondiente espécimen citológico y representando por tanto células displásicas, produjeron bandas claramente visibles en la zona del anticuerpo de captura manchado. Por el contrario, no se pudieron detectar bandas en 6 muestras residuales, clasificadas como PAP II-IIw mediante manchado PAP y por tanto representando células normales. Las líneas de control positivo indicaron componentes funcionales del ensayo. El control negativo (Co) sin muestra no mostró manchado no específico.
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Ejemplo 4 Análisis inmunoquímica de los niveles de proteína de MCM-5 y MCM-2 en muestras para citología líquida procedentes de orina
Se usaron en el presente ejemplo 20 muestras LBC de células de orina en CytoLyt^{TM}. El análisis de proteína se llevó a cabo en un formato ELISA según se da en el Ejemplo 1 usando pares de anticuerpos comercialmente disponibles dirigidos contra las respectivas proteínas analito. En ambos casos se usaron anticuerpos monoclonales como anticuerpos de captura revestidos en las placas ELISA, y se usaron anticuerpos policlonales como anticuerpos de detección. Los procedimientos experimentales se ejecutaron como se ha indicado en el presente documento. En este ejemplo, las muestras corporales se analizaron para los analitos inmediatamente tras la lisis y el calentamiento de las muestras.
Podría demostrarse que tanto MCM-5 como MCM-2 se pueden detectar fácilmente en lisados LBC procedentes de muestras de orina tras la lisis de dichas muestras en el medio de muestra según se desvela en el Ejemplo 1 y tras calentamiento de la disoluciones de las muestras. Los resultados obtenidos mediante el ensayo inmunoquímico sobre MCM-2 y MCM-5 corresponden bastante bien con los resultados obtenidos mediante el análisis inmunoquímico de la muestras para las proteínas respectivas. En la citología, se usó el manchado inmunocitológico para la proteína MCM-5 como ayuda en la evaluación del diagnóstico.
Los experimentos anteriores demuestran que los procedimientos desvelados en el presente documento son adecuados para la estabilización de un amplio conjunto de analitos para almacenamiento y trasporte y posterior análisis mediante inmunoensayo sin necesidad de añadir conservante. Además, los experimentos demuestran que los inmunoensayos desnaturalizantes se aplican a un amplio conjunto de analitos y pueden ayudar a mejorar la detección inmunoquímica de los mismos.
La presente invención facilita una conservación sencilla y eficaz frente al coste de analitos obtenidos a partir de un cuerpo de un mamífero para análisis posterior mediante análisis inmunoquímico. La invención proporciona un procedimiento que obvia el uso de ingredientes tóxicos y peligrosos que por otra parte se pueden usar para la conservación de los analitos en las muestras. Además, la presente invención permite una mayor precisión y reproducibilidad de la determinación de analitos en muestras y por tanto una mayor fiabilidad de los procedimientos de detección inmunoquímica. Por tanto, la invención contribuye por ejemplo a procedimientos inmunoquímicos mejorados que pueden contribuir a resultados de ensayos que apoyen la evaluación del diagnóstico de enfermedades en seres humanos.

Claims (13)

1. Un procedimiento para ejecutar un inmunoensayo desnaturalizante de uno o más analitos en disolución comprendiendo las etapas de
i) solubilizar una muestra corporal obtenida de un sujeto mamífero en un medio de muestra que comprende SDS de 0,1% a 1% como agente desnaturalizante;
ii) calentar posteriormente el medio de muestra que contiene dicha muestra hasta una temperatura superior a 70ºC durante un periodo de tiempo;
iii) almacenar la muestra en el medio de muestra, y
iv) ejecutar un inmunoensayo sobre dicha muestra en el medio de muestra, en el que la etapa del antígeno de captura se realiza directamente a partir de dicho medio de muestra que contiene el analito y el SDS 0,1%-1%.
2. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que la temperatura superior a 70ºC es una temperatura entre 90ºC y 110ºC.
3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que la temperatura entre 90ºC y 110ºC es una temperatura entre 95ºC y 99ºC.
4. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el periodo de tiempo es un periodo de tiempo superior a 5 minutos.
5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el periodo de tiempo superior a 5 minutos es un periodo de tiempo entre 7 minutos y 30 minutos.
6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que el periodo de tiempo entre 7 minutos y 30 minutos es un periodo de tiempo entre 10 minutos y 27 minutos.
7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que el periodo de tiempo entre 10 minutos y 27 minutos es un periodo de tiempo entre 20 y 25 minutos.
8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la etapa de calentamiento se ejecuta en un dispositivo de calentamiento seleccionado entre el grupo que comprende un baño de agua, una olla a presión, un horno de microondas, un dispositivo de calentamiento por UV y un bloque de calefacción.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la muestra corporal se selecciona entre un grupo que comprende secreciones, hisopos, lavados, fluidos corporales, semen, muestras celulares y tisulares, muestras para citología líquida, sangre, mocos cervicales, esputo, orina, heces, líquido cerebroespinal, bilis, secreciones gastrointestinales, linfa, médula ósea, aspirados y biopsias de órganos tales como biopsias de aguja o sacabocados y aspirados con aguja (fina).
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que uno o más analitos se seleccionan entre un grupo que comprende p13.5, p14, p15, p16 (también denominado como p16^{INK4a}), p19, p21, p27, p53, pRb, p14ARF, ciclina A, ciclina B, ciclina E, MDM-2, CDC2, Id1, osteopontina, GRP, dipeptidasa renal, her2/neu, receptor de TGFbII, Citoqueratinas, (por ejemplo citoqueratina 8, citoqueratina 10, citoqueratina 18), antígenos de mucina (MUC1, MUC2, Tn, STn), EpCAM y gCatenina, receptor de concanavalina A, GalNacTransferasa, oligosacariltransferasa, lectinas (ConA, WGA, PNA, UEA I. DBA, SBA, SNA), placofilina, vimentina, antígenos de CD (por ejemplo CD3, CD16, CD18, CD4, CD8, CD56, CD19, CD20), marcadores asociados con HPV por ejemplo derivados de los genes de HPV L1, L2, E1, E2. E4, E5, E6 o E7, CDC6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, proteína quinasa CDC7, Dbf4, proteína fosfatasa CDC14. CDC45 y MCM10, Ki67, Ki-S2, PCNA, helicasa, una topoisomerasa, Topo2alpha, factores de transcripción, miembros de la familia E2F, Bm-3a, Bm-3b o POLD.
11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el almacenamiento se lleva a cabo durante hasta 14 días.
12. El inmunoensayo desnaturalizante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que al menos una detección inmunoquímica es un inmunoensayo seleccionado entre un grupo que comprende inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos, EIA, ELISA, RIA, ensayos de flujo lateral, ensayos de flujo pistón, tiras inmunocromatográficas y ensayos de aglutinación en látex.
13. El inmunoensayo desnaturalizante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que al menos un agente desnaturalizante está presente en una concentración del 0,3% o superior en la disolución de la muestra aplicada al ensayo.
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