ES2342535T3 - Procedimientol para detectar afecciones de relevancia medica en una muestra de lbc solubilizada. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para evaluar el diagnóstico de un tumor seleccionado del grupo que consiste en tumores del tracto anogenital, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del tracto respiratorio y tumores del sistema urinario a partir de muestras solubilizadas de citología en liquido (CBC) que consiste en las etapas de a. detectar la presencia o ausencia y/o el nivel de un polipéptido marcador seleccionado del grupo de p16INK4a, claudina, Ki67, KiS1, PCNA MCM-2, MCM-5, CDC-6, Her-2/Neu, ciclina E y un polipéptido del HPV derivado de un gen del HPV seleccionado del grupo que consiste en HPV L1, HPV L2, HPV El, HPV E2, HPV E4, HPV E5, HPV E6 y HPV E7; b. comparar la presencia o ausencia y/o el nivel de dicho polipéptido marcador con la presencia o ausencia y/o el nivel conocido como característico de una muestra corporal sana no patológica; y c. evaluar el diagnóstico del tumor basado en la presencia o ausencia y/o el nivel de dicho polipéptido marcador en las células contenidas en la muestra de LBC comparado con una muestra corporal sana no patológica.
Description
Procedimiento para detectar afecciones de
relevancia médica en una muestra de LBC solubilizada.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para detectar afecciones de relevancia médica en
muestras de LBC solubilizadas. Dicho procedimiento no se basa en
parámetros morfológicos y usa análisis bioquímicos no basados en
células para determinar la presencia o ausencia y/o el nivel de
molécula marcadora en la muestra de LBC solubilizada. La detección
de moléculas marcadoras se lleva a cabo por detección de la
presencia o ausencia y/o el nivel de determinadas proteínas o
fragmentos de las mismas.
El diagnóstico de un gran número de afecciones
de relevancia médica se lleva a cabo hoy en día usando marcadores
moleculares como herramientas. Las herramientas moleculares en
general se usan como un aspecto en un examen complejo, que tienen en
cuenta una serie de parámetros diferentes que caracterizan las
muestras que se van a
examinar.
examinar.
En los análisis de relevancia médica es común el
uso del examen morfológico de muestras por medios citológicos.
Dichos procedimientos basados en la caracterización morfológica de
las muestras basadas en células, se pueden aplicar, por ejemplo, en
el análisis de muestras clínicas tales como fluidos corporales,
sangre, resecciones quirúrgicas, secreciones, extensiones o
lavados.
Las aplicaciones actuales de citología en el
diagnóstico usan cada vez más procedimientos de citología en liquido
(en lo sucesivo abreviado como LBC, por sus siglas en inglés
liquid based cytology). Esto se debe al hecho de que la LBC
puede proporcionar propiedades de la morfología mejoradas de la
preparación citológica y que los contaminantes tales como, p. ej.,
moco o similares, se pueden eliminar por el procedimiento de LBC.
Además, la LBC permite el almacenamiento de material de muestra sin
procesar que después se puede someter a diferentes tipos de exámenes
citológicos. En la citología convencional, el material de muestra se
procesa hasta una muestra de ensayo de citología convencional. El
sobrante no se podía conservar. Por lo tanto, solo se podía aplicar
un análisis a las muestras convencionales.
Una aplicación importante de la LBC se refiere
al amplio cribado de población para el cáncer de cuello de útero.
Sin embargo, se pueden aplicar procedimientos similares para otras
entidades de cáncer y las respectivas etapas precursoras tales como
p. ej. cánceres del sistema urinario, del tracto respiratorio y
otros.
Es una práctica habitual el uso de muestras de
LBC para preparar una muestra de citología monocapa o en capa fina.
Esta muestra se somete a un análisis basado en célula. En
determinadas circunstancias, se aplican reacciones
inmunocitoquímicas a las muestras de citología. Sin embargo, en la
práctica común, las muestras de LBC se usan para el análisis basado
en células de las muestras. Esto también puede verse por el hecho de
que los argumentos para usar la LBC señalan las ventajas relativas a
la morfología celular y la eliminación de los contaminantes.
En el cribado del cáncer de cuello de útero, por
ejemplo, se usan muestras de LBC preparadas a partir de extensiones
para detectar lesiones neoplásicas del cuello de útero. En el
procedimiento de cribado, deben distinguirse lesiones de diferente
origen. Las causas de lesiones pueden ser, por ejemplo,
inflamaciones (debidas a agentes infecciosos o daño físico o
químico) o cambios preneoplásicos o neoplásicos. En los exámenes
morfológicos es complejo distinguir las lesiones de diferentes
características. Así, para el examen de frotis convencionales, así
como de muestras en capa fina preparadas a partir de muestras de
LBC, los citólogos y patólogos deben estar especialmente entrenados,
e incluso los analizadores con experiencia tienen una alta variación
entre observadores y en un mismo observador en la evaluación de un
diagnóstico basado en muestras citológicas. En general, el resultado
del examen se basa en la interpretación subjetiva de los criterios
de diagnóstico del patólogo/citólogo que lo examina. Como resultado,
la tasa de resultados positivos falsos y negativos falsos en los
ensayos de cribado sigue siendo muy insatisfactoria.
Por lo tanto, en muchos casos estos
procedimientos de examen citológico se respaldan mediante el uso de
marcadores moleculares. Dichos marcadores se usan a menudo en
reacciones de tinción inmunocitoquímica, o en el curso de reacciones
de hibridación in situ. En las combinaciones de la técnica
anterior de exámenes morfológicos y reacciones de tinción
inmunocitoquímica basadas en moléculas marcadores, las
características de diferentes estados de relevancia médica de
tejidos o células, pueden conducir a resultados mejorados. El examen
morfológico sigue siendo laborioso y requiere tiempo y por lo tanto
es caro, incluso cuando está respaldado por los procedimientos
moleculares, que hacen que los resultados sean más fiables. P. ej.,
el documento WO0208764 describe la detección basada en proteínas y
péptidos de moléculas marcadoras tales como HPV E4, la proteína MCM,
y otras en aplicaciones basadas en células incluyendo preparaciones
histológicas y citológicas. Para reducir el coste de los programas
de diagnóstico que usan exámenes citológicos, debería realizarse una
preselección de las muestras que se van a examinar por
procedimientos citológicos. Esto bajaría el coste y reduciría la
sobrecarga del examen citológico y así contribuiría a la precisión
del diagnóstico basado en citología.
En la técnica describen procedimientos para
detectar el cáncer de cuello de útero, basados en muestras
cervicouterinas solubilizadas, Brule, van den, y col.; J. Clin.
Microbiol:, Vol 28/12, 1990, páginas 2739-2743,
WO03/057914 y el documento WO99/29890. Brule y col. describen un
procedimiento para la detección basada en la PCR de ácidos nucleicos
del HPV en raspados cervicouterinos. El documento WO99/29890
describe un procedimiento para detectar el ARNm del HPV en muestras
cervicouterinas y describe la posibilidad de usar muestras de LBC
como un punto de partida para dichos exámenes. El documento
WO03/057914 también describe un procedimiento basado en ARNm para
detectar ácidos nucleicos del HPV en muestras cervicouterinas. Todos
los documentos describen el uso de los procedimientos en el curso
del diagnóstico del cáncer de cuello de útero. Sin embargo, los tres
documentos usan la detección basada en ácidos nucleicos de los
productos de expresión del HPV como marcador molecular y no indican
ningún uso de moléculas marcadoras péptidos o proteínas en
procedimientos de detección similares.
Un procedimiento para detectar los ácidos
nucleicos del HPV de muestras de LBC se describe en el documento
WO99/29890 de Digene Corp. Este procedimiento usa muestras de LBC
como base para el análisis. La detección de ácidos nucleicos del HPV
se lleva a cabo después de la lisis de las células contenidas en las
muestras de LBC. En este procedimiento, no se lleva a cabo la
normalización de la cantidad de la muestra de LBC que se va a usar
en la detección bioquímica no basada en célula del ácido nucleico
del HPV, con respecto a la información obtenida de la muestra
citológica preparada a partir de la misma muestra de LBC. Por lo
tanto, el procedimiento descrito por Digene está restringido a
simples mediciones cualitativas. Cualquier procedimiento
cuantitativo o incluso semicuantitativo bioquímico no basado en
células, necesita información sobre la composición de las muestras,
que se puede obtener de los marcadores bioquímicos o del análisis
microscópico o de citometría de flujo de la muestra.
En el documento EP1388734 se describe un
procedimiento no basado en células para detectar enfermedades. Este
procedimiento usa una etapa de normalización basada en una molécula
marcadora de normalización para sustituir la información que se
podría obtener de las muestras citológicas y por lo tanto permitir
la evaluación del diagnóstico. Por lo tanto, este procedimiento se
basa en la detección simultánea de una molécula marcadora para una
enfermedad, junto con un marcador de normalización de cada muestra.
En este documento no se sugiere un procedimiento de evaluación de
enfermedades a partir de muestras corporales solubilizadas basado
solo en marcadores de la enfermedad, sin normalización respecto a un
segundo marcador bioquímico.
En la presente invención, el uso de muestras de
LBC para evaluar el diagnóstico, permite una forma precisa y
comparable de proporcionar información citológica para el ensayo
bioquímico no basado en células. El uso de la normalización
bioquímica con respecto a marcadores indicativos de la presencia o
ausencia de células o tipos de células se puede omitir. La ventaja
de usar muestras de LBC en este sentido, es que la información
citológica basada en célula está directamente relacionada con la
muestra de LBC homogénea, y por lo -tanto proporciona información
precisa valiosa para usar en la evaluación de los resultados del
ensayo bioquímico no basado en células.
Por otra parte, se describe en varias
publicaciones un procedimiento para detectar marcadores moleculares
en el nivel de proteína o ácido nucleico de muestras solubilizadas.
Sin embargo, con respecto a esto, no se hace ninguna conexión con el
uso de muestras de LBC como una fuente de la muestra de ensayo. En
general, los procedimientos de LBC se aplican en la técnica para
permitir una mejor evaluación morfológica de las muestras de
citología. Por lo tanto, el campo de aplicación de las muestras de
LBC está indicado solo para citología. Basándose en la descripción,
en la técnica anterior no se describe la preparación de una muestra
de LBC para la posterior solubilización de la muestra para el ensayo
bioquímico. Además de la descripción de las ventajas de los
procedimientos de LBC, enseña la aplicación de muestras de LBC en
cualquier procedimiento que no esté basado en la evaluación
morfológica celular de la muestra. De acuerdo con los
descubrimientos de los autores de la invención, el uso de muestras
de LBC como una fuente para la determinación bioquímica no basada en
células de los niveles de proteína en muestras solubilizadas,
proporciona la ventaja de que los resultados se pueden comparar
directamente con una muestra citológica. En este sentido el análisis
bioquímico basado en proteínas puede servir, p. ej., como un ensayo
previo o para proporcionar información adicional o incluso para
confirmar un resultado citológico equivocado. En realizaciones
adicionales, la información obtenida del ensayo bioquímico no basado
en células, puede ser para el diseño de los procedimientos
citológicos que se van a aplicar.
Un procedimiento para evaluar el diagnóstico de
afecciones de relevancia médica basado en muestras de LBC
solubilizadas, como proporciona la presente invención, podría
servir, por ejemplo, como preselección de muestras que se van a
analizar mediante citología.
La comprensión de los autores de la invención de
que el uso de muestras de LBC como fuente de material de muestra
para el desarrollo de procedimientos de diagnóstico para la
evaluación bioquímica no basada en células del diagnóstico de
afecciones de relevancia médica, es otro aspecto de la presente
invención. En la técnica, las muestras de LBC se usan para el
desarrollo de formatos de ensayo basados en células. Sin embargo, la
lisis de muestras de una forma como se describe en el presente
documento, permite a los autores de la invención basar el desarrollo
de los procedimientos bioquímicos en material de muestra que es
adecuado para proporcionar información sobre el estado patológico de
los pacientes, de otros procedimientos de diagnóstico en el mismo
material de muestra. El procedimiento de desarrollo descrito en el
presente documento tiene, por lo tanto, un gran valor para obtener
kits y dispositivos de diagnóstico in vitro eficaces y
fiables. El procedimiento para desarrollar kits y dispositivos de
diagnóstico in vitro descrito en el presente documento, logra
que sean comparables los resultados generados por el análisis
bioquímico no basado en células con los resultados evaluados por
citología mediante una normalización. Esta normalización de la
muestra para aplicar en el formato de ensayo bioquímico se realiza
con respecto a la información sobre la muestra de LBC que se puede
obtener de la muestra citológica preparada a partir de la muestra de
LBC. Dicha información comprende, p. ej., la celularidad de la
muestra de LBC, información con respecto al volumen de la muestra de
LBC, información con respecto a la masa de la muestra de LBC o con
respecto a parámetros accesibles solo por la generación de una
muestra en capa fina a partir de la muestra de LBC. Con respecto a
esto, los autores de la invención proporcionan mediante los
procedimientos reivindicados en el presente documento, un
procedimiento fiable para el desarrollo de kits y dispositivos de
diagnóstico in vitro, basados en muestras de LBC.
La presente invención se basa en los
descubrimientos de los autores de la invención ilustrados en los
ejemplos proporcionados en el presente documento, de que la
evaluación del diagnóstico de afecciones que normalmente puede
hacerse y/o está respaldado (en sistemas de diagnóstico basados en
células) por procedimientos de examen citológicos, se puede realizar
en disoluciones de muestras de LBC solubilizadas por un
procedimiento que comprende las etapas de detectar el nivel de uno o
más marcadores asociados con la afección que se va a diagnosticar, y
diagnosticar la presencia o ausencia de una afección en la
muestra.
El procedimiento de acuerdo con la presente
invención, se puede aplicar, por ejemplo, como un ensayo de cribado
primario en casos en los que normalmente se realiza un examen
citológico. Mediante el uso de la presente invención, se puede
discriminar si la afección que se va a diagnosticar puede estar
presente en la muestra. Si el diagnóstico basado en disolución da un
resultado negativo con respecto a una afección particular,
posiblemente se puede omitir el examen posterior. En el caso de
resultados positivos, se puede continuar con la determinación por
procedimientos de aplicación clásica. Así, se puede evitar el examen
microscópico y de otro tipo, caros y que requieren tiempo, mediante
un procedimiento de ensayo bioquímico no basado en células, rápido y
barato.
Un aspecto de la presente invención es un
procedimiento para mejorar el diagnóstico de afecciones de
relevancia médica, en el que la evaluación del diagnóstico se lleva
a cabo usando disoluciones de muestras de LBC solubilizadas. El
procedimiento para el diagnóstico descrito de acuerdo con la
presente invención, no se basa en parámetros morfológicos sino que
permite un diagnóstico mediante análisis bioquímico. El
procedimiento de evaluación del diagnóstico de afecciones de
relevancia médica de acuerdo con la presente invención usa el
análisis bioquímico no basado en células, de la presencia o ausencia
y/o del nivel de moléculas marcadoras en muestras corporales
solubilizadas, en el que la muestra corporal es una muestra de LBC,
y en el que la detección de moléculas marcadoras se lleva a cabo por
detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de proteínas o
fragmentos de las mismas en dichas muestras solubilizadas. Las
moléculas marcadoras que se pueden aplicar para este procedimiento y
las afecciones de relevancia médica para las que se puede aplicar el
procedimiento se especifican en la reivindicación 1.
Las muestras destinadas a los procedimientos de
citología en liquido (en lo sucesivo abreviado como muestras de LBC)
se solubilizan en un medio de lisis adecuado y se usan para
procedimientos de diagnóstico in vitro, para detectar
afecciones de relevancia médica a partir de las muestras corporales
solubilizadas, basándose en análisis bioquímicos no basados en
células.
Una ventaja del procedimiento descrito en el
presente documento es que la misma muestra, en la que se evalúa el
diagnóstico para un individuo, se puede usar para la evaluación del
resultado bioquímico. Por lo tanto, se asegura que se puede comparar
el resultado bioquímico con el diagnóstico.
la fig. 1 muestra los valores de DO obtenidos en
un ensayo ELISA de detección del nivel de p16^{INK4a} en muestras
cervicouterinas solubilizadas; para los detalles experimentales
véase el ejemplo 1.
Basándose en los descubrimientos de los autores
de la invención, se lleva a cabo un procedimiento para la evaluación
del diagnóstico de afecciones de relevancia médica, mediante
análisis bioquímico no basado en células como se define en las
reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con la invención, los procedimientos
de examen citológico se pueden respaldar o incluso sustituir por el
uso de marcadores moleculares. Dichos marcadores se pueden usar, p.
ej., en reacciones de tinción inmunocitoquímica o en el curso de
reacciones de hibridación in situ. Las combinaciones de los
exámenes morfológicos y las reacciones de tinción inmunocitoquímica
basadas en moléculas marcadoras, características de afecciones de
relevancia médica tales como, p. ej., cánceres, puede conducir a
resultados mejores. El examen morfológico sigue siendo laborioso y
requiere tiempo y por lo tanto es caro, incluso cuando está
respaldado por procedimientos moleculares que hacen que los
resultados sean más fiables. Además, el diagnóstico a un nivel
morfológico celular, incluso cuando está respaldado por parámetros
moleculares, está sometido a la percepción individual de la
morfología por los examinadores individuales. Por lo tanto, el
diagnóstico depende de la persona que lleva a cabo los exámenes.
De acuerdo con la presente invención, el uso de
muestras de LBC para la evaluación del diagnóstico puede
proporcionar, por ejemplo, un modo preciso y comparable de
suministrar información citológica para el ensayo bioquímico no
basado en células. Esto se puede lograr mediante el uso de la
normalización de la muestra con respecto a la información que se
puede obtener de una muestra citológica preparada a partir de la
misma muestra de LBC. La normalización bioquímica con respecto a los
marcadores indicativos de la presencia o ausencia de células o tipos
de células se puede omitir en dichos procedimientos. La ventaja de
usar muestras de LBC en este sentido, es que la información
citológica basada en células está directamente relacionada con la
muestra de LBC homogénea y por lo tanto proporciona información
precisa valiosa para usar en la evaluación de los resultados de
ensayo bioquímicos no basados en células.
En la técnica, el campo de aplicación de
muestras de LBC es permitir la evaluación morfológica mejorada de
muestras de citología. Por lo tanto, clásicamente el campo de
aplicación de las muestras de LBC está indicado solo para citología.
De acuerdo con la presente invención, el uso de muestras de LBC como
una fuente para la determinación bioquímica no basada en células de
niveles de proteínas en muestras solubilizadas, proporciona la
oportunidad de que los resultados del ensayo bioquímico no basado en
células se pueda comparar directamente con una muestra citológica.
En este sentido, el análisis bioquímico basado en proteínas puede
servir, p. ej., como ensayo previo o para proporcionar más
información o incluso confirmar un resultado citológico equivoco. En
realizaciones adicionales, la información obtenida del ensayo
bioquímico no basado en células, puede ser para el diseño de los
procedimientos citológicos que se van a aplicar.
Mediante la presente invención, se pueden
diagnosticar afecciones de relevancia médica tales como por ejemplo,
trastornos neoplásicos. En particular, se pueden detectar
precozmente las fases precursoras de los cánceres. También hay que
destacar que se puede hacer una diferenciación con respecto a
cambios inflamatorios benignos o metaplásicos de trastornos
neoplásicos. Otra característica es que los resultados obtenidos por
un procedimiento de acuerdo con la invención no se basan en la
evaluación subjetiva, de modo que se pueden reducir o evitar, p.
ej., los resultados negativos falsos y positivos falsos de un ensayo
Pap u otras preparaciones citológicas. Además, la presente invención
se caracteriza por su manejo rápido y sencillo, de modo que se puede
usar para mediciones de cribado amplias, en particular también en
países del tercer mundo. Por lo tanto, la presente invención
representa una contribución importante a los diagnósticos actuales
de afecciones de relevancia médica.
Los autores de la invención pudieron mostrar que
los marcadores moleculares se pueden usar como herramientas de
diagnóstico sin el respaldo adicional de exámenes morfológicos
basados en células. Los procedimientos para el diagnóstico de
afecciones de relevancia médica solo en un nivel molecular no basado
en células, sin el respaldo de la información basada en células, se
pueden aplicar a muestras solubilizadas tales como, p. ej., muestras
de LBC. Los análisis bioquímicos pueden servir como ensayo único o
como un ensayo adjunto o conjunto con un examen citológico de la
muestra.
El procedimiento de evaluación de diagnóstico de
acuerdo con la presente invención se lleva a cabo usando muestras de
LBC como material bruto. El procedimiento de acuerdo con la presente
invención para el análisis de muestras de LBC solubilizadas se puede
aplicar como un ensayo adjunto o conjunto con un procedimiento de
análisis citológico establecido o como un único ensayo.
Las muestras de LBC, como se usa en el contexto
de la presente invención, se entiende que son muestras corporales
que comprenden cualquier muestra celular que está conservada en un
medio de transporte, almacenamiento, recolección de muestra
estándar, conocido para los expertos en la materia, tales como, p.
ej., medios de conservación disponibles en el comercio (disolución
de formalina, "PreservCyt" o "CytoLyt" de Cytyc,
"Universal Collection Médium" de Digene, "Cytorich" de
Tripath Imaging etc.). Por consiguiente, las muestras de LBC
comprenden muestras celulares en cualquier medio de conservación
celular adecuado que puede contener una mezcla de uno o más
seleccionados del grupo que comprende alcoholes, aldehídos, cetonas,
ácidos, iones metálicos o sublimados, éteres, etc. para la
conservación de componentes celulares. Los alcoholes incluyen
metanol, etanol (n- o i-)propanol, (n- o t-)butanol o alcoholes
superiores ramificados o no ramificados. Los aldehídos incluyen
formaldehído, acetaldehído, glutaraldehído, etc. Se pueden usar
cetonas tales como acetona. Los ácidos para usar en medios de
muestra estándar incluyen ácidos orgánicos (ácido acético, ácido
tricloroacético, ácido salicílico, ácido pícrico) o ácidos
inorgánicos tales como, p. ej. ácido crómico. Las disoluciones de
muestra estándar pueden comprender metales tales como plata, cobre,
cromo, mercurio, osmio, uranio. Las disoluciones de sales tales como
acetato de uranilo, bicromato de potasio, sulfato amónico, etc.
pueden ser componentes de los medios de conservación.
Las muestras de LBC pueden ser muestras de
cualquier tipo de células tomadas para diferentes propósitos de
diagnóstico. Actualmente, las muestras de LBC con respecto al
diagnóstico en la asistencia sanitaria humana, se preparan a partir
de cualquier región del cuerpo en la que estén indicados
procedimientos de ensayo citológicos y/o microbiológicos o parezcan
razonables. Se cree que para una variedad de muestras citológicas,
las muestras de LBC proporcionan un modo que minimiza la pérdida de
células y conserva el detalle morfológico. Por lo tanto, las
muestras de LBC de acuerdo con la presente invención, comprenden
muestras obtenidas como aspirados con aguja fina. Los aspirados con
aguja fina pueden comprender muestras de diferentes fuentes tales
como, p. ej., de pecho, tiroides (p. ej., de nódulos), riñones,
páncreas, próstata, pulmón, nódulos linfáticos, pleura, masas del
cuello, ovarios, sinovia, masas tumorales, etc. Las muestras de LBC
además se pueden preparar usando fluidos corporales. Los fluidos
corporales adecuados comprenden una amplia variedad de fluidos que
se pueden obtener del cuerpo humano o animal, comprendiendo pero sin
limitar, p. ej., ascitis, liquido cefalorraquídeo, pus o efusiones.
Las efusiones donde quiera que aparezcan en el cuerpo se pueden
someter a LBC. Algunos ejemplos de efusiones son efusiones
pericárdica, pleural, sinovial y abdominal. Los fluidos corporales a
los que se puede aplicar la LBC comprenden además, p. ej., los
fluidos presentes en algunos tumores o quistes tales como, p. ej.,
quistes de pecho, quistes ováricos u otros. Las muestras que se
pueden obtener en forma liquida del cuerpo comprenden además,
muestras de moco tales como, p. ej., esputo. La LBC se aplica
ampliamente a cualquier tipo de muestra de citología exfoliativa.
Dichas muestras de citología exfoliativa se pueden obtener por
diferentes procedimientos tales como, p. ej., cualquier clase de
extensiones, cepillado, raspado, frotis, etc. También deben
entenderse como muestras de citología exfoliativa las irrigaciones,
lavados etc. de cualquier región del cuerpo. Las irrigaciones y los
lavados se pueden obtener de una amplia variedad de regiones del
cuerpo incluyendo, pero sin limitar, epitelios mucosos, la piel,
cualquier epitelio interior o exterior del cuerpo o similares. Los
epitelios mucosos pueden ser, p. ej., los epitelios del tracto
gastrointestinal, del sistema urinario, del tracto anogenital, del
tracto respiratorio, del recto, la uretra, el cuello de útero, la
vagina, la vulva, la cavidad oral, la cavidad endometrial, etc. Toda
la variedad de muestras citológicas exfoliativas se puede someter a
procedimientos de LBC.
Para las muestras de LBC usadas en el
procedimiento de acuerdo con la presente invención, puede haber o no
información relacionada con procedimientos citológicos. Dicha
información comprende, p. ej., el volumen de una muestra de LBC
necesaria para preparar una preparación en capa fina adecuada,
información sobre la celularidad o contenido de células de la
muestra de LBC, información sobre la idoneidad de la muestra de LBC
o del procedimiento de toma de muestra subyacente, información sobre
la información del diagnóstico evaluada basándose en una muestra
citológica, información sobre la enfermedad y diagnóstico del
paciente etc.
En un procedimiento de acuerdo con la presente
invención, la muestra de LBC obtenida se usa en su totalidad o solo
en partes. En algunas realizaciones de la invención, se usa el
volumen total de la muestra de LBC. En otra realización, se usa el
número total de células contenidas en la muestra. En otra
realización más, solo se usa una fracción del volumen total o el
número toral de células contenido en la muestra de LBC original.
En el procedimiento, se puede aplicar una
normalización de la muestra de LBC (esto no es parte de la invención
reivindicada). En determinadas realizaciones, se puede aplicar una
normalización de la muestra de LBC para asegurar la presencia de una
cantidad comparable de células en los procedimientos de análisis
bioquímico no basado en células realizados usando la muestra de LBC
solubilizada. Esto se puede lograr, p. ej., normalizando el volumen
de la muestra de LBC con respecto al volumen de dicha muestra
necesario para preparar una muestra adecuada de capa fina. (La
preparación de la muestra de capa fina se puede realizar por
cualquier procedimiento adecuado conocido para los expertos en la
materia, tal como, p. ej., usando centrifugación, un procesador
ThinPrep^{TM} o similar). En este caso, el volumen de la fracción
de la muestra de LBC para usar en el procedimiento de análisis
bioquímico no basado en células de acuerdo con la presente
invención, puede ser variable para las diferentes muestras. En
determinadas realizaciones adicionales, la normalización de la
muestra de LBC se lleva a cabo con respecto al volumen de la muestra
sometido al procedimiento de ensayo. En este caso, la cantidad de
células presente en la fracción de la muestra de LBC para usar en el
procedimiento de desarrollo de acuerdo con la presente invención,
puede ser variable.
La expresión "muestra corporal" tal como se
usa en el presente documento, comprende cualquier muestra corporal
de cualquier tipo y naturaleza. Las muestra corporales, como se usa
en el contexto de la presente invención, comprenden la expresión
"muestra de LBC" como una realización especial de una muestra
corporal. Los ejemplos de dichas muestras corporales son
secreciones, extensiones, lavados, fluidos corporales, semen,
muestras de células y tejidos, sangre, frotis, esputo, orina,
materia fecal, líquido cefalorraquídeo (abreviado denominado como
"LCR" en el presente documento), bilis, secreciones
gastrointestinales, linfa, médula ósea, aspirados y biopsias de
órganos tales como biopsias con aguja o punción y aspirados con
aguja (fina). En particular, los frotis, extensiones y biopsias
están indicados cuando se refiere a la detección de cánceres
anogenitales, p. ej., cánceres de cuello de útero. El término
biopsias tal como se usa a lo largo de este texto comprenderá todos
los tipos de biopsias que conoce el experto en la materia. Por lo
tanto, las biopsias como se usan en el contexto de la presente
invención pueden comprender, p. ej., muestras de resección de
tumores, muestras de tejidos preparadas por medios endoscópicos o
biopsias con aguja o punción de órganos. Las biopsias comprenden
muestras obtenidas por diferentes procedimientos tales como las
biopsias de cuchillo frió, biopsias por LEEP (procedimiento de
escisión electroquirúrgica con asa), etc.
Además, se pueden usar muestras corporales que
se han sometido a condiciones de lisis celular inmediatamente
después de obtener las muestras, en los procedimientos descritos en
el presente documento. Los autores de la invención han encontrado
una serie de modos consistentes, rápidos y fáciles para preservar
las propiedades moleculares de las muestras, en los que se pierde la
información morfológica de las muestras. Las muestras se pueden
preparar, p. ej., en una forma reproducible y fácil de almacenar y
de transportar, solubilizando los componentes celulares de la
muestra bruta en un medio de lisis adecuado inmediatamente después o
incluso durante la obtención de la muestra. Los fluidos corporales
se pueden transferir directamente del cuerpo de un individuo a un
medio que contiene detergentes y sustancias conservantes adecuadas.
Además, las muestras de tejido se pueden transferir inmediatamente a
condiciones de lisis desnaturalizantes (opcionalmente soportado por
fuerzas físicas) y así conservarlas. Usando los ingredientes
adecuados en el medio de lisis, se pueden conservar los componentes
moleculares de la muestra original y no se produce degradación. La
degradación por actividades enzimáticas se puede minimizar, por
ejemplo, por el uso de inhibidores enzimáticos. Por lo tanto, una
disolución de las muestras de ensayo en dicho medio de lisis puede
representar las propiedades moleculares de una muestra de ensayo en
el momento de la solubilización.
En general, el medio de lisis incluido en un kit
de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier disolvente
adecuado conocido para los expertos en la materia. El medio de lisis
para usar en el kit puede ser, por ejemplo, disoluciones orgánicas o
acuosas de agentes caotrópicos tales como p. ej., urea, GuaSCN,
formamida, de detergentes tales como detergentes aniónicos (p. ej.,
SDS, N-lauril-sarcosina,
desoxicolato sódico,
alquil-aril-sulfonatos, sulfatos de
alcoholes (grasos) de cadena larga, sulfatos y sulfonatos de
olefina, sulfatos y sulfonatos de alfa-olefinas,
monoglicéridos sulfatados, éteres sulfatados, sulfosuccinatos,
alcano-sulfonatos, ésteres de fosfato, isetionatos
de alquilo, ésteres de sacarosa), detergentes catiónicos (p. ej.,
cloruro de trimetilamonio), detergentes no iónicos (p. ej., Tween
20, Nonidet P-40, Tritón X-100,
NP-40, Igepal CA-630,
N-octil-glucósido) o detergentes
anfóteros (p. ej., CHAPS,
3-dodecil-dimetilamonio-propano-1-sulfonato,
óxido de laurildimetilamina) y/o hidróxidos alcalinos tales como, p.
ej., NaOH o KOH. En determinadas realizaciones, en las que se puede
lograr la lisis de las células sin el uso de detergentes, se pueden
usar como disolventes disoluciones hiper o hipotónicas o tampones, o
simplemente agua o un liquido orgánico. Cualquier liquido que sea
adecuado para solubilizar componentes celulares de las muestras
corporales en total o en partes, se puede considerar como un medio
de lisis, tal como se usa en el presente documento. Por lo tanto, el
medio de lisis, tal como se usa en el presente documento, no es
necesario que contengan sustancias tamponantes o que tengan
capacidad de tamponamiento.
En general, se puede usar cualquier liquido
adecuado como un disolvente en el medio de lisis de la presente
invención. El liquido puede ser orgánico o inorgánico y puede ser un
liquido puro, una mezcla de líquidos o una disolución de sustancias
en el liquido, y puede contener sustancias adicionales para
potenciar las propiedades del disolvente. En determinadas
realizaciones en las que la lisis de las células se puede lograr sin
el uso de detergentes, se pueden usar como disolventes disoluciones
hiper o hipotónicas o tampones o simplemente agua o un liquido
orgánico. Cualquier liquido que sea adecuado para solubilizar los
componentes celulares de las muestras corporales en total o en
partes se puede considerar como un medio de lisis, tal como se usa
en el presente documento. Por lo tanto, los medios de lisis, tal
como se usa en el presente documento, no es necesario que contengan
sustancias tamponantes o que tengan capacidad de tamponamiento. Sin
embargo, en determinadas realizaciones de la invención, el medio de
lisis puede tener capacidad de tamponamiento y puede contener
sustancias tamponantes.
En una realización, el medio de lisis se diseña
de modo que se solubilizan las células, restos celulares, ácidos
nucleicos, polipéptidos, lípidos y otras biomoléculas potencialmente
presentes en la muestra bruta. En realizaciones adicionales de la
presente invención, el disolvente se puede diseñar para asegurar la
solubilización diferencial de componentes específicos de la muestra
corporal, dejando los otros componentes sin solubilizar.
El medio de lisis para solubilizar la muestra
corporal de acuerdo con la presente invención puede comprender
además uno o más agentes que previenen la degradación de componentes
en las muestras brutas. Dichos componentes pueden comprender, por
ejemplo, inhibidores de enzimas tales como inhibidores de proteasas,
inhibidores de RNAsa, inhibidores de DNAsa, etc. En una realización
de la presente invención, la muestra se lisa directamente en la
forma obtenida de los individuos en los que se hace el ensayo. Los
inhibidores de proteasas pueden comprender, p. ej., inhibidores de
serina proteasas, inhibidores de cisteina proteasas, inhibidores de
aspártico proteasas, inhibidores de metaloproteasas, inhibidores de
proteasas ácidas, inhibidores de proteasas alcalinas o inhibidores
de proteasas neutras. En determinadas realizaciones de la presente
invención, la inhibición de enzimas se puede lograr por medios
químicos tales
como, p. ej., la desnaturalización de las enzimas mediante concentración salina, pH, agentes caotrópicos o similares.
como, p. ej., la desnaturalización de las enzimas mediante concentración salina, pH, agentes caotrópicos o similares.
En determinadas realizaciones de la invención,
con el fin de obtener resultados óptimos del ensayo, el pH de un
medio de lisis que se puede aplicar directamente al sistema de
ensayo es aproximadamente neutro. En realizaciones adicionales el pH
del medio de lisis está en el intervalo de 4 a 10. En determinadas
realizaciones, el pH está en el intervalo de 5 a 9. En una
realización preferida, el pH está en un intervalo de 6 a 8. En una
realización más preferida, el pH está en el intervalo de 6,5 a
7,5.
Los ejemplos de medios de lisis se pueden
seleccionar por ejemplo, de las composiciones dadas en la tabla
1.
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En determinadas situaciones, las moléculas
marcadoras pueden degradarse en las muestras solubilizadas y por lo
tanto pueden no ser detectadas. Esto es particularmente cierto si
las muestras se transfieren directamente a un medio de lisis y se
almacenan en el mismo durante un determinado periodo de tiempo. Para
prevenir la degradación, el medio de lisis puede comprender además
uno o más agentes que previenen la degradación de los componentes en
las muestras brutas. Dichos componentes pueden comprender, por
ejemplo, inhibidores de enzimas tales como inhibidores de proteasas,
inhibidores de RNAsa, inhibidores de DNAsa, etc. Los inhibidores
pueden comprender, por ejemplo, inhibidores de proteasa
seleccionados de las composiciones dadas en la Tabla 2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los expertos en la materia conocen los
inhibidores de DNasa y RNasa y se pueden aplicar en condiciones
adecuadas para usar en un medio de lisis de acuerdo con la presente
invención.
Para propósitos de estabilización, el medio de
lisis también puede comprender proteína en masa (p. ej., albúmina
tal como albúmina de suero bovino o albúmina de suero de ternero u
otras proteínas en masa) para competir en la degradación con las
proteínas de la muestra. Las proteínas en masa pueden estar
presentes, p. ej., en combinación con inhibidores de proteasa o se
pueden añadir en lugar de inhibidores de proteasa. En una
realización, el disolvente se puede seleccionar para que sea
compatible con la realización del ensayo (p. ej., ELISA), de modo
que las muestras solubilizadas se puedan aplicar directamente al
ensayo.
En algunas realizaciones de la presente
invención, el medio de lisis se puede diseñar con el fin de permitir
fijar un valor discriminante específico.
El procedimiento de detección descrito en el
presente documento a este respecto, se refiere a la detección de
moléculas marcadoras tales como proteínas o péptidos y los
respectivos fragmentos de los mismos. En determinadas realizaciones,
la detección de las moléculas marcadoras se lleva a cabo por
detección inmunoquímica de la presencia o ausencia y/o del nivel de
proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos en dichas muestras
solubilizadas. Las moléculas marcadoras que se pueden aplicar para
este procedimiento se describen como moléculas marcadoras
características para afecciones de relevancia médica.
La detección de dichas moléculas marcadoras en
el transcurso de un análisis bioquímico no basado en células, se
puede llevar a cabo en disolución o usando reactivos fijados a una
fase sólida. En determinadas realizaciones de la presente invención,
la detección de las moléculas marcadoras se lleva a cabo de una
disolución de muestras corporales disueltas. Por lo tanto, la
detección se puede llevar a cabo en disolución o usando reactivos
fijados a una fase sólida. Una fase sólida como se usa en el
contexto de la presente invención, puede comprender diferentes
realizaciones de las sustancias sólidas tales como superficies
planas, partículas (incluyendo micropartículas, nanopartículas o
incluso partículas más pequeñas). En determinadas realizaciones, las
partículas se pueden proporcionar como perlas, coloides o similares.
La fijación de los reactivos en la fase sólida en un kit de ensayo o
en un dispositivo de diagnóstico in vitro, se puede realizar
por fijación directa o por fijación indirecta. La fijación directa
se puede realizar, p. ej., por unión covalente o no covalente o por
asociación a superficies. La fijación indirecta se puede realizar
por la unión de los reactivos (p. ej., anticuerpos, sondas, etc.) a
agentes que están ellos mismos fijados directamente a fases sólidas.
Dichos agentes pueden comprender anticuerpos u otros agentes de
unión como estreptavidina, biotina o similares. La detección de uno
o más marcadores moleculares se puede realizar en una sola mezcla de
reacción o en dos o más mezclas de reacción separadas. Las
reacciones de detección para varias moléculas marcadoras se pueden
realizar por ejemplo de forma simultánea en recipientes de reacción
de múltiples pocillos o también puede hacerse en una o dos o más
tiras de ensayo separadas. Los marcadores característicos para los
trastornos de proliferación celular se pueden detectar usando
reactivos que reconocen específicamente estas moléculas. La reacción
de detección en el caso de que se vaya a detectar más de un
marcador, puede comprender una o más reacciones adicionales con
agentes de detección que reconocen las moléculas marcadoras
iniciales o preferiblemente que reconocen las moléculas previas (p.
ej., anticuerpos primarios) usados para reconocer los marcadores
iniciales. La reacción de detección además puede comprender una
reacción indicadora, que indica el nivel de marcadores
característicos para los trastornos de proliferación celular.
El término diagnóstico como se usa de acuerdo
con la presente invención, en general comprende cualquier tipo de
evaluación de la presencia o ausencia de una afección de relevancia
médica. El diagnóstico comprende, por lo tanto, procedimientos tales
como cribado de la predisposición a una afección de relevancia
médica, cribado del precursor de una afección de relevancia médica,
cribado de una afección de relevancia médica, diagnóstico clínico o
patológico de una afección de relevancia médica, etc. El diagnóstico
o la evaluación del diagnóstico tal como se usa en el presente
documento, pueden comprender además la evaluación del pronóstico o
la provisión de información para estratificar la terapia del
paciente basándose en el ensayo bioquímico no basado en células. El
diagnóstico de afecciones de relevancia médica tal como se usa en el
presente documento, puede comprender el examen de cualquier
afección, que sea detectable en un nivel citológico, histológico,
bioquímico o de biología molecular, que pueda ser útil con respecto
a la salud y/o el cuerpo humano. Dichos exámenes pueden comprender,
p. ej., procedimientos de diagnóstico médico y estudios de
investigación en ciencias de la vida. En una realización de la
invención, el procedimiento se usa para el diagnóstico de afecciones
de relevancia médica tales como, p. ej., enfermedades. Dichas
enfermedades pueden comprender, por ejemplo, trastornos
caracterizados por la proliferación de tipo no salvaje de células o
tejidos.
En una realización, el diagnóstico se refiere al
diagnóstico de enfermedades neoplásicas y sus fases precursoras,
para seguir el curso de la enfermedad en trastornos neoplásicos,
para evaluar el pronóstico de trastornos neoplásicos y para detectar
células tumorales diseminadas, p. ej., en el curso del diagnóstico
de la enfermedad residual mínima. El procedimiento de acuerdo con la
presente invención se puede usar, por ejemplo, en el curso del
diagnóstico clínico o patológico de cánceres y sus fases precursoras
o en ensayos de cribado rutinarios cuando se realizan para
trastornos neoplásicos particulares, tales como por ejemplo para el
examen de extensiones, p. ej. en ensayos de cribado para lesiones
cervicouterinas, de lavados bronquiales para el cáncer de pulmón o
de materia fecal para lesiones del tracto gastrointestinal, p. ej.,
lesiones colorrectales.
Las afecciones de relevancia médica tal como se
usa de acuerdo con la presente invención pueden ser, por ejemplo,
composiciones de tejidos, fluidos corporales, secreciones,
irrigaciones o extensiones. Dichas afecciones pueden comprender, por
ejemplo, la composición celular de fluidos corporales, tales como la
composición de sangre, la composición de liquido cefalorraquídeo o
la composición de semen. En este contexto, las composiciones serán
la presencia o ausencia de tipos de células particulares (p. ej.
patógenos, tales como virus etc., células neoplásicas y/o
displásicas etc.), la presencia o ausencia de patrones de
diferenciación de tipos de células particulares, el número total de
tipos particulares de células (p. ej., eritrocitos, leucocitos,
esperma, etc.), el número total de todas las células de cualquier
tipo de células o la fracción de células de otras características
particulares presentes o ausentes en la muestra.
Las afecciones de relevancia médica de acuerdo
con la presente invención son trastornos neoplásicos, es decir,
tumores, que comprenden tumores del tracto respiratorio, tumores del
tracto anogenital, del tracto gastrointestinal, o tumores del
sistema urinario.
Los tumores pueden comprender por ejemplo,
neoplasmas tales como tumores benignos y malignos, carcinomas,
sarcomas o displasias.
Los tumores del tracto anogenital pueden
comprender el cáncer de la piel perianal y del escroto, cáncer de
cuello de útero, cáncer de vulva, cáncer de vagina, cáncer de pene,
cáncer de ano, etc. El cáncer de cuello de útero puede comprender
lesiones escamosas, lesiones glandulares u otros tumores
epiteliales. Las lesiones escamosas comprenden, p. ej., neoplasias
intraepiteliales cervicouterinas (displasia leve, moderada y grave),
carcinoma in situ, carcinoma de células escamosas (p. ej.,
queratinizante, no queratinizante, verrugoso, condilomatoso, de tipo
linfoepitelioma). Las lesiones glandulares pueden comprender
hiperplasias atípicas, adenocarcinoma in situ, adenocarcinoma
(tal como, p. ej., adenocarcinoma mucinoso, endometrial, de células
claras, adenoma maligno, papilar, seroso o mesonéfrico). Otros
tumores epiteliales pueden comprender carcinoma adenoescamoso,
carcinoma de células vidriosas, carcinoma quístico adenoideo,
carcinoma basal adenoideo, tumor carcinoide, carcinoma de células
pequeñas y carcinoma indiferenciado. Para una información más
detallada, consultar "Kurman, R., Norris, H., y col., Tumors of
the Cervix, Vagina, and Vulva, Atlas of Tumor Pathology, 1992,
AFIP", cuyo contenido se incorpora en el presente documento por
referencia.
Los tumores gastrointestinales pueden comprender
cáncer de colon, cáncer del colon ascendente, del colon descendente,
del colon transverso, del sigmoide, del recto, cáncer del intestino
delgado, cáncer del yeyuno, cáncer del duodeno, cáncer gástrico,
cáncer esofágico, cáncer de hígado, cáncer biliar, cáncer del
sistema biliar, cáncer pancreático, etc. Se da una visión general
global de las lesiones gastrointestinales en "Hamilton Sr,
Aaltonen LA (Eds.): World Health Organization Classification of
Tumours, Pathology and Genetics of Tumors of the Digestive System,
IARC Press: Lyon 2000", que se incorporará en el presente
documento por referencia.
Los tumores del tracto respiratorio pueden
comprender cualquier afección maligna del tracto respiratorio tal
como, p. ej., cáncer del pulmón, los alvéolos, los bronquiolos, el
árbol bronquial y los bronquios, el espacio nasofaríngeo, la cavidad
oral, la faringe, la cavidad nasal y los senos paranasales. Cáncer
de pulmón tal como cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de
pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células
escamosas, carcinoma de pulmón de células pequeñas, adenocarcinoma
del pulmón, carcinoma de pulmón de células grandes, carcinoma de
pulmón adenoescamoso, tumor carcinoide del pulmón, tumor de las
glándulas bronquiales o mesotelioma (maligno). Se puede encontrar
una visión general de los tumores del tracto respiratorio en Colby
TV, y col.: Tumors of the Lower Respiratory Tract, Atlas of Tumor
Pathology, Third Series, Fascicle 13, AFIP: Washington 1995'', que
se incorporará en el presente documento por referencia.
Los tumores del sistema urinario pueden
comprender cáncer de vejiga, cáncer de los riñones, la pelvis renal,
cáncer de los uréteres y cáncer de la uretra, etc. Los tumores del
sistema reproductivo pueden comprender cáncer y fases precursoras
del mismo, del ovario, útero, testículos, próstata, epidídimo, etc.
En una realización de la invención, el cáncer es, p. ej., cáncer de
cuello de útero, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de mama,
cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de la cavidad oral
etc.
Los trastornos neoplásicos a los que se pueden
aplicar los procedimientos de la presente invención comprenden, por
ejemplo, lesiones neoplásicas del tracto respiratorio, del sistema
urinario, del tracto gastrointestinal, del tracto anogenital,
trastornos neoplásicos asociados con la infección por el HPV y
otros. Pueden ser cánceres del tracto respiratorio, del sistema
urinario, del tracto reproductivo o cánceres anogenitales, cánceres
asociados con el HPV y en particular cáncer de cuello de útero. En
relación con este último, deben mencionarse en particular las fases
precursores, p. ej., neoplasias intraepiteliales cervicouterinas
(CIN1-3), carcinomas in situ (CIS), etc. La
expresión "fases precursoras" en todas sus formas gramaticales
tal como se usa en el presente documento, comprende todas las fases
precursoras y precursores del cáncer o cualquier otro tumor maligno.
Con respecto a los precursores del cáncer de cuello de útero o fases
preliminares, tal como se usa en el presente documento, se puede
referir, p. ej., a fases de neoplasias interepiteliales
cervicouterinas identificadas mediante un sistema de clasificación
adecuado tal como, p. ej. la clasificación
CIN (CIN 1 - CIN 3), la clasificación de PAP (PAP I - PAP V) o la clasificación de Bethesda (NILM, LSIL, HSIL).
CIN (CIN 1 - CIN 3), la clasificación de PAP (PAP I - PAP V) o la clasificación de Bethesda (NILM, LSIL, HSIL).
En determinadas realizaciones de la invención,
el trastorno neoplásico se referirá en general a trastornos
neoplásicos asociados con el HPV. En este sentido, la invención se
puede aplicar a trastornos neoplásicos asociados con el HPV y en
especial con los tipos de HPV de riesgo alto y tipos de HPV de
mucosas. El HPV de riesgo alto puede comprender subtipos de HPV
tales como p. ej. HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58.
Los marcadores para la infección por el HPV pueden comprender, p.
ej., productos de expresión del HPV de los genes del HPV L1, L2, E2,
E4, E5, E6 o E7.
Los procedimientos de acuerdo con la presente
invención también se aplican a fases precursoras de las lesiones,
tumores o cánceres.
En una realización, el procedimiento se refiere
a la detección de células tumorales diseminadas o metástasis.
Las moléculas marcadoras usadas en la solicitud,
se referirán a moléculas marcadoras características para afecciones
de relevancia médica. Las expresiones "molécula marcadora" o
"molécula marcadora característica para afecciones de relevancia
médica" en todas sus formas gramaticales, tal como se usa en el
contexto de la presente invención, se refiere a moléculas de ácido
nucleico así como de (poli)péptidos. Por lo tanto, dichas
moléculas marcadoras comprenden, p. ej., ARN (ARNm, ARNhn, etc.),
ADN (ADNc, ADN genómico, etc.), proteínas, polipéptidos,
proteoglicanos, glicoproteínas y los respectivos fragmentos de estas
moléculas.
Un nivel de una molécula marcadora, como se usa
en el presente documento, se refiere a un valor semicuantitativo así
como cuantitativo con respecto a la cantidad del respectivo marcador
presente en una muestra. Un valor cuantitativo se puede representar,
p. ej., en términos de una concentración. Un valor semicuantitativo
se puede expresar en términos de una escala de niveles, p. ej.,
niveles indetectables, niveles bajos, niveles intermedios, niveles
altos o cualquier otro modo adecuado. El nivel de un marcador
también se puede representar en términos de un parámetro dependiente
tal como la intensidad de una señal generada en un formato de ensayo
en respuesta a la presencia de una molécula marcadora.
Una "sonda" (usado de forma intercambiable
con la expresión "agente de unión" en la presente invención)
para detectar moléculas marcadoras, como se usa en el contexto de la
presente solicitud, será cualquier molécula que se una
específicamente a dichas moléculas marcadoras. La sonda puede ser,
por ejemplo, un agente de unión a antígeno tal como anticuerpos
(monoclonales o policlonales), fragmentos de anticuerpo o moléculas
artificiales que comprenden epítopos de unión al antígeno, moléculas
de unión a ADN o ARN tales como proteínas o ácidos nucleicos. Los
ácidos nucleicos que se unen a otros ácidos nucleicos pueden ser por
ejemplo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) u oligonucleótidos (ARN,
ADN, PNA, ácidos nucleicos artificiales, etc.) para los propósitos
de detección o cebadores. En algunas realizaciones, se pueden
aplicar moléculas de nucleótidos incluso más largas para reacciones
de hibridación. Se dice que una molécula reconoce otra molécula si
interacciona específicamente con esta molécula. La interacción
especifica puede ser por ejemplo la unión especifica a o de otra
molécula. El término "anticuerpo" en todas sus formas
gramaticales, en el contexto de la presente invención, se referirá
en general a las moléculas de unión al antígeno, incluyendo pero sin
limitar, anticuerpos monoclonales y policlonales, fragmentos de
anticuerpos, epítopos de unión al antígeno, minianticuerpos,
peptidomiméticos con propiedades de unión al antígeno, anticalinas y
dianticuerpos.
Se dice que una molécula reconoce otra molécula
si interacciones específicamente con esta molécula. La interacción
especifica puede ser, por ejemplo, la unión especifica a o de otra
molécula.
De acuerdo con la invención, la detección del
nivel de moléculas marcadoras se lleva a cabo determinando el nivel
de expresión de una proteína. La determinación de las moléculas
marcadoras en el nivel de proteínas se puede llevar a cabo, por
ejemplo, en una reacción que comprende un agente de unión específico
para la detección de las moléculas marcadoras. Estos agentes de
unión pueden comprender, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de
unión al antígeno, anticuerpos híbridos bifuncionales,
peptidomiméticos que contienen epítopos de unión al antígeno mínimo,
etc. Los agentes de unión se pueden usar en muchas técnicas de
detección diferentes, por ejemplo, en transferencia western, ELISA,
RIA, EIA, ensayo de flujo continuo, ensayo de flujo lateral,
aglutinación en látex, tiras inmunocromatográficas o
inmunoprecipitación. En general, la detección basada en agente de
unión se puede llevar a cabo tanto in vitro como directamente
in situ, por ejemplo, en el curso de una reacción de tinción
inmunocitoquímica. Se puede usar cualquier otro procedimiento
adecuado para determinar la cantidad de polipéptidos particulares en
disoluciones de muestras biológicas de acuerdo con la presente
invención.
Los formatos aplicables para la reacción de
detección de acuerdo con la presente invención pueden ser técnicas
de transferencia, tales como transferencia western, transferencia
southern, transferencia northern. Las técnicas de transferencia son
conocidas para los expertos en la materia y se pueden llevar a cabo,
por ejemplo, como electrotransferencias, transferencias semisecas,
transferencias a vacío, o transferencias en manchas. Además, se
pueden aplicar procedimientos inmunológicos para detectar moléculas,
tales como por ejemplo inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos,
tales como EIA, ELISA, RIA, FIA (inmunoensayo fluorescente), ensayos
de flujo lateral (usando piezas porosas o capilares), tiras
inmunocromatográficas, ensayos de flujo continuo, ensayos de
aglutinación en látex, etc. Los inmunoensayos para usar en la
invención pueden comprender inmunoensayos competitivos así como no
competitivos, tales como ensayos de tipo sándwich.
En determinadas realizaciones de la presente
invención, el ensayo inmunoquímico se puede llevar a cabo usando un
dispositivo de ensayo para laboratorios clínicos. Dicho dispositivo
de ensayo puede comprender cualquier dispositivo adecuado para el
ensayo inmunoquímico incluyendo cualquier formato tal como, p. ej.,
dispositivos de análisis de diagnóstico inmediato, así como
dispositivos de sobremesa o de laboratorio. Los dispositivos se
pueden proporcionar, p. ej., como sistemas de plataforma abierta o
cerrada. El sistema se puede basar en cualquier metodología adecuada
tal como, p. ej., usando placas de microvaloración, placas
multipocillos, sistemas de flujo continuo o de flujo lateral,
sistemas de microchip o basados en matrices o sistemas basados en
perlas o membranas. Los procedimientos de detección usados pueden
comprender cualquier procedimiento conocido para los expertos en la
materia, útil para reacciones de detección inmunoquímica. Dichos
sistemas de detección pueden ser, p. ej., sistemas de luminiscencia
(electroluminiscencia, bioluminiscencia, fotoluminiscencia,
radioluminiscencia, quimioluminiscencia,
electroquimioluminiscencia), sistemas basados en fluorescencia,
sistemas de detección basados en conductividad, radiación (luz, UV,
rayos X, gamma, etc.) o cualquier otro procedimiento conocido.
El procedimiento para detectar el nivel de
moléculas marcadoras, en una realización de la presente invención es
cualquier procedimiento que sea adecuado para detectar cantidades
(pequeñas) de moléculas especificas en muestras biológicas. Además,
se puede aplicar cualquier procedimiento para detectar moléculas
marcadoras independientemente de la sensibilidad. La reacción de
detección de acuerdo con la presente invención, comprende reacciones
de detección en el nivel de polipéptidos. En una realización de la
invención, la detección de las moléculas marcadoras puede comprender
la detección de variantes de corte y empalme particulares. En otra
realización de la presente invención, el procedimiento de detección
puede comprender la detección de modificaciones de las moléculas
marcadoras tales como fosforilación o glicosilación etc., de
polipéptidos en las muestras.
La reacción indicadora puede ser cualquier
suceso que produzca una señal en respuesta a la presencia del
marcador o la unión de una sonda especifica al marcador. Por
ejemplo, una reacción que produce un compuesto coloreado, un
compuesto fluorescente, un compuesto que emite luz, un compuesto que
emite radiación, o la concentración de uno o más de estos compuestos
en una concentración detectable en un área predefinida de un
dispositivo de ensayo, pueden servir como reacción indicadora.
La reacción indicadora puede ser, por ejemplo,
una reacción que produce un compuesto coloreado. En una realización
de la presente invención, las sustancias indicadoras correlacionadas
con los marcadores particulares desarrollan colores diferentes. En
otra realización, un indicador puede ser una molécula que atenúa la
señal producida por la molécula indicadora especifica para otro
marcador, característica para la afección de relevancia médica, que
depende del nivel del respectivo marcador presente en la muestra. En
otra realización más, las reacciones indicadoras pueden producir
colorantes fluorescentes con longitudes de onda diferentes
características. En una realización más de la presente invención, la
reacción indicadora puede comprender reacciones que emiten luz con
diferentes longitudes de onda características para las sustancias
indicadoras especificas para el marcador que se va a detectar. En
otra realización de la presente invención, la reacción indicadora
puede comprender la emisión de radiación radiactiva y procedimientos
adicionales para visualizar o cuantificar la radiación. En una
realización, las diferentes moléculas marcadoras pueden ser
reconocidas por agentes que llevan radionucleidos que emiten
radiación con diferentes propiedades energéticas, de modo que se
pueden distinguir las señales relacionadas con las moléculas
marcadoras.
La preparación de una muestra para usar en un
procedimiento como se describe en el presente documento también
puede comprender varias etapas de preparaciones adicionales de la
muestra, tal como la separación de componentes insolubles,
aislamiento de polipéptidos o ácidos nucleicos, la preparación de
péptidos o ácidos nucleicos fijados en fase sólida o la preparación
de perlas, membranas o láminas a las que las moléculas que se van a
determinar se acoplan de forma covalente o no covalente.
La expresión "determinar la sobreexpresión de
moléculas marcadoras" comprende cualquier procedimiento que sea
adecuado para detectar la expresión de moléculas marcadoras
proteínicas. Con el fin de determinar una sobreexpresión, la muestra
corporal que se va a examinar se puede comparar con una muestra
corporal correspondiente que se origina de una persona sana o de una
región no enferma del órgano respectivo. Dicha muestra puede estar
presente en una forma estandarizada.
La comparación con muestras corporales sanas
normales se puede lograr por diferentes procedimientos. En una
realización de la presente invención, la comparación se puede
realizar directamente incluyendo una reacción de control con muestra
de tejido o celular no patológica. Estas muestras de tejido o
células no patológicas se pueden obtener de una persona sana o de
regiones no enfermas del sujeto humano que se examina o de células
de cultivo celular que se sabe que presentan propiedades de células
no enfermas con respecto a la expresión de la molécula marcadora. En
otra realización, la comparación se puede realizar indirectamente
comparando el nivel de moléculas marcadoras en la muestra que se
está investigando, con un nivel de dicha molécula marcadora que se
sabe que está presente en muestras sanas normales. El conocimiento
sobre el nivel para muestras de tejido o células sanas normales se
puede obtener de una serie representativa de ensayos o de
publicaciones científicas que proporcionan información del nivel de
expresión de dichas moléculas marcadoras en células sanas normales.
La comparación se puede llevar a cabo usando un valor para la
concentración de la molécula marcadora; por otra parte se puede usar
un valor característico que depende de la concentración de proteína
tal como la densidad óptica en condiciones de reacción definidas. De
otra forma, el valor conocido se puede representar por un control
sustituto tal como un péptido o una proteína recombinante. Por
ejemplo, el nivel de p16^{INK4a} presente en muestras sanas
normales se puede representar por una muestra de control de una
proteína recombinante o un péptido en el procedimiento de
ensayo.
En general, la comparación del nivel presente en
la muestra que se está investigando se puede llevar a cabo con
respecto a un valor determinado en cada procedimiento de ensayo
individual o a un valor predeterminado. El valor predeterminado se
puede determinar para el procedimiento de ensayo de forma global. De
otro modo, el valor puede ser válido solo para un determinado lote
de reactivos de ensayo. Por ejemplo, el valor de referencia puede
ser válido solo para un periodo de calibración definido y se puede
definir tras calibración del procedimiento de ensayo.
Por ejemplo, el nivel de molécula marcadora en
una muestra cervicouterina humana sana se puede determinar a partir
de una disolución de muestra estandarizada. Una disolución de
muestra estandarizada puede comprender una disolución de un grupo
solubilizado de muestras de tejidos normales o células normales. El
grupo de muestras puede ser, p. ej., un grupo de muestras
citológicas con diagnóstico previamente evaluado normal de una
población de cribado, o un grupo de células normales obtenidas de
muestras histológicas. Además, se puede obtener un grupo de células
normales de cultivo de tejido de células epiteliales cervicouterinas
normales. La disolución de muestra puede estar, por ejemplo,
estandarizada con respecto al contenido de células por mi de
disolución de muestra. Se puede aplicar cualquier otro parámetro
para la estandarización. La disolución de muestra se puede
proporcionar, por ejemplo, en una forma estandarizada para asegurar
la estabilidad y reproducibilidad de los resultados del ensayo. En
algunas realizaciones, dicha disolución se puede proporcionar como
un componente del kit de comparación o con el propósito de la
calibración.
En algunas realizaciones, la etapa de comparar
el nivel de moléculas presentes en una muestra del paciente con un
nivel que se sabe que está presente en una muestra corporal sana
normal, se realiza usando un valor discriminante o valor umbral para
la concentración de la molécula marcadora respectiva. El valor
discriminante en este contexto es un valor (por ejemplo, una
concentración de una molécula marcadora proteínica-., p. ej., en
mg/ml o una densidad óptica medida en condiciones definidas en un
ensayo ELISA) que es adecuado para separar las muestras sanas
normales de las muestras patológicas, p. ej., todas las muestras que
dan valores por encima del valor discriminante se considera que son
displásicas, mientras que las muestras que dan valores por debajo
del valor discriminante se considera que son sanas.
En algunas realizaciones, el umbral o valor
discriminante se puede establecer de forma que separe los trastornos
neoplásicos de grado alto (HSIL o trastornos neoplásicos que
corresponden, p. ej., a carcinoma invasivo, displasia de grado alto
o lesiones CIN 3 evaluadas por histología) de las fases menos graves
de los trastornos neoplásicos (p. ej., LSIL). En otras
realizaciones, el valor discriminante se puede definir para
diferenciar muestras sanas (NILM) de trastornos neoplásicos
incluyendo fases precursoras (LSIL y HSIL). Por lo tanto, se puede
diseñar el formato de ensayo con el fin de ajustar las diferentes
tareas tales como la detección precoz de las lesiones e incluso
precursores de las lesiones o detección de lesiones que merecen una
terapia inmediata.
En relación con la detección de un nivel de
proteína, se pueden usar, p. ej., anticuerpos que se dirigen contra
dichas moléculas marcadoras. Estos anticuerpos se pueden usar en los
procedimientos más variados tales como transferencia western, ELISA
o inmunoprecipitación. Puede ser favorable para los anticuerpos
estar fijados sobre soportes sólidos tales como placas de ELISA,
recipientes de reacción, perlas, esferas, membranas, coloides tales
como metales coloidales (p. ej. oro), piezas porosas, superficies de
capilares (p. ej., en el ensayo de flujo continuo), tiras de ensayo
o partículas de látex. En relación con la detección del nivel de
ácidos nucleicos, se pueden aplicar procedimientos tales como
técnicas de amplificación o técnicas de hibridación de ácidos
nucleicos.
En algunas realizaciones de la presente
invención, la detección de las moléculas marcadoras se lleva a cabo
a partir de una disolución de las muestras corporales solubilizadas.
Por lo tanto, la detección se puede llevar a cabo en disolución o
usando reactivos fijados en una fase sólida.
Una fase sólida, como se usa en el contexto de
la presente invención puede comprender diferentes realizaciones de
sustancias sólidas tales como superficies planas, partículas
(incluyendo micropartículas, nanopartículas o incluso partículas más
pequeñas). En algunas realizaciones, las partículas se pueden
proporcionar como esferas, perlas, coloides o similares.
La fijación de los reactivos a la fase sólida se
puede llevar a cabo por fijación directa o por fijación indirecta.
La fijación directa se puede llevar a cabo por unión covalente,
unión no covalente, asociación o adsorción a superficies. La
fijación indirecta se puede llevar a cabo por unión del anticuerpo a
agentes, los cuales están ellos mismos fijados directamente a fases
sólidas. Los agentes de unión incluyen, por ejemplo, avidina,
estreptavidina, biotina, digoxigenina, anticuerpos o similares.
La detección de uno o más marcadores moleculares
se puede llevar a cabo en una sola mezcla de reacción o en dos o más
mezclas de reacción separadas. Las reacciones de detección para
varias moléculas marcadoras se pueden llevar a cabo, por ejemplo, de
forma simultánea en recipientes de reacción de múltiples pocillos.
La reacción de detección para moléculas marcadoras puede comprender
una o más reacciones adicionales con agentes de detección que
reconocen las moléculas marcadoras iniciales o preferiblemente que
reconocen las moléculas previas (p. ej., anticuerpos primarios)
usadas para reconocer los marcadores iniciales. La reacción de
detección puede comprender además una reacción indicadora que indica
el nivel de los marcadores característicos para los trastornos de
proliferación celular o los marcadores de normalización.
La reacción de detección para detectar el nivel
de moléculas marcadoras en muestras solubilizadas se puede llevar a
cabo en disolución o con reactivos fijados a fases sólidas. En
algunas realizaciones, la reacción de detección se puede llevar a
cabo en disolución; dichos procedimientos pueden comprender
cualquier procedimiento adecuado para la detección de interacciones
moleculares (unión de un anticuerpo o agente de unión a un antígeno
similar) en disolución. Los procedimientos para determinar la
interacción molecular (cambio en la conductividad, cambios de masa,
cambios de espectrometría de luz, UV, IR, magnética, resonancia de
plasmón, etc.) son conocidos para los expertos en la materia. En
algunas realizaciones, la detección puede comprender un
procedimiento en el que un complejo de reactivo de detección unido
al antígeno se adsorbe en una fase sólida con propósitos de
detección. Por lo tanto, se puede usar la unión no covalente de los
analitos a fases sólidas en el curso de la reacción de detección o
incluso antes de empezar la reacción de detección, en un
procedimiento de acuerdo con la presente invención.
En algunas realizaciones de la invención, se
puede llevar a cabo el ensayo inmunoquímico usando un dispositivo de
ensayo para laboratorios clínicos. Dicho dispositivo de ensayo puede
comprender cualquier dispositivo adecuado para el ensayo
inmunoquímico incluyendo cualquier formato tal como dispositivos de
análisis de diagnóstico inmediato así como dispositivos de sobremesa
o de laboratorio. Los dispositivos se pueden proporcionar, p. ej.,
como sistemas de plataforma abierta o cerrada. El sistema se puede
basar en cualquier metodología adecuada tal como placas de
microvaloración, placas de multipocillos, sistemas de flujo continuo
o de flujo lateral, sistemas basados de microchip o matrices o
sistemas basados en perlas o membranas. Los procedimientos de
detección usados pueden comprender cualquier procedimiento conocido
para los expertos en la materia, útil para las reacciones de
detección inmunoquímicas o basadas en ácidos nucleicos. Dichos
sistemas de detección pueden ser, p. ej., sistemas de luminiscencia
(electroluminiscencia, bioluminiscencia, fotoluminiscencia,
radioluminiscencia, quimioluminiscencia,
electroquimioluminiscencia), sistemas basados en fluorescencia,
sistemas de detección basados en conductividad, radiación (luz, UV,
rayos X, gamma, etc.), resonancia de plasmones (p. ej., resonancia
de plasmones superficiales SPR), FRET o cualquier otro procedimiento
conocido.
La expresión pieza porosa, como se usa en el
presente documento, en general se aplicará a cualquier disposición
tridimensional de sustancias porosas. Dicha pieza porosa puede
comprender, p. ej., compuestos tales como membranas, perlas u
otros.
Mediante la presente invención, se pueden
diagnosticar cánceres de forma precoz, es decir, en sus fases
preliminares.
La detección de estados modificados de
polipéptidos puede comprender, por ejemplo, agentes de unión que
reconocen específicamente estados modificados o no modificados de
polipéptidos. Alternativamente, se pueden usar enzimas tales como
fosfatasas o glicosilasas para eliminar modificaciones en moléculas.
La presencia o ausencia de modificaciones se puede detectar por lo
tanto, por determinación del cambio de masa o carga de la molécula
mediante electroforesis, cromatografía, espectrometría de masas etc.
antes o después de la incubación con una enzima respectiva.
En una realización adicional de la presente
invención, la detección de una serie de moléculas marcadoras se
lleva a cabo en el nivel de polipéptidos y se lleva a cabo de forma
simultánea la detección de una serie adicional de moléculas
marcadoras y/o de todos o algunas de las mismas moléculas marcadores
a nivel de los ácidos nucleicos.
Las moléculas marcadoras características para
las afecciones de relevancia médica pueden ser, p. ej., moléculas
que influyen y/o reflejan las características de proliferación y/o
diferenciación de células y/o tejidos. Dichas moléculas pueden
comprender, por ejemplo, proteínas reguladoras del ciclo celular,
proteínas asociadas con la replicación del ADN, proteínas
transmembrana, proteínas receptoras, proteínas de transducción de
señales, proteínas que se unen al calcio, proteínas que contienen
dominios de unión al ADN, metaloproteasas, quinasas, inhibidores de
quinasa, chaperonas, proteínas de embriogénesis, proteínas de choque
térmico o enzimas que modifican otras proteínas después de
traducción regulando así su actividad, o ácidos nucleicos que
codifican las proteínas nombradas. Los ARNm que codifican las
proteínas nombradas también pueden ser moléculas marcadoras útiles
de acuerdo con la presente invención. En una realización, el
marcador asociado con el trastorno de proliferación celular puede
expresarse, por ejemplo, únicamente en células afectadas por el
trastorno, puede no expresarse en dichas células o puede
sobreexpresarse en dichas células.
Las moléculas marcadoras para usar en un
procedimiento de acuerdo con la presente invención, comprenden una o
más moléculas marcadoras (proteínas así como ácidos nucleicos)
elegidos de las proteínas reguladoras del ciclo celular ciclina E,
inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p16^{INK4a}, antígenos
asociados a tumores MCM5, MCM6, CDC6, claudina, her2/neu, marcadores
asociados a HPV, genes derivados del HPV L1, L2, El, E2, E4, E5, E6
o E7. En algunas realizaciones, las moléculas marcadoras detectadas
de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente documento,
pueden comprender genes implicados en la replicación del ADN tales
como, p. ej., proteínas del complejo de preinicio o de la horquilla
de replicación. Dichas moléculas comprenden proteínas MCM [MCM2 y
MCM5], quinasas CDCG implicadas en el procedimiento de replicación,
proteínas implicadas en la horquilla de replicación en desarrollo,
es decir PCNA, moléculas necesarias para el mantenimiento de la
proliferación celular, es decir Ki67 o Ki-S1. En
general, el procedimiento para el desarrollo de kits y dispositivos
de diagnóstico in vitro descritos en el presente documento,
es adecuado para kits y dispositivos de diagnóstico in vitro
basados en diferentes moléculas marcadoras características para
afecciones de relevancia médica. En una realización, las moléculas
marcadoras para una afección de relevancia médica pueden ser un
marcador para tumores (marcadores tumorales). Las moléculas
marcadoras características para tumores pueden ser, p. ej.,
proteínas que se expresan de una forma no natural en tumores
comparado con el tejido de control normal. La expresión de tipo no
natural, como se usa en el presente documento, puede comprender
niveles aumentados o reducidos de expresión, o carencia de
expresión, o expresión de formas de tipo no natural de las moléculas
respectivas. La expresión de formas de tipo no natural de una
proteína puede comprender la expresión de formas mutadas de
proteínas que proceden de la inserción, deleción, sustitución o
mutaciones con desplazamiento del marco de lectura u otros tipos
conocidos de mutaciones en proteínas o ácidos nucleicos. En todos
los casos de la expresión de proteínas de tipo no natural o de
niveles no naturales de proteínas, las proteínas, polipéptidos o
fragmentos de los mismos, o los ácidos nucleicos que codifican estas
proteínas o polipéptidos o fragmentos de estos ácidos nucleicos, se
pueden usar como marcadores moleculares asociados con tumores y por
lo tanto se pueden entender en la expresión de "marcador
tumoral" como se usa en el contexto de la presente invención. Las
proteínas que presentan expresión de tipo no natural asociada con
tumores, se describen, por ejemplo, en los documentos WO9904265A2,
WO0149716A2, WO0055633A2 y WO0142792A2.
Los inhibidores dependientes de ciclina para
usar en algunas realizaciones de la presente invención comprenden
inhibidores de quinasa dependientes de ciclina p16^{INK4a}. Además
de los inhibidores de quinasa dependientes de ciclina, también se
puede usar la proteína reguladora del ciclo celular p14^{ARF}
codificada por un marco de lectura alternativo del gen de
p16^{INK4a}, para un procedimiento como se describe en el presente
documento. Por conveniencia, en el contexto de la presente
invención, la proteína reguladora del ciclo celular p14^{ARF}, que
por su función no es un inhibidor de la quinasa dependiente de
ciclina, se incluirá en la expresión "inhibidor de quinasa
dependiente de ciclina".
"p16" o el "inhibidor de quinasa
dependiente de ciclina p16^{INK4a}", como se usa en el presente
documento, se refiere al inhibidor de quinasa dependiente de ciclina
pl6lNK4a (también denominado CDKN2 o MTS1), cuyo gen está situado en
la región cromosómica 9p21. p16^{INK4a} lo describieron por
primera vez Serrano, M., y col., Nature, 16 dic 1993; 366
(6456): 704-7. Las expresiones "p16^{INK4a}"
o "inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p16^{INK4a}"
en todas sus formas gramaticales, como se usa en el contexto de la
presente invención, se refiere al ácido nucleico así como a las
moléculas polipeptídicas. Por lo tanto "p16^{INK4a}" o
"inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p16^{INK4a}",
comprenden, p. ej., ARN (ARNm, ARNhn, etc.), ADN (ADNc, ADN
genómico, etc.), proteínas, polipéptidos, proteoglicanos,
glicoproteínas y los respectivos fragmentos de estas moléculas.
En una realización de la invención, el marcador
característico para la afección de relevancia médica puede ser una
proteína reguladora del ciclo celular tal como por ejemplo una
ciclina, una quinasa dependiente de ciclina o un inhibidor de
quinasa dependiente de ciclina. En una realización adicional de la
invención, el marcador característico para la afección de relevancia
médica puede ser un marcador asociado con una infección vírica
transitoria o persistente. La infección vírica puede comprender una
infección por un virus de papiloma humano (HPV) tal como HPV de
riesgo alto o de riesgo bajo. El HPV de riesgo alto puede comprender
subtipos de HPV tales como, por ejemplo, HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56 y 58. Los marcadores para la infección por el HPV
pueden comprender, p. ej., productos de expresión de HPV de los
genes del HPV L1, L2, E2, E4, E5, E6 o E7. En una tercera
realización de la invención, se puede usar un marcador
característico para una infección vírica en combinación con
cualquier otro marcador para una afección de relevancia médica, tal
como p. ej. en combinación con una proteína reguladora del ciclo
celular. Las combinaciones de moléculas marcadoras que pueden tener
interés especial con respecto a la asociación con el HPV se
describen, p. ej., en el documento WO0208764.
En una realización, las proteínas reguladoras
del ciclo celular para usar en combinación con marcadores de HPV se
pueden elegir, por ejemplo, de un grupo que comprende pRb, p53,
p14^{ARF}, inhibidores de quinasa dependientes de ciclina. En una
realización especial, se puede usar, por ejemplo, p16^{INK4a} en
combinación con marcadores para la infección por el HPV (p. ej., L1,
L2, E2, E4, E5, E6 o E7).
Para el procedimiento de detección de afecciones
de relevancia médica como se describen en el presente documento, en
principio se puede aplicar cualquier molécula marcadora para varias
afecciones de relevancia médica. Sin embargo, se sabe que algunas
moléculas marcadoras están asociadas con afecciones de relevancia
médica especificas. Los expertos en la materia saben que moléculas
marcadoras se podrían usar razonablemente en un procedimiento de
acuerdo con la presente invención, para detectar una afección de
relevancia médica en una muestra corporal solubilizada. A
continuación se dan ejemplos de afecciones de relevancia médica y
moléculas marcadoras adecuadas para aplicar en un procedimiento como
se describe en el presente documento. A continuación en la tabla 3
se dan ejemplos de afecciones de relevancia médica y moléculas
marcadoras adecuadas para aplicar en un procedimiento de acuerdo con
la presente invención. La información se pretende que ilustre el
procedimiento como se describe en el presente documento, y no
restringe el alcance de la invención, que se define por las
reivindicaciones adjuntas.
Las moléculas marcadoras para afecciones de
relevancia médica de acuerdo con la presente invención pueden ser
características de la presencia o ausencia de una afección de
relevancia médica. En una realización de la presente invención, las
moléculas marcadoras pueden ser características de propiedades
especificas de las afecciones de relevancia médica. Dichas
características pueden comprenden el potencial de progreso,
información de pronóstico, comportamiento con respecto a
determinados tratamientos terapéuticos de la afección de relevancia
médica. Por lo tanto, las moléculas marcadoras características para
las afecciones de relevancia médica pueden ser moléculas marcadoras
útiles para la determinación del pronóstico de individuos afectados
por afecciones de relevancia médica o para estratificar la terapia
de individuos afectados por afecciones de relevancia médica. En
algunas aplicaciones esto se puede aplicar a la determinación de la
presencia o ausencia de la expresión de algunas moléculas
marcadoras, que es indicativo del pronóstico positivo o negativo en
afecciones de relevancia médica (p. ej., expresión del nivel de p16,
Her-2/Neu, claudina y otros en el cáncer de mama,
etc.). Los ejemplos de moléculas marcadoras que permiten evaluar el
pronóstico de individuos afectados de afecciones de relevancia
médica especificas, son conocidos para los expertos en la materia.
Se puede usar cualquiera de dichos marcadores conocidos de los
procedimientos citológicos o histológicos basados en células, en un
procedimiento de acuerdo con la presente invención. La evaluación
del pronóstico se puede hacer, p. ej., durante o después del
diagnóstico primario de la afección de relevancia médica, durante o
después del tratamiento (quirúrgico) de la afección de relevancia
médica, o en cualquier otra fase de la historia de la respectiva
afección de relevancia médica. En otras realizaciones, el
procedimiento de acuerdo con la invención se puede usar para
estratificar el tratamiento de individuos afectados de afecciones de
relevancia médica. Dicha estratificación puede comprender, p. ej.,
la selección de determinados compuestos terapéuticos en el sentido
de procedimientos diagnóstico-terapéuticos (usados,
por ejemplo, para la selección de pacientes para la terapia con
herceptina o similares), selección de pacientes para quimioterapia,
para radioterapia o para cualquier otra decisión en el tratamiento
terapéutico adicional de individuos, o en general para la decisión
del tratamiento médico de individuos tales como la supervisión del
seguimiento y similares.
En algunas realizaciones de la presente
invención, las moléculas marcadoras características para afecciones
de relevancia médica pueden ser marcadores indicativos del avance de
la afección de relevancia médica. En algunas realizaciones
adicionales de la presente invención, las moléculas marcadoras
características del avance de las afecciones de relevancia médica se
pueden usar en combinación con moléculas marcadoras características
simplemente de la presencia de dicha afección de relevancia
médica.
La solicitud describe un procedimiento para el
desarrollo de kits y dispositivos de diagnóstico in vitro
para el diagnóstico de afecciones de relevancia médica a partir de
muestras corporales solubilizadas, en el que el desarrollo se lleva
a cabo usando muestras corporales proporcionadas como células
conservadas en un medio de conservación de células y en el que las
células conservadas están dirigidas y preparadas para usar en
procedimientos de examen citológico tales como procedimientos de
citología en líquido (no es parte de la invención reivindicada). Las
muestras destinadas a los procedimientos de citología en líquido (en
lo sucesivo denominadas muestras de LBC) se solubilizan en un medio
de lisis adecuado y se usan para actividades de desarrollo de kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro para la detección de
afecciones de relevancia médica a partir de muestras corporales
solubilizadas basada en análisis bioquímico no basado en
células.
El procedimiento de desarrollo de kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro se puede aplicar a kits
y dispositivos de diagnóstico in vitro para detectar y
diagnosticar todos los tipos de afecciones de relevancia médica.
El desarrollo, como se usa en el contexto de la
presente solicitud, se refiere a todas las actividades de diseño y
desarrollo realizadas para permitir a un fabricante la producción
controlada de un kit o dispositivo de diagnóstico in vitro
acabado, dirigido a la distribución comercial o venta de dicho kit o
dispositivo de diagnóstico in vitro. Por consiguiente, el
desarrollo de kits y dispositivos de diagnóstico in vitro,
como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a
todas las actividades en conexión con el diseño y el desarrollo,
verificación de diseño y desarrollo, validación de diseño y
desarrollo, evaluación de datos de rendimiento, evaluación de datos
de seguridad y eficacia de los kits y dispositivos de diagnóstico
in vitro. En una realización, el desarrollo se referirá al
ensayo de la idoneidad de los resultados de diseño y desarrollo de
los kits y dispositivos de diagnóstico in vitro en relación
con el uso pretendido propuesto. En este sentido, el uso pretendido
se entiende como el propósito de detección o diagnóstico para el que
se aplicará el kit o dispositivo de diagnóstico in vitro.
El procedimiento para el desarrollo de kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro descrito en el presente
documento, se dirige al desarrollo de kits y dispositivos de
diagnóstico in vitro para formatos de ensayo bioquímico. En
estos formatos de ensayo se detecta la presencia o ausencia y/o el
nivel de moléculas marcadoras en las muestras corporales
solubilizadas. La solubilización de las muestras corporales se lleva
a cabo usando un medio de lisis adecuado como se ha detallado antes.
El desarrollo de un kit o dispositivo de diagnóstico in vitro
de acuerdo con la presente invención usa muestras de LBC para el
diseño, desarrollo, verificación de diseño y desarrollo, validación
de diseño y desarrollo. Además, el procedimiento para el desarrollo
de kits y dispositivos de diagnóstico in vitro basado en
muestras de LBC como se describe en el presente documento, es
cualquier procedimiento que use muestras de LBC para proporcionar
documentación técnica y/o de pruebas de la seguridad y eficacia
destinadas a la autorización reglamentaria o aprobación del
respectivo kit o dispositivo de diagnóstico in vitro ante las
autoridades reguladoras y organismos (notificados) reguladores, si
se aplica. El procedimiento de desarrollo de kits y dispositivos de
diagnóstico in vitro como se describe en el presente
documento, puede usar muestras de LBC en todas las etapas del
diseño, desarrollo, verificación, validación, suministro de datos
para la presentación reguladora y autorización/aprobación, o puede
usar muestras de LBC solo en una o más de las etapas nombradas del
diseño y desarrollo del kit o dispositivo de diagnóstico in
vitro. En una realización, el procedimiento de desarrollo de los
kits o dispositivos de diagnóstico in vitro es un
procedimiento para el diseño y desarrollo de dichos kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro, en el que las muestras
de LBC se usan para la verificación y/o validación del diseño y
desarrollo. En otra realización de la invención, el procedimiento de
desarrollo de kits y dispositivos de diagnóstico in vitro es
un procedimiento para suministrar datos para la presentación
reglamentaria y autorización/aprobación de los kits y/o dispositivos
de diagnóstico in vitro ante las autoridades reglamentarias
regionales o nacionales y/o organismos (notificados) reguladores
nacionales o regionales, en el que se usan las muestras de LBC para
proporcionar datos técnicos, datos de producción o datos de
seguridad y eficacia en relación con el kit o dispositivo de
diagnóstico in vitro. En una realización adicional de la
invención, el procedimiento de desarrollo de kits y dispositivos de
diagnóstico in vitro es un procedimiento en el que se
combinan los últimos procedimientos.
Los kits y dispositivos de diagnóstico in
vitro usados en el procedimiento de la presente invención se
caracterizan porque la detección de las moléculas marcadoras
características de afecciones de relevancia médica, se lleva a cabo
basándose en análisis bioquímicos no basados en células. Los
análisis bioquímicos no basados en células, como se usa en el
contexto de la presente invención, se referirán a todos los
procedimientos en los que se detecta un analito o una molécula
marcadora en una disolución, en el que no se usa información de la
morfología celular o de la arquitectura tisular para la evaluación
del diagnóstico. (Los restos de células y tejidos no tienen que
estar necesariamente ausentes de dicha disolución). Dicho análisis
bioquímico no basado en células se fundamenta en la información
obtenida de la detección de la presencia o ausencia de una o más
moléculas marcadoras en la disolución que se está investigando, o de
la detección de los niveles de una o más moléculas marcadoras en la
disolución que se está investigando. En algunas realizaciones de la
presente invención, los kits y dispositivos de diagnóstico in
vitro se diseñan para detectar solo una molécula marcadora. En
realizaciones adicionales de la presente invención, los kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro se diseñan para detectar
un grupo de moléculas marcadoras. En general, el procedimiento de
desarrollo como se describe en el presente documento se puede
aplicar a varios tipos de kits y dispositivos de diagnóstico in
vitro.
Los kits, como se usa en el contexto de la
presente invención, son composiciones de componentes proporcionadas
para la realización de un procedimiento de ensayo analítico. El kit
puede comprender todos o algunos de los reactivos y materiales
necesarios para la realización correcta del ensayo. Además, en
algunas realizaciones de la invención, el kit puede comprender
instrucciones para una aplicación adecuada de los componentes del
kit, incluyendo, por ejemplo, un protocolo de ensayo ilustrativo,
advertencias e información de peligro e información auxiliar
adicional para el usuario del kit.
Los kits usados en los procedimientos de la
presente invención pueden comprender, p. ej.:
(a) un reactivo para detectar la expresión de
una molécula marcadora, p. ej. una sonda dirigida contra una
proteína y partes de la misma, respectivamente,
(b) un medio de lisis para la solubilización de
una muestra corporal,
(c) agentes auxiliares convencionales, tales
como tampones, vehículos, marcadores, etc. y opcionalmente
(d) un agente para reacciones de control, p.
ej., una molécula marcadora proteínica y partes de la misma,
respectivamente, o una preparación de células.
Además, pueden estar presentes uno o varios de
los componentes individuales. Por ejemplo, pueden estar presentes el
reactivo de detección y otros reactivos fijados en una fase sólida.
En una realización, el kit comprende un reactivo para detectar una
molécula marcadora fijada en fases sólidas y reactivos de no
detección de otras especificidades fijados en las fases sólidas.
En algunas realizaciones, los kits para detectar
moléculas marcadoras inhibidoras se proporcionan como dispositivos
de diagnóstico in vitro.
En realizaciones frecuentes, el kit se puede
proporcionar como dispositivo de diagnóstico in vitro. Un
dispositivo de diagnóstico in vitro es un kit como se ha
definido antes, que está destinado a la evaluación del diagnóstico
de una afección de relevancia médica a partir de muestras corporales
humanas o animales.
Un dispositivo de diagnóstico in vitro es
un kit como se ha definido antes, que está destinado a la evaluación
del diagnóstico de una afección de relevancia médica a partir de
muestras corporales humanas o animales. En algunas realizaciones de
la invención, un dispositivo de diagnóstico in vitro será
cualquier dispositivo que esté dentro del alcance de la definición
de dispositivo médico de diagnóstico in vitro dado en la
directiva 98/97 EC en el articulo 1(b):
"dispositivo de diagnóstico in
vitro "significa cualquier dispositivo médico que es
un producto reactivo, calibrador, material de control, kit,
instrumento, aparato, equipo o sistema, usado sólo o en combinación
con otros, destinado por el fabricante a ser usado in vitro
para el estudio de muestras, incluyendo donaciones de sangre y
tejidos, procedentes del cuerpo humano, con el fin principal o único
de proporcionar información relativa al estado fisiológico o
patológico; o relativa a una anomalía congénita; o para determinar
la seguridad y compatibilidad con receptores potenciales; o para
supervisar medidas terapéuticas.
El dispositivo de diagnóstico in vitro
también se aplicará a la clase I-IVD de EE.UU. y en
general a dispositivos de diagnóstico in vitro que se
proporcionan sin reivindicaciones con respecto a su rendimiento
diagnóstico. Por lo tanto, se entenderá que cualquier clase de ASR o
similar también es un dispositivo de diagnóstico in vitro
como se usa en el presente documento. En una realización de la
presente invención, el dispositivo de diagnóstico in vitro se
caracteriza por reactivos de detección fijados en una fase sólida
específicos para una molécula marcadora.
El dispositivo de diagnóstico in vitro
puede comprender sondas dirigidas contra moléculas marcadoras
fijadas en una fase sólida que permiten evaluar el diagnóstico de
afecciones de relevancia médica en una muestra solubilizada. Las
sondas pueden comprender, p. ej. anticuerpos o fragmentos de los
mismos dirigidos contra moléculas marcadoras. Una ventaja de los
dispositivos de diagnóstico in vitro es el permitir la
evaluación fácil y económica del diagnóstico de afecciones de
relevancia médica. El ensayo puede ser adecuado para propósitos de
cribado, así como para propósitos de diagnóstico y se puede aplicar
en el diagnóstico primario asó como en el seguimiento del curso de
la enfermedad. Los dispositivos de diagnóstico in vitro en
algunas realizaciones pueden ser aplicables para usar en
laboratorios clínicos, para ensayos de diagnóstico inmediato o
incluso para el autoensayo.
Los dispositivos de diagnóstico in vitro
que comprenden reactivos fijados en fase sólida para detectar
moléculas marcadoras pueden ser útiles para detectar diferentes
afecciones de relevancia médica. Los dispositivos de diagnóstico
in vitro se pueden aplicar para el análisis de cualquier
clase de muestras corporales lisadas.
Las sondas se pueden fijar a la fase sólida por
fijación directa o por fijación indirecta. La fijación directa se
puede hacer por unión covalente o no covalente o por asociación a
superficies. La fijación indirecta se puede hacer por la unión del
anticuerpo a agentes, los cuales están ellos mismos fijados
directamente a fases sólidas. Dichos agentes pueden comprender
anticuerpos u otros agentes de unión como avidina, estreptavidina,
biotina, digioxigenina o similares.
Los dispositivos de diagnóstico in vitro
útiles para la presente invención se seleccionan del grupo que
consiste en:
a. un dispositivo de ELISA que comprende
anticuerpos dirigidos contra moléculas marcadoras fijadas en placas
ELISA, tiras ELISA o pocillos ELISA;
b. un dispositivo de ensayo de flujo lateral,
que comprende anticuerpos dirigidos contra moléculas marcadoras
fijadas en tiras de ensayo, partículas de oro coloidal o partículas
de látex;
c. un dispositivo de ensayo de flujo continuo,
que comprende anticuerpos dirigidos contra moléculas marcadoras
fijadas en una pieza porosa, o a la superficie de capilares;
d. un dispositivo de ensayo de aglutinación en
látex, que comprende anticuerpos dirigidos contra moléculas
marcadoras fijadas en partículas de látex; y
e. un dispositivo de inmunoensayo, que comprende
anticuerpos dirigidos contra moléculas marcadoras fijadas en perlas,
membranas o microesferas.
Los dispositivos de ELISA pueden ser de
cualquier clase conocida por los expertos en la materia. Estos
dispositivos comprenden dispositivos para formatos de ELISA tipo
sándwich, para formatos de ELISA competitivos y otros formatos de
ELISA.
En una realización, el dispositivo de
diagnóstico in vitro puede comprender un medio de lisis para
la solubilización de la muestra. En otra realización, el dispositivo
de diagnóstico in vitro comprende reactivos para detectar una
molécula marcadora especifica fijada a fases sólidas y reactivos que
no son de detección de otras especificidades fijados en las fases
sólidas.
Los dispositivos de ensayo de flujo lateral para
usar como un dispositivo de diagnóstico in vitro son
cualquier dispositivo de ensayo de flujo lateral que use al menos un
reactivo que se une a la molécula marcadora fijada a una fase
sólida. Dichos dispositivos pueden usar diferentes mecanismos para
visualizar el resultado de ensayo. En algunas realizaciones, los
ensayos pueden usar reactivos de detección secundarios dirigidos
contra moléculas marcadoras u otros componentes que participan en el
ensayo acoplados a los restos detectables. Los restos detectables
pueden comprender oro coloidal, partículas de látex (coloreadas) y
otros.
Los dispositivos de flujo lateral para usar en
la presente invención pueden comprender dispositivos basados en
capilares o en piezas porosas (tales como membranas, perlas u otras
disposiciones tridimensionales de las sustancias porosas).
Dependiendo de la realización, es necesario ajustar el tamaño de los
poros o capilares para asegurar condiciones de flujo óptimas.
Los kits y dispositivos de diagnóstico in
vitro pueden estar dirigidos al uso con cualquier tipo de
muestra corporal solubilizada. En la presente invención, el
procedimiento de diagnóstico descrito en el presente documento está
dirigido al uso solo con muestras de LBC. En este caso, el kit o el
dispositivo de diagnóstico in vitro se puede desarrollar y
fabricar para analizar muestras de LBC solublizadas como un ensayo
adjunto o conjunto al análisis citológico o como un ensayo
único.
Los formatos aplicables para las reacciones de
detección aplicadas en los kits y dispositivos de diagnóstico in
vitro de acuerdo con la presente invención, pueden ser técnicas
de transferencia, tales como transferencia Western, transferencia
southern, transferencia northern. Las técnicas de transferencia son
conocidas para los expertos en la materia y se pueden realizar, por
ejemplo, como electrotransferencias, transferencias semisecas o
transferencias en manchas. Además, se pueden aplicar procedimientos
inmunológicos para detectar moléculas, tales como por ejemplo
inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos, tales como EIA, ELISA,
RIA, ensayos de flujo lateral, ensayos de flujo continuo, tiras
inmunocromatográficas, etc. Los inmunoensayos para usar en la
invención pueden comprender inmunoensayos competitivos así como no
competitivos.
Los procedimientos de ensayo para los cuales se
aplicarán los kits y dispositivos de diagnóstico in vitro de
acuerdo con la presente invención, incluyen detectar los niveles de
moléculas marcadoras características de afecciones de relevancia
médica en la muestra de ensayo basándose en el análisis bioquímico
no basado en células. Los marcadores adecuados para estos
procedimientos de ensayo de acuerdo con la presente invención pueden
ser de diferentes orígenes. El patrón de expresión de un marcador,
que es adecuado para la detección de las afecciones de relevancia
médica en cuestión, puede depender del estado proliferativo de las
células, del estado de diferenciación, del tipo de célula o del
organismo.
\newpage
El procedimiento para desarrollar kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro como se detalla en el
presente documento, usa muestras de LBC de una forma que es adecuada
para recoger datos sobre las características de rendimiento del kit
o dispositivo que se está desarrollando. En general, se usan
muestras de LBC como una fuente de muestras corporales para usar en
el transcurso del desarrollo del kit o dispositivo de diagnóstico
in vitro. En una realización de la presente invención, la
muestra de LBC se suministra como una muestra sobrante, de la que se
ha preparado una muestra citológica a partir de la muestra de LBC
antes, durante o después de usar partes de la muestra de LBC para el
procedimiento de desarrollo de acuerdo con la presente invención. En
otra realización, la muestra de LBC se ha obtenido solo para el
propósito de usarla en un procedimiento de desarrollo de acuerdo con
la presente invención. En este caso, se puede haber obtenido una
segunda y quizás una tercera muestra de LBC o incluso una muestra
preparada por procedimientos no de capa fina convencionales para la
evaluación citológica, antes o después de la toma de muestra de la
respectiva muestra de LBC usada en el procedimiento de desarrollo de
acuerdo con la presente invención.
En otra realización de la presente invención, la
muestra corporal se puede purificar además antes de Usarla. Dichos
procedimientos de purificación pueden comprender, por ejemplo, el
arrastre por lavado de contaminantes tales como moco o similares,
separación o concentración de componentes celulares, conservación y
transporte de las células. En una realización, por ejemplo, las
células se pueden separar mediante citometría de flujo u otras
formas adecuadas de clasificación celular conocidas para los
expertos en la materia. Por lo tanto, los componentes celulares de
las muestras brutas están incluidos en una sola disolución de
muestra.
La invención se ilustra además con los
siguientes ejemplos, que no debe considerarse que limitan el alcance
de la invención a los procedimientos específicos descritos en los
mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 (ejemplo de
referencia)
Se sometieron 33 extensiones cervicouterinas
suministradas en un medio de lisis, a la detección basada en ELISA
de la sobreexpresión del inhibidor de quinasa dependiente de ciclina
p16^{INK4a} en disoluciones preparadas a partir de células
contenidas en las extensiones. El ensayo de ELISA se llevó a cabo
como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Los cepillados de extensiones cervicouterinas se
dieron en recipientes de 15 mi, que contenían 2 mi de medio de lisis
mtm (Tritón X-100 al 2%, SDS al 0,4%, PMSF 0,6 mM en
PBS). Las células cervicouterinas presentes en el cepillado se
Usaron durante al menos 20 h. Los Usados de las muestras de
extensiones cervicouterinas después se transfirieron a tubos de 2 mi
y se centrifugaron a 4ºC (15 min a 28.000 x g (16.600 rpm,
Centrifuga de alta velocidad JEC Multi RF)). El liquido sobrenadante
se transfirió a un tubo nuevo. El liquido sobrenadante se puede
almacenar a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La disolución madre del clon E6H4 de mtm
anticuerpo específico de p16^{INK4a}, se diluyó en PBS para dar la
disolución de recubrimiento lista para usar.
Se añadieron 50 \mul de disolución de
recubrimiento a cada pocillo de las placas de ELISA.
Para el recubrimiento, las placas se incubaron
durante la noche a 4ºC.
La disolución de recubrimiento se eliminó de las
placas de ELISA y las placas se lavaron usando un lavador de ELISA
automático como sigue:
- 7 x 250 \mul de tampón de lavado (Tween 20
al 0,1% (v/v) en PBS)
después de eliminar los sobrantes del tampón de
lavado, se añadieron a cada pocillo 300 \mul de tampón de bloqueo
(BSA al 2% en PBS). Las placas se incubaron durante 1 h en un
dispositivo de balanceo a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de eliminar el tampón de bloqueo, se
añadieron 100 \mul de muestra de células Usadas a cada pocillo. Se
usaron como control positivo Usados de células HeLa;
Con el fin de calibrar el ensayo, se incluyeron
en el ensayo diferentes concentraciones de la proteína p16^{INK4a}
recombinante (0 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 400 pg/ml, 800
pg/ml).
Las células se incubaron durante 1 h a
temperatura ambiente.
Después se llevó a cabo el lavado en un lavador
de ELISA automático como sigue.
- 7 x 250 \mul de tampón de lavado. Se eliminó
el tampón que quedaba.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó disolución de trabajo del clon de
anticuerpo secundario biotinilado D7D7 de mtm específico para la
proteína p16^{INK4a} por dilución de la disolución madre.
Se añadieron 100 \mul de disolución de trabajo
a cada pocillo. Después de incubar durante 1 h a t.a., se eliminó la
disolución de anticuerpo y las placas de ELISA se lavaron en un
lavador de ELISA automático
- 7 x 250 \mul de tampón de lavado
\vskip1.000000\baselineskip
Se prediluyeron polímeros de
estreptavidina-HRP (1 mg/ml) hasta 1:10. (4 \mul +
36 \mul de tampón de incubación). La disolución de incubación
final se preparó por dilución 1:300 en tampón de incubación (BSA al
0,1% en PBS) hasta una concentración final de 0,33 \mug/ml.
Se añadieron \mul de esta disolución a cada
pocillo y se incubaron durante 1 h a t.a.
Después, se eliminó el tampón y las placas se
lavaron manualmente con 200 \mul de tampón de lavado por pocilil,
5 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
El sustrato TMB se equilibró a 25ºC durante 1 h
en la oscuridad.
Se añadieron 100 \mul de disolución de
sustrato a cada pocillo.
Las placas de ELISA se incubaron a 25ºC durante
exactamente 15 min en la oscuridad. Después, la reacción se detuvo
por adición de 80 \mul de H_{2}SO_{4} 2,5 M.
A los 5 min después de detener la reacción, se
determinó la DO a 450 nm. Después de evaluar los resultados, cada
muestra devolvió un valor para la DO.
Los resultados de este experimento se dan en la
Tabla 4. Los resultados del ELISA se compararon con los resultados
del diagnóstico de un ensayo de Papanicolau (ensayo PAP, citología
cervicouterina) de los mismos pacientes. La citología cervicouterina
se evaluó de acuerdo con la Clasificación de Munich II (1990). Pap
II abarca células benignas, cervicitis y metaplasia, Pap IV abarca
displasia grave y carcinoma in situ. Resultó que las muestras
que devolvían una DO mayor que 0,9 en el ELISA correspondían a
muestras que se clasifican como displásicas por el ensayo PAP
citológico convencional.
Aplicando una DO de 0,9 como umbral para la
evaluación de las muestras, los resultados de ELISA se pueden
describir como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de ELISA es positivo en todas las
muestras (100%) de mujeres que tienen displasia grave y es negativa
en las 30 muestras (100%) de mujeres que no tienen displasia.
Usando el umbral evaluado en estos experimentos,
se ensayaron muestras citológicas de 300 pacientes en el formato de
ensayo ELISA presentado. En estos experimentos, las muestras
identificadas como displásicas por examen citológico también se
pueden identificar como displásicas en el formato de ensayo
ELISA.
Los resultados muestran que la cuantificación de
la proteína p16^{INK4a} en muestras solubilizadas de pacientes
permiten detectar displasias en las muestras. El diagnóstico en el
presente ejemplo se basa en la comparación del nivel de
p16^{INK4a} determinado en una muestra de paciente específico, con
el nivel que se sabe que está presente en muestras normales no
displásicas. La comparación se lleva a cabo en el formato de ensayo
aplicando un valor umbral para la DO determinada en el ELISA
anterior, por encima del cual la muestra se clasifica como
positiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Nueve extensiones cervicouterinas suministradas
en disol ución de PreservCyt (Cytyc Corporation, Boxborough, MA) se
han sometido a ensayo de PAP convencional y simultáneamente a
detección basada en flujo lateral de la sobreexpresión del inhibidor
de quinasa dependiente de ciclina p16^{INK4a} en disoluciones
preparadas a partir de suspensiones celulares obtenidas de las
extensiones. El ensayo de flujo lateral se llevó a cabo como
sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
10 mi de suspensiones celulares de muestras de
extensiones cervicouterinas individuales proporcionados como
materiales fijados en PreservCyt^{TM} se transfirieron a un
recipiente de reacción de 15 mi. Las muestras se centrifugaron 15
min a temperatura ambiente a 1500 x g (3000 rpm, Heraeus Varifuge,
rotor 8074); se descartó el liquido sobrenadante y el metanol
restante se dejó evaporar (15 min a temperatura ambiente); el
sedimento se solubilizó en 500 \mul de tampón de lisis y se
transfirió a un recipiente de reacción de 1,5 mi. La disolución se
centrifugó a 4ºC (15 min a 28000 x g (16600 rpm Microcentrifuge
Biofuge fresco)); el liquido sobrenadante se transfirió a un tubo
reciente. El liquido sobrenadante se almacenó a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyó disolución madre del anticuerpo
específico de p16^{INK4a} el clon E6H4 de mtm en TBS (que contenía
albúmina de suero bovino al 1%) para dar una disolución de
aplicación en manchas puntuales lista para usar con una
concentración final de 1 mg de anticuerpo/ml. La disolución lista
para usar se aplicó en manchas puntuales sobre una membrana de
nitrocelulosa con 30 \mul/30 cm. Se unieron mechas Whatman a un
extremo de la nitrocelulosa y las tiras reactivas se secaron durante
1 hora a 37ºC. Después se dejaron equilibrar a temperatura ambiente
y se cortaron en tiras reactivas de 4 mm de anchura.
\vskip1.000000\baselineskip
La disolución madre del anticuerpo específico de
p16^{INK4a} el clon D7D7 de mtm, conjugado con oro coloidal
(tamaño de partículas 40 nm) se diluyó en TBS (que contenía albúmina
de suero bovino al 1%) para dar la disolución de anticuerpo de
detección lista para usar con una concentración final de DO 1,0 a
520 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Después se añadieron 20 \mul de las muestras
de células Usadas a 20 \mul de disolución de anticuerpo de
detección lista para usar en un pocillo de microvaloración y se
mezcló. Se añadió al pocillo la tira reactiva recubierta con el
anticuerpo de captura el clon E6H4, la muestra se sumergió y se
llevó hasta completarse. La señal se leyó mientras la tira reactiva
todavía estaba húmeda.
\vskip1.000000\baselineskip
En el formato de ensayo de los autores de la
invención, 2 muestras (muestras 1 y 2) clasificadas como PAP IV por
tinción de PAP y que por lo tanto contenían células displásicas,
dieron bandas púrpuras claramente visibles en la zona del anticuerpo
de captura aplicado en manchas puntuales. En contraste, no se
detectó blanda en las otras 7 muestras (muestras
3-9), clasificadas como PAP II-III
por tinción de PAP y que por lo tanto no contenían células
displásicas.
Se llevó a cabo el ELISA por los mismos
protocolos dados en el Ejemplo 1. Los resultados se dan en la tabla
5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La invención y la forma y procedimiento para
hacerla y usarla, ahora están descritos en términos completos,
claros, concisos y exactos de forma que cualquier experto en la
materia a la que pertenece pueda hacer y usar la misma. Hay que
entender que lo anterior describe realizaciones preferidas de la
presente invención, y que se pueden hacer modificaciones en la misma
sin salirse del alcance de la presente invención como se expone en
las reivindicaciones. Para señalar en particular y reivindicar de
forma inconfundible el objeto referido como invención, las
siguientes reivindicaciones concluyen esta memoria descriptiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron muestras cervicouterinas de 50
individuos para este análisis. Para cada individuo se obtuvieron dos
muestras, en disolución una en medio Universal Collection y otra en
PreservCyt^{TM}. Ambas muestras se obtuvieron durante la misma
sesión de examen. Para cada uno de los individuos habla disponible
un diagnóstico basado en un análisis de una muestra cervicouterina
en capa fina preparada a partir de la disolución en
PreservCyt^{TM}. Se escogieron 20 muestras incluidas en el
presente estudio para diagnosticar como NILM, se escogieron 20
muestras para ser LSIL y 10 muestras se escogieron para ser HSIL. De
todas las muestras se ha determinado el nivel de transcritos de
p16^{INK4a} y p14^{ARF} a nivel del ARNm por
RT-PCR de acuerdo con el siguiente protocolo: Para
realizar el análisis, las células se sedimentaron de las
disoluciones en UCM y PreservCyt^{TM} por centrifugación. Los
sedimentos obtenidos se sometieron directamente al procedimiento de
preparación de ARN.
El sedimento se diluyó y se volvió a suspender
en tampón de RLT listo para usar. Después de añadir etanol al 70% al
Usado homogeneizado, la suspensión se mezcló mediante pipeta.
La purificación y el aislamiento del ARN se
llevó a cabo usando columnas de centrifugación QIAamp de acuerdo con
las directrices del fabricante.
La concentración de ARN se determinó por
fotometría a 260 nm. Para la reacción de la transcriptasa inversa se
usaron de 100 ng hasta 500 ng de ARN. El ADN de degradó por reacción
con DNasa como sigue:
17,0 \muL de ARN (6-30
ng/\mul)
1,0 \mul de DNAsa I calidad Amp (1
Unidad/\mul) (Invitrogen)
2,0 \mul tampón de reacción de DNAsa (10x)
(Invitrogen)
20,0 \mul de volumen total
La incubación se llevó a cabo durante 15 min a
25ºC y la reacción se detuvo por adición de 2 pl de EDT? 25 mM e
incubación durante 10 min a 65ºC.
La síntesis del ADNc se realizó usando el
volumen total de la digestión por DNasa usando la transcriptasa
inversa de Omniscript en presencia de RNasin.
La reacción se llevó a cabo durante 2 h a 37ºC y
posteriormente 5 min a 93ºC. Después la mezcla se almacenó a 4ºC.
Para usar en la RT-PCR, la mezcla de reacción de 40
\mul de ADNc se diluyó con 30 \mul de agua exenta de RNasa hasta
un volumen de 70 \mul. Esto dio una disolución de ADNc lista para
usar para la PCR-Taqman con una concentración
aproximada de ADNc de aproximadamente 7-36 ng/5
\mul. Los cebadores usados eran:
Cebador de p16^{INK4a}, directo:
5'-CGA ATA GTT ACG GTC GGA GG-3'
Cebador de p16^{INK4a}, inverso.
5'-ACC AGC GTG TCC AGG AAG-3'
Cebador de p14^{ARF}, directo:
5'-CCG CCG CGA GTG AGG GTT-3'
Cebador de p14^{ARF'}, inverso.
5'-TGC CCA TCA TCA TGA CCT GGT
CT-3'
Como controles se llevaron a cabo reacciones de
PCR para la \beta-actina y GAPDH usando los
cebadores:
Cebador (63) de \beta-Actina,
directo: 5'-CCT AAA AGC CAC CCC ACT TCT
C-3'
Cebador (64) de \beta-Actina,
inverso: 5'-ATG CTA TCA CCT CCC CTG TGT
G-3'
Cebador de GAPDH, directo:
5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'
Cebador de GAPDH, inverso:
5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Cada cebador se usó con una concentración de 300
nmol. La mezcla de reacción para la RT-PCR estaba
compuesta como sigue:
12,5 \mul de SYBR-Umix
0,25 \mul de mezcla de cebadores
7,25 \mul de agua para biología molecular
5,0 \mul de disolución de ADNc
25,0 \mul de volumen total
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones para la etapa 2 de la PCR en
tiempo real son:
1ª etapa: 50ºC 2 min, 95ºC 10 min
2ª etapa: 95ºC 15 s, 60ºC 1 min 10 s, 40
ciclos
\vskip1.000000\baselineskip
La evaluación de los resultados de la
RT-PCR se llevó a cabo calculando el grado de
sobreexpresión de los transcritos de p16^{INK4a} basándose en el
nivel de transcritos detectados en las muestras de ensayo comparado
con los niveles de transcritos presentes en las muestras de células
o tejido normales. Se llevó a cabo la normalización con respecto al
nivel de genes de mantenimiento detectados en cada muestra, para los
niveles de p14^{ARF} antes del análisis de la sobreexpresión. Una
sobreexpresión de 0 a 24 veces comparado con el tejido normal se
consideró como no relevante. Sólo los niveles de sobreexpresión de
p16^{INK4a} y p14ärf mayores que 24 veces se consideraron como
niveles de transcritos significativamente elevados en las muestras.
Debe observarse que este esquema para la evaluación es sólo uno de
los varios procedimientos igualmente adecuados. Los expertos en la
materia saben cómo se pueden usar los resultados de la
RT-PCR para calcular los niveles de transcritos y
hacer correlaciones con los parámetros clínicos de las muestras. El
umbral mencionado en este ejemplo es ilustrativo y puede variar
dependiendo de las condiciones.
Los valores obtenidos de la muestra en UCM de
una muestra y de la correspondiente muestra en PreservCyt^{TM}
dieron los mismos resultados.
Una comparación del nivel de transcrito
detectado con el diagnóstico de la muestra de citología
correlacionada mostró una buena correlación entre niveles de
transcrito elevados y la presencia de lesiones cervicouterinas
basándose en las muestras citológicas en capa fina.
\newpage
La correlación era la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento muestra que un procedimiento para
detectar el nivel de transcrito de p16^{INK4a} y p14^{ARF} en
muestras cervicouterinas Usadas es adecuado para evaluar el
diagnóstico de lesiones cervicouterinas y sus precursores. Las
disoluciones de conservación de células ensayadas resultaron ser
igualmente adecuadas para el procedimiento descrito. Los niveles de
transcritos de ambos genes ensayados se pueden usar para contribuir
a la evaluación del diagnóstico de neoplasia intraepitelial
cervicouterina, en la que p16^{INK4a} muestra resultados
ligeramente mejores que p14^{ARF}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron cada una de las 10 muestras de LBC en
disolución de PreservCyt^{TM} o CytoLyt^{TM} respectivamente de
las extensiones cervicouterinas de individuos con lesión HSIL
diagnosticada, de esputo de individuos con cáncer de pulmón de
células pequeñas y de extensiones de la cavidad oral de individuos
con cáncer de la cavidad oral, para cada una de las moléculas
marcadoras en el presente ejemplo. Para las muestras cervicouterinas
y orales se llevó a cabo un análisis por captura de híbridos de la
presencia de tipos de hrHPV y de transcritos de p16^{INK4a} y
p14^{ARF}. La captura de híbridos para los tipos de hrHPV se
realizó usando el ensayo de HybridCaptrue hc2 de Digene Corp. El
análisis de captura de híbridos para los transcritos de los
inhibidores de quinasa dependientes de ciclina nombrados se llevó a
cabo como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el presente ejemplo, la cantidad de muestra
de LBC dependía del contenido de células de la muestra de LBC. Se
preparó una muestra en capa fina de cada una de las muestras usando
un procesador Cytyc ThinPrep^{TM}. La masa de la muestra de LKBC
se determinó antes y después de preparar la muestra en capa fina.
Puesto que el procesador ThinPrep^{TM} consume tras cada
procesamiento solo la cantidad de muestra necesaria para una
densidad celular especifica en el filtro, el volumen consumido es
una medida de la concentración relativa de células en la muestra de
LBC. En el presente ejemplo de cada LBC se aplicó dos veces la masa
consumida para preparar la muestra en capa fina por el procesador
ThinPrep^{TM} para el análisis de captura de híbridos (Se
excluyeron las muestras para las que la celularidad de las muestras
de LBC era demasiado baja).
Para llevar a cabo el análisis, las células se
sedimentaron a partir de disoluciones en CytoLyt^{TM} y
PreservCyt^{TM} por centrifugación.
Los sedimentos obtenidos se sometieron
directamente al procedimiento de preparación de ARN.
El sedimento se diluyó y se volvió a suspender
en tampón de RLT listo para usar. Después de añadir etanol al 70% al
lisado homogeneizado, la suspensión se mezcló mediante pipeta.
La purificación y aislamiento del ARN se llevó a
cabo usando columnas de centrifugación QIAamp de acuerdo con las
directrices del fabricante.
Para detectar el ARNm de p16^{INK4a} se usó
una mezcla de sondas de oligonucleótidos de ADN de 40 nucleótidos
específicas para p16^{INK4a} y p14^{ARF}. Las sondas más
adecuadas en la mezcla tenían las siguientes secuencias:
p14^{ARF}:
Es ventajoso poner las sondas en el borde entre
el exón 1\beta y el exón 2 del ARNm para asegurar que las sondas
solo reconocen el ARNm específico para p14^{ARF} (Nota: la
situación es similar para las condiciones de PCR específicas para
p16^{INK4a} y p14^{ARF} respectivamente; las parejas de
cebadores se podían seleccionar para cubrir el límite del exón en el
amplificado). Se pueden usar de la misma forma cualquier sonda que
reconozca específicamente el ARNm de p14^{ARF}. Las sondas
descritas en este ejemplo se usan como un ejemplo y no se pretende
que restrinjan el alcance de la invención. La secuencia de la sonda
que comprende las secuencias anteriores o fragmentos de las mismas
se puede usar igualmente para un procedimiento como se describe en
el presente documento.
Para p16^{INK4a} las secuencias de sondas
prometedoras son las siguientes:
Igual que la situación con p14^{ARF}, para
p16^{INK4a} las sontas se ponen preferiblemente para que se
superpongan con el limite del exón, del exón la al exón 2. Este
suministro puede asegurar que p16^{INK4a} es reconocido y no se
transcriben otros ARNm del locus de INK4. Además, los comentarios
dados para las sondas para p14^{ARF} se aplican aquí con los
cambios correspondientes. La mezcla de sondas marcada se añade al
extracto de ARN celular total. Para la hibridación, la mezcla se
incubó a 65ºC durante 30 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Para detectar los híbridos de
ARN-ADN, se usaron placas de microvaloración
recubiertas con anticuerpos anti-híbrido de ARN/ADN
disponibles en Degene Corp. La disolución de la hibridación se
añadió directamente a las placas de microvaloración y se incubaron
durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. La detección se llevó a cabo
usando el anticuerpo anti-híbrido de ARN/ADN
secundario y los reactivos de detección proporcionados por Degene
Corp.
El ensayo de captura de híbridos puso de
manifiesto resultados positivos para p16^{INK4a} para todas las
muestras cervicouterinas. Este resultado estaba de acuerdo con todas
las muestras cervicouterinas que eran positivas para hrHPV por la
captura de híbridos. Aproximadamente la mitad de las muestras de
cáncer de la cavidad oral en el ensayo dieron sobreexpresión de
p16^{INK4a}. En todas estas muestras que eran positivas para
p16^{INK4a} se ensayó hrHPV por hac2. Había una correlación
significativa entre el resultado positivo de HPV y la sobreexpresión
de p16^{INK4a} en el cáncer de la cavidad oral. Para el cáncer de
pulmón de células pequeñas, se pudo detectar pl6 como positivo en 8
de los 10 casos ensayados. Todos los resultados para p16^{INK4a}
obtenidos por el ensayo de captura de híbridos se pudieron confirmar
por ensayo inmunocitoquímico de las muestras en capa fina.
Para p14^{ARF} los resultados para las
muestras cervicouterinas eran comparables a los de p16^{INK4a}.
Para el cáncer de pulmón de células pequeñas, solo 2 de los 10 casos
que se investigaban mostraron resultado positivo para p14^{ARF} en
la captura de híbridos. Este resultado se pudo confirmar por
inmunocitoquímica. En las muestras de LBC de la cavidad oral,
p14^{ARF} se pudo detectar en 7 de los 10 casos en concordancia
con los resultados inmunocitoquímicos.
Los resultados muestran que la detección de
inhibidores de quinasa dependientes de ciclina en un formato de
ensayo de captura de híbridos de muestras de LBC se puede usar para
evaluar el diagnóstico de varias entidades de cáncer. Los resultados
sugieren que los ensayos bioquímicos se podrían usar como un ensayo
adjunto o conjunto del ensayo citológico.
\vskip1.000000\baselineskip
10 extensiones cervicouterinas con una
clasificación citológica de HSIL, 10 muestras de esputo con cáncer
de pulmón de células pequeñas diagnosticado por citología, 10
muestras de orina de individuos con tumores de vejiga diagnosticados
y 10 aspirados con aguja fina de individuos con CDIS diagnosticado,
todos en medio PreservCyt^{TM} se sometieron a centrifugación de
las células y posterior solubilización de las células en un medio de
lisis. Después se llevó a cabo la detección basada en ELISA del
nivel de expresión del inhibidor de quinasa dependiente de ciclina
p16^{INK4a}, de p14^{ARF} y de HER-2/Neu en
disoluciones preparadas a partir de las células contenidas en las
exten-
siones.
siones.
El ensayo ELISA se realizó como sigue:
Se centrifugaron 10 mi de cada muestra de LBC
para dejar que las células sedimentaran. El sedimento celular
[tiempo] se disolvió en 700 \mul de medio de lisis, el tampón de
lisis de mtm (Tritón X-100 al 2%, SDS al 0,4%, PMSF
0,6 mM en PBS) mediante mezcla y se incubó durante 10 min a 80ºC.
Los Usados de las muestras de LBC después se centrifugaron a 4ºC (15
min a 28.000 x g (centrifuga de alta velocidad de 16.600 rpm JEC
Multi RF)); el liquido sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo.
El liquido sobrenadante se puede conservar a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada proteína se prepararon como sigue
placas de ELISA separadas. Se diluyeron disoluciones madre de los
anticuerpos primarios específicos para p16^{INK4a}, p14^{ARF} y
HER-2/Neu en PBS para dar la disolución de
recubrimiento lista para usar.
Para p16^{INK4a} se usó el clon E6H4 de mtmt
para recubrir las placas de ELISA. Para p14^{ARF} se usó
anticuerpo policlonal dirigido contra p14^{ARF} disponible en
Calbiochem. Para Her-2/Neu se usó para el
recubrimiento anticuerpo policlonal de DakoCytomation.
Se añadieron a cada pocillo de las placas de
ELISA 50 \mul de la disolución de recubrimiento.
Para el recubrimiento, las placas se incubaron
durante la noche a 4ºC.
La disolución de recubrimiento se retiró de las
placas de ELISA y las placas se aclararon usando un lavador de ELISA
automático como sigue:
- 7 x 250 \mul de tampón de lavado (Tween20 al
0,1% (v/v) en PBS), después de eliminar los sobrantes del tampón de
lavado, se añadieron a cada pocillo 300 \mul de tampón de bloqueo
(BSA al 2% en PBS). Las placas se incubaron durante 1 h en un
dispositivo de balanceo a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de eliminar el tampón de boqueo, se
añadieron a cada pocillo 100 \mul de la muestra de células
lisadas. Con el fin de calibrar el ensayo, se incluyeron en cada uno
de los ensayos diferentes concentraciones de proteínas recombinantes
(0 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 400 pg/ml, 800 pg/ml).
Las muestras se incubaron durante 1 h a
temperatura ambiente.
Después se llevó a cabo el lavado en un lavador
de ELISA automático como sigue:
- 7 x 250 \mul de tampón de lavado. Se retiró
el tampón sobrante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó disolución de trabajo de los
anticuerpos secundarios biotinilados específicos para las proteínas
respectivas por dilución de la disolución madre. Para p16^{INK4a}
se aplicó el clon D7D7 de mtmt, para p14^{ARF} se aplicó el
anticuerpo monoclonal de Calbiochem y para Her-2/Neu
se usó el anticuerpo monoclonal de DakoCytomation.
Se añadieron 100 \mul de disolución de trabajo
a cada pocillo. Después de incubar durante -1 h a t.a., se eliminó
la disolución de anticuerpo y las placas de ELISA se lavaron en un
lavador de ELISA automático
- 7 x 250 \mul de tampón de lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prediluyeron polímeros de
estreptavidina-HRP (1 mg/ml) hasta 1:10. (4 \mul +
36 \mul de tampón de incubación). La disolución de incubación
final se preparó por dilución 1:300 en tampón de incubación (BSA al
0,1% en PBS) hasta una concentración final de 0,33 \mug/ml.
Se añadieron 100 \mul de esta disolución a
cada pocillo y se incubaron durante 1 h a t.a.
Después, se eliminó el tampón y las placas se
lavaron manualmente con 200 \mul de tampón de lavado por pocillo,
5 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
El sustrato TMB se equilibró a 25ºC durante 1 h
en la oscuridad.
Se añadieron 100 \mul de disolución de
sustrato a cada pocillo.
Las placas de ELISA se incubaron a 25ºC durante
exactamente 15 min en la oscuridad. Después, la reacción se detuvo
por adición de 80 \mul de H_{2}SO_{4} 2,5 M.
A los 5 min después de detener la reacción, se
determinó la DO a 450 nm. Después de evaluar los resultados, cada
muestra devolvió un valor para la DO. Para cada anticuerpo se
determinó una DO umbral usando el valor visto para el valor de
fondo.
Los resultados de ELISA se compararon con los
resultados diagnosticados de la evaluación citológica de las
muestras de los mismos individuos. Los resultados son los
siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Resultó que para p16^{INK4a} en 100% de los
casos ensayados había una buena correlación entre el patrón de
tinción de p16^{INK4a} evaluado por citología y el resultado
positivo de p16^{INK4a} en un formato de ensayo ELISA usando
muestras solubilizadas en preservCyt^{TM} para el análisis. Para
p14^{ARF} la correlación era de 93%. Para
Her-2/Neu se detectó una correlación de más de 90%
entre la detección inmunocitoquímica de la sobreexpresión y el
resultado positivo en el formato ELISA.
Los resultados de los ejemplos anteriores
muestran que el formato de ensayo bioquímico usando muestras de LBC
solubilizadas se puede aplicar en las mismas muestras que para el
análisis inmunocitoquímico. Puesto que el ensayo bioquímico consume
solo una fracción de la muestra de LBC, se puede aplicar fácilmente
como un análisis adjunto al inmunocitoquímico.
Hay una buena correlación entre los resultados
inmunocitoquímicos y los resultados de ELISA. Esto muestra que el
procedimiento de acuerdo con la presente invención es adecuado para
evaluar el diagnóstico en diferentes tipos de afecciones de
relevancia médica en las que actualmente se aplica la citología en
liquido, sea como un ensayo adjunto o conjunto, o cuando sea posible
como el único ensayo de diagnóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron 20 muestras de LBC de células de orina
en CytoLyt^{TM} para el presente ejemplo. Se llevó a cabo la
RT-PCR de la misma forma dada en el ejemplo 3. El
análisis de proteínas se llevó a cabo en un formato de ensayo en
tira como se da en el ejemplo 2 y en paralelo en un formato de ELISA
como se da en el ejemplo 1. Los procedimientos experimentales se
llevaron a cabo como se dan en estos ejemplos. Se pudo mostrar que
MCM-5 se podía detectar más fácilmente en Usados de
muestras de LBC de orina. Los resultados obtenidos por el ensayo
bioquímico no basado en células del nivel de proteínas así como de
ácidos nucleicos se corresponden bien con los resultados obtenidos
de la citología. En la citología, se usó la tinción
inmunocitoquímica para la proteína MCM-5 como ayuda
para la evaluación del diagnóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el autor
de la solicitud es sólo para la conveniencia del lector. No forma
parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido mucho
cuidado al recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u
omisiones y la EPO rechaza cualquier responsabilidad en este
aspecto.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet WO 0208764 A
- \bullet WO 9904265 A2
- \bullet WO 03057914 A
- \bullet WO 0149716 A2
- \bullet WO 9929890 A, Brule
- \bullet WO 0055633 A2
- \bullet EP 1388734 A
- \bullet WO 0142792 A2
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletBrule, van den y col. J.
Clin. Microbiol, 1990, vol. 28/12,
2739-2743
\bullet Tumors of the Cervix, Vagina, and
Vulva. Kurman, R.; Norris, H. y col. Atlas of Tumor
Pathology. AFIP, 1992
\bullet World Health Organization
Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumors of the
Digestive System. IARC Press, 2000
\bulletColby TV y col. Tumors of
the Lower Respiratory-Tract, Atlas of Tumor
Pathology. AFIP, 1995, vol. 13
\bulletSerrano, M. y col.
Nature, 16 de diciembre, 1993, vol. 366 (6456),
704-7
Claims (8)
1. Un procedimiento para evaluar el diagnóstico
de un tumor seleccionado del grupo que consiste en tumores del
tracto anogenital, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del
tracto respiratorio y tumores del sistema urinario a partir de
muestras solubilizadas de citología en liquido (CBC) que consiste en
las etapas de
a. detectar la presencia o ausencia y/o el nivel
de un polipéptido marcador seleccionado del grupo de p16^{INK4a},
claudina, Ki67, KiS1, PCNA MCM-2,
MCM-5, CDC-6,
Her-2/Neu, ciclina E y un polipéptido del HPV
derivado de un gen del HPV seleccionado del grupo que consiste en
HPV L1, HPV L2, HPV El, HPV E2, HPV E4, HPV E5, HPV E6 y HPV E7;
b. comparar la presencia o ausencia y/o el nivel
de dicho polipéptido marcador con la presencia o ausencia y/o el
nivel conocido como característico de una muestra corporal sana no
patológica; y
c. evaluar el diagnóstico del tumor basado en la
presencia o ausencia y/o el nivel de dicho polipéptido marcador en
las células contenidas en la muestra de LBC comparado con una
muestra corporal sana no patológica.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el tumor del tracto anogenital es cáncer de cuello de útero,
neoplasia intraepitelial cervicouterina o carcinoma de cuello de
útero in situ.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el tumor del tracto gastrointestinal es cáncer de colon,
cáncer del duodeno, cáncer pancreático, cáncer esofágico, cáncer de
hígado, cáncer del sistema biliar o cáncer del ano o recto.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el tumor del tracto respiratorio es cáncer de pulmón, cáncer
de los alveolos, cáncer del árbol bronquial, cáncer del espacio
nasofaríngeo, cáncer de la cavidad oral, cáncer de pulmón, cáncer de
pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón adenoescamoso,
mesotelioma, tumor carcinoide del pulmón o tumor de las glándulas
bronquiales.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el tumor del sistema urinario es cáncer de vejiga, cáncer de
riñón, cáncer de pelvis renal, cáncer de los uréteres o cáncer de la
uretra.
6. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la
detección de un polipéptido marcador se lleva a cabo usando al menos
un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o minianticuerpo, específico
de dicho polipéptido marcador que se va a detectar.
7. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o
minianticuerpo está marcado de forma detectable.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el marcador se selecciona del grupo que
consiste en un radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un
compuesto quimioluminiscente, un compuesto electroluminiscente, un
compuesto fluorescente, un quelato de metal, una enzima o una
estructura de unión biológicamente relevante.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP03103218A EP1507148B1 (en) | 2003-08-25 | 2003-08-25 | Method for detecting carcinomas in a solubilized cervical body sample |
EP03103218 | 2003-08-25 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2342535T3 true ES2342535T3 (es) | 2010-07-08 |
Family
ID=33560881
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04104026T Active ES2342535T3 (es) | 2003-08-25 | 2004-08-20 | Procedimientol para detectar afecciones de relevancia medica en una muestra de lbc solubilizada. |
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---|---|
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EP (2) | EP1507148B1 (es) |
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Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7601497B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-10-13 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method |
EP1510820B1 (en) * | 2003-08-25 | 2010-03-17 | MTM Laboratories AG | Method for detecting medically relevant conditions in a solubilized LBC sample |
US7972776B2 (en) * | 2005-11-15 | 2011-07-05 | Oncohealth Corporation | Protein chips for HPV detection |
AU2007249242B2 (en) | 2006-05-11 | 2014-02-27 | Arbor Vita Corporation | Method of protein extraction from cells |
US8968995B2 (en) * | 2008-11-12 | 2015-03-03 | Oncohealth Corp. | Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers |
US20100003704A1 (en) * | 2008-06-13 | 2010-01-07 | Shuling Cheng | IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection |
US9207240B2 (en) | 2007-11-14 | 2015-12-08 | Arbor Vita Corporation | Method of efficient extraction of protein from cells |
EP2708894B1 (en) * | 2008-01-25 | 2016-07-06 | Berg LLC | Assay system for the assessment of oncogenicity, tumor progression, and treatment efficacy |
US20090204009A1 (en) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | Los Alamos National Security | Medical device system and related methods for diagnosing abnormal medical conditions based on in-vivo optical properties of tissue |
WO2010025928A1 (en) * | 2008-09-04 | 2010-03-11 | Mtm Laboratories Ag | Method for prediction of the progression risk of tumors |
US8288520B2 (en) * | 2008-10-27 | 2012-10-16 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and system |
CN101487845B (zh) * | 2009-02-19 | 2013-01-02 | 苏州海路生物技术有限公司 | 大便标本自动检测仪 |
EP2425019B1 (en) | 2009-05-01 | 2014-03-19 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample |
EP2427763A4 (en) * | 2009-05-07 | 2013-08-21 | Oncohealth Corp | IDENTIFICATION OF HIGH GRADE OR CIN2 FOR DETECTION, MONITORING AND DIAGNOSIS, AT EARLY STAGES AND ADVANCED STAGES, OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) AND HPV ASSOCIATED CANCERS |
EP2521914A4 (en) | 2010-01-08 | 2013-07-10 | Oncohealth Corp | CELL-BASED HPV IMMUNOTESTS HAVE A HIGH PERFORMANCE FOR DIAGNOSIS AND SCANNING OF HPV ASSOCIATED CANCER |
CN102822353A (zh) | 2010-01-29 | 2012-12-12 | 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 | 确定和确认样品中存在hpv的方法 |
EP2528932B1 (en) | 2010-01-29 | 2016-11-30 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
WO2011146629A2 (en) | 2010-05-19 | 2011-11-24 | Qiagen Gaithersburg Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
AU2011258501B2 (en) | 2010-05-25 | 2016-07-07 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes |
US9212387B2 (en) | 2010-06-17 | 2015-12-15 | National University Corporation Okayama University | Method for detection of genes targeted by microRNA |
GB201014335D0 (en) * | 2010-08-27 | 2010-10-13 | Forensic Science Service Ltd | Improvements in and relating to analysis |
WO2012031273A2 (en) | 2010-09-03 | 2012-03-08 | Stem Centrx, Inc. | Novel modulators and methods of use |
CN102033056B (zh) * | 2010-10-14 | 2012-05-30 | 中国科学院化学研究所 | 抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法 |
EP2678442B1 (en) | 2011-02-24 | 2019-01-16 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Materials and methods for detection of hpv nucleic acid |
BR112014011563B1 (pt) | 2011-11-15 | 2022-05-24 | University Of Miami | Método para determinar um risco aumentado de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (hnscc) em um indivíduo humano infectado com papiloma vírus humano (hpv), e kit |
RU2508542C1 (ru) * | 2012-07-16 | 2014-02-27 | Полина Михайловна Шварцбурд | Экспресс-способ определения риска злокачественности клеток |
RU2535071C1 (ru) * | 2013-04-09 | 2014-12-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ивановская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ диагностики недифференцированной дисплазии соединительной ткани у женщин с потерей беременности в анамнезе |
MX2016001439A (es) * | 2013-07-31 | 2016-07-05 | Univ Miami | Composiciones y metodos para identificar un riesgo de cancer en un sujeto. |
WO2015147370A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
RU2558987C1 (ru) * | 2014-04-21 | 2015-08-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ диагностики степени тяжести недифференцированной дисплазии соединительной ткани у женщин репродуктивного возраста |
EP3304082B1 (en) | 2015-06-08 | 2020-05-13 | Arquer Diagnostics Limited | Methods for analysing a urine sample |
EP4060344A1 (en) | 2015-06-08 | 2022-09-21 | Arquer Diagnostics Limited | Methods and kits |
CN106610434A (zh) * | 2016-02-26 | 2017-05-03 | 弗雷米德生物医药技术(天津)有限公司 | 一种hpv16型e7蛋白的elisa检测试剂盒 |
RU2680930C2 (ru) * | 2017-03-24 | 2019-02-28 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ забора материала для цитологического исследования при опухолевых заболеваниях поджелудочной железы, печени и желчевыводящих путей |
CN107748265A (zh) * | 2017-09-29 | 2018-03-02 | 中南大学湘雅医院 | Cdc6和ki67在制备癌症放疗抵抗的诊断标记物中的应用 |
CN111526889B (zh) * | 2017-12-29 | 2023-06-02 | 沃泰克斯药物股份有限公司 | 使用atr抑制剂治疗癌症的方法 |
US11230729B2 (en) | 2018-04-20 | 2022-01-25 | Inanna Diagnostics, Inc | Methods and devices for obtaining cellular and DNA material from human female reproductive system |
CN109781977B (zh) * | 2019-01-09 | 2022-03-29 | 首都医科大学附属北京安定医院 | IL15Rα以及相关膜蛋白检测试剂盒及其应用 |
RU2707099C1 (ru) * | 2019-04-24 | 2019-11-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ скрининга злокачественных опухолей органов грудной полости |
MX2019005940A (es) * | 2019-05-21 | 2019-10-11 | Atso Corp Affairs S A De C V | Biomarcadores relacionados a cancer. |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4281061A (en) * | 1979-07-27 | 1981-07-28 | Syva Company | Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay |
EP0584264A1 (en) | 1991-05-16 | 1994-03-02 | Cold Spring Harbor Laboratory | D-type cyclin and uses related thereto |
US5889169A (en) * | 1991-05-16 | 1999-03-30 | Cold Spring Harbor Laboratory | Cell cycle regulatory protein p16 gene |
CA2125769C (en) * | 1991-12-13 | 1999-01-26 | Morgan Van Aken | Agglutination assays and kits employing colloidal dyes |
US6316208B1 (en) * | 1994-01-07 | 2001-11-13 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Methods for determining isolated p27 protein levels and uses thereof |
US5989815A (en) * | 1994-03-18 | 1999-11-23 | University Of Utah Research Foundation | Methods for detecting predisposition to cancer at the MTS gene |
AU685627B2 (en) * | 1994-03-18 | 1998-01-22 | Myriad Genetics, Inc. | Germline mutations in the MTS gene and method for detecting predisposition to cancer at the MTS gene |
US6060301A (en) * | 1994-03-18 | 2000-05-09 | Myriad Genetics, Inc. | Vector containing MTS1E1β gene |
CA2164167A1 (en) | 1994-12-20 | 1996-06-21 | Izak Bahar | Assay normalization method |
US6033847A (en) * | 1995-02-06 | 2000-03-07 | St. Jude Children's Research Hospital | InK4c-p18 and InK4d-p19, inhibitors of cyclin-dependent kinases CDK4 and CDK6, and uses thereof |
US5843756A (en) * | 1995-06-07 | 1998-12-01 | Myriad Genetics, Inc. | Mouse MTSI gene |
US6403383B1 (en) * | 1996-03-11 | 2002-06-11 | American Bio Medica Corp. | Diagnostic test kit for immunological assays of fluid samples |
US5976799A (en) * | 1996-03-21 | 1999-11-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Early detection of ovarian carcinoma using P16 gene products |
US5858683A (en) * | 1996-08-30 | 1999-01-12 | Matritech, Inc. | Methods and compositions for the detection of cervical cancer |
WO1999004238A2 (en) | 1997-07-15 | 1999-01-28 | Mitotix, Inc. | Reagents and methods for diagnosis and prognosis of proliferative disorders |
US6090579A (en) * | 1997-08-12 | 2000-07-18 | Smithkline Beecham Corporation | Human SDR2 cDNA clone |
CA2313483C (en) | 1997-12-12 | 2017-12-05 | Digene Corporation | Assessment of human papilloma virus-related disease |
US20010051364A1 (en) * | 1997-12-23 | 2001-12-13 | Francis Michon | Procedures for the extraction and isolation of bacterial capsular polysaccharides for use as vaccines or linked to proteins as conjugate vaccines |
US6686151B1 (en) | 1998-02-06 | 2004-02-03 | Digene Corporation | Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays |
US5994079A (en) * | 1998-02-06 | 1999-11-30 | Digene Corporation | Direct detection of RNA mediated by reverse transcriptase lacking RNAse H function |
US7399589B2 (en) * | 1998-02-06 | 2008-07-15 | Digene Corporation | Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays |
US6576420B1 (en) * | 1998-06-23 | 2003-06-10 | Regents Of The University Of California | Method for early diagnosis of, and determination of prognosis in, cancer |
DE19829473C2 (de) * | 1998-07-01 | 2000-08-10 | Magnus Von Knebel Doeberitz Ch | Verfahren zur frühen Diagnose von Carcinomen |
US7306926B2 (en) * | 1998-07-01 | 2007-12-11 | Mtm Laboratories Ag | Method for detecting carcinomas in a solubilized cervical body sample |
US6593084B2 (en) * | 1998-10-13 | 2003-07-15 | Robert E. Bird | Carcinogen assay |
WO2000031538A1 (en) * | 1998-11-23 | 2000-06-02 | Praxsys Biosystems, Inc. | Improved lateral flow assays |
SE515668C2 (sv) * | 1999-02-22 | 2001-09-17 | Quantovir Ab | Metod och kit för tidig förutsägelse av cancer |
DE10014685B4 (de) * | 2000-03-24 | 2004-07-01 | Schubert, Walter, Dr. | Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Zielstrukturen |
GB0018140D0 (en) | 2000-07-24 | 2000-09-13 | Medical Res Council | Screening for abnormalities |
DE10063179A1 (de) | 2000-12-18 | 2002-06-20 | Bayer Ag | Verfahren zur spezifischen Detektion von Tumorzellen und ihren Vorstufen in Gebärmutterhalsabstrichen durch simultane Messung von mindestens zwei verschiedenen molekularen Markern |
ITRM20010363A1 (it) * | 2001-06-25 | 2001-09-24 | Franco Castelmani | Gancio adattivo applicato ad un generatore di vivrazioni sinusoidali. |
CN100422342C (zh) | 2002-01-07 | 2008-10-01 | 诺奇普公司 | 检测人乳头瘤病毒mRNA的方法 |
EP1333278B1 (en) * | 2002-02-01 | 2004-03-10 | MTM molecular tools in medicine | Methods for monitoring and prognosis of disease course of gastrointestinal tumors |
ES2215957T3 (es) * | 2002-08-01 | 2004-10-16 | Mtm Laboratories Ag | Metodo para diagnostico basado en una solucion. |
US7361460B2 (en) * | 2003-04-11 | 2008-04-22 | Digene Corporation | Approach to molecular diagnosis of human papillomavirus-related diseases |
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