SE515668C2 - Metod och kit för tidig förutsägelse av cancer - Google Patents

Description

515 668 2 och kontrollfragment. Därefter bestäms sekvensen för sekvenseringsregionen såväl som dess patogena källa.

Ylitalo et al. beskriver i J. Clin. Microbiol. 33: l822-1828 detektion av genitala HPV- typer genom ampliñering av den konserverade El-regionen hos onkogena HPV- typer. Kvantifiering av viral belastning diskuteras inte.

Hittills fmns ingen känd metod för att förutsäga livmoderhalscancer flera år innan cancem utvecklas.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning tillhandahåller en metod och kit som möjliggör tidig förut- sägelse av det kliniska resultatet av livmoderhalscancer in situ (cervical cancer in situ, CCIS). Enligt föreliggande uppfmning kan livmoderhalscancer förutsägas hos HPV-positiva kvinnor där de initiala HPV-positiva utstryken togs flera år innan cancem utvecklades. l en första aspekt tillhandahåller föreliggande uppfinning en metod för att förutsäga risken för progression till virus-associerad cancer hos en människa, innefattande a) att mäta mängden viral nukleinsyrasekvens eller fragment därav i ett prov från individen; b) att mäta mängden av en human nukleinsyrasekvens eller fragment därav i provet: c) att relatera värdet från a) i förhållande till värdet från b) för att erhålla ett värde på relativ viral belastning i provet.

Den virala nukleinsyrasekvensen är företrädesvis nukleinsyra från livmoderhals- cancer-associerat genitalt humant papillomvirus (HPV-typer), såsom HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 och 58. I en föredragen utföríngsform härstammar den virala nukleinsyran från El-genen, E6-genen, E7-genen, Ll-genen eller frag- ment därav. Den humana nukleinsyrasekvensen år företrädesvis genomiskt DNA från en nukleär gen. u v... nu 515 668 I metoden enligt uppfinningen, utförs mätningen i steg a) och b) genom kända metoder för kvantitativ DNA- eller RNA-analys, såsom polymeraskedjereaktion (PCR), in situ-hybridisering, NASBA, 3SR, hybridinfångning etc.

I en andra aspekt tillhandahåller uppfinningen ett kit för att förutsäga HPV- associerad livmoderhalscancer genom arnpliñering av viral nukleinsyra, innefattan- de a) primrar som är specifika för en region av den konserverade El-genen hos onkogena HPV-typer; och b) primrar som är specifika för genorriisk nukleinsyra i ett prov från en human individ.

Primrarna i b) kan väljas från godtycklig nukleär gen, företrädesvis en enkopie- gen. Kitet kan också innefatta DNA-interkalerande föreningar, såsom etidium- bromid och SYBR® Green.

I den föredragna utföringsformen, innefattar kítet också märkta HPV-specifika prober; och märkta prober som är specifika för humant genomiskt DNA. Markörer- na kan vara fluoroforer, radioaktiva isotoper, förening för kemiluminiscerande detektion etc.

Exempel på fluoroforer är FAM (ö-karboxyfluoreschein), HEX (hexakloro-6-karboxy- fluorescein, TET (tetrakloro-ö-karboxyfluorescein), JOE (2,7-dirnetoxy-4,5-dik1oro- ö-karboxyfluoreschein), TAMRA (ö-karboxytetrametylrodarnin), ROX (ö-karboxy-X- rodamin), Cy5 (cyanin).

Föredragna HPV-prober är: HPV 16 probe: 5'- ATAATCTCCTTTTTGCAGCTCTACTTTGTVÜÜVF-B' HPV 18 probe: 5'- CCGCCTÜTTGCCTÜTTCTGCCCACTAATT-S' HPV 31 probe: 5'- TCTPCGTTTTGCTGTTTTACTGTTATTTTCTAT-S' l-IPV 33 probe: 5'- TTTTCGTTTTCTGTATGTGCATTCflTATPTTT-S' HPV 35 probe: 5'- TCGTCGCTlTCGTGCTGTATTTTTATTTTCA-S' n.. 515 668 Detaljerad beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning kommer nu att beskrivas närmare nedan i anslutning till de bifogade ritningarna, i vilka Figur lA visar fördelning av ß-aktin tröskelcykel (Ct)-värden för fall (ofyllda kvadrater) och kontroll (ofyllda cirklar) utstryk, i förhållande till kalenderår för preparation av utstryken (1969- 1995).

Figur 1B visar fördelning av HPV 16 tröskelcykel (Ct)-värden för fall (ofyllda kvadrater) och kontroll (ofyllda cirklar) utstryk, i förhållande till kalenderår för preparation av utstryken (1969-1995).

Figur 2 visar fördelning av HPV 16 tröskelcykel (Ct)-värden för kontroll (övre histo- gram) och fall (lägre histogram) utstryk. HPV 16 Ct-värdena (på X-axeln) delades in i åtta grupper, mittgruppvärdet för vardera visas. Absolut frekvens av utstryk på Y- axeln.

Figur 3 visar positivt prediktivt värde (PPV) för kvinnor vid olika percentiler av för- delningen av HPV 16 tröskelcykel (Ct)-vårdena. De olika kategorierna av HPV 16 Ct-värden är från Tabell 2. Separata analyser utfördes för utstryk med höga mäng- der nukleärt DNA (ß-aktin Ct<34,78 (figur 4A) och låga mängder nukleärt DNA (ß-aktin Ct>34,87 (figur 4B) eftersom ß-aktin befanns vara en effektmodifierare.

Föreliggande uppfinnare har studerat den relativa virala belastningen av HPV som en determinant för progression till livmoderhalscancer in situ (CCIS). Den relativa virala belastningen analyserades i arkiverade utstryk genom en kvantitativ DNA- amplifieringsmetod. Flera utstryk erhölls från varje kvinna över en period av 26 år.

Totalt 2081 utstryk erhölls från 478 fall och 1754 utstryk från 608 kontroller.

DNA från utstryken isolerades och analyserades för mängden HPV 16 med an- vändning av en amplifiering av ett fragment av 180 bp av El öppna läsramen och en dubbelmärkt typspecifik probe. Uppfinningen kommer att exemplifieras med en HPV 16 specifik probe. Emellertid är uppfinningen inte begränsad till denna utan 515 668 5 det förväntas att alla ovan nämnda prober såväl som prober utformade på liknande sätt för andra onkogena typer kommer att ge tillfredsställande resultat.

EXPERIMENTELL SEKTION DNA-extraktion från arkiverade utstryk DNA-extraktion från Papanicolau-färgade arkiverade utstryk utfördes genom följande procedur: en xylen-inkubering, en avfärgning med 95% etanol, en proteinas K-behandling (60°C minimum 1 h) och därefter en proteinutfällning genom mättad ammoniumacetat. DNA-supernatanten utvanns med etanol, fäll- ningen tvättades med 70% etanol, torkades och upplöstes i 200 pl TE-låg (10 mM Tris-HCL, pH 7,4, 0,1 mM EDTA).

PCR-amplifiering PCR-arnplifieringen utfördes i en 50pl volym innehållande 50 mM KCl, 10 mM tris- HCI (pH 8,4), 10 mM EDTA, 60 nM passiv referensfärg (Rox), 5 mM MgClg, 0,25 pM HPV El 5' primer(s), 0,5 pM HPV El 3' primer(s), HPV-specifik dubbelmärkt probe vid en koncentration av 100 nM, dATP, dCTP och dGTP vardera vid en koncentra- tion av 200 pM, 400 pM dUTP, 0,5 E uracil N ïglykosylas (AmpErase UNG; Perkin- Elmer), 1,25 E DNA-polymeras (Amplitaq Gold; Perkin-Elmer) och 2-10 pl DNA från utstryket. Mängden DNA som tillsattes till PCR-blandningen representerar 1 till 5% av DNA:t erhållet från ett cervikalt utstryk. För att minska primrarnas komplexici- tet konstruerade vi en 5'-primerblandning bestående av endast två primrar (HPVEl 16L 5'-TACAGGTTCTAAAACGAAAGT-3' specifik för HPV 16 och 5'- l-lPVEl18L TGCATGTTTTAAAACGAAAGT-B' specifik för HPV 18) och en 3' primerblandning bestående av tre primrar (HPVE1 16R 5'-TTCCAC'I“TCAGTA'I"PGCCATA-3' specifik för HPV 16, HPVEl18R 5'-TTCCACTTCAGAACAGCCATA-3' specifik för HPV 18 och HPVElRE SJFRYRKGMNYTAAAACGAAAGT-B' specifik för HPV 30-60, där R = A eller G, Y = C eller T, K = G eller T, M = A eller C, S = G eller C, W = A eller T, N = A, T, C eller G, B = C, G eller T, D = A, G eller T, H = A, C eller T, V = A, C eller G). Det är också möjligt att använda de HPV 16-specifika eller HPV 18-specifika 5'- och 3'-primrarna för sig eller i kombination med varandra. . m.. u. t» 515 668 6 De fluorescerande probema var 30-33 bp långa för att säkerställa ett högre Tm än för primrarna. Följande HPV 16 probe: FAM- 5'ATAATCTCCTITITGCAGCTCTACTTPGTPITT-S'FAMRA användes i en amplifier- ing och detektionsanalys, med användning av en ABI Prism 7700, sekvensdetek- tionssystem (Perkin Ehner Inc.) Amplifieringsrampen innehöll två hållprogram (1) 2 minuter vid 50°C för att aktivera dekontarninationsenzymet, Uracil N' glykosylas (UNG) följt av (2) 10 minuter vid 95°C för att inaktivera UNG och frigöra aktiviteten från DNA-polymeraset. Detta följdes av en två-stegs-cykel bestående av ett smält- ningssteg under 15 sekunder vid 95°C och parning under l minut vid 55°C, under totalt 50 cykler. För att övervaka kontamination, innefattades cirka 8 rör med enbart PCR-komponenter utan DNA-templat. Tröskelcykelvärdet beräknades med användning av Sequence Detection System-mjukvaran och baslinjen inställdes automatiskt (10 SD över bakgrunden i de första 3-15-cyklerna). Eftersom alla beräkningar ordes direkt på Ct-värdena, användes inga standardkurvor.

Normalisering av HPV DNA och genomiskt DNA Utstryksprov varierade väsentligt i tröskelcykelvårde (Ct), som representerar det amplifieringscykelnummer vid vilken detektionssignalen signifikant överskred bas- linjen, vilket potentiellt avspeglar en skillnad i HPV DNA-kopieantal på åtminstone 100 gånger mellan individuella utstryk (data ej visade). På grund av slaget av procedur som användes för provtagning av cervikala epitelceller, kan HPV-kopie- antalskillnader avspegla antalet provtagna celler. För att normalisera HPV-upp- skattningarna för mängden genomiskt DNA i individuella prov, kvantifierades en nukleär gen, ß-aktin i alla utstryk med användning av samma amplifieringsmetod.

Det nukleära DNA:t kan vara godtyckligt nukleärt DNA, företrädesvis en enkopie- gen. Uppfinningen är inte beroende på det sätt som HPV DNA:t normaliseras till nukleärt DNA. Mängden viralt DNA bör relateras till genomiskt nukleärt DNA på godtyckligt lämpligt sätt för att ge ett värde på den relativa virala belastningen.

Exempelvis kan relationen vara mängden viralt DNA delat med mängden genomiskt nukleärt DNA.

Såsom nämnts ovan preparerades de analyserade utstryken under en period av nästan 26 är och proceduren och reagensen som användes för preparation av ut- stryk kan ha förändrats under denna tid, vilket potentiellt kan påverka resultaten.

. HH 1.- .- 515 668 Medianvärdet för fördelning av ß-aktin bland fall (Ct = 37,30) och (Ct = 37,58) för kontrollerna skilde sig inte vilket indikerar att det inte föreligger någon skillnad i DNA-kvalitet mellan gruppema (se tabell 1 nedan). Fördelningen av tröskel (Ct)- värden för ß-aktin visade inte någon signifikant trend över tiden och var inte signifikant olika mellan fall- och kontrollutstryk (figur 1).

Resultat Totalt 871 utstryk från fall och 117 utstryk från kontroller typades positiva för HPV 16 (tabell l). Fördelningen av Ct-värden skiljer sig avsevärt mellan fallen och kontrollerna (figur 2), med ett medianvårde Ct = 37,59 för fall och Ct = 43,88 i kontroller (tabell 1). 515 668 Tabell 1. Karakteristika för deltagarna Fall Kontroll Antal kvinnor 478 608 ß-aktin positiva utstryk totalt antal 208 1 1754 medianvärde (område) 4( 1- 17) 2(1- 14) 75% percentíl 6 4 Fördelning av ß-aktin C, min 19,96 24,6 1 25% percentíl 35,04 35,44 median 37,30 37,58 75% percentíl 39,10 39,24 max 49,08 49,30 HPV 16 positiva utstryk totalantal 87 1 1 1 7 antal kvinnor utan positiva utstryk 190 509 antal kvinnor med en eller flera positiva utstryk 288 99 Fördelning av HPV 16 Ci min 23, 1 3 3 1,49 25% percentíl 34,74 40,08 median 37,59 43,88 75% percentíl 40,92 46,77 max 49,72 49,90 515 668 9 Eftersom det föreligger ett omvänt förhållande mellan Ct och viralt kopieantal, över- ensstämrner skillnaden mellan fall och kontroll med en högre genomsnittlig viral belastning i fallen. Ct-värdena för HPV 16 visar inte någon trend över kalendertiden och skillnaden mellan patienter och kontroller förefaller vara konstant över kalen- dertiden (figur lB). Således kan skillnaden i HPV 16 Ct-värden mellan patienter och kontroller inte förklaras genom variation i DNA-kvalitet över kalendertid.

Förhållandet mellan viral belastning (HPV 16 Ci) och risk för sjukdom undersöktes med användning av konditionell logistisk regressionsanalys. Oddsförhållandet (OR), baserat på medeltalet av alla utstryksprov från en kvinna, är statistiskt signifikant för varje 20% percentil och visar en kraftigt ökande trend men högre HPV- belastning (lägre HPV 16 Ct) (tabell 2). I denna analys justerade vi för effekten av skillnader i mängden genomiskt DNA med användning av medelvärde för ß-aktin Ci. OR för percentilen innefattande utstryk med den högsta virala belastningen (OR = 68,83 95% Cl l5,8l-299) indikerar en nästan 70 gånger högre risk i förhållande till kvinnor som testar negativa för HPV. Statistiskt signifikant ökande ORs med högre HPV-belastning observeras också med användning av endast utstryket med det minimala, eller maximala, Ct-värdet från en individuell kvinna. Detta kan tyda på att individuella kvinnor över tiden tenderar att ha antingen låg eller hög HPV- titer.

. »H- im .i 515 668 10 cflxøà å: oaooomflw + .mccïx uDm> .Ra oooomšoooëófi >mI .O >o cuwcmcfiovoo.. >m Ecuoooa .xöm »bär mm wmcxwüun .ëtomvoæx « :wfiåvmwüv 3.3 ma? Awqäwqmflmv 3% QS :æäwåfv 3.3 Næm omäm v .o _+ å: âfibvlmfls 85 QS âïmowmämo 8.2 Qom Ååfixwmoš 3.2 tå Swan M åøwfio f, å: afiææmi .aa âaw fiwotoofiqv www m :S fimíæmmv wqæ N :ä GQ? M 3%. .o .+ å: :šwmoi mmm oxå :owšøvovo omm oxå :ædæwæv o? få æí M 3:: .o _+ å: šaæwov ä; Saw oixwmm. s www Raw æmvä. c QQN NQR .om H me: _o _+ å: f Näää f åïäm P äšüm - å: b=8ä8_ Bäšnâ. bšnuâ. + :o .ämm mo _ šæ _25 tö .šo mo :E :så tö än. mo :ä _85 Eëåmå änšmmßo »fišzëoë åmuo .äuåsmx CÛXGIQ Ufldfifl MUSOuHCOX 200 >d wäfiflfldwflOwwmvuwßk ÅWÛW«WO~ ZUCOMUZUCOM Cflhm ußfiflwüww :ÜÛß-F 515 668 ll Slutligen är OR baserat endast på det första HPV 16-positiva utstryket från varje kvinna, som tagits i genomsnitt 7,8 år före diagnos, fortfarande signifikant för alla percentiler, förutom den första, och visar också en kraftigt ökande trend med högre viral belastning (tabell 3). Eftersom endast en utstryk har inkluderats per kvinna beror förhållandet mellan hög viral belastning (låg HPV 16 Ct) och risk för cancer inte på beroende bland utstryk. Dessutom kan resultaten vid jämförelse av endast det första positiva utstryket från varje kvinna inte bero på asyrnmetrisk provtag- ning från fall och kontroller eftersom det inte föreligger någon skillnad i medeltiden mellan provtagning och diagnos för fallen och kontrollerna (data ej visade).

Tabell 3. Resultat från konditionell logistisk regressionsanalys av det första utstryket från fall och kontroller bland ß-aktin-positiva kvinnor.

Kategorier* HPV Ct första utstryk oR (9s% cnf HPV - HPV +, C; [45,26; 50] HPV +, Ct [42,08; 45,26] HPV +, Ct [38,7; 42,08] HPV +, Ct [35,9; 38,7] HPV +, C, <35,9 1 1,88 (o,83-4,25) 7,17 (2,68-19,14) 22,78 (5,47-94,96) 18,88 (s,49-64,86) 58,97 (7352-46224) ~k Kategorier är beräknade på varje 20% percentil av fördelningen av HPV 16 Ct-värdet för det första utstryket från varje kvinna. f Justerat för ß-aktin.

Dessa resultat demonstrerar att ökad HPV DNA viral belastning är en signifikant riskfaktor för livmoderhalscancer. Fallen och kontrollerna uppvisar en skillnad i viral belastning upp till 8 år före datumet för diagnos av cancer in situ. En sådan långtidsskillnad i viral belastning skulle antingen kunna bero på miljömässiga eller genetiska riskfaktorer. Ett antal miljömässiga faktorer, såsom sexuellt beteende, rökning och variation i HPV subtyp, som tidigare föreslagits påverka risken för in- nu 515 668 12 fektion, skulle också kunna i princip, påverka den virala belastningen. Det höga OR kan också avspegla inneboende skillnader mellan individer i svaret på HPV 16- infektion.

På grund av det mycket höga OR för höga HPV 16 virala belastningar, kan kvantifi- ering av onkogena subtyper av HPV ha klinisk användbarhet. Därför uppskattades det positiva prediktiva värdet (PPV), som ett mått på absolut risk, förknippad med olika HPV 16 virala belastningar, från fall- kontrollstudien, enligt beskrivna meto- der. För denna analys uteslöts inte utstryk tagna inom det senaste året för diagnos.

I analysen med användning av endast det första utstryket från varje kvinna, be- fanns ß-aktin vara en effektmodifierare. På grund av detta stratifierades utstryken i två grupper med låga och höga ß-aktin-värden. PPV ökar konsekvent med viral be- lastning i alla åldersgrupper och för båda ß-aktin-kategorier (figur 3). Sannolik- heten av att utveckla livmoderhalscancer in situ för kvinnor med ett HPV 16 nega- tivt första utstryk varierar mellan O,3-O,8°/o, medan i gruppen med en högre nukleär DNA-mängd (C, >34,78), så når PPV för percentilen med den högsta HPV virala belastningen över 27% i den yngsta åldersgruppen. Således har en kvinnai tjugoårsäldem från denna population och med ett HPV 16 Ct-värde i den högsta percentilen en 27% risk att utveckla cancer. Detta bör jämföras med risken för en kvinna som testar negativ i samma åldersgrupp av O,8%, ett sannolikhetsför- hållande på 34.

Således kan uppskattningar av HPV DNA viral belastning signifikant förbättra för- mågan att särskilja mellan infektioner som har en hög eller låg risk till att utveck- las till livmoderhalscancer in situ. Vidare erhölls, såsom noterats, dessa absoluta riskuppskattningar med användning av det första ß-aktin positiva utstryket, vilket i de flesta fall inte hade några tecken på dysplasi och erhölls nästan 8 år före diagnos. Följaktligen är uppskattningar av HPV DNA viral belastning sannolikt informativa vid ett sådan tidigt stadium i utvecklingen av livmoderhalscancer in situ att preventiv behandling kan vara mycket framgångsrik. Tillågget av en kvan- titativ test av HPV viral belastning i samband med rutinmässiga gynekologiska hälsokontroller, förefaller således att vara ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att identifiera kvinnor som år benägna att utveckla livmoderhalscancer och, som en följd därav, också för att minska incidensen för livmoderhalscancer. ..| »i

Claims (10)

., E, . . .. .n -fl <1 « n; u; o ~ * fi ' “ ' _ . f: e. f- n; n f in. .N , ,. |« va. s. un .= i i n, n I. u e i» u _ , , , ,,, s. , i; 13 PATENTKRAV

1. Metod för att förutsäga risken för progression till virus-associerad cancer hos en människa, innefattande a) att mäta mängden viral nukleinsyrasekvens eller fragment därav i ett prov från individen; b) att mäta mängden av en human nukleinsyrasekvens eller fragment därav i provet: c) att relatera värdet från a) i förhållande till värdet från b) för att erhålla ett värde på relativ viral belastning i provet.

2. Metod enligt krav 1, vari den virala nukleinsyrasekvensen är från humana papillomvirus (HPV)-typer som är associerade med livmoderhalscancer.

3. Metod enligt krav 1 eller 2, vari den virala nukleinsyrasekvensen är från onkogena genitala HPV-typer.

4. Metod enligt krav 3, vari den virala nukleinsyrasekvensen härstammar från El-genen, E6-genen, E7-genen, Ll-genen eller fragment därav.

5. Metod enligt krav 1, 2, 3 eller 4, vari den humana nukleinsyrasekvensen härstammar från en genomisk nukleär gen.

6. Metod enligt något av ovanstående krav, vari de virala och humana nukleinsyrasekvenserna är DNA- eller RNA-sekvenser och mätningen i steg a) och b) görs genom metoder för kvantitativ DNA- eller RNA-analys, såsom polymeras- kedjereaktion (PCR), NASBA, 3SR, in situ, hybridisering, hybridinfångning etc..

7. Kit för att förutsäga risken för progression till livmoderhalscancer som är associerad med humant Papillom-virus (HPV) genom amplifiering av viral nuklein- syra, innefattande: a) primrar som är specifika för en region av den konserverade El-genen hos onko- gena HPV-typer; vilka är HPVEl16L SÄTACAGGTFCTAAAACGAAAGT-EU specifik för HPV 16 och HPVE116R 5'-TTCCACTTCAGTATTGCCATA-3' specifik för HPV 16; ,==. 515 668 14 och / eller 5'-HPVE1 18L TGCATGFFPFAAAACGAAAGT-B' specifik för HPV 18, och HPVEl18R SïTTCCACTTCAGAACAGCCATA-S' specifik för HPV 18; och b) primrar specifika för genomiskt DNA i ett prov från en människa.

8. Kit enligt krav 7, vari primrarna i a) består av en 5'-primerblandning av två primrar HPVEl l6L SïTACAGGTTCTAAAACGAAAGT-ß' specifik för HPV 16 och 5'-I-IPVEl 18L TGCATGTTTTAAAACGAAAGT-ß' specifik för HPV 18 och en 3' primerblandning bestående av följande tre primrar: HPVEl l6R SïTTCCACTTCAGTATTGCCATA-B' specifik för HPV 16, och l-IPVEI l8R öïTTCCACTTCAGAACAGCCATA-S' specifik för HPV 18 och HPVElRE öïTRYRKGMNYTAAAACGAAAGT-S' specifik för HPV 30-60, där R = A e11erG,Y= C ellerT, K= GellerT, M =Ae11erC, S=Ge1lerC, W=Ae11erT, N=A, T, CellerG, B= C, Ge1lerT, D =A, G ellerT, H=A, CellerT, V=A, CellerG.

9. Kit enligt krav 7 eller 8, också innefattande DNA-interkalerande färg.

10. Kit enligt krav 7, 8 eller 9, också innefattande c) märkta HPV-specifika prober; och d) märkta prober specifika för humant genomiskt DNA. 1 l. Kit enligt krav 10, vari den HPV-specifika proben är vald från: HPV 16 probe: 5'- ATAATCTCCTTTTTGCAGCTCTACTTTGTIVIVFT-S' HPV 18 probe: 5'- CCGCCTTVIVIVFGCCTIVIVTTCTGCCCACTAATT-ß' HPV 31 prober 5'- TCTTCGTTTTGCTGTTTTACTGTTATTTTCTAT-ß' HPV 33 probe: 5'- 'ITTTCGTTTTCTGTATGTGCATTCTIVFATVIVIVPT-S' HPV 35 prober 5'- TCGTCGCTIVFCGTGCTGTATTTVTTATTTTCA-B' n.-