JP2002537779A - 早期がん予測のための方法及びキット - Google Patents
早期がん予測のための方法及びキットInfo
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- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
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Abstract
(57)【要約】
本発明は早期がん予測の分野に属するものである。さらに詳細には、本発明はヒト被験者におけるウイルス関連子宮頚がんを予測するための方法及びキットに関するものである。本発明の方法では、ウイルス核酸量はヒト被験者からの試料の量に対して正規化される。本発明のＤＮＡ増幅キット中の特異的なプライマー及びプローブを用いることで相対的ウイルス感染量値が得られ、これは子宮頚がんの症状が出る数年前にその危険度を予測することを可能にする。
Description
【０００１】 発明の技術分野 本発明は早期がん予測の分野に属する。さらに詳細には、本発明はヒト被験者
におけるウイルス関連子宮頚がんを予測するための方法及びキットに関するもの
である。
におけるウイルス関連子宮頚がんを予測するための方法及びキットに関するもの
である。
【０００２】 発明の背景 ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のある種のサブタイプ、特にＨＰＶ１６及
びＨＰＶ１８の感染は子宮頚がんの主要な危険因子として長い間認識されており
、がん生検の約９５％はＨＰＶ ＤＮＡを含んでいる。ＨＰＶの感染は１６〜２
４歳の若い女性に普通にみられるが、腫瘍形成性ＨＰＶ塗抹標本を有する女性の
わずか１％以下が子宮頚がんに進展する。従って、ＨＰＶの存在を検査する公知
の方法は予測という点で価値が低い。
びＨＰＶ１８の感染は子宮頚がんの主要な危険因子として長い間認識されており
、がん生検の約９５％はＨＰＶ ＤＮＡを含んでいる。ＨＰＶの感染は１６〜２
４歳の若い女性に普通にみられるが、腫瘍形成性ＨＰＶ塗抹標本を有する女性の
わずか１％以下が子宮頚がんに進展する。従って、ＨＰＶの存在を検査する公知
の方法は予測という点で価値が低い。
【０００３】 先行技術には、子宮頚がんを予測又は診断するための二つの主要な戦略がある
。一つの戦略は、細胞診断において、扁平上皮内病変又は子宮頚部異形成を子宮
頚がんへの進展の指標として用いるものである。他の主要な戦略は、患者試料中
のＨＰＶ核酸を直接又はその核酸を増幅した後に検出するものであり、その際、
ＨＰＶ核酸の存在が子宮頚がんへ進展する可能性の指標とみなされている。
。一つの戦略は、細胞診断において、扁平上皮内病変又は子宮頚部異形成を子宮
頚がんへの進展の指標として用いるものである。他の主要な戦略は、患者試料中
のＨＰＶ核酸を直接又はその核酸を増幅した後に検出するものであり、その際、
ＨＰＶ核酸の存在が子宮頚がんへ進展する可能性の指標とみなされている。
【０００４】 先行技術は正確なＨＰＶタイプを決定することにも集中している。例えば、US
5 580 970は、重篤な子宮頚がんへ進展する危険度がより低いことの指標として
ＨＰＶ６及び１１などの低腫瘍形成性ＨＰＶ遺伝子の増幅を、危険度のより高い
ことの指標として高腫瘍形成性ＨＰＶ遺伝子の増幅を記載している。
5 580 970は、重篤な子宮頚がんへ進展する危険度がより低いことの指標として
ＨＰＶ６及び１１などの低腫瘍形成性ＨＰＶ遺伝子の増幅を、危険度のより高い
ことの指標として高腫瘍形成性ＨＰＶ遺伝子の増幅を記載している。
【０００５】 US 5 795 722は、（i）１個あるいは複数の対照核酸の増幅を、（ii）患者試
料中の疑わしい病原体に由来する分析物核酸中の保存領域の増幅と（iii）分析
物核酸中の塩基配列決定用部位の増幅とともに記載している。増幅した後、塩基
配列決定部位を増幅混合物から取り出し、残りの断片混合物を電気泳動的に分離
して保存領域断片と対照断片の相対的な量を決定する。その後、塩基配列決定部
位及び病原性源の塩基配列を決定する。
料中の疑わしい病原体に由来する分析物核酸中の保存領域の増幅と（iii）分析
物核酸中の塩基配列決定用部位の増幅とともに記載している。増幅した後、塩基
配列決定部位を増幅混合物から取り出し、残りの断片混合物を電気泳動的に分離
して保存領域断片と対照断片の相対的な量を決定する。その後、塩基配列決定部
位及び病原性源の塩基配列を決定する。
【０００６】 Ylitaloらは、J. Clin. Microbiol. 33: 1822-1828において、腫瘍形成性ＨＰ
Ｖタイプの保存Ｅ１領域の増幅による生殖器ＨＰＶタイプの検出について記載し
ている。ウイルス感染量の定量については議論されていない。
Ｖタイプの保存Ｅ１領域の増幅による生殖器ＨＰＶタイプの検出について記載し
ている。ウイルス感染量の定量については議論されていない。
【０００７】 これまでのところ、子宮頚がんをその発生の数年前に予測する公知の方法は存
在していない。 発明の概要 本発明は、子宮頚上皮内がんの臨床結果を早期に予測することを可能にする方
法及びキットを提供する。本発明によれば、がんの発生の数年前に最初のＨＰＶ
陽性塗抹標本が採取されたＨＰＶ陽性の女性において、子宮頚がんを予測するこ
とができる。
在していない。 発明の概要 本発明は、子宮頚上皮内がんの臨床結果を早期に予測することを可能にする方
法及びキットを提供する。本発明によれば、がんの発生の数年前に最初のＨＰＶ
陽性塗抹標本が採取されたＨＰＶ陽性の女性において、子宮頚がんを予測するこ
とができる。
【０００８】 第１の態様において、本発明は、ヒト被験者においてウイルス関連がんへの進
展危険度を予測する方法であって、 ａ）ヒト被験者試料中のウイルス核酸配列又はその断片の量を測定し； ｂ）上記試料の量を測定し； ｃ）ａ）の値とｂ）の値とを関係づけて上記試料中の相対的なウイルス感染量値
を得る、ことを含む方法を提供する。１つの実施態様において、上記試料の量を
、ヒト核酸配列又はその断片を測ることで測定し； ｄ）上記値を用いて子宮頚がん進展危険度を評価し、より多いウイルス感染量が
あると子宮頚がんへの進展危険度が増加することを意味する。
展危険度を予測する方法であって、 ａ）ヒト被験者試料中のウイルス核酸配列又はその断片の量を測定し； ｂ）上記試料の量を測定し； ｃ）ａ）の値とｂ）の値とを関係づけて上記試料中の相対的なウイルス感染量値
を得る、ことを含む方法を提供する。１つの実施態様において、上記試料の量を
、ヒト核酸配列又はその断片を測ることで測定し； ｄ）上記値を用いて子宮頚がん進展危険度を評価し、より多いウイルス感染量が
あると子宮頚がんへの進展危険度が増加することを意味する。
【０００９】 ウイルス核酸配列は、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５
１、５２、５６及び５８などの子宮頚がんに関連した生殖器ヒトパピローマウイ
ルス（ＨＰＶ）タイプの核酸であることが好ましい。好ましい実施態様において
、ウイルス核酸はＥ１遺伝子、Ｅ６遺伝子、Ｅ７遺伝子、Ｌ１遺伝子又はそれら
の断片由来である。ヒト核酸配列は核遺伝子からのゲノムＤＮＡであることが好
ましい。
１、５２、５６及び５８などの子宮頚がんに関連した生殖器ヒトパピローマウイ
ルス（ＨＰＶ）タイプの核酸であることが好ましい。好ましい実施態様において
、ウイルス核酸はＥ１遺伝子、Ｅ６遺伝子、Ｅ７遺伝子、Ｌ１遺伝子又はそれら
の断片由来である。ヒト核酸配列は核遺伝子からのゲノムＤＮＡであることが好
ましい。
【００１０】 本発明の方法において、工程ａ）及びｂ）での測定は、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）、in situハイブリダイゼーション、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、ハイブリ
ッドキャプチャーなどの定量的ＤＮＡ又はＲＮＡ解析用の公知の方法で行われる
。あるいは、生物試料の量は、同一量の生物試料を得るための技術機器を用いて
、又は容量、重量若しくは試料の量を正規化するための他の手段を用いて、細胞
数計測、細胞染色、細胞蛍光、全ＤＮＡ量により測定される。
（ＰＣＲ）、in situハイブリダイゼーション、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、ハイブリ
ッドキャプチャーなどの定量的ＤＮＡ又はＲＮＡ解析用の公知の方法で行われる
。あるいは、生物試料の量は、同一量の生物試料を得るための技術機器を用いて
、又は容量、重量若しくは試料の量を正規化するための他の手段を用いて、細胞
数計測、細胞染色、細胞蛍光、全ＤＮＡ量により測定される。
【００１１】 第２の態様において、本発明は、ａ）腫瘍形成性ＨＰＶタイプの保存Ｅ１遺伝
子領域に特異的なプライマー；及びｂ）ヒト被験者試料中のゲノム核酸に特異的
なプライマーを含む、ＨＰＶ関連子宮頚がんをウイルス核酸の増幅により予測す
るためのキットを提供する。
子領域に特異的なプライマー；及びｂ）ヒト被験者試料中のゲノム核酸に特異的
なプライマーを含む、ＨＰＶ関連子宮頚がんをウイルス核酸の増幅により予測す
るためのキットを提供する。
【００１２】 ｂ）におけるプライマーは核遺伝子、好ましくは単一コピー遺伝子から選択さ
れる。上記キットはエチジウムブロミド及びＳＹＢＲ（登録商標）グリーンなど
のＤＮＡ挿入試薬を含んでいてもよい。
れる。上記キットはエチジウムブロミド及びＳＹＢＲ（登録商標）グリーンなど
のＤＮＡ挿入試薬を含んでいてもよい。
【００１３】 好ましい実施態様において、キットは標識ＨＰＶ特異的プローブ及びヒトゲノ
ムＤＮＡに特異的な標識プローブも含む。標識は、蛍光物質、放射性同位元素、
化学発光検出用化合物などでよい。蛍光物質の例としては、ＦＡＭ（６−カルボ
キシフルオレッセイン）、ＨＥＸ（ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレッセ
イン）、ＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン）、ＪＯＥ（
２,７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン）、
ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、ＲＯＸ（６−カルボキ
シ−Ｘ−ローダミン）、Ｃｙ５（シアニン）が挙げられる。
ムＤＮＡに特異的な標識プローブも含む。標識は、蛍光物質、放射性同位元素、
化学発光検出用化合物などでよい。蛍光物質の例としては、ＦＡＭ（６−カルボ
キシフルオレッセイン）、ＨＥＸ（ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレッセ
イン）、ＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン）、ＪＯＥ（
２,７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン）、
ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、ＲＯＸ（６−カルボキ
シ−Ｘ−ローダミン）、Ｃｙ５（シアニン）が挙げられる。
【００１４】 好ましいＨＰＶプローブは以下のものである。 ＨＰＶ１６プローブ：5'-ATAATCTCCTTTTTGCAGCTCTACTTTGTTTTT-3' ＨＰＶ１８プローブ：5'-CCGCCTTTTTGCCTTTTTCTGCCCACTAATT-3' ＨＰＶ３１プローブ：5'-TCTTCGTTTTGCTGTTTTACTGTTATTTTCTAT-3' ＨＰＶ３３プローブ：5'-TTTTCGTTTTCTGTATGTGCATTCTTTATTTTT-3' ＨＰＶ３５プローブ：5'-TCGTCGCTTTCGTGCTGTATTTTTATTTTCA-3' 発明の詳細な説明 本発明を、添付の図面と関連させて以下に詳細に説明する。
【００１５】 本発明者らは子宮頚上皮内がん（ＣＣＩＳ）への進展の決定因子としてのＨＰ
Ｖの相対的ウイルス感染量を調べた。保管されている塗抹標本について相対的ウ
イルス感染量を定量的ＤＮＡ増幅法により解析した。多数の試料を２６年間に渡
って各々の女性から採取した。合計２０８１例の塗抹標本を４７８症例から、１
７５４例の塗抹標本を６０８例の対照例から得た。
Ｖの相対的ウイルス感染量を調べた。保管されている塗抹標本について相対的ウ
イルス感染量を定量的ＤＮＡ増幅法により解析した。多数の試料を２６年間に渡
って各々の女性から採取した。合計２０８１例の塗抹標本を４７８症例から、１
７５４例の塗抹標本を６０８例の対照例から得た。
【００１６】 塗抹標本のＤＮＡを単離し、ＨＰＶ１６の量をＥ１読み取り枠（open reading
frame）の１８０塩基対断片の増幅と２重標識タイプ特異的プローブを用いて定
量した。本発明はＨＰＶ１６特異的プローブで例示される。しかしながら、本発
明の方法はこれに限定されるものではなく、他の腫瘍形成性タイプ用に同様にデ
ザインされたプローブはもちろん、上述したプローブの全ては十分な結果を与え
るものと期待される。
frame）の１８０塩基対断片の増幅と２重標識タイプ特異的プローブを用いて定
量した。本発明はＨＰＶ１６特異的プローブで例示される。しかしながら、本発
明の方法はこれに限定されるものではなく、他の腫瘍形成性タイプ用に同様にデ
ザインされたプローブはもちろん、上述したプローブの全ては十分な結果を与え
るものと期待される。
【００１７】 実施例 保管されている塗抹標本からのＤＮＡの抽出 保管されているパパニコロー染色塗抹標本からのＤＮＡ抽出を以下の操作手順
で行なった：キシレン中でのインキュベーション、９５％エタノールによる脱染
色、プロテイナーゼK処理（６０℃で最低１時間）、続いて飽和酢酸アンモニウ
ムによるタンパク質沈澱。上清中のＤＮＡをエタノールで回収し、生成沈澱を７
０％エタノールで洗浄し、乾燥させた後２００μｌのＴＥ−低（ＴＥ−ｌｏｗ）
（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
で行なった：キシレン中でのインキュベーション、９５％エタノールによる脱染
色、プロテイナーゼK処理（６０℃で最低１時間）、続いて飽和酢酸アンモニウ
ムによるタンパク質沈澱。上清中のＤＮＡをエタノールで回収し、生成沈澱を７
０％エタノールで洗浄し、乾燥させた後２００μｌのＴＥ−低（ＴＥ−ｌｏｗ）
（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
【００１８】 ＰＣＲ増幅 ＰＣＲ増幅は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ ８．４）、１０
ｍＭ ＥＤＴＡ、６０ｎＭ受動性参照色素（passive reference dye）（Ｒｏｘ）
、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２５μＭ ＨＰＶ Ｅ１ ５'プライマー、０．５μＭ
ＨＰＶ Ｅ１ ３'プライマー、１００ｎＭのＨＰＶ特異的２重標識プローブ、そ
れぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、４００μＭ ｄＵＴＰ、
０．５ＵウラシルN'-グリコシラーゼ（AmpErase UNG; Perkin-Elmer）、１．２
５Ｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq Gold; Perkin-Elmer）、並びに塗抹標本か
ら抽出したＤＮＡ２〜１０μｌを含む５０μｌの容量で行った。ＰＣＲ混合液に
加えたＤＮＡの量は子宮頚部塗抹標本から得たＤＮＡの１〜５％に相当する。プ
ライマーの複雑さを減ずるために、本発明者らは、２種類のプライマー（ＨＰＶ
１６に特異的なＨＰＶＥ１１６Ｌ 5'-TACAGGTTCTAAAACGAAAGT-3'及びＨＰＶ１８
に特異的なＨＰＶＥ１１８Ｌ 5'-TGCATGTTTTAAAACGAAAGT-3'）のみから成る5'プ
ライマー混合物、並びに３種類のプライマー（ＨＰＶ１６に特異的なＨＰＶＥ１
１６Ｒ 5'-TTCCACTTCAGTATTGCCATA-3'、ＨＰＶ１８に特異的なＨＰＶＥ１１８Ｒ
5'-TTCCACTTCAGAACAGCCATA-3'及びＨＰＶ３０〜６０に特異的なＨＰＶＥ１ＲＥ
5'-TRYRKGMNYTAAAACGAAAGT-3'、ここでＲ＝Ａ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｋ＝Ｇ又
はＴ、Ｍ＝Ａ又はＣ、Ｓ＝Ｇ又はＣ、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ、Ｂ
＝Ｃ、Ｇ又はＴ、Ｄ＝Ａ、Ｇ又はＴ、Ｈ＝Ａ、Ｃ又はＴ、Ｖ＝Ａ、Ｃ又はＧを表
す）から成る３'プライマー混合物を作製した。ＨＰＶ１６特異的又はＨＰＶ１
８特異的５'及び３'プライマーを単独で又はそれぞれを組み合わせて用いること
も可能である。
ｍＭ ＥＤＴＡ、６０ｎＭ受動性参照色素（passive reference dye）（Ｒｏｘ）
、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２５μＭ ＨＰＶ Ｅ１ ５'プライマー、０．５μＭ
ＨＰＶ Ｅ１ ３'プライマー、１００ｎＭのＨＰＶ特異的２重標識プローブ、そ
れぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、４００μＭ ｄＵＴＰ、
０．５ＵウラシルN'-グリコシラーゼ（AmpErase UNG; Perkin-Elmer）、１．２
５Ｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq Gold; Perkin-Elmer）、並びに塗抹標本か
ら抽出したＤＮＡ２〜１０μｌを含む５０μｌの容量で行った。ＰＣＲ混合液に
加えたＤＮＡの量は子宮頚部塗抹標本から得たＤＮＡの１〜５％に相当する。プ
ライマーの複雑さを減ずるために、本発明者らは、２種類のプライマー（ＨＰＶ
１６に特異的なＨＰＶＥ１１６Ｌ 5'-TACAGGTTCTAAAACGAAAGT-3'及びＨＰＶ１８
に特異的なＨＰＶＥ１１８Ｌ 5'-TGCATGTTTTAAAACGAAAGT-3'）のみから成る5'プ
ライマー混合物、並びに３種類のプライマー（ＨＰＶ１６に特異的なＨＰＶＥ１
１６Ｒ 5'-TTCCACTTCAGTATTGCCATA-3'、ＨＰＶ１８に特異的なＨＰＶＥ１１８Ｒ
5'-TTCCACTTCAGAACAGCCATA-3'及びＨＰＶ３０〜６０に特異的なＨＰＶＥ１ＲＥ
5'-TRYRKGMNYTAAAACGAAAGT-3'、ここでＲ＝Ａ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｋ＝Ｇ又
はＴ、Ｍ＝Ａ又はＣ、Ｓ＝Ｇ又はＣ、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ、Ｂ
＝Ｃ、Ｇ又はＴ、Ｄ＝Ａ、Ｇ又はＴ、Ｈ＝Ａ、Ｃ又はＴ、Ｖ＝Ａ、Ｃ又はＧを表
す）から成る３'プライマー混合物を作製した。ＨＰＶ１６特異的又はＨＰＶ１
８特異的５'及び３'プライマーを単独で又はそれぞれを組み合わせて用いること
も可能である。
【００１９】 蛍光プローブは、プライマーよりもより高いＴｍを確保するために長さを３０
〜３３塩基対とした。以下のＨＰＶ１６プローブ：FAM-5'ATAATCTCCTTTTTGCAGCT
CTACTTTGTTTTT-3'TAMRAを、ABI Prism7700、Sequence detection system（Perki
n Elmer社）を用いた増幅及び検出試験に用いた。増幅の立ち上げ（ramp）には
、（１）不純物除去酵素、ウラシルＮ'グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を活性化する
ための５０℃、２分、続いて（２）ＵＮＧを不活化しＤＮＡポリメラーゼ活性を
解放させるための９５℃、１０分、の２つの保持プログラムを含めた。この後に
、９５℃、１５秒の融解ステップ及び５５℃、１分のアニーリングステップから
成る２段階サイクルを合計５０サイクル行なった。不純物を検査するために、Ｄ
ＮＡ鋳型を除いたＰＣＲ構成成分のみを有する約８本のチューブを含めた。閾サ
イクル数（Ｃｔ）を、Sequence Detection Systemソフトウェアを用いて計算し
、ベースラインを自動的にセットした（最初の３〜１５サイクルでバックグラウ
ンド上１０ＳＤ）。全ての計算をＣｔ値を基に直接行なったため、標準曲線は用
いなかった。
〜３３塩基対とした。以下のＨＰＶ１６プローブ：FAM-5'ATAATCTCCTTTTTGCAGCT
CTACTTTGTTTTT-3'TAMRAを、ABI Prism7700、Sequence detection system（Perki
n Elmer社）を用いた増幅及び検出試験に用いた。増幅の立ち上げ（ramp）には
、（１）不純物除去酵素、ウラシルＮ'グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を活性化する
ための５０℃、２分、続いて（２）ＵＮＧを不活化しＤＮＡポリメラーゼ活性を
解放させるための９５℃、１０分、の２つの保持プログラムを含めた。この後に
、９５℃、１５秒の融解ステップ及び５５℃、１分のアニーリングステップから
成る２段階サイクルを合計５０サイクル行なった。不純物を検査するために、Ｄ
ＮＡ鋳型を除いたＰＣＲ構成成分のみを有する約８本のチューブを含めた。閾サ
イクル数（Ｃｔ）を、Sequence Detection Systemソフトウェアを用いて計算し
、ベースラインを自動的にセットした（最初の３〜１５サイクルでバックグラウ
ンド上１０ＳＤ）。全ての計算をＣｔ値を基に直接行なったため、標準曲線は用
いなかった。
【００２０】 ＨＰＶ ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの正規化 塗抹標本試料では、検出シグナルがベースラインを有意に越える際の増幅サイ
クル数を表す閾サイクル数（Ｃｔ）が実質的にばらついており、これは可能性と
して個々の塗抹標本間での少なくとも１００倍のＨＰＶ ＤＮＡコピー数の差を
反映していると思われる（データは示していない）。子宮頚部上皮細胞の採取方
法の性質からして、ＨＰＶコピー数の差は採取された細胞数を反映していると思
われる。個々の試料中に存在するゲノムＤＮＡ量に対するＨＰＶの概算値を正規
化するために、核遺伝子であるβ−アクチンを全ての塗抹標本において同じ増幅
法を用いて定量した。核ＤＮＡはどのような核ＤＮＡでも良いが、単一コピー遺
伝子が好ましい。本発明は、ＨＰＶ ＤＮＡを核ＤＮＡに対して正規化する方法
には依存しない。ウイルスＤＮＡ量をいずれかの好適な方法でゲノムＤＮＡと関
係づけて、相対的ウイルス感染量値を与える必要がある。例えば、その関係はゲ
ノムＤＮＡ量で割ったウイルスＤＮＡ量であることもできる。
クル数を表す閾サイクル数（Ｃｔ）が実質的にばらついており、これは可能性と
して個々の塗抹標本間での少なくとも１００倍のＨＰＶ ＤＮＡコピー数の差を
反映していると思われる（データは示していない）。子宮頚部上皮細胞の採取方
法の性質からして、ＨＰＶコピー数の差は採取された細胞数を反映していると思
われる。個々の試料中に存在するゲノムＤＮＡ量に対するＨＰＶの概算値を正規
化するために、核遺伝子であるβ−アクチンを全ての塗抹標本において同じ増幅
法を用いて定量した。核ＤＮＡはどのような核ＤＮＡでも良いが、単一コピー遺
伝子が好ましい。本発明は、ＨＰＶ ＤＮＡを核ＤＮＡに対して正規化する方法
には依存しない。ウイルスＤＮＡ量をいずれかの好適な方法でゲノムＤＮＡと関
係づけて、相対的ウイルス感染量値を与える必要がある。例えば、その関係はゲ
ノムＤＮＡ量で割ったウイルスＤＮＡ量であることもできる。
【００２１】 上述したように、解析した塗抹標本はほぼ２６年間に渡って作製されたもので
あり、塗抹標本の作製において使われた操作手順や試薬はこの間に変わっている
かもしれず、これが結果に影響している可能性がある。症例（Ｃｔ＝３７．３０
）及び対照例（Ｃｔ＝３７．５８）の間でβ−アクチンの中央値分布には差違が
なく、これはグループ間でＤＮＡの質に差がないことを示している（以下の表１
を参照されたい）。β−アクチンの閾値（Ｃｔ）の分布は期間を通じて何ら有意
な傾向を示さず、また症例及び対照例の塗抹標本間に有意な差はなかった（図１
）。
あり、塗抹標本の作製において使われた操作手順や試薬はこの間に変わっている
かもしれず、これが結果に影響している可能性がある。症例（Ｃｔ＝３７．３０
）及び対照例（Ｃｔ＝３７．５８）の間でβ−アクチンの中央値分布には差違が
なく、これはグループ間でＤＮＡの質に差がないことを示している（以下の表１
を参照されたい）。β−アクチンの閾値（Ｃｔ）の分布は期間を通じて何ら有意
な傾向を示さず、また症例及び対照例の塗抹標本間に有意な差はなかった（図１
）。
【００２２】 結果 症例で合計８７１例及び対照例で１１７例の塗抹標本がＨＰＶ１６型陽性であ
った（表１）。Ｃｔ値の分布は症例及び対照例の間で極めて異なり（図２）、中
央値は症例でＣｔ＝３７．５９、対照例でＣｔ＝４３．８８であった（表１）。
った（表１）。Ｃｔ値の分布は症例及び対照例の間で極めて異なり（図２）、中
央値は症例でＣｔ＝３７．５９、対照例でＣｔ＝４３．８８であった（表１）。
【００２３】
【表１】 Ｃｔ値とウイルスコピー数との間には逆相関関係があるため、症例及び対照例
の間の差違は症例におけるより多い平均ウイルス感染量と一致している。ＨＰＶ
１６のＣｔ値は歴時間（calendar time）を通じていかなる傾向も示しておらず
、患者及び対照例の間の差は歴時間を通じて一定にみえる（図１Ｂ）。したがっ
て、患者及び対照例の間のＨＰＶ１６ Ｃｔ値の相違は歴時間を通じたＤＮＡの
質の変化では説明することができない。
の間の差違は症例におけるより多い平均ウイルス感染量と一致している。ＨＰＶ
１６のＣｔ値は歴時間（calendar time）を通じていかなる傾向も示しておらず
、患者及び対照例の間の差は歴時間を通じて一定にみえる（図１Ｂ）。したがっ
て、患者及び対照例の間のＨＰＶ１６ Ｃｔ値の相違は歴時間を通じたＤＮＡの
質の変化では説明することができない。
【００２４】 ウイルス感染量（ＨＰＶ１６ Ｃｔ）と疾患の危険度との関係を条件つきロジ
スティック回帰分析を使って調べた。一人の女性からのすべての塗抹標本試料の
平均を基にしたオッズ比（ＯＲ）はそれぞれの２０パーセンタイルに対して統計
的に有意であり、より多いＨＰＶ感染量（より低いＨＰＶ１６ Ｃｔ）に従って
強い増加傾向を示している（表２）。これらの分析では、β−アクチンＣｔ値の
平均を用いてゲノムＤＮＡ量の違いによる影響を補正した。表２（Ｃｔ−ＨＰＶ
平均の下）に示したように、最も多いウイルス感染量（Ｃｔ＜３６．６６）を有
する塗抹標本を含むパーセンタイルに対するＯＲは、ＨＰＶ陰性と判定された女
性と比較してほぼ７０倍高い危険度を示す。同様に、３６．６６〜３８．９９間
のＣｔ値のパーセンタイル中の塗抹標本では、ＯＲは１９倍高い危険度を示し、
３８．９９〜４１．２５間のＣｔ値では８倍高い危険度を示し、４１．２５〜４
４．８間のＣｔ値では４倍高い危険度を示し、４４．８〜５０間のＣｔ値では２
倍高い危険度を示す。
スティック回帰分析を使って調べた。一人の女性からのすべての塗抹標本試料の
平均を基にしたオッズ比（ＯＲ）はそれぞれの２０パーセンタイルに対して統計
的に有意であり、より多いＨＰＶ感染量（より低いＨＰＶ１６ Ｃｔ）に従って
強い増加傾向を示している（表２）。これらの分析では、β−アクチンＣｔ値の
平均を用いてゲノムＤＮＡ量の違いによる影響を補正した。表２（Ｃｔ−ＨＰＶ
平均の下）に示したように、最も多いウイルス感染量（Ｃｔ＜３６．６６）を有
する塗抹標本を含むパーセンタイルに対するＯＲは、ＨＰＶ陰性と判定された女
性と比較してほぼ７０倍高い危険度を示す。同様に、３６．６６〜３８．９９間
のＣｔ値のパーセンタイル中の塗抹標本では、ＯＲは１９倍高い危険度を示し、
３８．９９〜４１．２５間のＣｔ値では８倍高い危険度を示し、４１．２５〜４
４．８間のＣｔ値では４倍高い危険度を示し、４４．８〜５０間のＣｔ値では２
倍高い危険度を示す。
【００２５】 ＨＰＶ１６感染量が多くなるに従って統計的に有意に増加するＯＲは、１個人
の女性から採取された最小又は最大Ｃｔ値を示す塗抹標本のみを用いても観察さ
れる。これは、長期間に渡って個々の女性が低い又は高いＨＰＶタイターのどち
らかを有する傾向にあることを意味する。
の女性から採取された最小又は最大Ｃｔ値を示す塗抹標本のみを用いても観察さ
れる。これは、長期間に渡って個々の女性が低い又は高いＨＰＶタイターのどち
らかを有する傾向にあることを意味する。
【００２６】
【表２】 最後に、各々の女性から診断の平均７．８年前に採取した最初のＨＰＶ１６陽
性塗抹標本のみに基づいたＯＲは、初めのパーセンタイルを除いた全てのパーセ
ンタイルに対して依然として有意であり、ウイルス感染量が多くなるに従って強
い増加傾向も示している（表３）。表３に示したように、なんらかの細胞学的異
常が見つかる前のある時期に単一塗抹標本が採取され、Ｃｔ＜３５．９である女
性は、ＨＰＶ陰性と判定された女性と比べて６０倍増加した子宮頚がん発生の危
険度を示す。同様に、ＨＰＶ陰性の女性と比較して、Ｃｔ値が３５．９〜３８．
７の女性は１９倍増加した子宮頚がん発生の危険度を、Ｃｔ値が３８．７〜４２
．０８の女性は２３倍増加した危険度を、Ｃｔ値が４２．０８〜４５．２６の女
性は７倍増加した危険度を、最後に、Ｃｔ値が４５．２６〜５０の女性は１．８
倍増加した危険度を示す。女性１人あたりわずか１つの塗抹標本しか含まれてい
ないため、高ウイルス感染量（低いＨＰＶ１６ Ｃｔ）とがんの危険度との関係
は塗抹標本間での依存関係によるものではない。また、各々の女性から採取した
最初の陽性塗抹標本のみの比較におけるこの結果は、症例及び対照例の標本採取
と診断との間の平均期間に差が無いため（データは示していない）、症例及び対
照例の不均整な標本採取によるものではありえない。
性塗抹標本のみに基づいたＯＲは、初めのパーセンタイルを除いた全てのパーセ
ンタイルに対して依然として有意であり、ウイルス感染量が多くなるに従って強
い増加傾向も示している（表３）。表３に示したように、なんらかの細胞学的異
常が見つかる前のある時期に単一塗抹標本が採取され、Ｃｔ＜３５．９である女
性は、ＨＰＶ陰性と判定された女性と比べて６０倍増加した子宮頚がん発生の危
険度を示す。同様に、ＨＰＶ陰性の女性と比較して、Ｃｔ値が３５．９〜３８．
７の女性は１９倍増加した子宮頚がん発生の危険度を、Ｃｔ値が３８．７〜４２
．０８の女性は２３倍増加した危険度を、Ｃｔ値が４２．０８〜４５．２６の女
性は７倍増加した危険度を、最後に、Ｃｔ値が４５．２６〜５０の女性は１．８
倍増加した危険度を示す。女性１人あたりわずか１つの塗抹標本しか含まれてい
ないため、高ウイルス感染量（低いＨＰＶ１６ Ｃｔ）とがんの危険度との関係
は塗抹標本間での依存関係によるものではない。また、各々の女性から採取した
最初の陽性塗抹標本のみの比較におけるこの結果は、症例及び対照例の標本採取
と診断との間の平均期間に差が無いため（データは示していない）、症例及び対
照例の不均整な標本採取によるものではありえない。
【００２７】
【表３】 これらの結果は、増加したＨＰＶ ＤＮＡウイルス感染量が子宮頚がんの重要
な危険因子であることを証明している。症例及び対照例は、上皮内がんの診断日
の８年前に至るまでウイルス感染量において差違を示している。このような長期
間のウイルス感染量の差違は、環境的又は遺伝学的危険因子のいずれかによるも
のであるかもしれない。感染の危険性に影響すると初期に提唱された性行動、喫
煙やＨＰＶサブタイプの違いなどの多くの環境因子も、原則として、ウイルス感
染量に影響する。高いＯＲもＨＰＶ１６感染への反応性における先天的な個人差
を反映しているもしれない。
な危険因子であることを証明している。症例及び対照例は、上皮内がんの診断日
の８年前に至るまでウイルス感染量において差違を示している。このような長期
間のウイルス感染量の差違は、環境的又は遺伝学的危険因子のいずれかによるも
のであるかもしれない。感染の危険性に影響すると初期に提唱された性行動、喫
煙やＨＰＶサブタイプの違いなどの多くの環境因子も、原則として、ウイルス感
染量に影響する。高いＯＲもＨＰＶ１６感染への反応性における先天的な個人差
を反映しているもしれない。
【００２８】 多いＨＰＶ１６ウイルス感染量に対して非常に高いＯＲが与えられるとすると
、腫瘍形成性ＨＰＶのサブタイプの定量は臨床的に有用であろう。したがって、
異なるＨＰＶ１６ウイルス感染量と関連した絶対危険度の尺度である陽性予測値
（ＰＰＶ）を、記載した方法にしたがって、患者・対照研究から評価した。この
解析に関しては、診断前１年以内に採取された塗抹標本を一切除外しなかった。
各々の女性から採取した最初の塗抹標本のみを使った解析では、β−アクチンが
効果修飾因子であることが判明した。従って、塗抹標本を、低いβ−アクチンＣ
ｔ値及び高いβ−アクチンＣｔ値を示す２つの群に分類した。ＰＰＶは、全ての
年齢群において、及び両方のβ−アクチンカテゴリーについても、ウイルス感染
量と一致して増加した（図３）。最初の塗抹標本がＨＰＶ１６陰性である女性に
おいて子宮頚上皮内がんが発生する確立は０．３〜０．８％間で変動している。
一方、核ＤＮＡ量の多い（Ｃｔ＞３４．７８）群において、最高のＨＰＶウイル
ス感染量を有するパーセンタイルに対するＰＰＶは最も若い年齢群において２７
％以上に達している。したがって、この集団の最高パーセンタイル中のＨＰＶ１
６ Ｃｔ値を示す２０代のある女性はがん発生の絶対危険度が２７％である。こ
れは、同年代群で陰性と判定されたある女性の危険度０．８％、尤度比（likeli
hood ratio）３４と比較されるべきである。
、腫瘍形成性ＨＰＶのサブタイプの定量は臨床的に有用であろう。したがって、
異なるＨＰＶ１６ウイルス感染量と関連した絶対危険度の尺度である陽性予測値
（ＰＰＶ）を、記載した方法にしたがって、患者・対照研究から評価した。この
解析に関しては、診断前１年以内に採取された塗抹標本を一切除外しなかった。
各々の女性から採取した最初の塗抹標本のみを使った解析では、β−アクチンが
効果修飾因子であることが判明した。従って、塗抹標本を、低いβ−アクチンＣ
ｔ値及び高いβ−アクチンＣｔ値を示す２つの群に分類した。ＰＰＶは、全ての
年齢群において、及び両方のβ−アクチンカテゴリーについても、ウイルス感染
量と一致して増加した（図３）。最初の塗抹標本がＨＰＶ１６陰性である女性に
おいて子宮頚上皮内がんが発生する確立は０．３〜０．８％間で変動している。
一方、核ＤＮＡ量の多い（Ｃｔ＞３４．７８）群において、最高のＨＰＶウイル
ス感染量を有するパーセンタイルに対するＰＰＶは最も若い年齢群において２７
％以上に達している。したがって、この集団の最高パーセンタイル中のＨＰＶ１
６ Ｃｔ値を示す２０代のある女性はがん発生の絶対危険度が２７％である。こ
れは、同年代群で陰性と判定されたある女性の危険度０．８％、尤度比（likeli
hood ratio）３４と比較されるべきである。
【００２９】 ＨＰＶ１６ウイルス感染量及びＰＡＰコードで決められた細胞学的スクリーニ
ング状況の関係を調べるために、異なるＰＡＰコードクラスに対するＨＰＶ１６
Ｃｔ中央値を症例及び対照例について計算した（表４）。ＰＡＰコード１は細
胞学的に正常な塗抹標本を表わす。症例及び対照例において、減少するＨＰＶ１
６ Ｃｔ値（増加するＨＰＶタイター）とより高いＰＡＰコードとの間に明瞭な
相関関係が認められた。興味深いことに、症例（ＰＡＰコード１）（ＨＰＶ１６
Ｃｔ＝３８．７）のなかで細胞学的に正常な塗抹標本における中央値は、対照
例（ＨＰＶ１６ Ｃｔ＝４４．３）のそれよりも実質的に低く、このことは、現
在のスクリーニング手段（ＰＡＰ塗抹標本など）では情報が得られないような早
い時期においてもがん発生の危険度が高い女性を識別するためにＨＰＶタイター
試験を用いることができることを証明している。
ング状況の関係を調べるために、異なるＰＡＰコードクラスに対するＨＰＶ１６
Ｃｔ中央値を症例及び対照例について計算した（表４）。ＰＡＰコード１は細
胞学的に正常な塗抹標本を表わす。症例及び対照例において、減少するＨＰＶ１
６ Ｃｔ値（増加するＨＰＶタイター）とより高いＰＡＰコードとの間に明瞭な
相関関係が認められた。興味深いことに、症例（ＰＡＰコード１）（ＨＰＶ１６
Ｃｔ＝３８．７）のなかで細胞学的に正常な塗抹標本における中央値は、対照
例（ＨＰＶ１６ Ｃｔ＝４４．３）のそれよりも実質的に低く、このことは、現
在のスクリーニング手段（ＰＡＰ塗抹標本など）では情報が得られないような早
い時期においてもがん発生の危険度が高い女性を識別するためにＨＰＶタイター
試験を用いることができることを証明している。
【００３０】
【表４】 このように、ＨＰＶ ＤＮＡウイルス感染量の評価は、子宮頚上皮内がんへ進
展する危険度が高い感染か又は低い感染かを区別する能力を顕著に向上させるこ
とができる。さらに、前述したように、これらの絶対危険度評価は最初のβ−ア
クチン陽性塗抹標本を用いて得られ、これらはほとんどの場合なんの異形成の兆
候もなく、また診断のほぼ８年前に採取されたものである。必然的に、ＨＰＶ
ＤＮＡウイルス感染量の評価は予防処置がまさに成功し得る子宮頚上皮内がん発
生の初期段階でおそらく有益であろう。従って、常用の婦人科的健康管理と併せ
てＨＰＶウイルス感染量の定量試験を加えることは、子宮頚がんになりそうな女
性を同定し、結果として、子宮頚がんの発生も減ずる簡便で費用対効果のある手
段になることは明らかである。
展する危険度が高い感染か又は低い感染かを区別する能力を顕著に向上させるこ
とができる。さらに、前述したように、これらの絶対危険度評価は最初のβ−ア
クチン陽性塗抹標本を用いて得られ、これらはほとんどの場合なんの異形成の兆
候もなく、また診断のほぼ８年前に採取されたものである。必然的に、ＨＰＶ
ＤＮＡウイルス感染量の評価は予防処置がまさに成功し得る子宮頚上皮内がん発
生の初期段階でおそらく有益であろう。従って、常用の婦人科的健康管理と併せ
てＨＰＶウイルス感染量の定量試験を加えることは、子宮頚がんになりそうな女
性を同定し、結果として、子宮頚がんの発生も減ずる簡便で費用対効果のある手
段になることは明らかである。
【００３１】 このような検査を適用する際には、試料は常用の婦人科的健康管理の一環とし
て採取され、相対的ウイルス感染量（試料の量に対して正規化されたＨＰＶ Ｄ
ＮＡ量）が調べられる。次に計測された相対的ウイルス感染量は、ウイルス感染
量と上記タイプのがんとの間で立証された危険度相関を基に、個人の危険度カテ
ゴリーを評価するために使われる。試験の結果（高い又は低い危険度カテゴリー
）に依存して異なる結論（例えば、継続したフォローアップ、治療）が提示され
る。
て採取され、相対的ウイルス感染量（試料の量に対して正規化されたＨＰＶ Ｄ
ＮＡ量）が調べられる。次に計測された相対的ウイルス感染量は、ウイルス感染
量と上記タイプのがんとの間で立証された危険度相関を基に、個人の危険度カテ
ゴリーを評価するために使われる。試験の結果（高い又は低い危険度カテゴリー
）に依存して異なる結論（例えば、継続したフォローアップ、治療）が提示され
る。
【図１】 図１Ａは、症例（白四角）及び対照例（白丸）の塗抹標本におけ
るβ−アクチン閾サイクル数（Ｃｔ）値の塗抹標本作製暦年（１９６９〜１９９
５年）に対する分布を示す。図１Ｂは、症例（白四角）及び対照例（白丸）の塗
抹標本におけるＨＰＶ１６閾サイクル数（Ｃｔ）値の塗抹標本作製暦年（１９６
９〜１９９５年）に対する分布を示す。
るβ−アクチン閾サイクル数（Ｃｔ）値の塗抹標本作製暦年（１９６９〜１９９
５年）に対する分布を示す。図１Ｂは、症例（白四角）及び対照例（白丸）の塗
抹標本におけるＨＰＶ１６閾サイクル数（Ｃｔ）値の塗抹標本作製暦年（１９６
９〜１９９５年）に対する分布を示す。
【図２】 図２は、対照例（上段ヒストグラム）と症例（下段ヒストグラム
）の塗抹標本におけるＨＰＶ１６閾サイクル数（Ｃｔ）値の分布を示す。ＨＰＶ
１６ Ｃｔ値（Ｘ軸上）は８群に分割され、それぞれの群の中央値が示されてい
る。Ｙ軸は塗抹標本の絶対頻度である。
）の塗抹標本におけるＨＰＶ１６閾サイクル数（Ｃｔ）値の分布を示す。ＨＰＶ
１６ Ｃｔ値（Ｘ軸上）は８群に分割され、それぞれの群の中央値が示されてい
る。Ｙ軸は塗抹標本の絶対頻度である。
【図３】 図３は、ＨＰＶ１６閾サイクル数（Ｃｔ）値分布の異なるパーセ
ンタイルでの女性の陽性予測値（ＰＰＶ）を示す。ＨＰＶ１６ Ｃｔ値の異なる
カテゴリーは表２からのものである。β−アクチンが効果修飾因子であることが
判明したため、核ＤＮＡ量の多い塗抹標本（β−アクチンＣｔ＜３４．７８（図
４Ａ））と核ＤＮＡ量の少ない塗抹標本（β−アクチンＣｔ＞３４．７８（図４
Ｂ）で別個の分析を行った。
ンタイルでの女性の陽性予測値（ＰＰＶ）を示す。ＨＰＶ１６ Ｃｔ値の異なる
カテゴリーは表２からのものである。β−アクチンが効果修飾因子であることが
判明したため、核ＤＮＡ量の多い塗抹標本（β−アクチンＣｔ＜３４．７８（図
４Ａ））と核ＤＮＡ量の少ない塗抹標本（β−アクチンＣｔ＞３４．７８（図４
Ｂ）で別個の分析を行った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マグヌソン，パトリック スウェーデン国エス−753 14 ウプサラ， ストゥレガタン ９ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 AA14 BA80 CA03 FA20 GA30 HA12 4B063 QA01 QA13 QA19 QQ43 QR32 QR35 QR39 QR55 QR62 QS34
Claims (13)
- 【請求項１】 ヒト被験者においてウイルス関連がんへの進展危険度を予測
する方法であって、 ａ）ヒト被験者試料中のウイルス核酸配列又はその断片の量を測定し； ｂ）該試料の量を測定し； ｃ）ａ）の値とｂ）の値とを関係づけて該試料中の相対的ウイルス感染量値を得
； ｄ）該値を用いて子宮頚がん進展危険度を評価し、より多いウイルス感染量があ
ると子宮頚がんへの進展危険度が増加することを意味する、 ことを含む方法。 - 【請求項２】 該試料の量を、ヒト核酸配列又はその断片を測ることで測定
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該ウイルス核酸配列が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
タイプ関連子宮頚がん由来である請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 該ウイルス核酸配列が、腫瘍形成性生殖器ＨＰＶタイプ由来
である請求項１、２又は３に記載の方法。 - 【請求項５】 該ウイルス核酸配列が、Ｅ１遺伝子、Ｅ６遺伝子、Ｅ７遺伝
子、Ｌ１遺伝子、又はそれらの断片由来である請求４に記載の方法。 - 【請求項６】 該試料の量が、ゲノム遺伝子由来のヒト核酸配列を測ること
により、あるいは同一量の生物試料を得るための技術機器を用いて、又は容量、
重量若しくは試料の量を正規化するための他の手段を用いて、細胞数計測、細胞
染色、細胞蛍光、全ＤＮＡ量などの生物試料の量を決定する方法により測定され
る請求項１、２、３、４又は５に記載の方法。 - 【請求項７】 該ウイルス及びヒト核酸配列がＤＮＡ又はＲＮＡ配列であり
、工程ａ）及びｂ）における測定を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＮＡＳ
ＢＡ、３ＳＲ、in situハイブリダイゼーション、ハイブリッドキャプチャーな
どの定量的ＤＮＡ又はＲＮＡ解析用の方法で行う請求項１〜６のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項８】 ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連子宮頚がんへの進展
危険度をウイルス核酸の増幅により予測するためのキットであって、 ａ）腫瘍形成性ＨＰＶタイプの保存Ｅ１遺伝子領域に特異的なプライマー；ＨＰ
Ｖ１６に特異的なＨＰＶＥ１１６Ｌ 5'-TACAGGTTCTAAAACGAAAGT-3'及びＨＰＶ１
６に特異的なＨＰＶＥ１１６Ｒ 5'-TTCCACTTCAGTATTGCCATA-3'；及び／又はＨＰ
Ｖ１８に特異的なＨＰＶＥ１１８Ｌ 5'-TGCATGTTTTAAAACGAAAGT-3'及びＨＰＶ１
８に特異的なＨＰＶＥ１１８Ｒ 5'-TTCCACTTCAGAACAGCCATA-3' を含むキット。 - 【請求項９】 更に、ｂ）ヒト被験者試料中のゲノムＤＮＡに特異的なプラ
イマーを含む請求項８に記載のキット。 - 【請求項１０】 ａ）における該プライマーが、以下の２種類のプライマー
から成る５'プライマー混合物：ＨＰＶ１６に特異的なＨＰＶＥ１１６Ｌ 5'-TAC
AGGTTCTAAAACGAAAGT-3'及びＨＰＶ１８に特異的なＨＰＶＥ１１８Ｌ 5'-TGCATGT
TTTAAAACGAAAGT-3'、並びに以下の３種類のプライマーから成る３'プライマー混
合物：ＨＰＶ１６に特異的なＨＰＶＥ１１６Ｒ 5'-TTCCACTTCAGTATTGCCATA-3；
ＨＰＶ１８に特異的なＨＰＶＥ１１８Ｒ 5'-TTCCACTTCAGAACAGCCATA-3'；及びＨ
ＰＶタイプ３０〜６０に特異的なＨＰＶＥ１ＲＥ 5'-TRYRKGMNYTAAAACGAAAGT-3'
、ここでＲ＝Ａ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｋ＝Ｇ又はＴ、Ｍ＝Ａ又はＣ、Ｓ＝Ｇ又
はＣ、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ、Ｂ＝Ｃ、Ｇ又はＴ、Ｄ＝Ａ、Ｇ又
はＴ、Ｈ＝Ａ、Ｃ又はＴ、Ｖ＝Ａ、Ｃ又はＧを表わす、から成る請求項９に記載
のキット。 - 【請求項１１】 更に、ＤＮＡ挿入色素を含む請求項９又は１０に記載のキ
ット。 - 【請求項１２】 更に、ｃ）標識ＨＰＶ特異的プローブ；及びｄ）ヒトゲノ
ムＤＮＡ特異的標識プローブ、を含む請求項９、１０又は１１に記載のキット。 - 【請求項１３】 該ＨＰＶ特異的プローブが、 ＨＰＶ１６プローブ：5'-ATAATCTCCTTTTTGCAGCTCTACTTTGTTTTT-3' ＨＰＶ１８プローブ：5'-CCGCCTTTTTGCCTTTTTCTGCCCACTAATT-3' ＨＰＶ３１プローブ：5'-TCTTCGTTTTGCTGTTTTACTGTTATTTTCTAT-3' ＨＰＶ３３プローブ：5'-TTTTCGTTTTCTGTATGTGCATTCTTTATTTTT-3' ＨＰＶ３５プローブ：5'-TCGTCGCTTTCGTGCTGTATTTTTATTTTCA-3' から選択される請求項１２に記載のキット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9900615A SE515668C2 (sv) | 1999-02-22 | 1999-02-22 | Metod och kit för tidig förutsägelse av cancer |
| SE9900615-7 | 1999-02-22 | ||
| PCT/SE2000/000350 WO2000050645A1 (en) | 1999-02-22 | 2000-02-22 | Method and kit for early cancer prediction |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002537779A true JP2002537779A (ja) | 2002-11-12 |
| JP2002537779A5 JP2002537779A5 (ja) | 2007-04-19 |
| JP5546085B2 JP5546085B2 (ja) | 2014-07-09 |
Family
ID=20414574
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000601208A Expired - Lifetime JP5546085B2 (ja) | 1999-02-22 | 2000-02-22 | 早期がん予測のための方法及びキット |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP5546085B2 (ja) |
| AT (1) | ATE315107T1 (ja) |
| AU (1) | AU3205600A (ja) |
| CA (1) | CA2367833C (ja) |
| DE (1) | DE60025336T2 (ja) |
| SE (1) | SE515668C2 (ja) |
| WO (1) | WO2000050645A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012032412A (ja) * | 2003-08-25 | 2012-02-16 | Roche Mtm Laboratories Ag | 可溶化身体サンプルにおける新形成疾患を検出するための方法 |
| JP2013534806A (ja) * | 2010-05-05 | 2013-09-09 | ドイチェス クレブスフォルシュングスツェントルム | 様々な子宮頸部病変におけるｈｒ−ｈｐｖの診断用転写産物及びスプライスパターン |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10009143B4 (de) | 2000-02-26 | 2012-04-26 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Nachweis von Humanen Papillomviren |
| GB0207242D0 (en) * | 2002-03-27 | 2002-05-08 | Norchip As | Universal detection of human papillomavirus mRNA |
| EP1819835B1 (en) | 2004-12-08 | 2010-08-04 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses |
| US8518639B2 (en) * | 2006-04-11 | 2013-08-27 | Bio-Rad Innovations | HPV detection and quantification by real-time multiplex amplification |
| DE102006041970A1 (de) * | 2006-08-28 | 2008-03-06 | Genome Identification Diagnostics Gmbh | Verfahren und Mittel zum Nachweis von humanen Papillomaviren |
| CN109593755A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-09 | 北京优迅医学检验实验室有限公司 | 一种用于提取保存的动物样品中基因组dna的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2629458B2 (fr) * | 1987-07-31 | 1991-08-09 | Ire Celltarg Sa | Nouvelles sondes d'acides nucleiques specifiques de differents types de virus de papillome humain |
| US5182377A (en) * | 1988-09-09 | 1993-01-26 | Hoffmann-La Roche Inc. | Probes for detection of human papillomavirus |
| DE69033850T2 (de) * | 1989-12-01 | 2002-06-06 | Vysis Inc | Nukleinsäuresonden zum Nachweis von HPV-Transkripts |
-
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012032412A (ja) * | 2003-08-25 | 2012-02-16 | Roche Mtm Laboratories Ag | 可溶化身体サンプルにおける新形成疾患を検出するための方法 |
| JP2013534806A (ja) * | 2010-05-05 | 2013-09-09 | ドイチェス クレブスフォルシュングスツェントルム | 様々な子宮頸部病変におけるｈｒ−ｈｐｖの診断用転写産物及びスプライスパターン |
| JP2016182139A (ja) * | 2010-05-05 | 2016-10-20 | ドイチェス クレブスフォルシュングスツェントルム | 様々な子宮頸部病変におけるｈｒ−ｈｐｖの診断用転写産物及びスプライスパターン |
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