JP5546085B2 - 早期がん予測のための方法及びキット - Google Patents
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Description
本発明は早期がん予測の分野に属する。さらに詳細には、本発明はヒト被験者におけるウイルス関連子宮頚がんを予測するための方法及びキットに関するものである。
ヒトパピローマウイルス(HPV)のある種のサブタイプ、特にHPV16及びHPV18の感染は子宮頚がんの主要な危険因子として長い間認識されており、がん生検の約95%はHPV DNAを含んでいる。HPVの感染は16〜24歳の若い女性に普通にみられるが、腫瘍形成性HPV塗抹標本を有する女性のわずか1%以下が子宮頚がんに進展する。従って、HPVの存在を検査する公知の方法は予測という点で価値が低い。
発明の概要
本発明は、子宮頚上皮内がんの臨床結果を早期に予測することを可能にする方法及びキットを提供する。本発明によれば、がんの発生の数年前に最初のHPV陽性塗抹標本が採取されたHPV陽性の女性において、子宮頚がんを予測することができる。
a)ヒト被験者試料中のウイルス核酸配列又はその断片の量を測定し;
b)上記試料の量を測定し;
c)a)の値とb)の値とを関係づけて上記試料中の相対的なウイルス感染量値を得る、ことを含む方法を提供する。1つの実施態様において、上記試料の量を、ヒト核酸配列又はその断片を測ることで測定し;
d)上記値を用いて子宮頚がん進展危険度を評価し、より多いウイルス感染量があると子宮頚がんへの進展危険度が増加することを意味する。
HPV16プローブ:5'-ATAATCTCCTTTTTGCAGCTCTACTTTGTTTTT-3'
HPV18プローブ:5'-CCGCCTTTTTGCCTTTTTCTGCCCACTAATT-3'
HPV31プローブ:5'-TCTTCGTTTTGCTGTTTTACTGTTATTTTCTAT-3'
HPV33プローブ:5'-TTTTCGTTTTCTGTATGTGCATTCTTTATTTTT-3'
HPV35プローブ:5'-TCGTCGCTTTCGTGCTGTATTTTTATTTTCA-3'
発明の詳細な説明
本発明を、添付の図面と関連させて以下に詳細に説明する。
保管されている塗抹標本からのDNAの抽出
保管されているパパニコロー染色塗抹標本からのDNA抽出を以下の操作手順で行なった:キシレン中でのインキュベーション、95%エタノールによる脱染色、プロテイナーゼK処理(60℃で最低1時間)、続いて飽和酢酸アンモニウムによるタンパク質沈澱。上清中のDNAをエタノールで回収し、生成沈澱を70%エタノールで洗浄し、乾燥させた後200μlのTE−低(TE−low)(10mMトリス塩酸、pH7.4、0.1mM EDTA)に溶解した。
PCR増幅は、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.4)、10mM EDTA、60nM受動性参照色素(passive reference dye)(Rox)、5mM MgCl2、0.25μM HPV E1 5'プライマー、0.5μMHPV E1 3'プライマー、100nMのHPV特異的2重標識プローブ、それぞれ200μMのdATP、dCTP及びdGTP、400μM dUTP、0.5UウラシルN'-グリコシラーゼ(AmpErase UNG; Perkin-Elmer)、1.25U DNAポリメラーゼ(Amplitaq Gold; Perkin-Elmer)、並びに塗抹標本から抽出したDNA2〜10μlを含む50μlの容量で行った。PCR混合液に加えたDNAの量は子宮頚部塗抹標本から得たDNAの1〜5%に相当する。プライマーの複雑さを減ずるために、本発明者らは、2種類のプライマー(HPV16に特異的なHPVE116L 5'-TACAGGTTCTAAAACGAAAGT-3'及びHPV18に特異的なHPVE118L 5'-TGCATGTTTTAAAACGAAAGT-3')のみから成る5'プライマー混合物、並びに3種類のプライマー(HPV16に特異的なHPVE116R 5'-TTCCACTTCAGTATTGCCATA-3'、HPV18に特異的なHPVE118R 5'-TTCCACTTCAGAACAGCCATA-3'及びHPV30〜60に特異的なHPVE1RE 5'-TRYRKGMNYTAAAACGAAAGT-3'、ここでR=A又はG、Y=C又はT、K=G又はT、M=A又はC、S=G又はC、W=A又はT、N=A、T、C又はG、B=C、G又はT、D=A、G又はT、H=A、C又はT、V=A、C又はGを表す)から成る3'プライマー混合物を作製した。HPV16特異的又はHPV18特異的5'及び3'プライマーを単独で又はそれぞれを組み合わせて用いることも可能である。
塗抹標本試料では、検出シグナルがベースラインを有意に越える際の増幅サイクル数を表す閾サイクル数(Ct)が実質的にばらついており、これは可能性として個々の塗抹標本間での少なくとも100倍のHPV DNAコピー数の差を反映していると思われる(データは示していない)。子宮頚部上皮細胞の採取方法の性質からして、HPVコピー数の差は採取された細胞数を反映していると思われる。個々の試料中に存在するゲノムDNA量に対するHPVの概算値を正規化するために、核遺伝子であるβ−アクチンを全ての塗抹標本において同じ増幅法を用いて定量した。核DNAはどのような核DNAでも良いが、単一コピー遺伝子が好ましい。本発明は、HPV DNAを核DNAに対して正規化する方法には依存しない。ウイルスDNA量をいずれかの好適な方法でゲノムDNAと関係づけて、相対的ウイルス感染量値を与える必要がある。例えば、その関係はゲノムDNA量で割ったウイルスDNA量であることもできる。
症例で合計871例及び対照例で117例の塗抹標本がHPV16型陽性であった(表1)。Ct値の分布は症例及び対照例の間で極めて異なり(図2)、中央値は症例でCt=37.59、対照例でCt=43.88であった(表1)。
Claims (11)
- ヒト被験者においてウイルス関連がんへの進展危険度を予測する方法であって、
a)ヒト子宮頸部から採取した細胞学的に異常の認められない試料中のヒトパピローマウイルス16(HPV16)核酸配列又はその断片の量を測定し;
b)該試料の量を測定し;
c)a)の値とb)の値とを関係づけて該試料中の相対的ウイルス感染量値を得;
d)該値を用いて子宮頚がん進展危険度を評価し、より多いウイルス感染量があると子宮頚がんへの進展危険度が増加することを意味する、
ことを含む方法。
- 該試料の量を、ヒト核酸配列又はその断片を測ることで測定する請求項1に記載の方法。
- 該ウイルス核酸配列が、E1遺伝子、E6遺伝子、E7遺伝子、L1遺伝子、又はそれらの断片由来である請求項1に記載の方法。
- 該試料の量が、ゲノム遺伝子由来のヒト核酸配列を測ることにより、あるいは同一量の生物試料を得るための技術機器を用いて、又は容量、重量若しくは試料の量を正規化するための他の手段を用いて、細胞数計測、細胞染色、細胞蛍光、全DNA量などの生物試料の量を決定する方法により測定される請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 該ウイルス及びヒト核酸配列がDNA又はRNA配列であり、工程a)及びb)における測定を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、NASBA、3SR、in situハイブリダイゼーション、ハイブリッドキャプチャーなどの定量的DNA又はRNA解析用の方法で行う請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法に使用される、ヒトパピローマウイルス16(HPV16)関連子宮頚がんへの進展危険度をウイルス核酸の増幅により予測するためのキットであって、
a)HPV16の保存E1遺伝子領域に特異的なプライマー;HPV16に特異的なHPVE116L 5’-TACAGGTTCTAAAACGAAAGT-3’及びHPV16に特異的なHPVE116R 5’-TTCCACTTCAGTATTGCCATA-3’
を含むキット。
- 更に、b)ヒト被験者試料中のゲノムDNAに特異的なプライマーを含む請求項6に記載のキット。
- a)における該プライマーが、以下の2種類のプライマーから成る5’プライマー混合物:HPV16に特異的なHPVE116L 5’-TACAGGTTCTAAAACGAAAGT-3’及びHPV18に特異的なHPVE118L 5’-TGCATGTTTTAAAACGAAAGT-3’、並びに以下の3種類のプライマーから成る3’プライマー混合物:HPV16に特異的なHPVE116R 5’-TTCCACTTCAGTATTGCCATA-3;HPV18に特異的なHPVE118R 5’-TTCCACTTCAGAACAGCCATA-3’;及びHPVタイプ30〜60に特異的なHPVE1RE 5’-TRYRKGMNYTAAAACGAAAGT-3’、ここでR=A又はG、Y=C又はT、K=G又はT、M=A又はC、S=G又はC、W=A又はT、N=A、T、C又はG、B=C、G又はT、D=A、G又はT、H=A、C又はT、V=A、C又はGを表わす、から成る請求項7に記載のキット。
- 更に、DNA挿入色素を含む請求項7又は8に記載のキット。
- 更に、c)標識HPV16特異的プローブ;及びd)ヒトゲノムDNA特異的標識プローブ、を含む請求項7〜9のいずれか1項に記載のキット。
- 該HPV特異的プローブが、
HPV16プローブ:5’-ATAATCTCCTTTTTGCAGCTCTACTTTGTTTTT-3’である請求項10に記載のキット。
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