CN1836166B - 在溶解的体样本中检测肿瘤疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对溶解的体样本中的肿瘤疾病的早期诊断方法，肿瘤疾病例如癌症及其前体阶段，特别是呼吸道癌症、泌尿系统癌症、生殖道癌症、与HPV感染相关的癌症或肛门和生殖道的癌症。本发明还涉及适用于此目的的检测试剂盒和体外诊断装置的开发。

Description

在溶解的体样本中检测肿瘤疾病的方法
本发明涉及溶解的体样本中的肿瘤的早期诊断的方法，如癌症及其前期状态，特别是呼吸道癌症、泌尿系统癌症、生殖道癌症、与HPV感染相关的癌症或肛门与生殖器的癌症。
背景技术
从五十年代中期之后，针对最不同的癌症(most differing cancers)提出了预防性计划。在许多发达国家已经建立起对于子宫颈癌的全部人群的筛选计划。然而，相似的筛选计划能够用于其它癌症实体以及诸如泌尿系统癌症、呼吸道以及其它癌症的前体阶段。下文以子宫颈癌为例强调现在预防计划的缺点。然而事实是必要的修改适用于其它用于任何癌症实体的预防性计划。
关于宫颈上皮内的瘤形成和宫颈腺体的损伤，预防性计划主要基于子宫颈的形态学和细胞学的细胞涂片检查(cytosmear)，既所谓的Pap检测，其是在从20岁之后的妇女的定期妇科学常规检查的基础上完成的。根据细胞的形态，将涂片分为不同强度的结构不良细胞改变。根据Pap I-V，这些强度分别指正常，轻微结构不良，相当严重结构不良，严重结构不良和浸润癌。如果Pap检测导致令人注意的结果，那么将要进行小的活组织检查并进行组织病理学检查，通过上述方法而确定结构不良的种类和强度并作为宫颈上皮内的瘤(CIN1-3)分类。
尽管所有的预防性计划，每年仍发生400000例新的子宫颈癌，并且已经称为妇女第二大常发肿瘤疾病。这尤其是因为最多达到30％的个体Pap检测为假阴性结果的事实。
在常规的宫颈上皮内的瘤形成的筛选中，使用拭子检测子宫颈的肿瘤损害。在此筛选过程中，不得不对不同种类的损害进行区分。产生损害的原因可以是例如炎症(由于感染物或物理或化学伤害)或肿瘤疾病。在形态学检查中，不同特性引起的损害的区分是困难的。因此，对于宫颈拭子和涂片检查，细胞学者和病理学者不得不进行特殊训练，并且甚至有经验的检查者对于基于细胞学标本的诊断的评估也具有高的内-和外-的观察者的不同。通常，检查结果基于检查病理学者/细胞学者对诊断标准的主观解释。作为结果，假阳性和假阴性的比例导致筛选检测仍然非常令人不满意。
然而，通过使用支持的分子工具可以加强检测结果的重复性。然而，仅仅通过附加使用分子标记不能克服与保存和制备标本相关的问题。当为了筛选的目的执行细胞学和组织学检查时，以及尤其当为了检测而使用分子标记时，另一个复杂性来自严格的预防以防止标本产生假相和不正确的结果。
这部分由于基于细胞的形态学信息的不稳定性，以及部分由于在检测过程中被检测的分子标记的不稳定性。如果标本的制备，运输和贮存没有按正确的方式进行，基于细胞的信息，或者甚至分子信息可能会丢失，或者可能被改变。因此可能不能进行诊断，或者可能倾向于假相。例如，由于被损坏的(物理或生物-/化学)细胞，使得对活检或细胞学标本的解释经常变得困难或者无法进行。另外，关于组织标本或活检标本，对于标本中容易迅速改变的分子成分的保护是复杂的，因为适当的防腐剂浸透整个标本需要一定时间。
尽管上文是使用子宫颈癌作为例子所显示的整个背景也应用于肿瘤疾病的一般预防计划，因为其它癌症实体的情况也非常与此相似。通常，本领域常规执行的以形态学为支持的诊断方法表现出两个主要的缺点。首先，该方法高度依赖于检查者的个人理解。其次，形态学信息容易受到腐败过程的影响，并因此在标本制备后产生假相。两个方面导致结果不适当的重复。
因此，本发明的目标是提供一种能够对肿瘤疾病例如癌症以及其前体阶段进行前期和可靠的诊断的方法。另外，通过本方法应该可以区分关于良性炎症或(组织)转化的改变与诸如结构不良损害和早期癌等肿瘤疾病之间的差别。而且，本发明提供在生化的基础上用于从溶解的标本中检测癌症的方法。标本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何种类，如用于基于细胞学的液体。
发明者发现使用液基细胞检测(LBC)样本作为标本物质的来源而用于开发用于生化的非细胞基础的医学上相关条件的诊断评估的诊断试剂盒是本发明的另一方面。在本领域，使用LBC样本用于开发基于细胞的方法模式。然而，使用本文公开的方法裂解标本使得发明者在基于标本的基础上开发生化试剂盒，该标本适合通过其它诊断方法提供关于患者疾病状况的信息。
Digene Corp.公开了一种从LBC样本中检测HPV核酸的方法。此方法使用LBC样本作为分析的基础。在裂解LBC样本含有的细胞之后实施对HPV核酸的检测。在此方法中对于从相同LBC样本制备的细胞学标本获得的信息，使用了将用于生化的非细胞基础的HPV核酸检测的非标准化量的LBC样本。因此Digene公开的这个方法仅仅限于定性检测。任何生化的非细胞基础的定量或半定量方法需要能够或者从生化标记或从对标本的显微的或流式细胞仪分析获得关于标本组合物的信息。在本发明中，使用用于诊断评估或用于开发试剂盒的LBC样本以及体外诊断装置使得以精确和可比较的方式提供用于生化的非细胞基础的检测的细胞学信息。对于显示细胞或细胞类型存在与否的标记而使用的生化标准可以忽略。在这方面使用LBC样本的优点是基于细胞的信息直接与均质的LBC样本相关，并且因此提供有价值的准确的用于评价生化的非细胞基础的检测结果的信息。
另一方面，在许多出版物中公开了在蛋白或核酸水平上从溶解的标本中检测分子标记的方法。然而，在这方面没有与使用LBC样本作为样品标本源联系起来。通常，本领域使用LBC方法以使能够改善细胞标本的形态学价值。因此LBC样本的应用领域仅仅显示在细胞学中。基于本领域在先文献的公开，没有公开制备随后用于生化检测的溶解的LBC样本的制备方法。另外，关于公开的LBC方法优点，其指出不要在与标本的细胞形态鉴定没有关系的任何方法中使用LBC样本。根据发明者的发现，使用溶解的LBC样本作为非细胞基础的生化的蛋白水平的检测的来源，其优点在于所提供的结果可以直接与细胞学标本的结果进行比较。在此方面基于蛋白的生化分析可以作为例如预检测或用于提供进一步的信息或甚至用于确认细胞学可疑的结果。在进一步的实施方案中，从基于生化的非细胞检测获得的信息可以用于设计将要应用的细胞学方法。
因此本文公开的改进的方法对于获得有效以及可靠的试剂盒以及体外检测方法具有很高价值。本文公开的用于开发试剂盒和体外诊断装置的方法获得具有可与依靠标准化得到的细胞评估结果比较的由基于非细胞生化分析产生的结果。在生化检测形式中使用的此标本的标准化参照于关于从由LBC样本制备的细胞学标本获得的信息而执行。该信息包括例如LBC样本的细胞结构，关于LBC样本体积的信息，关于LBC样本质量或关于仅仅通过从LBC样品制备一薄层标本而可获得的参数的信息。在此方面，发明者通过本文权利要求的方法提供了一个可靠的基于LBC样本的用于开发试剂盒和体外诊断装置的方法。
发明概述
本发明涉及用于在以人为对象的溶解的体样本中检测肿瘤疾病的方法。该方法包括下述步骤：(a)从人体获得体样本，(b)将体样本溶解在裂解介质中，(c)通过比较在所述溶解的体样本中的周期素依赖性激酶(细胞素-dependent kinase)的抑制因子的水平与存在于溶解的健康的人体样本中的相应抑制因子的水平，而测定所述溶解的体样本中的该周期素依赖性激酶的抑制因子的过量表达。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本，正如在液基细胞检测法(Liquid Based Cytology prosecces)中所使用的。
本发明进一步涉及用于检测依赖于细胞周期的蛋白激酶的抑制因子水平的检测试剂盒，该试剂盒包括所述周期素依赖性激酶的抑制因子的特异探针以及用于溶解体样本的裂解介质。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
在本发明特定的实施方案中，该试剂盒作为体外诊断装置被提供。因此，本发明还涉及用于检测溶解样本中周期素依赖性激酶的抑制因子的的体外诊断装置，其包括固定在固体载体上可识别周期素依赖性激酶的抑制因子的探针。
本发明进一步涉及开发用于对来自溶解体样本的医学相关情况诊断评估的试剂盒和体外诊断装置的方法，其中通过使用以存在于细胞保存液中的被保存细胞的形式的体样本而执行开发，其中所保存的细胞计划并制备以用于诸如液基细胞检测法的细胞学检测方法。计划用于液基细胞检测法的样本(下文命名为LBC样本)溶解在合适的裂解介质中，并且被用于开发在基于生化非细胞分析基础上的对来自溶解的体样本的医学相关情况进行检测的有功能的试剂盒和体外诊断装置。
本发明还涉及用于评估通过使用生化基于非细胞分析在溶解的体样本中存在或缺失或分子标记水平的医学相关情况的诊断的方法，其中体样本是LBC样本，并且通过检测在所述的溶解样本中蛋白、肽、核酸或其片断的存在或缺失或其水平而完成对分子标记的检测。在本发明中可以使用的标记分子被上文公开为“医学相关情况为特征的标记分子”。该方法可以应用到任何医学相关情况。
附图简要说明
图1显示在溶解的宫颈样本中检测p16INK4a水平的ELISA检测报告的OD值，详见实施例1。
发明详述
本发明基于申请者的在许多诸如癌症的肿瘤疾病中周期素依赖性激酶的抑制因子的基因产物过量表达的观点，其中的癌症例如呼吸道的癌症、生殖道的癌症、泌尿系统的癌症、HPV相关的癌症或肛门与生殖器的癌症、特别是子宫颈癌、以及这些癌症的前体阶段。周期素依赖性激酶的抑制因子的例子是蛋白p14、p15INK4b、p16INK4a、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1和p27KIP1。将在本发明中出现的，在功能上不是周期素依赖性激酶的抑制因子的细胞周期调节蛋白p14ARF，也包括在此“周期素依赖性激酶的抑制因子”的表述中。
申请者发现在细胞学标本中检测的过表达的周期素依赖性激酶的抑制因子的强度与相应的组织学标本中检测的结构不良的程度相关。
根据本发明，使用申请者的观点用于诸如癌症以及其前体阶段的肿瘤疾病的早期诊断的方法，其包括确定在体样本中周期素依赖性激酶的抑制因子的过表达。
根据本发明，使用分子标记可以支持或甚至取代细胞学和/或组织学检测方法。上述标记可以例如用于免疫细胞化学染色反应，或原位杂交反应过程中。结合形态学检测和基于标记分子的免疫细胞化学染色反应，可以导致诸如癌症，例如子宫颈癌，膀胱癌或肺癌的肿瘤疾病的特征增强的结果。即便使用使得结果更加可靠的分子方法作为支持时，形态学检测仍然是劳动量大、耗时并且因此而昂贵。另外，即使当用分子参数支持时，基于形态学细胞水平上的诊断容易遭受检测者个体的对形态学的个体理解。因此，该诊断依赖于执行检测的个人。
发明者能够进一步表明在特殊病例中，分子标记可以被用作诊断工具而不需要进一步的基于细胞的形态检测的支持。在没有基于细胞信息支持的情况下，仅仅在分子水平上对诸如癌症的肿瘤疾病的诊断方法受限于病例，其中标记或标记的水平应该对将要检测的情况具有特异性。如果标记是非人源的物质时，这是完全正确的。例如对病毒感染的检测可以在样本溶液中完成，因为组织中病毒存在的标记特性不会发生在未感染的人组织中。
然而，发明者发现某些人的周期素依赖性激酶的抑制因子可以作为在基于生化标记的检测方法中癌症的标记，尽管其是细胞周期调节蛋白，并且在任何正常增殖的人类细胞的细胞周期的特定阶段以低水平表达。
本发明使用的周期素依赖性激酶的抑制因子包括周期素依赖性激酶的抑制因子p14、p15INK4b、p16INK4a、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1和p27KIP1。另外除了周期素依赖性激酶的抑制因子，由p16INK4a基因一个可供选择的读框编码的细胞周期调节蛋白p14ARF也可以被用在本文公开的方法中。为了方便起见，在本发明内容中，其功能并非周期素依赖性激酶的抑制因子的细胞周期调节蛋白p14ARF也包括在“周期素依赖性激酶的抑制因子”的表述中。
本文使用的“p16”或“周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a”指周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a(也命名为CDKN2或MTS1)，其基因位于染色体9p21区域。p16INK4a首先在Serranl，M.，等人的1993年12月16日的Nature，366(6456)704-7中公开。本发明内容中使用的所有它们的文法形式中，术语“p16INK4a”或“周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a”指核酸以及多肽分子。因此“p16INK4a”或“周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a”包括例如RNA(mRNA，hnRNA等)，DNA(cDNA，基因组DNA等)，蛋白，多肽，蛋白聚糖，糖蛋白以及这些分子相应的片段。
本发明使用的周期素依赖性激酶的抑制因子或其它标记分子的“水平”指关于存在于样本中的标记(周期素依赖性激酶的抑制因子或其它标记分子)含量的半定量和定量值。定量值可以例如以浓度的形式表示。半定量值可以以水平的范围，例如未测出水平，低水平，中水平，高水平或任何适合的方式表示。诸如p16INK4a的标记的水平也可以用从属参数表示，例如在周期素依赖性激酶的抑制因子存在的情况下在一种化验方式中产生的信号的强度。在特定实施方案中，水平也可以指一个标记分子存在的定性检测。
因为存在于体样本(如宫颈标本，来自于口腔、尿、唾液等的标本)中某些良性细胞类型中表达周期素依赖性激酶的抑制因子(如p16INK4a)，基于周期素依赖性激酶的抑制因子水平而没有另外关于细胞形态学的信息的肿瘤疾病的诊断看起来是困难或不可能的。本领域技术人员已知最多达30％的宫颈标本，少数到许多组织转化的细胞可以与周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a发生中等或高水平的免疫反应。而且，在一定条件下可以存在于宫颈拭子上的子宫内膜细胞可以对p16INK4a反应阳性。在细胞学或组织学检测方法中，这个事实将不影响诊断，因为根据它们的细胞形态可以容易的将它们从结构不良的细胞中区分出来。
发明者惊讶的发现，通过定义周期素依赖性激酶的抑制因子的界值(如p16INK4a)，能够使得对结构不良的检测或诊断在不需要细胞形态学知识的情况下成为可能。
本发明的内容中使用的所有的文法形式的“肿瘤疾病”的表述指任何种类和起源的癌症以及其前体阶段。根据术语“肿瘤疾病”应该包括由术语“瘤形成”、“赘生物”、“癌症”、“前癌”或“肿瘤”所确定的主旨。对应于组织学情况的细胞学术语“结构不良”或“发育不良”也在本文使用的“肿瘤疾病”的范围之内。
可以应用在本发明方法中的肿瘤疾病包括例如，呼吸道肿瘤损害的肿瘤疾病，泌尿系统的肿瘤疾病，胃肠道的肿瘤疾病，肛门和生殖道的肿瘤疾病，与HPV感染相关的肿瘤疾病以及其它的肿瘤疾病。它们可以是呼吸道、泌尿系统、生殖道或肛门的癌症，HPV相关的癌症和特别是宫颈癌症。特别提及与后者相关的其前体阶段，例如宫颈上皮瘤形成(CINI-III)，原位瘤扩散(CIS)等。本文使用的以所有的文体形式的术语“前体阶段”包括所有癌症或其它任何恶性肿瘤的前体阶段以及前体。例如关于本文使用的宫颈癌症的前体或初期阶段指通过合适的分类系统对宫颈上皮瘤形成所鉴定的阶段，该系统例如CIN分类(CINI-III)，PAP分类(PAPI-PAPV)或Bethesda分类(NILM，LSIL，HSIL)。
关于呼吸道癌症可以包括呼吸道任何恶性情况，例如肺的、肺泡的、细支气管、支气管树以及支气管的、鼻咽区的、口腔的、咽的、鼻腔的以及鼻旁窦的癌症。肺癌例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、小细胞肺癌(carcinoma)、肺的腺癌、大细胞肺癌、腺鳞肺癌(adeno-squamous lung carcinoma)、肺的良性肿瘤、支气管腺瘤(broncheal gland tumor)或(恶性)间皮瘤。关于呼吸道整个肿瘤的概况可以在Colby TV，等人的Tumors of the Lower Respiratory Tract，Altlas of Tumor Pathology，Third Series，Fascicle 13，AFIP：Washington1995中找到，将其作为参考文献而合并入本文。
泌尿系统的肿瘤可以包括膀胱癌、肾的癌症、肾盂、输尿管的癌症和尿道的癌症等。生殖系统的肿瘤可以包括卵巢、子宫、睾丸、前列腺、附睾等的癌症以及其的前体阶段。
在本发明的某些实施方案，肿瘤疾病通常将指HPV相关的肿瘤疾病。本发明的这个方面适用于与HPV相关的肿瘤疾病，尤其是高风险HPV类型和粘膜型的HPV类型的肿瘤疾病。高风险的HPV可以包括HPV亚型，例如HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56和58。用于HPV感染的标记可以例如包括HPV基因L1，L2，E2，E4，E5，E6或E7的HPV表达产物。
表述“体样本”包括任何种类和天然的体样本。上述体样本的例子是分泌物、拭子、灌洗、体液、精液、细胞-和组织样本、血液、涂片、唾液、尿液、大便、脑脊液，胆汁、胃肠道的分泌物、淋巴、骨髓、抽吸物以及诸如针刺活检和(细)-针吸取的器官的活检标本。特别地，当检测肛门和生殖道癌症，如子宫颈癌时，需要涂片、拭子和活检。本发明全文使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。活检样本包括通过一些不同的诸如冷刀活检，LEEP(环电烙切除方法)活检等方法获得的标本。
本发明中使用的体样本可以包括固定的或保存的细胞或组织样本。细胞或组织样本可以例如被保存在标准的样本收集、储存或运输介质中，例如那些本领域技术人员已知的商业可获得的保存介质(福尔马林溶液、Cytyc“PreservCyt”或“CytoLyt”，Digene“UniversalCollection Medium”，Tripath Imaging“Cytorich”等)。本发明一个实施方案中，在标准样本收集介质中提供的细胞或组织样本是基于细胞学的液体样本(LBC样本)，其根据或类似于本领域技术人员已知的用于细胞学LBC制备的方法制备。合适的细胞保存介质可以包括一个或多个选自醇、醛、酮、酸、金属离子或汞(sublimate)、醚等的用于保存细胞组分的混合物。醇包括甲醇、乙醇、(正或异)丙醇、(正、异或叔)丁醇或高支链或无支链的醇。醛包括甲醛、乙醛、戊二醛等。也可以使用诸如丙酮的酮类。在标准的样本介质中使用的酸包括有机酸(乙酸、三氯乙酸、水杨酸和苦味酸)或诸如铬酸的无机酸。标准的样本溶液中可以包括金属例如银、铜、铬、汞、锇和铀。诸如乙酸铀酰、二铬酸钾、硫酸铵等的盐溶液可以是保存介质的组分。
根据本发明的方法可以使用保存在合适介质(醇等)中的细胞或固定的组织样本作为原材料。在一个实施方案中，体样本可以例如包括唾液样本、宫颈拭子、口腔拭子、尿道拭子或被转到含有醇的保存介质中的类似物。
另外，在本文公开的方法中可以使用在获得后立即进行细胞裂解的体样本。发明者发现许多好用的、迅速并容易的保存样本的分子特性的方法，而在这些方法中该样本的形态学信息已丢失。例如样本可以通过在获得之后立即或甚至在获得过程中将原材料的细胞组分溶解在合适的裂解介质中而制备成可以重复的易储存和运输的形式。体液可以直接从个体的躯体转移到含有合适的去垢剂和保存剂的溶液中。另外，组织样本可以立即转移至变性裂解环境(最终通过物理因素)并且被保存。在裂解介质中使用合适的试剂，可以保存原材料的分子组分，并且可以不发生降解。例如可以通过使用酶抑制剂而使酶活力降解最小化。因此，在该裂解介质中的检测样本的溶液可以在溶解时显示检测样本的分子特性。
根据本发明，体样本可以溶解在任何合适的裂解介质中。该裂解介质例如可以是离液剂(chaotropic agent)的水溶液，例如尿素、GuaSCN、甲酰胺，去垢剂的水溶液，例如阴离子去垢剂(如SDS，N-十二烷醇肌酸钠，去氧胆酸钠，烷芳基磺酸盐，长链(脂肪族)醇硫酸盐，烯烃硫酸盐和磺酸盐，α-烯烃硫酸盐和磺酸盐，硫酸盐甘油一酸酯，硫酸醚，硫代琥珀酸盐，链烷磺酸盐，磷酸酯，烷基异硫代硫酸盐，蔗糖酯)，阳离子去垢剂(如，氯化十六烷基三甲基铵)，非离子去垢剂(如，Tween 20，Nonidet P-40，Triton X-100，NP-40，lgepal CA-630，N-辛基-配糖物)或两性去垢剂(如，CHAPS，3-十二烷基-二甲基胺-丙烷-1-磺酸，十二烷醇二甲基胺氧化物)和/或氢氧化物碱，例如氢氧化钠或氢氧化钾。通常任何合适的液体可以用作本发明酯裂解介质的溶剂。液体可以是有机或无机的，并且可以是纯液体，液体混合物或含物质溶液的液体并可以含有其它物质以增强溶剂的性质。在一定的实施方案中，其中裂解细胞可以在使用高渗或低渗溶液或缓冲液或简单的水溶液或有机液体作为溶剂而不使用去垢剂的情况下完成。任何适合全部或部分溶解体样本细胞成分的液体将视为本文使用的裂解介质。因此，本文使用的裂解介质不需要包括缓冲液物质或具有缓冲能力。然而，在本发明某些实施方案中，裂解介质可以具有缓冲能力并可以含有缓冲物质。
在一个实施方案中，设计裂解介质，以便原材料中的细胞、细胞碎片、核酸、多肽、脂类以及其它潜在的生物分子能够溶解。在本发明进一步的实施方案中，可以设计溶剂以确保体样本中特异组分的不同的溶解能力，而除去其它不溶解的组分。
根据本发明用于溶解体样本的裂解介质可以进一步含有一个或多个防止原材料中组分降解的试剂。该组分例如可以包括酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂，RNA酶抑制剂，DNA酶抑制剂等。在本发明一个实施方案中，样本以从检测个体获得的形式直接裂解。蛋白酶抑制剂例如可以包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，天门冬氨酸蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，酸性蛋白酶抑制剂，碱性蛋白酶抑制剂或中性蛋白酶抑制剂。在本发明的某些实施方案中，可以通过化学方式完成对酶的抑制，例如通过盐浓度，PH，离液剂或类似试剂使酶变性。
在本发明另一个实施方案中，在裂解之前对体样本进行纯化。上述纯化方法例如可以包括洗涤除去诸如粘液或其类似的污染物，分离或浓缩细胞组分，保存或运输该细胞。例如在一个实施方案中，通过流式细胞仪或其它本领域技术人员已知的合适的细胞分选方式将细胞分离。因此，原材料的细胞组分包含于单一的样本溶液中。
用于本发明公开的方法中的样本制备也可以包括进一步制备样本的几个步骤，例如分离不溶解的组分，提取多肽或核酸，制备固相的被固定的多肽或核酸或制备与要检测的分子共价或非共价连接的小珠，膜或片。
表述“检测周期素依赖性激酶的抑制蛋白的过量表达”包括任何分别适合检测周期素依赖性激酶的抑制蛋白或其编码mRNA的表达以及相应基因扩增的方法。为了检测过量表达，要检测的体样本可以与来自健康个体的相应体样本或来自器官非病变区域的样本进行比较。该样本可以以标准形式表示。
可以通过不同方法完成与正常健康体样本的比较。在本发明一个实施方案中，通过包括与非病变组织和细胞样本的对照反应而直接进行比较。该非病变组织和细胞样本可以来自于健康个体或进行测试的个体的非病变区域或来自于已知的在周期素依赖性激酶的抑制因子表达水平方面为非病变细胞的培养细胞。在另一个实施方案中，可以通过比较所观测样本的周期素依赖性激酶的抑制因子的表达水平与已知的在正常健康样本中该周期素依赖性激酶的抑制因子的表达水平而间接完成比较。正常健康组织或细胞样本的所述因子的表达水平的知识可以来自许多代表性的检测或来自科学出版物提供的在正常健康细胞中该周期素依赖性激酶的抑制因子的表达水平的信息。比较可以通过应用周期素依赖性激酶的抑制蛋白或其核酸的浓度值而完成；或者是蛋白或核酸浓度的特征值，例如可以使用在定义的反应中的光密度值。另外，可以使用诸如多肽或重组蛋白的代替对照来表示已知的值。在正常健康样本中的p16INK4a存在的水平可以通过一个检测方法中的重组蛋白或多肽的对照样品所代表。
通常，对观测样本中的存在水平的比较可以根据在同一个检测步骤中测定的值或预先测定的值来完成。预定的值可以为整个检测方法确定。另外，值可以仅仅对一定的检测试剂有效。例如，参考值可以仅仅对限定的校准期有效，并且通过校准检测方法来定义。
例如，在健康人子宫样本中的周期素依赖性激酶的抑制因子的水平可以从一个标准的样本溶液中测定。标准样本溶液可以包括溶解的正常细胞或正常组织样本库的溶液。样本库例如可以是来自筛选人群的具有预评估正常诊断的细胞学标本库，或从组织标本获得的正常细胞库。另外，正常细胞库可以从正常宫颈上皮细胞的组织培养而获得。样本溶液例如可以根据每毫升样本溶液的细胞含量而标准化。可以使用任何其它的用于标准化的参数。样本溶液例如可以以标准形式被提供，以确保检测结果的稳定性和可重复性。在一特定实施方案中，上述溶液可以作为用于比较和校准的试剂盒的组分而被提供。
在一定的实施方案中，比较存在于患者样本中的周期素依赖性激酶的抑制因子的水平和已知的正常健康体样本中的水平的步骤具体化为使用相应周期素依赖性激酶的抑制因子的浓度的截断值(cut-offvalue)和域值。本文中的截断值是适合将正常健康样本从疾病样本中分开的值(例如，以mg/ml形式给出的p16INK4a的浓度，或在ELISA检测中限定条件下检测的光密度值)，例如，认为给出的值在截断值之上的所有样本是结构不良，其中所给出的值在截断值之下的样本认为是健康的。
在一定的实施方案中，可以以一定的方式设置域值和截断值，以将高等级的肿瘤疾病(HSIL或相应于例如浸润瘤，高等级结构不良或组织学确定的CIN 3损害的肿瘤疾病)从所有较低严重等级的肿瘤疾病(如LSIL)中分离出来。在另一定的实施方案中，截断值可以定义为从包括前体阶段的肿瘤疾病(LSIL和HSILL)区分健康样本(NILM)。为了适合不同的需要而选择合适的检测形式是可能的，不同的需要包括损害的早期诊断以及甚至损害前体的诊断，或检测需要立刻进行治疗的损害。
可以分别在核酸水平和蛋白水平对周期素依赖性激酶的抑制因子的过量表达进行检测。关于在蛋白水平上进行检测，例如可能使用直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子的抗体。这些抗体可以在最广泛的方法中使用，例如Wsester blot，ELISA或免疫沉淀。可以将抗体固定在诸如ELISA板，反应容器，小珠，球，膜，例如胶体金属(如金)的胶体，多孔膜，毛细管表面(如流动通过检测)，检测带或橡胶颗粒等的固体载体上。关于在核酸水平上检测，可以使用诸如核酸扩增技术或杂交技术等方法。核酸扩增技术包括所有种类的单步或多重步骤的诸如链反应的反应过程。链反应包括但不局限于PCR，NASBA，RTPCR，LCR等。杂交反应包括使用任何种类报告系统的任何杂交反应。杂交捕获反应以及其后的依靠抗体直接抗所述杂交体的杂交核酸检测反应。应用杂交反应在RNA转录水平上检测表达的例子例如RNA原位杂交反应。
本发明某些的实施方案中，对标记分子的检测在溶解的体样本溶液中实施。以此检测可以在溶液或使用固定在固体相上的试剂完成。
在本发明内容中使用的固体相可以包括多种固体物质的实施方案，例如平坦的表面，颗粒(包括微米，纳米颗粒或甚至较小的颗粒)。在一定的实施方案中，颗粒可以以球，珠，胶体或类似物的形式提供。
检测试剂盒或体外诊断装置中的试剂的固定可以通过直接固定或通过间接固定的方式完成。直接固定可以通过共价结合，非共价结合，联合或吸附到表面的方式实现。非直接固定可以通过将抗体结合到直接固定在固体相上的试剂上而实现。结合试剂例如包括抗生物素蛋白，链霉抗生物素，生物素，地高辛，抗体或类似物。
对一个或多个分子标记的检测可以在单一反应混合物或在两个或多个分开的反应混合物中实施。几个标记分子的检测反应例如可以同时在多孔的反应容器中实施。标记分子的检测反应可以包括一个或多个另外的反应，在该反应中检测试剂或者识别起始标记分子或优选识别用于检测起始标记的在先分子(例如一抗)。检测反应进一步可以包括显示细胞增殖紊乱的标记水平或标准标记水平的报告反应。
用于检测在溶解的样本中周期素依赖性激酶的抑制因子水平的检测反应可以在溶液或使用固定在固体相上的试剂而完成。在一定实施方案中，检测反应可以在溶液中完成；上述方法可以包括任何适合在溶液中检测分子相互作用(与抗体结合或类似结合试剂与抗原结合)的检测方法。检测分子相互作用的方法对于本领域技术人员是已知的，(这些方法包括改变电导率，质量改变，光-，紫外线-，IR-，磁场改变，等离子体共振等)。在某些实施方案中，检测可以包括将结合抗原的检测试剂复合物吸附到固相的方法。以此，根据本发明可以在检测反应过程中或甚至在检测反应开始之前使用将分析物非共价的结合到固相的方法。
用于检测标记分子的探针可以是任何特异与所述标记分子结合的分子。例如探针可以是抗原结合试剂，例如抗体(单克隆或多克隆)，抗体片段或包括抗原结合表位的人造分子，例如蛋白和核酸的DNA或RNA结合分子。与其它核酸结合的核酸例如可以是用于检测目的的寡聚核苷酸和引物。在一定实施方案中，甚至可以使用较大的核酸分子进行杂交反应。如果一个分子特异地与另一个分子相互作用，则称该分子可以识别另一分子。特异的相互作用例如可以是与另一个分子的特异结合。在本发明中使用的所有的文法形式的术语“抗体”通常指抗原的结合分子，其包括但不局限于多克隆或单克隆抗体，抗体片段，抗原结合决定簇，微小抗体，具有抗原结合特性的多肽模拟物(peptidomimetics)，抗促成素(anticalines)和二价二聚体(diabodies)。
报告反应可以是任何相应于标记和与标记结合的特异探针存在而产生信号的过程。例如，产生有色化合物，荧光化合物，发光化合物，放射性化合物的反应，或在检测设备的预定范围内将一个或多个这些化合物浓缩至可检测浓度的浓缩过程也可以作为报告反应。
根据本发明，可使用的检测反应的形式可以是印迹技术，例如Western-blot，Southern-blot，Northern-blot。对于本领域技术人员而言，印迹技术是熟知的技术，并且可以用作例如电印迹，半干印迹，真空印迹或点印迹。另外，可以使用用于检测分子的免疫性方法，例如免疫沉淀或免疫分析方法，例如EIA，ELISA，RIA，FIA(荧光免疫检测)测流方法(lateral flow assays)(使用多孔膜或毛细管)，免疫层析带，流通方法(flow through assays)，乳胶凝聚试验装置等。本发明使用的免疫检测装置可以包括竞争以及非竞争免疫分析，例如三明治分析。
可以使用基于核酸方法的杂交或扩增技术。杂交技术例如可以包括任何本领域技术人员已知的方法。在某些实施方案中，使用抗体直接结合用于检测的DNA-RNA杂交分子的杂交捕获方法来完成杂交反应。扩增反应可以使用PCR，NASBA，RT-PCR，LCR或其它合适的链反应。另外，甚至单一步骤或非链反应的连续反应也可以应用到核酸扩增中。
本发明某些的实施方案中，可以应用临床实验室完成免疫化学或基于核酸的检测方法。这些检测装置可以包括任何适合免疫化学或基于核酸的检测，如包括任何形式现场检测装置(point of care testingdevices)以及手动(bench top)装置或实验室装置。例如可以以开放或封闭平台系统提供该装置。该系统可以基于任何合适的方法学，例如微滴定板，多孔板，流通或测流系统(lateral flow system)，微芯片或基于矩阵的系统或小珠或基于膜的系统。使用的检测方法可以包括任何本领域技术人员已知的用于免疫化学或基于核酸检测反应的方法。该检测系统例如可以是发光系统(电发光，生物发光，光子发光，射线发光，化学发光，电化学发光)，基于荧光的系统，基于电导率检测系统，放射(光，UV，X-射线，γ射线等)，等离子体共振(如，表面等离子体共振SPR)或任何其它已知的方法。
本文使用的术语多孔物质通常应该应用于任何多孔物质的三维排列。该多孔物质例如可以包括作为膜、小珠或其它的化合物。
使用本发明的方法可以诊断癌症的早期，即其前体阶段。
本发明的另一个主旨涉及用于本发明实施方法的试剂盒。该试剂盒包括：
(a)用于检测周期素依赖性激酶的抑制因子表达的试剂，例如直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子或核酸或其一部分的探针，
(b)用于溶解体样本的裂解介质
(c)常规辅助试剂，例如缓冲液，载体，标记等，并且任选
(d)用于对照实验的试剂，例如周期素依赖性激酶的抑制蛋白或核酸以及其部分，或细胞制备物。
另外，可以存在一个或几个单独的组分。例如，可以有检测试剂和其它固定在固体相上的试剂。本发明某些实施方案中，试剂盒包括固定在固相上的用于检测p16INK4a的试剂，以及固定在固相上的其它特异的非检测试剂。
本发明某些实施方案中，用于检测周期素依赖性激酶的抑制因子的试剂盒作为体外诊断装置而被提供。
通常，根据本发明，试剂盒中包括的裂解介质可以是任何本领域技术人员已知的合适溶剂。试剂盒中使用的裂解介质例如可以是例如尿素、GuaSCN、甲酰胺等离液剂的有机或水溶液，去垢剂的水溶液，例如阴离子去垢剂(如SDS，N-十二烷醇肌酸钠，去氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate)，烷芳基磺酸盐，长链(脂肪族)醇硫酸盐，烯烃硫酸盐和磺酸盐，α-烯烃硫酸盐和磺酸盐，硫酸盐甘油一酸酯，硫酸醚，硫代琥珀酸盐，链烷磺酸盐，磷酸酯，烷基异硫代硫酸盐，蔗糖酯)，阳离子去垢剂(如，氯化十六烷基三甲基铵)，非离子去垢剂(如，Tween20，Nonidet P-40，Triton X-100，NP-40，lgepal CA-630，N-辛基-配糖物)或两性去垢剂(如，CHAPS，3-十二烷基-二甲基胺-丙烷-1-磺酸，十二烷醇二甲基胺氧化物)和/或氢氧化物碱，例如氢氧化钠或氢氧化钾。在某些实施方案中，其中裂解细胞可以在使用高渗或低渗溶液或缓冲液或简单的水溶液或有机液体作为溶剂，而没有使用去垢剂的情况下完成。任何适合全部或部分溶解体样本的细胞成分的液体被视为本文使用的裂解介质。因此，本文使用的裂解介质不需要包括缓冲液物质或具有缓冲能力。
本发明的某些实施方案中，为了获得最佳的检测结果，可以直接将应用到检测系统中的裂解介质的PH值调整到中性范围内。在更进一步的实施方案中，裂解介质的PH值的范围为4-10。在另一个实施方案中，PH值的范围为5-9。在优选的实施方案中，PH值的范围为6-8。在更优选的实施方案中，PH值的范围为6.5-7.5。
例如，裂解介质的例子可以选自表1中给出的组合物。
表1
裂解介质 Western blot中溶解的p16<sup>INK4a</sup>  与Elisa的相容性
  去垢剂
  0.1-1％SDS   +   +/-
  0.2-3％SDS   +   ＜0.5％
  0.2-3％DOC   ++   +/-
  0.1-1％n-辛炔配糖   +   是
  0.1-3％Triton x-100％   +   是
  0.1-1％Chaps   +   nd
  去垢剂混合物
  RIPA(1％NP40，0.5％DOC，0.1％SDS，PBS)40-100％ ++ 是
  SOX(0.5％DOC，0.5％n-辛炔配糖)40-100％ + 是
  Mtm裂解介质(3％Tritonx-100，0.4％SDS，PBS)   ++   是
  商售裂解介质：
  Dynal(Dynal，奥斯陆，挪威)   ++   是
  M-PER/B-PER(Pierce，罗克福德，伊利诺斯州)   ++   是
  混合物
裂解介质 Western blot中溶解的p16<sup>INK4a</sup>  与Elisa的相容性
  PBS中0.5-8M尿素   +++   相容性＜2M
  Lammli样品缓冲液   +++   无
  10-80％DMSO   +++   无
  10-80％甲酰胺   nd   无
  50-70％蚁酸   ++   无
  PBS   +/-   是
  柠檬酸盐缓冲液pH 6.0   +/- 是
  磷酸盐缓冲液中500mM NaCl   +/-   是
nd：未检测；+/-：不好；+：好；++：良好；+++：极好；
在一定情况下，溶液中的周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a能够被降解并因此而无法检测。如果样本直接转入裂解介质并且在其中存储一定时间，这是特别容易发生的事。为了避免降解，裂解介质另外可以包括一个或多个防止原材料中组分降解的试剂。该试剂例如可以包括诸如蛋白酶抑制剂的酶抑制剂，RNA酶抑制剂，DNA酶抑制剂等。抑制剂例如可以包括选择表2给出的组合物的蛋白酶抑制剂。
表2
抑制剂   被抑制蛋白酶的种类   浓度   水中溶解性   水中稳定性   P161NK4a在mtm裂解介质中的稳定性
抑肽酶   丝氨酸   0.6-2μg/ml   很好   好   无
苯甲脒   丝氨酸   0.5-4mM   好   好   无
bestatin   氨基肽酶   1-10μM   好   好   无
Calpeptin   半胱氨酸   0.3-1μM   好   好   无
抑制剂   被抑制蛋白酶的种类   浓度   水中溶解性   水中稳定性   P161NK4a在mtm裂解介质中的稳定性
胱蛋白酶抑制剂   半胱氨酸   1μM   好   好   无
E-64   半胱氨酸   1-10μM   好   好   无
EDTA   Metallo   0.5-5mM   好   好   无
弹性蛋白酶抑制   丝氨酸   0.5-2μg/ml   差   好   无
EST   半胱氨酸   20-50μg/ml   很不好   差   无
小牛血清   所有种类   10％   好   好   有
亮抑霉肽   丝氨酸/半胱氨酸   10-100μM   好   好   无
a2-   所有种类   1μM   好   好   无
巨球蛋白
NCO-700   半胱氨酸   0.5-100mM   差   差   无
Pefabloc＝   丝氨酸   0.2-10μM   好   很好   有
AEBSF
抑肽素A   Aspartic   1μM   很不好   差 无
PMSF   丝氨酸   0.2-10μM   很不好   很差   有
o-邻二氮杂菲   Metallo   1-10mM   很不好   差   无
DNA酶抑制剂和RNA酶抑制剂对于本领域技术人员是已知的，并且根据本发明可以在适当的条件下在裂解介质中使用。
为了稳定的目的，裂解介质还可以包括用于在降解中与样本蛋白竞争的bulk蛋白(如，诸如牛血清清蛋白或小牛血清清蛋白的清蛋白或其它bulk蛋白)。bulk蛋白例如可以与蛋白酶抑制剂组合存在或可以取代蛋白酶抑制剂而加入。在一个实施方案中，可以选择溶剂以使之与实施的方法(如ELISA)相兼容，以便溶解的样本可以直接使用在该方法中。
在本发明一些实施方案中，可以选择适合的裂解介质以便可以设立特异的截断值。
在某些实施方案中，试剂盒可以作为体外诊断装置被提供。如上文定义，一个体外诊断装置是一个试剂盒，其用于评估来自于人或动物体样本的医学相关情况的诊断。在本发明一定的实施方案中，体外诊断装置应该是任何满足98/79规章条款1(b)中所给出的体外诊断医学方法定义的范围内的装置。条款1(b)是：
“体外诊断医学装置指任何医学装置，其是试剂产物，测量器，对照物质，试剂盒，器械，设备或系统，无论单独使用还是组合使用，制造商的目的是体外用于标本检测，标本包括来自于人体的血液和捐赠的组织，其唯一或主要目的是提供关于生理或病理状态，或先天异常的信息；或确定受体的安全或兼容性；或监控治疗措施。”
体外诊断装置也可以应用到U.S.Class I IVD，考虑到其诊断行为，体外诊断装置通常不作为权利要求提供。因此，任何种类的ASR或其类似也可以理解为本文所使用的体外诊断装置。本发明一个实施方案中，体外诊断装置的特征是固定在固相上的特异于周期素依赖性激酶抑制因子的检测试剂。在一个实施方案中，检测试剂特异于周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a。
在本领域，有一些使用在组织学或细胞学标本中检测周期素依赖性激酶抑制因子p16INK4a的试剂的体外诊断装置。这些体外诊断装置是基于细胞的诊断方法，其检测在细胞或组织中的而非溶解的样本中的p16INK4a的的抗原。
在浸透细胞之后，诸如p16INK4a的周期素依赖性激酶的抑制因子作为细胞内抗原，仅仅可以与溶液中的检测试剂接触。因此，本领域已知的用于检测周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a的检测试剂的体外诊断装置排除了固定在固相上的检测试剂。本领域没有指导设计含有固定在固相上的p16INK4a的检测试剂的检测试剂盒或体外诊断。在溶解样本的基础上评估诊断的方法似乎在现有技术中没有看到并且之前也没有被建议。
这恰是本发明的一个方面，即提供一个体外诊断装置，该装置包括固定在固相上的直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子的探针，使得可以评估对溶解的样本的癌以及其前体损害的诊断。本发明一定的实施方案中，探针例如可以包括直接抗p14ARF和p16INK4a蛋白的核酸、抗体或其片段。本发明的体外诊断装置的优点是提供了容易和经济的对癌症及其前体损害诊断的评估方法。该检测适合用于筛选目的以及诊断目的，并且可以主要应用于诊断以及监控疾病过程。在某些实施方案中的体外诊断装置可以应用于临床实验室，用于现场检测或者甚至是个人应用中(。
包括用于检测周期素依赖性激酶的抑制因子的固定在固相上的试剂的该体外诊断装置可以用于多种不同癌症实体及其相应前期损害的检测。该体外诊断装置可以用于分析任何种类的裂解的体样本。
通过直接固定或间接固定的方法将探针固定在固相上。直接固定可以通过共价或非共价结合或组合到表面上完成。非直接固定可以通过将抗体结合到直接固定在固相上的试剂上完成。上述试剂可以包括抗体或其它结合试剂如抗生物素蛋白，链霉抗生物素，生物素，地高辛，或类似物。
本发明设想的体外诊断装置选自：
a.包括将直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子的抗体固定在ELISA板，ELISA条带或ELISA孔上的ELISA装置装置；
b.包括将直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子的抗体固定在检测条带，胶体金颗粒或橡胶颗粒的侧流检测装置(lateralflow test device)；
c.包括将直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子的抗体固定在多孔物质，或毛细管表面的流通检测装置；
d.包括将直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子的抗体固定在橡胶颗粒上的乳胶凝聚试验装置；
e.包括将直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子的抗体固定在小珠，膜或微球上的免疫检测装置。
ELISA装置可以是本领域技术人员已知的任何种类。这些方法包括三明治ELISA形式的方法，竞争ELISA形式以及其它ELISA形式的方法。
本发明一定的实施方案中，体外诊断装置包括用于溶解样本的裂解介质。在本发明进一步的实施方案中，体外诊断装置包括固定在固相上的用于检测特异周期素依赖性激酶的抑制因子的试剂且在固相上没有其它特异检测试剂。
根据本发明作为体外诊断装置的侧流检测装置是使用至少一个固定在固相上的与周期素依赖性激酶的抑制因子结合的试剂的任何侧流检测装置。该装置可以使用多种使检测结果可视的机制。在某些实施方案中，该检测可以使用直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子的第二个检测试剂或其它参与与可检测部分偶联的检测组分。该可检测部分可以包括胶体金，(有色)橡胶颗粒以及其它。
本发明使用的流通检测装置可以包括基于毛细管或多孔物质(例如膜、小珠或其它的三维排列的多孔物质)的装置。根据实施方案，孔或毛细管的大小需要调整以确保最佳流动条件。
本发明的另一个方面是直接抗周期素依赖性激酶的抑制因子的检测试剂或探针所固定或附着的固相在制造检测试剂盒或体外诊断装置或本发明的试剂盒中的应用。本发明一定的实施方案中，探针是抗体或其片段。在进一步的实施方案中，探针是寡聚核苷酸。
可以在制造的检测试剂盒或体外诊断装置中使用的固体相在上文描述，其可以包括任何适合的固体相。在某些实施方案中，固相是膜，多孔物质，平坦表面，(具有平坦或不平坦表面的)多孔板，胶体，颗粒以及其它。检测周期素依赖性激酶的抑制因子的探针可以被固定的任何固体相都可以用于制造根据本发明的试剂盒以及体外诊断装置。根据本发明，上述试剂盒的制造可以包括任何提供最终体外诊断装置的适合的行为。这些行为包括所有制造活动以及重包装，单个组分装配，再标记等。
提供开发用于对来自溶解体样本的医学相关情况诊断的试剂盒和体外诊断装置的方法是本发明的一个方面，其中通过使用存在于细胞保存介质中的以保存的细胞形式提供的体样本而实施开发，并且其中所保存的细胞被制备以用于诸如液基细胞检测法的细胞学检测方法。用于液基细胞检测法的样本(下文命名为LBC样本)溶解在合适的裂解介质中，并且被用于开发在基于生化非细胞分析基础上的对来自溶解的体样本的医学相关情况检测的试剂盒和体外诊断装置中。
根据本发明，使用用于诊断评估或用于开发试剂盒和体外诊断装置的LBC样本例如可以为非细胞生化检测提供精确和可比较的细胞学信息。根据从同样的LBC样本制备的细胞学标本获得的信息，通过使样品标准化而完成上述过程。在该方法中显示细胞或细胞类型存在与否的标记的生化标准被忽略。在这方面使用LBC样本的优点是基于细胞的信息直接与均质LBC样本相关，并且因此提供有价值的准确信息而用于评价生化的基于非细胞的检测结果。
使用LBC样本的领域可以能够提高细胞学标本的形态学价值。因此，使用LBC样本的领域被经典的仅仅指示用于细胞学。根据本发明，使用LBC样本作为用于检测存在于溶解的样本中的蛋白水平的基于非细胞的生化检测的来源，提供了基于非细胞的生化检测结果可以直接比较于细胞学标本的机会。在这方面，基于蛋白的生化分析可以作为例如预检测或提供进一步的信息或甚至确认细胞学模棱两可的结果。在进一步的实施方案中，从基于非细胞的生化检测获得的信息可以用于设计将要应用的细胞学方法。
用于开发产品的该方法的一个优点是可以使用曾用于对个体诊断评估的相同的标本对基于生化的结果进行评估。因此生化结果对诊断的可比性得到确认。
本发明中使用的LBC样本可以是保存在标准的样本收集液，储存或运输的介质中的任何细胞样本，例如那些本领域技术人员已知的商业可获得的保存介质(福尔马林溶液、Cytyc“PreservCyt”或“CytoLyt”，Digene“Universal Collection Medium”，Tripath Imaging“Cytorich”等)。因此，LBC样本包括存在于任何合适细胞保存介质中的细胞样本，合适的细胞保存介质可以一个或多个包括选自醇、醛、酮、酸、金属离子或汞、醚等的用于保存细胞组分的的混合物。醇包括甲醇、乙醇、(正或异)丙醇、(正、异或叔)丁醇或高支链或无支链的醇。醛包括甲醛、乙醛、戊二醛等。也可以使用诸如丙酮的酮类。在标准的样本介质中使用的酸包括有机酸(乙酸、三氯乙酸、水杨酸和苦味酸)或诸如铬酸的无机酸。标准的样本溶液中可以包括金属例如银、铜、铬、汞、锇和铀。诸如乙酸铀酰、二铬酸钾、硫酸铵等的盐溶液可以是保存介质的组分。
LBC样本可以是为多种诊断目的任何种类的细胞。目前，在人类健康诊断方面，制备的LBC样本来自细胞学和/或微生物学检测方法显示或看起来可行的身体任何部位。据信，对于大量的细胞学标本，LBC样本提供了最小化的细胞损失，并且很细微的保护形态学。因此根据本发明，LBC样本包括作为细针抽吸获得的样本。细针抽吸可以包括来自诸如乳腺，甲状腺(如结节)，肾，胰腺，前列腺，肺，淋巴结，胸膜，颈部肿块，卵巢，滑膜，肿瘤肿块等许多来源的标本。LBC样本可以进一步使用体液制备。合适的体液包括从人或动物体获得的大范围的液体，其包括但不局限于腹水，脑脊液，脓或渗出液。无论身体那里的渗出液可以看做LBC。渗出液的一些例子是心包的，胸膜的，滑液的以及腹部渗出液。LBC可以被应用的体液例如进一步包括更多的存在于一些肿瘤或诸如乳腺囊肿，卵巢囊肿或其它的囊肿的液体。从身体可获得的液体形式的样本进一步包括诸如唾液的粘液标本。LBC广泛的用于任何种类的脱落的细胞学标本。上述脱落的细胞学标本可以通过多种方法而获得，例如任何种类的拭子，刷(brushing)，刮片，涂片等。来自身体任何部位的诸如洗液(washes)，灌洗等标本也应该理解为脱落的细胞学标本。洗液，灌洗可以获得自身体广泛的部位，其包括但不局限于粘膜上皮，皮肤，任何内部或外部的身体上皮或其类似物。粘膜上皮例如可以是胃肠道的上皮，泌尿系统的上皮，肛门与生殖器的上皮，呼吸道上皮，直肠上皮，尿道上皮，子宫颈上皮，阴道上皮，阴户上皮，口腔上皮，子宫内膜上皮等。整个范围的脱落的细胞学标本可以使用LBC方法。
本发明使用的试剂盒为用于实施分析检测方法的组分的组合物。试剂盒可以包括所有或部分的正确实施检测的必要的试剂和材料。本发明一定的实施方案中的试剂盒进一步可以包括正确使用试剂盒组分的说明，例如包括可效仿的检测步骤，警告和危险信息以及进一步的使用试剂盒的必要信息。
如上文定义，一个体外诊断装置是一个试剂盒，其用于评估来自于人或动物体样本的医学相关情况的诊断。在本发明一定的实施方案中，体外诊断装置应该是任何满足98/79规章条款1(b)中所给出的体外诊断医学方法定义的范围内的方法。条款1(b)是：
“体外诊断医学装置指任何医学装置，其是试剂产物，测量器，对照物质，试剂盒，器械，设备或系统，无论单独使用还是组合使用，制造商的目的是体外用于标本检测，标本包括来自于人体的血液和捐赠的组织，其唯一或主要目的是提供关于生理或病理状态，或先天异常的信息；或确定受体的安全或兼容性；或监控治疗措施。”
体外诊断装置以可以应用到U.S.Class I IVD，考虑到其诊断行为，通常体外诊断装置不涉及到权利要求中。因此，任何种类的ASR或其类似也可以理解为本文所使用的体外诊断装置。本发明一定的实施方案中，本文公开的使用开发方法开发的检测试剂盒和体外诊断装置是基于蛋白或多肽的用于分子标记检测的检测试剂盒和体外诊断装置。
根据本发明应用开发的检测试剂盒和体外诊断装置的检测方法包括检测分子标记的水平，该分子标记在生化基于非细胞分析的基础上代表测试样本的医学相关情况的特性。根据本发明适合检测方法的标记可以是不同来源。适合检测怀疑的医学相关情况的标记的表达模式可以依赖于细胞的增值状况，不同分化状况，细胞类型或有机体。合适的标记的例子在下文列出。
关于本文开发的试剂盒和体外诊断装置中所使用的术语“诊断”通常包括一个医学相关情况存在与否的任何种类的评估。因此诊断包括这些过程，例如对易患病体质进行医学相关情况的筛选，筛选医学相关情况的前体，筛选医学相关情况，医学相关情况的临床或病例诊断等。本文使用的诊断或诊断评估可以进一步包括在生化基于非细胞检测的基础上患者治疗的预后评估或提供用于分类患者的信息。本文使用的医学相关情况的诊断可以包括任何情况的检测，其在细胞学，组织学，生化或分子生物学水平上能够检测，其在人的健康和/或身体中是有用的。上述检测例如可以包括医学诊断方法以及生命科学的研究方法。本发明一定的实施方案中，该方法用于诊断诸如疾病的医学相关情况。该疾病例如可以包括以细胞或组织的非野生型增殖特性为特性的疾病。
在一个实施方案中，诊断属于肿瘤疾病以及其前体阶段、在肿瘤疾病中监控疾病进程、评估肿瘤疾病的预后以及诸如在最小量残余疾病诊断过程中检测散布的肿瘤细胞的诊断。根据本发明的方法，其例如可以应用在癌症及其前体阶段的临床或病理诊断过程中，或者用于特殊肿瘤疾病的常规筛选检测中，例如在对宫颈损害的筛选检测中对拭子的检查，对肺癌的支气管灌洗检查或对例如结肠直肠损害的胃肠道损害的大便的检查。
根据本发明的试剂盒和体外诊断装置的开发方法可以应用到用于检测和诊断所有种类的医学相关情况的试剂盒和体外诊断装置中。
根据本发明使用的医学相关情况例如可以是组织、体液、分泌物、洗液或拭子的组成成分。上述情况例如可以包括体液的细胞成分，例如血液的成分，脑脊液的成分，或精液的成分。在本发明中，成分例如可以是特殊细胞类型(如诸如病毒等的病原体，肿瘤发生前的，肿瘤和/或结构不良的细胞等)的存在与否，特别细胞类型的分化模式的存在与否，特殊细胞类型的总数(如，红细胞，白细胞，精子等)，任何细胞种类的所有细胞的总数，或样本中具有其它特征的细胞部分存在与否。
另外，医学相关情况还可以包括与细胞或组织相关的紊乱。将要被诊断的这种情况可以包括与在细胞学或组织学组织样本中的细胞相关的参数。该情况可以包括存在于组织样本中的细胞的分化模式，例如外科切除术样本，活检样本，拭子，灌洗样本等。该情况例如可以包括先天疾病，发炎疾病，机械疾病，外伤疾病，动脉管疾病，退行性疾病，生长紊乱，良性肿瘤，恶性肿瘤等。根据本发明该情况的另一个方面可以包括以增生特性是否存在为特征的情况。以增生特性是否存在为特征的情况例如可以是细胞增生紊乱。
根据本发明的细胞增生紊乱包括这样的疾病，其特征在于相比于正常对照细胞或组织的生长特性，而存在细胞和组织不正常的生长特性。例如细胞或组织的生长异常加速、减速或可以被异常调控。上文使用的异常调控可以包括对于正常发生的生长调控的影响而表现的细胞或组织的任何非野生型的反应的存在与否。细胞或组织生长过程中异常例如可以包括肿瘤或增生。
在一个实施方案中，细胞增生紊乱是诸如肿瘤的肿瘤疾病。肿瘤可以包括头和颈的肿瘤，呼吸道的肿瘤，肛门和生殖器的肿瘤，胃肠道的肿瘤，泌尿系统的肿瘤，生殖系统的肿瘤，内分泌系统的肿瘤，中枢和外周神经系统的肿瘤，皮肤及其附属物的肿瘤，软组织和骨的肿瘤，淋巴系统和造血系统的肿瘤等。肿瘤例如可以包括诸如良性和恶性肿瘤，癌，肉瘤，白血病，淋巴瘤或结构不良。在一个特别实施方案中，例如肿瘤是头和颈的癌，呼吸道的癌，肛门和生殖器的癌，胃肠道的癌，皮肤及其附属物的癌，中枢和外周神经系统的癌，泌尿系统的癌，生殖系统的癌，内分泌系统的癌，软组织和骨的癌，淋巴系统和造血系统的癌。
肛门和生殖器的肿瘤可以包括会阴和阴囊皮肤的癌，子宫颈癌，阴户癌，阴道癌，阴茎癌，肛门癌等。子宫颈癌可以包括鳞状损害，腺体损害或其它上皮肿瘤。鳞状损害包括例如宫颈上皮内的瘤形成(轻微的，中度的和严重的结构不良)，原位癌，鳞状细胞癌(如，角质化，非角质化，疣，似疣的，乳突状的，淋巴上皮瘤样的)。腺体损害可以包括非典型性增生，原位腺癌，腺癌(例如粘蛋白的，子宫内膜样的，清除细胞，恶性腺瘤，乳突的，严重的或中度的腺瘤)。其它上皮瘤可以包括鳞腺癌，玻璃态细胞癌，腺体包囊癌，腺体基底癌，良性肿瘤，小细胞癌和未分化癌。为了更多详细信息，将Kurman，R.，Norris，H.，，等人，Tumors of the Cervix，Vagina，and Vulva，Atlas of Tumor Pathology，1992，AFIP的内容通过引用而并入本发明。
胃肠道肿瘤可以包括结肠癌，升结肠的癌，降结肠的癌，横结肠的癌，乙状结肠癌，直肠癌，小肠癌，空肠癌，十二指肠癌，胃癌，食管癌，肝癌，胆癌，胆系统癌，胰腺癌等。关于胃肠道损害的全面的概述在“Hamilton Sr，Aaltonen La(EDS.)：World Health OrganizationClassification Of Tumours，Pathology And Genetics Of Tumors Of TheDigestive System，Iarc Press：Lyon 2000”中阐述，其通过引用而并入本发明。
呼吸道肿瘤可以包括任何呼吸道的恶性情况，例如肺的、肺泡的、细支气管、支气管树以及支气管的、鼻咽区的、口腔的、咽的、鼻腔的以及鼻旁窦的癌症。肺癌例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状上皮细胞肺癌、小细胞肺鳞癌、肺的腺癌、大细胞肺癌、腺鳞状肺上皮癌、肺的良性肿瘤、支气管腺瘤或(恶性)间皮瘤。关于呼吸道整个肿瘤的概况可以在Colby TV，等人的Tumors of the Lower RespiratoryTract，Altlas of Tumor Pathology，Third Series，Fascicle13，AFIP：Washington 1995中阐述，其将作为参考文献而合并入本文。
泌尿系统的肿瘤可以包括膀胱癌、肾、肾盂的癌症、输尿管的癌症和尿道的癌症等。生殖系统的癌症可以包括卵巢、子宫、睾丸、前列腺、附睾等的癌症以及其的前体阶段。
在所有情况中，根据本发明的方法开发的试剂盒和体外诊断装置中的方法也可以应用到损害，肿瘤或癌症的前体阶段。
在一个实施方案中，方法适合检测散布的肿瘤细胞或转移的肿瘤细胞。
在本发明一个实施方案中，癌症例如是子宫颈癌，结肠癌，胃癌，乳癌，膀胱癌，肺癌，口腔癌等。
本发明使用的开发方法应该适合所有的设计和实施的开发功能，以便使得制造者能够控制最终试剂盒或体外诊断装置，并计划商业销售该试剂盒和体外诊断装置。如本发明使用的试剂盒和体外诊断装置的开发应该适合所有的活动，该活动与设计和开发，设计和开发的鉴定，设计和开发的确认，实施数据的评估，试剂盒和体外诊断装置的安全和有效数据的评估有关。在一个实施方案中，开发应该适合试剂盒和体外诊断装置的设计和开发的输出数据的检测是否符合于所期望的用途。在这方面，期望的用途应该被理解为使用试剂盒和体外诊断装置的检测或诊断目的。
根据本发明公开的方法开发的试剂盒和体外诊断装置的特征在于，代表医学相关情况的标记分子的检测是在基于非细胞的生化分析的基础上实施的。本发明使用的基于非细胞的生化分析应该指所有的在溶液中检测被分析物或标记的方法，其中没有使用基于细胞形态学或组织结构的信息作为诊断的评估。(细胞和组织残余物不需要从溶液中分离出来。)所述的基于非细胞的生化分析在获得的信息基础上建立，所述获得的信息来自于被检测样本溶液中的一个或多个标记分子的存在与否的检测，或来自于被检测样本溶液中的一个或多个标记分子的水平的检测。在本发明的某些实施方案中，设计的试剂盒和体外诊断装置用于对仅仅一个单一分子标记进行检测。在本发明进一步的实施方案中，设计的试剂盒和体外诊断装置用于对仅仅一系列分子标记进行检测。通常，本发明公开的开发的方法可以应用到一些类型的试剂盒和体外诊断装置中。试剂盒和体外诊断装置的不同实施方案的描述已在上文给出。
在基于非细胞生化分析的过程中对所述标记分子的检测可以在溶液中完成，或使用固定在固相上的试剂完成。在本发明的某些实施方案中，对标记分子的检测在溶解的体样本的溶液中实施。因此，检测可以在溶液中或使用固定在固相上的试剂而完成。在本发明中使用的固相可以包括多种固体物质，例如平坦的表面，颗粒(包括微米，纳米颗粒或甚至较小的颗粒)。在某些实施方案中，颗粒可以以珠，胶体或类似物的形式提供。试剂在检测试剂盒和体外诊断装置的固相上的固定可以通过直接固定或间接固定而有效地完成。直接固定可以通过共价结合，非共价结合，联合到表面的方式实现。非直接固定可以通过将试剂(如抗体，探针等)结合到直接固定在固体相上的试剂而实现。所述直接固定在固体相上的试剂包括抗体或其他结合试剂例如链霉抗生物素、生物素等。对一个或多个分子标记的检测可以在单一反应混合物或在两个或多个分开的反应混合物中实施。一些标记分子的检测反应例如可以同时在多孔的反应容器中实施或在一个或两个或多个独立的试验带上实施。细胞增殖紊乱的特征性标记分子可以被特异地识别这些分子的试剂检测。检测超过一个标记分子的检测反应可以包括使用识别起始标记分子或优选识别用于与起始标记分子识别的在先分子(例如一抗)的检测试剂的一个或多个另外的检测反应。检测反应进一步可以包括显示代表细胞增殖紊乱的标记的水平的报告反应。
本发明中使用的标记分子在所有时间指代表医学相关情况特征的标记分子。本发明使用的所有文法形式的术语“标记分子”或“代表医学相关情况特征的标记分子”指核酸以及多肽分子。上述标记分子因此包括例如RNA(mRNA，hnRNA等)，DNA(cDNA，基因组DNA等)，蛋白，多肽，蛋白聚糖，糖蛋白以及这些分子相应的片段。
本发明使用的标记分子的水平指样本中关于该标记分子的半定量以及定量值。定量值可以例如以浓度的形式表示。半定量值可以以水平的范围，例如未测出水平，低水平，中水平，高水平或任何适合的方式表示。标记的水平也可以使用一个依赖的参数代表，例如相应于标记分子的存在，而在一种化验方式中产生的信号的强度。
本发明使用的用于检测标记分子的探针可以是任何特异结合于所述标记分子的分子。例如探针可以是抗原结合试剂，例如抗体(单克隆或多克隆)，抗体片段或包括抗原结合表位的人造分子，例如蛋白和核酸的DNA或RNA结合分子。与其它核酸结合的核酸例如可以是多肽核酸(PNAs)或用于检测目的物的寡聚核苷酸或引物。
如果一个分子特异地与另一个分子相互作用，则称该分子可以识别另一分子。特异的相互作用例如可以是与另一个分子的特异结合。
报告反应例如可以是产生有色化合物的反应。在本发明一个实施方案中，与特异标记相关的报告物质产生不同的颜色。在另一个实施方案中，标准化的标记特异性报告物可以是根据存在于样本中的标准化的标记水平而淬灭由代表医学相关情况的标记特异的报告分子所产生的信号的分子。然而在另一个实施方案中，报告反应可以产生具有不同波长特性的荧光染料。在本发明进一步的实施方案中，报告反应可以包括具有针对任一需要检测的标记的具有不同波长特性的报告物质的发光反应。在本发明另一个实施方案中，报告反应可以包括释放放射性射线以及附加的用于观测或量化这些射线的方法。在一个实施方案中，不同的标记分子可以通过具有不同能量特性的放射核素释放射线的试剂而对其识别，以便指代标记分子的信号可以被区分开。
根据本发明，在试剂盒和体外诊断装置中使用的检测反应的应用方式可以是印迹技术，例如Western-blot，Southern-blot，Northern-blot。对于本领域技术人员而言，印迹技术是熟知的技术，并且可以用作例如电印迹，半干印迹，真空印迹或点印迹。另外，也可以使用用于检测分子的免疫性方法，例如免疫沉淀或免疫性检测方法，例如EIA，ELISA，RIA，FIA侧流检测分析，免疫层析带(immunochromatographic strip)等。本发明使用的免疫分析可以包括竞争以及非竞争免疫方法。
在根据本发明的方法开发的试剂盒和体外诊断装置的一定的实施方案中，免疫化学或基于核酸的检测方法可以应用临床实验室检测装置完成。该检测装置可以包括任何适合免疫化学或基于核酸检测的装置，包括任何形式例如现场检测装置(point of care testing devices)以及手动(bench top)或实验室方法。该装置例如可以以开放或封闭平台系统被提供。该系统可以基于任何合适的方法学，例如微滴定板，多孔板，流通或侧流检测系统，微芯片或基于矩阵的系统或小珠或基于膜的系统。使用的检测方法可以包括任何本领域技术人员已知的用于免疫化学或基于核酸检测反应的方法。该检测系统例如可以是发光系统(电发光，生物发光，光子发光，射线发光，化学发光，电化学发光)，基于荧光的系统，基于电导率检测系统，放射(光，UV，X-射线，γ射线等)，或任何其它已知的方法。
在本发明一个实施方案中，其为根据本发明公开的方法而设计和开发的试剂盒和体外诊断装置所使用的用于检测标记分子水平的方法，可以是任何适合检测生物学样本中甚至非常少量的特异分子的方法。另外，可以使用任何不考虑灵敏度的检测标记分子的方法。根据本发明的检测反应例如可以包括在核酸水平的检测反应和/或在多肽水平的检测反应。在本发明一个实施方案中，标记分子的检测可以包括特别的变异片段的检测。在本发明另一个实施方案中，检测方法可以包括对修饰的标记分子的检测，例如样本中多肽的磷酸化或糖基化等，或核酸分子的甲基化。
在本发明一个实施方案中，可以测定诸如p16INK4a、p14ARF、TSLC1、封闭蛋白、pRB、Her-2/Neu、p53、p21WAF1/CIP1、p27KIP1或其它基因的核酸甲基化状态。超甲基化存在与否或在甲基化基础上LOH状态的检测可以显示医学相关情况的存在。
在本发明一个实施方案中，以检测标记分子水平的方式设计的试剂盒和体外诊断装置可以通过检测存在于样本中的编码标记分子的核酸或其片段的水平而完成。检测核酸分子的方法对于本领域技术人员是已知的。检测核酸的方法例如可以通过下述步骤而完成：待检测分子与互补的核酸探针的结合反应，特异结合核酸的蛋白或其它实体特异性地识别并与所述的核酸结合。该方法也可以在体外并且直接在原位实施，例如在检测染色反应的过程中实施。根据本发明的方法，在核酸水平上检测样本中标记分子的另一个方法通过对核酸进行例如聚合酶链式反应的扩增反应而实施，其可以以定量的方式完成。在本发明一个实施方案中，例如可以使用实时RT PCR反应以定量存在于细胞增殖紊乱的样本中的标记RNA的水平。
在本发明另一个实施方案中，以检测标记分子水平的方式设计的试剂盒和体外诊断装置可以通过检测蛋白的表达水平而完成。在蛋白水平上对标记分子的检测例如可以在包括特异地与被检测标记分子结合的试剂的反应中完成。这些结合试剂例如可以包括抗体，抗原结合片断，两种功能的杂交抗体，含有最小的抗原结合表位的多肽模拟物等。结合试剂可以在许多不同检测技术中使用，例如Western-blot，ELISA，RIA，EIA，流通方法，侧流检测装置，latex-agglutination，免疫层析带或免疫沉淀。通常，基于结合试剂的检测也可以在体外原位直接完成，例如在免疫染色反应的过程中完成。根据本发明，其它任何适合检测生物学样本溶液中的特定多肽含量的方法均可被使用。
对于本领域技术人员，用于检测修饰状态的核酸分子和/或多肽的方法是已知的。
对于本领域技术人员，用于检测核酸甲基化的方法是已知的，例如可以包括方法：使用例如硫酸氢钠，高锰酸或肼预处理的核酸，并且然后通过使用特异性限制性内切酶或使用特异的例如扩增反应过程中的探针对修饰进行检测。对甲基化的检测可以进一步通过使用甲基化特异性限制性内切酶而实施。例如对核酸甲基化状态检测的方法在专利申请EP02010272.9，US5856094，WO0031294，US6331393等中公开。所引用的文献通过引用并入本发明。
对多肽修饰状态检测的方法例如可以包括特异识别修饰或未修饰状态的多肽的结合试剂。可选择的，诸如磷酸酶或糖基化酶等酶可以用于除去分子的修饰。因此可以通过使用电泳，层析，质谱等方法对与相应酶孵育前后的待检测分子的质量或电荷进行检测，而确定分子是否存在修饰。
在本发明进一步的一个实施方案中，试剂盒和体外诊断装置根据一定的方法而设计，在该方法中，在多肽的水平上完成对一系列标记分子的检测，并且同时在核酸的水平上，对另外的一系列标记分子和/或相同标记分子的全部或一些进行检测。
与医学相关情况相关的标记分子例如可以是影响和/或反应细胞和/或组织增殖和/或分化特征的分子。上述分子例如可以包括细胞周期调节蛋白，与DNA复制相关的蛋白，跨膜蛋白，受体蛋白，信号转导蛋白，钙结合蛋白，含有DNA结合域的蛋白，金属蛋白，激酶，激酶抑制因子，chaperone，胚胎形成蛋白，热休克蛋白或修饰其它翻译后的蛋白并调节其活性的酶，或编码相应命名蛋白的核酸。编码相应命名蛋白的mRNA也可以用于根据本发明的标记分子。在本发明一个实施方案中，与细胞增殖紊乱相关的标记例如可以独特地在受紊乱影响的细胞中表达，或在所述细胞中不表达或可以过量表达。
根据本发明公开的方法开发的试剂盒和体外诊断装置包括一个和多个标记分子(蛋白以及核酸)，其选自细胞周期调控蛋白或编码相同蛋白的核酸(如p53，pRb，p14ARF)，周期素(如细胞素A，细胞素B，细胞素E)，周期素依赖性激酶的抑制因子(如p13.5、p14、p15INK4b、p16INK4a、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1和p27KIP1)，肿瘤相关抗原(如MDM-2，MCM2，MCM5，MCM6，CDC2，CDC6，ld1，骨桥蛋白，GRP，封闭蛋白(claudin)，CD46，肾二肽酶(renal dipeptidase)，her2/neu，TGFβII受体)，肿瘤抑制基因，HPV相关标记(如HPV基因来源的L1，L2，E1，E2，E4，E5，E6或E7等)细胞表面抗原(如细胞角蛋白，连环蛋白或其它)或其类似物。在某些实施方案中，使用根据本发明公开的方法开发的试剂盒和体外诊断装置检测的标记分子可以包括在DNA复制中起作用的基因，例如预起始复合物中的蛋白或核酸，或复制叉中的蛋白或核酸。上述分子例如可以包括增值标记(蛋白以及核酸)例如，解螺旋酶，(如真核解螺旋酶或MCM蛋白【MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6，MCM7】，如WO0050451和WO0217947公开的TP蛋白【也命名为HELAD1，Pomfil2，Unc-53】，参与复制过程的激酶或磷酸酶，例如CDC6，CDC7蛋白激酶，Dbf4，CDC14蛋白磷酸酶，CDC45和MCM10)，参与复制叉行进的蛋白(如，PCNA或DNA聚合酶δ，复制蛋白A(RPA)，复制因子C(RFC)，FEN1)，维持细胞增殖所必要的分子(如Ki67，Ki-S5或Ki-S2)等。通常，本发明公开的开发试剂盒和体外诊断装置的方法适合以代表医学相关情况特征的多种标记分子为基础的试剂盒和体外诊断装置。在一个特定实施方案中，代表某一个医学相关情况的标记分子可以是用于肿瘤的标记(肿瘤标记)。代表肿瘤的标记分子例如可以是蛋白，相比较于正常对照组织，其在肿瘤中以(non-wild)非野生型的方式表达。本文使用的非野生型的表达方式可以包括表达水平的上调和下调，或缺乏表达，或相关分子的非野生型表达方式。蛋白的非野生型表达方式可以包括通过插入，缺失，取代或移码突变或任何其它已知的蛋白或核酸的突变形式产生的蛋白突变形式的表达。在所有非野生型蛋白表达或非野生型蛋白表达水平的情况中，蛋白，多肽或其片段，或编码这些蛋白，多肽或这些片段的核酸可以用作与肿瘤相关的分子标记，并且因此可以被理解成发明内容中所使用的术语“肿瘤标记”。与肿瘤相关的表现出非野生型表达的蛋白例如在文献WO9904265A2，WO0149716A2和WO0142792A2中公开，这些文献将通过引用而并入本发明。
在本发明一个特定实施方案中，代表医学相关情况特征的标记可以是细胞周期调控蛋白，例如周期素，周期素依赖性激酶或周期素依赖性激酶的抑制因子。在本发明进一步的实施方案中，代表医学相关情况特征的标记可以是与瞬时或长久病毒感染相关的标记。病毒感染可以包括由诸如高风险或低风险的HPV的人乳突状瘤病毒(HPV)引起的感染。高风险HPV可以包括HPV亚型：例如HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56和58。HPV感染的标记例如可以包括HPV基因L1，L2，E2，E4，E5，E6或E7的HPV表达产物。在本发明的第三部分实施方案中，代表病毒感染特征的标记可以与任何其它代表医学相关情况的标记联合使用，例如与细胞周期调控蛋白联合使用。例如标记分子的联合使用，特别是与感兴趣的HPV相关的联合，在WO0208764中公开，其将通过引用而并入本发明。
在一个特定实施方案中，与HPV标记联合使用的细胞周期调控蛋白例如可以选自pRb，p53，p14ARF，周期素依赖性激酶的抑制因子。例如在一个特殊的实施方案中，可以使用p16INK4a与HPV感染的标记(如L1，L2，E2，E4，E5，E6或E7)联合使用。
在本发明一个特定实施方案中，进行HPV基因的转录或蛋白水平的检测。在这个方面，将基于非细胞的生化检测中使用的样本相对从相同LBC样本制备的细胞学信息进行的标准化具有一定的优势。在本发明一个实施方案中，根据使用CytycTM ThinPrepTM处理器制备ThinPrepTM标本所必要的LBC样本的体积对用于基于非细胞生化检测的样本进行标准化。这使得可以产生与存在于样本中的细胞相比能够产生的相对HPV核酸量的可比较的结果。如果省略了上述标准化，就不能知道HPV感染与细胞的关系。
在本发明公开的检测医学相关情况的方法中任何主要的分子标记可以应用到一些医学相关情况中。然而，已知一定的标记分子与特殊的医学相关情况相关联。本领域技术人员已知何种分子标记可以合理的用于本发明的用于检测溶解的体样本的医学相关情况的方法中。下文的表3给出了一些医学相关情况的例子以及适合本发明的方法所使用的分子标记。该信息意图例证本发明公开的方法，而未限制本发明的范围，其表明本领域技术人员已知的与特异的医学相关情况相关联的通常应用的分子。
表3
根据本发明，用于医学相关情况的标记分子可以代表医学相关情况的存在与否。在本发明的一个实施方案中，标记分子可以代表医学相关情况的特异性质。该性质可以包括医学相关情况的进展潜能，预兆信息，相应于一定治疗措施的行为表现。代表医学相关情况的标记分子因此可以是用于检测受医学相关情况影响的个体预后的标记分子，或用于分类受到医学相关情况影响的个体的治疗。在某些实施方案中，这可以用于检测一定标记分子的表达与否，该标记分子显示在特异医学相关情况下阳性或阴性的预后(如乳癌中p16、Her2/Neu、Brca-2、封闭蛋白或其它的表达水平)。允许评估特异医学相关情况影响的个体的预后的标记分子的例子对于本领域技术人员而言是已知的。根据本发明，任何基于细胞的细胞学或组织学方法中的上述标记可以使用在本发明中的方法中。预后的评估例如可以在医学相关情况的主要诊断之中或之后实施，医学相关情况的(外科)治疗的之中或之后实施，或医学相关情况的历史的任何阶段实施。在另一实施方案中，根据本发明的方法可以用于分类受到医学相关情况影响的个体的治疗。该分类例如可以包括在治疗过程中选择一定的治疗化合物(例如用于为治疗的病人选择赫赛汀(Herceptin)或其类似)，选择用于化疗、放疗或者决定对个体进一步治疗的患者，或进行一般医学治疗的个体，例如继续监控或其类似。
在本发明一个特定实施方案中，代表医学相关情况的标记分子可以是显示医学相关情况进程的标记。在本发明的某些进一步的实施方案中，代表医学相关情况进程的标记分子可以与仅仅代表所述医学相关情况存在的标记分子联合使用。
根据本发明的开发使用LBC样本作为原材料实施。在本发明的一个实施方案中，根据本发明公开的方法所开发的试剂盒和体外诊断装置意图用于任何种类的溶解的体样本。在本发明中的另一个实施方案，根据本发明公开的方法所开发的试剂盒和体外诊断装置计划仅仅使用LBC样本。在这种情况下，开发和制造的试剂盒和体外诊断装置作为细胞学分析的一个附加或连续的检测或作为单独的标准检测而用于分析溶解的LBC样本。
根据本发明用于开发试剂盒和体外诊断装置的方法指导开发用于生化检测方式的试剂盒和体外诊断装置。在这些检测方式中可以检测在溶解的体样本中的标记分子存在与否和/或标记分子的表达水平。如上文的详细说明，对体样本的溶解可以通过使用合适的裂解介质而实施。根据本发明的试剂盒和体外诊断装置的开发使用LBC样本用于设计，开发，设计和开发的鉴定，设计和开发的确认。另外，根据本发明公开的基于LBC样本的开发试剂盒和体外诊断装置的方法是任何提供了技术资料和/或规定的安全和有效证据的使用LBC样本的方法，从而获得监管当局或如果可以适用的监管(授权)实体的对所述试剂盒和体外诊断装置的许可证或同意使用。根据本发明公开的开发试剂盒和体外诊断装置的方法可以在任何阶段使用LBC样本，包括设计，开发，鉴定，确认，提供用于监管通过和安全/同意的数据，或可以仅仅在开发试剂盒和体外诊断装置的这些步骤中的一个或多个步骤使用LBC样本。在本发明一个实施方案中，根据本发明开发试剂盒和体外诊断装置的方法是用于设计和开发所述的试剂盒和体外诊断装置的方法，其中LBC样本用于设计和开发鉴定和/或确认。在本发明另一个实施方案中，开发试剂盒和体外诊断装置的方法是用于为获得国家或地区监管当局和/或国家或地区监管(授权)实体的对该试剂盒和体外诊断装置的监管建议和安全/许可提供数据，其中LBC样本用于提供关于试剂盒和体外诊断装置的技术数据，实施数据或安全和有效性的数据。在本发明的进一步的实施方案中，开发试剂盒和体外诊断装置的方法是联合上述最后一项方法的方法。
本发明详述的开发试剂盒和体外诊断装置的方法在任何适于在所开发试剂盒和体外诊断装置的实施特性的基础之上集合数据的方法中使用LBC样本。通常，LBC样本作为体样本的来源而用于所开发的试剂盒和体外诊断装置的过程中。在本发明一个实施方案中，LBC样本作为标本的剩余物而提供，其中在使用LBC样本的部分用于根据本发明的开发方法的过程之前，之中或之后而用同样的LBC样本准备了细胞学标本。在另一个实施方案中，获得的LBC样本仅仅用于在根据本发明的开发方法中使用。在这种情况下，第二以及可以是第三个LBC样本或甚至更多的通过常规的用于细胞学评价的非薄层方法准备的样本在根据本发明的开发方法制备LBC样本的过程之前或之后而获得。
关于根据本发明方法使用的LBC样本的关于细胞学方法的信息可以存在或缺失。该信息例如包括制备合适的薄层样品的所需要的LBC样本的体积，关于LBC样本的细胞内容的信息，关于LBC样本适量或样本准备的基本的信息，关于在细胞学标本的基础上评估的诊断信息的信息，关于患者疾病以及诊断的信息等。
根据本发明的方法，使用获得的LBC样本的全部或仅仅其一部分。在本发明的一个特定的实施方案中，LBC样本的总体积用于开发目的。在另一个实施方案中，样本中含有的细胞的总数目用于开发目的。然而，在另一个实施方案中，仅仅原始LBC样本的总体积的一部分或其含有的细胞总数的一部分用于开发目的。
根据本发明的方法，可以使用标准化的LBC样本。在本发明的一个特定的实施方案中，可以使用标准化的LBC样本以确保在使用LBC样本实施的开发过程中可比较的存在的细胞量。可以根据用于制备适当的薄层标本的必要的所述样本的体积而标准化LBC样本的体积而实现。可以使用任何合适的方法实施对薄层标本的制备，例如使用ThinPrepTM处理器或其类似物。在这种情况下，根据本发明，可以忽略在开发过程中使用的部分的LBC样本的体积。在进一步的实施方案中，根据用于检测的样本的体积而使用标准化的LBC样本。在这种情况下，可以忽略在开发过程中使用的部分的LBC样本中含有的细胞量。本发明描述的标准化的实施例子在实施例4ff中给出。
本发明另一个方面是通过对存在于溶解的体样本中的标记分子的存在与否或标记分子的水平的基于非细胞的生化分析，而对医学相关情况的诊断进行评估的方法，其中的体样本是LBC样本。在本发明的一个特定的实施方案中，评估诊断的方法包括根据从由LBC样本制备的细胞学样本(如薄层)获得的信息而在基于非细胞的生化分析中应用标准化的样本量。该信息例如可以是样本细胞性的信息。在这方面，细胞性应被理解为存在于介质中的每毫升中的细胞含量。细胞性可以指无论种类以及特性的所有细胞含量。在另一个实施方案中，术语细胞性可以指LBC样本中的特殊定义的细胞类型的含量。该细胞例如可以是依据来源和位置而定义的细胞(如，子宫颈内细胞，子宫颈外细胞，子宫内膜细胞，宫颈细胞，阴道细胞)，根据增殖和/或分化状态定义的细胞(如化生细胞，结构不良细胞，HPV感染细胞等)或其它任何定义的细胞类型。
本发明公布的的检测方法在这方面适合检测诸如核酸或蛋白或多肽以及其片段的标记分子。在本发明的某些实施方案中，标记分子的检测通过检测在所述溶解的样本中蛋白，多肽或其片段的存在与否或其表达水平而完成。可以在此方法中使用的标记分子如上文所公开的“代表医学相关情况的标记分子”。该方法可以应用到如上文定义的任何医学相关情况中。在本发明其他实施方案中，检测了代表医学相关情况的标记分子的核酸。在这方面使用的核酸在上文的本发明的说明书中定义。
如本发明公开的方法中对标记分子的检测指如上文定义的任何适合的检测。在本发明的某些实施方案中，通过免疫化学检测完成对蛋白和多肽的检测。
根据本发明，对诸如癌症及其前体阶段的肿瘤疾病的诊断可以及早进行。特别地，癌症的前体阶段可以被及早检测。必须强调的是，其能够区分良性炎症和肿瘤疾病的化生改变。另一个特性是根据本发明的方法获得的结果不依赖于主观判断，例如可以降低或避免例如Pap检测或组织学产生的假阴性结果和假阳性结果。另外，本发明的显著之处是其快速和简单的操作，因此其可以用于广泛的筛选检测中，也特别适合第三世界的国家。因此，本发明对今天的癌症疾病的诊断具有重要贡献。
本发明进一步通过下述实施例进行说明，该实施例并不通过其所公开的具体方法对本发明的范围和精神进行限制。
实施例
实施例1：用ELISA检测方式检测宫颈的上皮内的瘤形成
提供的33份存在于裂解介质中的宫颈拭子，通过基于ELISA的方法检测由拭子含有的细胞制备的溶液中的周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a的过量表达。ELISA检测如下文实施：
(A)细胞裂解
将宫颈拭子刷放入含有2ml mtm裂解介质(PBS中含有2％Triton-X 100，0.4％SDS，0.6mM PMSF)的15ml的容器中。存在于刷上的宫颈细胞裂解至少20小时。然后将宫颈拭子样本的裂解液转入2毫升试管中，并且在4℃离心(28.000×g 15分钟(16.600rpm高速离心机JEC Multi RF))；将上清转入一新试管中。上清可以保存在-20℃。
(B)实施ELISA
包被ELISA板
用PBS稀释p16INK4a特异抗体克隆mtm E6H4原液至可以使用的包被溶液。
将50μl包被溶液加入ELISA板的每一个孔中。
为了包被，将ELISA板在4℃孵育过夜。
将包被溶液从ELISA板中移出，并使用ELISA自动化清洗机按下述方法对ELISA板清洗：
7×250μl清洗缓冲液(含有0.1％Tween20(v/v)的PBS溶液)
除去残留的清洗缓冲液之后，将300μl封闭缓冲液(含有2％BSA的PBS溶液)加入到每个孔中。将板放在摇床上室温孵育1小时。
与样本孵育
除去封闭缓冲液之后，将100μl裂解的细胞样本加入每个孔。裂解的HeLa细胞作为阳性对照；
为了校准检测，在检测中包括不同浓度的重组p16INK4a蛋白(0pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，400pg/ml和800pg/ml)。
室温孵育样本1小时。
然后使用ELISA自动化清洗机按下述方法对ELISA板清洗：
7×250μl清洗缓冲液。除去残留的清洗缓冲液。
与检测抗体孵育
通过稀释原液而制备与p16INK4a蛋白特异结合的生物素酰化标记的二抗克隆mtmD7D7的工作液。
将100μl工作液加入每个孔。在室温孵育1小时之后，移去抗体溶液，并且使用ELISA自动化清洗机清洗ELISA板：
7×250μl清洗缓冲液。
检测
预稀释链霉抗生物素-HRP-聚合物(1mg/ml)至1∶10。(4μl+36μl孵育缓冲液)；用孵育缓冲液(含有0.1％BSA的PBS溶液)按1∶300的稀释比例制备终孵育溶液，终浓度是0.33μg/ml。
将100μl该溶液加入每个孔并在室温孵育1小时。
其后，移去缓冲液并且使用200μl清洗缓冲液人工清洗板，每孔洗5次。
底物孵育
TMB-底物在25℃避光平衡1小时、
100μl底物溶液加入每个孔。
ELISA板在25℃避光准确孵育15分钟。然后加入80μl 2.5MH2SO4溶液终止反应。
在终止反应之后5分钟内，检测OD 450nm的结果。结果被评估之后，每个样本返回一个OD值。
本实施例的结果在表4中给出。ELISA结果与对同一个患者的Papanicolaou检测(PAP检测，宫颈细胞学)的诊断结果进行比较。根据Munich Classification II(1990)对宫颈细胞学进行评估。Pap II包括良性细胞，子宫颈炎和化生。Pap IV包括严重结构不良和原位癌。结果表明相应ELISA的结果的OD值大于0.9的样本，根据常规细胞学PAP检测其被分类为结构不良。
使用OD0.9作为评估样本的域值，ELISA结果可以如下文所报告：
表4
  诊断/ELISA结果  ELISA阳性  ELISA阴性
  Pap II   0   30
  Pap IV   3   0
对于来自具有严重结构不良的妇女的所有样本(100％)，ELISA检测为阳性，而对于没有结构不良的妇女的30个样本(100％)，ELISA检测为阴性。
使用在这些实验中所评估的域值，300个患者的细胞学标本用现在的ELISA检测方法进行检测。在这个实验中，用细胞学检测方法鉴定为结构不良的样本，用ELISA检测方式也被确认为结构不良。
该结果显示，对溶解的患者样本中的p16INK4a的量化可以用于检测样本的结构不良。在此实施例中的诊断的基础是对比在特殊患者样本中的p16INK4a的表达水平与已知的存在于非结构不良标本中的p16INK4a的表达水平。通过应用ELISA中OD检测的域值而在检测中完成对比，高于该域值的被认为是阳性。
实施例2：用侧流检测方式检测宫颈的上皮内的瘤形成
对提供的9份存在于PreservCyt(Cytyc Corporation，Boxborough，MA)溶液中的宫颈拭子进行常规PAP检测，同时使用基于侧流的方法检测从拭子获得的细胞悬液制备的溶液中的周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a的过量表达。测流检测如下文实施：
(A)细胞裂解
来自于以PreservCytTM固定的材料提供的个体的宫颈拭子样本的10ml细胞悬液转入15ml的反应容器中。样本在室温1500×g离心15分钟(3000rpm，Heraeus Varifuge，rotor8074)；弃掉上清，并且让剩余的甲醇挥发掉，(室温，15分钟)；沉淀溶解在500μl裂解缓冲液中，然后转入1.5毫升反应溶液容器中。溶液在4℃离心(28.000×g 15分钟(16.600rpm Microcentrifuge Biofuge Fresco))；将上清转入一新试管中。上清可以保存在-20℃。
(B)实施测流检测
将捕获抗体应用在膜上
用TBS(含有1％牛血清清蛋白)稀释p16INK4a特异抗体克隆mtmE6H4原液，形成可以即时使用的终浓度为1mg抗体/ml的溶液。将该溶液按照30μl/30cm浓度点在硝化纤维膜上。Whatman纤维(wicks)附在硝化纤维膜和测验片(dipstick)的一端在37℃干燥1小时。然后在室温平衡然后切成4mm宽的测验片。
制备耦联溶液
耦联在胶体金(40nm颗粒大小)上的p16INK4a的特异抗体克隆mtmD7D7的原液用TBS(含有1％牛血清清蛋白)稀释，以产生在520nm的OD值为1.0的终浓度的可以即时使用的检测抗体溶液。
与样本孵育
将20μl的裂解细胞样本加入微滴定孔中的20μl的即时使用的检测抗体溶液中。将包被有捕获抗体克隆E6H4的检测片加入孔，样本浸透到检测片上并完成泳动。当检测片仍然湿润时读取信号。
结果
在我们的检测方式中，通过PAP染色分类为PAPIVa的2个样本(样本1和2)，其含有结构不良细胞，在点种有捕获抗体的区域显示出清晰可见的紫色条带。作为对照，通过PAP染色分类为PAPII-III的7个样本(样本3-9)没有检测出条带，因此不含有结构不良细胞。
使用实施例1给出的方法进行了相同的ELISA检测，结果在表5中给出。
表5
  样本   诊断  ELISAOD
  1   Pap IVa   2.209
  2   Pap IVa   0.536
  3   Pap III   0.067
  样本   诊断  ELISAOD
  4   Pap II   0.113
  5   Pap II   0.095
  6   Pap II   0.284
  7   Pap II   0.192
  8   Pap II   0.138
  9   Pap II   0.07
本发明以及制备和使用的方式和方法以如此全面、清晰、简练和确切的术语描述，以便使得本领域技术的任何人员能够制备和使用。可以理解，以上描述的本发明优选实施方案是可以在不脱离本发明权利要求中列出的范围的情况下做出修饰的。为了特别地指出以及清晰地要求关于本发明的主旨，下面的权利要求包括此说明书。
实施例3：使用RT-PCR方法检测p16INK4a和p14ARF的转录
来自于50个个体的宫颈样本用于此分析。对于每个个体，获得两份样本，一个存在于通用收集介质(Universal Collection Medium)中，而另一个存在于PreservCytTM溶液中。在同样的检测过程中获得两个样本。对于每一个个体，基于对从PreservCytTM溶液中制备的宫颈薄层标本的分析而获得诊断。本研究中20个样本选出被诊断为NILM，20个样本诊断为LSIL以及10个样本诊断为HSIL。根据下面的方法，使用RT-PCR方法在mRNA水平上对所有样本的p16INK4a和p14ARF的转录水平进行测定：
为了实施分析，通过离心将细胞从UCM和PreservCytTM溶液中沉淀下来。获得的沉淀直接进行RNA制备。
沉淀稀释并重悬于准备好的RLT缓冲液中。将70％乙醇加入均匀的裂解液之后，通过吸打混合悬液。
根据厂商的说明书，使用QIAamp Spin-colums实施对RNA的纯化和分离。
在260nm对RNA浓度进行光密度测定。对于反转录反应，使用100ng，最多500ng的RNA。使用DNA酶降解DNA，反应如下：
17.0μl    RNA(6-30ng/μl)
1.0μl     DNAse IAmp级(1单位/μl)(invitrogen)
2.0μl     DNAse反应缓冲液(10×)(invitrogen)
20.0μl    总体积
25℃孵育15分钟，通过加入2μlEDTA 25mM终止反应并在65℃孵育10分钟。
使用Omniscript反转录酶在含有RNAsin的整体积的DNase降解液中进行cDNA合成。
反应在37℃实施2小时，然后在93℃进行5分钟。然后将混合物储存在4℃。这提供了Taqman-PCR可以使用的cDNA溶液(相应于cDNA浓度约为7-36ng/5μl)。
为了在RT-PCR中使用，40μl的cDNA反应混合物使用30μl没有RNase的水稀释成70μl的溶液。使用的引物是：
引物p16INK4a，正向：5’-CGA ATA GTT ACG GTC GGA GG-3’
引物p16INK4a，反向. 5’-ACC AGC GTG TCC AGG AAG-3’
引物p14ARF，  正向：5′-CCG CCG CGA GTG AGG GTT-3′
引物p14ARF  ，反向. 5′-TGC CCA TCA TCA TGA CCT GGT CT-3′
对于使用β-肌动蛋白和GAPDH作为对照PCR反应的引物为：
引物(63)β-Actin，正向：5’-CCT AAA AGC CAC CCC ACT TCT C-3’
引物(64)β-Actin，反向：5’-ATG CTA TCA CCT CCC CTG TGT G-3’
引物GAPDH，正向：5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’
引物GAPDH，反向：5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’
每个引物使用的浓度是300nmol。RT-PCR反应混合物包括如下：
12.5μl SYBR-Umix
0.25μl引物混合物
7.25μl Wasserdie Molekularbiologie
5.0μl cDNA溶液
25.0μl总体积
2步骤实时PCR反应的条件是：
第一步：50℃2分钟，95℃10分钟
第二步：95℃15秒，60℃1分钟10秒，40个循环。
通过在相同标本中检测的转录本的水平的基础上估算p16INK4a转录本的过量表达的程度，并与存在于正常组织或细胞标本中的转录本的水平对比而评估RT-PCR的结果。根据在每一个样本中管家基因的水平而在分析过量表达之前实施对p14ARF的水平的标准化。对比于正常组织，过量表达0到24倍被认为不相关。仅仅当p16INK4a和p14ARF的过量表达的水平大于24倍时，才被认为样本中的转录本显著提高。必须注意，这种评估的安排仅仅是几种相等的合适方法之一。那些本领域技术人员已知如何可以使用RT-PCR结果评估转录本的水平以及与标本的临床参数相联系。在这个实施例中提及的域值是示范性的并且可以根据条件而改变。
从一个样本的UCM标本以及与相应的PreservCytTM标本获得的结果是相同的。
将转录本水平的检测结果与来自于细胞学的相关标本的诊断结果对比，显示评估的转录本水平与在细胞学薄层标本的基础上诊断的存在的宫颈损害之间存在良好的相关性。
这种相关性在下文显示：
表6：
Figure G2004800230648D00461
该实验显示用于对裂解的宫颈样本中的p16INK4a和p14ARF的转录本水平的检测的方法适合对宫颈损害以及其前体的诊断进行评估。被检测的细胞保存溶液同样适合所公开的方法。两个被测基因的转录本水平可以被用于补充对宫颈上皮内的瘤形成的诊断的评估，其中p16INK4a显示出比p14ARF稍微好一些的结果。
实施例4：在对来自口腔、唾液的拭子和来自宫颈拭子的细胞学样本的基于液体的基础上使用杂交捕获方法分析p16INK4a和p14ARF的转录本水平
在本实施例中，分别来自诊断为HSIL损害的个体的宫颈拭子、来自患有小细胞肺癌的个体的唾液、以及来自患有口腔癌的个体的口腔拭子的并且每个都分别存在于PreservCytTM或CytoLytTM溶液中的各10个LBC样本用于对每个标记分子进行检测(总共每个癌症实体包括20个标本)。对于宫颈和口腔标本，实施了对hfHPV型和p16INK4a和p14ARF的转录的杂交捕获分析。对hfHPV型的杂交捕获由Digene Corp提供的HybridCaptrue hc2检测实施。对指定的周期素依赖性激酶的抑制因子转录的杂交捕获分析根据下文描述的实施。
(A)细胞裂解
对于本实施例，LBC样本的量取决于LBC样本的细胞内容。使用Cytyc ThinPrepTM处理器制备了每个样本的薄层标本。在制备薄层标本之前和之后对LKBC样本的质量进行测定。由于每次过程，ThinPrepTM处理器仅仅消耗对于滤器上一个特异细胞密度必须的样本的量，所以对于LBC样本中相关细胞浓度，可以测定消耗的体积。在本实施例中，来自每个LBC样本中两倍的用于制备薄层标本被ThinPrepTM处理器消耗的质量被用于杂交捕获分析。(LBC样本的细胞性非常低的样本被排除)。
为了实施分析，通过离心从PreservCytTM或CytoLytTM溶液中沉积细胞。获得的沉淀直接进行RNA制备。
沉淀稀释并重悬于准备好使用的RLT缓冲液中。将70％乙醇加入均匀的裂解液之后，通过吸打混合悬液。
根据厂商的说明书，使用QIAamp Spin-colums实施对RNA的纯化和分离。
为了检测p16INK4amRNA，使用p16INK4a和p14ARF的特异的40-mer的DNA寡聚核苷酸的混合物。混合物中最适合的探针为下面所列的序列：
p14ARF：
5’-GCT CCG CCA CTC GGG CGC TGC CCA TCA TCA TGA CCT GGT C-3’
5’-GCC ACT CGG GCG CTG CCC ATC ATC ATG ACC TGG TCT TCT A-3’
5’-TCG GGC GCT GCC CAT CAT CAT GAC CTG GTC TTC TAG GAA G-3’
5’-CGC TGC CCA TCA TCA TGA CCT GGT CTT CTA GGA AGC GGC T-3’
5’-CCC ATC ATC ATG ACC TGG TCT TCT AGG AAG CGG CTG CTG C-3’
5’-CAT CAT CAT GAC CTG GTC TTC TAG GAA GCG GCT GCT GCC CTA G-3’
5’-TGC CCA TCA TCA TGA CCT GGT CTT CTA GGA AG-3’
5’-ATC ATC ATG ACC TGG TCT TCT AGG AAG CGG CTG CTG CCC TAG-3
将探针放置于mRNA的外显子1β和外显子2的交界处是有利的，以确保只有p14ARF的特异mRNA被探针识别(对于p16INK4a和p14ARF的特异PCR条件的情况也是相似的，选择引物对以覆盖扩增区内的外显子的边界)。同样的，可以使用任何其它特异识别p14ARFmRNA的探针。在本实施例公开的探针仅仅作为例子使用，而并不对本发明进行限制。包括上述序列或其片段的探针序列可以同样地用于本发明公开的方法。
p16INK4a有希望的探针序列为下述序列：
5’-CTC CGC CAC TCG GGC GCT GCC CAT CAT CAT GAC CTG GAT CGG-3’
5’-ACT CGG GCG CTG CCC ATC ATC ATG ACC TGG ATC GGC CTC-3’
5’-CGG GCG CTG CCC ATC ATC ATG ACC TGG ATC GGC CTC CGA-3’
5’-GCT GCC CAT CAT CAT GAC CTG GAT CGG CCT CCG ACC GTA A-3’
5’-CAT CAT CAT GAC CTG GAT CGG CCT CCG ACC GTA ACT ATT C-3’
5’-ATC ATC ATG ACC TGG ATC GGC CTC CGA CCG TAA CTA TTC GGTGC-3’
5’-AGC AGC TCC GCC ACT CGG GCG CTG CCC ATC ATC ATG ACC TGGATC-3’
5’-ATC ATC ATG ACC TGG ATC GGC CTC CGA CCG TAA CTA TTC-3’
5’-TCA TCA TGA CCT GGA TCG GCC TCC GAC CGT AAC TAT TCG GT-3’
与p14ARF的情况相似，对于p16INK4a，优选的探针位于外显子1α和外显子2的交界处。这种规定能够确保p16INK4a被识别而不识别INK4基因座中的其它mRNA转录本。此外，应用在本发明的对p14ARF的探针的评论需要做必要的修改。
将标记的探针混合物加入到总细胞RNA抽提物中。为了杂交，混合物在65℃孵育30分钟。
(B)实施ELISA
为了检测RNA-DNA杂交，使用购自Digene Corp的包被有抗RNA/DNA杂交抗体的微滴定板。将杂交液直接加入微滴定板并在室温孵育1小时。根据制造商的说明书对板洗涤。使用第二个抗RNA/DNA杂交抗体以及Digene Corp提供的检测试剂实施检测。
对于所有的宫颈标本，杂交捕获方法显示p16INK4a为阳性结果。这个结果与用杂交捕获方法检测为hfHPV阳性的所有宫颈标本相关。大约来自口腔癌症标本的一半检测为p16INK4a过量表达。所有这些对p16INK4a阳性的标本通过hc2被检测为hfHPV。在口腔癌症中，在HPV阳性和p16INK4a过量表达之间存在显著的相关性。对于小细胞肺癌，在10个测试样本中，p16检测为阳性的为8个。对于由杂交捕获获得的关于p16INK4a的结果可以被薄层标本的免疫细胞化学方法所确认。
对于宫颈样本中p14ARF的结果与p16INK4a的结果相当。对于小细胞肺癌，在杂交捕获方法中，10个样本中仅有2例被检测为p14ARF阳性。这个结果可以被免疫细胞化学所确认。对来自口腔的LBC样本，10例中有7例的p14ARF结果与免疫细胞化学的结果一致。
该结果显示，使用杂交捕获检测方式对来自LBC样本中的周期素依赖性激酶的抑制因子进行检测的方法可以用于对一些癌症身体的诊断进行评估。该结果提示生化检测可以用做细胞学检测的补充检测或联合检测。
实施例5：在对来自尿、唾液、乳腺细针抽吸(breast fine needleaspirate)和来自宫颈拭子的基于细胞学的液体样本的基础上使用免疫化学方法分析p16INK4a、Her-2/Neu和p14ARF的蛋白水平
10个细胞学分类为HSIL的宫颈拭子，10个细胞学诊断为小细胞肺癌的唾液样本，10个来自于诊断为膀胱癌的个体的尿液样本以及10个来自个体诊断为DCIS的细针抽吸样本，所有样本在PreservCytTM介质中进行离心获得细胞，然后将细胞溶解在裂解介质中。然后基于ELISA检测由含有细胞的拭子制备的溶液中周期素依赖性激酶的抑制因子p16INK4a、p14ARF和Her-2/Neu的表达水平。
ELISA检测如下文实施：
(A)细胞裂解
对每个10ml的LBC样本离心以便使细胞沉积。细胞沉淀[TIME]溶于700μl mtm裂解介质(PBS中含有2％Triton-X 100，0.4％SDS，0.6mM PMSF)中，然后混合并在80℃孵育10分钟。然后LBC样本的裂解液在4℃离心(28.000×g 15分钟(16.600rpm高速离心机JECMulti RF))；将上清转入一新试管中。上清可以保存在-20℃。
(B)实施ELISA
包被ELISA板
对于每个蛋白，ELISA板分别按下文制备。p16INK4a、p14ARF和Her-2/Neu的特异性一抗的原液用PBS稀释为可以使用的包被溶液。
对于p16INK4a，克隆mtm E6H4用于包被ELISA板。对于p14ARF使用购自Calbiochen的直接抗p14ARF的多克隆抗体。对于Her-2/Neu，使用来自DakoCytomation的多克隆抗体进行包被。
将50μl包被溶液加入ELISA板的每一个孔中。
为了包被，将ELISA板在4℃孵育过夜。
将包被溶液从ELISA板中移出，并使用ELISA自动化清洗机按下述方法对ELISA板清洗：
7×250μl清洗缓冲液(含有0.1％Tween20(v/v)的PBS溶液)
除去残留的清洗缓冲液之后，将300μl封闭缓冲液(含有2％BSA的PBS溶液)加入到每个孔中。将板放在摇床上室温孵育1小时。
与样本孵育
除去封闭缓冲液之后，将100μl裂解的细胞样本加入每个孔。
为了校准检测，每个检测包括不同浓度的重组蛋白(0pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，400pg/ml和800pg/ml)。
室温孵育样本1小时。
然后使用ELISA自动化清洗机按下述方法对ELISA板清洗：
7×250μl清洗缓冲液。除去残留的清洗缓冲液。
与检测抗体孵育
通过稀释原液而制备分别特异性针对每个蛋白的生物素酰化标记的二抗的工作液。对于p16INK4a使用mtm克隆D7D7，对于p14ARF使用购自Calbiochen的单克隆抗体，而对于Her-2/Neu，使用来自DakoCytomation的单克隆抗体。
将100μl工作液加入每个孔。在室温孵育1小时之后，移去抗体溶液，并且使用ELISA自动化清洗机清洗ELISA板：
7×250μl清洗缓冲液。
检测
预稀释链霉抗生物素-HRP-聚合物(1mg/ml)为1∶10。(4μl+36μl孵育缓冲液)；用孵育缓冲液(含有0.1％BSA的PBS溶液)按1∶300的稀释比例制备终孵育溶液，终浓度是0.33μg/ml。
将100μl该溶液加入每个孔并在室温孵育1小时。
其后，移去缓冲液并且使用200μl清洗缓冲液人工清洗板，每孔洗5次。
底物孵育
TMB-底物在25℃黑暗中平衡1小时、
100μl底物溶液加入每个孔。
ELISA板在25℃黑暗中准确孵育15分钟。然后加入80μl 2.5MH2SO4溶液终止反应。
在终止反应之后5分钟内，检测OD 45Onm结果。结果被评估之后，每个样本返回一个OD值。对于每个抗体，使用看做背景的值确定其OD域值。
ELISA结果与来自同一个个体标本的细胞学评估的诊断结果进行对比。结果在表6出示。
表7
Figure G2004800230648D00511
Figure G2004800230648D00521
结果显示，对于p16INK4a在100％的检测例中，在p16INK4a染色模式的细胞学评估和使用溶解在PreservCytTM溶液中的样本的p16INK4a阳性的ELISA检测模式之间存在良好的相关性。对于p14ARF相关性是93％。对于Her-2/Neu，可以在过量表达的免疫细胞化学检测和阳性的ELISA模式之间可以检测到高于90％的相关性。
上述实施例的结果显示使用溶解的LBC样本的生化检测模式可以应用到作为免疫细胞化学分析的同样标本中。由于生化检测仅仅消耗LBC样本的一部分，其可以容易的作为免疫细胞化学分析的补充部分。
在免疫细胞化学结果和ELISA结果之间存在良好的相关性。这表明根据本发明的方法适合评估多种医学相关情况的诊断，其中基于细胞学的液体目前可以或者作为补充或作为联合检测而应用，或者根据情况可以作为标准的单独诊断检测。
实施例6：对来自尿的基于细胞学的液体样本中的MCM-5和MCM-2的mRNA/蛋白水平的免疫化学和RT-PCR分析
在本实施例中，使用在CytoLytTM溶液中的尿细胞的20个LBC样本。按照实施例3中给出的相同方法实施RT-PCR。如实施例2所给出的带测试方式以及实施例1给出的ELISA方式平行实施蛋白分析。实验方法按照这些实施例中所给出的方法实施。
据显示，来自尿LBC样本的裂解液中，可以容易的检测MCM-5。通过基于非细胞的生化方法关于蛋白以及关于核酸水平的结果很好的相应于从细胞学获得的结果。关于MCM-5蛋白的细胞免疫细胞学染色可用于辅助诊断的评估。

Claims (12)

1.一种体外诊断装置，包括固定在固相上的具有一种特异性的探针，和用于溶解体样本的裂解介质，其中该装置包括的探针仅为具有一种特异性的探针，所述的具有一种特异性的探针特异于选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子，所述的裂解介质包括至少一个选自离液剂、阴离子去垢剂、阳离子去垢剂、非离子去垢剂、两性去垢剂、碱的组合物、蛋白酶抑制剂、DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂的组合物，从而在溶解的样本中检测所述标记分子。
2.根据权利要求1的体外诊断装置，其特征在于，所述的探针是抗体、抗体片段、微小抗体、包括抗原结合表位的多肽模拟物或核酸。
3.根据权利要求1或2的体外诊断装置，其特征在于，所述的装置选自：
a.ELISA装置，其包括固定在ELISA板、ELISA条带或ELISA孔上的选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子的抗体、抗体片段或抗原结合试剂；
b.侧流检测装置，其包括固定在测试带、胶体金颗粒或橡胶颗粒上的选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子的抗体、抗体片段或抗原结合试剂；
c.流通检测装置，其包括固定在多孔物质或毛细管表面上的选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子的抗体、抗体片段或抗原结合试剂；
d.乳胶凝聚试验装置，其包括固定在橡胶颗粒上的选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子的抗体、抗体片段或抗原结合试剂；
e.免疫检测装置，其包括固定在小珠或膜上的选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子的抗体、抗体片段或抗原结合试剂；
f.免疫检测装置，其包括固定在微球上的选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子的抗体、抗体片段或抗原结合试剂；
g.核酸检测装置，其包括直接特异地与固定在固相上的选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子的核酸基因产物杂交的探针。
4.一个用于检测选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子水平的体外诊断装置，其包括选自抗体、抗体片段、微小抗体或包括抗原结合表位的多肽模拟物的探针和与选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子具有特异性的核酸，以及用于溶解体样本的裂解介质，所述的裂解介质包括至少一个选自离液剂、阴离子去垢剂、阳离子去垢剂、非离子去垢剂、两性去垢剂、碱的组合物、蛋白酶抑制剂、DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂的组合物。
5.根据权利要求4的体外诊断装置，其特征在于，所述的蛋白酶抑制剂选自丝氨酸蛋白酶抑制剂，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，天门冬氨酸蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，酸性蛋白酶抑制剂，中性蛋白酶抑制剂或碱性蛋白酶抑制剂。
6.根据权利要求1和权利要求2和权利要求4中任意一项所述的体外诊断装置，其特征在于，所述的裂解介质包括至少一个非离子去垢剂和至少一个蛋白酶抑制剂。
7.根据权利要求6的体外诊断装置，其特征在于，所述的裂解介质包括Triton X-100和至少一个丝氨酸蛋白酶抑制剂。
8.根据权利要求1和权利要求2和权利要求4中任意一项所述的体外诊断装置，其进一步包括至少一个用于完成阳性对照反应的标记分子，通常用于完成检测反应的试剂和缓冲液。
9.根据权利要求1和权利要求2和权利要求4中任意一项所述的体外诊断装置，其进一步包括选自i)周期素依赖性激酶的抑制因子，其选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1；或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的重组蛋白、其片段或来源于所述蛋白的多肽，其作为标记分子用于完成阳性对照反应。
10.作为研究装置或体外诊断装置的一个杂交捕获装置，其包括互补或反向互补于一个或多个周期素依赖性激酶的抑制因子核酸的核酸分子，和用于溶解体样本的裂解介质，所述的裂解介质包括至少一个选自离液剂、阴离子去垢剂、阳离子去垢剂、非离子去垢剂、两性去垢剂、碱的组合物、蛋白酶抑制剂、DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂的组合物，从而在溶解的样本中检测所述标记分子，其中所述周期素依赖性激酶的抑制因子选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1、p27KIP1或p14ARF，用于检测在溶解的体样本中所述的一个或多个周期素依赖性激酶的抑制因子的过量表达。
11.选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子的抗体、抗体片段或抗原结合试剂固定或粘附于其上的固相在制备一个体外诊断装置中的应用，该装置用于检测存在于人体溶解的样本中的选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子的水平，其中，体外诊断装置仅仅包括固定在固相上的具有一个特异性的探针，以及用于溶解体样本的裂解介质，其中具有一个特异性的探针是对选自i)选自p16INK4a、p14、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1或p27KIP1的周期素依赖性激酶的抑制因子或ii)细胞周期调控蛋白p14ARF的标记分子是特异的，所述的裂解介质包括至少一个选自离液剂、阴离子去垢剂、阳离子去垢剂、非离子去垢剂、两性去垢剂、碱的组合物、蛋白酶抑制剂、DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂的组合物。
12.根据权利要求11的应用，其特征在于，所述的固相选自多孔物质、毛细管、膜、小珠、平坦表面、球、微球、纳米球、胶体金颗粒、橡胶颗粒或胶体。
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