JP4545189B2

JP4545189B2 - 子宮頸部疾患を検出するための方法及び組成物

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Publication number: JP4545189B2
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Inventors: ティモシージェイ．フィッシャー; ダグラスピー．マリノウスキー; アドリアンジェイ．テイラー; マーガレットアール．パーカー
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Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-03-23
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Description

本発明は、高悪性度子宮頸部疾患（high-grade cervical disease）を検出するための方法及び組成物に関する。

子宮頚部癌は女性で２番目に一般的な新生物であり、女性の癌全体の約１２％を占め、毎年約２５０，０００件の死亡を引き起こしている。Baldwin et al. (2003) Nature Reviews Cancer 3:1-10。集団スクリーニングプログラムが利用可能でない多くの発展途上国では、この臨床的問題はさらに重大である。このような国において、子宮頸癌は女性の癌死亡の第１位である。

子宮頸癌の症例の大多数が扁平細胞癌を示すが、腺癌も見られる。子宮頸癌は、明確に定義された、形態学的に識別することができる非侵襲性の上皮内期を介して進化するので、集団スクリーニングによって予防することができる。Williams et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14932-14937。正常細胞がどのように形質転換されるのかは理解されていないが、正常な重層上皮から頸部上皮内新形成（ＣＩＮ、cervical intraepithelial neoplasia）を介して侵襲性の癌へと組織病理学的に変化していく連続範囲の概念は、長年の間広く受け入れられてきた。子宮頸癌の前駆型は異形成であり、当分野ではＣＩＮ又は扁平上皮内病変（ＳＩＬ、squamous intraepithelial lesion）としても知られている。扁平上皮内の異常は、３段（ＣＩＮ）又は２段（Bethesda）のシステムを用いることによって分類し得る。システムの下では、ＣＩＮＩ及びＨＰＶ感染症に対応する低悪性度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ、low-grade squamous intraepithelial lesion）は、一般に、侵襲性の疾患へと進行するリスクが比較的低い増殖性ＨＰＶ感染症を示す。３段システムにおいてＣＩＮII及びＣＩＮIIIに対応する高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ、high-grade squamous intraepithelial lesion）は、ＬＳＩＬより高い子宮頸癌へと進行するリスクを示すが、ＬＳＩＬ及びＨＳＩＬはどちらも悪性疾患の潜在的な前駆型としてみなされる。患者の試料は、このシステムの下ではＡＳＣＵＳ（意義不明の非定型扁平細胞、atypical squamous cells of unknown significance）又はＡＧＵＳ（意義不明の非定型腺細胞、atypical glandular cells of unknown significance）として分類され得る。

子宮頸癌と１６、１８、及び３１型などの高リスク型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染症との強力な関連性が確立されている。実際、大量の疫学的及び分子生物学的な証拠により、ＨＰＶ感染症が子宮頸癌における原因因子として確立されている。さらに、ＨＰＶは高悪性度子宮頸部疾患の症例の８５％以上で見つかっている。しかし、ＨＰＶ感染症は非常に一般的であり、３０歳を超える女性の５〜１５％で起こっている可能性があるが、ＨＰＶ陽性の女性の少数のみしか一生のうちに高悪性度子宮頸部疾患又は癌を発生しない。ＨＰＶの単独での存在は感染症だけの指標であり、高悪性度子宮頸部疾患の指標ではないので、ＨＰＶ感染症を単独で試験することで多くの偽陽性が生じる。例えば、Wright et al. (2004) Obstet. Gynecol. 103:304-309を参照されたい。

現在の文献は、ＨＰＶは子宮−子宮頚部の下にある組織内の基底幹細胞に感染することを示唆している。細胞の重層頸部上皮への遊走を伴う、幹細胞から成熟ケラチノサイトへの分化は、ＨＰＶウイルスの複製及び細胞の再感染に関連している。このウイルス複製プロセスの間には、細胞周期の調節解除、能動増殖、ＤＮＡ複製、転写活性化及びゲノム不安定化を含めたいくつかの細胞変化が起こる（Crum (2000) Modern Pathology 13:243-251；Middleton et al. (2003) J. Virol. 77:10186-10201；Pett et al. (2004) Cancer Res. 64:1359-1368）。

ほとんどのＨＰＶ感染症は一過性の性質であり、ウイルス感染症は１２カ月の期間内に自然に消散される。ＨＰＶの１つ又は複数の発癌性の亜型による持続性の感染症を発生した個体では、ＨＰＶ感染症に罹患していない患者と比較して新形成を発生するリスクがある。頸部新形成の発生におけるＨＰＶの重要性を考慮すると、ＨＰＶの臨床検出は、頸部新形成を発生するリスクにある患者を同定する重要な診断ツールとなっている。ＨＰＶに基づいた子宮頸部疾患のスクリーニングの臨床的な有用性は、その陰性適中率にある。正常なＰａｐスメアの履歴と組み合わせたＨＰＶ陰性結果は、疾患がない状態であること及びその後１〜３年間頸部新形成の発生のリスクが低いことの優れた指標である。しかし、陽性ＨＰＶ結果は子宮頸部疾患に診断的ではなく、むしろ感染症を示す。ＨＰＶ感染症の大多数は一過性であり、１２カ月の期間内に自発的に消散されるが、高リスクのＨＰＶウイルス亜型による持続性の感染症は、頸部新形成を発生するリスクがより高いことを示す。ＨＰＶ試験を補うために、頸部新形成に関連する分子マーカーの同定が子宮頸部疾患の診断において臨床的特異性を向上させることが期待されている。

パパニコロー染色頸部スメア（Ｐａｐスメア）の細胞診断検査が、子宮頸癌を検出するための現在一般に好まれる方法である。Ｐａｐ試験とは、６０年間実質的に変化のないままである主観的方法である。しかし、その性能に関していくつかの懸案事項が存在する。１回のＰａｐ試験の報告されている感度（疾患が陽性であるもののうち、試験によって陽性であるものの割合）は低く、広いばらつきが見られる（３０〜８７％）。１回のＰａｐ試験の特異性（疾患が陰性であるもののうち、試験によって陰性であるものの割合）は、スクリーニング集団中８６％と低い場合があり、根底にある高悪性度疾患を決定するためのＡＳＣＵＳＰＬＵＳ集団においてそれよりも相当低い。Baldwin et al.、上記を参照されたい。ＬＳＩＬ又はＣＩＮＩとして特徴づけられたＰａｐスメアの有意なパーセンテージが、実際には高悪性度病変に関して陽性である。さらに、Ｐａｐスメアの１０％までがＡＳＣＵＳ（意義不明の非定型扁平細胞）として分類される、即ち、正常、中等度若しくは重篤な病変、又は腫瘍として明確な分類を行うことが不可能である。しかし、経験によりこのＡＳＣＵＳ集団の１０％までが高悪性度病変に罹患していることが示され、これらは結果的に見落とされる。例えば、Manos et al. (1999) JAMA 281:1605-1610を参照されたい。

Baldwin et al. (2003) Nature Reviews Cancer 3:1-10 Williams et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14932-14937 Wright et al. (2004) Obstet. Gynecol. 103:304-309 Crum (2000) Modern Pathology 13:243-251 Middleton et al. (2003) J. Virol. 77:10186-10201 Pett et al. (2004) Cancer Res. 64:1359-1368 Manos et al. (1999) JAMA 281:1605-1610

したがって、従来のＰａｐスメア及び高リスクＨＰＶ感染症の分子学的試験とは独立して、又はそれと協力して働く、高悪性度子宮頸部疾患の診断方法が必要である。このような方法では、Ｐａｐ染色によってＬＳＩＬ又はＣＩＮＩと分類されたが実際には高悪性度病変に関して陽性である場合（即ち「偽陰性」）を含めたすべての患者集団において存在する高悪性度子宮頸部疾患を特異的に同定することができるべきである。したがって、当分野において、高悪性度子宮頸部疾患を検出することができる、且つ高悪性度疾患を初期ＨＰＶ感染症及び軽い異形成などの臨床的疾患とみなされない状態から区別することができる、特異的な信頼性のある診断方法が必要である。

高悪性度子宮頸部疾患を診断するための組成物及び方法を提供する。本発明の方法は、人体試料中の少なくとも１つのバイオマーカー、特に核バイオマーカーの過剰発現を検出することを含み、前記バイオマーカーの過剰発現の検出は、高悪性度子宮頸部疾患を示す試料を特異的に同定することを含む。本方法は、高悪性度子宮頸部疾患を示す試料を、良性増殖、初期ＨＰＶ感染症、又は軽い異形成を示す試料から識別する。したがって、本方法は、高悪性度頸部の病状において選択的に過剰発現されるが、正常細胞又は臨床的疾患の指標でない細胞中では過剰発現されないバイオマーカーの検出に依存する。

本発明のバイオマーカーとは、ＨＰＶ誘発性の細胞周期機能不全及びＳ期の誘発を司る特定の遺伝子の活性化の結果生じるものを含めた、高悪性度子宮頸部疾患において選択的に過剰発現されるタンパク質及び／又は遺伝子である。特に興味深いバイオマーカーには、その過剰発現がＨＰＶ誘発性の細胞周期機能不全並びにそれに続く転写因子ＳＰ−１及びＥ２Ｆの活性化の結果起こる、Ｓ期遺伝子が含まれる。本発明のバイオマーカー遺伝子又はタンパク質の過剰発現の検出により、中等度から重篤な異形成及び子宮頸癌などの高悪性度疾患を示す試料を、正常細胞又は臨床的疾患の指標でない細胞（例えば、初期のＨＰＶ感染症が存在しない異形成及び軽い異形成）から区別することが可能となる。

バイオマーカーの過剰発現は、タンパク質又は核酸レベルで評価することができる。一部の実施形態では、頸部細胞診断試料中のバイオマーカータンパク質の過剰発現を検出するために抗体を利用する免疫細胞化学的技術を提供する。本発明のこの態様では、特定の目的バイオマーカーに向けられた少なくとも１つの抗体を用いる。また、過剰発現は、例えばハイブリダイゼーション及びＲＴ−ＰＣＲを含めた、核酸に基づいた技術によって検出することもできる。さらに、本発明の方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。

また、本発明の方法は、形態学的特徴又はＨＰＶ感染症の状態を解析する従来の婦人科的診断技術と組み合わせて用いることもできる。したがって、例えば、本明細書中に提示する免疫細胞化学的方法は、従来方法からのすべての形態学的情報が保存されるように、Ｐａｐ試験と組み合わせることができる。このようにして、高悪性度子宮頸部疾患において選択的に過剰発現されるバイオマーカーの検出により、Ｐａｐ試験の高い偽陰性率を下げることができ、また、集団自動スクリーニングが容易になり得る。

本発明は、高悪性度子宮頸部疾患を同定又は診断するための組成物及び方法を提供する。この方法は、高悪性度子宮頸部疾患（例えば中等度から重篤な異形成及び子宮頸癌）において選択的に過剰発現される特異的バイオマーカーの過剰発現を検出することを含む。即ち、本発明のバイオマーカーは、ＨＰＶに感染した細胞と、前悪性、悪性、又は明らかに癌性であるＨＰＶに感染した細胞とを識別する能力を有する。高悪性度子宮頸部疾患の診断方法は、患者由来の組織又は体液試料において、高悪性度子宮頸部疾患を示す少なくとも１つのバイオマーカーの過剰発現を検出することを含む。特定の実施形態では、抗体及び免疫細胞化学的技術を用いて目的バイオマーカーの発現を検出する。さらに、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。

「高悪性度子宮頸部疾患を診断すること（diagnosing high-grade cervical disease）」とは、例えば、子宮頸部疾患の存在を診断又は検出すること、疾患の進行を監視すること、及び高悪性度子宮頸部疾患を示す細胞若しくは試料を同定又は検出することを含むことを意図する。高悪性度子宮頸部疾患を診断、検出、及び同定する、なる用語は、本明細書中で互換性があるように用いられる。「高悪性度子宮頸部疾患（high-grade cervical disease）」とは、膣頸管検査によって前悪性病理、悪性病理、中等度から重篤な異形成、及び子宮頸癌と分類された状態を意図する。根底にある高悪性度子宮頸部疾患には、ＣＩＮII、ＣＩＮIII、ＨＳＩＬ、ｉｎｓｉｔｕ癌腫、腺癌、及び癌（ＦＩＧＯステージＩ〜IV）の組織学的同定が含まれる。

上述のように、正常、ＣＩＮＩ、又はＡＳＣＵＳと分類されたＰａｐスメアを示す患者のうち、有意なパーセンテージが実際には高悪性度子宮頸部疾患の病変的特徴を有する。したがって、本発明の方法は、このような「偽陰性」患者を含めたすべての患者集団において高悪性度子宮頸部疾患を同定することを可能にし、また、患者の試料中の稀な異常細胞の検出を容易にする。診断は細胞形態学及びＨＰＶ感染症の状態とは独立して行うことができるが、本発明の方法は、従来の診断技術、例えばＰａｐ試験、高リスク型ＨＰＶの分子試験などと併せて用いることもできる。

ＨＰＶの型は、子宮頸癌及び前癌性の病変とのその関連性に基づいて高リスク及び低リスクの分類に分けられている。低リスク型ＨＰＶには６、１１、４２、４３、４４型が含まれ、子宮頸癌のリスクの増加に関連づけられていない。対照的に、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８型を含めた高リスク型ＨＰＶは、子宮頸癌及び扁平上皮内病変に強く関連づけられている。例えば、Wright et al. (2004) Obstet. Gynecol. 103:304-309を参照されたい。実際、９９％を超える子宮頸癌が高リスクＨＰＶ感染症に関連している。持続性の高リスクＨＰＶ感染症は、ＨＰＶ遺伝子Ｅ２、Ｅ６、及びＥ７の作用を介して頸部細胞において細胞周期並びに有糸分裂性チェックポイントの混乱をもたらす。具体的には、ＨＰＶのＥ７は、サイクリンＥの増加、及びそれに続く網膜芽細胞腫（Ｒｂ、retinoblastoma）タンパク質からの転写因子Ｅ２ｆの放出を引き起こす。その後、放出されたＥ２ｆ転写因子がトポイソメラーゼIIα（Ｔｏｐｏ２Ａ）、ＭＣＭタンパク質、サイクリンＥ１及びＥ２、並びにｐ１４ａｒｆを含めた様々なＳ期遺伝子の転写を始動し、その結果、細胞周期の制御の損失がもたらされる。ＨＰＶのＥ２はさらに、Ｓｐ−１転写因子を活性化させることによってｐ２１^{ｗａｆ−１}などのＳ期遺伝子の過剰発現を刺激する。持続性のＨＰＶ感染症によって引き起こされる細胞周期の混乱（cell cycle disruption）は、その後に中等度又は重篤な異形成へと進行し、一部の例では最終的に子宮頸癌まで進行し得る軽い頸部異形成を引き起こす場合がある。「子宮頸癌」とは、頸部組織若しくは頸部細胞に関連する任意の癌又は癌性病変を意図する。

頸部ケラチノサイト内のＨＰＶ感染症は、細胞周期内の活性を混乱させるいくつかの変化をもたらす。高リスクのＨＰＶ亜型のＥ６及びＥ７腫瘍性タンパク質は、増殖及び感染したケラチノサイトの新生物性形質転換の増加に関連するいくつかの細胞プロセスに関連づけられている。Ｅ６タンパク質は、２つの重大なプロセスに関連づけられている。１つ目は、ユビキチン媒介のタンパク質分解によるｐ５３腫瘍抑制タンパク質の分解である。機能的なｐ５３を取り除くことにより、ＤＮＡ複製及び有糸分裂に入る前にＤＮＡ修復を司る主要な細胞周期チェックポイントが排除される（Duensing and Munger (2003) Prog Cell Cycle Res. 5:383-391）。さらに、Ｅ６はｃ−ｍｙｃタンパク質と相互作用することが示されており、ｈＴＥＲＴ遺伝子の直接の転写活性化及びそれに続くテロメラーゼの発現を司っている（McMurray and McCance (2003) J Virol. 77:9852-9861；Veldman et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100: 8211-8216）。テロメラーゼの活性化は、複製する染色体上のテロメア長の維持を司る癌の生物学における主要なステップであり、この酵素は細胞の不死化中に染色体が機能的に無傷であることを保証する。

ＨＰＶ腫瘍性タンパク質Ｅ７は、２つの独立した機構によって細胞増殖に貢献することが知られている。１つ目は、Ｅ７とＳｍａｄタンパク質（Ｓｍａｄ２、３及び４）との直接相互作用によってＧ１期での細胞周期を停止させ、したがってＤＮＡに結合するその能力を阻害することを司っている、ＴＧＦ−β腫瘍抑制経路の失活である（Lee et al. (2002) J Biol Chem. 277:38557-38564）。同様に、Ｅ７は、Ｒｂ腫瘍抑制タンパク質と特異的に相互作用することが知られている。細胞周期のＧ１期内では、ＲｂがＥ２Ｆ転写因子と複合体形成し、Ｅ２Ｆが遺伝子の転写を活性化させることを妨げる。Ｇ１／Ｓ境界では、Ｅ２Ｆ転写因子の放出とともにＲｂタンパク質がリン酸化され、したがってＥ２Ｆ遺伝子の転写及び細胞周期のＳ期への移行が開始される。ＨＰＶのＥ７腫瘍性タンパク質は、Ｒｂと直接結合してＥ２Ｆを複合体から追放することによってこの制御機構を廃止させる。その結果、正常な細胞周期の制御とは独立した、Ｅ２Ｆに駆動される遺伝子の転写が生じる（Duensing and Munger (2003) Prog Cell Cycle Res. 5:383-391；Duensing and Munger (2004) Int J Cancer 109:157-162；Clarke and Chetty (2001) Gynecol Oncol. 82:238-246）。このＥ２Ｆの放出は遺伝子の転写を細胞周期の制御から切り離し、その結果、ＤＮＡ合成及び細胞増殖を司るＳ期遺伝子の転写の延長並びに異常がもたらされる。さらに、Ｅ６及びＥ７の合わせた作用は、中心体の異常及びそれに続く頸部新形成におけるゲノム不安定化に貢献することが示されている（Duensing and Munger (2004) Int J Cancer 109:157-162）。

特定の機構に限定することを意図しないが、一部の実施形態では、高悪性度子宮頸部疾患の分子挙動は、ＨＰＶの発癌性の株による感染症の結果として、通常では細胞周期のＳ期中にのみ発現される明確に区別される遺伝子の過剰発現として特徴づけることができる。それに続く非制御の遺伝子転写の活性化及び異常なＳ期誘発は、Ｅ２Ｆ−１転写因子経路に媒介される。この挙動は高悪性度子宮頸部疾患を示すと考えられ、発癌性のＨＰＶ感染症と頸部新形成の分子挙動との間の関連を提供する。分子診断的アッセイ様式におけるこれら頸部新形成の分子バイオマーカーの使用は、子宮頸部疾患の検出を改善させることができ、感度及び特異性が現在の方法を越えて改善されている。一般に、図１〜４及びその全体で本明細書中に参考として組み込まれているMalinowski (2005) BioTechniques 38:1-8（印刷中）を参照されたい。したがって、特定の実施形態では、高悪性度子宮頸部疾患の診断方法は、バイオマーカーの過剰発現を検出することを含み、本明細書に記載のように、バイオマーカーの過剰発現は異常なＳ期誘発を示す。さらに他の実施形態では、この方法は、バイオマーカーの過剰発現を検出することを含み、バイオマーカーの過剰発現は、ＨＰＶのＥ６遺伝子及びＨＰＶのＥ７遺伝子の能動転写（active transcription）又は過剰発現を示す。

異形成は従来、細胞並びに核の大きさ、形状、及び染色特徴の変化を伴った、形態学的観点から上皮細胞の正常な配向性の損失として定義されていた。異形成は細胞異常の度合（即ち、軽度、中等度、重篤な）に従って格付けされ、ＣＩＮなどの前悪性異形成状態の同定によって証明されるように、正常組織から新形成への進行の中間段階であると広く認められている。本発明の方法は、高悪性度子宮頸部疾患に特異的なバイオマーカーの過剰発現に基づいた中等度から重篤な異形成及び子宮頸癌（即ちＣＩＮII状態以上）を含めた、高悪性度子宮頸部疾患の同定を可能にする。

本明細書中に開示する方法は、ＰＡＰスメア及び／又はＨＰＶ感染症の試験と比較して優れた高悪性度子宮頸部疾患の検出を提供する。本発明の特定の態様では、本方法の感度及び特異性は、従来のＰａｐスメアに等しい、又はそれを超える。本明細書中で用いる「特異性」とは、本発明の方法が、膣頸管検査によってＮＩＬであると確認された試料（即ち真陰性）を正確に同定することができるレベルをいう。即ち、特異性とは、疾患が陰性であるもののうち、試験によって陰性であるものの割合である。臨床研究では、特異性は、真陰性の数を真陰性と偽陽性との和で割ることによって計算する。「感度」とは、高悪性度子宮頸部疾患に関して陽性であると膣頸管検査によって確認された試料（即ち真陽性）を正確に同定できるレベルを意図する。したがって、感度とは、疾患が陽性であるもののうち、試験によって陽性であるものの割合である。感度は、臨床研究では、真陽性の数を真陽性と偽陰性との和で割ることによって計算する。以下の実施例１〜３を参照されたい。一部の実施形態では、開示した高悪性度子宮頸部疾患の検出方法の感度は、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上である。さらに、本方法の特異性は、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上である。

用語「陽性適中率(positive predictive value)」又は「ＰＰＶ」とは、本発明の方法を用いて陽性を分類された患者に限定した場合に、患者が高悪性度子宮頸部疾患に罹患している確率をいう。ＰＰＶは、臨床研究では、真陽性の数を真陽性と偽陽性との和で割ることによって計算する。一部の実施形態では、本発明の高悪性度子宮頸部疾患の診断方法のＰＰＶは少なくとも約４０％である一方で、少なくとも約９０％、より詳細には少なくとも約９５％の感度が保たれる。試験の「陰性適中率(negative predictive value)」又は「ＮＰＶ」とは、試験で陰性であったすべての患者に限定した場合に、患者が疾患に罹患していない確率をいう。ＮＰＶは、臨床研究では、真陰性の数を真陰性と偽陰性との和で割ることによって計算する。

本発明のバイオマーカーには、遺伝子及びタンパク質、並びにその変異体及び断片が含まれる。このようなバイオマーカーには、バイオマーカーをコードしている核酸配列の全体若しくは部分配列、又はそのような配列の相補体を含むＤＮＡが含まれる。また、バイオマーカー核酸には、目的核酸の任意のものの全体又は部分配列を含むＲＮＡが含まれる。バイオマーカータンパク質とは、本発明のＤＮＡバイオマーカーによってコードされている、又はそれに対応するタンパク質である。バイオマーカータンパク質は、バイオマーカータンパク質又はポリペプチドの任意のもののアミノ酸配列の全体又は部分配列を含む。

「バイオマーカー」とは、組織又は細胞におけるその発現レベルが、正常又は健康な細胞若しくは組織の発現レベルと比較して変化している、任意の遺伝子或いはタンパク質である。本発明のバイオマーカーは、根底にある高悪性度子宮頸部疾患に選択的である。「高悪性度子宮頸部疾患において選択的に過剰発現される」とは、目的バイオマーカーが、高悪性度子宮頸部疾患において過剰発現されるが、ＬＳＩＬ、ＣＩＮＩ、異形成がまったく存在しないＨＰＶに感染した試料、未熟な異形成細胞、及び臨床的疾患であるとみなされない他の状態と分類された状態において過剰発現されないことを意図する。したがって、本発明のバイオマーカーの検出により、根底にある高悪性度子宮頸部疾患を示す試料を、良性増殖、初期ＨＰＶ感染症、又は軽い異形成を示す試料から区別することが可能となる。「初期ＨＰＶ感染症」とは、頸部異形成まで進行していないＨＰＶ感染症を意図する。本明細書中で使用する「軽い異形成」とは、高悪性度病変が存在しないＬＳＩＬ及びＣＩＮＩを意図する。また、本発明の方法は、高悪性度疾患を示す細胞を、正常細胞、未熟な異形成細胞、及び臨床的疾患の指標でない他の細胞から識別する。このようにして、本発明の方法により、従来のＰａｐ試験によって正常、ＣＩＮＩ、ＬＳＩＬ、又はＡＳＣＵＳと誤分類症例（即ち「偽陰性」）においても、高悪性度子宮頸部疾患の正確な同定が可能となる。一部の実施形態では、高悪性度子宮頸部疾患の診断方法は、異常な又は非定型のＰａｐスメアを反映して行う。即ち、本発明の方法は、異常な又は非定型のＰａｐスメア結果を有する患者に応えて行い得る。本発明の他の態様では、この方法は、従来のＰａｐ試験が現在行われているのと同様に、女性の一般集団における高悪性度子宮頸部疾患の一次スクリーニング試験として行う。

本発明のバイオマーカーには、本明細書中に上記で定義した、高悪性度子宮頸部疾患において選択的に過剰発現される任意の遺伝子又はタンパク質が含まれる。このようなバイオマーカーは、前悪性、悪性、又は明らかに癌性である、細胞診断用の細胞懸濁液内の細胞を同定する能力を有する。本発明のバイオマーカーは、ＣＩＮII状態以上の細胞を検出するが、根底にある高悪性度疾患が存在しないＣＩＮＩ及びＨＰＶに感染した細胞を検出しない。特に興味深いバイオマーカーには、細胞周期の調節、細胞周期ＨＰＶによる混乱、ＤＮＡの複製及び転写、シグナル伝達に関与する遺伝子並びにタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、バイオマーカーは、その発現がＥ２ｆ転写因子又はＳｐ−１転写因子によって刺激される遺伝子を含めたＳ期遺伝子である。核バイオマーカーを用いて、本発明の特定の態様を実施し得る。「核バイオマーカー」とは、主に細胞の核内で発現されるバイオマーカーを意図する。核バイオマーカーは、より低い度合で細胞の他の部分でも発現され得る。高悪性度子宮頸部疾患を示す任意のバイオマーカーを本発明で用い得るが、特定の実施形態では、バイオマーカー、特に核バイオマーカーは、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ｐ２１^ｗａｆ１、トポイソメラーゼIIα（Ｔｏｐｏ２Ａ）、ｐ１４^ａｒｆ、及びサイクリンＥからなる群から選択される。最も具体的には、バイオマーカーはＭＣＭタンパク質を含み得る。

ミニ染色体保持（ＭＣＭ、minichromosome maintenance）タンパク質は、真核のＤＮＡ複製において重要な役割を果たす。ミニ染色体保持（ＭＣＭ）タンパク質は、前複製複合体をＤＮＡ上に載せること及び複製ＤＮＡ鎖の新規合成中に二重鎖ＤＮＡの巻き戻しを補助するためのヘリカーゼとして機能することで、ＤＮＡ複製の初期段階において機能する。ＭＣＭタンパク質のそれぞれが、その高度に保存された中心ドメイン中にＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅモチーフを有する。ＭＣＭタンパク質のレベルは、一般に、正常細胞が細胞周期のＧ０期からＧ１／Ｓ期へと進むにつれて、変動的な様式で増加する。Ｇ０期では、ＭＣＭ２及びＭＣＭ５タンパク質はＭＣＭ７及びＭＣＭ３タンパク質よりもはるかに少ない。ＭＣＭ６はＭＣＭ２、ＭＣＭ４、及びＭＣＭ７と複合体を形成し、これはヒストンＨ３に結合する。さらに、ＭＣＭ４、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の部分複合体はヘリカーゼ活性を有し、これはＭＣＭ６のＡＴＰ結合活性及びＭＣＭ４のＤＮＡ結合活性によって媒介される。例えば、すべてその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Freeman et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:2121-2132；Lei et al. (2001) J. Cell Sci. 114:1447-1454；Ishimi et al. (2003) Eur. J. Biochem. 270:1089-1101を参照されたい。

初期の出版物は、ＭＣＭタンパク質、具体的にはＭＣＭ−５が、子宮頸部疾患（Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:14932-14937）及び他の癌（Freeman et al. (1999) Clin Cancer Res. 5:2121-2132）の検出に有用であることを示している。出版された文献は、ＭＣＭ−５に対する抗体が頸部新生細胞を検出する能力を有することを示している。高悪性度子宮頸部疾患を検出する特異性は、ＭＣＭ−５について実証されていない（Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:14932-14937）。ＭＣＭ−５の発現の検出は高悪性度子宮頸部疾患に限定されておらず、高リスクＨＰＶによる感染ののちに細胞周期に再度入った、同定された低悪性度異形成及び増殖性細胞でも検出されている。ＭＣＭ−５に対する抗体を用いた頸部新形成の検出を図４に示す。ＭＣＭ−５に加えて、ＭＣＭ−２及びＭＣＭ−７を含めたＭＣＭファミリーの他のメンバーが、組織試料中の頸部新形成を検出するための潜在的に有用なマーカーであることが示されている（Freeman et al. (1999) Clin Cancer Res. 5:2121-2132；Brake et al. (2003) Cancer Res. 63:8173-8180）。最近の結果により、ＭＣＭ−７が免疫化学的様式を用いた高悪性度子宮頸部疾患を検出するための特異的マーカーであると考えられることが示されている（Brake et al. (2003) Cancer Res. 63:8173-8180；Malinowski et al. (2004) Acta Cytol. 43:696）。

トポイソメラーゼIIα（Ｔｏｐｏ２ａ）はＤＮＡ複製に関与する重要な核酵素であり、癌の治療に用いられる多くの抗癌薬の標的である。Ｔｏｐｏ２ａの発現の低下は、いくつかの化学療法剤に対する主な耐性機構である。このタンパク質の発現範囲の顕著な変動が多くの異なる腫瘍において注目されている。Ｔｏｐｏ２ａは、増殖細胞中で優勢であり、Ｍ期中に特異的部位におけるリン酸化によって修飾され、これは有糸分裂性染色体の凝結及び分離に重要である。

ｐ２１とは、染色体６ｐ上のＷＡＦ１／Ｃｉｐ１遺伝子によってコードされているタンパク質である。この遺伝子は、いくつかのサイクリン／サイクリン依存性キナーゼ複合体の活性を阻害すること、及び細胞周期の進行を遮断することが示されている。ｐ２１^ｗａｆ１の発現はｐ５３の細胞周期停止機能を媒介する。ｐ２１はｐ５３のいくつかの増殖調節機能を媒介すると考えられるので、その発現は、ｐ５３の蓄積よりも正確にｐ５３の機能状態を反映し得る。さらに、ｐ２１^ｗａｆ１は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ、proliferating cell nuclear antigen）の作用を遮断することによってＤＮＡ複製を阻害することができる。

サイクリンＥとはｃｄｋ−２の調節性サブユニットであり、哺乳動物の細胞周期中にＧ１／Ｓの移行を制御する。サイクリンＥの複数のアイソフォームが腫瘍中でのみ発現され、正常組織中では発現されず、これはサイクリンＥの転写後調節を示唆している。ｉｎｖｉｔｒｏ解析により、サイクリンＥのこれら切断された変異体アイソフォームがヒストンＨ１をリン酸化することができることが示された。サイクリンＥタンパク質中の変化は、様々な癌における予後不良の指標として関連づけられている。

上記バイオマーカーについて詳述にしたが、高悪性度頸部の病状（例えば、ＣＩＮII、ＣＩＮIII、及び子宮頸癌）において過剰発現される任意のバイオマーカーを本発明の実施に用い得る。他の目的バイオマーカーには、Ｇ１／Ｓ期の境界又はＳ期に特異的な、細胞周期に調節される遺伝子が含まれる。このような遺伝子には、それだけには限定されないが、ヘリカーゼ（ＤＤＸ１１）、ウラシルＤＮＡグリコラーゼ（ＵＮＧ、uracil DNA glycolase）、Ｅ２Ｆ５、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）、サイクリンＥ２（ＣＣＮＥ２）、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ４５Ｌ、ＣＤＣ６、ｐ２１ＷＡＦ−１（ＣＤＫＮ１Ａ）、ＣＤＫＮ３、Ｅ２Ｆ１、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＮＰＡＴ、ＰＣＮＡ、ステムループＢＰ（ＳＬＢＰ、stem loop BP）、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ２Ｃ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、dihydrofolate reductase）、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＭＳＨ２、ＮＡＳＰ、リボヌクレオチドレダクターゼＭ１（ＲＲＭ１、ribonucleotide reductase M1）、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２、ribonucleotide reductase M2）、チミジン合成酵素（ＴＹＭＳ、thymidine synthase）、複製因子Ｃ４（ＲＦＣ４、replication factor C4）、ＲＡＤ５１、クロマチン因子１Ａ（ＣＨＡＦ１Ａ、chromatin Factor 1A）、クロマチン因子１Ｂ（ＣＨＡＦ１Ｂ、chromatin Fator 1B）、トップイソメラーゼIII（ＴＯＰ３Ａ、topisomerase III）、ＯＲＣ１、プライマーゼ２Ａ（ＰＲＩＭ２Ａ、primase 2A）、ＣＤＣ２７、プライマーゼ１（ＰＲＩＭ１、primase 1）、フラップ構造エンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ１、flap structure endonuclease）、ファンコーニ貧血相補群Ａ（ＦＮＡＣＡ、fanconi anemia comp. grp A）、ＰＫＭＹＴ１、及び複製タンパク質Ａ２（ＲＰＡ２、replication protein A2）が含まれる。例えば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Whitfield et al. (2002) Mol. Biol. Cell 13:1977-2000を参照されたい。他の目的Ｓ期遺伝子には、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２、cyclin-dependent kinase 2）、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＤＮＡポリメラーゼＩα（ＤＮＡＰＯＬ１、DNA polymerase I alpha）、ＤＮＡリガーゼ１、Ｂ−Ｍｙｂ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡＭＥＴ、DNA methyl transferase）、ペリセントリン（ＰＥＲ、pericentrin）、ＫＩＦ４、ＤＰ−１、ＩＤ−３、ＲＡＮ結合タンパク質（ＲＡＮＢＰ１、RAN binding protein）、ギャップジャンクションα６（ＧＪＡ６、gap junction alpha 6）、アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＤＨ、aminolevulinate dehydratase）、ヒストン２ＡＺ（Ｈ２Ａ．Ｚ、histone 2A Z）、スペルミン合成酵素（ＳｐｍＳ、spermine synthase）、プロリフェリン２、Ｔリンパ球活性化タンパク質、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２、phospholipase A2）、及びＬ６抗原（Ｌ６、L6 antigen）が含まれる。例えば、本明細書中に参考として組み込まれている、Nevins et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:4689-4699を参照されたい。

本発明の一部の態様では、バイオマーカーはＥ２ｆ転写因子によって誘導される遺伝子を含む。このような遺伝子には、それだけには限定されないが、チミジル酸合成酵素、チミジンキナーゼ１、リボヌクレオチドレダクターゼＭ１、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２、ＣＤＫ２、サイクリンＥ、ＭＣＭ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、ＤＮＡプライマーゼ小サブユニット、トポイソメラーゼIIＡ（Ｔｏｐｏ２Ａ、topoisomerase II A）、ＤＮＡリガーゼ１、フラップエンドヌクレアーゼ１、ＲＡＤ５１、ＣＤＣ２、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＢ２、ＫＩ−６７、ＫＩＦＣ１、ＦＩＮ１６、ＢＵＢ１、インポーチンα−２、ＨＭＧ２、ｚｅｓｔｅのエンハンサー、ＳＴＫ−１、ヒストンステムループＢＰ、Ｒｂ、Ｐ１８−ＩＮＫ４Ｃ、アネキシンVIII、ｃ−Ｍｙｂ、ＣＤＣ２５Ａ、サイクリンＤ３、サイクリンＥ１、デオキシシトシンキナーゼ、ＤＰ−１、エンドセリン変換酵素、エノラーゼ２、Ｐ１８ＩＮＫ４Ｃ、リボヌクレオチドレダクターゼ、及びウラシルＤＮＡグリコラーゼ２が含まれる。例えば、Nevins et al.、上記；Muller et al. (2000) Genes and Dev. 15:267-285を参照されたい。特定の実施形態では、目的バイオマーカーは、例えば、サイクリンＥ２、Ｋｉ−６７、ｐ５７ＫＩＰ２、ＲＡＮＢＰＭ、及び複製タンパク質Ａ１などの、細胞周期の調節並びにＤＮＡ複製に関与するＥ２ｆ転写因子によって誘導される遺伝子である。ＡＰＡＦ１、Ｂｃｌ−２、カスパーゼ３、ＭＡＰ３キナーゼ５、及びＴＮＦ受容体関連因子を含めた一部のＥ２ｆ誘導性の目的遺伝子は、アポトーシスに関与している。他のＥ２ｆ誘導性の遺伝子は転写の調節に関与しており、例えば、ａｓｈ２様、ポリホメオチック２（polyhomeotic 2）、胚体外胚葉タンパク質、ｚｅｓｔｅのエンハンサー、ｈａｉｒｙ／ｓｐｌｉｔのエンハンサー、ホメオボックスＡ１０、ホメオボックスＡ７、ホメオボックスＡ９、ホメオドメインＴＦ１、前Ｂ細胞白血病ＦＴ３、ＹＹ１ＴＦ、ＰＯＵドメインＴＦ、ＴＡＦII１３０、ＴＢＰ因子１７２、塩基性ＴＦ３、ブロモドメイン／ジンクフィンガー、ＳＷＩ／ＳＮＦ、ＩＤ４、ＴＥＡ−４、ＮＦＡＴＣ１、ＮＦＡＴＣ３、ＢＴ、ＣＮＣ−１、ＭＡＦ、ＭＡＦＦ、ＭＡＦＧ、コア結合タンパク質、Ｅ７４様因子４、ｃ−ＦＯＳ、ＪＵＮＢ、ジンクフィンガーＤＮＡＢＰ、及びＣｂｐ／ｐ３００トランス活性化因子が含まれる。シグナル伝達に関与するＥ２ｆ誘導性の遺伝子も潜在的な目的バイオマーカーであり、ＴＧＦβ、フォリスタチン、骨形態発生タンパク質２、ＢＭＰ受容体１Ａ型、ｆｒｉｚｚｌｅｄ相同体１、ＷＮＴ１０Ｂ、スフィンゴシンキナーゼ１、二重特異性ホスファターゼ７、二重特異性（Ｙ）ホスファターゼ、ＦＧＦ受容体３、タンパク質チロシンホスファターゼ、二重特異性（Ｙ）ホスファターゼＤ６６５５、インスリン受容体、成熟Ｔ細胞増殖１、ＦＧＦ受容体２、ＴＧＦα、ＣＤＣ４２エフェクタータンパク質３、Ｍｅｔ、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＴＡＣＣ１、及びＴＥＡＤ４が含まれる。

本発明の方法は高悪性度子宮頸部疾患を検出するために患者の試料中に少なくとも１つのバイオマーカーを検出することを要するが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のバイオマーカーを用いて本発明を実施し得る。人体試料中における複数のバイオマーカーの検出を用いて高悪性度子宮頸部疾患の事例を同定し得ることが理解されよう。したがって、一部の実施形態では、２つ以上のバイオマーカー、より好ましくは、２つ以上の補完的バイオマーカーを用いる。「補完的(complementary)」とは、人体試料中のバイオマーカーの組合せを検出した結果、高悪性度子宮頸部疾患の同定が、１つのバイオマーカーのみを用いた場合に同定されるよりも高いパーセンテージの事例で成功することを意図する。したがって、一部の例では、少なくとも２つのバイオマーカーを用いることによって高悪性度子宮頸部疾患のより正確な決定を行うことができる。したがって、少なくとも２つのバイオマーカーを用いた場合、明確に異なるバイオマーカータンパク質に向けられた少なくとも２つの抗体を用いて、本明細書中に開示した免疫細胞化学的方法を実施する。抗体は、同時、即ちともに人体試料と接触させ得る。本発明の特定の態様では、ＭＣＭ２及びＴｏｐｏ２Ａの過剰発現は３つの抗体を用いて検出し、この抗体のうち２つはＭＣＭ２に特異的であり、３つ目の抗体はＴｏｐｏ２Ａに特異的である。

特定の実施形態では、本発明の診断方法は、患者から頸部試料を採取すること、試料を目的バイオマーカーに特異的な少なくとも１つの抗体と接触させること、及び抗体結合を検出することを含む。抗体結合の検出によって決定されるように本発明のバイオマーカーの過剰発現を示す試料は、高悪性度子宮頸部疾患に関して陽性であるとみなされる。特定の実施形態では、人体試料は頸部細胞単層である。本発明の一部の態様では、頸部細胞単層をスライドガラス上で提供する。

「人体試料(body sample)」とは、バイオマーカーの発現を検出することができる細胞、組織、又は体液の任意のサンプリングを意図する。このような人体試料の例には、それだけには限定されないが血液、リンパ液、尿、婦人科系体液、生検、及びスメアが含まれる。人体試料は、例えば領域の掻爬若しくはスワブによる技術又は針を用いて体液を吸引することによる技術を含めた様々な技術によって、患者から得ることができる。様々な人体試料を採取する方法は当分野で周知である。特定の実施形態では、人体試料は、懸濁状態、特に液体系調製物中に懸濁状態の頸部組織試料又は頸部細胞としての頸部細胞を含む。一実施形態では、頸部試料は、例えば、SurePath（登録商標）（TriPath Imaging, Inc.社製）又はThinPrep（登録商標）調製物（CYTYC, Inc.社製）などの液体系細胞診断標本の調製指針に従って採取する。拡大して視察するために、人体試料をスライドガラスに移してもよい。標本を保存し、検査を容易にするために、固定液及び染色液をスライド上で細胞に施用し得る。一実施形態では、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，３４６，８３１号に記載のように、頸部試料を採取及び加工して単層試料を提供する。

単層方法は、陽イオンで帯電させた基質上に細胞診断物質の単層を生成する方法に関する。この方法は、一定の密度勾配にわたって遠心分離を行うことによって細胞診断物質を分離するステップと、細胞診断物質の固まったペレットを生成するステップと、細胞診断物質のペレットを混合するステップと、所定体積のアリコートを混合したペレットから取り出すステップと、アリコート及び所定体積の水を、陽イオンで帯電させた基質に取り外し可能に固定した沈降容器中で堆積させるステップと、重力下で細胞診断物質を基質上に沈降させるステップと、細胞診断物質の沈降後に、沈降容器から水を除去するステップとを含む。自動解析には、沈降容器を基質から外し得る。解離は、シリンジ処理、トリプシン処理、超音波処理、振盪、ボルテックス攪拌などの当分野で知られている任意の方法によるものであるか、又は、その内容が本明細書中に参考として組み込まれている同時係属米国特許第５，３１６，８１４号に記載の装置を用いることによるものであり得る。一部の実施形態では、頸部細胞単層を含むスライドは、PrepStain（商標）スライドプロセッサー（TriPath Imaging, Inc.社製）を用いて、SurePath（商標）（TriPath Imaging, Inc.社製）試料から調製する。

バイオマーカーを同定又は検出するための当分野で利用可能な任意の方法が、本明細書中に包含される。本発明のバイオマーカーの過剰発現は、核酸レベル又はタンパク質レベルで検出することができる。過剰発現を決定するために、検査する人体試料を、健康な人由来の対応する人体試料と比較し得る。即ち、「正常な」発現レベルとは、高悪性度子宮頸部疾患に罹患していないヒト対象又は患者の頸部細胞中におけるバイオマーカーの発現レベルである。このような試料は標準化した形態で存在することができる。一部の実施形態では、特に人体試料が頸部細胞単層を含む場合は、バイオマーカーの過剰発現の決定に人体試料と健康な人由来の対応する人体試料との比較を要さない。この場合、単一の患者由来の頸部細胞単層は、存在する５０，０００個の正常細胞あたり１〜２個の異常細胞の少ない数のみ含み得る。その本発明のバイオマーカーの過剰発現によって同定される、このような異常細胞の検出により、健康な人由来の対応する人体試料と比較する必要性が排除される。

本発明のバイオマーカーの検出方法は、バイオマーカーの量又は存在を核酸レベル若しくはタンパク質レベルのいずれかで決定する任意の方法を含む。このような方法は当分野で周知であり、それだけには限定されないが、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写方法、及び核酸増幅方法が含まれる。特定の実施形態では、バイオマーカーの過剰発現は、例えば特異的バイオマーカータンパク質に向けられた抗体を用いて、タンパク質レベルで検出される。これらの抗体は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、又は免疫細胞化学的技術などの様々な方法で用いることができる。同様に、形態学的情報及び免疫細胞化学的情報が得られるように、頸部スメアの免疫染色を従来のＰａｐ染色方法と組み合わせることができる。このようにして、バイオマーカーの検出によりＰａｐスメア試験の高い偽陰性率を下げることができ、また、集団自動スクリーニングが容易になり得る。

一実施形態では、バイオマーカータンパク質に特異的な抗体を利用して人体試料中のバイオマーカータンパク質の過剰発現を検出する。この方法は、患者から人体試料を得ること、人体試料を、高悪性度子宮頸部疾患において選択的に過剰発現されるバイオマーカーに向けられた、少なくとも１つの抗体と接触させること、及び抗体結合を検出して、バイオマーカーが患者の試料中で過剰発現されているかどうかを決定することを含む。本発明の好ましい態様は、高悪性度子宮頸部疾患を診断するための免疫細胞化学的技術を提供する。具体的には、本方法は、患者の試料中の、高悪性度子宮頸部疾患に特異的なバイオマーカーの抗体染色を含む。当業者は、本明細書中で以下に記載の免疫細胞化学的方法を手動で、又は、例えばAutostainer Universal Staining System（Dako社製）若しくはBiocare Nemesis Autostainer（Biocare社製）を用いて、自動的な様式で行い得ることを理解されよう。頸部試料の抗体染色の１つのプロトコル（即ち免疫細胞化学）を実施例１に提供する。

好ましい免疫細胞化学的方法では、患者の頸部試料を例えばSurePath（商標）採取バイアル（TriPath Imaging, Inc.社製）などの液体培地中に採取する。PrepStain（商標）システム（TriPath Imaging, Inc.社製）などの自動プロセッサーを用いて細胞を液体培地から採取し、さらなる解析のためにそれらをスライドガラス上に薄層として堆積させる。スライド標本は固定若しくは未固定であり得、解析し調製後すぐに解析するか、又はのちに解析するために保存し得る。一部の実施形態では、調製したスライドを最短で２４時間、９５％のエタノール中で保存する。或いは、他の実施形態では、下に記述するようにスライドを前処理緩衝液中で保存する。

バイオマーカー抗原の抗体結合へのアクセシビリティを可能にするために、試料を改変する必要がある可能性がある。免疫細胞化学的方法の特定の態様では、スライドを前処理緩衝液、例えばSureSlide（登録商標）調製緩衝液（TriPath Imaging, Inc.社製）に移し、抗原のアクセシビリティを増大するために任意選択で加熱する。前処理緩衝液中での試料の加熱により、細胞の脂質二重層が迅速に破壊され、抗原（即ちバイオマーカータンパク質）の抗体結合におけるアクセシビリティが増す。前処理緩衝液は、ポリマー、洗剤、又は、例えばエチルオキシ化した陰イオン性若しくは非イオン性の界面活性剤、アルカノエート若しくはアルコキシレート若しくはさらにこのような界面活性剤の混合物などの非イオン性若しくは陰イオン性の界面活性剤、或いは、さらには胆汁酸塩の使用を含み得る。特定の実施形態では、前処理緩衝液は、約１８３ｋＤの分子量を有するナトリウムアルカノエートと混合した約３７０ｋＤの分子量を有するアルコキシレート（本明細書中で以降ＲＡＭと呼ぶ）などの非イオン性又は陰イオン性の洗剤を含む。特定の実施形態では、前処理緩衝液は１％のＲＡＭを含む。一部の実施形態では、前処理緩衝液は、上記で指示したように、スライド保存緩衝液としても用い得る。別の実施形態では、０．１％〜１％のデオキシコール酸、ナトリウム塩、一水和物の溶液を、保存緩衝液及び前処理緩衝液のどちらとしても用いる。本発明のさらに別の実施形態では、ラウレス−１３−カルボン酸ナトリウム（例えばSandopan LS）又は及びエトキシル化した陰イオン性複合体又はさらにはアルキルアリールエトキシレートカルボン酸の溶液を、保存及び前処理緩衝液に用いることができる。本発明の特定の態様では、スライド前処理緩衝液は０．０５％〜５％のラウレス−１３−カルボン酸ナトリウム、具体的には０．１％〜１％のラウレス−１３−カルボン酸ナトリウム、より具体的には０．５％のラウレス−１３−カルボン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、スライドを、前処理及び染色工程の前に７２時間まで緩衝液中で保存することができる。本発明の前処理緩衝液は、例えば免疫細胞化学的方法又は免疫組織化学的方法などの免疫アッセイにおいて、抗体結合に対するアクセシビリティを増大する方法で用い得る。実施例１４を参照されたい。用語「前処理緩衝液(pretreatment buffer)」及び「調製緩衝液(preparation buffer)」は本明細書中で互換性があるように使用され、特に抗体結合に対する抗原のアクセシビリティを増大させることによって免疫染色用に細胞診断試料又は組織学的試料を調製するために用いる緩衝液をいう。

当分野で知られている抗原の回収方法を含めた、抗体結合に対するアクセシビリティを増大する任意の方法を本発明の実施において用い得る。例えば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Bibbo et al. (2002) Acta. Cytol. 46:25-29；Saqi et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370；Bibbo et al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11を参照されたい。一部の実施形態では、抗原の回収は、スライドを９５％のエタノール中に少なくとも２４時間保存すること、スライドを９５℃に予熱した１×Target Retrieval Solution、ｐＨ６．０（DAKO社製S1699）／ｄＨ２Ｏ浴に浸す、及びスライドをスチーマーに２５分間入れることを含む。以下の実施例２を参照されたい。

抗原のアクセシビリティを増大するための前処理又は抗原の回収ののち、適切な遮断剤、例えば過酸化水素などのペルオキシダーゼ遮断剤を用いて試料を遮断する。一部の実施形態では、抗体の非特異的結合を防ぐためにタンパク質遮断剤を用いて試料を遮断する。タンパク質遮断剤は、例えば精製カゼインを含み得る。その後、目的バイオマーカーに向けられた抗体、特にモノクローナル抗体を、試料とともにインキュベーションする。上述のように、当業者は、場合によっては患者の試料中で複数のバイオマーカーを検出することによって高悪性度子宮頸部疾患のより正確な診断が得られ得ることを理解されよう。したがって、特定の実施形態では、２つの明確に異なるバイオマーカーに向けられた少なくとも２つの抗体を用いて高悪性度子宮頸部疾患を検出する。複数の抗体を用いる場合、これらの抗体は、個別の抗体試薬として逐次的に、又は抗体カクテルとして同時に、単一の試料に加え得る。以下の実施例３を参照されたい。或いは、それぞれの個別の抗体を同一の患者由来の別々の試料に加え、その結果生じるデータをプールし得る。特定の実施形態では、抗体カクテルは少なくとも３つの抗体を含み、２つの抗体がＭＣＭ２と特異的に結合し、３つ目の抗体はＴｏｐｏ２Ａと特異的に結合する。

抗体結合を検出するための技術は当分野で周知である。目的バイオマーカーへの抗体結合は、抗体結合のレベルに対応し、したがってバイオマーカータンパク質の発現レベルに対応する、検出可能なシグナルを生じる化学試薬を使用することによって検出し得る。本発明の免疫細胞化学的方法の１つでは、標識したポリマーにとコンジュゲートした二次抗体を使用することによって抗体結合を検出する。標識したポリマーの例には、それだけには限定されないが、ポリマー−酵素コンジュゲートが含まれる。このような複合体中の酵素は、典型的には、抗原−抗体の結合部位で色素原の堆積を触媒するために用いられ、その結果、目的バイオマーカーの発現レベルに対応する細胞染色が生じる。特に興味深い酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、horseradish peroxidase）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ、alkaline phosphatase）が含まれる。本発明を実施するために、例えばDako社製Envision+システム及びBiocare Medical社製Mach 3システムなどの市販の抗体検出システムを用い得る。

本発明の１つの具体的な免疫細胞化学的方法では、バイオマーカーへの抗体結合は、二次抗体とコンジュゲートしたＨＲＰ標識ポリマーを使用することによって検出する。また、抗体結合は、マウスモノクローナル抗体に結合するマウスプローブ試薬、及びマウスプローブ試薬に結合する、ポリマーとコンジュゲートしたＨＲＰを使用することによっても検出することができる。スライドを、色素原３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、3,3'-diaminobenzidine）を用いて抗体結合について染色し、その後、ヘマトキシリン及び任意選択で水酸化アンモニウム又はＴＢＳ／Tween-20などの青味剤（bluing agent）を用いて対比染色を行う。本発明の一部の態様では、細胞染色（即ちバイオマーカーの過剰発現）を評価し、且つ高悪性度子宮頸部疾患が存在するかどうかを決定するために、細胞検査技師及び／又は病理学者によってスライドを顕微鏡検査する。或いは、試料を自動顕微鏡観察によって、又は陽性染色細胞の同定を容易にするコンピュータソフトウェアの支援を用いて人手によって検査し得る。

用語「抗体」及び「複数の抗体」とは、単鎖抗体、キメラ、ヒト化抗体などの抗体の天然に存在する型及び組換え抗体、多特異性抗体、並びに前述のものすべての断片及び誘導体を広く包含し、断片及び誘導体は少なくとも１つの抗原結合部位を有する。抗体の誘導体は、抗体とコンジュゲートしたタンパク質又は化学薬品部分を含み得る。

「抗体」及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ、immunoglobulin）とは、同じ構造的等張を有する糖タンパク質である。抗体は抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンには抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子のどちらも含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低いレベルで、且つ骨髄腫によってより高いレベルで産生される。

用語「抗体」とは、最も広義に用いられ、完全に構築された抗体、抗原に結合することができる抗体断片（例えばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体）、及び前述のものを含む組換えペプチドにわたる。

本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得た抗体ことをいい、即ち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る潜在的な自然に存在する突然変異以外は同一である。

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖抗体（Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062）；単鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び、その名称が容易に３５結晶化するその能力を反映している、残りの「Ｆｃ」断片が生じる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するが、それでも抗原を架橋結合する能力を有する、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。

「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位及び結合部位を含む最小の抗体断片である。２鎖のＦｖ種では、この領域は、１本の重鎖及び１本の軽鎖の可変ドメインの、密な非共有結合の二量体からなる。単鎖Ｆｖ種では、１本の重鎖及び１本の軽鎖の可変ドメインは、軽鎖と重鎖とが、２鎖のＦｖ種に類似の「二量体」構造で結合できるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合されていることができる。それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上の抗原−結合部位を定義するのは、この立体配置においてである。集合すると、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合の特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）さえも、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識且つ結合する能力を有する。

また、Ｆａｂ断片も、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体のヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含めた、重鎖Ｃ_Ｈ１ドメインのカルボキシ末端における数残基の付加によって、Ｆａｂ’断片と異なる。定常ドメインのシステイン残基（又は複数のシステイン残基）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書中の命名は、Ｆａｂ’−ＳＨである。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初、間にヒンジのシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。

ポリクローナル抗体は、バイオマーカータンパク質免疫原を用いて適切な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、又は他の哺乳動物）の免疫化を行うことによって調製することができる。免疫化された対象における抗体価は、固定したバイオマーカータンパク質を使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ、enzyme linked immunosorbent assay）などを用いて、標準の技術によって経時的に監視することができる。免疫化後の適切な時点、例えば抗体価が最も高い時に、抗体産生細胞を対象から得て、最初にKohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al. (1985)、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld and Sell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), pp. 77-96）又はトリオーマ技術などの標準の技術による、モノクローナル抗体の調製に用いることができる。ハイブリドーマを産生する技術は周知である（一般に、Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY)；Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52；Kenneth (1980)、Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY)；及びLerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402を参照されたい）。

モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、バイオマーカータンパク質を用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば抗体ファージディスプレイライブラリ）のスクリーニングを行い、それによりバイオマーカータンパク質に結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することによって、モノクローナル抗体を同定及び単離することができる。ファージディスプレイライブラリを作製及びスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Pharmacia社製Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号２７−９４００−０１；及びStratagene社製SurfZAP 9 Pharge Display Kit、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリの作製及びスクリーニングにおける使用に特に受け入れられる方法並びに方法の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９１／１７２７１号；ＷＯ９２／２０７９１号；ＷＯ９２／１５６７９号；第９３／０１２８８号；ＷＯ９２／０１０４７号；第９２／０９６９０号；及び第９０／０２８０９号；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281；Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734に見つかる。

抗体結合の検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングさせることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光性物質、生物発光物質、及び放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族の複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリンが含まれ；発光性物質の例にはルミノールが含まれ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ；適切な放射性物質の例には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、又は^３Ｈが含まれる。

本発明の免疫細胞化学的方法において抗体染色を検出することに関して、当分野には、生体試料中の複数の分子種（例えばバイオマーカータンパク質）の量を定量的に決定するための、映像顕微鏡観察及びソフトウェアによる方法も存在し、存在する各分子種は特異的な色を有する代表的な色素マーカーによって示される。このような方法は、当分野で比色分析方法としても知られている。このような方法では、特定の目的バイオマーカーの存在を視覚的に示すために、映像顕微鏡観察を用いて染色後の生体試料の画像を提供する。本明細書中に参考として組み込まれているMarcelpoil et al.の米国特許出願第０９／９５７，４４６号及びMarcelpoil et al.の米国特許出願第１０／０５７，７２９号に開示されているものなどの、このような方法の一部は、画像処理システム及び関連するソフトウェアを使用して、画像処理システム及び関連するソフトウェアによって決定される色素マーカーのそれぞれ光学密度又は透過率の値によって示される、代表的な色素マーカーの存在に基づいて、存在するそれぞれの分子種の相対量を決定することを開示している。これらの技術は、構成色部分に「分解した」単一の映像画像を用いた、染色した生体試料中のそれぞれの分子種の相対量の定量的な決定を提供する。

本発明を実施するために用いた抗体は、目的バイオマーカータンパク質に対して高い特異性を有するように選択する。抗体を作製する方法及び適切な抗体を選択する方法は当分野で知られている。例えば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Celis, ed. (印刷中) Cell Biology & Laboratory Handbook, 3rd edition (Academic Press, New York)を参照されたい。一部の実施形態では、特異的バイオマーカータンパク質に向けられた市販の抗体を、本発明の実施に用い得る。本発明の抗体は、組織学的試料ではなく、細胞診断の望ましい染色に基づいて選択し得る。即ち、特定の実施形態では、抗体は、最終的な試料の種類（即ち細胞診断調製物）を念頭において、且つ結合特異性について選択する。

本発明の一部の態様では、目的特異的バイオマーカーに向けられた抗体は、複数ステップのスクリーニング工程によって選択及び精製する。特定の実施形態では、ポリドーマをスクリーニングして、所望の特異性及び感度の特色を有する、バイオマーカーに特異的な抗体を同定する。本明細書中で使用する「ポリドーマ」とは、複数のハイブリドーマをいう。本発明のポリドーマは、典型的にはマルチウェル組織培養プレート中に提供する。最初の抗体スクリーニングステップでは、複数の正常（即ちＣＩＮなし）、ＣＩＮIII、扁平細胞癌、及び腺癌の試料を含む腫瘍組織マイクロアレイを作製する。複数の組織のアレイを単一のスライド上に作製するための方法及びChemicon社製（登録商標）Advanced Tissue Arrayerなどの装置は、当分野で知られている。例えば、米国特許第４，８２０，５０４号を参照されたい。ポリドーマを含む各ウェルからの無希釈の上清で、標準の免疫組織化学的技術を用いて陽性染色についてアッセイを行う。この最初のスクリーニングステップでは、バックグラウンド、即ち非特異的結合は基本的に無視する。陽性結果を生じるポリドーマを選択し、抗体スクリーニングの第２ステージに用いる。

第２のスクリーニングステップでは、陽性ポリドーマを限界希釈工程に供する。その結果生じるスクリーニングされていない抗体は、標準の免疫組織化学的技術を用いて、ＣＩＮIII又は子宮頸癌試料の陽性染色についてアッセイを行う。この段階では、バックグラウンド染色は関係があり、異常細胞（即ちＣＩＮIII及び癌細胞）に関してのみ陽性に染色される候補ポリドーマだけをさらなる解析用に選択する。

正常及びＣＩＮＩ試料を、高悪性度子宮頸部疾患を示すもの（即ちＣＩＮII以上）から識別することができる抗体を同定するために、疾患パネル組織マイクロアレイを作製する。この組織マイクロアレイは、典型的には複数のＣＩＮなし、ＣＩＮＩ、ＣＩＮII、ＣＩＮIII、扁平細胞癌、及び腺癌の試料を含む。標準の免疫組織化学的技術を用いて、高悪性度子宮頸部疾患を示す試料のみ（即ちＣＩＮIIの試料以上）の特異的な陽性染色について、候補ポリドーマのアッセイを行う。陽性結果及び最小限のバックグラウンド染色を生じるポリドーマをさらなる解析用に選択する。

個別の候補モノクローナル抗体を選択するために、陽性染色培養物は個別のクローンとして調製する。個別のクローンを単離する方法は、当分野で周知である。本明細書中で上述した腫瘍及び疾患パネル組織マイクロアレイを用いて、未精製の抗体を含む各クローンからの上清を、ＣＩＮII、ＣＩＮIII、扁平細胞癌、及び腺癌の試料の特異的染色についてアッセイを行う。高悪性度子宮頸部疾患試料（即ちＣＩＮII以上）、他の細胞種（即ち正常及びＣＩＮＩ試料）の最小限の染色、及び僅かなバックグラウンドの陽性染色を示す候補抗体を、精製及びさらなる解析用に選択する。親和性吸着クロマトグラフィーによって抗体を精製する方法は当分野で周知である。

高悪性度子宮頸部疾患試料の最大の特異的染色及び最小限のバックグラウンド、即ち頸部細胞診断試料中の非特異的な染色を示す抗体を同定するために、上記の免疫組織化学に基づいたスクリーニング工程で単離及び精製した候補抗体を、本発明の免疫細胞化学的技術を用いてアッセイする。免疫細胞化学を行う例示的なプロトコルを実施例１及び２に提供する。

具体的には、精製した目的抗体を用いて、統計的に有意な数のＮＩＬ（即ち侵襲性の病変なし）、ＡＳＣＵＳ、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬ又は癌性の患者の頸部細胞診断試料のアッセイを行う。試料を本明細書中に記載の免疫細胞化学によって解析し、特定のバイオマーカーにおける陽性抗体染色に基づいて、高悪性度子宮頸部疾患に対して陽性、陰性、又は確定不能として分類する。各抗体について感度、特異性、陽性適中率、及び陰性適中率を計算する。頸部細胞診断試料中で高悪性度子宮頸部疾患の最大の特異的染色を示し、最小限のバックグラウンド（即ち最大の信号対雑音比）を示す抗体を本発明用に選択する。

適切な抗体の同定は、信号対雑音比の増加及びアッセイの臨床的有用性の増加をもたらす。用いるアッセイ様式及び試料の型は、適切な抗体の選択に重大な要素である。バイオマーカーに向けられた多くの抗体は、免疫細胞化学的様式において細胞診断調製物でも、又は免疫組織化学的様式においてホルマリンで固定したパラフィン包埋の試料でも、望ましい信号対雑音比を生じない。さらに、免疫組織化学的様式において最大の信号対雑音比を生じるバイオマーカー抗体は、免疫細胞化学的アッセイではうまく作動しない可能性がある。例えば、免疫細胞化学的様式において所望の染色レベルを生じる抗体は、免疫組織化学的アッセイにおいては適切な染色レベルを生じない可能性がある（データ示さず）。同様に、免疫組織化学的アッセイにおいて許容される信号対雑音比を生じる抗体は、免疫細胞化学試料の過剰染色を示す可能性がある（データ示さず）。したがって、抗体の選択にはアッセイ様式及び用いる最終的な試料の型の早期考慮が必要である。

細胞診断系のアッセイ（即ち免疫細胞化学）は、組織の構造が免疫細胞化学的様式における染色の解釈を補助するために利用可能でないという範囲では、組織系のアッセイ（即ち免疫組織化学）とは異なる。例えば、Ｃｌａｕｄｉｎ１に向けられた抗体を用いて、軽い異形成又は扁平細胞癌に罹患している患者由来の試料で行った免疫組織化学的アッセイでは、結果により、Ｃｌａｕｄｉｎ１は軽い異形成試料の病変中で発現されたが（即ち薄茶色の染色）、癌の病変中で顕著に過剰発現された（即ち濃茶色の染色）が示された（図１２）。同じＣｌａｕｄｉｎ１抗体を用いて免疫細胞化学的アッセイ様式で得られた結果は確定不能であった（図１３）。異常細胞は、Ｃｌａｕｄｉｎ１抗体を用いて免疫組織化学的アッセイにおいて容易に検出可能であるが、本発明の免疫細胞化学的アッセイにおいてＣｌａｕｄｉｎ１の染色によって得られた結果は解釈がより困難であった。したがって、免疫組織化学的様式において適切なバイオマーカーは免疫細胞化学的アッセイにおいては適切でない可能性があり、したがって、本発明の好ましい実施形態に含まれない。

さらに、細胞内におけるバイオマーカーの位置も、免疫細胞化学的アッセイにおける重要な検討事項である。核、細胞質、又は膜の染色パターンを示すバイオマーカーは形態学的に確認することができ、免疫組織化学的方法に適切である。しかし、細胞質及び膜の染色は、免疫細胞化学的アッセイにおける子宮頸部疾患の重大な形態学的特徴（例えば核対細胞質の比）の同定を困難にする。図１５を参照されたい。対照的に、核中で発現され、核染色パターンを示すバイオマーカーは抗体染色の検出を容易にし、また、形態学的解析も可能にする。図１５を参照されたい。したがって、一部の好ましい実施形態では、核中で選択的に発現されるバイオマーカーのみの本発明の免疫細胞化学的アッセイで用いる。

当業者は、特定の抗体の信号対雑音比を最大にするために、抗体価及び検出の化学の最適化が必要であることを理解されよう。本発明のバイオマーカーに対する特異的結合を最大にし、非特異的結合（又は「バックグラウンド」）を最小にする抗体濃度を決定する。特定の実施形態では、頸部細胞診断調製物中で用いる適切な抗体価は、まず、ホルマリンで固定したパラフィン包埋の正常組織試料及び高悪性度子宮頸部疾患組織試料に対して様々な抗体希釈率を試験することによって決定する。最適な抗体濃度及び検出の化学の条件は、まず、ホルマリンで固定したパラフィン包埋の頸部組織試料について決定する。抗体価及び検出条件を最適化するためのアッセイの設計は標準的であり、十分に当業者の日常的な能力の範囲内にある。固定した組織試料の最適条件が決定された後に、同じ条件下でそれぞれの抗体を頸部細胞診断調製物に用いる。一部の抗体は、細胞診断試料中のバックグラウンド染色を低減する且つ／又は染色の特異性及び感度を増大するために、さらなる最適化を要する。

さらに、当業者は、本発明の方法を実施するために用いる特定の抗体の濃度は、結合時間、バイオマーカータンパク質に対する抗体の特異性のレベル、及び人体試料の調製方法などの要素に応じて変化することを理解されよう。さらに、複数の抗体を用いた場合は、抗体を試料に施用する順序に応じて、即ち、カクテルとして同時に又は個別の抗体試薬として逐次的に施用することに応じて、所要の濃度が影響を受け得る。さらに、所望の信号対雑音比を生じるために、目的バイオマーカーへの抗体結合を可視化するために用いる検出の化学も最適化しなければならない。

他の実施形態では、目的バイオマーカーの発現を核酸レベルで検出する。発現を評価するための核酸に基づいた技術は当分野で周知であり、例えば、人体試料中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを決定することが含まれる。多くの発現検出方法では単離したＲＮＡを用いる。ｍＲＮＡの単離の選択に対抗しない任意のＲＮＡ単離技術を、頸部細胞由来のＲＮＡの精製に利用することができる（例えば、Ausubel et al., ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York)を参照されたい）。さらに、例えば、Chomczynskiの単一ステップのＲＮＡ単離工程（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５号）などの当業者に周知の技術を用いて、多数の組織試料を容易に処理することができる。

用語「プローブ」とは、具体的に意図する標的生体分子、例えばヌクレオチド転写物又はバイオマーカーによってコードされている若しくはそれに対応するタンパク質に選択的に結合する能力を有する任意の分子をいう。プローブは当業者によって合成するか、又は適切な生物学的調製物から誘導することができる。プローブは、標識するために具体的に設計し得る。プローブとして利用することができる分子の例には、それだけには限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が含まれる。

単離したｍＲＮＡは、それだけには限定されないが、サザン若しくはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析及びプローブアレイを含めたハイブリダイゼーション又は増幅アッセイで用いることができる。ｍＲＮＡレベルを検出する一方法は、単離したｍＲＮＡを、検出する遺伝子によってコードされているｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、完全長のｃＤＮＡ、又は、長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０若しくは５００個のヌクレオチドであり、且つストリンジェントな条件下でｍＲＮＡ若しくは本発明のバイオマーカーをコードしているゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチドなどの、その一部分であることができる。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは、議題のバイオマーカーが発現されていることを示す。

一実施形態では、例えば単離したｍＲＮＡをアガロースゲルに流し、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜へと移すことによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定してプローブと接触させる。代替実施形態では、例えばAffymetrix社製遺伝子チップアレイ中で、プローブを固体表面上に固定してｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者は、本発明のバイオマーカーによってコードされているｍＲＮＡのレベルの検出で用いる既知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適応することができる。

試料中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを決定するための代替方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（実験の実施形態はMullis、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記載）、リガーゼ連鎖反応（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193）、自立的配列複製（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム（Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197）、ローリングサークル複製（Lizardi et al.、米国特許第５，８５４，０３３号）又は任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅工程、次いで、当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数しか存在しない場合に、そのような分子の検出に特に有用である。本発明の特定の態様では、バイオマーカーの発現を定量的蛍光発生的ＲＴ−ＰＣＲ（即ちTaqMan（登録商標）システム）によって評価する。このような方法では、典型的には、目的バイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの対を利用する。既知の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの設計方法は当分野で周知である。

ＲＮＡのバイオマーカー発現レベルは、膜ブロット（ノーザン、サザン、ドット等のハイブリダイゼーション解析で用いるものなど）、或いはマイクロウェル、試料管、ゲル、ビーズ又は繊維（若しくは結合した核酸を含む任意の固体担体）を用いて監視し得る。本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第５，７７０，７２２号、第５，８７４，２１９号、第５，７４４，３０５号、第５，６７７，１９５号及び第５，４４５，９３４号を参照されたい。また、バイオマーカーの発現の検出は、溶液中の核酸プローブの使用も含み得る。

本発明の一実施形態では、マイクロアレイを用いてバイオマーカーの発現を検出する。様々な実験間の再現性により、マイクロアレイはこの目的に特によく適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定する一方法を提供する。それぞれのアレイが、固体担体に付着した捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識したＲＮＡ又はＤＮＡがアレイ上の相補的プローブにハイブリダイズし、その後、レーザー走査によって検出される。アレイ上のそれぞれのプローブのハイブリダイゼーション強度を決定し、相対遺伝子発現レベルを表す定量的な値に変換する。本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第６，０４０，１３８号、第５，８００，９９２号及び第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号、及び第６，３４４，３１６号を参照されたい。試料中の多数のＲＮＡの遺伝子発現プロフィールを決定するためには、高密度のオリゴヌクレオチドアレイが特に有用である。

機械的合成方法を用いてこのようなアレイを合成する技術は、例えば、すべての目的においてその全体で本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。平面的なアレイ表面が好ましいが、アレイは事実上任意の形状の表面、又はさらには複数の表面上に作製し得る。アレイは、ビーズ、ゲル、高分子表面、光ファイバーなどの繊維、ガラス若しくは任意の他の適切な基材上のペプチド又は核酸であり得る。それぞれがすべての目的においてその全体で本明細書中に組み込まれている、米国特許第５，７７０，３５８号、第５，７８９，１６２号、第５，７０８，１５３号、第６，０４０，１９３号及び第５，８００，９９２号を参照されたい。アレイは、診断又は包括的な装置の他の操作を可能にする様式でパッケージングし得る。例えば、本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第５，８５６，１７４号及び第５，９２２，５９１号を参照されたい。

一手法では、試料から単離した全ｍＲＮＡを標識したｃＲＮＡに変換し、その後、オリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズさせる。各試料を別々のアレイにハイブリダイズさせる。アレイ上及び試料中に存在する適切な対照を参照することによって、相対転写レベルを計算し得る。

本発明の方法を実施するためのキットをさらに提供する。「キット」とは、本発明のバイオマーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも１つの試薬、例えば、抗体、核酸プローブなどを含む、任意の製造物（例えばパッケージ又は容器）を意図する。キットを、本発明の方法を行うための単位として推進、流通、又は販売し得る。さらに、キットは、キット及びその使用方法を説明するパッケージ挿入物を含み得る。

特定の実施形態では、本発明の免疫細胞化学的方法を実施するためのキットを提供する。このようなキットは、以下の実施例に記述するように、手動及び自動の免疫細胞化学的技術（例えば細胞染色）のどちらにも適合性がある。これらのキットは、目的バイオマーカーに向けられた少なくとも１つの抗体、バイオマーカーへの抗体結合を検出するための化学薬品、対比染色剤、及び、任意選択で、陽性染色細胞の同定を容易にするための青味剤を含む。抗原−抗体結合を検出する任意の化学薬品を本発明の実施で用い得る。一部の実施形態では、検出化学薬品は、二次抗体とコンジュゲートした標識したポリマーを含む。例えば、抗原−抗体結合部位で色素源の堆積を触媒する酵素とコンジュゲートした二次抗体を提供し得る。このような酵素及び抗体結合の検出にそれらを用いる技術は、当分野で周知である。一実施形態では、キットは、ＨＲＰ標識ポリマーとコンジュゲートした二次抗体を含む。コンジュゲートした酵素に適合性のある色素原（例えば、ＨＲＰ標識二次抗体の場合はＤＡＢ）及び非特異的な染色を遮断するための過酸化水素などの溶液をさらに提供し得る。他の実施形態では、マウスモノクローナル抗体に結合するマウスプローブ試薬を用いて、次いで、マウスプローブ試薬に結合する、ＨＲＰとコンジュゲートしたデキストランポリマーを加えることによって、バイオマーカータンパク質への抗体結合を検出する。このような検出試薬は、例えばBiocare Medical社から市販されている。

本発明のキットは、ペルオキシダーゼ遮断剤（例えば過酸化水素）、タンパク質遮断剤（例えば精製カゼイン）、及び対比染色剤（例えばヘマトキシリン）をさらに含み得る。陽性染色細胞の検出を用にするために、キット中に青味剤（例えば水酸化アンモニウム又はＴＢＳ、ｐＨ７．４、Tween-20及びアジ化ナトリウムを含む）をさらに提供し得る。

別の実施形態では、本発明の免疫細胞化学的キットは、少なくとも２つの明確に異なるバイオマーカーの発現を特異的に検出するための、少なくとも２つの試薬、例えば抗体をさらに含む。それぞれの抗体は、個別の試薬として、又は異なる目的バイオマーカーに向けられた抗体すべてを含む抗体カクテルとして、キット中に提供し得る。さらに、キットの試薬の任意のもの又はすべてを、密封容器などの外部環境からそれを保護する容器中で、提供し得る。本発明の方法を実施するための例示的なキットを以下の実施例８に記載する。

活性並びに本発明に従って用いた試薬の正しい使用を確認するために、陽性及び／又は陰性対照をキットに含め得る。対照には、目的バイオマーカーの存在に関して陽性又は陰性のいずれかであることが知られている、組織切片、スライドガラス上に固定した細胞などの試料が含まれ得る。特定の実施形態では、陽性対照はＳｉＨａ細胞を含む。これは、高三倍体であり、ＨＰＶ−１６感染症に関して陽性であり、したがって、高悪性度頸部の病状におけるバイオマーカーの過剰発現に関して陽性対照として役割を果たす、ヒト頸部扁平上皮癌細胞系である。ＳｉＨａ対照細胞は、本発明のキット中に調製したスライド又はスライドの調製に適合性のある細胞懸濁液として提供し得る。対照の設計及び使用は標準的であり、十分に当業者の日常的な能力の範囲内にある。

他の実施形態では、バイオマーカーの過剰発現を核酸レベルで検出することを含む、高悪性度の頸部を同定するためのキットをさらに提供する。このようなキットは、例えば、バイオマーカー核酸若しくはその断片と特異的に結合する少なくとも１つの核酸プローブを含む。特定の実施形態では、キットは、明確に異なるバイオマーカー核酸とハイブリダイズする少なくとも２つの核酸プローブを含む。

一部の実施形態では、本発明の方法は、形態学的特徴を解析する従来の細胞診断技術と組み合わせて用いることができる。例えば、従来方法からのすべての形態学的情報が保存されるように、本発明の免疫細胞化学的な技術を従来のＰａｐ染色と組み合わせることができる。このようにして、バイオマーカーの検出によりＰａｐスメア試験の高い偽陰性率を下げることができ、また、集団自動スクリーニングが容易になり得る。特定の実施形態では、本明細書中に上記で開示した免疫細胞化学的方法を、実施例６〜７で以下に記述するように、単一の方法で従来のＰａｐ染色と組み合わせる。免疫細胞化学及びＰａｐ染色の複合方法により、高悪性度子宮頸部疾患において選択的に過剰発現されるバイオマーカー及び細胞形態学をどちらも単一の試料（例えば頸部細胞単層を含む顕微鏡スライド）中で可視化することが可能となる。免疫細胞化学及びＰａｐ染色の複合方法は、特に従来のＰａｐ試験によって正常、ＬＳＩＬ、又はＡＳＣＵＳと誤分類された症例において、高悪性度子宮頸部疾患のより正確な同定及び診断を可能にし得る。バイオマーカーの過剰発現及び細胞形態学をどちらも単一の方法内で解析することは、子宮頸癌の一次スクリーニング方法としてＰａｐスメアに置き換わることができる可能性がある。

当業者は、免疫細胞化学出力（例えば色素原の染色）とＰａｐ染色との間で十分な対比が得られるように、この複合方法の染色パラメータ（例えば、インキュベーション時間、洗浄条件、色素原／染色剤の濃度など）を最適化する必要があることを理解されよう。染色パラメータを最適化するためのアッセイの設計は標準的であり、十分に当業者の日常的な能力の範囲内にある。また、免疫細胞化学及びＰａｐ染色の複合方法を行うためのキットも本発明によって包含される。このようなキットは、本明細書中に上述するように、免疫細胞化学に必要な試薬、並びに従来のＰａｐ染色用の試薬、特にEA50及びOrange Gを含む。

当業者は、本発明の方法の任意の若しくはすべてのステップを、人手によって実行する、又は自動的な様式で行うことができることを理解されよう。したがって、人体試料の調製、試料の染色、及びバイオマーカーの発現の検出のステップは自動であり得る。

以下の実施例は例示目的で提供し、限定するものではない。

免疫細胞化学を用いたバイオマーカーの過剰発現の検出
スライドの調製及び前処理
患者の頸部試料を採取し、SurePath（商標）採取バイアル（TriPath Imaging, Inc.社製）に入れた。頸部細胞を液体培地から採取し、PrepStain（商標）スライドプロセッサーシステム（TriPath Imaging, Inc.社製）を用いてスライドガラス上に薄層として堆積させた。調製したスライドをすぐに前処理緩衝液（１％のＲＡＭ）に移し、４５分間９５℃で加熱した。スライドを室温まで冷却し、ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水、tris buffered saline）で３回すすいだ（１回のすすぎあたり２分間）。

手動免疫細胞化学
非特異的なバックグラウンド染色を防ぐために、染色手順中にスライドを乾燥させない。さらに、非特異的な染色を遮断するために、過酸化水素をスライドに５分間施用し、次いでＴＢＳですすいだ。ＭＣＭ６に向けられた抗体をスライドに１時間室温で施用した。ＭＣＭ６抗体とともにインキュベーションを行ったのち、スライドをＴＢＳで３回、１回の洗浄あたり２分間洗浄した。Dako社製Envision+ＨＲＰ標識ポリマー二次抗体をスライドに３０分間室温で施用し、次いでＴＢＳですすいだ。ＨＲＰ基質色素原ＤＡＢを１０分間施用し、その後、スライドを５分間水ですすいだ。それぞれのスライドでヘマトキシリンを用いて対比染色を行い、その後、透明になるまで水ですすいだ。対比染色ののち、スライドを水酸化アンモニウムに１０秒間浸し、その後、水で１分間すすいだ。

スライドを９５％のエタノールに１分間浸し、その後無水エタノールにさらに１分間浸すことによって、試料を脱水した。キシレンで３回、１回のすすぎあたり１分間すすぐことによって、スライドを清澄にした。その後、永久封入剤を用いてスライドにカバーガラスを乗せ、３５℃で乾燥するまでインキュベーションを行った。明視野顕微鏡を用いて陽性染色細胞を可視化した。

自動免疫細胞化学
Dako社製Autostainer Universal Staining Systemを製造者の指示書に従ってプログラムし、上述の手動免疫細胞化学に必要な染色試薬及び対比染色試薬を機械に載せた。調製した前処理したスライドをAutostainerに載せ、プログラムを実行した。実行の終わりにスライドを取り出し、水で５分間すすいだ。スライドを脱水し、清澄にし、カバーガラスを乗せ、上述のように解析した。

臨床的試料中のバイオマーカーの検出
様々な診断を示している約１８０個の患者の頸部細胞診断試料を採取した。これらの患者において癌細胞若しくは高悪性度疾患を示す病変が存在すること又は存在しないことは、膣頸管検査によって事前に確認した。以下の表は、この研究で解析したそれぞれの診断群内の試料数、及び膣頸管検査の所見の説明（例えば高悪性度病変が存在すること又は存在しないこと）を示す。

試料は、高悪性度子宮頸部疾患を同定するために免疫細胞化学的方法によって解析した。６個の目的バイオマーカーの過剰発現を検出するために抗体、即ちＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ｐ２１^ｗａｆ１、サイクリンＥ、及びＴｏｐｏ２Ａを用いた。アッセイ対照にはＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ｐ２１^ｗａｆ１、サイクリンＥ、Ｔｏｐｏ２Ａが含まれ、マウスＩｇＧ陰性をＳｉＨａ細胞系で実行した。また、試料を従来のＰａｐ染色技術によっても解析した。

スライドの調製
各試料を保管庫から取り出し、室温にした。６ｍｌのTriPath社製CytoRich（登録商標）保存料を各バイアルに加え、バイアルをボルテックス攪拌した。試料をTriPath社製PrepMate（登録商標）自動プロセッサーで処理し、バイアル中に残った流体をすべて遠心管に移した。試料を２分間２００×ｇで遠心分離し、上清を吸引した。その後、試料を１０分間８００×ｇで遠心分離し、上清を傾瀉した。試料管をTriPath社製PrepStain（登録商標）システムに載せ、システムソフトウェア（バージョン１．１；Transfer Only）を実行した。患者の試料それぞれについて８個のスライドを調製し、Ｐａｐ染色及び免疫細胞化学的方法で用いる前に、９５％のエタノール中で少なくとも２４時間且つ２週間未満、保存した。

Ｐａｐ染色方法
調製したスライドを９５％のエタノールで３０秒間インキュベーションし、その後、水でさらに３０秒間すすいだ。ヘマトキシリンをスライドに６分間施用した。スライドを水で１分間、酸性水で２秒間、及び水で３０秒間すすいだ。青味剤（水酸化アンモニウム）を３０秒間施用し、スライドをまず水で、その後９５％のエタノールで、それぞれ３０秒間ずつすすいだ。EA 50及びOrange G（Autocyte（登録商標））を６分間施用した。スライドを９５％のエタノールで２回、１００％のエタノールで３回、及びキシレンで３回、１回のすすぎあたり３０秒間すすいだ。

その後、Acrytol封入剤を用いてスライドにカバーガラスを乗せ、３５℃で乾燥するまでインキュベーションを行った。試料は病理学者が明視野顕微鏡を用いることによって検査した。

免疫細胞化学的方法
調製したスライドを９５％のエタノールから取り出し、脱イオン水で約１分間すすいだ。スライドを９５℃に予熱した１×Target Retrieval SolutionｐＨ６．０（DAKO社製S1699）／ｄＨ２Ｏ浴に入れ、スチーマーに２５分間入れた。試料を２０分間室温で冷却させ、脱イオン水でよくすすぎ、ＴＢＳに入れた。本質的に実施例１「自動免疫細胞化学」に上述したように、前処理したスライドをバイオマーカーの発現について染色した。ＭＣＭ２（１：２００）、ＭＣＭ７（１：２５）、ｐ２１ｗａｆ１（１：１００）、及びサイルシンＥ（１：１００）に向けられた市販の抗体を指示したように希釈し、バイオマーカーの発現を検出するために用いた。実施例４に記載のポリドーマスクリーニングによって同定した、精製したＭＣＭ６抗体を１：６０００の希釈率で用いた。

スライドの解釈
それぞれのスライドは細胞検査技師及び病理学者がスクリーニング並びに検査した。試料は、以下のパラメータに従って、高悪性度子宮頸部疾患に対して陽性、陰性、又は確定不能として分類した：
・非細胞性の人工産物及び茶色に染色された炎症細胞（ＤＡＢ）は無視した。
・成熟した正常に見える扁平細胞及び正常に見える腺細胞は、ＤＡＢで染色した場合に陽性として計数しなかった。
・扁平異形成細胞は異常細胞とともに陽性とみなした。
・１．５未満の染色強度は陰性とみなした。
・相異した結果はスライドの検査を合わせることによって解決した。

免疫細胞化学的結果を、膣頸管検査によって事前に得た結果と比較した。その後、それぞれのスライドに真陽性（ＴＰ）、真陰性（ＴＮ）、偽陽性（ＦＰ）、偽陰性（ＦＮ）、又は確定不能の最終結果を与えた。各バイオマーカーの感度、特異性、陽性適中率、及び陰性適中率を計算した。

結果
各バイオマーカーの結果を以下に要約する。

本発明の免疫細胞化学的方法を用いて、約１８０件の症例を、高悪性度子宮頸部疾患の存在について解析した。その数のうち、ＭＣＭバイオマーカーが４％〜７％の範囲の確定不能率を生じた。さらに、ＭＣＭ２は９５％の特異性及び８７％の感度を示した。ＭＣＭ６及びＭＣＭ７バイオマーカーは、匹敵する９５％及び９３％の感度の結果をそれぞれ生じた。これら２つのバイオマーカーの特異性は８７％〜８９％の範囲であった。

サイクリンＥが最も高い特異性値９８％を生じた。確定不能率は６％であったが、感度は７１％しかなかった。ｐ２１^ｗａｆ１の確定不能率は試験したすべてのマーカーの中で最も高く、１３％であった。ｐ２１^ｗａｆ１は８４％の感度及び８８％の特異性を生じた。バイオマーカーＴｏｐｏ２Ａでは９６％の特異性が観察された。Ｔｏｐｏ２Ａの確定不能率１１％であり、感度は８９％であった。

抗体カクテルを用いた臨床的試料中のバイオマーカーの検出
高悪性度子宮頸部疾患を同定するために、約１８０個の膣頸管検査で確認した頸部細胞診断試料を免疫細胞化学的方法によって解析した。各試料を複数の目的バイオマーカーの発現について解析した。具体的には、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ｐ２１ｗａｆ１、サイクリンＥ、及びＴｏｐｏ２Ａに向けられた抗体の様々な組合せを、高悪性度子宮頸部疾患を検出するその能力について解析した。これらの試料は、実施例２に記載の免疫細胞化学的方法及びスライド解釈指針を用いて、複数の目的バイオマーカーの発現について評価した。

結果
各バイオマーカーの結果を以下に要約する。

上述のように、２８種の抗体カクテルについてデータを蓄積した。バイオマーカーの発現は、２、３、４、５個、又はさらには６個の目的バイオマーカーすべてに向けられた抗体を含むカクテルを用いて解析した。２８種のうち２１種の抗体カクテルが９２％を超える感度を示した。２８種のうち４種のカクテルが９０％を超える特異性を生じ、最も低い値は７８％であった。最も高い値は、ＭＣＭ２、ＴＯＰＯIIＡ及びサイクリンＥの組合せで得られた。このカクテルは、９３％の感度及び９２％の特異性を与えた。少なくとも３つのバイオマーカーの組合せにより９０％を超える感度が与えられるはずであると考えられる。アッセイの調節により、アッセイの感度及び特異性がさらに増加することが理解されよう。

抗体カクテルを用いたバイオマーカーの発現の検出
サイクリンＥ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ｐ２１ｗａｆ１、及びＴＯＰＯ２ａに向けられた抗体の様々な組合せを用いて抗体カクテルを調製した。各カクテルの組成を以下の表に記載する。

ＨＳＩＬの症例（ＨＳＩＬプール）及びＮＩＬの症例（ＮＩＬプール）をプールすることによって、２組の頸部細胞診断標本を調製した。その後、それぞれの抗体カクテルをＨＳＩＬプール及びＮＩＬプールで試験した。また、バイオマーカー抗体も対照として個別に試験した。実施例２に記載のようにスライドの調製及び自動免疫細胞化学を実施した。

スライドは細胞検査技師及び病理学者がスクリーニング並びに検査した。高悪性度子宮頸部疾患を示す細胞の特異的染色、腺細胞の染色、細菌の交差反応性、及び細胞染色の位置は、すべてスクリーニング工程の間に記録した変数である。

免疫細胞化学的結果により、単一のバイオマーカーの検出で得られた結果と比較した場合に、バイオマーカー抗体カクテルで、ＨＳＩＬプールにおいて高悪性度子宮頸部疾患を示す細胞の染色の増加が示された。さらに、カクテル中の抗体数を２から３、４又は６に増加した場合に、バックグラウンドに有意な増加はない。さらに、ＮＩＬプールで試験した場合に、様々な抗体カクテルはバックグラウンド染色の増加を示さなかった。

免疫細胞化学を用いた頸部試料中のバイオマーカーの過剰発現の検出
スライドの調製及び前処理
患者の頸部試料を実施例１に上述したように採取した。頸部細胞単層を含むスライドは、AutoPrep（登録商標）システムによって、「prepのみ」モードを用いて調製した。調製したスライドはすぐに、最短１時間且つ最長７２時間の間１×SureSlide（登録商標）前処理緩衝液（脱イオン水Ｈ_２Ｏ中の０．５％のラウレス−１３−カルボン酸ナトリウム（Sandopan LS））中にに入れた。前処理したスライドを、予熱なしで９５℃のスチーマーに４５分間入れた。スライドをスチーマーから取り出し、室温で２０分間冷却し、その後、脱イオン水でよくすすいだ。スライドをＴＢＳＴ（ＴＢＳ／Tween-20）で２回、１回のすすぎあたり２分間すすいだ。スライドを軽くたたいて過剰の緩衝液を除去し湿気のあるチャンバに入れた。下に記述するように、スライドを手動又は自動の免疫細胞化学に供した。

手動免疫細胞化学
２００μｌのペルオキシダーゼ遮断剤（０．０３％の過酸化水素）を、それぞれのスライドに、細胞堆積領域を覆うように５分間施用した。その後、スライドをＴＢＳＴで３回、１回のすすぎあたり２分間すすいだ。過剰の緩衝液を取り除き、スライドを湿気のあるチャンバに入れた。２００μｌのタンパク質遮断剤（精製カゼイン及び界面活性剤）をそれぞれのスライドに施用し、５分間インキュベーションを行った。過剰のタンパク質遮断剤を取り除いたあと、スライドを湿気のあるチャンバに入れた。

ＭＣＭ２に向けられた２つのマウス抗ヒト抗体（０．３９ｍｇ／ｍＬのクローン２７Ｃ５．６、１：８００の希釈率；０．９１８ｍｇ／ｍＬのクローン２６Ｈ６．１９、１：１０，０００の希釈率）及び３つ目のＴｏｐｏ２Ａに特異的なマウス抗ヒト抗体（１００μｇ／ｍＬのクローンＳＷＴ３Ｄ１、１：１０，０００の希釈率）を含む２００μｌの一次モノクローナル抗体カクテルを、それぞれのスライドに、細胞堆積領域を完全に覆うように施用した。スライドを３０分間インキュベーションし、その後、ＴＢＳＴで３回、１回のすすぎあたり２分間すすいだ。過剰の緩衝液を取り除き、スライドを湿気のあるチャンバに戻した。マウスモノクローナル抗体に結合する２００μｌのマウスプローブ試薬を上記のように２０分間施用した。スライドをＴＢＳＴで３回、１回のすすぎあたり２分間すすいだ。過剰の緩衝液を取り除き、スライドを湿気のあるチャンバに再度入れた。

ＨＲＰとコンジュゲートしたデキストランポリマー及びマウスプローブ試薬に結合する二次ヤギ抗マウス抗体を含む２００μｌのポリマー試薬を上記のように２０分間施用し、その後、スライドをＴＢＳＴで３回、１回のすすぎあたり２分間すすいだ。過剰の緩衝液を取り除いたあと、スライドを湿気のあるチャンバに戻した。２００μｌのＤＡＢ基質−クロムゲン溶液を上記のように５分間施用した。スライドを脱イオン水で５分間すすぎ、その後、ＴＢＳＴで２分間、緩衝液を１回交換してすすいだ。過剰の緩衝液を取り除き、前述と同様にスライドを湿気のあるチャンバに入れた。２００μｌのヘマトキシリンを１分間加え、次いで脱イオン水で３回、１回のすすぎあたり２分間すすいだ。過剰の脱イオン水を取り除き、スライドを湿気のあるチャンバに入れた。２００μｌの青味剤（即ち、ＴＢＳ、tween-20でｐＨ７．４及びアジ化ナトリウム）をそれぞれのスライドに１分間施用した。その後、スライドを、ＴＢＳＴを１回交換して、且つ脱イオン水を１回交換して、２分間ずつすすいだ。その後、スライドを脱水し、清澄にし、カバーガラスを乗せ、実施例１及び２に記載のように解析した。

自動免疫細胞化学
自動染色機は、以下の一連のステップを含むように製造者の指示書に従ってプログラミングした：
ａ．緩衝液を用いた２回のすすぎ（ＴＢＳＴ）
ｂ．５分間のペルオキシダーゼ遮断
ｃ．緩衝液を用いた２回のすすぎ（ＴＢＳＴ）
ｄ．５分間のタンパク質遮断、ブロウ（blow）
ｅ．一次抗体カクテルを用いた３０分間のインキュベーション
ｆ．緩衝液を用いた３回のすすぎ（ＴＢＳＴ）
ｇ．マウスプローブ試薬を２０分間
ｈ．緩衝液を用いた３回のすすぎ（ＴＢＳＴ）
ｉ．ポリマー−ＨＲＰを２０分間
ｊ．緩衝液を用いた３回のすすぎ（ＴＢＳＴ）
ｋ．ＤＡＢ（１ｍｌの緩衝液に１滴のクロマゲン）を５分間
ｌ．Ｈ_２Ｏを用いた３回のすすぎ
ｍ．緩衝液を用いた２回のすすぎ（ＴＢＳＴ）
ｎ．メイヤー（Mayer's）ヘマトキシリンを１分間
ｏ．Ｈ_２Ｏを用いた３回のすすぎ
ｐ．青味剤を１分間
ｑ．緩衝液を用いた１回のすすぎ（ＴＢＳＴ）
ｒ．Ｈ_２Ｏを用いた１回のすすぎ

必要な染色試薬及び対比染色試薬を機械に載せた。調製した前処理したスライドを自動染色機に載せ、上記プログラムを実行した。実行の終わりにスライドを取り出し、水道水で手短にすすいだ。スライドを脱水し、清澄にし、カバーガラスを乗せ、実施例１及び２に記載のように解析した。

試験した４５件のＮＩＬの症例のうち、Ｐａｐ染色したスライドの検査により１件のＡＳＣ−ＵＳの症例が明らかとなった。ＮＩＬ試料の免疫細胞化学（ＩＣＣ、immunocytochemistry）の結果は陰性であり、１件の症例が評価に不十分であるとみなされた。ＨＳＩＬの症例に関しては、４５件の症例のそれぞれがＰａｐ染色したスライドの検査に基づいて高悪性度子宮頸部疾患であると確認された。さらに、４５件のＨＳＩＬの症例はＩＣＣアッセイにおいても陽性であった。陰性対照、即ちＳｉＨａ細胞系対照に施用したユニバーサルマウスＩｇＧ対照は、ＩＣＣアッセイにおいて陰性結果を生じた。陽性対照、即ちＳｉＨａ細胞系対照に施用した一次抗体カクテルは、ＩＣＣアッセイにおいて陽性結果を生じた。

免疫細胞化学及びＰａｐ染色の複合手順
患者の頸部試料を実施例１に上述したように採取した。頸部細胞単層を含むスライドを調製し、実施例５で指示したように前処理した。前処理したそれぞれのスライドを自動免疫細胞化学及びＰａｐ染色に供し、これにより、バイオマーカーの過剰発現及び細胞形態学をどちらも単一のスライドで可視化することが可能となった。

自動免疫細胞化学
実施例５に上述したように、それぞれのスライドで自動免疫細胞化学を行った。染色プログラムの終わりにスライドを自動染色機から取り出し、水道水で３〜５分間すすいだ。その後、下に記述するように従来のＰａｐ染色方法に従ってそれぞれのスライドを染色した。

Ｐａｐ染色方法
自動免疫細胞化学ののち、Ｐａｐ染色を用いてそれぞれのスライドをさらに染色した。まず、スライドを９５％のエタノールで３０秒間すすいだ。EA50及びOrange Gをスライドの半数に３分間施用し、残りのスライドに６分間施用した。その後、すべてのスライドを９５％のエタノールで２回、１００％のエタノールで３回、及びキシレンで３回、１回のすすぎあたり３０秒間すすいだ。永久封入剤を用いてスライドにカバーガラスを乗せ、実施例１及び２に上述のように解析した。

結果
５件のＮＩＬ及び５件のＨＳＩＬの症例のパネルのそれぞれを、Ｐａｐ染色方法においてEA50及びOrange Gを用いた３分間又は６分間の染色に供した。結果では、３分間及び６分間の染色プロトコルの間に最小限の差異しか示されなかった。３分間のＰａｐ染色に供したスライドは、わずかに弱い染色を示した。さらに、Ｐａｐ対比染色ではＩＣＣ陽性染色ＨＳＩＬ細胞が容易に観察された。

免疫細胞化学及びＰａｐ染色の複合手順（Ｐａｐ染色の最適化）
免疫細胞化学的方法の色素原（即ちＤＡＢ）染色とＰａｐ染色のレベルとの間のを最大限にするために、実施例６に概要を示した免疫細胞化学及びＰａｐ染色の複合手順を改変してＰａｐ染色のパラメータを最適化した。

スライドを調製し、前処理し、実施例６に上述したように自動免疫細胞化学に供した。その後、以下の改変を含む本質的に実施例６に記載の従来のＰａｐ染色を用いて、スライドを染色した。ハリス（Harris）配合物及びマイヤーズ（Myers）配合物を用いてヘマトキシリンを試験した。EA／Orange Gを３分間又は６分間施用した。さらに、EA／Orange Gを加えたあとに９５％のエタノールを３回交換した。

免疫細胞化学的染色に基づいてスライドを陽性、陰性、又は不十分と決定した。さらに、受信する（incoming）Ｐａｐ診断と比較するために、スライドを形態学的に評価した。

ＩＣＣ及びＰａｐ染色の複合手順により、形態学的解析及びバイオマーカーの過剰発現の評価がどちらも可能となった。本方法をさらに最適化するためにはさらなる実験が必要であろう。

頸部試料中のバイオマーカーの過剰発現を検出するための免疫細胞化学的キット
Ｉ．手順の原理
イムノサイトケニカル試験キットは、ルーチン的に調製した単層頸部標本の３ステップの免疫細胞化学的染色手順を完了するために必要な試薬を含む。モノクローナル抗体カクテルとともにインキュベーションを行ったのち、このキットでは、デキストラン技術に基づいたすぐに使用できる可視化試薬を用いる。この試薬は、二次ヤギ抗マウス抗体分子及びデキストランポリマー主鎖に連結した西洋ワサビペルオキシダーゼ分子からなる。続けて加えた色素原の酵素変換の結果、抗原（又は複数の抗原）の部位において可視反応生成物の形成がもたらされる。その後、ヘマトキシリンを用いて標本の対比染色を行い、青味剤を施用し、スライドにカバーガラスを乗せた。結果は光学顕微鏡を用いて解釈した。目的細胞が茶色に染色された場合に、頸部の高悪性度を示す陽性結果が得られる。

自動画像処理装置を用いて潜在的に陽性な細胞のギャラリーを作成し得る。その後、ギャラリーを検査して陽性結果又は陰性結果を決定することができる。

免疫細胞化学的試験のキットは、手動及び自動の染色のどちらにも適用可能である。

II．提供する試薬
調製物１個あたり２００μＬのすぐに使用できるマウスモノクローナルカクテルを用いて７５個の単層調製物に十分な以下の材料を、免疫細胞化学的試験のキットに含めた：

免疫細胞化学的方法を行うために必要であるがキット中で提供しなかった材料及び試薬は、以下のとおりである：
・吸収性拭取り材
・ＳｉＨａ細胞系（TriPath Imaging, Inc.社製）
・脱イオン水又は蒸留水
・エタノール（９５％及び１００％）
・ガラス製カバーガラス
・手袋
・湿気のあるチャンバ
・光学顕微鏡（１０×、２０×、４０×対物）
・封入剤
・ピペット及びピペットチップ（２０μｌ、２００μｌ及び１０００μｌの体積を届けることができる）
・ SureSlide調製緩衝液（TriPath Imaging, Inc.社製）−前処理緩衝液（脱イオン水Ｈ_２Ｏ中の０．５％のラウレス−１３−カルボン酸ナトリウム（Sandopan LS））
・染色用のビン又は槽
・タイマー（１〜６０分間隔が可能）
・トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）
・ Tween 20
・ユニバーサルマウスＩｇＧ陰性対照
・ボルテックス器
・キシレン又はキシレン代用物
・スチーマー／水浴

III．使用説明書
標本の調製
頸部試料の調製には以下のステップに従った：
・残存標本からのスライドの調製には、SurePath PrepStainシステム（商標）の操作指示書を参考にされたい。
・ SurePath（商標）バイアル中で８ｍＬのSurePath（商標）保存液を残存試料（約２ｍＬ）に加える。希釈された試料を、標準技術を用いてPrepMate（商標）で、且つＧＹＮバージョン１．１、スライドの調製を用いてPrepStain（商標）で処理する。
・調製したスライドをすぐに前処理緩衝液中に、免疫染色の前に最短１時間且つ最長７２時間入れる。
・最適なキットの性能のために、エピトープの回収を用いなければならない。この手順は、調製したスライドを前処理緩衝液中に最短１時間、室温浸すこと、次いでスライドを前処理緩衝液中で９５℃まで加熱することを含む。スライドを９５℃で１５分間保ち、室温で２０分間冷却させた。所要の温度を維持できるキャリブレーションした水浴又は野菜スチーマーの使用が推奨される。標高の高い場所に位置する研究所では、所要の温度を維持するための最良の方法を決定すべきである。染色手順は、エピトープの回収及び冷却のあとすぐに開始する。記載した手順からの逸脱は結果に影響を与え得る。

試薬の調製
染色の前に以下の試薬を調製した：
０．０５％のTween 20を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ、Tris Buffered Saline with 0.05% Tween 20）
・製造者の明細事項に従ってＴＢＳを調製する。
・最終濃度０．０５％までTween 20を加える。
・１週間以内に用いる場合は室温で保存する。
・未使用の溶液は２〜８℃で３カ月間保存し得る。
・溶液は無色透明である。希釈した溶液の外見が濁っている場合は廃棄する。

基質−色素原溶液（ＤＡＢ）（５個のスライドに十分な体積）
・１ｍＬのＤＡＢ緩衝基質を試験管に移す。
・１滴（２０〜３０ｕＬ）のＤＡＢ＋色素原を加える。よく混合し、ピペットを用いてスライドに施用する。
・基質−色素原溶液は毎日新鮮なものを調製する。
・溶液中に沈殿物が発生する場合はどれも染色の品質に影響を与えない。

IV．染色プロトコル（室温、２０〜２５℃で行った）
頸部細胞診断試料の免疫染色のために以下のステップを行った：
染色手順の注記
・使用者はこれらの指示を注意して読み、使用前にすべての構成成分を熟知すべきである。
・すべての試薬は免疫染色前に室温（２０〜２５℃）に平衡化した。すべてのインキュベーションは室温で行った。
・染色手順中にスライドを乾燥させない。乾燥した細胞調製物は非特異的な染色の増加を示し得る。気流に触れるスライドを覆う。長期のインキュベーションには、スライドを湿気のあるチャンバに入れるべきである。

エピトープの回収
・調製したスライドを前処理緩衝液中に最短１時間且つ最長７２時間入れる。
・１５分間９５℃でインキュベーションを行う。
・コプリンビン全体をスライドとともに水浴又はスチーマーから取り出し、スライドを緩衝液中で２０分間冷却させる。
・スライドをｄｉＨ２Ｏですすぎ、ＴＢＳＴ浴に移す。

ペルオキシダーゼ遮断
・軽くたたいて過剰の緩衝液を除去する。
・スライドを準備した湿性チャンバ（水で湿らせたペーパータオル又はガーゼで満たした）に入れる。
・２００μＬのペルオキシダーゼ遮断剤を施用して細胞堆積領域を覆う。
・５分間（±１分）インキュベーションを行う。
・スライドをＴＢＳＴで、３回交換して、２分間ずつすすぐ。

タンパク質遮断
・軽くたたいて過剰の緩衝液を除去する。
・スライドを準備した湿性チャンバ（水で湿らせたペーパータオル又はガーゼで満たした）に入れる。
・２００μＬのタンパク質遮断を施用して細胞堆積領域を完全に覆う。
・５分間（±１分）インキュベーションを行う。
・スライドをすすがない。

一次抗体カクテル
・軽くたたいて過剰のタンパク質遮断を除去する。
・スライドを準備した湿性チャンバ（水で湿らせたペーパータオル又はガーゼで満たした）に入れる。
・２００μＬの一次抗体カクテルを施用する（細胞堆積領域を完全に覆うため。
・３０分間室温でインキュベーションを行う。
・洗浄ボトルを用いてそれぞれのスライドを個別にＴＢＳＴですすぐ（流れを直接細胞堆積領域上に集中させない）。スライドをスライドラックに乗せる。
・スライドをＴＢＳＴで、３回交換して、２分間ずつすすぐ。

検出の化学
・軽くたたいて過剰の緩衝液を除去する。
・スライドを準備した湿性チャンバ（水で湿らせたペーパータオル又はガーゼで満たした）に入れる。
・２００μＬのマウスプローブを施用して細胞堆積領域を完全に覆う。
・２０分間（±１分）インキュベーションを行う。
・スライドをＴＢＳＴで、３回交換して、２分間ずつすすぐ。
・軽くたたいて過剰の緩衝液を除去する。
・スライドを準備した湿性チャンバ（水で湿らせたペーパータオル又はガーゼで満たした）に入れる。
・２００μＬのポリマーを施用して細胞堆積領域を覆う。
・２０分間（±１分）インキュベーションを行う。
・スライドをＴＢＳＴ浴で、３回交換して、２分間ずつすすぐ。
・軽くたたいて過剰の緩衝液を除去する。
・スライドを準備した湿性チャンバ（水で湿らせたペーパータオル又はガーゼで満たした）に入れる。
・２００μＬのＤＡＢ使用液を施用して細胞堆積領域を完全に覆う。
・５分間（±１分）インキュベーションを行う。
・スライドを５分間、ｄｉＨ２Ｏで５分間すすぐ。

対比染色
・スライドをＴＢＳＴで、１回交換して２分間すすぐ。
・スライドを準備した湿性チャンバ（水で湿らせたペーパータオル又はガーゼで満たした）に入れる。
・２００μＬのヘマトキシリンを施用して細胞堆積領域を完全に覆う。
・１分間（±１０秒）インキュベーションを行う。
・スライドを３分間、ランニングＨ２Ｏですすぐ。
・スライドを準備した湿性チャンバ（水で湿らせたペーパータオル又はガーゼで満たした）に入れる。
・２００μＬの青味剤を１分間（±１０秒）施用することによってスライドを青色にする。
・ランニング水を用いた１分間のすすぎを繰り返す。

封入
・スライドを９５％のエタノールに浸す（１分間又は２５回漬ける）。
・スライドを無水アルコールに浸す（４回交換、１分間ずつ又は２５回ずつ漬ける）。
・キシレンで清澄にする（３回交換、１分間ずつ又は２５回ずつ漬ける）。
・ガラス製カバーガラスを用いて、非水性の永久封入剤でスライドガラスを覆う。

Ｖ．品質管理
本実施例中に記載の免疫細胞化学的キットを用いる際に以下の品質管理上の問題点を考慮した：

結果のばらつきは、多くの場合標本の取扱いの違い及び試験手順の変更に由来する。さらなる情報には、ＮＣＣＬＳの免疫細胞化学の品質保証に提案された品質管理指針を参考にされたい。

対照細胞系はTriPath Imaging, Inc.社から入手可能である。各バイアルは、臨床標本と同様に処理する子宮頸癌細胞系を含む。それぞれの染色手順において２つのスライドを染色すべきである。対照スライド細胞系の評価は染色の実行の妥当性を示す。

VI．染色の解釈
対照スライド：
すべての試薬が適切に機能したかどうかを確認するために、最初に免疫細胞化学的試験のキットを用いて染色した対照スライドを検査した。細胞核中に茶色の（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩、ＤＡＢ）反応生成物が存在することが、陽性反応の指標であった。

患者標本：
スライドの評価は、細胞検査技師又は病理学者が光学顕微鏡を用いることによって行った。細胞は、光学顕微鏡から導いた画像ギャラリー中に保存して手動で又は電子的に検査した。

様々な診断を示している約１６１０個の頸部試料を採取した。以下の表は、従来のＰａｐ染色又は生検によって決定した、それぞれの診断群内で免疫細胞化学的キットを用いて解析した試料数を示す。

スライドのスコアガイド
本実施例中に記載の免疫細胞化学的方法によって解析したすべてのスライドのスコア決定は、以下の手順に従った：

ステップ１：妥当な標本であるか？
The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology (second edition)には、「妥当な液体系調製物は、推定で最低少なくとも５０００個のよく可視化された／よく保存された扁平細胞を有するべきである」と記載されている。すべてのスライドを評価する際に、この同じ基準を適用した。しかし、ルーチンＰａｐ調製物と同様、陽性の分子反応を示す異常細胞を有する任意の標本は、本質的に、評価に十分であった。このステップへの答えが「はい」である場合は、細胞検査技師は次のステップに進んだ。答えが「いいえ」であった場合、結果は評価に不十分であった。

ステップ２：中程度から強く茶色の核染色が上皮細胞中に存在するか？
本実施例の免疫細胞化学的キット（例えばSureDetect検出化学キット）で用いた検出用化学薬品は、≧ＣＩＮ２に関連する異形成核を茶色のクロマゲン、ＤＡＢで染色する。このステップで「はい」と答えるために、試料を、容易に可視化される茶色染色について解析した。茶色が僅かな量のみ、即ち「紅潮」のみ見られる場合は、これは陽性であると保証するには不十分であった。茶色の核染色が見られなかった場合は、陰性の試験結果であるとみなされた。妥当な茶色染色が存在した場合は、解析を次のステップへと進めた。

ステップ３：これは茶色の核染色を有する扁平（又は腺性）細胞であり、細胞≧ＡＳＣ（ＡＧＣ）であるか？
The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology (2nd Ed.)（「ＴＢＳ」）に概要を示した一部の形態学的基準を用いて、茶色の核を含む扁平細胞が≧ＡＳＣ（非定型扁平細胞l）であるかどうかを決定した。これには、ＡＳＣ−ＵＳ、ＡＳＣ−Ｈ、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬ、及び癌が含まれるであろう。細胞の外見が腺性である場合は、細胞が≧ＡＧＣ（非定型腺細胞）であるかを決定するためのＴＢＳの基準が適用された。これには、子宮頸管内ＡＧＣ、子宮内膜ＡＧＣ、ＡＩＳ、及び腺癌が含まれるであろう。細胞が≧ＡＳＣ（又は≧ＡＧＣ）であるとみなされた場合、これは陽性の試験結果をもたらすであろう。問題の細胞がＮＩＬＭ（上皮内病変又は悪性疾患に関して陰性、negative for intraepithelial lesion or malignancy）で一貫している場合は、これは陰性の試験結果となるであろう。

VII．結果
従来のＰａｐ染色方法によって最初はＮＩＬと分類された２７件の症例が、免疫細胞化学試験において陽性に染色された。これら２７件の症例のうち、有資格の病理学者による検査によって７件がＨＳＩＬ、１０件がＡＳＣ−Ｈ、３件がＡＳＣ−ＵＳ、３件が確定不能と分類された。７件のＨＳＩＬの症例は高悪性度子宮頸部疾患とみなされる。これら２７件の症例はイモサイトケミストリーアッセイによって陽性免疫染色と同定され、Ｐａｐ染色によってＮＩＬと誤分類された患者を同定するための、本明細書中に開示した方法の価値が示された。

生検の結果はすべてのＮＩＬ標本では得られなかった。本実施例中に記載した免疫細胞化学的方法の感度及び陽性適中率（ＰＰＶ）の推定は、「ゴールドスタンダード」生検の結果との比較に基づいて計算した。単一の生検はゴールドスタンダードとして限度がある。ＩＣＣアッセイのＰＰＶは、患者を連続して監視すること、又はループ電気外科的切除手順若しくは円錐生検などのより攻撃的な外科的エンドポイントを利用することによって改善される。単一の生検は、疾患の偽陰性結果が少なくとも３１％であることが知られている。Elit et al. (2004) J. Lower Genital Tract Disease 8(3):181-187を参照されたい。

^＊（９５％の信頼区間）

また、免疫細胞化学的方法の感度及びＰＰＶを従来のＰａｐ染色で得られたものとも比較した。Ｐａｐ染色の２つの臨床的エンドポイント（即ち≧ＬＳＩＬ及び≧ＨＳＩＬ）を用いた。ここでも、すべての計算の標準は生検の結果であった。

^＊（９５％の信頼区間）

表４２に示す結果は、免疫細胞化学的方法によって、高いＰＰＶを維持したままでより多くの高悪性度子宮頸部疾患試料が検出されたことを示している。

本研究では、免疫細胞化学的キットを用いて１４個の偽陰性が存在していた。１４個の患者試料のうちの１３個でＨＰＶ試験を実施した。偽陰性患者の１つでは利用可能な試料が残っていなかった。

NucleoSpin（登録商標）組織ＤＮＡキット（BD Clontech社製、カタログ番号６３５９６７）を用いて、ゲノムＤＮＡを頸部細胞診断試料から単離した。品質管理の目的で、ハウスキーピング遺伝子であるβ−グロビンのＰＣＲ解析を行った。

検出感度を向上させるために、ＭＹ０９／１１プライマー組を用いた従来のＬ１ＰＣＲ並びにＭＹ０９／１１及びＧＰ５^＋／６^＋プライマー組を用いたネステッドＰＣＲの両方によって、当分野に記載のＨＰＶのＬ１の遺伝子増幅を行った。存在するＨＰＶの型を同定するために、Ｌ１単位複製配列のＤＮＡ配列決定をさらに行った。

高品質のゲノムＤＮＡが１３個の臨床的細胞診断試料のうち１０個から単離された。３個の試料が、β−グロビンＰＣＲ解析によって示される低品質のゲノムＤＮＡを有していた。ＨＰＶのＤＮＡは、従来のＬ１ＰＣＲ（ＭＹ０９／１１プライマーを用いる）並びにネステッドＬ１ＰＣＲ（ＭＹ０９／１１及びＧＰ５^＋／６^＋プライマーを用いる）をどちらも用いて、１３個のうち１０個の試料で検出不可能又は陰性のどちらかであった。ＨＰＶが高悪性度子宮頸部疾患に関して陽性であることを考慮すると（＞９２％の感度）、このデータは、偽陰性試料の大多数でサンプリングエラーが起こったことを示す。

ＭＣＭ６抗体選択
ポリドーマのスクリーニング
マルチウェル組織培養プレート中に提供されたポリドーマのスクリーニングを行って、所望の感度及び特異性の特色を有する、ＭＣＭ６バイオマーカーに特異的な抗体を同定した。単一のスライド上に複数の正常（即ちＣＩＮなし）、ＣＩＮIII、扁平細胞癌、及び腺癌の試料を含む組織マイクロアレイを作製した。ポリドーマを含む各ウェルからの無希釈の上清で、組織マイクロアレイの陽性染色についてアッセイを行った。バックグラウンド、即ち非特異的結合は、この段階では基本的に無視した。試験した３５個のポリドーマのうち１１個が陽性染色結果を生じ、さらなる解析のためにそれを選択した。

選択されたポリドーマの特異性を決定するために、ポリドーマの上清から得られた染色パターンを、市販のＭＣＭ６抗体（BD Transduction Laboratories社製）を用いて得られたものと比較した。ポリドーマの上清で得られた染色パターンは、市販のＭＣＭ６抗体で観察されたものよりも特異的であると考えられる（図１７）。

その後、１１個の選択されたポリドーマを限界希釈工程に供した。選択されたポリドーマの上清から生じた３０個の限界希釈物を用いて、複数の正常（即ちＣＩＮなし）、ＣＩＮIII、扁平細胞癌、及び腺癌の試料を含む組織マイクロアレイの陽性染色についてアッセイを行った。異常な及び癌性の頸部組織試料の陽性染色に基づいて２つの限界希釈クローン、即ち９Ｄ４．３及び９Ｄ４．４を最も良好な上清として選択した。その後、これらのクローンの様々な希釈率を、ＮＩＬ、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬ組織及びプールした液体系細胞診断試料に対するその反応性について試験した。１：１００の希釈率のクローン９Ｄ４．３が最大の信号対雑音比を生じ、さらなる特徴づけを行うために選択した。

ＭＣＭ６、クローン９Ｄ４．３の特徴づけ
クローン９Ｄ４．３のさらなる特徴づけを行うために、クローンを用いて、以下の診断分類、即ちＮＩＬ（７）、ＬＳＩＬ（１０）、ＨＳＩＬ（１８）、及び子宮頸癌（５）から選択された４０個の液体系細胞診断試料の陽性染色についてアッセイを行った。４０個の試料のそれぞれについて、PrepStain（商標）スライドプロセッサー（TriPath Imaging, Inc.社製）を用いてスライドを調製した。試料１個あたり２つのスライドを、それぞれＭＣＭ２抗体（Dako社製）及びクローン９Ｄ４．３で染色した。残りのスライドはＰａｐ染色用又は陰性対照として用いた。

スライドを調製するために、各試料を２分間２００×ｇで遠心分離してペレットを形成し、上清を傾瀉した。２ｍＬの脱イオン水を各試料に加え、試料をボルテックス攪拌し、その後、５分間６００×ｇで遠心分離した。上清を傾瀉したあと、さらに７００μＬのトリス緩衝水を加えた。最後に、試料をPrepStain（商標）スライドプロセッサー（TriPath Imaging, Inc.社製）、バージョン１．１に載せ、Transfer Onlyプログラムを実行した。

すべてのスライドを、９５％のＥＴＯＨ中で、調製後少なくとも２４時間且つ３日未満維持した。ＭＣＭ２の抗原の回収は、スライドを９５℃に予熱した１×Target Retrieval Solution、ｐＨ６．０（DAKO社製S1699）／ｄＨ２Ｏ浴中で、スチーマー内に２５分間入れることによって達成した。ＭＣＭ６では、スライドを９５℃に予熱した１×トリスｐＨ９．５緩衝液（Biocare社製）／ｄＨ２Ｏ浴中で、スチーマー内に２５分間入れることによって、抗原のアクセシビリティを達成した。スチーマー処理後、すべてのスライドを室温で２０分間冷却した。

スライドは、実施例１、「自動免疫細胞化学」に記載のDAKO社製Universal Autostainerを用いた免疫細胞化学によって染色した。診断分類を形態学的に決定するために、熟練の細胞検査技師によってスライドのスクリーニング及び評価を行った。試料を、マーカー染色強度（０〜３）、陽性染色細胞のパーセンテージ、及びマーカー染色位置（核、細胞質、膜、又は組合せ）について評価した。細胞染色の強度に０〜３のスコアを与えた。スコア≧１．５の細胞を計数した。成熟した正常に見える扁平細胞及び正常に見える腺細胞は、茶色に染色された場合に陽性として計数しなかった。しかし、扁平異形成細胞は、異常細胞とともに陽性として計数した。その後、免疫細胞化学のスライドにＴＮ（真陰性）、ＦＮ（偽陰性）、ＴＰ（真陽性）、又はＦＰ（偽陽性）を指定した。

用いた計算
感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）
特異性＝ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）
陽性適中力（ＰＰＰ、Positive Predictive Power）＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）
陰性適中力（ＮＰＰ、Negative Predictive Power）＝ＴＮ／（ＦＮ＋ＴＮ）

クローン９Ｄ４．３の感度及び特異性は、市販のＭＣＭ２抗体を用いて得られたものと匹敵していた。１件のＮＩＬの症例はどちらの抗体に関しても陰性であった。１０件のうち９件のＬＳＩＬ症例がクローン９Ｄ４．３及び市販のＭＣＭ２抗体で陰性であった。２４件のうち２３件のＨＳＩＬの症例がクローン９Ｄ４．３及び市販のＭＣＭ２抗体で陽性であった。子宮頸癌試料では、５個のうち５個がクローン９Ｄ４．３で陽性であり、５個のうち４個がＭＣＭ２抗体で陽性であった。

ＭＣＭ６、クローン９Ｄ４．３の精製
その感度、特異性、及び核染色パターンの提示のため、クローン９Ｄ４．３をさらなる解析用に精製した。精製した抗体は、標準の方法に従って、Streamline rProteinA（Amersham Biosciences社製）親和性吸着クロマトグラフィーを用いて得られた。その後、結果として生じた抗体溶液を、１：５００〜１：６０００の様々な希釈率のＨＳＩＬ液体系頸部細胞診断プールに対する反応性について試験した。１：６０００の力価までシグナルが明白であった。

臨床的組織試料中のバイオマーカーのリアルタイムＰＣＲ検出
ABI Prism社製7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems社）を用いてTaqMan（登録商標）リアルタイムＰＣＲを行った。本研究の標的頸部バイオマーカー（即ち、ＭＣＭ７、ｐ２１^ｗａｆ１、ｐ１４^ＡＲＦ／ｐ１６、サイクリンＥ１、及びサイクリンＥ２）を特異的に増幅するために、プライマー及びプローブをPrimer Express（商標）プログラム、バージョン１．５（Applied Biosystems社）の支援により設計した。プライマー及びプローブの配列情報を以下に示す：

ＭＣＭ７：
プライマー名：MCM7_T1T3-F
配列：CTCTGAGCCCGCCAAGC（配列番号２５）
プライマー名：MCM7_T1T3-R
配列：TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA（配列番号２６）
プローブ名：MCM7_T1T3−プローブ
配列：CCCTCGGCAGCGATGGCACT（配列番号２７）
プライマー名：MCM7_T2T4-F
配列：GAGGAATCCCGAGCTGTGAA（配列番号２８）
プライマー名：MCM7_T2T4-R
配列：CCCGCTCCCGCCAT（配列番号２９）
プローブ名：MCM7_T2T4−プローブ
配列：CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA（配列番号３０）
プライマー名：MCM7_T2-F
配列：GTCCGAAGCCCCCAGAA（配列番号３１）
プライマー名：MCM7_T2-R
配列：CCCGACAGAGACCACTCACA（配列番号３２）
プローブ名：MCM7_T2−プローブ
配列：CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA（配列番号３３）
プライマー名：MCM7_T3T4-F
配列：CGCTACGCGAAGCTCTTTG（配列番号３４）
プライマー名：MCM7_T3T4-R
配列：CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA（配列番号３５）
プローブ名：MCM7_T3T4−プローブ
配列：TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA（配列番号３６）

ｐ２１^ｗａｆ１：
プライマー名：p21T1T2-F
配列：CAAACGCCGGCTGATCTT（配列番号３７）
プライマー名：p21T1T2-R
配列：CCAGGACTGCAGGCTTCCT（配列番号３８）
プローブ名：p21T1T2−プローブ
配列：CAAGAGGAAGCCCTAATCCGCCCA（配列番号３９）
プライマー名：p21T2-F
配列：GAGCGGCGGCAGACAA（配列番号４０）
プライマー名：p21T2-R
配列：CCGCGAACACGCATCCT（配列番号４１）
プローブ名：p21T2−プローブ
配列：CCCAGAGCCGAGCCAAGCGTG（配列番号４２）
プライマー名：p21T3-F
配列：TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA（配列番号４３）
プライマー名：p21T3-R
配列：TCCAGTCTGGCCAACAGAGTT（配列番号４４）
プローブ名：p21T3−プローブ
配列：CGGCGGCAGACCAGCATGAC（配列番号４５）

ｐ１４^ＡＲＦ／ｐ１６：
プライマー名：p16T4-F
配列：GCC CTC GTG CTG ATG CTA CT（配列番号４６）
プライマー名：p16T4-R
配列：TCA TCA TGA CCT GGT CTT CTA GGA（配列番号４７）
プローブ名：p16T4−プローブ
配列：AGC GTC TAG GGC AGC AGC CGC（配列番号４８）
プライマー名：p16T1-F
配列：TGCCCAACGCACCGA（配列番号４９）
プライマー名：p16T1-R
配列：GGGCGCTGCCCATCA（配列番号５０）
プローブ名：p16T1−プローブ
配列：TCGGAGGCCGATCCAGGTCATG（配列番号５１）
プライマー名：p16T2-F
配列：AAGCTTCCTTTCCGTCATGC（配列番号５２）
プライマー名：p16T2-R
配列：CATGACCTGCCAGAGAGAACAG（配列番号５３）
プローブ名：p16T2−プローブ
配列：CCCCCACCCTGGCTCTGACCA（配列番号５４）
プライマー名：p16T3-F
配列：GGAAACCAAGGAAGAGGAATGAG（配列番号５５）
プライマー名：p16T3-R
配列：TGTTCCCCCCTTCAGATCTTCT（配列番号５６）
プローブ名：p16T3−プローブ
配列：ACGCGCGTACAGATCTCTCGAATGCT（配列番号５７）
プライマー名：p16Universal-F
配列：CACGCCCTAAGCGCACAT（配列番号５８）
プライマー名：p16Universal-R
配列：CCTAGTTCACAAAATGCTTGTCATG（配列番号５９）
プローブ名：p16Universal−プローブ
配列：TTTCTTGCGAGCCTCGCAGCCTC（配列番号６０）

サイクリンＥ１：
プライマー名：CCNE1T1T2-F
配列：AAAGAAGATGATGACCGGGTTTAC（配列番号６１）
プライマー名：CCNE1T1T2-R
配列：GAGCCTCTGGATGGTGCAA（配列番号６２）
プローブ名：CCNE1T1T2-P
配列：CAAACTCAACGTGCAAGCCTCGGA（配列番号６３）
プライマー名：CCNE1T1-F
配列：TCCGCCGCGGACAA（配列番号６４）
プライマー名：CCNE1T1-R
配列：CATGGTGTCCCGCTCCTT（配列番号６５）
プローブ名：CCNE1T1−プローブ
配列：ACCCTGGCCTCAGGCCGGAG（配列番号６６）

サイクリンＥ２
プライマー名：CCNE2T1T2-F
配列：GGAATTGTTGGCCACCTGTATT（配列番号６７）
プライマー名：CCNE2T1T2-R
配列：CTGGAGAAATCACTTGTTCCTATTTCT（配列番号６８）
TaqManプローブ名：CCNE2T1T2-P
配列：CAGTCCTTGCATTATCATTGAAACACCTCACA（配列番号６９）
プライマー名：CCNE2T1T3-F
配列：TCAACTCATTGGAATTACCTCATTATTC（配列番号７０）
プライマー名：CCNE2T1T3-R
配列：ACCATCAGTGACGTAAGCAAACTC（配列番号７１）
TaqManプローブ名：CCNE2T1T3-P
配列：CCAAACTTGAGGAAATCTATGCTCCTAAACTCCA（配列番号７２）
プライマー名：CCNE2T2-F
配列：TTTTGAAGTTCTGCATTCTGACTTG（配列番号７３）
プライマー名：CCNE2T2-R
配列：ACCATCAGTGACGTAAGCAAGATAA（配列番号７４）
TaqManプローブ名：CCNE2T2-P
配列：AACCACAGATGAGGTCCATACTTCTAGACTGGCT（配列番号７５）

プローブの５’塩基を蛍光色素ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で、且つ３’塩基を消光色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）で標識した。単位複製配列の大きさは約１００ｂｐであった。１８ＳリボソームＲＮＡを内在コントロールとして利用した。１８ＳｒＲＮＡプローブを蛍光色素ＶＩＣ（商標）で標識した。事前に開発された１８ＳｒＲＮＡプライマー／プローブ混合物をApplied Biosystems社から購入した。正常（Ｎ、normal）又は癌性（Ｔ、cancerous）の頸部組織から抽出した５μｇの全ＲＮＡを、High-Capacity cDNA Archive Kit（Applied Biosystems社）を用いてランダムな六量体を有する一本鎖ｃＤＮＡの形態へと定量的に変換した。以下の反応試薬を調製した：
プライマー／プローブの２０×マスター混合物（２００μｌ中）
１８０μＭの順方向プライマー２０μｌ
１８０μＭの逆方向プライマー２０μｌ
１００μＭのTaqManプローブ１０μｌ
Ｈ_２Ｏ１５０μｌ
最終反応混合物（２５μｌ／ウェル）
プライマー／プローブの２０×マスター混合物１．２５μｌ
２×TaqManUniversal PCR Master Mix（Ｐ／Ｎ：４３０４４３７）１２．５μｌ
ｃＤＮＡ鋳型５．０μｌ
Ｈ_２Ｏ６．２５μｌ

２０×TaqMan Universal PCR Master MixはApplied Biosystems社から購入した。全体積２５μｌ中の最終的なプライマー及びプローブの濃度は、それぞれ０．９μＭ及び０．２５μＭであった。１０ｎｇの全ＲＮＡを各ウェルに入れた。増幅条件は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、並びに９５℃で１５秒間及び６０℃で６０秒間の２ステップのサイクルを、合計４０サイクルであった。少なくとも３つの非鋳型対照反応混合物をそれぞれの実行に含めた。すべての実験は３つ組で行った。

各反応の終わりに、記録された蛍光強度を以下の計算に用いた。Ｒｎ^＋とは、すべての構成成分を含む反応のＲｎ値である。Ｒｎ⁻とは、未反応の試料のＲｎ値である（基底値又はＮＴＣで検出された値）。ΔＲｎとは、Ｒｎ^＋とＲｎ⁻との差であり、ＰＣＲによって生じたシグナルの大きさを示す。本研究では、既知の量の標準物質を用いないが、選択した任意の参照値（例えば１８ＳｒＲＮＡ）に対する標的配列の相対量を比較する、比較Ｃ_Ｔ方法を用いた。TaqMan（登録商標）Human Endogenous Control Plateプロトコルを用いて、生データをリアルタイムＰＣＲデータ分析用に変換した。

結果
各バイオマーカー及び特異的プライマーを用いて得られた結果を以下に表形式で記載する。正常な頸部組織試料（即ちＮＩＬ）で得られた結果をＮと示し、子宮頸癌組織で得られた結果をＴと示した。

臨床的組織試料中のバイオマーカーのリアルタイムＰＣＲ検出
子宮頸癌組織試料（例えば腺癌、扁平細胞癌）及び正常な頸部組織試料を用いて、実施例９に記載のようにTaqMan（登録商標）リアルタイムＰＣＲを行った。本研究の標的頸部バイオマーカー（即ち、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、及びＴｏｐｏ２Ａ）を特異的に増幅するために、プライマー及びプローブをPrimer Express（商標）プログラム、バージョン１．５（Applied Biosystems社）の支援により設計した。プライマー及びプローブの配列情報を以下に示す：

TaqManプライマー
ＭＣＭ２：
プライマー名：MCM2-F
配列：５’−GGAGGTGGTACTGGCCATGTA−３’（配列番号８０）
プライマー名：MCM2-R
配列：５’−GGGAGATGCGGACATGGAT−３’（配列番号８１）
TaqManプローブ名：MCM2-P
配列：５’−CCAAGTACGACCGCATCACCAACCA−３’（配列番号８２）

ＭＣＭ６：
プライマー名：MCM6-F
配列：５’−CATTCCAAGACCTGCCTACCA−３’（配列番号８３）
プライマー名：MCM6-R
配列：５’−ATGCGAGTGAGCAAACCAATT−３’（配列番号８４）
TaqManプローブ名：MCM6-P
配列：５’−ACACAAGATTCGAGAGCTCACCTCATCCA−３’（配列番号８５）

ＴＯＰＯ２Ａ：
プライマー名：TOP2A_F
配列：５’−GGCTACATGGTGGCAAGGA−３’（配列番号８６）
プライマー名：TOP2A_R
配列：５’−TGGAAATAACAATCGAGCCAAAG−３’（配列番号８７）
TaqManプローブ名：TOP2A_P
配列：５’−TGCTAGTCCACGATACATCTTTACAATGCTCAGC−３’（配列番号８８）

結果
各バイオマーカーを用いて得られた結果を以下に表形式で記載する。また、データを以下に要約する。

ＳＣＣ：扁平細胞癌；ＡＣ：腺癌。

頸部及び乳癌細胞中のバイオマーカーのリアルタイムＰＣＲ検出
頸部並びに乳癌細胞系中のＭＣＭ２、ＭＣＭ６及びＭＣＭ７の発現レベルを検出するためにTaqMan（登録商標）リアルタイムＰＣＲを行った。

実験の設計及びプロトコル
ＳｉＨａ、Ｃａｓｋｉ及びＨｅＬａの３つのヒト子宮頸癌細胞系並びにＭＣＦ−７、ＳＫ−ＢＲ３及びＣＡＭＡの３つのヒト乳癌細胞系をＡＴＣＣから購入し、本実験で用いた。RNeasy（登録商標）Protect Miniキット（Qiagen社製、カリフォルニア州Valencia）によって新しく培養した細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、High-Capacity cDNA Archive Kit（Applied Biosystems社、Ｐ／Ｎ：４３２２１７１）を用いてランダムな六量体を有する一本鎖ｃＤＮＡの形態へと変換した。TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems, Inc.社製、カリフォルニア州Foster City）を用いて、ABI Prism社製（登録商標）7700 Sequence Detection SystemでリアルタイムＰＣＲを行った。

ABI社製Primer Express（商標）プログラム、ｖ１．５を用いて、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６及びＭＣＭ７を特異的に増幅するためのプライマー並びにプローブを設計した。ＭＣＭ７は４つの転写変異体を含み、転写変異体１（Ｔ１、参照配列ＮＭ＿００５９１６）及び転写変異体２（Ｔ２、参照配列ＮＭ＿１８２７７６）がNCBI Entrezヌクレオチドデータベース中で同定された。NCBIのModel MakerのＥＳＴアセンブリによって解析すると、変異体Ｔ３及びＴ４は５’末端付近に代替エクソンを有する。プライマー及びプローブは、それぞれ具体的に変異体Ｔ１及びＴ３、Ｔ２及びＴ４、Ｔ２、並びにＴ３及びＴ４を検出するために、Ｔ１Ｔ３、Ｔ２Ｔ４、Ｔ２並びにＴ３Ｔ４として設計した。プライマー及びプローブの配列は上記実施例１０及び１１に示した。

プローブの５’塩基を蛍光色素ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で、且つ３’塩基を消光色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）で標識した。１８ＳリボソームＲＮＡを内在コントロールとして利用した。１８ＳｒＲＮＡプローブを蛍光色素ＶＩＣ（商標）で標識した。事前に開発された１８ＳｒＲＮＡプライマー／プローブ混合物をApplied Biosystems社から購入した。１０ｎｇのｃＤＮＡを、それぞれ０．９μＭ及び０．２５μＭのプライマー及びプローブを全体積２５μｌ中に含む反応混合物に施用した。増幅条件は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、並びに９５℃で１５秒間及び６０℃で６０秒間の２ステップのサイクルを、合計４０サイクルであった。少なくとも３つの非鋳型対照反応混合物をそれぞれの実行に含めた。すべての実験は２つ組で行った。１８Ｓ内在コントロールに対する標的遺伝子の発現レベルを計算するために相対的定量方法を用い、ABI社の使用者の手引きに従ってそのＣＴ値に基づいて行った（Ｐ／Ｎ４３０３８５９）。

結果
各バイオマーカーで得られた結果を以下に表形式で記載する。

結論
頸部ＨｅＬａ細胞系はＭＣＭ２、ＭＣＭ６及びＭＣＭ７のバイオマーカーの発現レベルが低いことが示された。頸部ＳｉＨａ、乳房ＭＣＭ７、及びＣＡＭＡの細胞系はすべて、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６及びＭＣＭ７バイオマーカーの過剰発現を示した。頸部Ｃａｓｋｉ及び乳房ＳＫ−ＢＲ３の細胞系はＭＣＭ７の過剰発現を示したが、ＭＣＭ２及びＭＣＭ６に関しては発現が低かった。

一過性のＨＰＶ１６のＥ６／Ｅ７遺伝子形質移入による２９３細胞中の頸部バイオマーカーの発現の誘発
TaqMan（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて、ＨＥＫ２９３細胞系の系における頸部バイオマーカーの発現と高リスクＨＰＶ癌遺伝子の転写との関連を調査した。

実験の設計及びプロトコル
テトラサイクリン調節性の発現系（T−Rex System、Invitrogen, Inc社製）を本実験に適応させた。ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６又はＥ７タンパク質を発現するT−Rexベクターを構築した。突然変異体Ｅ２、Ｅ６又はＥ７遺伝子を含むベクターを陰性対照として利用した。その後、T−Rexの２９３細胞にＨＰＶプラスミドを形質移入し、テトラサイクリンによって４時間、２４時間及び７２時間、ＨＰＶ遺伝子の発現を活性化させた。RNeasy（登録商標）Protect Miniキット（Qiagen社製、カリフォルニア州Valencia）によって形質移入した細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、High-Capacity cDNA Archive Kit（Applied Biosystems社、Ｐ／Ｎ：４３２２１７１）を用いてランダムな六量体を有する一本鎖ｃＤＮＡの形態へと変換した。TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems, Inc.社製、カリフォルニア州Foster City）を用いて、ABI Prism社製（登録商標）7700 Sequence Detection SystemでリアルタイムＰＣＲを行った。

ABI社製Primer Express（商標）プログラム、ｖ１．５を用いて、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＴＯＰ２Ａ、サイクリンＥ１、ｐ２１、ｐ１４、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６及びＥ７を特異的に増幅するためのプライマー並びにプローブを設計した。ＭＣＭ７は４つの転写変異体を含み、転写変異体１（Ｔ１、参照配列ＮＭ＿００５９１６）及び転写変異体２（Ｔ２、参照配列ＮＭ＿１８２７７６）がNCBI Entrezヌクレオチドデータベース中で同定された。NCBIのModel MakerのＥＳＴアセンブリによって解析すると、変異体Ｔ３及びＴ４は５’末端付近に代替エクソンを有する。プライマー及びプローブは、それぞれ具体的に変異体Ｔ１及びＴ３、Ｔ２及びＴ４、Ｔ２、並びにＴ３及びＴ４を検出するために、Ｔ１Ｔ３、Ｔ２Ｔ４、Ｔ２並びにＴ３Ｔ４として設計した。プライマー及びプローブの配列は実施例１０及び１１に示した。

結果
T−Rexの２９３細胞中でのＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６及びＥ７遺伝子の発現は、形質移入の時間経過を通して増加することが観察された。T−Rexの２９３細胞中でのＴｏｐｏ２Ａ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７及びサイクリンＥのｍＲＮＡ発現は、ＨＰＶ１６のＥ６又はＥ７遺伝子によって、形質移入後４時間から７２時間までに顕著に誘発された。しかし、ｐ２１及びｐ１４ではＨＰＶ遺伝子の形質移入後に発現レベルの上昇は検出されなかった。Ｅ６又はＥ７の発現はＥ２遺伝子の同時形質移入によって抑制されないと考えられる。これは、Ｅ６又はＥ７の発現が天然のＨＰＶプロモーターではなく外部ＣＭＶプロモーターに完全によって駆動されていたからである。後者は本モデルシステム中に存在しない。

スライド前処理緩衝液を用いて免疫細胞化学的方法及び免疫組織化学的方法において抗原のアクセシビリティを増加させる方法
標本の選択及び試薬の説明
バイオマーカーの過剰発現を検出するために、同一患者由来の細胞診断標本と組織学的標本との対を免疫アッセイに供した。ＡＳＣＵＳ（３）、ＬＳＩＬ（６）、及びＨＳＩＬ（５）と分類された患者由来のパラフィンブロック組織試料及びSurePath（登録商標）細胞診断標本を解析した。用いた試薬は、抗体カクテル（細胞診断用）、改変抗体カクテル（組織学用）、検出試薬、対比染色剤、及びSureSlide（登録商標）調製緩衝液１０×（前処理緩衝液）であった。

細胞診断用スライドの調製及び自動免疫細胞化学
免疫細胞化学では、スライドの調製及び前処理を実施例５で指示したように実施した。その後、各細胞診断標本で、１点を除いては実施例５に記載のように自動免疫細胞化学を行った。本実験では、一次抗体カクテル（１：１０，０００のＭＣＭ２クローン２６Ｈ６．１９、１：８００のＭＣＭ２クローン２７Ｃ５．６、１：１０００のＴＯＰＯIIＡクローンＳＷＴ３Ｄ１）のインキュベーションを３０分間に短縮した。

組織学用スライドの調製及び自動免疫組織化学
それぞれの症例について、４ミクロンの切片を切り出して、終夜又は７０℃の強制通風炉中で２０分間乾燥させた。キシレンで５分間ずつ、３回交換して切片の脱パラフィン化を行った。その後、無水アルコールで５分間ずつ、スライド清澄にした。スライドを水に入れ、十分にすすいだ。スライドを予熱した１×SureSlide調製緩衝液の溶液に移し、スチーマー中で２５分間、インキュベーションを行った。スライドをスチーマーから取り出し、室温で２０分間冷却した。緩衝液が完全に交換されるまでスライドをゆっくりと水ですすいだ。ＴＢＳＴのすすぎを２回交換して２分間ずつ行った。

２点を除いては免疫細胞化学について実施例５に記載のように、自動免疫組織化学を実施した。本実験では、一次抗体カクテルのインキュベーションを３０分間に短縮した。さらに、一次抗体カクテルを以下の希釈率に改変した（１：４，０００のＭＣＭ２クローン２６Ｈ６．１９、１：２００のＭＣＭ２クローン２７Ｃ５．６、１：４００のＴＯＰＯIIＡクローンＳＷＴ３Ｄ１）。

結果
ＲＵＯ試薬を用いて、組織学的標本及び細胞診断標本のいずれについても予測された染色パターンが観察された。具体的には、SureSlide（登録商標）調製緩衝液、検出試薬及び対比染色試薬を用いて、組織学的標本並びに細胞診断標本のどちらにおいても免疫染色を行う能力の実証が成功した。

上記の説明及び実施例に鑑みて、当業者は、本発明の方法により、従来の実施と比較して年齢に無関係に高悪性度子宮頸部疾患の優れた検出が可能となることを理解されよう。本発明の方法は、以下に記述するように具体的に使用し得る：
・３０歳を超える女性では、試験はＨＰＶ陽性結果を反映して、又はＡＳＣＵＳ＋細胞診断結果を反映して行い得る。
・３０歳未満の女性では、試験は高悪性度子宮頸部疾患を検出するための細胞診断と組み合わせて用い得る。
・３０歳を超える女性では、試験は高悪性度子宮頸部疾患を検出するための細胞診断と組み合わせて用い得る。
・３０歳未満の女性では、試験は高悪性度子宮頸部疾患を検出するための一次スクリーニングとして用い得る。
・３０歳を超える女性では、試験は高悪性度子宮頸部疾患を検出するための一次スクリーニングとして用い得る。
・試験は３０歳未満の女性においてＰａｐスメアの代わりであり得る。
・最終的には、試験は年齢に無関係にＰａｐスメアの代わりであり得る。

本発明の実施から派生する他の潜在的な利点には以下が含まれる：
・ＮＩＬ／ＨＰＶ陽性結果を有する３０歳以上の女性における組織学的な高悪性度異常の検出。
・ＤＮＡ＋Ｐａｐ試験に陽性である３０歳を超える女性において高悪性度子宮頸部疾患を検出する優れた特異性。
・年齢に無関係に、ＡＳＣ−ＵＳ、ＡＳＣ−Ｈ、及びＬＳＩＬの分類内の女性における高悪性度子宮頸部疾患の優れた検出性。
・ＨＳＩＬ分類内において高悪性度頸部を検出する優れた特異性。
・３０歳未満の女性において、細胞診断系の診断と併せて高悪性度子宮頸部疾患が検出されること。
・年齢に無関係に、細胞診断系の診断と併せて高悪性度子宮頸部疾患が検出されること。
・３０歳未満の女性において、一次スクリーニングとして高悪性度子宮頸部疾患を検出する特異性が向上すること。
・年齢に無関係に、一次スクリーニングとして高悪性度子宮頸部疾患を検出する特異性が向上すること。
・子宮頸部疾患の同定及びＨＰＶ感染症と高悪性度頸部疾患との区別。
・手動の解釈又は自動顕微鏡観察による支援解釈を用いて許容されるアッセイ性能が確立できる。

本明細書中で言及したすべての出版物及び特許出願は、本発明が関する分野の技術者のレベルを示す。すべての出版物及び特許出願は、個々のそれぞれの出版物又は特許出願を具体的且つ個別に参考として組み込んだ場合と同じように、本明細書中に参考として組み込まれている。

前述の発明は、理解の明確化のために例示及び実施例によってある程度詳述したが、添付の実施形態の範囲内で特定の変更及び改変を実施し得ることは明らかであろう。

頸部異形成における増殖及び細胞周期の調節解除を示す模式的概要図である。細胞周期の変化及び増殖制御により、頸部新形成に欠陥が生じる。ＨＰＶ感染症並びにＥ６及びＥ７腫瘍性タンパク質の過剰発現により、細胞周期及び増殖制御に一連の変化が生じる。ＨＰＶのＥ６腫瘍性タンパク質はＧ１／Ｓ及びＧ２／Ｍの境界における細胞周期チェックポイントを廃止させ、それに続いて体細胞突然変異を有するＤＮＡが複製される。Ｅ７は、Ｓ期への加速を促進し、ＤＮＡ複製に必要なＳ期遺伝子の発現が延長される（異常なＳ期誘発）。同様に、Ｅ６は、テロメラーゼの発現を促進して、増殖及び細胞の不死化の間に染色体テロメアの完全性の持続を保証する。最後に、Ｅ７は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を廃止させ、また、Ｇ１停止及び増殖制御のこの制御機構を廃止させる。頸部新形成における異常なＳ期誘発を示す模式図である。細胞周期の制御及び増殖に対するＨＰＶタンパク質の効果には、とりわけ、ｐ５３及びＲｂ腫瘍抑制経路の不活性化、Ｅ２Ｆ−１転写の活性化、Ｓ期遺伝子ＭＣＭ−２、ＭＣＭ−６、ＭＣＭ−７、ＴＯＰ２Ａ及びサイクリンＥ１の誘導が含まれる。さらに、Ｅ２は、Ｓｐ−１転写因子と相互作用してｐ２１−ｗａｆ−１の遺伝子発現を活性化する。細胞周期の異常なＳ期における細胞増殖に対するフィードバックループを示す模式図である。Ｓ期におけるサイクリンＥ及びＣＤＫ２の過剰発現の結果、Ｓ期遺伝子の誘導を可能にする独立した機構が生じる。異常なＳ期誘発におけるｃ−ｍｙｃの役割を示す模式図である。ｃ−ｍｙｃは、細胞増殖における重要な転写活性化因子である。ｃ−ｍｙｃをコードしている遺伝子は染色体上に位置する。これは、この遺伝子領域の対応する増幅に関してＨＰＶ１８の組込みが記載されているのと同じ部位である。ｃ−ｍｙｃ遺伝子の増幅はコードされたタンパク質の過剰発現をもたらし、ｃ−ｍｙｃレベルの増加は非依存的にＳ期遺伝子の転写に貢献して細胞増殖をさらに促進するであろう。ＭＣＭ７転写変異体に向けられたTaqMan（登録商標）プライマーを示す模式図である。軽い異形成に罹患した患者及び扁平細胞癌に罹患した患者のＩＨＣアッセイにおける、Ｃｌａｕｄｉｎ１に向けられた抗体の分染パターンを例示する図である。ＩＨＣ及びＩＣＣ様式におけるＣｌａｕｄｉｎ１に向けられた抗体の分染パターンを例示する図である。正常細胞並びにＣＩＮIII及びＨＳＩＬの指標となる細胞を示す。核バイオマーカー（即ちＭＣＭ２）を用いて得られた核染色パターン及び細胞質バイオマーカー（ｐ１６）を用いて得られた細胞質染色パターンを例示する図である。結果は、高悪性度子宮頸部疾患の患者試料の免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイから得たものである。高悪性度子宮頸部疾患に罹患した患者由来の頸部組織上のＭＣＭ６に向けられた２つの異なる抗体を用いた免疫組織化学的（ＩＨＣ、immunohistochemistry）アッセイにおける、望ましい抗体染色及び望ましくない抗体染色を例示する図である。

Claims

高悪性度子宮頸部疾患の判定方法であって、
ａ）試料を、少なくとも３つの抗体とインビトロで接触させるステップであって、第１及び第２抗体がＭＣＭ２と特異的に結合し、第３抗体がTopo2Aと特異的に結合するステップ；及び、
ｂ）前記抗体とＭＣＭ２及びTopo2Aとの結合を検出するステップ
とを含むことを特徴とする方法。
少なくとも３つの抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
免疫細胞化学を行うことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
手動で行われる、請求項３に記載の方法。
自動的な様式で行われる、請求項３に記載の方法。
試料が、頸部細胞を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
試料が、頸部細胞単層を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
試料が、液体系調製物に懸濁状態の頸部細胞、又は頸部組織試料を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
高悪性度子宮頸部疾患を判定する方法の感度が、少なくとも９０％である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
高悪性度子宮頸部疾患を判定する方法の特異性が、少なくとも８５％である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
試料のパパニコロー（Ｐａｐ）染色をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
少なくとも３つの抗体を、個別の抗体試薬として逐次的に試料と接触させる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
少なくとも３つの抗体を、抗体カクテルとして同時に試料と接触させる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
異常なＰａｐスメア結果を有する患者に対して行われる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
一般患者集団において、高悪性度子宮頸部疾患の一次スクリーニングとして行う、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
少なくとも３つの抗体を含むキットであって、前記キット中の第１及び第２抗体がＭＣＭ２と特異的に結合し、第３抗体がTopo2Aと特異的に結合し、前記抗体とＭＣＭ２及びTopo2Aとの結合を検出することができる高悪性度子宮頸部疾患判定用キット。
少なくとも３つの抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１６に記載のキット。
ペルオキシダーゼ遮断剤、タンパク質遮断剤、ＭＣＭ２とTopo2Aとの抗体結合を検出するための化学薬品、対比染色剤、青味剤、及び使用説明書をさらに含む、請求項１６又は１７に記載のキット。
抗体結合を検出するための化学薬品が、色素原及び標識したポリマーに結合した二次抗体を含み、前記色素原が３’，３’−ジアミノベンジジンを含み、標識したポリマーがデキストランポリマーに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼを含む、請求項１８に記載のキット。
対比染色剤がヘマトキシリンを含む、請求項１８に記載のキット。
青味剤がトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、Tween-20、及びアジ化ナトリウムを含む溶液を含む、請求項１８に記載のキット。
陽性対照試料をさらに含む、請求項１６〜２１のいずれかに記載のキット。
陽性対照試料がＳｉＨａ細胞を含む、請求項２２に記載のキット。
パパニコロー（Ｐａｐ）染色用の試薬をさらに含む、請求項１６〜２３のいずれかに記載のキット。
Ｐａｐ染色用の試薬がＥＡ５０及びＯｒａｎｇｅＧを含む、請求項２４に記載のキット。
少なくとも３つの抗体を別々の試薬として提供する、請求項１６〜２５のいずれかに記載のキット。
少なくとも３つの抗体をカクテルとして提供する、請求項１６〜２５のいずれかに記載のキット。