ES2381644T3 - Métodos y composiciones para la detección de enfermedades de cuello uterino - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado en una paciente, comprendiendo dicho método: a) poner en contacto una muestra corporal de dicha paciente al menos con tres anticuerpos, en el que un primer y segundo anticuerpo se unen específicamente a la proteína 2 de mantenimiento de minicromosomas MCM2 y un tercer anticuerpo que se une específicamente a la toposiomerasa II alfa, Topo2A; y, b) detectar la unión de los anticuerpos a MCM2 y a Topo2A.

Description

Métodos y composiciones para la detección de enfermedades de cuello uterino

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y a composiciones para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado.

Antecedentes de la invención

El carcinoma de cuello uterino es el segundo neoplasma más común en mujeres, representando aproximadamente un 12% de todos los cánceres en mujeres y ocasionando aproximadamente 250.000 muertes por año. Baldwin et al (2003) Nature Reviews Cancer 3:1-10. En muchos países en desarrollo en los que no se dispone de programas de

15 exploración masiva, el problema clínico es más serio. En estos países, el cáncer de cuello uterino es la causa número uno de muerte por cáncer en mujeres.

La mayoría de los casos de cáncer de cuello uterino representan carcinomas de células escamosas, aunque también se observan adenocarcinomas. El cáncer de cuello uterino puede prevenirse por exploración de la población a medida que evoluciona a través de fases intraepiteliales no invasivas bien definidas, que pueden diferenciarse morfológicamente. Williams et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14932-14937. Si bien no se conoce cómo se transforman las células normales, el concepto de un espectro continuo de cambios histopatológicos a partir del epitelio estratificado, normal por medio de neoplasia intraepitelial de cuello uterino (CIN) a cáncer invasivo se ha aceptado ampliamente durante años. El precursor del cáncer de cuello uterino es la displasia, conocida también en

25 la técnica como CIN o lesiones intraepiteliales escamosas (SIL). Las anomalías intraepiteliales escamosas pueden clasificarse usando el sistema triple (CIN) o doble (Bethesda). En el sistema Bethesda, las lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LSIL), que corresponden a CINI e infección por el VPH, generalmente representan infecciones por el VPH productivas con un riesgo de progreso relativamente bajo hacia una enfermedad invasiva. Las lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (LSIL), que corresponden a CINII y CINIII en el sistema triple, muestran un riesgo de progreso mayor a cáncer de cuello uterino que las LSIL, aunque tanto las LSIL como las HSIL se contemplan como precursores potenciales de malignidad. Las muestras de los pacientes también pueden clasificarse como ASCUS (células escamosas atípicas de significado desconocido) o AGUS (células glandulares atípicas de significado desconocido) con este sistema.

35 Se ha establecido una fuerte asociación del cáncer e infección de cuello uterino por tipos de virus de papiloma humano (VPH) de alto riesgo, tales como los tipos 16, 18 y 31. De hecho, un gran cúmulo de pruebas epidemiológicas y de biología molecular ha establecido la infección por VPH como un factor causal en el cáncer de cuello uterino. Por otra parte, el VPH se encuentra en un 85% o más de los casos de enfermedad de cuello uterino de alto grado. Sin embargo, la infección por VPH es muy habitual, produciéndose posiblemente en un 5-15% de las mujeres de más de 30 años de edad, pero pocas mujeres positivas al VPH desarrollarán alguna vez una enfermedad de cuello uterino de alto grado o cáncer. La presencia del VPH solo es indicativa únicamente de infección, no de enfermedad de cuello uterino de alto grado, y, por lo tanto, el ensayo para detectar infección por el VPH solo da como resultado muchos positivos falsos. Véase, por ejemplo, Wright et al (2004) Obstet Gynecol 103:304-309.

45 Las publicaciones actuales sugieren que el VPH infecta las células madre basales dentro del tejido subyacente del cuello uterino. La diferenciación de las células madre en queratinocitos maduros, con la migración resultante de las células al epitelio del cuello uterino estratificado, está asociada con la replicación viral del VPH y la re-infección de las células. Durante este proceso de replicación viral, se producen numerosos cambios celulares que incluyen la desregulación del ciclo celular, la proliferación activa, la replicación del ADN, la activación transcripcional y la inestabilidad genómica (Crum (2000) Modern Pathology 13:243-251; Middleton et al (2003) J. Virol. 77:10186-10201; Pett et al (2004) Cancer Res. 64:1359-1368).

La mayor parte de las infecciones por el VPH tienen una naturaleza transitoria, resolviéndose la infección viral por sí misma en un período de 12 meses. Para aquellos individuos que desarrollan infecciones persistentes con uno o más 55 subtipos oncogénicos del VPH, existe el riesgo de desarrollo de neoplasia en comparación con los pacientes sin infección por el VPH. Dada la importancia del VPH en el desarrollo de neoplasia de cuello uterino, la detección clínica del VPH se ha convertido en una importante herramienta de diagnóstico en la identificación de pacientes con riesgo de desarrollo de neoplasia de cuello uterino. La utilidad clínica de la exploración basada en el VPH para enfermedades del cuello uterino se encuentra en su valor predictivo negativo. Un resultado negativo para el VPH combinado con un historial de frotis de Papanicolau normales es un indicador excelente de un estado libre de enfermedad y un bajo riesgo de desarrollo de neoplasia de cuello uterino durante los 1-3 años siguientes. Sin embargo, un resultado positivo para el VPH no es un diagnóstico de enfermedad de cuello uterino sino una indicación de infección. Aunque la mayoría de las infecciones por VPH son transitorias y se eliminarán espontáneamente en un periodo de 12 meses, una infección persistente con un subtipo viral de VPH de alto riesgo 65 indica un riesgo mayor de desarrollo de neoplasia de cuello uterino. Para complementar el ensayo del VPH, se espera que la identificación de marcadores moleculares asociados con la neoplasia de cuello uterino mejore la

especificidad clínica para la diagnosis de las enfermedades de cuello uterino.

El examen citológico de frotis de cuello uterino teñido con Papanicolau (frotis de Pap) es actualmente el método de elección para detectar el cáncer de cuello uterino. El ensayo de Pap es un método subjetivo que ha permanecido 5 sustancialmente inalterado durante 60 años. Sin embargo, existen numerosas cuestiones, en lo que respecta a su realización. La sensibilidad referida de un único ensayo de Pap (la proporción de positivos para la enfermedad que es positiva para el ensayo) es baja y muestra una amplia variación (30-87%). La especificidad de un solo ensayo de Pap (la proporción de negativos para la enfermedad que son negativos para el ensayo) podría ser tan baja como un 86% en una población en exploración y considerablemente más baja en la población ASCUS PLUS para la determinación de enfermedades de alto grado subyacentes. Véase, Baldwin et al., anteriormente. Un porcentaje significativo de frotis de Pap caracterizados como LSIL o CINI son realmente positivos para lesiones de alto grado. Además, hasta un 10% de los frotis de Pap se clasifican como ASCUS (células escamosas atípicas de significado no determinado), es decir, no es posible realizar una clasificación clara como lesión normal, moderada o grave, o tumor. Sin embargo, la experiencia demuestra que hasta el 10% de esta población ASCUS tiene lesiones de alto grado,

15 que por consiguiente se pasan por alto. Véase, por ejemplo, Manos et al (1999) JAMA 281:1605-1610.

El documento de Baldwin P et al (2003), Nature Reviews, vol. 3 págs. 217-226 describe intentos para mejorar la exploración de cuello uterino. El documento WO02101075 describe genes, composiciones, kits y métodos en relación con el cáncer de cuello uterino. El documento de Santin A et al describe marcadores moleculares candidatos para el diagnóstico del cáncer de cuello uterino.

Por lo tanto, se necesita un método para el diagnóstico de enfermedades de cuello uterino de alto grado que sea independiente de o que funcione junto con los frotis de Pap y ensayos moleculares convencionales para la infección por VPH de alto riesgo. Tal método debe ser capaz de identificar específicamente enfermedades de cuello uterino de

25 alto grado que estén presentes en todas las poblaciones de pacientes, incluyendo aquellos casos clasificados como LSIL o CINI por tinción con Pap que sean realmente positivos para lesiones de alto grado (es decir, “negativos falsos”). Por lo tanto, en la materia existe una necesidad de métodos de diagnóstico específicos, fiables que sean capaces de detectar enfermedades de cuello uterino de alto grado y de diferenciar enfermedades de alto grado de afecciones que no se consideran enfermedades clínicas, tales como infección por VPH de fase temprana y displasia leve.

Sumario de la invención

La invención, en su sentido más amplio, es como se detalla en las reivindicaciones.

35 Se proporcionan composiciones y métodos para el diagnóstico de enfermedades de cuello uterino de alto grado. Los métodos de la invención comprenden detectar la sobreexpresión de al menos dos biomarcadores, MCM2 y Topo 2A en una muestra corporal, en el que la detección de la sobreexpresión de dichos biomarcadores identifica específicamente muestras que son indicativas de enfermedades de cuello uterino de alto grado y en el que dicha detección comprende poner en contacto dicha muestra corporal al menos con tres anticuerpos, en el que un primer y segundo anticuerpo se unen específicamente a MCM2 y un tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A. El presente método distingue muestras que son indicativas de enfermedades de cuello uterino de alto grado de muestras que son indicativas de proliferación benigna, infección por el VPH en fase temprana o displasia leve. Por tanto, el método se basa en la detección de los dos biomarcadores MCM2 y Topo2A que se sobreexpresan de

45 manera selectiva en patologías de cuello uterino de alto grado pero que no se sobreexpresan en células normales o en células que no son indicativas de enfermedades clínicas.

Los biomarcadores en los que se basa la presente invención son las proteínas MCM2 y Topo2A, que se sobreexpresan de manera selectiva en enfermedades de cuello uterino de alto grado, posiblemente como resultado de una disfunción del ciclo celular inducida por el VPH y de una activación de determinados genes responsables de la inducción de la fase S. Los biomarcadores de interés particular incluyen genes de la fase S, cuya sobreexpresión resulta de una disfunción del ciclo celular inducida por el VPH y la activación posterior de los factores transcripcionales SP-1 y E2F. La detección de la sobreexpresión de las proteínas biomarcadoras en las que se basa la presente invención permite la diferenciación de muestras que son indicativas de enfermedades de alto grado,

55 tales como displasia moderada a grave y carcinomas de cuello uterino, de células normales o de células que no son indicativas de enfermedades clínicas (por ejemplo, infección por el VPH en fase temprana sin displasia y displasia leve).

Adicionalmente, se proporcionan técnicas inmunocitoquímicas que utilizan anticuerpos para detectar la sobreexpresión de las dos proteínas biomarcadoras MCM2 y Topo2A en muestras citológicas de cuello uterino. También se proporcionan kits que comprenden reactivos para llevar a la práctica los métodos de la invención.

Los métodos de la invención también pueden usarse en combinación con técnicas de diagnóstico ginecológico tradicional que analizan características morfológicas o estados de infección por el VPH. Por tanto, por ejemplo, los

65 métodos inmunocitoquímicos presentados en el presente documento pueden combinarse con el ensayo de Pap de manera que toda la información morfológica procedente del método convencional se conserva. De esta manera, la detección de biomarcadores que se sobreexpresan de manera selectiva en enfermedades de cuello uterino de alto grado puede reducir el alto índice de negativos falsos del ensayo de Pap y puede facilitar la exploración masiva automatizada.

5 Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona un resumen esquemático de proliferación y desregulación del ciclo celular en displasia de cuello uterino. En la neoplasia de cuello uterino se producen modificaciones del ciclo celular y defectos sobre el control en la proliferación. La infección por el VPH y la sobreexpresión de las oncoproteínas E6 y E7 producen una serie de modificaciones en el ciclo celular y en control de la proliferación. La oncoproteína E6 del VPH anula puntos de control del ciclo celular en los límites G1/S y G2/M con posterior replicación del ADN con mutaciones somáticas. E7 promueve la aceleración en la fase S con expresión prolongada de genes de la fase S necesarios para la replicación del ADN (inducción aberrante de la fase S). Del mismo modo, E6 promueve la expresión de la telomerasa que garantiza la integridad del telómero

15 cromosómico continuada durante la proliferación e inmortalización celular. Por último, E7 anula la ruta de señalización del TGF-beta y anula este mecanismo de control para detener G1 y el control de proliferación.

La Figura 2 proporciona una representación esquemática de la inducción aberrante de la fase S en neoplasia de cuello uterino. El efecto de las proteínas del VPH sobre el control del ciclo celular y la proliferación incluye la activación de las rutas supresoras tumorales p53 y Rb, la activación de transcripción de E2F-1, inducción de los genes MCM-2, MCM-6, MCM-7, TOP2A y Ciclina E1, entre otros, de la fase S. Además, E2 interacciona con el factor de transcripción Sp-1 para activar la expresión génica de p21-waf-1.

La Figura 3 proporciona una representación esquemática del bucle de retroalimentación sobre la proliferación

25 celular en la fase S aberrante del ciclo celular. La sobreexpresión de la Ciclina E y CDK2 en la fase S da como resultado un mecanismo independiente que permite la inducción de los genes de la fase S.

La Figura 4 proporciona una representación esquemática de la función de c-myc en la inducción aberrante de la fase S. C-myc es un activador transcripcional importante en la proliferación celular. El gen que codifica cmyc se localiza en el cromosoma. Existen documentos que indican que este es el mismo sitio que el de la integración del VPH 18 con una amplificación correspondiente de esta región génica. La amplificación del gen c-myc daría como resultado la sobreexpresión de la proteína codificada y los niveles aumentados de c-myc contribuirían independientemente a la transcripción génica en la fase S acelerando adicionalmente la proliferación celular.

35 La Figura 5 proporciona una representación esquemática de cebadores TaqMan® dirigidos a variantes de transcripción de MCM7.

La Figura 6 ilustra el patrón de tinción diferencial de un anticuerpo dirigido contra Claudina 1 en un ensayo IHC (inmunohistoquímico) para una paciente con displasia leve y una paciente con carcinoma de células escamosas.

La Figura 7 ilustra el patrón de tinción diferencial de un anticuerpo dirigido contra Claudina 1 en un formato IHC (inmunohistoquímico) e ICC (inmunocitoquímico). Se muestran células normales y células indicativas de

45 CINIII y HSIL.

La Figura 8 ilustra patrones de tinción nuclear obtenidos con un biomarcador nuclear (es decir, MCM2) y patrones de tinción citoplásmica obtenidos con un biomarcador citoplásmico (p 16). Los resultados proceden de un ensayo inmunocitoquímico (ICC) de una muestra de una paciente con una enfermedad de cuello uterino de alto grado.

La Figura 9 ilustra una tinción deseable y no deseable de anticuerpos en un ensayo inmunohistoquímico (IHC) usando dos anticuerpos diferentes dirigidos contra MCM6 en tejido de cuello uterino procedente de una paciente con una enfermedad de cuello uterino de alto grado.

Descripción detallada de la invención

La invención, en su sentido más amplio, es como se detalla en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona composiciones y métodos para identificar o diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado. Los métodos comprenden la detección de la sobreexpresión de biomarcadores específicos que se sobreexpresan selectivamente en enfermedades de cuello uterino de alto grado (por ejemplo, displasia moderada a grave y cáncer de cuello uterino). Esto es, los biomarcadores son capaces de distinguir entre células infectadas por el VPH y células infectadas por el VPH que son premalignas, malignas o claramente cancerosas. Los 65 métodos para diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado implican detectar la sobreexpresión de al menos un biomarcador lo que es indicativo de una enfermedad de cuello uterino de alto grado en una muestra de

tejido o de líquido corporal procedente de una paciente. Para detectar la expresión del biomarcador de interés se usan anticuerpos y técnicas inmunocitoquímicas. Adicionalmente se proporcionan kits para la realización práctica de los métodos de la invención. La expresión “diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado” significa incluir, por ejemplo, realizar un

5 diagnóstico o detectar la presencia de una enfermedad de cuello uterino, controlando la progresión de la enfermedad e identificando o detectando células o muestras que son indicativas de una enfermedad de cuello uterino de alto grado. En el presente documento, los términos diagnosticar, detectar e identificar una enfermedad de cuello uterino de alto grado se usan indistintamente. Por “enfermedad de cuello uterino de alto grado” se entiende aquellas afecciones clasificadas por colposcopia como patología premaligna, patología maligna, displasia moderada a grave y cáncer de cuello uterino. Básicamente una enfermedad de cuello uterino de alto grado incluye la identificación histológica de CINII, CINIII, HSIL, carcinoma in situ, adenocarcinoma y cáncer (etapas mediante el Sistema de Clasificación FIGO I-IV).

Como se ha indicado anteriormente, un porcentaje significativo de pacientes que presentan frotis de Pap clasificados

15 como normales, CINI o ASCUS realmente poseen lesiones características de una enfermedad de cuello uterino de alto grado. Por tanto, los métodos de la presente invención permiten identificar enfermedades de cuello uterino de alto grado en todas las poblaciones de pacientes, incluyendo aquellas pacientes con “negativos falsos” y facilitar la detección de células anómalas raras procedentes de una muestra de una paciente. El diagnóstico puede realizarse independientemente de la morfología celular y del estado de infección por el VPH, aunque los métodos de la invención también pueden usarse junto con técnicas de diagnóstico convencionales, por ejemplo, ensayo Pap, ensayo molecular para tipos de VPH de alto riesgo, etc.

Los tipos del VPH se han dividido en categorías de alto y bajo riesgo basándose en su asociación con el cáncer de cuello uterino y lesiones precancerosas. Los tipos del VPH de bajo riesgo incluyen los tipos 6, 11, 42, 43, 44 y no 25 están asociados con un riesgo aumentado de cáncer de cuello uterino. Por otro lado, los tipos del VPH de alto riesgo, que incluyen los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, se han asociado estrechamente con cáncer de cuello uterino y con lesiones intraepiteliales escamosas. Véase, por ejemplo, Wright et al (2004) Obstet Gynecol 103:304-309. De hecho, más del 99% de los cánceres de cuello uterino están asociados con infección por el VPH de alto riesgo. La infección persistente por el VPH de alto riesgo conduce a la interrupción del ciclo celular y de los puntos de control de la mitosis en células de cuello uterino a través de la acción de los genes E2, E6 y E7 del VPH. En particular, el E7 del VPH produce un aumento en ciclina E y la liberación posterior del factor de transcripción E2f de la proteína del retinoblastoma (Rb). El factor de transcripción E2f liberado desencadena después la transcripción de una diversidad de genes de la fase S, incluyendo la topoisomerasa II alfa (Topo2A), proteínas MCM, ciclinas E1 y E2 y p14arf, dando como resultado la pérdida del control del ciclo celular. Además, el

35 gen E2 del VPH estimula la sobreexpresión de genes de la fase S tales como p21waf-1 mediante la activación del factor de transcripción Sp-1. La interrupción del ciclo celular causada por infección persistente por el VPH puede conducir a displasia de cuello uterino leve que después puede progresar a displasia moderada o grave y eventualmente, en algunos casos, a cáncer de cuello uterino. Por “cáncer de cuello uterino” se entiende cualquier cáncer o lesión cancerosa asociada con tejido de cuello uterino o células de cuello uterino.

La infección por VPH en queratinocitos del cuello uterino da como resultado una serie de modificaciones que interrumpen las actividades dentro del ciclo celular. Las oncoproteínas E6 y E7 de los subtipos del VPH de alto riesgo se han implicado en una serie de procesos celulares relacionados con una proliferación aumentada y una transformación neoplásica de los queratinocitos infectados. La proteína E6 se ha implicado en dos procesos críticos.

45 El primero es la degradación de la proteína supresora tumoral p53 mediante proteolisis mediada por ubiquitina. La retirada de la p53 funcional elimina un punto de control principal del ciclo celular responsable de la reparación del ADN antes de entrar en la replicación del ADN y en la mitosis (Duensing y Munger (2003) Prog Cell Cycle Res. 5:383-391). Además, se ha demostrado que E6 interacciona con la proteína c-myc y que es responsable de la activación transcripcional directa del gen hTERT con expresión posterior de telomerasa (McMurray y McCance (2003) J Virol. 77:9852-9861; Veldman et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100: 8211-8216). La activación de la telomerasa es una etapa clave en la biología del cáncer responsable del mantenimiento de la longitud del telómero en los cromosomas que se replican y esta enzima garantiza cromosomas funcionalmente intactos durante la inmortalización celular.

55 Se sabe que la oncoproteína E7 del VPH contribuye a la proliferación celular mediante dos mecanismos independientes. El primero es la inactivación de la ruta supresora tumoral del TGF-beta responsable de la detención del ciclo celular en la fase G1 a través de interacción directa de E7 con las proteínas Smad (Smad 2, 3 y 4), inhibiendo de esta manera su capacidad para unirse al ADN (Lee et al. (2002) J Biol Chem. 277:38557-38564). Del mismo modo, se sabe que E7 interacciona específicamente con la proteína supresora tumoral Rb. Dentro de la fase G1 del ciclo celular, Rb forma complejos con el factor de transcripción E2F e impide que E2F active la transcripción génica. En el límite de G1/S, la proteína Rb se fosforila con la liberación del factor de transcripción E2F-iniciando de esta manera la transcripción del gen E2F y la entrada en la fase S del ciclo celular. La oncoproteína E7 del VPH anula este mecanismo de control uniéndose directamente con Rb y desplazando a E2F del complejo. Esto da como resultado la transcripción génica conducida por E2F independientemente del control del ciclo celular normal

65 (Duensing y Munger (2003) Prog Cell Cycle Res. 5:383-391; Duensing y Munger (2004) Int J Cancer 109:157-162; Clarke y Chetty (2001) Gynecol Oncol. 82:238-246). Esta liberación de E2F desacopla la transcripción génica del control del ciclo celular y da como resultado una transcripción prolongada y aberrante de genes de la fase S responsables de la síntesis del ADN y de la proliferación celular. Además, se ha demostrado que las acciones combinadas de E6 y E7 contribuyen a anomalías en el centrosoma y a la posterior inestabilidad genómica en neoplasia de cuello uterino (Duensing y Munger (2004) Int J Cancer 109:157-162).

5 Sin pretender limitarse a ningún mecanismo particular, en algunas realizaciones, el comportamiento molecular de una enfermedad de cuello uterino de alto grado puede caracterizarse como la sobreexpresión de genes específicos, normalmente expresados sólo durante la fase S del ciclo celular, como resultado de infección por cepas oncogénicas del VPH . La activación posterior no controlada de la transcripción génica e inducción aberrante de la fase S está mediada a través de la ruta del factor de transcripción E2F-1. Este comportamiento parece ser indicativo de enfermedad de cuello uterino de alto grado y proporciona una relación entre infecciones oncogénicas por el VPH y el comportamiento molecular de neoplasia de cuello uterino. El uso de estos biomarcadores moleculares de neoplasia de cuello uterino en formatos de ensayo de diagnóstico molecular puede mejorar la detección de enfermedades de cuello uterino con una sensibilidad y especificidad mejoradas sobre los métodos actuales. Véase, en líneas generales, las Figuras 1-4 y Malinowski (2005) BioTechniques 38:1-8 (publicado). Por tanto, un método para

15 diagnosticar una enfermedad de cuello uterino de alto grado comprende detectar la sobreexpresión de un biomarcador, en el que la sobreexpresión del biomarcador es indicativa de una inducción aberrante de la fase S, como se describe en el presente documento. Los métodos comprenden detectar la sobreexpresión de un biomarcador, en el que la sobreexpresión del biomarcador es indicativa de una transcripción o sobreexpresión activa de los genes a E6 y E7 del VPH.

La displasia se define convencionalmente en términos morfológicos por una pérdida de orientación normal de las células epiteliales, acompañada por cambios en cuanto al tamaño, forma y a las características de tinción en el núcleo y en las células. La displasia se clasifica de acuerdo con el grado de anomalías celulares (es decir, leve, moderada, grave) y se acepta ampliamente que es una fase intermedia en el progreso desde tejidos normales a

25 neoplasia, como demuestra la identificación de afecciones displásicas premalignas tales como CIN. Los métodos de la presente invención permiten la identificación de enfermedades de cuello uterino de alto grado, que incluyen displasia moderada a grave y cáncer de cuello uterino (es decir, estados CINII y los citados anteriormente), basándose en la sobreexpresión de los biomarcadores MCM2 y Topo2A que son específicos de enfermedades de cuello uterino de alto grado.

Los métodos descritos en el presente documento proporcionan una mejor detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado en comparación con frotis de Pap y/o ensayos de infección por VPH. En aspectos particulares de la invención, la sensibilidad y especificidad de los métodos de la presente invención son iguales a o superiores que los de los frotis de Pap convencionales. Como se usa en el presente documento, “especificidad” se refiere al 35 nivel al cual un método de la invención puede identificar con precisión muestras que se han confirmado como NIL por colposcopia (es decir negativos verdaderos). Esto es, especificidad es la proporción de negativos a enfermedad que son negativos a ensayo. En un estudio clínico, la especificidad se calcula dividiendo el número de negativos verdaderos entre la suma de negativos verdaderos y positivos falsos. Por “sensibilidad” se entiende el nivel al cual el método de la invención puede identificar con precisión muestras que se han confirmado como positivas por colposcopia para enfermedad de cuello uterino de alto grado (es decir, positivos verdaderos). Por tanto, la sensibilidad es la proporción de positivos a enfermedad que es positivo a ensayo. En un estudio clínico, la sensibilidad se calcula dividiendo el número de positivos verdaderos entre la suma de positivos verdaderos y negativos falsos. Véanse los Ejemplos 1-3 más adelante. En algunas realizaciones, la sensibilidad de los métodos descritos para la detección de una enfermedad de cuello uterino de alto grado es al menos del 90, 91, 92, 93, 94, 95,

45 96, 97, 98, 99% o más. Adicionalmente, la especificidad de los métodos de la presente invención es preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos aproximadamente un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más.

La expresión “valor predictivo positivo” o “VPP” se refiere a la probabilidad de que una paciente posea una enfermedad de cuello uterino de alto grado cuando se limita a esos pacientes que se han clasificado como positivos usando un método de la invención. En un estudio clínico, el VPP se calcula dividiendo el número de positivos verdaderos entre la suma de positivos verdaderos y positivos falsos. En algunas realizaciones, el VPP de un método de la invención, para diagnosticar una enfermedad de cuello uterino de alto grado, es de al menos aproximadamente 40% manteniendo al mismo al tiempo una sensibilidad de al menos 90%, más particularmente al menos 95%. El

55 “valor predictivo negativo” o “VPN” de un ensayo, es la probabilidad de que una paciente no tenga la enfermedad cuando se limita a todos los pacientes que son negativos al ensayo. En un estudio clínico, el VPN se calcula dividiendo el número de negativos verdaderos entre la suma de negativos verdaderos y negativos falsos.

Los biomarcadores descritos en el presente documento incluyen genes y proteínas, y variantes y fragmentos de los mismos. Tales biomarcadores incluyen ADN que comprende la secuencia total o parcial de la secuencia de ácido nucleico que codifica al biomarcador o el complemento de tal secuencia. Los ácidos nucleicos del biomarcador también incluyen ARN que comprende la secuencia total o parcial de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de interés. Una proteína biomarcadora es una proteína codificada por o correspondiente a un biomarcador de ADN. Una proteína biomarcadora comprende la secuencia total o parcial de aminoácidos de cualquiera de las proteínas o

65 polipéptidos biomarcadores.

Un “biomarcador” es cualquier gen o proteína cuyo nivel de expresión en un tejido o célula está modificado en comparación con el de una célula o tejido normal o sano. Los biomarcadores MCM2 y Topo2A, en los que se basa la presente invención, son selectivos para enfermedades de cuello uterino de alto grado subyacentes. Por “sobreexpresado selectivamente en enfermedades de cuello uterino de alto grado” se entiende que el biomarcador 5 de interés se sobreexpresa en enfermedades de cuello uterino de alto grado pero no se sobreexpresa en afecciones clasificadas como LSIL, CINI, muestras infectadas por el VPH sin presencia de displasia, células metaplásicas inmaduras y otras afecciones que no se consideran que son enfermedades clínicas. Por tanto, la detección de los biomarcadores permite la diferenciación de muestras indicativas de enfermedades de cuello uterino de alto grado subyacentes procedentes de muestras que son indicativas de proliferación benigna, infección por el VPH en fase temprana o displasia leve. Por “infección por el VPH en fase temprana” se entiende infección por el VPH que no ha progresado a displasia de cuello uterino. Como se usa en el presente documento, "displasia leve" se refiere a LSIL y CINI donde no está presente ninguna lesión de alto grado. Los métodos de la invención también distinguen células indicativas de enfermedades de alto grado de células normales, células metaplásicas inmaduras y otras células que no son indicativas de enfermedades clínicas. De esta manera, los métodos de la invención permiten identificar con

15 precisión enfermedades de cuello uterino de alto grado, incluso en casos erróneamente clasificados como normales, CINI, LSIL o ASCUS por ensayo Pap tradicional (es decir, “negativos falsos”). En algunas realizaciones, los métodos para diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado se realizan en respuesta a un frotis Pap anómalo o atípico. Es decir, los métodos de la invención pueden realizarse en respuesta a una paciente que posee un resultado de frotis Pap anómalo o atípico. En otros aspectos de la invención, los métodos se realizan como un ensayo de exploración primario para detectar enfermedades de cuello uterino de alto grado en la población general de mujeres, exactamente como actualmente se realiza el ensayo Pap convencional.

Los biomarcadores descritos en el presente documento pueden identificar células, en una suspensión celular citológica, que sean premalignas, malignas o claramente cancerosas. Los biomarcadores en los que se basa la

25 invención detectan células de afecciones CINII y citadas anteriormente, pero no detectan CINI ni células infectadas por el VPH en las que no hay enfermedad de alto grado subyacente. Los biomarcadores descritos en el presente documento incluyen genes y proteínas implicados en la regulación del ciclo celular, interrupción del ciclo celular del VPH, replicación y transcripción del ADN y transducción de señal. Algunos de los biomarcadores descritos en el presente documento son genes de la fase S, incluyendo aquellos genes cuya expresión la estimula el factor de transcripción E2f o el factor de transcripción Sp-1. Para la realización práctica de determinados aspectos de la descripción pueden usarse biomarcadores nucleares. Por “biomarcador nuclear” se entiende un biomarcador que se expresa predominantemente en el núcleo de la célula. Un biomarcador nuclear puede expresarse a un menor grado en otras partes de la célula.

35 Las proteínas de mantenimiento de minicromosomas (MCM) desempeñan una función esencial en la replicación de ADN eucariota. Las proteínas de mantenimiento de minicromosomas (MCM) actúan en las etapas tempranas de la replicación del ADN cargando el complejo pre-replicativo sobre el ADN y actúan como una helicasa para ayudar a desenrollar el ADN dúplex durante la síntesis de novo de la cadena de ADN duplicada. Cada una de las proteínas MCM posee motivos de ATPasa dependientes de ADN en su dominio central altamente conservado. Los niveles de proteínas MCM generalmente aumentan de una manera variable a medida que las células normales avanzan de la fase G0 a la fase G1/S del ciclo celular. En la fase G0, las proteínas MCM2 y MCM5 son mucho menos abundantes que las proteínas MCM7 y MCM3. MCM6 forma un complejo con MCM2, MCM4 y MCM7, que se une a histona H3. Además, el subcomplejo de MCM4, MCM6 y MCM7 posee actividad helicasa, que está mediada por la actividad de unión al ATP de la MCM6 y la actividad de unión al ADN de la MCM4. Véase, por ejemplo, Freeman et al. (1999)

45 Clin. Cancen Res. 5:2121-2132; Lei et al. (2001) J. Cell Sci. 114:1447-1454; Ishimi et al. (2003) Eur. J. Biochem. 270:1089-1101.

Publicaciones antiguas han demostrado que las proteínas MCM, y en particular, la MCM-5, son útiles para detección de enfermedades de cuello uterino (Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:14932-14937), así como de otros cánceres (Freeman et al. (1999) Clin Cancer Res. 5:2121-2132). La bibliografía publicada indica que los anticuerpos contra MCM-5 son capaces de detectar células neoplásicas de cuello uterino. La especificidad para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado no se ha demostrado para la MCM-5 (Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:14932-14937). La detección de la expresión de MCM-5 no está limitada a enfermedades de cuello uterino de alto grado sino que también se detecta en displasia de bajo grado identificada y

55 en células proliferativas que han vuelto a entrar en el ciclo celular después de infección por VPH de alto riesgo. En la Figura 4 se muestra la detección de neoplasia de cuello uterino con anticuerpos contra MCM-5. Además de MCM-5, otros miembros de la familia de MCM, incluyendo MCM-2 y MCM-7, han demostrado ser marcadores potencialmente útiles para la detección de neoplasia de cuello uterino en muestras de tejido (Freeman et al. (1999) Clin Cancer Res. 5:2121-2132; Brake et al. (2003) Cancer Res. 63:8173-8180). Resultados recientes han demostrado que, usando formatos inmunoquímicos, la MCM-7 parece ser un marcador específico para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado (Brake et al. (2003) Cancer Res. 63:8173-8180; Malinowski et al. (2004) Acta Cytol. 43:696).

La topoisomerasa II alfa (Topo2a) es una enzima nuclear esencial implicada en la replicación del ADN y es una

65 diana para muchos fármacos anticancerosos usados para la terapia contra el cáncer. La expresión disminuida de Topo2a es un mecanismo predominante de resistencia frente a diversos agentes quimioterapéuticos. Una variación significativa en el intervalo de expresión de esta proteína se ha observado en muchos tumores diferentes. Topo2a es predominante en células proliferativas y se modifica en la fase M por fosforilación en sitios específicos, lo que es crítico para la condensación y segregación del cromosoma durante la mitosis. La proteína p21 es una proteína codificada por el gen WAF1/Cip1 en el cromosoma 6p. Se ha demostrado que este

5 gen inhibe la actividad de diversos complejos ciclina/quinasa dependientes de ciclina y bloquean la progresión del ciclo celular. La expresión de p21WAF1 media la función de detención del ciclo celular de p53. Dado que p21 parece mediar varias de las funciones reguladoras del crecimiento de p53, su expresión puede reflejar el estado funcional de p53 más exactamente que la acumulación de p53. Además, p21WAF1 puede inhibir la replicación de ADN bloqueando la acción del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA).

La ciclina E es una subunidad reguladora de cdk-2 y controla la transición de G1/S durante el ciclo celular de mamíferos. Isoformas múltiples de Ciclina E se expresan sólo en tumores pero no en tejidos normales, lo que sugiere una regulación post-transcripcional de la Ciclina E. En análisis realizados in vitro se indica que estas isoformas variantes de Ciclina E truncadas pueden fosforilar la histona H1. Modificaciones en proteínas de Ciclina E

15 se han implicado como indicadores de mal pronóstico en diversos cánceres.

Otros biomarcadores de interés incluyen genes regulados por el ciclo celular que son específicos para el límite de la fase G1/S o para la fase S. Tales genes incluyen, pero sin limitación, helicasa (DDX11), uracil ADN glucolasa (UNG), E2F5, ciclina E1 (CCNE1), ciclina E2 (CCNE2), CDC25A, CDC45L, CDC6, p21 WAF-1(CDKN1A), CDKN3, E2F1, MCM2, MCM6, NPAT, PCNA, tallo-lazo PB (SLBP), BRCA1, BRCA2, CCNG2, CDKN2C, dihidrofolato reductasa (DHFR), histona H1, histona H2A, histona H2B, histona H3, histona H4, MSH2, NASP, ribonucleótido reductasa M1 (RRM1), ribonucleótido reductasa M2 (RRM2), timidina sintetasa (TYMS), factor de replicación C4 (RFC4), RAD51, Factor 1A de cromatina (CHAF1A), Factor 1B de cromatina (CHAF1B), topoisomerasa III (TOP3A), ORC1, primasa 2A (PRIM2A), CDC27, primasa 1 (PRIM1), endonucleasa de estructura flap (FEN1), anemia de fanconi comp. grp A

25 (FNACA), PKMYT1 y la proteína de replicación A2 (RPA2). Véase, por ejemplo, Whitfield et al. (2002) Mol. Biol. Cell 13:1977-2000. Otros genes de fase S de interés incluyen quinasa 2 dependiente de ciclina (CDK2), MCM3, MCM4, MCM5, ADN polimerasa I alfa (ADN POL1), ADN ligasa 1, B-Myb, ADN metil transferasa (ADN MET), pericentrina (PER), KIF4, DP-1, ID-3, proteína de unión a RAN (RANBP1), alfa 6 de unión comunicante (GJA6), aminolevulinato deshidratasa (ALDH), histona 2A Z (H2A.Z), espermina sintasa (SpmS), proliferina 2, proteína de activación de linfocitos T, fosfolipasa A2 (PLA2) y antígeno L6 (L6). Véase, por ejemplo, Nevins et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:4689-4699.

También se describen genes biomarcadores que están inducidos por el factor de transcripción E2f. Tales genes incluyen, pero sin limitación, timidilato sintasa, timidina quinasa 1, ribonucleótido reductasa M1, ribonucleótido 35 reductasa M2, CDK2, ciclina E, MCM3, MCM7, PCNA, subunidad pequeña de ADN primasa, topoisomerasa II A (Topo2A), ADN ligasa 1, endonucleasa flap 1, RAD51, CDC2, ciclina A2, ciclina B1, ciclina B2, KI-67, KIFC1, FIN16, BUB1, importina alfa-2, HMG2, potenciador de zeste, STK-1, BP tallo-bucle histona, Rb, P18-INK4C, annexina VIII, c-Myb, CDC25A, ciclina D3, ciclina E1, desoxicitosina quinasa, DP-1, enzima convertidora de endotelina, enolasa 2, P18 INK4C, ribonucleótido reductasa y uracil-ADN-glucolasa 2. Véase, por ejemplo Nevins et al., anteriormente citados; Muller et al. (2000) Genes y Dev. 15:267-285. También se describe un biomarcador de interés que es un gen inducido por el factor de transcripción E2f que está implicado en la regulación del ciclo celular y en la replicación del ADN, tales como, por ejemplo, ciclina E2, Ki-67, p57KIP2, RANBPM y la proteína de replicación A1. Algunos genes de interés inducidos por E2f están implicados en la apóptosis, incluyendo APAF1, Bcl-2, caspasa 3, MAP3 quinasa 5 y el factor asociado al receptor del TNF. Otros genes inducidos por E2f están implicados en la regulación 45 de la transcripción e incluyen, por ejemplo, el polihomeótico 2 similar a ash2, la proteína ectodérmica embrionaria, el potenciador de zeste, hairy/potenciador de división, homeocaja A10, homeocaja A7, homeocaja A9, homeodominio TF1, leucemia pre-cel_Bl FT3, YY1 TF, dominio POU TF, TAFII130, factor TBP 172, TF3 básico, bromodominio/ dedo de zinc, SWI/SNF, ID4, TEA-4, NFATC1, NFATC3, BT, CNC-1, MAF, MAFF, MAFG, proteína de unión al núcleo, factor 4 similar a E74, c-FOS, JUNB, BP ADN dedo de zinc, y transactivador de Cbp/p300. Los genes inducidos por E2f implicados en la transducción de señal también son biomarcadores potenciales de interés e incluyen TGF beta, follistatina, proteína morfogenética ósea 2, receptor de BMP de tipo 1A, homólogo frizzled 1, WNT10B, esfingosina quinasa 1, fosfatasa 7 de especificidad dual, fosfatasa (Y) de especificidad dual, Receptor 3 del FGF, proteína tirosina fosfatasa, fosfatasa (Y) de especificidad dual D6655, receptor de insulina, proliferación 1 de linfocitos T maduros, receptor 2 del FGF , TGF alfa, proteína 3 efectora CDC42, Met, CD58, CD83, TACC1 y

55 TEAD4.

Aunque para la detección de una enfermedad de cuello uterino de alto grado los métodos de la invención requieren la detección de al menos dos biomarcadores MCM2 y Topo2A en una muestra procedente de una paciente, para la realización práctica de la presente invención pueden usarse 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más biomarcadores. Se reconoce que, para identificar casos de enfermedades de cuello uterino de alto grado, en una muestra corporal, puede usarse la detección de más de los dos biomarcadores MCM2 y Topo2A. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se usan más de dos biomarcadores, más preferentemente, más de dos biomarcadores complementarios. Por “complementario” se entiende que la detección de la combinación de biomarcadores en una muestra corporal da como resultado la identificación satisfactoria de una enfermedad de cuello uterino de alto grado con un mayor porcentaje de casos de 65 los que podrían identificarse si sólo se usase uno de los biomarcadores. Por tanto, una determinación más exacta de una enfermedad de cuello uterino de alto grado se realiza usando al menos los dos biomarcadores MCM2 y Topo2A.

Por consiguiente, cuando para la realización práctica de los métodos inmunocitoquímicos descritos en el presente documento se usan al menos dos biomarcadores, se usarán al menos dos anticuerpos dirigidos contra proteínas biomarcadoras distintas. Los anticuerpos pueden ponerse en contacto con la muestra corporal simultánea o conjuntamente. En la invención, la sobreexpresión de MCM2 y de Topo2A se detecta usando tres anticuerpos, en el

5 que dos de los anticuerpos son específicos para MCM2 y el tercer anticuerpo es específico para Topo2A.

Los métodos de diagnóstico de la invención comprenden poner en contacto una muestra corporal, procedente de una paciente, al menos con tres anticuerpos, en el que un primer y un segundo anticuerpo se unen específicamente a MCM2 y un tercer anticuerpo se une a Topo2A y detectar la unión de los anticuerpos. Las muestras que presentan sobreexpresión de los biomarcadores MCM2 y Topo2A, determinada por la detección de la unión de los anticuerpos, se consideran positivas para una enfermedad de cuello uterino de alto grado. En realizaciones particulares, la muestra corporal es una monocapa de células de cuello uterino. En algunos aspectos de la invención, la monocapa de células de cuello uterino se proporciona en un portaobjetos de vidrio.

15 Por “muestra corporal” se entiende cualquier muestreo de células, tejidos o líquidos corporales en los que pueda detectarse la expresión de un biomarcador. Son ejemplos de tales muestras corporales los que incluyen, pero sin limitación, sangre, linfa, orina, líquidos ginecológicos, biopsias y frotis. Las muestras corporales pueden obtenerse de una paciente mediante una diversidad de técnicas que incluyen, por ejemplo, raspado o frotis de un área o usando una aguja para aspirar líquidos corporales. En la materia se conocen bien métodos para recoger diversas muestras corporales. En realizaciones particulares, la muestra corporal comprende células de cuello uterino, como muestras de tejido de cuello uterino o como células en suspensión de cuello uterino, particularmente en una preparación basada en líquido. En una realización, las muestras de cuello uterino se recogen siguiendo las directrices de preparación de especímenes citológicos basados en líquido, tales como, por ejemplo, la preparación SurePath® (TriPath Imaging, Inc.) o ThinPrep® (CYTYC, Inc.). Las muestras corporales pueden transferirse a un

25 portaobjetos de vidrio para observar al microscopio. En el portaobjetos de vidrio a las células pueden aplicarse soluciones fijadoras y colorantes para conservar el espécimen y para facilitar el examen. En una realización, la muestra de cuello uterino se extraerá y se procesará para proporcionar una muestra en monocapa, como se expone en la Patente de Estados Unidos Nº 5.346.831.

El método en monocapa se refiere a un método que produce una monocapa de material citológico sobre un sustrato cargado con cationes. El método comprende las etapas de separar el material citológico por centrifugación sobre un gradiente de densidad, producir un sedimento compacto del material citológico, mezclar el sedimento del material citológico, extraer una alícuota de un volumen predeterminado del sedimento mixto, depositar la alícuota y un volumen predeterminado de agua en un recipiente de sedimentación, que puede fijarse de manera extraíble al

35 sustrato cargado con cationes, permitiendo que -debido a la fuerza gravedad-el material citológico se asiente sobre el sustrato, y después del asentamiento del material citológico, eliminar el agua del recipiente de sedimentación. Para un análisis automatizado, el recipiente de sedimentación puede desprenderse del sustrato. La desagregación puede realizarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la materia, tal como mediante inyección con jeringa, tripsinización, ultrasonido, agitación, agitación vorticial o usando el dispositivo descrito en la Patente relacionada de Estados Unidos 5.316.814. En algunas realizaciones, los portaobjetos que comprenden una monocapa de células de cuello uterino se preparan a partir de muestras SurePath™ (TriPath Imaging, Inc.) usando el procesador de portaobjetos PrepStain™ (TriPath Imaging, Inc.).

La sobreexpresión de un biomarcador puede detectarse sobre un nivel de ácido nucleico o de proteína. Para

45 determinar la sobreexpresión, la muestra corporal a examinar puede compararse con una muestra corporal correspondiente que se origina de una persona sana. Es decir, el nivel de expresión “normal” es el nivel de expresión del biomarcador en las células de cuello uterino de un sujeto humano o de una paciente que no padece una enfermedad de cuello uterino de alto grado. Tal muestra puede estar presente en forma convencional. En algunas realizaciones, particularmente cuando la muestra corporal comprende una monocapa de células de cuello uterino, la determinación de la sobreexpresión del biomarcador no requiere la comparación entre la muestra corporal y una muestra corporal correspondiente que se origina de una persona sana. En esta situación, la monocapa de células de cuello uterino de un solo paciente puede contener solo 1-2 células anómalas por 50.000 células normales presentes. La detección de estas células anómalas, identificadas por la sobreexpresión de los biomarcadores MCM2 y Topo2A, excluye la necesidad de comparar con una muestra corporal correspondiente que se origina de una

55 persona sana.

Los métodos para detectar biomarcadores comprenden cualquiera de los métodos que determinen la cantidad o la presencia de los biomarcadores bien a nivel de ácido nucleico o bien a nivel de proteína. Tales métodos se conocen bien en la materia e incluyen, pero sin limitación, transferencias de western, transferencias de Northern, transferencias de Southern, ELISA, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, citometría de flujo, inmunocitoquímica, técnicas de hibridación de ácido nucleico, métodos de transcripción inversa de ácido nucleico y métodos de amplificación de ácido nucleico. De acuerdo con la invención, la sobreexpresión de los biomarcadores MCM2 y Topo2A se detecta a nivel de proteína usando anticuerpos que se dirigen contra estas proteínas biomarcadoras específicas. Estos anticuerpos pueden usarse en diversos métodos tales como transferencia de 65 Western, ELISA, inmunoprecipitación o técnicas de inmunocitoquímica. Del mismo modo, la inmunotinción de frotis de cuello uterino puede combinarse con métodos de tinción Pap convencionales de manera que pueda obtenerse

información morfológica e información inmunocitoquímica. De esta manera, la detección de los biomarcadores puede reducir el elevado índice de negativos falsos del ensayo del frotis Pap y puede facilitar la exploración masiva automatizada. De acuerdo con la invención, los al menos tres anticuerpos específicos para las proteínas biomarcadoras MCM2 y

5 Topo2A se utilizan para detectar la sobreexpresión de dichas proteínas biomarcadores en una muestra corporal. El método comprende poner en contacto una muestra corporal de una paciente al menos con tres anticuerpos, en el que un primer y segundo anticuerpo se unen específicamente a MCM2 y un tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A, que son biomarcadores sobreexpresados selectivamente en enfermedades de cuello uterino de alto grado y detectar la unión de los anticuerpos para determinar si los biomarcadores se sobreexpresan en la muestra del paciente. Un aspecto preferido de la invención proporciona una técnica inmunocitoquímica para el diagnóstico de enfermedades de cuello uterino de alto grado. Un experto en la materia reconocerá que el método inmunocitoquímico descrito a continuación en el presente documento puede realizarse manualmente o de una manera automatizada usando, por ejemplo, el Sistema de Tinción Universal Autostainer (Dako) o el Biocare Nemesis Autostainer (Biocare). En el Ejemplo 1 se proporciona un protocolo para la tinción de anticuerpos (es decir,

15 inmunocitoquímica) de muestras de cuello uterino.

En un método inmunocitoquímico, en un medio líquido, tal como, por ejemplo, en un vial de recogida SurePath™ (TriPath Imaging, Inc.) se recoge una muestra de cuello uterino de una paciente. Para recoger células procedentes del medio líquido y para depositarlas en una capa fina sobre un portaobjetos de vidrio para análisis posterior se usa un procesador automatizado, tal como el sistema PrepStain™ (TriPath Imaging, Inc.). Los especímenes del portaobjetos pueden fijarse o no y pueden analizarse inmediatamente después de la preparación o pueden conservarse para análisis posterior. Los portaobjetos preparados pueden conservarse en etanol al 95% durante un mínimo de 24 horas. Como alternativa, los portaobjetos pueden conservarse en un tampón de tratamiento previo tal y como se describe más adelante.

25 Puede ser necesario modificar las muestras para hacer que los antígenos biomarcadores sean accesibles a la unión del anticuerpo. En un aspecto particular de los métodos inmunocitoquímicos, los portaobjetos se transfieren a un tampón de tratamiento previo, por ejemplo el Tampón de Preparación SureSlide® (TriPath Imaging, Inc.) y opcionalmente se calientan para aumentar la accesibilidad del antígeno. El calentamiento de la muestra en el tampón de tratamiento previo altera rápidamente la bicapa lipídica de las células y hace que los antígenos (es decir las proteínas biomarcadoras) sean más accesibles para la unión del anticuerpo. El tampón de tratamiento previo puede comprender un polímero, un detergente, o un tensioactivo no iónico o aniónico, tal como, por ejemplo, un tensioactivo aniónico o no aniónico etoxilado, un alcanoato o un alcoxilato o incluso mezclas de estos tensioactivos incluso el uso de una sal biliar. El tampón de tratamiento previo puede comprender un detergente no iónico o

35 aniónico, tal como alcanoato sódico con un peso molecular aproximado de 183 kD mezclado con un alcoxilato con un peso molecular aproximado de 370 kD (en lo sucesivo el presente documento denominado RAM). El tampón de tratamiento previo puede comprender RAM al 1%. El tampón de tratamiento previo también puede usarse como un tampón de conservación de portaobjetos, como se ha indicado anteriormente. Puede usarse una solución del 0,1% al 1% de ácido desoxicólico, sal de sodio, monohidrato tanto para un tampón de conservación así como para un tampón de tratamiento previo. Para los tampones de conservación y de tratamiento previo, puede usarse una solución de laureth-13-carboxilato sódico (por ejemplo Sandopan LS) o un complejo aniónico etoxilado o incluso un ácido carboxílico alquilaril etoxilado. El tampón de tratamiento previo para portaobjetos puede comprender del 0,05% al 5% de laureth-13-carboxilato sódico, particularmente del 0,1% al 1% de laureth-13-carboxilato sódico, más particularmente el 0,5% de laureth-13-carboxilato sódico. Los portaobjetos pueden conservarse en el tampón

45 durante un tiempo de hasta 72 horas antes del proceso de tratamiento previo y de tinción. En un inmunoensayo, tal como, por ejemplo, un método inmunocitoquímico o inmunohistoquímico, los tampones de tratamiento previo pueden usarse en métodos para hacer que los antígenos sean más accesibles para la unión del anticuerpo. Véase el Ejemplo 14. Las expresiones “tampón de tratamiento previo” y “tampón de preparación” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un tampón que se usa para preparar muestras citológicas o histológicas para inmunotinción, particularmente aumentando la accesibilidad del antígeno para la unión del anticuerpo.

En la realización práctica de la invención puede usarse cualquier método para hacer que los antígenos sean más accesibles para la unión del anticuerpo, incluyendo los métodos de recuperación de antígenos conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, Bibbo et al. (2002) Acta. Cytol. 46: 25-29; Saqi et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:

55 365-370; Bibbo et al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25: 8-11. En algunas realizaciones, la recuperación de antígenos comprende conservar los portaobjetos en etanol al 95% durante al menos 24 horas, sumergir los portaobjetos en un baño de Solución de Recuperación Diana 1X, pH 6,0, (DAKO S1699)/dH2O precalentado a 95 ºC y colocar los portaobjetos en un vaporizador durante 25 minutos. Véase el Ejemplo 2 más adelante.

Después del tratamiento previo o de la recuperación del antígeno para aumentar la accesibilidad del antígeno, las muestras se bloquean usando un agente bloqueador apropiado, por ejemplo, un reactivo bloqueador de peroxidasa tal como peróxido de hidrógeno. En algunas realizaciones, para impedir la unión no específica del anticuerpo, las muestras se bloquean usando un reactivo bloqueador de proteína. El reactivo bloqueador de proteína puede comprender, por ejemplo, caseína purificada. Después, un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal,

65 dirigido contra un biomarcador de interés, se incuba con la muestra. Como se ha indicado anteriormente, un experto en la materia apreciará que, en algunos casos, puede obtenerse un diagnóstico más preciso de una enfermedad de cuello uterino de alto grado, detectando más de un biomarcador en una muestra de una paciente. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, para detectar una enfermedad de cuello uterino de alto grado se usa al menos tres anticuerpos, en el que un primer y segundo anticuerpo se unen específicamente a MCM2 y un tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A. Cuando se usa más de un anticuerpo, estos anticuerpos pueden añadirse a una

5 sola muestra secuencialmente como reactivos de anticuerpos individuales o de manera simultánea como un cóctel de anticuerpos. Véase el Ejemplo 3 más adelante. Como alternativa, cada anticuerpo individual puede añadirse a una muestra específica del mismo paciente y agruparse los datos resultantes. En realizaciones particulares, un cóctel de anticuerpos comprende al menos los tres anticuerpos, en el que dos anticuerpos se unen específicamente a MCM2 y un tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A.

10 En la materia se conocen bien técnicas para detectar la unión de anticuerpos. La unión de anticuerpos a un biomarcador de interés puede detectarse usando reactivos químicos que generan una señal detectable que corresponde al nivel de unión del anticuerpo y, por consiguiente, al nivel de expresión de proteína biomarcadora. En uno de los métodos inmunocitoquímicos de la invención, la unión al anticuerpo se detecta usando un anticuerpo

15 secundario que se conjuga con un polímero marcado. Los ejemplos de polímeros marcados incluyen, pero sin limitación, conjugados de polímero-enzima. Las enzimas, en estos complejos, se usan típicamente para catalizar la deposición de un cromógeno en el sitio de unión del antígeno al anticuerpo, por lo que da como resultado una tinción celular que corresponde al nivel de expresión del biomarcador de interés. Las enzimas de interés particular incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP) y fosfatasa alcalina (AP). Para la realización práctica de la presente invención

20 pueden usarse sistemas de detección de anticuerpos comerciales, tales como, por ejemplo, el sistema Envision+ de Dako y el sistema Mach 3 de Biocare Medical.

En un método inmunocitoquímico particular de la invención, la unión de anticuerpos a un biomarcador se detecta usando un polímero marcado con HRP que está conjugado a un anticuerpo secundario. La unión al anticuerpo

25 también puede detectarse usando un reactivo sonda de ratón, que se une a anticuerpos monoclonales de ratón y un polímero conjugado a HRP, que se une al reactivo sonda de ratón. Los portaobjetos se tiñen para la unión del anticuerpo usando el cromógeno 3,3-diaminobencidina (DAB) y después se tiñen con un colorante de contraste con hematoxilina y, opcionalmente, con un agente colorante azul tal como hidróxido de amonio o TBS/Tween-20. En algunos aspectos de la invención, un citólogo y/o un patólogo observa los portaobjetos al microscopio para evaluar

30 la tinción celular (es decir, la sobreexpresión del biomarcador) y para determinar si existe una enfermedad de cuello uterino de alto grado. Como alternativa, las muestras pueden observarse por microscopía automatizada o por personal con la ayuda de un programa informático por ordenador que facilita la identificación de células con tinción positiva.

35 Los términos “anticuerpo” y “anticuerpos” incluyen ampliamente formas de origen natural de anticuerpos y anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos y humanizados y anticuerpos multiespecíficos así como fragmentos y derivados de todo lo anterior, cuyos fragmentos y derivados poseen al menos un sitio de unión antigénico. Los derivados de anticuerpo pueden comprender una proteína o un resto químico conjugado al anticuerpo.

40 Los “anticuerpos” y las “inmunoglobulinas” (Igs) son glucoproteínas que poseen las mismas características estructurales. Si bien los anticuerpos muestran una especificidad de unión hacia un antígeno, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad hacia un antígeno. Los polipéptidos de esta última clase se producen, por ejemplo, a bajos niveles por el sistema linfático y a altos

45 niveles por los mielomas.

El término “anticuerpo” se usa en su sentido más amplio e abarca anticuerpos totalmente ensamblados, fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a un antígeno (por ejemplo, Fab’, F’(ab)2, Fv, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos) y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores.

50 La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades mínimas.

55 Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión a antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); moléculas de anticuerpo monocatenario y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de

60 anticuerpo. La digestión de los anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión al antígeno y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar rápidamente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab’)2 que posee dos sitios de combinación con el antígeno y todavía es capaz de presentar reacción cruzada con el antígeno.

65 “Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión al antígeno completo. En una especie Fv bicatenaria, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en íntima asociación no covalente. En una especie Fv monocatenaria, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden estar unidos covalentemente por un conector peptídico flexible de manera

5 que las cadenas pesada y ligera pueden asociarse en una estructura dimérica “análoga” a la de una especie Fv bicatenaria. Es en esta configuración en la que tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión al antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. En su conjunto, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene una capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque con una menor afinidad a la del sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab’ por la adición de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del

15 anticuerpo. En la presente memoria, Fab’-SH es la denominación para Fab’ en el que el resto (o los restos) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab’ que poseían entre ellos cisteínas de la región bisagra.

Los anticuerpos policlonales pueden prepararse inmunizando un sujeto adecuado (por ejemplo, un conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con un inmunógeno de proteína biomarcadora. La titulación del anticuerpo en el sujeto inmunizado puede monitorizarse con el paso del tiempo mediante técnicas convencionales, tales como con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando una proteína biomarcadora inmovilizada. A un tiempo apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando las titulaciones del anticuerpo son más elevadas, las células productoras de anticuerpos pueden obtenerse a partir del sujeto y usarse para preparar anticuerpos

25 monoclonales por técnicas convencionales, tales como la técnica del hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4: 72), la técnica del hibridoma de EBV (Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld y Sell (Alan R. Liss, Inc., Nueva York, NY), págs. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas se conoce bien (véase, en líneas generales, Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY); Galfre et al. (1977) Nature 266: 550-52; Kenneth (1980) in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY); y Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 387-402).

Como alternativa a la preparación de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal

35 puede identificarse y aislarse explorando una biblioteca de inmunoglobulinas combinatoria recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación de anticuerpos en fagos) con una proteína biomarcadora para aislar así miembros de la biblioteca de inmunoglobulina aislados que se unen a la proteína biomarcadora. En el mercado se encuentras disponibles kits para generar y explorar bibliotecas de presentación de fagos (por ejemplo, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; y the Stratagene SurfZAP9 Phage Display Kit, Catalog No. 240612). Adicionalmente, ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para usar en la generación y exploración de bibliotecas de presentación de anticuerpos pueden encontrarse, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; en las Publicaciones PCT Nº WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; y 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281;

45 Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734.

La detección de la unión de anticuerpos puede facilitarse acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina, ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriacinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales luminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de materiales

55 radioactivos adecuados incluyen 125l, 131l, 35S, o 3H.

Con respecto a la detección de la tinción de anticuerpos en los métodos inmunocitoquímicos de la invención, también existen en la materia, métodos vídeo microscópicos e informáticos para la determinación cuantitativa de una cantidad de especies moleculares múltiples (por ejemplo, proteínas biomarcadoras) en una muestra biológica en la que cada especie molecular presente se indica por un marcador colorante representativo que posee un color específico. Tales métodos también se conocen en la materia como métodos de análisis colorimétrico. En estos métodos, para proporcionar una imagen de la muestra biológica después de que se ha teñido, se usa la vídeo microscopia para indicar visualmente la presencia de un biomarcador de interés particular. Algunos de estos métodos, tales como los descritos en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 09/957.446 de Marcelpoil et al. y en 65 la Solicitud de Patente de Estados Unidos 10/057.729 de Marcelpoil et al., describen el uso de un sistema de formación de imágenes y un programa informático asociado para determinar las cantidades relativas de cada

especie molecular presente basándose en la presencia de marcadores de tinte de color representativos como se indica por los valores de densidad óptica o transmitancia de los marcadores de tinte de color, respectivamente, determinado por un sistema de formación de imágenes y programas informáticos asociados. Estas técnicas proporcionan determinaciones cuantitativas de las cantidades relativas de cada especie molecular en una muestra

5 biológica teñida usando una sola imagen de vídeo que se “deconstruye” en sus partes de componente de color.

Los anticuerpos usados para la realización práctica de la invención se seleccionan por tener alta especificidad por las proteínas biomarcadoras de interés. En la materia se conocen métodos para preparar anticuerpos y para seleccionar anticuerpos apropiados. Véase, por ejemplo, Celis, ed. (publicado) Cell Biology & Laboratory Handbook, 3ª edición (Academic Press, Nueva York). En algunas realizaciones, para la realización práctica de la invención pueden usarse anticuerpos comerciales dirigidos contra proteínas biomarcadoras específicas. Los anticuerpos de la invención pueden seleccionarse basándose en la tinción deseable de muestras citológicas, en lugar de histológicas. Esto es, en realizaciones particulares los anticuerpos se seleccionan teniendo en cuenta el tipo de muestra final (es decir, preparaciones citológicas) y la especificidad de unión.

15 Los anticuerpos dirigidos contra biomarcadores específicos de interés pueden seleccionarse y purificarse mediante un proceso de exploración multietapa. Pueden explorarse polidomas para identificar anticuerpos específicos de biomarcadores que posean los rasgos de especificidad y sensibilidad deseados. Como se usa en el presente documento, "polidoma" se refiere a hibridomas múltiples. Los polidomas se proporcionan típicamente en placas de cultivo tisular multipocillo. En la etapa inicial de exploración de anticuerpos, se genera una micromatriz tisular tumoral que comprende muestras múltiples, normales (es decir, no CIN), CINIII, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma. En la materia se conocen bien métodos y equipos, tales como Chemicon® Advanced Tissue Arrayer, para generar matrices de tejidos múltiples en un solo portaobjetos. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.820.504. Los sobrenadantes no diluidos de cada pocillo que contienen un polidoma se someten

25 a ensayo para detectar la tinción positiva usando técnicas inmunohistoquímicas convencionales. En esta etapa de exploración inicial, la unión no específica, fondo, básicamente se ignora. Los polidomas que producen resultados positivos se seleccionan y se usan en la segunda fase de exploración de anticuerpos.

En la segunda etapa de exploración, los polidomas positivos se someten a un proceso de dilución limitante. Los anticuerpos no explorados resultantes se someten a ensayo para detectar la tinción positiva de muestras de CINIII o carcinoma de cuello uterino usando técnicas inmunohistoquímicas convencionales. En esta fase, la tinción de fondo es relevante y solo se seleccionan los polidomas candidatos con tinción positiva para células anómalas (es decir, células CINIII y cancerosas) para análisis posterior.

35 Para identificar anticuerpos que puedan distinguir muestras normales y CINI de las que son indicativas de enfermedad de cuello uterino del alto grado (es decir, CINII y anteriores), se genera un micromatriz tisular de tipo panel de enfermedades. Esta micromatriz tisular comprende típicamente muestras múltiples no CIN, CINI, CINII, CINIII, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma. Las técnicas inmunohistoquímicas convencionales se emplean para someter a ensayo polidomas candidatos para detectar tinción positiva específica solo de muestras indicativas de enfermedades de cuello uterino de alto grado (es decir, muestras CINII y anteriores). Los polidomas que producen resultados positivos y tinción de fondo mínima se seleccionan para análisis posterior.

Los cultivos de tinción positiva se preparan como clones individuales para seleccionar anticuerpos monoclonales candidatos individuales. En la materia se conocen bien métodos para aislar clones individuales. El sobrenadante de

45 cada clon que comprende anticuerpos no purificados se somete a ensayo para detectar tinción específica de muestras CINII, CINIII, carcinoma de célula escamosa y adenocarcinoma usando las micromatrices tisulares de tipo panel tumorales y de enfermedades descritas anteriormente en el presente documento. Los anticuerpos candidatos que muestran tinción positiva de muestras de enfermedad de cuello uterino de alto grado (es decir, CINII y anteriores), tinción mínima de otros tipos de células (es decir muestras normales y CINI) y escaso fondo se seleccionan para purificación y análisis posterior. En la materia se conocen bien métodos para purificar anticuerpos mediante cromatografía de adsorción por afinidad.

Para identificar anticuerpos que presenten tinción específica máxima de muestras de enfermedad de cuello uterino de alto grado y tinción no específica, de escaso fondo, en muestras citológicas de tinción no específica, los

55 anticuerpos candidatos aislados y purificados en los procesos de exploración anteriores, basados en inmunohistoquímica, se someten a ensayo usando técnicas inmunocitoquímicas. En los Ejemplos 1 y 2 se proporcionan protocolos ejemplares para realizar inmunocitoquímica.

Específicamente, los anticuerpos de interés purificados se usan para someter a ensayo un número estadísticamente significativo de muestras NIL (es decir, lesión no invasiva), ASCUS, LSIL, HSIL o de pacientes con citología de cuello uterino cancerosa. Las muestras se analizan por inmunocitoquímica, como se describe en el presente documento, y se clasifican como positivas, negativas o indeterminadas para una enfermedad de cuello uterino de alto grado basándose en la tinción de anticuerpo positiva para un biomarcador particular. Los valores de sensibilidad, especificidad, predictivos positivos y predictivos negativos para cada anticuerpo se calculan. Se 65 seleccionan los anticuerpos que muestran una tinción específica máxima de enfermedad de cuello uterino de alto grado en muestras citológicas de cuello uterino con fondo mínimo (es decir, proporción de señal con respecto a

interferencia máxima).

La identificación de anticuerpos apropiados da como resultado un aumento en la proporción de señal con respecto a interferencia y un aumento en la utilidad clínica del ensayo. El formato de ensayo y el tipo de muestra a usar son 5 factores críticos en la selección de anticuerpos apropiados. Muchos anticuerpos dirigidos contra biomarcadores no producen una proporción de señal con respecto a interferencia deseable en un formato inmunocitoquímico con preparaciones citológicas o en un formato inmunohistoquímico con muestras incluidas en parafina fijadas con formalina. Además, los anticuerpos biomarcadores que producen una proporción de señal con respecto a interferencia máxima en un formato inmunohistoquímico no pueden funcionar tan bien en ensayos inmunocitoquímicos. Por ejemplo, un anticuerpo que produce el nivel de tinción deseado en un formato inmunocitoquímico puede no producir el nivel de tinción apropiado en un ensayo inmunohistoquímico (datos no mostrados). Del mismo modo, un anticuerpo que produce una proporción aceptable de señal con respecto a interferencia, cuando se usa en el ensayo inmunohistoquímico, puede dar como resultado una sobretinción de las muestras inmunocitoquímicas (datos no mostrados). Por tanto, la selección del anticuerpo requiere una primera

15 consideración del formato de ensayo y del tipo de muestra final a usar.

Los análisis basados en citología (es decir, inmunocitoquímica) se diferencian de los ensayos basados en tejidos (es decir, inmunohistoquímica) en la medida en que la arquitectura tisular no esté disponible para ayudar en la interpretación de la tinción en el formato inmunocitoquímico. Por ejemplo, en un ensayo inmunohistoquímico realizado en muestras procedentes de pacientes con displasia leve o carcinoma de células escamosas con un anticuerpo dirigido contra Claudina 1, el resultado indicó que la Claudina 1 se expresaba en la lesión de la muestra de displasia leve (es decir, tinción de color marrón claro) pero se sobreexpresó significativamente (es decir, tinción de color marrón oscuro) en la lesión cancerosa (Figura 12). Los resultados obtenidos con el mismo anticuerpo dirigido contra Claudina 1 en un formato de ensayo inmunocitoquímico fueron indeterminados (Figura 13). Aunque

25 las células anómalas se detectan fácilmente usando un anticuerpo dirigido contra Claudina 1 en un ensayo inmunohistoquímico, el resultado obtenido por la tinción de Claudina 1 en el ensayo inmunocitoquímico es más difícil de interpretar. Por lo tanto, los biomarcadores que son apropiados en un formato inmunohistoquímico pueden no ser adecuados en un ensayo inmunocitoquímico y, por tanto, no se incluyen en la realización preferida de la presente invención.

Adicionalmente, la localización de los biomarcadores en la célula también es una consideración importante en ensayos inmunocitoquímicos. Los biomarcadores que presentan patrones de tinción nuclear, citoplásmica o de membrana pueden confirmarse morfológicamente y son apropiados para métodos inmunohistoquímicos. La tinción citoplásmica y de membrana, sin embargo, hace difícil identificar características morfológicas críticas de la

35 enfermedad de cuello uterino (por ejemplo, proporción de tinción nuclear respecto a citoplásmica) en ensayos inmunocitoquímicos. Véase la Figura 15. En cambio, los biomarcadores que se expresan en el núcleo y que presentan un modelo de tinción nuclear facilitan la detección de la tinción del anticuerpo y también permiten realizar análisis morfológicos. Véase la Figura 15. Por tanto, en un ensayo inmunocitoquímico de la presente invención, solo se usan biomarcadores que se expresan selectivamente en el núcleo.

Un experto en la materia reconocerá que, para maximizar la proporción de señal con respecto a interferencia para un anticuerpo particular, es necesario maximizar la optimización de la titulación y la detección química del anticuerpo. Las concentraciones de anticuerpo que maximizan la unión específica a los biomarcadores y minimizan la unión no específica (o “fondo”) se determinarán. En realizaciones particulares, las titulaciones de anticuerpos

45 apropiadas para su uso en preparaciones citológicas de cuello uterino se determinan inicialmente sometiendo a ensayo diversas diluciones de anticuerpo en muestras tisulares normales y de enfermedad de cuello uterino de alto grado, incluidas en parafina fijadas en formalina. Las concentraciones óptimas de anticuerpo y las condiciones químicas de detección se determinan en primer lugar para las muestras tisulares de cuello uterino incluidas en parafina fijadas en formalina. El diseño de ensayos para optimizar la titulación de anticuerpos y las condiciones de detección es convencional y se encuentra bien dentro de las habilidades rutinarias de los expertos habituales en la materia. Después de determinar las condiciones óptimas para las muestras tisulares fijadas, cada anticuerpo se usa después en preparaciones citológicas de cuello uterino en las mismas condiciones. Algunos anticuerpos requieren optimización adicional para reducir la tinción de fondo y/o para aumentar la especificidad y sensibilidad de la tinción en las muestras citológicas.

55 Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá que la concentración de un anticuerpo particular usado para la realización práctica de los métodos de la invención variará dependiendo de factores tales como el tiempo para la unión, el nivel de especificidad del anticuerpo por la proteína biomarcadora y el método de la preparación de la muestra corporal. Además, cuando se usan anticuerpos múltiples, la concentración necesaria puede estar afectada por el orden en el que se aplican los anticuerpos a la muestra, es decir, simultáneamente como un cóctel o secuencialmente como reactivos de anticuerpos individuales. Además, la detección química usada para visualizar la unión del anticuerpo a un biomarcador de interés también debe optimizarse para producir la proporción de señal con respecto a interferencia deseada.

65 La expresión de un biomarcador de interés puede detectarse a nivel de ácido nucleico. Las técnicas basadas en ácido nucleico para evaluar la expresión se conocen bien en la materia e incluyen, por ejemplo, determinar el nivel de ARNm biomarcador en una muestra corporal. Muchos métodos de detección de expresión usan ARN aislado. Para la purificación de ARN procedente de células de cuello uterino puede utilizarse cualquier técnica de aislamiento de ARN que no se seleccione contra el aislamiento del ARNm (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Nueva York). Adicionalmente, gran cantidad de muestras

5 tisulares pueden procesarse fácilmente usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el proceso se aislamiento de ARN de una sola etapa de Chomczynski (1989, Patente de Estados Unidos Nº 4.843.155).

El término “sonda” se refiere a cualquier molécula que sea capaz de unirse selectivamente a una biomolécula diana específicamente deseada, por ejemplo, un transcrito nucleotídico o una proteína codificada por, o que corresponde a, un biomarcador. Un experto en la materia puede sintetizar sondas o estas pueden derivar de preparaciones biológicas apropiadas. Las sondas pueden diseñarse específicamente para marcarse. Los ejemplos de moléculas que pueden utilizarse como sondas incluyen, pero sin limitación, ARN, ADN, proteínas, anticuerpos, y moléculas orgánicas.

15 El ARNm aislado puede usarse en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero sin limitación, análisis de Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa y matrices de sondas. Un método para la detección de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridarse con el ARNm codificado por el gen a detectar. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa o una parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente en condiciones rigurosas con un ARNm o ADN genómico que codifica un biomarcador. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que el biomarcador en cuestión va a expresarse.

25 El ARNm se inmoviliza en una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo procesando el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm desde el gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. Como alternativa la sonda (o sondas) se inmoviliza en una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la sonda (o sondas) por ejemplo, en una matriz de placa génica Affymetrix. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente métodos de detección de ARNm conocidos para su uso en la detección del nivel de ARNm codificado por los biomarcadores.

Un método alternativo para determinar el nivel de ARNm codificado por el biomarcador en una muestra implica el proceso de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, por RT-PCR (la realización experimental expuesta en Mullis, 1987,Pat. de Estados Unidos No. 4.683.202), reacción en cadena de la ligasa (Barany (1991) Proc. Natl.

35 Acad. Sci. USA 88: 189-193), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), Q-Beta Replicasa (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6: 1197), replicación de enrollamiento circular (Lizardi et al., Patente de Estados Unidos No. 5.854.033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en muy pequeñas cantidades. La expresión del biomarcador puede evaluarse por RT-PCR flourogénica cuantitativa (es decir, el Sistema TaqMan®). Tales métodos utilizan típicamente pares de cebadores oligonucleotídicos que son específicos para el biomarcador de interés. En la materia se conocen bien métodos para diseñar cebadores oligonucleotídicos específicos para una secuencia conocida.

45 Los niveles de expresión del ARN del biomarcador pueden controlarse usando una transferencia de membrana (tal y como se usa en análisis de hibridación tales como de Northern, Southern, puntual y similares) o micropocillos, tubos de muestra, geles, perlas o fibras (o cualquier soporte sólido que comprenda ácidos nucleicos unidos). Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.770.722, 5.874.219, 5.744.305, 5.677.195 y 5.445.934. La detección de la expresión del biomarcador también puede comprender el uso de sondas de ácido nucleico en solución.

Para detectar expresión de biomarcadores pueden usarse micromatrices. Las micromatrices son particularmente muy adecuadas para este fin debido a su reproducibilidad entre diferentes experimentos. Las micromatrices de ADN proporcionan un método para la medición simultánea de los niveles de expresión de grandes cantidades de genes.

55 Cada matriz consiste en un patrón reproducible de sondas de captura unidas a un soporte sólido. El ARN o ADN marcado se hibrida con sondas complementarias sobre la matriz y después se detecta por escáner láser. Las intensidades de hibridación para cada sonda en la matriz se determinan y se convierten en un valor cuantitativo que representa niveles de expresión de genes relativos. Véanse, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.040.138,

5.800.992 y 6.020.135, 6.033.860, y 6.344.316. Las matrices de oligonucleótidos de alta densidad son particularmente útiles para determinar el perfil de expresión génico de una gran cantidad de los ARN existentes en una muestra.

Las técnicas para la síntesis de estas matrices usando métodos de síntesis mecánicos se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.384.261. Aunque se prefiere una superficie matricial plana, la matriz puede

65 fabricarse prácticamente sobre una superficie de cualquier forma o incluso sobre una multiplicidad de superficies. Las matrices pueden ser péptidos o ácidos nucleicos en perlas, geles, superficies poliméricas, fibras, tales como, fibras ópticas, vidrio o cualquier otro sustrato apropiado, véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.770.358, 5.789.162, 5.708.153, 6.040.193 y 5.800.992. Las matrices pueden envasarse de tal manera que se permita realizar el diagnóstico u otra manipulación de un dispositivo todo incluido.. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.856.174 y 5.922.591.

5 En una estrategia, el ARNm total aislado de la muestra se convierte en ARNc marcado y después se hibrida con una matriz de oligonucleótidos. Cada muestra se hibrida con una matriz individual. Los niveles de transcripción relativos pueden calcularse por referencia a controles apropiados presentes en la matriz y en la muestra.

También se proporcionan kits para la realización práctica de los métodos de la invención. Por “kit” se entiende cualquier fabricación (por ejemplo un envase o un recipiente) que comprenda al menos un reactivo, por ejemplo, un anticuerpo, una sonda de ácido nucleico, etc. para detectar específicamente la expresión de los biomarcadores MCM2 y Topo2A de la invención. El kit puede facilitarse, distribuirse o comercializarse como una unidad para realizar los métodos de la presente invención. Adicionalmente, los kits pueden contener un prospecto de envase que

15 describa el kit y los métodos para su uso.

En una realización particular, se proporcionan kits para la realización práctica de los métodos inmunocitoquímicos de la invención. Tales kits son compatibles tanto con técnicas inmunocitoquímicas manuales como automatizadas (por ejemplo, tinción celular) como se describe más adelante en el Ejemplo 1. Estos kits comprenden al menos tres anticuerpos, en los que un primer y un segundo anticuerpo, incluidos en el kit, se unen específicamente a MCM2 y en los que un tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A, productos químicos para la detección de la unión de los anticuerpos a los biomarcadores, un colorante de contraste y, opcionalmente, un agente colorante azul para facilitar la identificación de las células con tinción positiva. En la realización práctica de la invención puede usarse cualquier producto químico que detecte la unión del antígeno al anticuerpo. En algunas realizaciones, los productos 25 químicos para la detección comprenden un polímero marcado conjugado con un anticuerpo secundario. Por ejemplo, puede proporcionarse un anticuerpo secundario que esté conjugado con una enzima que cataliza la deposición de un cromógeno en el sitio de unión del antígeno-anticuerpo. Tales enzimas y técnicas para usarlas en la detección de la unión de anticuerpos se conocen bien en la técnica. En una realización, el kit comprende un anticuerpo secundario que está conjugado con un polímero marcado con HRP. Adicionalmente pueden proporcionarse cromógenos compatibles con la enzima conjugada (es decir, DAB en el caso de un anticuerpo secundario marcado con HRP) y soluciones, tales como peróxido de hidrógeno, para bloquear la tinción no específica. En otras realizaciones, la unión de anticuerpos a una proteína biomarcadora se detecta mediante el uso de un reactivo sonda de ratón que se une a anticuerpos monoclonales de ratón, seguido por la adición de un polímero de dextrano conjugado con HRP que se une al reactivo sonda de ratón. Dichos reactivos de detección son asequibles, por

35 ejemplo, en el mercado de Biocare Medical.

Los kits de la presente invención pueden comprender adicionalmente un reactivo bloqueador de peroxidasa (es decir, peróxido de hidrógeno), un reactivo bloqueador de proteínas (por ejemplo, caseína purificada) y un colorante de contraste (por ejemplo, hematoxilina). Adicionalmente, en el kit puede proporcionarse un agente colorante azul (por ejemplo hidróxido de amonio o TBS, pH 7,4, con Tween 20 y azida sódica) para facilitar la detección de las células con tinción positiva.

Los kits inmunocitoquímicos de la invención comprenden al menos tres anticuerpos en el que un primer y un segundo anticuerpo, incluidos en el kit, se unen específicamente a MCM2 y en el que un tercer anticuerpo se une a

45 Topo2A, para detectar específicamente la expresión de al menos dos biomarcadores MCM2 y Topo2A. Cada anticuerpo puede proporcionarse en el kit como un reactivo individual o, como alternativa, como un cóctel de anticuerpos que comprende todos los anticuerpos dirigidos contra los diferentes biomarcadores de interés. Adicionalmente, cualquiera o todos los reactivos del kit pueden proporcionarse en envases que los protegen del medio externo, tal como envases herméticos. En el Ejemplo 8, más adelante, se describe un kit ejemplar para la realización práctica de los métodos de la invención.

En los kits pueden incluirse controles positivos y/o negativos para validar la actividad y el correcto uso de los reactivos empleados de acuerdo con la invención. Los controles pueden incluir muestras, tales como cortes tisulares, células fijadas en portaobjetos, etc., que se sabe que son positivas o negativas para la presencia del

55 biomarcador de interés. En una realización particular, el control positivo comprende células SiHa. Esta es una línea celular humana de cáncer de células escamosas de cuello uterino que es hipertriploide y positiva para infección por VPH-16 y, por lo tanto, sirve como un control positivo para la sobreexpresión de biomarcadores en patologías de cuello uterino de alto grado. Las células de control SiHa pueden proporcionarse en los kits de la invención como portaobjetos preparados o como una suspensión celular que es compatible con la preparación del portaobjetos. El diseño y uso de los controles es convencional y se encuentra bien dentro de la habilidad rutinaria de los expertos habituales en la materia.

También se describen kits para identificar una enfermedad de cuello uterino de alto grado que comprende detectar la sobreexpresión de biomarcadores a nivel de ácido nucleico. Tales kits comprenden, por ejemplo, al menos una 65 sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico biomarcador o a un fragmento del mismo. En un aspecto particular, los kits comprenden al menos dos sondas de ácido nucleico que se hibridan con distintos

ácidos nucleicos biomarcadores.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden usarse en combinación con técnicas de citología tradicionales que analizan características morfológicas. Por ejemplo, las técnicas inmunocitoquímicas de la presente 5 invención pueden combinarse con la tinción Pap convencional de manera que se conserva toda la información morfológica procedente del método convencional. De esta manera, la detección de biomarcadores puede reducir el alto índice de negativos falsos del ensayo del frotis de Pap y puede facilitar la exploración masiva automatizada. En una realización particular, los métodos inmunocitoquímicos descritos anteriormente en el presente documento se combinan con la tinción Pap convencional en un solo método, como se describe más adelante en los Ejemplos 6-7. Un método inmunocitoquímico y de tinción Pap combinado permite visualizar, en una sola muestra, los biomarcadores que se sobreexpresan selectivamente en una enfermedad de cuello uterino de alto grado y la morfología celular (por ejemplo, un portaobjetos para visualizar al microscopio que comprenda una monocapa de células de cuello uterino). El método inmunocitoquímico y de tinción Pap combinado puede permitir una identificación y un diagnóstico más preciso de una enfermedad de cuello uterino de alto grado, particularmente en

15 casos erróneamente clasificados como normales, LSIL o ASCUS por ensayo Pap convencional. El análisis de sobreexpresión de biomarcadores y de morfología celular en un solo método podría reemplazar al frotis de Pap como el método de exploración principal para el cáncer de cuello uterino.

Un experto en la materia reconocerá que, para esta metodología combinada, los parámetros de tinción (por ejemplo, tiempos de incubación, condiciones de lavado, concentraciones de cromógeno/colorante, etc..) deberán optimizarse de tal manera que se obtenga un contraste suficiente entre el resultado inmunocitoquímico (por ejemplo tinción con cromógeno) y la tinción de Pap. El diseño de ensayos para optimizar parámetros de tinción es convencional y se encuentra bien dentro de las habilidades rutinarias de los expertos habituales en la materia. Los kits, como se indica en las reivindicaciones, para realizar el método inmunohistoquímico de tinción Pap combinado se incluyen también

25 en la presente invención. Dichos kits comprenden los reactivos necesarios para realizar la inmunocitoquímica, como se ha descrito anteriormente en el presente documento, y los reactivos para realizar la tinción Pap convencional, particularmente EA50 y Orange G.

Adicionalmente, un experto en la materia apreciará que, en los métodos de la invención, puede implementarse cualquiera o todas las etapas, manualmente por personal, o como alternativa, de manera automática. Por tanto, las etapas de preparación de la muestra, tinción de la muestra y detección de la expresión del biomarcador pueden automatizarse.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

35 PARTE EXPERIMENTAL

Ejemplo 1 (EJEMPLO BASE): Detección de la Sobreexpresión de Biomarcadores Usando Inmunocitoquímica

Preparación y Tratamiento Previo del Portaobjetos

Se recogieron muestras de células de cuello uterino procedentes de pacientes y se colocaron en un vial de recogida SurePath™ (TriPath Imaging, Inc.). Las células de cuello uterino se recogieron del medio liquido y se depositaron en una capa fina sobre un portaobjetos de vidrio usando el sistema procesador de portaobjetos PrepStain™ (TriPath

45 Imaging, Inc.). Los portaobjetos preparados se transfirieron inmediatamente a un tampón de tratamiento previo (RAM al 1%) y se calentaron durante 45 minutos a 95 ºC. Los portaobjetos se enfriaron a temperatura ambiente y se aclararon tres veces (2 minutos por aclarado) en TBS (solución salina tamponada con tris).

Inmunocitoquímica manual

Para impedir la tinción no específica de fondo, no se permitió que los portaobjetos se secasen durante el proceso de tinción. Adicionalmente, para bloquear la tinción no específica, se aplicó peróxido de hidrógeno a los portaobjetos durante 5 minutos, seguido de un aclarado con TBS. Un anticuerpo dirigido contra MCM6 se aplicó al portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación con el anticuerpo dirigido contra MCM6, el

55 portaobjetos se lavó tres veces con TBS durante 2 minutos por lavado. Al portaobjetos se aplicó un anticuerpo secundario polimérico marcado con HRP de Dako Envision+ durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de un aclarado con TBS. Se aplicó cromógeno DAB al sustrato con HRP durante 10 minutos y después los portaobjetos se aclararon durante 5 minutos con agua. Cada portaobjetos se tiñó con una tinción de contraste de hematoxilina y después se aclararon con agua hasta quedar limpios. Después de la tinción de contraste, los portaobjetos se sumergieron en hidróxido de amonio durante 10 segundos y después se aclararon con agua durante 1 minuto.

Las muestras se deshidrataron sumergiendo los portaobjetos en etanol al 95% durante 1 minuto y después en etanol absoluto durante 1 minuto más. Los portaobjetos se limpiaron aclarando 3 veces en xileno durante 1 minuto por 65 aclarado. Después los portaobjetos se cubrieron con un cubreobjetos con un medio de montaje permanente y se incubaron a 35 ºC hasta secarse. Las células con tinción positiva se visualizaron usando un microscopio de campo

claro.

Inmunocitoquímica automatizada

5 El sistema de Tinción Universal Dako Autostainer se programó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los reactivos de tinción y de tinción de contraste necesarios descritos anteriormente para la inmunocitoquímica manual se cargaron en el aparato. Los portaobjetos preparados y previamente tratados se cargaron en el Autostainer y se activó el programa. Al final del procesamiento, los portaobjetos se retiraron y se aclararon en agua durante 5 minutos. Los portaobjetos se deshidrataron, se limpiaron, se cubrieron con un cubreobjetos y se analizaron como se

10 ha descrito anteriormente.

Ejemplo 2 (EJEMPLO BASE): Detección de Biomarcadores en Muestras Químicas

Se recogieron aproximadamente 180 muestras citológicas de cuello uterino de pacientes que representaban

15 diversos diagnósticos. La presencia o ausencia de células o lesiones cancerosas, indicativas de enfermedad de alto grado en estos pacientes, se confirmó previamente por colposcopia. La tabla siguiente indica la cantidad de muestras dentro de cada grupo de diagnóstico analizado en este estudio, así como una descripción de los hallazgos colposcópicos (por ejemplo, presencia o ausencia de lesiones de alto grado).

20 Tabla 1: Especímenes analizados

Diagnóstico

Recuento Descripción

NIL

72 Negativo a VPH

ASC-US

26 26 sin lesión 0 con lesión o con VPH de alto riesgo

LSIL

48 42 negativos para lesión de alto grado 6 positivos para lesión de alto grado

HSIL

25

Cáncer

10 Carcinoma de Células Escamosas y Adenocarcinoma

Las muestras se analizaron mediante métodos inmunocitoquímicos para identificar enfermedad de cuello uterino de alto grado. Se usaron anticuerpos para detectar la sobreexpresión de seis biomarcadores de interés: MCM2, MCM6, MCM 7, p21waf1, Ciclina E y Topo2A. Los controles de ensayo incluyeron MCM2, MCM6, MCM7, p21waf1, Ciclina E,

25 Topo2A y un proceso negativo de IgG de ratón en la línea celular SiHa. Las muestras también se analizaron por técnicas de tinción Pap tradicionales.

Preparación de Portaobjetos

30 Cada muestra se retiró del almacenamiento y se dejó llegar a temperatura ambiente. A cada vial se añadieron 6 ml de conservante TriPath CytoRich® y los viales se sometieron a agitación vorticial. Las muestras se procesaron en el procesador automatizado TriPath PrepMate® y cualquier líquido restante en el vial se transfirió a un tubo de centrífuga. Las muestras se centrifugaron durante 2 minutos a 200xg y se aspiró el sobrenadante. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 800xg y se decantó el sobrenadante. Los tubos de muestra se cargaron en el

35 sistema TriPath PrepStain® y se activó el programa informático del sistema (versión 1.1; Sólo Transferencia). Se prepararon ocho portaobjetos por cada muestra procedente del paciente y se conservaron en etanol al 95% durante al menos 24 horas, pero no más de 2 semanas, antes de usar en los métodos de tinción Pap y e inmunocitoquímicos.

40 Método de Tinción Pap

Los portaobjetos preparados se incubaron en etanol al 95% durante 30 segundos y después se aclararon con agua durante 30 segundos más. Se aplicó hematoxilina a los portaobjetos durante 6 minutos. Los portaobjetos se aclararon en agua durante 1 minuto, agua ácida durante 2 segundos y agua durante 30 segundos. Durante 30

45 segundos se aplicó un agente colorante azul (hidróxido de amonio) y los portaobjetos se aclararon primero en agua y después en etanol al 95% durante 30 segundos cada vez. Se aplicó con EA 50 y Orange G (Autocyte®) durante 6 minutos. Los portaobjetos se aclararon 2 veces en etanol al 95%, 3 veces en etanol al 100% y 3 veces en xileno durante 30 segundo por aclarado.

50 Posteriormente los portaobjetos se cubrieron con un cubreobjetos usando un medio de montaje Acrytol y se incubaron a 35 ºC hasta secarse. Un patólogo observó las muestras usando un microscopio de campo claro.

Método Inmunocitoquímico

Los portaobjetos preparados se retiraron del etanol al 95% y se aclararon con agua desionizada durante aproximadamente 1 minuto. Los portaobjetos se colocaron en un baño de Solución de Recuperación Diana 1X pH 5 6,0 (DAKO S1699)/dH2O precalentado a 95 ºC y se colocaron en un vaporizador durante 25 minutos. Las muestras se dejaron enfriar durante 20 minutos a temperatura ambiente, se aclararon bien en agua desionizada y se pusieron en TBS. Los portaobjetos previamente tratados se tiñeron para detectar la expresión del biomarcador, esencialmente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, “Inmunocitoquímica Automatizada”. Se diluyeron anticuerpos convencionales dirigidos contra MCM2 (1:200), MCM7 (1: 25), p21waf1 (1:100), y ciclina E (1:100), como se indica y

10 se usaron para detectar la expresión del biomarcador. El anticuerpo contra MCM6 purificado, identificado por exploración de polidoma, como se describe en el Ejemplo 4, se usó a una dilución 1:6000.

Interpretación de los Portaobjetos

15 Cada portaobjetos se exploró y analizó por un citólogo y un patólogo. Las muestras se clasificaron como positivas, negativas o indeterminadas para enfermedad de cuello uterino de alto grado de acuerdo con los siguientes parámetros:

• No se tuvieron en cuenta artefactos no celulares ni las células inflamatorias de tinción marrón (DAB).

20 • No se contaron como positivas las células escamosas de aspecto normal, maduras ni las células glandulares de aspecto normal cuando se tiñeron con DAB.

•

Se consideraron positivas las células metaplásicas escamosas junto con las células anómalas.

•

Se consideró negativa una intensidad de tinción de menos de 1,5.

•

Los resultados discrepantes se resolvieron analizando conjuntamente los portaobjetos..

25 Los resultados inmunocitoquímicos se compararon con los resultados previamente obtenidos por colposcopia. Después, cada portaobjetos proporcionó un resultado final de positivo verdadero (PV), negativo verdadero (NV), positivo falso (PF), negativo falso (NF) o indeterminado. Para cada biomarcador, se calculó la sensibilidad, la especificidad, los valores predictivos positivos y los valores predictivos negativos.

Resultados

A continuación se resumen los resultados para cada biomarcador.

35 Tabla 2: MCM2 PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

71 1

0

0

0

25 1

0

0

0

0

0

0

7 0 31 4

3

0 3 0 0

24

0 1 0 0

7

0 1 0 2

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

347 5127 8 181

Sensibilidad 0,8718

Especificidad 0,9478 VPP 0,8293 VPN 0,9621

Tabla 3: MCM6

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

68 4

0

3 0 22 1

0

0

0

0

0

0

14 0 24 4

3

0 2 0 1

22

0 0 0 3

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3517 2 114 13 181

Sensibilidad 0,9459

Especificidad 0,8702 VPP 0,6731 VPN 0,9828

Tabla 4: MCM7

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

67 5

0

2 0 21 3

0

0

0

0

0

0

12 0 28 2

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

9

0 0 0 1

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3714 3 116 11 181 Sensibilidad 0,9250

Especificidad 0,8923 VPP 0,7255 VPN 0,9748

Tabla 5: Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

72

0

0

0

0

26

0

0

0

0

0

0

0

3 0 35 4

2

0 4 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

PV PF NF NV Indeterminado Totales

HSIL

Cáncer

15

0 4 0 6

7

0 2 0 1

24 3 10133 11 181

Sensibilidad 0,7059

Especificidad 0,9779 VPP 0,8889 VPN 0,9301

Tabla 6: p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 61 9

0

1 0 22 3

0

0

0

0

0

0

12 0 23 7

3

0 3 0 0

21

0 1 0 3

7

0 2 0 1

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Con Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3115 6 106 23 181

Sensibilidad 0,8378

Especificidad 0,8760 VPP 0,6739 VPN 0,9464

Tabla 7: TOP02A

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

68 4

0

1 0 24 1

0

0

0

0

0

0

4 0 27 11

3

0 3 0 0

21

0 1 0 3

9

0 0 0 1

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Con Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

33

5 4 119 20 181

Sensibilidad

0,8919

Especificidad

0,9597

VPP

0,8684

VPN

0,9675

Usando los métodos inmunocitoquímicos de la invención, se analizaron aproximadamente 180 casos para detectar la presencia de una enfermedad de cuello uterino de alto grado. De este número, los biomarcadores MCM produjeron un índice indeterminado que variaba de 4% al 7%. Adicionalmente, MCM2 mostró una especificidad del 95% con una sensibilidad del 87%. Los biomarcadores MCM6 y MCM7 produjeron resultados de sensibilidad

5 comparables del 95% y 93%, respectivamente. La especificidad para estos dos biomarcadores varió del 87% al 89%.

La ciclina E produjo el valor de especificidad más alto del 98%. Aunque el índice indeterminado fue del 6%, la sensibilidad fue sólo del 71%. El índice indeterminado para p21waf1 fue el más alto de todos los marcadores

10 sometidos a ensayo al 13%. p21waf1 produjo una sensibilidad del 84% y una especificidad del 88%. Se observó una especificidad del 96% con el biomarcador Topo2A. El índice indeterminado para Topo2A fue del 11% con una sensibilidad del 89%.

Ejemplo 3 (EJEMPLO BASE): Detección de Biomarcadores en Muestras Clínicas Usando Cócteles de Anticuerpos

15 Para identificar una enfermedad de cuello uterino de alto grado se analizaron aproximadamente 180 muestras citológicas de cuello uterino confirmadas por colposcopia mediante métodos inmunocitoquímicos. Cada muestra se analizó para detectar la expresión de biomarcadores múltiples de interés. Específicamente, se analizaron diversas combinaciones de anticuerpos dirigidos contra MCM2, MCM6, MCM 7, p21 waf1, Ciclina E y Topo2A para

20 determinar su capacidad para detectar una enfermedad de cuello uterino de alto grado. Estas muestras se evaluaron para la expresión de biomarcadores múltiples de interés usando los métodos inmunocitoquímicos y las pautas de interpretación de portaobjetos descritas en el Ejemplo 2.

Los resultados inmunocitoquímicos se compararon con los resultados previamente obtenidos por colposcopia.

25 Después, cada portaobjetos proporcionó un resultado final de positivo verdadero (PV), negativo verdadero (NV), positivo falso (PF), negativo falso (NF) o indeterminado. Para cada biomarcador, se calculó la sensibilidad, la especificidad, los valores predictivos positivos y los valores predictivos negativos.

Resultados

30 A continuación se resumen los resultados para cada biomarcador.

Tabla 8: MCM2 y MCM7

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

66 6

0

2 0 20 4

0

0

0

0

0

0

13 0 25 4

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3815 3 111 14 181

Sensibilidad 0,9268

Especificidad 0,8810 VPP 0,7170 VPN 0,9737

Tabla 9: MCM6 y MCM7

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

65 7

0

3 0 21 2

0

0

0

0

0

0

16 0 23 3

4

0 2 0 0

24

0 0 0 1

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3819 2 109 13 181

Sensibilidad 0,9500

Especificidad 0,8516 VPP 0,6667 VPN 0,9820

Tabla 10: MCM7 y TOPO2A

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

64 8

0

2 0 21 3

0

0

0

0

0

0

12 0 29 1

4

0 2 0 0

20

0 2 0 3

8

0 0 0 2

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3214 4 114 17 181 Sensibilidad 0,8889

Especificidad 0,8906 VPP 0,6957 VPN 0,9661

Tabla 11: MCM7 y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

67 5

0

2 0 21 3

0

0

0

0

0

0

12 0 28 2

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

PV PF NF NV Indeterminado Totales

Cáncer

10

0 0 0 0

3814 3 116 10 181

Sensibilidad 0,9268

Especificidad 0,8923 VPP 0,7308 VPN 0,9748

Tabla 12: MCM7 y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 57 13

0

3 0 20 3

0

0

0

0

0

0

14 0 21 7

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

9

0 0 0 1

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3719 3 98 24 181

Sensibilidad 0,9250

Especificidad 0,8376 VPP 0,6607 VPN 0,9703

Tabla 13: MCM2 y MCM6

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

67 5

0

3 0 21 2

0

0

0

0

0

0

17 0 21 4

3

0 2 0 1

24

0 0 0 1

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3720 2 109 13 181

Sensibilidad 0,9487

Especificidad 0,8450 VPP 0,6491 VPN 0,9820

Tabla 14: MCM2 y TOPOIIA

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

67 5

0

1 0 23 2

0

0

0

0

0

0

8 4 18 12

3

0 3 0 0

25

0 0 0 0

9

0 0 0 1

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

379 7108 20 181

Sensibilidad 0,8409

Especificidad 0,9231 VPP 0,8043 VPN 0,9391

Tabla 15: MCM2 y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

67 5

0

0

0

71 1

0

0

0

25 1

0

9 0 27 6

3

0 3 0 0

24

0 1 0 0

8

0 2 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

359 6123 8 181 Sensibilidad 0,8537

Especificidad 0,9318 VPP 0,7955 VPN 0,9535

Tabla 16: MCM2 y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 60 10

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

13 0 21 8

3

0 3 0 0

24

0 1 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

PV PF NF NV Indeterminado Totales

Cáncer

9

0 1 0 0

3616 5 102 22 181

Sensibilidad 0,8780

Especificidad 0,8644 VPP 0,6923 VPN 0,9533

Tabla 17: TOPO2A y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

68 4

0

1 0 24 1

0

0

0

0

0

0

5 0 27 10

3

0 3 0 0

22

0 1 0 2

9

0 0 0 1

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

346 4119 18 181

Sensibilidad 0,8947

Especificidad 0,9520 VPP 0,8500 VPN 0,9675

Tabla 18: TOPO2A y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 58 12

0

2 0 21 3

0

0

0

0

0

0

13 0 19 10

3

0 3 0 0

25

0 0 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

38 17

3 98 25 181

Sensibilidad

0,9268

Especificidad

0,8522

VPP

0,6909

VPN

0,9703

Tabla 19: p21waf1 y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 61 9

0

1 0 22 3

0

0

0

0

0

0

12 0 23 7

3

0 3 0 0

22

0 1 0 2

8

0 1 0 1

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3315 5 106 22 181

Sensibilidad 0,8684

Especificidad 0,8760 VPP 0,6875 VPN 0,9550

Tabla 20: MCM2, MCM6 y MCM7

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

64 8

0

3 0 20 3

0

0

0

0

0

0

17 0 21 4

4

0 2 0 0

24

0 0 0 1

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3820 2 105 16 181 Sensibilidad 0,9500

Especificidad 0,8400 VPP 0,6552 VPN 0,9813

Tabla 21: MCM2, MCM7 y TOPO2A

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

63 9

0

2 0 20 4

0

0

0

0

0

0

13 0 21 8

4

0 2 0 0

25

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

PV PF NF NV Indeterminado Totales

Cáncer

10

0 0 0 0

3915 2 104 21 181

Sensibilidad 0,9512

Especificidad 0,8739 VPP 0,7222 VPN 0,9811

Tabla 22: MCM6, MCM7 y TOPO2A

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

63 9

0

3 0 21 2

0

0

0

0

0

0

16 0 20 6

4

0 2 0 0

25

0 0 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3919 2 104 17 181

Sensibilidad 0,9512

Especificidad 0,8455 VPP 0,6724 VPN 0,9811

Tabla 23: MCM6, MCM7 y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

65 7

0

3 0 21 2

0

0

0

0

0

0

16 0 23 3

4

0 2 0 0

24

0 0 0 1

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3819 2 109 13 181

Sensibilidad 0,9500

Especificidad 0,8516 VPP 0,6667 VPN 0,9820

Tabla 24: MCM2, MCM7 y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

66 6

0

2 0 20 4

0

0

0

0

0

0

13 0 25 4

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3815 3 111 14 181

Sensibilidad 0,9268

Especificidad 0,8810 VPP 0,7170 VPN 0,9737

Tabla 25: MCM2, MCM7 y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 56 14

0

3 0 18 5

0

0

0

0

0

0

14 0 20 8

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

38 19

3 94 27 181

Sensibilidad

0,9268

Especificidad

0,8319

VPP

0,6667

VPN

0,9691

Tabla 26: MCM2, TOPOIIA y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

67 5

0

1 0 23 2

0

0

0

0

0

0

9 0 22 11

3

0 3 0 0

25

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

PV PF NF NV Indeterminado Totales

Cáncer

9

0 0 0 1

3710 3 112 19 181

Sensibilidad 0,9250

Especificidad 0,9180 VPP 0,7872 VPN 0,9739

Tabla 27: MCM2, Ciclina E y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 60 10

0

1 0 21 4

0

0

0

0

0

0

13 0 21 8

3

0 3 0 0

24

0 1 0 0

9

0 1 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3616 5 102 22 181

Sensibilidad 0,878

Especificidad 0,8644 VPP 0,6923 VPN 0,9533

Tabla 28: MCM2, TOPOIIA y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 57 13

0

2 0 20 4

0

0

0

0

0

0

13 0 18 11

3

0 3 0 0

25

0 0 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

38 17

3 95 28 181

Sensibilidad

0,9268

Especificidad

0,8482

VPP

0,6909

VPN

0,9694

Tabla 29: MCM7, TOPO2A y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

64 8

0

2 0 21 3

0

0

0

0

0

0

12 0 23 7

4

0 2 0 0

25

0 0 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3914 2 108 18 181

Sensibilidad 0,9512

Especificidad 0,8852 VPP 0,7358 VPN 0,9818

Tabla 30: MCM7, p21waf1 y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 57 13

0

3 0 19 4

0

0

0

0

0

0

14 0 21 7

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

38 19

3 97 24 181

Sensibilidad

0,9268

Especificidad

0,8362

VPP

0,6667

VPN

0,9700

Tabla 31: MCM7, p21waf1 y TOP02A PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 54 16

0

3 0 19 4

0

0

0

0

0

0

14 0 18 10

4

0 2 0 0

25

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

PV PF NF NV Indeterminado Totales

Cáncer

10

0 0 0 0

39 19

2 91 30 181

Sensibilidad

0,9512

Especificidad

0,8273

VPP

0,6724

VPN

0,9785

Tabla 32: MCM2, MCM7, Ciclina E y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 56 14

0

3 0 18 5

0

0

0

0

0

0

14 0 20 8

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

38 19

3 94 27 181

Sensibilidad

0,9268

Especificidad

0,8319

VPP

0,6667

VPN

0,9691

Tabla 33: MCM2, MCM7, Ciclina E y TOPOIIA

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

63 9

0

2 0 20 4

0

0

0

0

0

0

13 0 21 8

4

0 2 0 0

25

0 0 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3915 2 104 21 181

Sensibilidad 0,9512

Especificidad 0,8739 VPP 0,7222 VPN 0,9811

NIL ASC-US (Sin Lesión) ASC-US (Lesión) LSIL(Sin HSIL) LSIL(HSIL) HSIL Cáncer

PV PF NF NV Indeterminado Totales

Tabla 34: MCM2, MCM7, Ciclina E, p21waf1 y TOPO2A

0

2 0 53 17

0

3 0 18 5

0

0

0

0

0

0

14 0 18 10

4

0 2 0 0

25

0 0 0 0

10

0 0 0 0

72 26 0 42 6 25 10

3919 2 89 32 181

Sensibilidad 0,9512

Especificidad 0,8241

VPP 0,6724

VPN 0,9780

Tabla 35: MCM2, MCM6, MCM7, TOPO2A, Ciclina E y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales NIL

0

2 0 52 18

0

4 0 18 4

0

0

0

0

0

0

18 0 16 8

4

0 2 0 0

25

0 0 0 0

10

0 0 0 0

72 ASC-US (Sin Lesión) 26

ASC-US (Lesión) 0

LSIL(Sin HSIL) 42

LSIL(HSIL) 6

HSIL 25

Cáncer 10

3924 2 86 30 181

Sensibilidad 0,9512

Especificidad 0,7818

VPP 0,6190

VPN 0,9773

Los datos se recopilaron 28 cócteles de anticuerpos, como se ha descrito anteriormente. La expresión del biomarcador se analizó usando cócteles que comprendían anticuerpos dirigidos contra 2, 3, 4, 5 o incluso los 6 biomarcadores de interés. Veintiuno de los 28 cócteles de anticuerpos mostraron sensibilidades superiores al 92%.

10 Cuatro de los 28 cócteles produjeron especificidades por encima del 90% con el valor mas bajo al 78%. Los mayores valores se consiguieron con una combinación de MCM2, TOPOIIA y Ciclina E. Este cóctel produjo una sensibilidad del 93% junto con una especificidad del 92%. Parece que una combinación de al menos 3 biomarcadores debe producir una sensibilidad mayor del 90%. Se admite que los ajustes con respecto al ensayo podrían aumentar adicionalmente la sensibilidad y especificidad del mismo.

Ejemplo 4 (EJEMPLO BASE): Detección de la Expresión de Biomarcadores Usando Cócteles de Anticuerpos

Se prepararon cócteles de anticuerpos usando diversas combinaciones de anticuerpos dirigidos contra Ciclina E, MCM2, MCM6, MCM7, p21waf1 y TOPO2a. La composición de cada cóctel se enumera en la siguiente tabla a 20 continuación.

Tabla 24: MCM2, MCM7 y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

66 6

0

2 0 20 4

0

0

0

0

0

0

13 0 25 4

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3815 3 111 14 181

Sensibilidad 0,9268

Especificidad 0,8810 VPP 0,7170 VPN 0,9737

Tabla 25: MCM2, MCM7 y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 56 14

0

3 0 18 5

0

0

0

0

0

0

14 0 20 8

4

0 2 0 0

24

0 1 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

38 19

3 94 27 181

Sensibilidad

0,9268

Especificidad

0,8319

VPP

0,6667

VPN

0,9691

Tabla 26: MCM2, TOPOIIA y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

67 5

0

1 0 23 2

0

0

0

0

0

0

9 0 22 11

3

0 3 0 0

25

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

PV PF NF NV Indeterminado Totales

Cáncer

10

0 0 0 0

3915 2 104 21 181

Sensibilidad 0,9512

Especificidad 0,8739 VPP 0,7222 VPN 0,9811

Tabla 22: MCM6, MCM7 y TOPO2A

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

63 9

0

3 0 21 2

0

0

0

0

0

0

16 0 20 6

4

0 2 0 0

25

0 0 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3919 2 104 17 181

Sensibilidad 0,9512

Especificidad 0,8455 VPP 0,6724 VPN 0,9811

Tabla 23: MCM6, MCM7 y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

65 7

0

3 0 21 2

0

0

0

0

0

0

16 0 23 3

4

0 2 0 0

24

0 0 0 1

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3819 2 109 13 181

Sensibilidad 0,9500

Especificidad 0,8516 VPP 0,6667 VPN 0,9820

Tabla 19: p21waf1 y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 61 9

0

1 0 22 3

0

0

0

0

0

0

12 0 23 7

3

0 3 0 0

22

0 1 0 2

8

0 1 0 1

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3315 5 106 22 181

Sensibilidad 0,8684

Especificidad 0,8760 VPP 0,6875 VPN 0,9550

Tabla 20: MCM2, MCM6 y MCM7

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

64 8

0

3 0 20 3

0

0

0

0

0

0

17 0 21 4

4

0 2 0 0

24

0 0 0 1

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

3820 2 105 16 181 Sensibilidad 0,9500

Especificidad 0,8400 VPP 0,6552 VPN 0,9813

Tabla 21: MCM2, MCM7 y TOPO2A

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

63 9

0

2 0 20 4

0

0

0

0

0

0

13 0 21 8

4

0 2 0 0

25

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

PV PF NF NV Indeterminado Totales

Cáncer

9

0 1 0 0

3616 5 102 22 181

Sensibilidad 0,8780

Especificidad 0,8644 VPP 0,6923 VPN 0,9533

Tabla 17: TOPO2A y Ciclina E

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

0

0

68 4

0

1 0 24 1

0

0

0

0

0

0

5 0 27 10

3

0 3 0 0

22

0 1 0 2

9

0 0 0 1

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

346 4119 18 181

Sensibilidad 0,8947

Especificidad 0,9520 VPP 0,8500 VPN 0,9675

Tabla 18: TOPO2A y p21waf1

PV PF NF NV Indeterminado Totales

NIL

0

2 0 58 12

0

2 0 21 3

0

0

0

0

0

0

13 0 19 10

3

0 3 0 0

25

0 0 0 0

10

0 0 0 0

72

ASC-US (Sin Lesión)

ASC-US (Lesión)

LSIL(Sin HSIL)

LSIL(HSIL)

HSIL

Cáncer

38 17

3 98 25 181

Sensibilidad

0,9268

Especificidad

0,8522

VPP

0,6909

VPN

0,9703

Vial Nº

Cantidad Descripción

4a

1 x 18 ml Tampón Sustrato DAB: tampón sustrato usado en la preparación del Cromógeno DAB

4b

1 x 1 ml Cromógeno DAB: solución de cromógeno 3,3’-diaminobencidina

5

1 x 18 ml Tinción de Contraste de Hematoxilina: Hematoxilina de Mayers con base acuosa

6

1 x 18 ml Agente colorante Azul: Solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 con Tween 20 y NaN3 al 0,09%

Se necesitarán los siguientes materiales y reactivos para realizar los métodos inmunocitoquímicos que no venían incluidos en el kit: 5

•

Toallitas Absorbentes

•

Línea Celular SiHa (TriPath Imaging, Inc.)

•

Agua Desionizada o Destilada

•

Etanol (95%y 100%) 10 • Cubreobjetos de Vidrio

•

Guantes

•

Cámara con humedad

•

Microscopio óptico (objetivos 10x, 20x, 40x)

•

Medio de Montaje 15 • Pipetas y Puntas de Pipeta (capaces de administrar volúmenes de 20 μl, 200 μl y 1000 μl)

•

Tampón de Preparación SureSlide (TriPath Imaging, Inc.)-Tampón de Tratamiento Previo (laureth-13-carboxilato sódico al 0,5% (Sandopan LS) en H2O desionizada)

•

Frascos o Baños para Tinción

•

Temporizador (capaz de medir intervalos de 1-60 minutos) 20 • Solución Salina Tamponada con Tris (TBS)

•

Tween 20

•

Control Negativo de IgG de Ratón Universal

•

Un Agitador Vorticial

•

Sustitutos de Xileno o Xileno 25 • Vaporizador/baño de agua

///. Instrucciones de Uso

Preparación de Especímenes

30 Para la preparación de muestras de cuello uterino se siguieron las siguientes etapas:

• Para la preparación de Portaobjetos de especímenes residuales consultar el Manual del Operador para el System™ PrepStain SurePath.

35 • Añadir 8 ml de líquido conservante SurePath™ a la muestra residual en el vial con SurePath™ (aprox. 2 ml). La muestra diluida se procesa en el PepMate™ usando la técnica convencional y en el PrepStain™ usando la versión 1.1 de GYN, Preparación de Portaobjetos.

• Colocar inmediatamente los portaobjetos preparados en el tampón de tratamiento previo durante un mínimo de 1 hora con un máximo de 72 horas antes de realizar la inmunotinción.

40 • Para un rendimiento óptimo del kit, debe usarse la recuperación del epítopo. Este procedimiento implica sumergir los portaobjetos preparados en el tampón de tratamiento previo durante un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente seguido del calentamiento de los portaobjetos en el tampón de tratamiento previo a 95 ºC. Los portaobjetos se dejan a 95 ºC durante 15 minutos y se deja enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se recomienda el uso de un baño de agua o de un vaporizador de vegetales calibrado capaz de

45 mantener la temperatura necesaria. Los laboratorios situados a gran altura deben determinar el mejor modo para mantener la temperatura necesaria. El procedimiento de tinción comienza inmediatamente después de la recuperación del epítopo y del enfriamiento. Cualquier desviación del procedimiento descrito puede influir en los resultados.

50 Preparación de Reactivos

Antes de la tinción se prepararon los siguientes reactivos:

Solución Salina Tamponada con Tris con Tween 20 al 0,05% (TBST) 55

•

Preparar TBS de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

•

Añadir Tween 20 a una concentración final del 0,05%.

•

Conservar a temperatura ambiente si se usa a la semana.

•

La solución no utilizada puede conservarse a 2-8 ºC durante 3 meses.

•

La solución es transparente e incolora. Desechar la solución diluida si se observa turbidez.

5 Solución Sustrato-Cromógeno (DAB) (volumen suficiente para 5 portaobjetos)

•

Transferir 1 ml de Sustrato Tamponado con DAB al tubo de ensayo.

•

Añadir una gota (20 – 30 ul) Cromógeno de DAB+. Mezclar cuidadosamente y aplicar a los portaobjetos con una

pipeta. 10 • Preparar diariamente la solución de Sustrato-Cromógeno reciente.

• Cualquier precipitado que se produzca en la solución no afecta a la calidad de la tinción.

IV. Protocolo de Tinción (Realizado a Temperatura Ambiente, 20-25 ºC)

15 Para realizar la inmunotinción de las muestras citológicas de cuello uterino se realizaron las siguientes etapas:

Indicaciones del Procedimiento de Tinción

• El usuario debe leer atentamente estas instrucciones y familiarizarse con todos los componentes antes de su uso.

20 • Todos los reactivos se equilibran a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de realizar la inmunotinción. Todas las incubaciones se realizan a temperatura ambiente.

• No dejar que los portaobjetos se sequen durante el procedimiento de tinción. Las preparaciones celulares que se secan pueden presentar tinción no específica aumentada. Exponer los cubreobjetos a corrientes de aire. Los portaobjetos deben colocarse en una cámara con humedad durante incubaciones prolongadas.

Recuperación del Epítopo

• Colocar los portaobjetos preparados en el tampón de tratamiento previo durante un mínimo de 1 hora a un máximo

de 72 horas. 30 • Incubar durante 15 minutos a 95 ºC.

•

Retirar todo el frasco Coplin con los portaobjetos del baño de agua o vaporizador y dejar que los portaobjetos se enfríen en el tampón durante 20 minutos.

•

Aclarar los portaobjetos con diH2O y transferirlos a un baño con TBST.

35 Bloqueo con Peroxidasa

•

Eliminar el tampón sobrante

•

Introducir los portaobjetos en la cámara con humedad preparada (cargada con toallitas o gasas de papel

humedecidas con agua). 40 • Aplicar 200 μl de reactivo Bloqueador de Peroxidasa para cubrir el área de deposición celular.

•

Incubar durante 5 minutos (± 1 minuto).

•

Aclarar los portaobjetos en TBST, 3 cambios, 2 minutos cada uno.

Bloqueo con Proteína

•

Eliminar el tampón sobrante.

•

Introducir los portaobjetos en la cámara con humedad preparada (cargada con toallitas o gasas de papel humedecidas con agua).

• Aplicar 200 μl de Bloqueador de Proteína para cubrir completamente el área de deposición celular. 50 • Incubar durante 5 minutos (± 1 minuto).

• No aclarar los portaobjetos.

Cóctel de Anticuerpos Primarios

55 • Eliminar el bloqueador de proteína sobrante

•

Introducir los portaobjetos en la cámara con humedad preparada (cargada con toallitas o gasas de papel humedecidas con agua).

•

Aplicar 200 μl de cóctel de anticuerpos primarios (para cubrir completamente el área de deposición celular.

•

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

60 • Aclarar cada portaobjetos individualmente con TBST usando un frasco de lavado (no dirigir directamente el chorro sobre el área de deposición celular). Introducir los portaobjetos en una rejilla para portaobjetos.

• Aclarar los portaobjetos en TBST, 3 cambios, 2 minutos cada uno.

Detección Química

• Eliminar el tampón sobrante

• Introducir los portaobjetos en la cámara con humedad preparada (cargada con toallitas o gasas de papel 5 humedecidas con agua).

•

Aplicar 200 μl de Sonda de Ratón para cubrir completamente el área de deposición celular.

•

Incubar durante 20 minutos (± 1 minuto).

•

Aclarar los portaobjetos en TBST, 3 cambios, 2 minutos cada uno.

•

Eliminar el tampón sobrante.

10 • Introducir los portaobjetos en la cámara con humedad preparada (cargada con toallitas o gasas de papel humedecidas con agua

•

Aplicar 200 μl de Polímero para cubrir el área de deposición celular.

•

Incubar durante 20 minutos (± 1 minuto).

•

Aclarar los portaobjetos en un baño con TBST, 3 cambios, 2 minutos cada uno. 15 • Eliminar el tampón sobrante.

•

Introducir los portaobjetos en la cámara con humedad preparada (cargada con toallitas o gasas de papel humedecidas con agua).

•

Aplicar 200 μl de solución de trabajo DAB para cubrir completamente el área de deposición celular.

•

Incubar durante 5 minutos (± 1 minuto). 20 • Aclarar los portaobjetos durante 5 minutos en diH2O durante 5 minutos.

Tinción de Contraste

• Aclarar los portaobjetos en TBST, 1 cambio durante 2 minutos.

25 • Introducir los portaobjetos en la cámara con humedad preparada (cargada con toallitas o gasas de papel humedecidas con agua

•

Aplicar 200 μl de hematoxilina para cubrir completamente el área de deposición celular.

•

Incubar durante 1 minuto (± 10 segundos).

•

Aclarar los portaobjetos durante 3 minutos en H2O corriente.

30 • Cargar los portaobjetos en la cámara de humedad preparada (cargada con toallitas o gasas de papel humedecidas con agua).

•

Teñir de color azul los portaobjetos aplicando durante 1 minuto (± 10 segundos) 200 μl de agente colorante azul.

•

Repetir el aclarado con agua corriente durante 1 minuto.

35 Montaje

•

Sumergir los portaobjetos en etanol al 95%, 1 minuto o realizar 25 inmersiones.

•

Sumergir los portaobjetos en alcohol absoluto, 4 cambios, 1 minuto cada uno o realizar 25 inmersiones.

• Limpiar con xileno, 3 cambios, 1 minuto cada uno o realizar 25 inmersiones. 40 • Cubrir los portaobjetos con cubreobjetos de vidrio, usando un medio de montaje permanente, no acuoso.

V. Control de Calidad

Cuando se usa el kit de ensayo inmunocitoquímico descrito en este ejemplo, se consideran las siguientes cuestiones 45 en cuanto al control de calidad:

La variabilidad en cuanto a los resultados frecuentemente procede de diferencias en la manipulación de los especímenes y cambios en los procedimientos de ensayo. Para obtener información adicional, consultar las directrices del control de calidad propuestas del NCCLS Quality Assurance para Inmunocitoquímica.

50 La línea celular de control se encuentra disponible en TriPath Imaging, Inc. Cada vial contiene una línea celular de cáncer de cuello uterino, que se procesa de manera similar a la de los especímenes clínicos. Deben teñirse dos portaobjetos en cada procedimiento de tinción. La evaluación de la línea celular del portaobjetos de control indica la validez del desarrollo de la tinción.

VI. Interpretación de la Tinción

Portaobjetos de control:

60 Los portaobjetos de control teñidos con el kit de ensayo inmunocitoquímico se examinaron en primer lugar para verificar que todos los reactivos funcionaban correctamente. La presencia de un producto de reacción de color marrón (tetrahidrocloruro de 3,3’-diaminobencidina, DAB) en el núcleo de las células fue indicativa de reactividad positiva.

Especímenes de Pacientes:

La evaluación de los portaobjetos la realizó un citólogo o un patólogo usando un microscopio óptico. Las células se revisaron manualmente o se guardaron electrónicamente en una galería de imágenes derivada de un microscopio 5 óptico.

Se recogieron aproximadamente 1610 muestras de cuello uterino que representaban diversos diagnósticos. La siguiente tabla indica la cantidad de muestras analizadas usando el kit inmunocitoquímico en cada grupo de diagnóstico, determinado por tinción Pap o biopsia convencional.

Tabla 41: Especímenes de Pacientes en Cada Grupo de Diagnóstico (Tinción Pap)

Resultados Citológicos

Cantidad %

NIL

671 41,7%

LSIL

395 24,53%

ASCUS

349 21,68%

HSIL

150 9,32%

ASC-H

38 2,36%

AGUS

6 0,37%

SCC

1 0,06%

Total

1610

Tabla 42: Especímenes de Pacientes en Cada Grupo de Diagnóstico (Biopsia)

Resultados de la biopsia

Cantidad %

NIL

968 60,20%

CIN1

369 22,95%

CIN2

140 8,71%

CIN3

131 8,15%

Ausente

2

Total

1610

Ruta de Puntuación de Portaobjetos

Para la puntuación de todos los portaobjetos analizados por los métodos inmunocitoquímicos descritos en este 20 ejemplo se siguió el siguiente procedimiento:

Etapa 1: ¿Es este un espécimen adecuado?

El Sistema Bethesda para describir citologías de cuello uterino (segunda edición) indica, “Una preparación basada

25 en líquido adecuada debe poseer un mínimo calculado de al menos 5000 células escamosas bien conservadas/bien visualizadas”. Este mismo criterio se aplicó cuando se evaluaron todos los portaobjetos. Sin embargo, como en el caso de una preparación Pap rutinaria, cualquier espécimen con células anómalas, que muestran una reacción molecular positiva, fue, por definición, satisfactorio para evaluación. Si la respuesta en esta etapa ha sido “sí”, el citólogo pasa a la siguiente etapa; si la respuesta ha sido “no”, el resultado ha sido No satisfactorio para Evaluación.

30 Etapa 2: ¿Se observa tinción nuclear de color marrón de moderado a intenso en las células epiteliales?

Los productos químicos de detección usados en el kit de ensayo inmunocitoquímico de este ejemplo (por ejemplo el Kit SureDetect Detection Chemistry) tiñen núcleos displásicos asociados con ≥ CIN 2 con un cromógeno marrón,

35 DAB. Para responder “sí” en esta etapa, las muestras se analizaron para detectar tinción marrón que se visualizó fácilmente. Si sólo se observó una leve cantidad o "rubor" de color marrón, esto no es suficiente para garantizar una interpretación de resultado positivo. Si no se observó tinción nuclear de color marrón, se considera que es un resultado de ensayo negativo. Si hubo una tinción de color marrón adecuada, el análisis pasa a la siguiente etapa.

40 Etapa 3: ¿Se trata de una célula escamosa (o glandular) con tinción nuclear marrón y es la célula ≥ ASC (AGC)?

Usando el mismo criterio morfológico indicado en el Sistema Bethesda para describir citologías de cuello uterino (2ª Ed.) (“TBS”), se determinó si la células escamosas que contenían el núcleo de color marrón eran ≥ ASC (células escamosas atípicas). Esto incluiría ASC-US, ASC-H, LSIL, HSIL y cáncer. Si la célula tenía un aspecto glandular, se 45 aplicaba el criterio TBS para determinar si una célula es ≥ AGC (células glandulares atípicas). Esto incluiría AGC endocervical, AGC endometrial, AIS y adenocarcinoma. Si se consideraba que la célula era ≥ASC (o ≥AGC) esto daría como resultado un resultado de ensayo positivo. Si las células en cuestión concuerdan con NILM (negativo

para lesión o malignidad intraepitelial) esta sería un resultado de ensayo negativo.

VII Resultados

5 27 casos que originalmente se clasificaron como NIL por métodos de tinción Pap convencionales se tiñeron positivos en el ensayo inmunocitoquímico. De estos 27 casos, 7 se clasificaron como HSIL, 10 como ASC-H, 3 como ASC-US y 3 como indeterminados después de revisión por el patólogo certificado. Los 7 casos HSIL se consideraron como enfermedad de cuello uterino de alto grado. Estos 27 casos se identificaron por inmunotinción positiva en el ensayo inmunocitoquímico, lo que indican por tanto el valor de los métodos descritos en el presente documento para

10 identificar pacientes erróneamente clasificados como NIL por tinción Pap.

No se obtuvieron resultados bióticos de todos los especímenes NIL. Los cálculos de sensibilidad y valor predictivo positivo (VPP) para el método inmunocitoquímico descrito en este ejemplo se calcularon basándose en la comparación con los resultados bióticos de “norma de oro”. La biopsia sencilla tiene limitaciones como una norma de

15 oro. El VPP para el ensayo ICC mejorará mediante control en serie del paciente o utilizando un criterio de valoración quirúrgico más agresivo tal como el procedimiento de escisión electro quirúrgica con asa o biopsia cónica. S e sabe que la biopsia sencilla posee un resultado negativo falso para enfermedades de al menos un 31%. Véase Elit et al. (2004) J Lower Genital Tract Disease 8(3): 181 -187.

20 Tabla 43: Sensibilidad y valores predictivos positivos calculados del ensayo ICC basados en resultados bióticos

ASC-H

ASCUS LSIL HSIL ≥ASCUS

Sensibilidad

76,5% (52,7%, 90,4%)* 92,6% (76,6%, 97,9%) 97,7% (92,1%, 99,4%) 98,5% (94,6%, 99,6%) 96,2% (93,1%, 97,9%)

VPP

59,1% (38,7%, 76,7%) 26,0% (18,3%, 35,6%) 31,0% (25,9%, 36,7%) 90,1% (84,1 %, 94,0%) 46,9% (42,8%, 51,2%)

*(intervalo de confianza del 95%)

La sensibilidad y VPP del método inmunocitoquímico también se comparó con los resultados obtenidos con tinción Pap convencional. Se usaron dos criterios de valoración clínicos para tinción Pap (es decir ≥LSIL y ≥HSIL). De 25 nuevo, el patrón para todos los cálculos fue el resultado biótico.

Tabla 44: Comparativa del Ensayo Pap y Método inmunocitoquímico

≥LSIL (con ensayo Pap)

≥HSIL (con ensayo Pap) ≥ASCUS (con ICC)

Sensibilidad

76,5% (52,7%, 90,4%)* 92,6% (76,6%, 97,9%) 97,7% (92,1%, 99,4%)

VPP

59,1% (38,7%, 76,7%) 26,0% (18,3%, 35,6%) 31,0% (25,9%, 36,7%)

*(intervalo de confianza del 95%)

30 Los resultados presentados en la Tabla 42 indican que el método inmunocitoquímico detecta más muestras de enfermedad de cuello uterino de alto grado manteniendo al mismo tiempo un alto VPP.

En este estudio se obtuvieron 14 negativos falsos usando el kit de ensayo inmunocitoquímico. El ensayo del VPH se realizó en 13 de las 14 muestras de los pacientes. Ninguna muestra restante estaba disponible para uno de los 35 pacientes con negativos falsos.

Se aisló ADN genómico de las muestras citológicas de cuello uterino usando el Kit de ADN Tisular NucleoSpin® (BD Clontech, Cat Nº 635967). Para propósitos de control de calidad, se realizó análisis por PCR de betaglobina, un gen constitutivo.

40 Se realizó la amplificación del gen L1 del VPH como se describe en la técnica mediante PCR de L1 convencional con el conjunto de cebadores MY09/11 y por PCR anidada con el conjunto de cebadores MY09/11 y G P5+/6+ para mejorar la sensibilidad de detección. Adicionalmente se realizó secuenciación de ADN del amplicón L1 para identificar el tipo (o tipos) del VPH (o de los VPH) presente.

45 Se aisló ADN genómico de buena calidad de 10 de las 13 muestras citológicas clínicas. 3 muestras tuvieron un ADN genómico de mala calidad, indicado por análisis PCR de betaglobina. El ADN del VPH fue indetectable o negativo en 10 de las 13 muestras usando PCR de L1 convencional (con los cebadores MY09/11) y PCR de L1 anidada (con los cebadores MY09/11 y GP5+/6+). Estos datos indican que se produce un error de muestreo en gran parte de las

50 muestras negativas falsas, dado que el VPH es positivo para enfermedad de cuello uterino de alto grado (sensibilidad de >92%).

Ejemplo 9 (Ejemplo base): Selección de Anticuerpos contra MCM6

Exploración de Polidomas

5 Para identificar anticuerpos específicos contra el biomarcador MCM6, se exploraron polidomas proporcionados en placas de cultivo tisular multipocillo que poseían los rasgos de sensibilidad y especificidad deseados. Se generó una micromatriz tisular que comprendía muestras múltiples, normales (es decir, no CIN), CINIII, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma en un solo portaobjetos. Los sobrenadantes no diluidos de cada pocillo que contenían un polidoma se sometieron a ensayo para detectar tinción positiva de la micromatriz tisular. El fondo, es decir la

10 unión no específica, se ignoró básicamente en esta fase. Once de los 35 polidomas sometidos a ensayo produjeron resultados de tinción positiva y se seleccionaron para análisis posterior.

Para determinar la especificidad de los polidomas seleccionados, se compararon los patrones de tinción obtenidos con los sobrenadantes de los polidomas con los obtenidos con un anticuerpo contra MCM6 disponible en el mercado

15 (BD Transduction Laboratories). Los patrones de tinción obtenidos con los sobrenadantes de los polidomas parecieron ser más específicos que los observados con el anticuerpo contra MCM 6 disponible en el mercado (Figura 9).

Después, los 11 polidomas seleccionados se sometieron a un proceso de dilución limitante. Treinta diluciones

20 limitantes, resultantes de los sobrenadantes de los polidomas seleccionados, se sometieron a ensayo para detectar tinción positiva de una micromatriz tisular que comprendía muestras múltiples, normales (es decir, no CIN), CINIII, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma. Se seleccionaron dos clones de la dilución limitante, 9D4.3 y 9D4.4, como los mejores sobrenadantes basándose en la tinción positiva de muestras tisulares de cuello uterino anómalas y cancerosas. Después se sometieron a ensayo diversas diluciones de estos clones para determinar su

25 reactividad contra tejido NIL, LSIL, HSIL y se agruparon las muestras citológicas basadas en líquido. El clon 9D4.3, a una dilución 1:100 produjo la máxima proporción de señal con respecto a interferencia y se seleccionó para caracterización posterior.

Caracterización del clon 9D4.3, MCM6

30 Para caracterizar el clon 9D4.3, el clon se sometió a ensayo para detectar tinción positiva de 40 muestras citológicas basadas en líquido seleccionadas de las siguientes categorías de diagnóstico: NIL (7), LSIL (10), HSIL (18), y carcinoma de cuello uterino (5). Los portaobjetos se prepararon usando el procesador de portaobjetos PrepStain™ (TriPath Imaging, Inc.) para cada una de las 40 muestras. Dos portaobjetos por muestra se tiñeron cada uno con un

35 anticuerpo contra MCM 2 (Dako) y el clon 9D4.3. Los restantes portaobjetos se usaron para tinción PAP o como un control negativo.

Para preparar los portaobjetos, cada muestra se centrifugó durante 2 minutos a 200 xg para formar un sedimento y el sobrenadante se decantó. Se añadieron 2 ml de agua desionizada a cada muestra y las muestras se sometieron a

40 agitación vorticial y después se centrifugaron durante 5 minutos a 600 xg. Después de decantar el sobrenadante, se añadieron 700 μl de agua tamponada con Tris. Finalmente las muestras se introdujeron en procesador de portaobjetos PrepStain™ (Tripath Imaging, Inc.), versión 1.1 y se puso en marcha el programa en modo Sólo Transferencia.

45 Después de la preparación, todos los portaobjetos se conservaron en ETOH al 95% durante al menos 24 horas y no más de 3 días. La recuperación del antígeno para MCM2 se consiguió colocando los portaobjetos en una Solución de Recuperación Diana 1X pH 6,0, baño (DAKO 51699)/dH2O, precalentado a 95 ºC, durante 25 minutos en un vaporizador. Para MCM6, la accesibilidad del antígeno se consiguió colocando los portaobjetos en un baño de tampón Tris, pH 9,5 (Biocare)/dH2O, precalentado a 95 ºC, durante 25 minutos en un vaporizador. Después de

50 vaporizar, todos los portaobjetos se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Los portaobjetos se tiñeron por inmunocitoquímica usando el Autostainer Universal DAKO como se ha descrito en el Ejemplo 1, “Inmunocitoquímica Automatizada”. Un citólogo experimentado evaluó y exploró los portaobjetos para la determinación morfológica de la categoría de diagnóstico. Las muestras se evaluaron por intensidad de tinción 55 marcadora (0-3), porcentaje de células con tinción positiva y la localización de la tinción marcadora (nuclear, citoplásmica, membrana o una combinación). A la intensidad de tinción celular se le asignó una puntuación de 0-3. Se contó la puntuación de las células ≥1,5. Las células escamosas de aspecto normal, maduras y las células glandulares de aspecto normal no se contaron como positivas cuando se tiñeron de color marrón. Sin embargo, las células metaplásicas escamosas se contaron como positivas juntos con las células anómalas. Después, a los

60 portaobjetos sometidos a inmunocitoquímica se les proporcionó una designación de NV (negativo verdadero), NF (negativo falso), PV (positivo verdadero), o PF (positivo falso).

Tabla 45: Clon 9D4.3 (MCM6)

PV

PF NF NV Indeterminado

0

0

0

1

0

0

1 0 9

0

23

0 1 0 0

5

0 0 0 0

Total

NIL

LSIL

HSIL

Cáncer

Sensibilidad

0,9655

Especificidad

0,9091

PPP

0,9655

PPN

0,9091

28 1110 0 40

Tabla 46: MCM2

PV

PF NF NV Indeterminado

0

0

0

1

0

0

1 0 9

0

23

0 1 0 0

4

0 1 0 0

Total

NIL

LSIL

HSIL

Cáncer

Sensibilidad

0,9310

Especificidad

0,9091

PPP

0,9643

PPN

0,8333

271210 0 40

Cálculos Usados

Sensibilidad=PV/ (PV + NF)

Especificidad=NV/(PF+NV)

Poder Predictivo Positivo (PPP) =PV/ (PV + PF)

Poder Predictivo Negativo (PPN) =NV/ (NF + NV)

La sensibilidad y la especificidad para el clon 9D4.3 fueron comparables con las obtenidas con el anticuerpo contra MCM2 disponible en el mercado. Un caso NIL fue negativo para ambos anticuerpos. De los 10 casos LSIL, 9 fueron

10 negativos con el clon 9D4.3 y con el anticuerpo contra MCM2 disponible en el mercado. De los 24 casos HSIL, 23 fueron positivos con el clon 9D4.3 y con el anticuerpo contra MCM2 disponible en el mercado. Con las muestras de cáncer de cuello uterino, 5 de las 5 fueron positivas con el clon 9D4.3 y 4 de las 5 fueron positivas con el anticuerpo contra MCM 2.

15 Purificación del clon 9D4.3, MCM 6

Debido a su sensibilidad, especificidad y a la presentación de un modelo de tinción nuclear, el clon 9D4.3 se purificó para análisis posterior. El anticuerpo purificado se obtuvo usando cromatografía de adsorción por afinidad Streamline rProteinA (Amersham Biosciences) de acuerdo con métodos convencionales. La solución de anticuerpo

20 resultante se sometió después a ensayo para determinar la reactividad contra grupos de citología de cuello uterino basados en líquido SHIL a diversas diluciones entre 1:500 y 1:6000. La señal fue clara a una titulación de 1:6000.

Ejemplo10 (Ejemplo base): Detección por PCR en tiempo real de Biomarcadores en Muestras Tisulares Clínicas

25 Se realizó PCR en tiempo real TaqMan® con el Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). En este estudio, los cebadores y las sondas se diseñaron utilizando el programa Primer Express™, versión 1.5 (Applied Biosystems), para la ampliación específica de los biomarcadores de cuello uterino diana (es decir, MCM7, p21waf1, p14ARF/p16, ciclina E1, y ciclina E2). La información de secuencias para cebadores y sondas se muestra a continuación:

MCM7:

Nombre del Cebador: MCM7_T1T3-F Secuencia: CTCTGAGCCCGCCAAGC (SEC ID Nº: 25)

35 Nombre del Cebador: MCM7_T1T3-R Secuencia: TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA (SEC ID Nº: 26)

Nombre de la Sonda: MCM7_T1T3-Sonda Secuencia: CCCTCGGCAGCGATGGCACT (SEC ID Nº: 27)

Nombre del Cebador: MCM7_T2T4-F

Secuencia: GAGGAATCCCGAGCTGTGAA (SEC ID Nº: 28)

Nombre del Cebador: MCM7_T2T4-R

Secuencia: CCCGCTCCCGCCAT (SEC ID Nº: 29)

Nombre de la Sonda: MCM7_T2T4-Sonda Secuencia: CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA (SEC ID Nº: 30) Nombre del Cebador: MCM7_T2-F Secuencia: GTCCGAAGCCCCCAGAA (SEC ID Nº: 31)

Nombre del Cebador: MCM7_T2-R 15 Secuencia: CCCGACAGAGACCACTCACA (SEC ID Nº: 32)

Nombre de la Sonda: MCM7_T2-Sonda

Secuencia: CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA (SEC ID Nº: 33)

Nombre del Cebador: MCM7_T3T4-F

Secuencia: CGCTACGCGAAGCTCTTTG (SEC ID Nº: 34)

Nombre del Cebador: MCM7_T3T4-R

Secuencia: CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA (SEC ID Nº: 35) 25

Nombre de la Sonda: MCM7_T3T4-Sonda

Secuencia: TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA (SEC ID Nº: 36)

P21waf1:

Nombre del Cebador: p21T1T2-F

Secuencia: CAAACGCCGGCTGATCTT (SEC ID Nº: 37)

Nombre del Cebador: p21T1T2-R 35 Secuencia: CCAGGACTGCAGGCTTCCT (SEC ID Nº: 38)

Nombre de la Sonda: p21T1T2-Sonda

Secuencia: CAAGAGGAAGCCCTAATCCGCCCA (SEC ID Nº: 39)

Nombre del Cebador: p21 T2-F

Secuencia: GAGCGGCGGCAGACAA (SEC ID Nº: 40)

Nombre del Cebador: p21 T2-R

Secuencia: CCGCGAACACGCATCCT (SEC ID Nº: 41) 45

Nombre de la Sonda: p21T2-Sonda

Secuencia: CCCAGAGCCGAGCCAAGCGTG (SEC ID Nº: 42)

Nombre del Cebador: p21T3-F

Secuencia: TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA (SEC ID Nº: 43)

Nombre del Cebador: p21T3-R

Secuencia: TCCAGTCTGGCCAACAGAGTT (SEC ID Nº: 44)

55 Nombre de la Sonda: p21T3-Sonda Secuencia: CGGCGGCAGACCAGCATGAC (SEC ID Nº: 45)

p14ARF/p16:

Nombre del Cebador: p16T4-F

Secuencia: GCC CTC GTG CTG ATG CTA CT (SEC ID Nº: 46)

Nombre del Cebador: p16T4-R

Secuencia: TCA TCA TGA CCT GGT CTT CTA GGA (SEC ID Nº: 47) 65

Nombre de la Sonda: p16T4-Sonda Secuencia: AGC GTC TAG GGC AGC AGC CGC (SEC ID Nº: 48)

Nombre del Cebador: p16T1 -F

Secuencia: TGCCCAACGCACCGA (SEC ID Nº: 49)

Nombre del Cebador: p16T1-R

Secuencia: GGGCGCTGCCCATCA (SEC ID Nº: 50)

Nombre de la Sonda: p16T1-Sonda

Secuencia: TCGGAGGCCGATCCAGGTCATG (SEC ID Nº: 51)

Nombre del Cebador: p 1 6T2-F

Secuencia: AAGCTTCCTTTCCGTCATGC (SEC ID Nº: 52)

15 Nombre del Cebador: p16T2-R Secuencia: CATGACCTGCCAGAGAGAACAG (SEC ID Nº: 53)

Nombre de la Sonda: p16T2-Sonda

Secuencia: CCCCCACCCTGGCTCTGACCA (SEC ID Nº: 54)

Nombre del Cebador: p16T3-F

Secuencia: GGAAACCAAGGAAGAGGAATGAG (SEC ID Nº: 55)

Nombre del Cebador: p16T3-R 25 Secuencia: TGTTCCCCCCTTCAGATCTTCT (SEC ID Nº: 56)

Nombre de la Sonda: p16T3-Sonda Secuencia: ACGCGCGTACAGATCTCTCGAATGCT (SEC ID Nº: 57)

Nombre del Cebador: p16 Universal-F

Secuencia: CACGCCCTAAGCGCACAT (SEC ID Nº: 58)

Nombre del Cebador: p16 Universal-R

Secuencia: CCTAGTTCACAAAATGCTTGTCATG (SEC ID Nº: 59) 35

Nombre de la Sonda: p16 Universal-Sonda

Secuencia: TTTCTTGCGAGCCTCGCAGCCTC (SEC ID Nº: 60)

Ciclina E1:

Nombre del Cebador: CCNE1T1T2-F Secuencia: AAAGAAGATGATGACCGGGTTTAC (SEC ID Nº: 61)

Nombre del Cebador: CCNE1T1T2-R 45 Secuencia: GAGCCTCTGGATGGTGCAA (SEC ID Nº: 62)

Nombre de la Sonda: CCNE1T1T2-P Secuencia: CAAACTCAACGTGCAAGCCTCGGA (SEC ID Nº: 63)

Nombre del Cebador: CCNE1T1-F

Secuencia: TCCGCCGCGGACAA (SEC ID Nº: 64)

Nombre del Cebador: CCNE1T1-R

Secuencia: CATGGTGTCCCGCTCCTT (SEC ID Nº: 65) 55

Nombre de la Sonda: CCNE1T1-Sonda

Secuencia: ACCCTGGCCTCAGGCCGGAG (SEC ID Nº: 66)

Ciclina E2

Nombre del Cebador: CCNE2T1T2-F Secuencia: GGAATTGTTGGCCACCTGTATT (SEC ID Nº: 67)

Nombre del Cebador: CCNE2T1T2-R 65 Secuencia: CTGGAGAAATCACTTGTTCCTATTTCT (SEC ID Nº: 68)

Nombre de la Sonda TaqMan: CCNE2T1T2-P Secuencia: CAGTCCTTGCATTATCATTGAAACACCTCACA (SEC ID Nº: 69)

Nombre del Cebador: CCNE2T1T3-F 5 Secuencia: TCAACTCATTGGAATTACCTCATTATTC (SEC ID Nº: 70)

Nombre del Cebador: CCNE2T1T3-R Secuencia: ACCATCAGTGACGTAAGCAAACTC (SEC ID Nº: 71)

10 Nombre de la Sonda TaqMan: CCNE2T1T3-P Secuencia: CCAAACTTGAGGAAATCTATGCTCCTAAACTCCA (SEC ID Nº: 72)

Nombre del Cebador: CCNE2T2-F Secuencia: TTTTGAAGTTCTGCATTCTGACTTG (SEC ID Nº: 73)

15 Nombre del Cebador: CCNE2T2-R Secuencia: ACCATCAGTGACGTAAGCAAGATAA (SEC ID Nº: 74)

Nombre de la Sonda TaqMan: CCNE2T2-P 20 Secuencia: AACCACAGATGAGGTCCATACTTCTAGACTGGCT (SEC ID Nº: 75)

Las sondas se marcaron con un colorante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) en la base 5’ y un colorante inactivador TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina) en la base 3’. Los tamaños de los amplicones eran de aproximadamente 100 pb. Como control endógeno se utilizó ARN Ribosómico 18S. Se marcó una sonda de ARNr

25 18S con un colorante fluorescente VIC™. La mezcla cebador/sonda ARNr 18S pre-desarrollada se adquirió en Applied Biosystems. 5 μg de ARN total extraído de tejidos de cuello uterino normal (N) o canceroso (T) se convirtieron cuantitativamente a la forma de ADNc monocatenario con hexámeros aleatorios usando el Kit de Alta Capacidad de ADNc Archive (Applied Biosystems). Se prepararon los siguientes reactivos de reacción:

30 Mezcla Maestra 20X de Cebadores/Sonda (en 200 μl)

Cebador directo 180 μM

20 μl

Cebador inverso 180 μM

20 μl

Sonda TaqMan 100 μM

10 μl

H2O

150 μl

Mezcla de Reacción Final (25 μl / pocillo)

Mezcla maestra 20X de cebadores/sonda

1,25 μl

Mezcla maestra de PCR Universal TaqMan 2X (P/N:4304437)

12,5 μl

Molde de ADNc

5,0 μl

H2O

6,25 μl

La Mezcla Maestra de PCR Universal TaqMan 20X se adquirió en Applied Biosystems. Las concentraciones finales de cebador y sonda, en un volumen total de 25 μl, fueron 0,9 μM y 0,25 μM, respectivamente. A cada pocillo se aplicaron 10 ng de ARN total. Las condiciones de amplificación fueron 2 minutos a 50 ºC, 10 minutos a 95 ºC y un

40 ciclo bietapa de 95 ºC durante 15 segundos y 60 ºC durante 60 segundos durante un total de 40 ciclos. En cada proceso se incluyeron al menos tres mezclas de reacción de control sin molde. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Al final de cada reacción, se usó la intensidad de fluorescencia registrada para los siguientes cálculos: Rn+ es el

45 valor Rn de una reacción que contenía todos los componentes. Rn-es el valor de Rn de una mezcla que no ha reaccionado (valor inicial o el valor detectado en NTC). ΔRn es la diferencia entre Rn+ y Rn-y es un indicador de la magnitud de la señal generada por la PCR. En este estudio, se usó el método comparativo CT, que se usa cantidades de patrón desconocidas pero compara la cantidad relativa de la secuencia diana con cualquier valor de referencia seleccionado (por ejemplo, ARNr 18S). Se usó el protocolo de Placa de Control Endógeno Humano

50 TaqMan® para convertir datos sin procesar para análisis de datos de PCR en tiempo real.

Resultados

A continuación se indican, en forma de tabla, los resultados obtenidos con cada biomarcador y con los cebadores específicos. Los resultados obtenidos con muestras de tejido de cuello uterino normal (es decir, NIL) se indican con la letra N; los obtenidos con tejidos de cáncer de cuello uterino se indican con la letra T.

Tabla 47: Resultados Taqman® con MCM7

Muestra

T2 T5 T1T3 T2T4 T3T4

CV01-T

4 0,04 29,9 4,5 1,4

CV03-T

5,7 0,02 36,8 6,1 2,6

CV05-T

4,13 0,08 17,3 1,35 3,68

CV07-T

2,6 0,06 18,77 0,88 3,27

CV09-T

4,96 0,08 15,01 3,69 3,22

CV11-T

5,9 0,01 7,37 3,08 1,75

CV13-T

6,74 0,04 19,74 4,55 4,11

CV15-T

3,04 0,05 3,65 3,43 1,25

CV17-T

5,21 0,02 20,07 2,74 1,56

CV19-T

3,34 0,09 21,17 2,88 6

CV21-T

6,7 0,08 10,64 4,75 4,59

CV23-T

7,08 0,33 32,17 5,6 4,25

CV25-T

4,87 0,03 18,11 4,58 4,51

CV27-T

4,24 0,03 36,25 4,6 2,82

MEDIA

4,89 0,07 20,50 3,77 3,22

MEDIANA

4,89 0,05 19,74 3,77 3,22

DT

1,32 0,07 9,46 1,39 1,32

CV02-N

2,5 0,02 10,6 2,6 1,1

CV04-N

4,6 0,02 7,1 4,8 2,4

CV06-N

1,75 0,01 2,14 1,36 2,63

CV08-N

1,35 0,01 4,8 1,71 1,54

CV10-N

5,6 0,03 5,07 5,12 1,85

CV12-N

5,68 0,02 7,34 3,19 2,29

CV16-N

4,35 0,08 3,72 2,75 1,78

CV18-N

3,98 0,01 4,74 3,63 1,7

CV20-N

2,03 0,03 5,42 1,4 2,78

CV22-N

2,66 0,02 4,33 2,26 2,42

CV24-N

4,88 0,09 9,03 1,53 2,77

CV28-N

2,71 0,01 10,38 1,36 1,7

MEDIA

3,51 0,03 6,22 2,64 2,08

MEDIANA

3,51 0,02 5,42 2,60 2,08

DT

1,40 0,03 2,48 1,21 0,50

Tabla 48: Resultados TaqMan® con P21waf1

Pacientes

T1T2 T2 T3

Pt01-T

23,33 0,06 0,00

Pt02-T

14,66 0,01 0,00

Pt03-T

11,86 0,00 0,00

Pt04-T

27,04 0,01 0,00

Pt05-T

14,72 0,00 0,00

Pt06-T

22,84 0,01 0,00

Pt07-T

14,04 0,00 0,00

Pt08-T

31,93 0,01 0,01

Pt09-T

35,02 0,00 0,00

Pt10-T

13,2 0,00 0,00

Pt11-T

24,87 0,01 0,00

Pt12-T

10,85 0,00 0,00

Pt13-T

36,51 0,02 0,01

Pt14-T

12,72 0,00 0,00

Pt15-T

10,64 0,00 0,00

Pt16-T

22,58 0,04 0,00

Pt17-T

39,64 0,14 0,04

Pt01-N

4,57 0,03 0,00

Pt02-N

5,57 0,00 0,00

Pt03-N

3,54 0,00 0,00

Pt04-N

8,18 0,00 0,00

Pt05-N

5,4 0,10 0,00

Pt06-N

11,01 0,00 0,00

Pt08-N

10,39 0,00 0,00

Pt09-N

9,11 0,00 0,00

Pt10-N

4,41 0,00 0,00

Pt11-N

8,64 0,00 0,00

Pt12-N

3,03 0,00 0,00

Pt14-N

3,55 0,00 0,00

Pt15-N

2,42 0,01 0,00

Pt17-N

11,46 0,05 0,01

T-media

21,5559

N-media

6,52

Ensayo T Conv =

7,3E-06

Tabla 49: Resultados TaqMan® con p14ARF/p16

Paciente

T1 T2 T3 T4 UNIVERSAL

Pt01-T

0,2 0,1 0,2 0,2 0,2

Pt02-T

16,3 11,2 5,1 21,7 36,5

Pt03-T

16,5 6,2 3,1 15,1 29,6

Pt04-T

10,1 2,8 2,6 13,2 27,7

Pt05-T

12,7 3,6 2,1 11,3 23,1

Pt01-N

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Pt02-N

2,5 2,6 1,6 2,7 6,8

Pt04-N

2,6 0,6 0,8 2,4 5,8

Pt05-N

2,1 0,8 0,7 4,1 4,6

T-Media

11,2 4,8 2,6 12,3 23,4

N-Media

1,8 1,0 0,8 2,3 4,3

Tabla 50: Resultados TaqMan® de Ciclina E1

Paciente

T1T2 Cáncer M. Cáncer DT T1T2 Normal M. Normal DT T1 Cáncer M. Cáncer DT T1 Normal M. Normal DT

Pt 01

12,19 0,12 4,11 0,13 1,34 0,04 0,5 0,03

Pt02

16,72 0,21 4,44 0,34 1,35 0,02 0,47 0,05

Pt03

11,45 0,41 2,81 0,13 1,17 0,01 0,06 0,02

Pt04

21,33 0,45 5,33 0,09 0,76 0,1 0,23 0,01

Pt05

11,17 0,25 3,68 0,15 0,95 0,05 0,15 0,03

Pt06

21,65 0,24 3,11 0,22 0,89 0,03 0,13 0,02

Pt07

23,26 0,54 0 0 0,75 0,06 0 0,01

Pt08

8,37 0,24 3,1 0,01 0,12 0,01 0,13 0,02

Pt09

17,74 0,43 2,17 0,08 0,73 0,02 0,09 0,01

Pt 10

18,51 0,29 4,56 0,17 1,37 0,03 0,41 0,04

Pt 11

10,58 0,52 3,92 0,12 0,57 0,01 0,23 0,03

Pt 12

33,67 0,58 7,87 0,1 0,78 0,01 0,28 0,05

Pt 13

36,9 0,41 0 0 1,05 0,04 0 0

Pt 14

31,01 0,29 6,01 0,26 1,68 0,05 0,24 0,03

Pt 15

7,35 0,23 1,24 0,09 0,34 0,08 0,08 0,02

Pt 16

12,71 0,61 3,72 0 1,1 0,06 0,07 0,01

Pt 17

12,13 0,21 11,46 0,15 0,34 0,07 0,05 0,01

Pt 18

14,22 0,14 5,94 0,06 0,73 0,08 0,26 0,04

Pt 19

12,69 0,81 3,52 0,02 0,41 0,04 0,24 0,02

Paciente

T1T2 Cáncer M. Cáncer DT T1T2 Normal M. Normal DT T1 Cáncer M. Cáncer DT T1 Normal M. Normal DT

Pt20

16,56 0,16 6,1 0,12 0,17 0,02 0,06 0

Pt 21

11,63 0,23 3,01 0,06 0,54 0,04 0,23 0,01

Pt22

17,39 0,34 2,36 0,02 0,47 0,02 0,24 0,05

Pt23

16,56 0,16 2,1 0,02 0,18 0,03 0,09 0,01

Pt24

22,23 0,33 4,06 0,28 1,9 0,17 0,52 0,01

Pt25

13,98 0,48 3,72 0,05 0,54 0,04 0,23 0,01

Pt26

22,71 0,76 4,48 0,07 0,47 0,02 0,24 0,05

Pt27

16,17 0,4 5,64 0,3 0,18 0 0,12 0,01

Pt28

12,6 0,56 3,8 0,06 0,29 0,03 0,05 0

Pt29

13,69 0,34 3,1 0,18 0,29 0,03 0,11 0

Pt30

17,69 0,61 4,3 0,11 0,36 0,01 0,03 0

Pt31

20,46 0,3 3,91 0,21 0,47 0,03 0,08 0

Pt32

18,38 0,18 3,16 0,06 0,42 0,02 0,17 0,01

Pt33

21,1 0,62 4,52 0,33 1,07 0,05 0,24 0,01

Pt34

21,5 1,37 4,56 0,13 0,24 0,01 0,11 0,01

Promedio

17,54 4,26 0,68 0,20

T/N

4,1

ensayo t P=

7,80E-14

Tabla 51: Resultados TaqMan® con Ciclina E2

Pacientes

T1T2 T1T2 Desv. Tip. T1T3 T1T3 Desv. Tip. T2 T2 Desv. Tip

Pt01-T

13,17 1,02 16,11 0,39 0,01 0,00

Pt02-T

13,42 0,3 18,12 2,21 0,15 0,02

Pt03-T

13,64 0,50 17,40 2,16 0,05 0,01

Pt04-T

19,37 1,41 24,26 1,01 0,01 0,00

Pt05-T

10,59 1,1 14,71 1,58 0,17 0,02

Pt06-T

7,96 0,91 9,32 0,51 0,06 0,01

Pt07-T

14,1 1,73 16,92 0,84 0,54 0,06

Pt08-T

8,11 0,67 9,50 0,66 0,34 0,07

Pt09-T

13,04 0,72 18,27 0,99 0,02 0,00

Pt10-T

19,56 2,29 23,42 0,00 0,02 0,01

Pt11 -T

16,8 1,57 18,71 2,15 0,08 0,01

Pt12-T

16,05 0,85 18,81 0,74 0,91 0,01

Pt13-T

14,91 0,87 18,51 1,59 0,61 0,16

Pt14-T

14,89 0,32 20,49 0,86 0,42 0,03

Pt15-T

12,44 0,47 15,26 1,00 0,68 0,18

Pacientes

T1T2 T1T2 Desv. Tip. T1T3 T1T3 Desv. Tip. T2 T2 Desv. Tip

Pt16-T

11,54 1,58 13,13 0,75 1,02 0,14

Pt17-T

6,78 0,47 7,91 0,45 0,85 0,10

Pt01-N

4,89 0,21 5,94 0,53 0,00 0,00

Pt02-N

6,32 0,47 8,91 0,61 0,13 0,00

Pt03-N

4,8 0,31 5,89 0,30 0,04 0,00

Pt04-N

13,28 0,74 15,28 1,37 0,01 0,00

Pt05-N

6,51 1,2 9,04 0,82 0,16 0,02

Pt06-N

4,96 0,83 6,41 0,84 0,05 0,01

Pt08-N

6,48 0,73 6,82 0,60 0,07 0,02

Pt09-N

3,74 0,48 4,63 0,66 0,03 0,01

Pt10-N

10,32 0,93 11,31 0,89 0,02 0,00

Pt11-N

10,34 0,26 13,90 0,53 0,04 0,04

Pt12-N

13,81 1,69 16,60 1,45 0,24 0,07

Pt14-N

6,92 0,63 9,07 0,95 0,14 0,03

Pt15-N

4,8 0,73 8,55 1,40 0,10 0,03

Pt17-N

5,33 0,2 5,78 0,27 0,23 0,07

T-media

13,32 16,52 0,35

N-media

7,32 9,15 0,09

Ensayo T Conv.

4,16E-05 3,31742E-05 0,008813

Ejemplo 11 (Ejemplo base): Detección por PCR en Tiempo Real de Biomarcadores en Muestras Tisulares Clínicas

Se realizó PCR en tiempo real TaqMan® como se describe en el Ejemplo 9 usando muestras tisulares de cáncer de

5 cuello uterino (por ejemplo, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas) y muestras tisulares de cuello uterino normal. En este estudio, para la amplificación específica de los biomarcadores de cuello uterino diana (es decir, MCM2, MCM6, MCM7 y Topo2A), los cebadores y las sondas se diseñaron utilizando el programa Primer Express™, versión 1.5 (Applied Biosystems). A continuación se indica la información de las secuencias para los cebadores y sondas:

Cebadores TaqMan

MCM2:

15 Nombre del Cebador: MCM2-D Secuencia: 5'-GGAGGTGGTACTGGCCATGTA-3' (SEC ID Nº: 80)

Nombre del Cebador: MCM2-I Secuencia: 5'-GGGAGATGCGGACATGGAT-3' (SEC ID Nº: 81)

20 Nombre de la Sonda TaqMan: MCM2-S Secuencia: 5'-CCAAGTACGACCGCATCACCAACCA-3' (SEC ID Nº: 82)

MCM6:

25 Nombre del Cebador: MCM6-D Secuencia: 5'-CATTCCAAGACCTGCCTACCA-3' (SEC ID Nº: 83)

Nombre del Cebador: MCM6-I 30 Secuencia: 5'-ATGCGAGTGAGCAAACCAATT-3' (SEC ID Nº: 84)

Nombre de la Sonda TaqMan: MCM6-S Secuencia: 5'-ACACAAGATTCGAGAGCTCACCTCATCCA-3' (SEC ID Nº: 85)

5 MCM7:

Nombre del Cebador: MCM7_T1T3-D Secuencia: CTCTGAGCCCGCCAAGC (SEC ID Nº: 25)

10 Nombre del Cebador: MCM7_T1T3-I Secuencia: TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA (SEC ID Nº: 26)

Nombre de la Sonda: MCM7_T1T3-Sonda Secuencia: CCCTCGGCAGCGATGGCACT (SEC ID Nº: 27) 15 Nombre del Cebador: MCM7_T2T4-D Secuencia: GAGGAATCCCGAGCTGTGAA (SEC ID Nº: 28)

Nombre del Cebador: MCM7_T2T4-I 20 Secuencia: CCCGCTCCCGCCAT (SEC ID Nº: 29)

Nombre de la Sonda: MCM7_T2T4-Sonda Secuencia: CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA (SEC ID Nº: 30)

25 Nombre del Cebador: MCM7_T2-D Secuencia: GTCCGAAGCCCCCAGAA (SEC ID Nº: 31)

Nombre del Cebador: MCM7_T2-I Secuencia: CCCGACAGAGACCACTCACA (SEC ID Nº: 32) 30 Nombre de la Sonda: MCM7_T2-Sonda Secuencia: CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA (SEC ID Nº: 33)

Nombre del Cebador: MCM7_T3T4-F 35 Secuencia: CGCTACGCGAAGCTCTTTG (SEC ID Nº: 34)

Nombre del Cebador: MCM7_T3T4-R Secuencia: CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA (SEC ID Nº: 35)

40 Nombre de la Sonda: MCM7_T3T4-Sonda Secuencia: TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA (SEC ID Nº: 36)

TOPO2A:

45 Nombre del Cebador: TOP2A_D Secuencia: 5'-GGCTACATGGTGGCAAGGA -3' (SEC ID Nº: 86)

Nombre del Cebador: TOP2A_I Secuencia: 5'-TGGAAATAACAATCGAGCCAAAG -3' (SEC ID Nº: 87) 50 Nombre de la Sonda TaqMan: TOP2A_S Secuencia: 5'-TGCTAGTCCACGATACATCTTTACAATGCTCAGC -3' (SEC ID Nº: 88)

Resultados

55 Los resultados obtenidos para cada biomarcador se indican a continuación en forma de tabla. Los datos también se resumen a continuación.

Tabla 52: Muestras Tisulares de Cáncer de Cuello Uterino sometidas a congelación instantánea

Paciente

TPO ID Diag. Patológ. Tipo de VPH TaqM MCM2 TaqMan MCM6 TaqM MCM7 TaqM T0P2A

Pt 01

CV-001 CA de Cél. Esc. VPH16 8,93 11,31 29,9 23,76

Pt02

CV-003 Adeno CA VPH18 10,94 14,29 36,8 25,28

Pt03

CV-005 Adeno CA VPH18 17,67 13,84 17,3 23,18

Pt04

CV-007 CA de Cél. Esc. VPH16 23,61 13,3 18,77 23,26

Pt05

CV-009 CA de Cél. Esc. VPH16 9,3 11,26 15,01 20,33

Pt06

CV-011 CA de Cél. Esc. VPH16 13,86 11,58 7,37 8,37

Pt07

CV-013 Adeno CA VPH18 27,03 16,32 19,74 34,29

Pt08

CV-015 CA de Cél. Esc. VPH16, VPH18,+ 8,28 8,16 3,65 8,57

Pt09

CV-017 CA de Cél. Esc. VPH18 12,61 13,56 20,07 11,31

Pt 10

CV-019 CA de Cél. Esc. VPH18 31,88 23,38 21,17 27,48

Pt 11

CV-021 CA de Cél. Esc. VPH16 11,27 14,76 10,64 12,73

Pt 12

CV-023 CA de Cél. Esc. VPH16 11,39 11,29 32,17 21,11

Pt 13

CV-025 CA de Cél. Esc. VPH16 23,88 18,98 18,11 27,96

Pt 14

CV-027 CA de Cél. Esc. VPH18, VPH16,+ 12,26 15,53 36,25 26,63

Pt 15

CV-029 Carcinoma Célula Esc. VPH16 6,56 7,92 9,64 7,81

Pt 16

CV-031 Carcinoma Célula Esc VPH73 28,12 12,21 27,3 21,4

Pt 17

CV-033 Carcinoma Célula Esc VPH16 8,76 7,59 14,37 12,42

Pt 18

CV-035 Carcinoma Célula Esc VPH16 21,4 12,65 23,63 27,57

Pt 19

CV-037 Carcinoma Célula Esc VPH18 12,59 13,06 14,37 9,24

Pt20

CV-039 CA de Cél. Esc. VPH16, VPH18,+ 7,24 8,17 16,97 15,13

Pt 21

CV-041 CA de Cél. Esc. VPH16 9,61 11,84 13,88 11,92

Pt22

CV-043 CA de Cél. Esc. VPH16 21,57 13,21 18,31 24,19

Pt23

CV-045 CA de Cél. Esc. VPH16 21,19 13,18 18,76 19,97

Pt24

CV-047 CA de Cél. Esc. VPH18 24,61 19,09 20,19 28,14

Pt25

CV-049 CA de Cél. Esc. VPH18 11,43 10,2 13,70 10,55

Pt26

CV-051 CA de Cél. Esc. VPH16 24,25 20,54 23,26 33,26

Pt27

CV-053 CA de Cél. Esc. VPH45 26,74 21,34 20,96 20,34

Pt28

CV-055 CA de Cél. Esc. VPH16, VPH18,+ 12,65 12 14,42 12,17

Pt29

CV-057 CA de Cél. Esc. VPH16 16 14,72 25,46 22,16

Pt30

CV-059 CA de Cél. Esc. VPH16, VPH18,+ 22,55 17,87 15,30 25,54

Pt 31

CV-061 CA de Cél. Esc. VPH16 24,08 21,88 23,11 25,28

Pt32

CV-063 CA de Cél. Esc. VPH18, VPH16,+ 24,16 12,55 21,63 22,39

Pt33

CV-065 CA de Cél. Esc. VPH16 26,63 16,05 27,56 28,84

Pt34

CV-067 CA de Cél. Esc. VPH16 19,61 23,28 19,03 25,57

Tabla 53: Muestras Tisulares Normales Adyacentes

Paciente

TPO ID Tipo VPH TaqM MCM2 TaqMan MCM6 TaqM MCM7 TaqM TOP2A

Pt 01

CV-002 Negativo 3,04 4,4 10,6 10,52

Pt02

CV-004 Negativo 6,26 6,28 7,1 9,06

Pt03

CV-006 VPH18 2,06 2,53 2,14 3,86

Pt04

CV-008 Negativo 3,14 4,15 4,8 8,03

Pt05

CV-010 Negativo 2,2 3,45 5,07 6,91

Pt06

CV-012 Negativo 2,06 2,29 7,34 6,82

Pt07

CV-014 Negativo N/A N/A N/A N/A

Pt08

CV-016 Negativo 2,55 3,13 3,72 2,02

Pt09

CV-018 Negativo 2,09 3,09 4,74 1,24

Pt 10

CV-020 Negativo 8,15 6,76 5,42 10,41

Pt 11

CV-022 Negativo 4,53 5,34 4,33 6,64

Pt 12

CV-024 Negativo 1,94 2,45 9,03 6,13

Pt 13

CV-026 Negativo N/A N/A N/A N/A

Pt 14

CV-028 Negativo 2,62 2,95 10,38 5,3

Pt 15

CV-030 Negativo 1,14 1,28 2,06 1,54

Pt 16

CV-032 Negativo N/A N/A N/A N/A

Pt 17

CV-034 Negativo 1,24 1,91 1,32 0,42

Pt 18

CV-036 Negativo 3,4 1,89 4,01 4,32

Pt 19

CV-038 Negativo 3,48 4,98 5,60 7,92

Pt20

CV-040 Negativo 1,84 3,28 3,73 1,38

Pt 21

CV-042 Negativo 1,53 3,3 4,77 1,01

Pt22

CV-044 Negativo 2,65 4,03 2,74 2,59

Pt23

CV-046 Negativo 3,09 3,53 5,90 3,42

Pt24

CV-048 VPH18 2,57 5,19 3,82 5,32

Pt25

CV-050 Negativo 5,84 4,64 7,78 9,14

Pt26

CV-052 Negativo 5,11 5,22 5,37 5,13

Pt27

CV-054 Negativo 2,91 3,29 5,10 0,76

Pt28

CV-056 Negativo 4,14 3,74 5,54 4,15

Pt29

CV-058 VPH16 2,83 4,98 10,13 7,57

Pt30

CV-060 Negativo 6,41 5 5,39 10,05

Pt31

CV-062 Negativo 5,72 4,93 9,29 9,95

Pt32

CV-064 Negativo 8,06 5,41 7,64 9

Pt33

CV-066 Negativo 9,93 7,94 10,78 9,95

Pt34

CV-068 Negativo 2,36 6,39 5,73 1,81

Resumen de Resultados

Tabla 54: Tumor frente a normal adyacente

Marcador Tumor ( M ± DT) Normal ( M ± DT)R P MCM2 17,43 ± 7,34 3,71 ± 2,21 4,70 <0,0001 MCM6 14,32 ± 4,32 4,12 ± 1,56 3,48 <0,0001 MCM7 19,38 ± 6,94 5,85 ± 2,59 3,31 <0,0001 TOP2A 20,53 ± 7,54 5,56 ± 3,33 3,69 <0,0001

M: Media; DT: Desviación Típica; R: Proporción de las medias de tumores frente a normal; P: valor P del ensayo t.

Marcador Tipo de Tumor VPH Casos Tumor (M ± DT) Normal

Tabla 55: VPH-16 frente a VPH-18

(M ± DT)

MCM2

16 18 16,77 ± 6,78 3,29 ± 2,13

18

8 17,23 ± 8,16 3,99 ± 2,40

16+18

6 14,52 ± 7,18 4,27 ± 2,47

MCM6

16 18 14,19 ± 4,44 3,97 ± 1,75

18

8 14,24 ± 4,10 4,35 ± 1,54

16+18

6 12,38 ± 3,89 3,92 ± 1,04

MCM7

16 18 19,39 ± 6,94 6,07 ± 2,98

18

8 17,23 ± 4,16 5,07 ± 1,91

16+18

6 18,04 ± 7,71 6,07 ± 2,56

TOP2A

16 18 20,92 ± 7,38 5,46 ± 3,26

18

8 19,78 ± 9,52 6,19 ±3,33

16+18

6 18,41 ± 7,49 5,32 ± 3,57

Tabla 56: Carcinoma de Células Escamosas frente a Adenocarcinoma

Marcador Histopatología Casos Tumor (M ± DT) Normal

MCM2

CCE AC 30 4 17,66 ± 7,28 15,72 ± 8,69 (M ± DT) 3,74 ± 2,23 3,39 ± 2,49

MCM6

CCE AC 30 4 14,48 ± 4,44 13,16 ± 3,49 4,13 ± 1,55 4,03 ± 1,98

MCM7

CCE AC 30 4 19,27 ± 7,25 20,20 ± 4,57 6,01 ± 2,58 4,32 ± 2,53

TOP2A

CCE AC 30 4 20,01 ± 7,47 21,47 ± 7,87 5,65 ± 3,34 4,77 ± 3,92

CCE: Carcinoma de Células Escamosas; AC: Adenocarcinoma

Ejemplo 12 (Ejemplo base): Detección por PCR de Biomarcadores en Líneas Celulares de Cáncer de Cuello uterino y de Mama

15 Se realizó PCR en tiempo real TaqMan® para detectar niveles de expresión de MCM2, MCM6 y MCM7 en líneas celulares de cáncer de cuello uterino y de mama.

Diseño Experimental y Protocolos

20 Se adquirieron tres líneas celulares de cuello uterino humano de SiHa, Caski y HeLa y tres líneas celulares de cáncer de mama humano de MCF-7, SK-BR3 y CAMA procedentes de la ATCC y se usaron en este experimento. Se extrajo ARN celular total de células recién cultivadas mediante el kit RNeasy® Protect Mini (Qiagen, Valencia, CA) y se convirtió en la forma de ADNc monocatenario con hexámeros al azar usando el Kit de Alta Capacidad de ADNc Archive (Applied Biosystems, P/N: 4322171). Se realizó PCR en tiempo real en el Sistema de Detección de

25 Secuencias ABI Prism® 7700 usando la Mezcla Maestra PCR Universal TaqMan® (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).

Se diseñaron cebadores y las sondas para amplificación específica de MCM2, MCM6 y MCM7 con el programa ABI Primer Express™, v1.5. MCM7 contenía cuatro variantes transcripcionales: la variante transcripcional 1 (T1, refsec NM_005916) y la variante transcripcional 2 (T2, refsec NM_182776) se identificaron en la base de datos de nucleótidos NCBI Entrez. La variante T3 y la T4 tenían exones alternos cerca del extremo 5’, analizado por

5 ensamblaje EST a través del Model Maker de NCBI. Los cebadores y sondas se diseñaron como T1T3, T2T4, T2 y T3T4 para detectar específicamente las variantes T1 y T3, T2 y T4, T2 y T3 y T4, respectivamente. Las secuencias de cebadores y sondas se han mostrado anteriormente en los Ejemplos 10 y 11.

Las sondas se marcaron con un colorante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) en la base 5’ y un colorante

10 inactivador TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina) en la base 3’. Como control endógeno se utilizó ARN Ribosómico 18S. La sonda de ARNr 18S se marcó con un colorante fluorescente VIC. La mezcla cebador/sonda ARNr 18S predesarrollada se adquirió en Applied Biosystems. Se aplicaron 10 ng de ADNc a la mezcla de reacción que contenía 0,9 μM y 0,25 μM de los cebadores y sondas, respectivamente, en un volumen total de 25 μl. Las condiciones de amplificación fueron: 2 minutos a 50 ºC, 10 minutos a 95 ºC y un ciclo bietapa de 95 ºC durante 15 segundos y 60 ºC

15 durante 60 segundos durante un total de 40 ciclos. En cada procesamiento se incluyeron al menos tres mezclas de reacción de control sin molde. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Se empleó el método de cuantificación relativa para calcular los niveles de expresión de los genes diana con respecto al control endógeno 18S, basándose en sus valores CT siguiendo el manual del usuario de ABI (P/N 4303859).

20 Resultados

Los resultados obtenidos para cada biomarcador se indican a continuación en un formato de tabla.

Tabla 57: Expresión de Biomarcadores en Líneas Celulares de Cáncer de Cuello Uterino y Mama

SiHa

Caski HeLa MCF7 SK-BR3 CAMA

MCM2

21,4 5,01 8,79 18,84 7,65 17,32

MCM6

12,34 5,77 6,46 12,6 5,44 13,14

MCM7

20,53 17,27 8,31 26,91 30,38 25,36

Conclusiones

La línea celular HeLa de cuello uterino mostró tener niveles de expresión bajos de los biomarcadores MCM2, MCM6

30 y MCM7. Las líneas celulares de cuello uterino SiHa, MCM7 de mama y CAMA mostraron sobreexpresión de los biomarcadores MCM2, MCM6 y MCM7. Las líneas celulares Caski de cuello uterino y SK-BR3 de mama mostraron sobreexpresión de MCM7 pero baja expresión para MCM2 y MCM6.

Ejemplo 13 (Ejemplo base): Inducción de la Expresión de Biomarcadores de Cuello Uterino en Células 293 por 35 Transfección Transitoria de Genes E6/E7 del VPH16

Para investigar la interrelación de la expresión de biomarcadores de cuello uterino con la transcripción de oncogenes del VPH de alto riesgo se usó el ensayo de PCR en tiempo real TaqMan® en un sistema de la línea celular HEK 293.

40 Diseño Experimental y Protocolos

En este experimento se adaptó un sistema de expresión regulado por tetraciclina (sistema T-Rex, Invitrogen, Inc). Se construyeron vectores T-Rex que expresaban la proteína de E2, E6 o E7 del VPH. Como controles negativos se utilizaron vectores que contenían los genes mutantes E2, E6 o E7. Las células T-Rex 293 se transfectaron después 45 con plásmidos del VPH y la expresión de los genes del VPH se activó por tetraciclina durante 4 horas, 24 horas y 72 horas. Se extrajo ARN celular total procedente de las células transfectadas mediante un kit RNeasy® Protect Mini (Qiagen, Valencia, CA) y se convirtieron en la forma ADNc monocatenario con hexámeros aleatorios usando el Kit de Alta Capacidad de ADNc Archive (Applied Biosystems, P/N: 4322171). Se realizó PCR en tiempo real en el Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism® 7700 usando la Mezcla Maestra PCR Universal TaqMan® (Applied

50 Biosystems, Inc., Foster City, CA).

Se diseñaron cebadores y sondas para amplificación específica de MCM2, MCM6 y MCM7 TOP2A, Ciclina E1, p21, p14, E2, E6 y E7 del VPH16 con el programa ABI Primer Express™, v1.5. MCM7 contenía cuatro variantes transcripcionales: la variante transcripcional 1 (T1, refsec NM_005916) y la variante transcripcional 2 (T2, refsec 55 NM_182776) se identificaron en la base de datos de nucleótidos NCBI Entrez. La variante T3 y T4 tenían exones alternos cerca del extremo 5’, analizado por ensamblaje EST a través del Model Maker de NCBI. Los cebadores y las sondas se diseñaron como T1T3, T2T4, T2 y T3T4 para detectar específicamente las variantes T1 y T3, T2 y T4, T2 y T3 y T4, respectivamente. Las secuencias de cebadores y sondas son como se muestra en los Ejemplos 10 y

11.

Las sondas se marcaron con un colorante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) en la base 5’ y un colorante inactivador TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina) en la base 3’. Como control endógeno se utilizó ARN Ribosómico 18S. La sonda de ARNr 18S se marcó con un colorante fluorescente VIC. La mezcla cebador/sonda ARNr 18S predesarrollada se adquirió en Applied Biosystems. Se aplicaron 10 ng de ADNc a la mezcla de reacción que contenía 5 0,9 μM y 0,25 μM de los cebadores y sondas, respectivamente, en un volumen total de 25 μl. Las condiciones de amplificación fueron: 2 minutos a 50 ºC, 10 minutos a 95 ºC y un ciclo bietapa de 95 ºC durante 15 segundos y 60 ºC durante 60 segundos durante un total de 40 ciclos. En cada procesamiento se incluyeron al menos tres mezclas de reacción de control sin molde. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Se empleó el método de cuantificación relativa para calcular los niveles de expresión de los genes diana con respecto al control endógeno

10 18S, basándose en sus valores CT siguiendo el manual del usuario de ABI (P/N 4303859).

Resultados

Se observó que la expresión de los genes E2, E6 y E7 del VPH16 en células 293 T-Rex aumentaba durante el

15 transcurso de la transfección. La expresión del ARNm de Topo2A, MCM2, MCM6, MCM7 y ciclina E en células 293 T-Rex se indujo significativamente por los genes E6 o E7 del VPH16, después de la transfección de 4 horas hasta 72 horas. Sin embargo, no se detectaron niveles de expresión elevados para p21 y p14 después de la transfección génica del VPH. La expresión de E6 o E7 no pareció reprimirse por la co-transfección del gel E2. Esto es porque la expresión de E6 o E7 la condujo íntegramente el promotor de CMV externo en lugar de los promotores naturales del

20 VPH. Lo último no está presente en este sistema modelo.

Tabla 58: Topo2A

Transfección

0 h 0 h DT 4 h 4 h DT 24 h 24 h DT 72 h 72 h DT

293-H16E2

6,91 0,07 5,22 0,13 5,68 0,14 6,61 0,36

293-H16E6

6,91 0,07 11,31 0,22 18,13 0,89 17,39 0,85

293-H16E7

6,91 0,07 20,33 0,9 28,94 0,71 35,02 1,03

293-H16dE7

6,91 0,07 6,43 0,35 8,18 0,64 7,39 0,18

293-LacZ

6,91 0,07 7,4 0,07 7,36 0,22 7,25 0,67

Tabla 59: MCM2

Transfección

0 h 0 h DT 4 h 4 h DT 24 h 24 h DT 72 h 72 h DT

293-H16E2

4,79 0,23 5,25 0,36 5,24 0,31 4,44 0,3

293-H16E6

4,79 0,23 6,04 0,21 9,38 0,37 12,08 0,18

293-H16E7

4,79 0,23 10,81 0,16 12,29 0,36 16,34 0,8

293-H16dE7

4,79 0,23 5,72 0,36 4,98 0,27 5,03 0,39

293-LacZ

4,79 0,23 5,67 0,61 5,68 0,47 5,98 0,79

Tabla 60: MCM6

Transfección

0 h 0 h DT 4 h 4 h DT 24 h 24 h DT 72 h 72 h DT

293-H16E2

3,62 0,2 3,5 0,22 4,72 0 4,44 0,26

293-H16E6

3,62 0,2 4,74 0,07 9,03 0,04 9,68 0,43

293-H16E7

3,62 0,2 7,7 0,04 13,5 0,33 14,03 0,41

293-H16dE7

3,62 0,2 5,23 0,28 4,6 0,32 4,73 0,37

293-LacZ

3,62 0,2 4,77 0,12 4,66 0,14 5,34 0,39

4Tabla 61: MCM7

Transfección

0 h 0 h DT 4 h 4 h DT 24 h 24 h DT 72 h 72 h DT

293-H16E2

4,2 0,04 6,3 0,28 5,3 0,18 5,8 0,31

293-H16E6

4,2 0,04 4,99 0,05 9,55 0,23 15,24 0,3

293-H16E7

4,2 0,04 10,11 0,84 14,23 0,84 21,18 0,31

293-H16dE7

4,2 0,04 3,65 0,3 6,06 0,3 4,64 0,07

293-LacZ

4,2 0,04 5,74 0,45 5,31 0,55 5,66 0,17

Tabla 62: Ciclina E1

Transfección

0 h 0 h DT 4 h 4 h DT 24 h 24 h DT 72 h 72 h DT

293-H16E2

6,02 0,00 5,06 0,10 5,03 0,35 5,72 0,31

293-H16E6

6,02 0,00 9,19 0,18 8,95 0,79 9,38 0,18

293-H16E7

6,02 0,00 12,91 0,38 17,63 0,17 17,32 0,25

293-H16dE7

6,02 0,00 5,45 0,24 6,87 0,20 5,11 0,08

293-LacZ

6,02 0,00 5,72 0,31 6,28 0,37 5,65 0,64

Tabla 63: p21

Transfección

0 h 0 h DT 4 h 4 h DT 24 h 24 h DT 72 h 72 h DT

293-H16E2

4,76 0,19 4,05 0,30 5,19 0,61 4,92 0,60

293-H16E6

4,76 0,19 5,56 0,19 5,60 0,08 7,21 0,07

293-H16E7

4,76 0,19 7,52 0,29 5,22 0,13 6,45 0,13

293-H16dE7

4,76 0,19 4,38 0,26 5,60 0,66 5,10 0,05

293-LacZ

4,76 0,19 3,86 0,00 4,53 0,27 5,37 0,29

Tabla 64: p14

Transfección

0 h 0 h DT 4 h 4 h DT 24 h 24 h DT 72 h 72 h DT

293-H16E2

4,78 0,30 4,44 0,09 5,04 0,44 5,04 0,07

293-H16E6

4,78 0,30 4,77 0,12 5,48 0,13 4,52 0,11

293-H16E7

4,78 0,30 6,38 0,62 5,60 0,25 6,43 0,35

293-H16dE7

4,78 0,30 5,08 0,12 5,53 0,35 5,10 0,15

293-LacZ

4,78 0,30 4,54 0,40 4,68 0,16 5,76 0,25

Tabla 65: E2 del VPH16

E2

E6 E7 dE2 dE6 dE7 E2+E6 E2+E7 dE2+E6 dE2+E7 LacZ Simulad o

4 h

130,22 0 0 110,7 0 0 95,34 36,6 3,94 12,86 0 0

24 h

0 0 111,41 0 0 118,17 90,19 19,77 7,7 0 0

72 h

0 0 141,57 0 0 162,54 128,41 32,94 9,89 0 0

Tabla 66: E6 del VPH16

E2

E6 E7 dE2 dE6 dE7 E2+E6 E2+E7 dE2+E6 dE2+E7 LacZ Simula do

4 h

0 205 0 0 219,87 0 128,41 0 199,65 0 0 0

24 h

0 329,67 0 0 225,96 0 158,31 0 188,03 0 0 0

72 h

0 757,26 0 0 315,22 0 392 0 271,55 0 0 0

Tabla 67: E7 del VPH16

E2

E6 E7 dE2 dE6 dE7 E2+E6 E2+E7 dE2+E6 dE2+E7 LacZ Simula do

4 h

0 0 330,76 0 0 165,48 0 120,65 0 201,19 0 0

24 h

0 0 1514,6 0 0 239,63 0 857,89 0 600,57 0 0

72 h

0 0 2806,8 0 0 355,9 0 1444,25 0 809,11 0 0

5 Ejemplo 14: La Accesibilidad del Antígeno Aumenta en los Métodos Inmunocitoquímicos e Inmunohistoquímicos Usando un Tampón de Tratamiento Previo para Portaobjetos

Selección de Especímenes y Descripción de Reactivos

10 Especímenes citológicos e histológicos relacionados, procedentes del mismo paciente, se sometieron a inmunoensayo para detectar la sobreexpresión de biomarcadores. Se analizaron muestras de tejido bloqueadas en parafina y especímenes citológicos SurePath® de pacientes clasificados como ASCUS (3), LSIL (6) y HSIL (5). Los reactivos usados fueron el Cóctel de Anticuerpos (para citología) el Cóctel de Anticuerpos Modificado (para histología), Reactivos de Detección, Tinciones de Contraste y el Tampón de Preparación SureSlide® 10X (tampón de

15 tratamiento previo).

Preparación de Portaobjetos para citología e Inmunocitoquímica Automatizada

Para la inmunocitoquímica, la preparación y el tratamiento previo de los portaobjetos se realizó como se indica en el

20 Ejemplo 5. Después se realizó la inmunocitoquímica automatizada sobre cada espécimen citológico como se describe en el Ejemplo 5 con una excepción. La incubación del cóctel de anticuerpos primarios (Clon MCM2 26H6.19 1:10.000, Clon MCM2 27C5.6 1:800, Clon TOPOILA SWT3D1 1:1000) se redujo a 30 minutos para este experimento.

25 Preparación de Portaobjetos para histología e Inmunocitoquímica automatizada

Para cada caso, se cortaron secciones de 4 micrómetros y se secaron durante una noche o durante 20 minutos en un horno de ventilación forzada a 70 ºC. Las secciones de desparafinaron en tres cambios de xileno durante 5 minutos cada uno. Después los portaobjetos se limpiaron en alcohol absoluto durante 5 minutos cada uno. Los

30 portaobjetos se redujeron de agua y se aclararon cuidadosamente. Los portaobjetos se transfirieron a una solución previamente calentada de Tampón de Preparación SureSlide 1X y se incubaron en el vaporizador durante 25 minutos. Los portaobjetos se retiraron del vaporizador y se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los portaobjetos se aclararon lentamente en agua hasta que el tampón estuvo completamente cambiado. Se aplicó un aclarado con TBST durante 2 cambios a 2 minutos cada uno.

35 La inmunohistoquímica automatizada se realizó como se describe en el Ejemplo 5 para la inmunocitoquímica, con dos excepciones. La incubación del cóctel de anticuerpos primarios se redujo a 30 minutos para este experimento. Adicionalmente, el cóctel de anticuerpos primarios se modificó con las siguientes diluciones (Clon MCM2 26H6.19 1:4.000, Clon MCM2 27C5.6 1:200, Clon TOPOILA SWT3D1 1:400).

Resultados

Se observaron los modelos de tinción previstos tanto en los especímenes histológicos como en los citológicos con el uso de los reactivos RUO. Específicamente, la capacidad de inmunotinción tanto de especímenes histológicos como

45 citológicos con el Tampón de Preparación SureSlide®, Reactivos de Detección y Reactivos de Tinción de Contraste se demostró de manera satisfactoria.

Tabla 68: Información de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los Biomarcadores

Secuencia de Nucleótidos

Secuencia de Aminoácidos

Nombre del Biomarcador

Nº de Acceso Identificador de Secuencia Nº de Acceso Identificador de Secuencia

Ciclina E1 (Isoforma 1)

NM_001238 SEC ID Nº: 1 NP 001229 SEC ID Nº: 2

Ciclina E1 (Isoforma 2)

NM_057182 SEC ID Nº: 3 NP 476530 SEC ID Nº: 4

Ciclina E2 (Isoforma 1)

NM_057749) SEC ID Nº: 5 NP 477097 SEC ID Nº: 6

Ciclina E2 (Isoforma 2)

NM_057735 SEC ID Nº: 7 NP 477083 SEC ID Nº: 8

Ciclina E2 (Isoforma 3)

NM_004702 SEC ID Nº: 9 NP 004693 SEC ID Nº: 10

MCM2

NM_004526 SEC ID Nº: 11 NP 0045417 SEC ID Nº: 12

MCM6

NM_005915 SEC ID Nº: 89 NP 005906 SEC ID Nº: 90

MCM7 (Isoforma 1)

NM_005916 SEC ID Nº: 13 NP 005907 SEC ID Nº: 14

MCM7 (Isoforma 2)

NM_182776 SEC ID Nº: 15 NP 877577 SEC ID Nº: 16

p21/waf1 (Variante 1)

NM_000389 SEC ID Nº: 17 NP 000380 SEC ID Nº: 18

p21/waf1 (Variante 2)

NM_078467 SEC ID Nº: 19 NP 510867 SEC ID Nº: 20

p14ARF

NM_058195 SEC ID Nº: 21 NP 478102 SEC ID Nº: 22

Topo2a

NM_001067 SEC ID Nº: 23 NP 0010568 SEC ID Nº: 24

A la luz de la descripción y de los ejemplos anteriores, un experto en la materia apreciará que los métodos de la

5 invención permiten mejorar la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado, independientemente de la edad, en comparación con la realización práctica convencional. Los métodos de la invención pueden encontrar un uso particular como se describe a continuación:

• Para mujeres mayores de treinta años, el ensayo puede ser un reflejo de un resultado positivo para VPH o un 10 reflejo de un resultado citológico ASCUS+.

•

Para mujeres menores de 30 años, el ensayo puede usarse en combinación con citología para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado.

•

Para mujeres mayores de 30 años, el ensayo puede usarse en combinación con citología para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado.

15 • Para mujeres menores de 30 años, el ensayo puede usarse como una exploración primaria para detectar enfermedades de cuello uterino de alto grado.

• Para mujeres mayores de 30 años, el ensayo puede usarse como una exploración primaria para detectar enfermedades de cuello uterino de alto grado.

•

El ensayo puede ser un sustituto del frotis Pap en mujeres menores de treinta años. 20 • Finalmente, el ensayo puede ser un sustituto del frotis Pap, independientemente de la edad.

Otras posibles ventajas que surgen a raíz de la realización práctica de la presente invención incluyen:

•

Detección de anomalías histológicas de alto grado en mujeres de 30 años y mayores con resultados NIL/VPH 25 positivos

•

Especificidad superior para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado en mujeres mayores de 30 años que son positivas para el ensayo Pap + ADN.

•

Detección superior para enfermedades de cuello uterino de alto grado en mujeres con las categorías ASCUS,

ASC-H y LSIL, independientemente de la edad. 30 • Especificidad superior para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado en la categoría HSIL.

•

Detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado junto con diagnóstico basado en citología en mujeres menores de 30 años.

•

Detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado junto con diagnóstico basado en citología, independientemente de la edad.

35 • Especificidad mejorada para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado como una exploración primaria en mujeres menores de 30 años.

• Especificidad mejorada para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado como una exploración primaria, independientemente de la edad.

• Identificación de enfermedades de cuello uterino y diferenciación de infección por VPH y de enfermedad de cuello 40 uterino de alto grado.

• Pueden establecerse rendimientos de ensayo aceptables usando interpretación manual o interpretación asistida mediante microscopia automatizada.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la materia a la que pertenece esta invención.

Aunque la anterior invención se ha descrito con detalle a modo de ilustración y se han proporcionado ejemplos con objeto de claridad de entendimiento, será evidente que en la realización práctica de la invención puedan efectuarse determinados cambios y modificaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Fischer, Timothy J. Malinowski, Douglas P. Taylor, Adriann J. Parker, Margaret R.

<120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA DETECCIÓN DE ENFERMEDADES DE CUELLO UTERINO

<130> 46143/290269

<150> 60/556.495

<151>

<160> 90

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 1958

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 1787

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 395

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 2748

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 404

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 2613

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 359

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 2536

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 296

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 3453

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 904

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 2821

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 719

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 2900

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 543

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 2140

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 164

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 2281

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 164

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 1275 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 173

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 5698

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 1531

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 25 ctctgagccc gccaagc

17

<210> 26 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 26 tgtaagaact tcttaacctt ttccttctct a

31

<210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 27 ccctcggcag cgatggcact

20

<210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 28 gaggaatccc gagctgtgaa

20

<210> 29 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 29 cccgctcccg ccat

14

<210> 30 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 30 cccatgtgct tctttgttta ctaagagcgg aa

32

<210> 31

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 31 gtccgaagcc cccagaa 17

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 32 cccgacagag accactcaca 20

<210> 33

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 33 cagtaccctg ctgaactcat gcgca 25

<210> 34

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 34 cgctacgcga agctctttg 19

<210> 35

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 35 cctttgtttg ccattgttct ctaa 24

<210> 36

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 36 tgccgtacaa gagctgctgc ctca 24

<210> 37

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 37 caaacgccgg ctgatctt 18

<210> 38

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 38 ccaggactgc aggcttcct 19

<210> 39

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 39 caagaggaag ccctaatccg ccca 24

<210> 40

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 40 gagcggcggc agacaa 16

<210> 41

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 41 ccgcgaacac gcatcct 17

<210> 42

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 42 cccagagccg agccaagcgt g 21

<210> 43

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 43 tggagactct cagggtcgaa a

<210> 44

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 44 tccagtctgg ccaacagagt t

<210> 45

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 45 cggcggcaga ccagcatgac

<210> 46

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 46 gccctcgtgc tgatgctact

<210> 47

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 47 tcatcatgac ctggtcttct agga

<210> 48

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 48 agcgtctagg gcagcagccg c

<210> 49

<211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 49 tgcccaacgc accga

15

<210> 50 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 50 gggcgctgcc catca

15

<210> 51 <217> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 51 tcggaggccg atccaggtca tg

22

<210> 52 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 52 aagcttcctt tccgtcatgc

20

<210> 53 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 53 catgacctgc cagagagaac ag

22

<210> 54 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 54 cccccaccct ggctctgacc a

21

<210> 55

<211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 55 ggaaaccaag gaagaggaat gag

23

<210> 56 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 56 tgttcccccc ttcagatctt ct

22

<210> 57 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 57 acgcgcgtac agatctctcg aatgct

26

<210> 58 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 58 cacgccctaa gcgcacat

18

<210> 59 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 59 cctagttcac aaaatgcttg tcatg

25

<210> 60 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 60 tttcttgcga gcctcgcagc ctc

23

<210> 61

<211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 61 aaagaagatg atgaccgggt ttac

24

<210> 62 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 62 gagcctctgg atggtgcaa

19

<210> 63 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 63 caaactcaac gtgcaagcct cgga

24

<210> 64 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 64 tccgccgcgg acaa

14

<210> 65 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 65 catggtgtcc cgctcctt

18

<210> 66 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 66 accctggcct caggccggag

20

<210> 67

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 67 ggaattgttg gccacctgta tt 22

<210> 68

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 68 ctggagaaat cacttgttcc tatttct 27

<210> 69

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 69 cagtccttgc attatcattg aaacacctca ca 32

<210> 70

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 70 tcaactcatt ggaattacct cattattc 28

<210> 71

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 71 accatcagtg acgtaagcaa actc 24

<210> 72

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 72 ccaaacttga ggaaatctat gctcctaaac tcca 34

<210> 73

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Cebador

<400> 73

ttttgaagtt ctgcattctg acttg 25 10

<210> 74

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Cebador

<400> 74 20 accatcagtg acgtaagcaa gataa 25

<210> 75

<211> 34

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

30 <400> 75 aaccacagat gaggtccata cttctagact gget 34

<210> 76

<211> 156 35 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE 40 <222> (1)...(156)

<223> Secuencia parcial de aminoácidos para la isoforma 1 p16/p14ARF

<400> 76

<210> 77

<211> 105

<212> PRT

<213> Homo sapiens

5 <220>

<221> VARIANTE

<222> (1)...(105)

<223> Secuencia parcial de aminoácidos para la isoforma 2 p16/p14ARF

10 <400> 77

<210> 78 15 <211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 20 <221> VARIANTE

<222> (1)...(116)

<223> Secuencia parcial de aminoácidos para la isoforma 3 p16/p14ARF

<400> 78 25

<210> 79

<211> 173

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 80 ggaggtggta ctggccatgt a 21

<210> 81

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 81 gggagatgcg gacatggat 19

<210> 82

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 82 ccaagtacga ccgcatcacc aacca 25

<210> 83

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 83 cattccaaga cctgcctacc a 21

<210> 84

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 84 atgcgagtga gcaaaccaat t 21

<210> 85

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 85 acacaagatt cgagagctca cctcatcca 29

<210> 86

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 86 ggctacatgg tggcaagga 19

<210> 87

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 87 tggaaataac aatcgagcca aag 23

<210> 88

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR

<400> 88 tgctagtcca cgatacatct ttacaatgct cagc 34

<210> 89

<211> 3769

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 89

<210> 90

<211> 821

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado en una paciente, comprendiendo dicho método:

   a) poner en contacto una muestra corporal de dicha paciente al menos con tres anticuerpos, en el que un primer y segundo anticuerpo se unen específicamente a la proteína 2 de mantenimiento de minicromosomas MCM2 y un tercer anticuerpo que se une específicamente a la toposiomerasa II alfa, Topo2A; y, b) detectar la unión de los anticuerpos a MCM2 y a Topo2A.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en el que los al menos tres anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, en el que el método comprende realizar inmunocitoquímica.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1, 2 ó 3 en el que el método se realiza manualmente; o en el que el método se realiza de manera automatizada.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende células de cuello uterino; preferentemente una monocapa de células de cuello uterino.

6. 6.

   El método de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende células de cuello uterino en suspensión en una preparación basada en líquido o una muestra tisular de cuello uterino.

7. 7.

   El método de la reivindicación 1, en el que la sensibilidad de dicho método, para diagnosticar una enfermedad de cuello uterino de alto grado, es de al menos el 90%; o en el que la especificidad de dicho método, para diagnosticar una enfermedad de cuello uterino de alto grado, es de al menos el 85%.

8. 8.

   El método de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende efectuar tinción de Papanicolaou (Pap) de la muestra.

9. 9.

   El método de la reivindicación 1, en el que dichos al menos tres anticuerpos se ponen en contacto con dicha muestra secuencialmente, como reactivos de anticuerpos individuales; o en el que dichos anticuerpos se ponen en contacto con dicha muestra simultáneamente, como un cóctel de anticuerpos.

10. 10.

    El método de la reivindicación 1, en el que el método se realiza en respuesta a una paciente que tiene un resultado anómalo en un ensayo de frotis Pap, o en el que el método se realiza como una exploración primaria para detectar una enfermedad de cuello uterino de alto grado en una población general de pacientes.

11. 11.

    Un kit que comprende al menos tres anticuerpos, en el que un primer y un segundo anticuerpo, incluidos en el kit, se unen específicamente a MCM2 y en el que un tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A.

12. 12.

    El kit de la reivindicación 11, en el que los al menos tres anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

13. 13.

    El kit de la reivindicación 11, en el que dicho kit comprende adicionalmente un reactivo bloqueador de peroxidasa, un reactivo bloqueador de proteína, productos químicos para la detección de la unión de anticuerpos a dichas proteínas biomarcadoras, un colorante de contraste, un agente colorante azul e instrucciones para su uso.

14. 14.

    El kit de la reivindicación 13, en el que para la detección de la unión de anticuerpos, dichos productos químicos comprendeN un cromógeno y un anticuerpo secundario conjugado con un polímero marcado, en el que el cromógeno comprende 3’,3’-diaminobencidina y en el que el polímero marcado comprende peroxidasa de rábano picante conjugada con un polímero de dextrano; dicho colorante de contraste comprende hematoxilina; o en el que dicho agente colorante azul comprende una solución que comprende solución salina tamponada con Tris, pH 7,4, Tween-20 y azida sódica.

15. 15.

    El kit de la reivindicación 11 ó 13 que comprende adicionalmente una muestra de control positivo; en la que preferentemente dicha muestra de control positivo comprende células SiHa.

16. 16.

    El kit de la reivindicación 11 ó 13 que adicionalmente comprende reactivos para tinción Pap; en el que preferentemente los reactivos para tinción Pap comprenden EA50 y Orange G.

17. 17.

    El kit de la reivindicación 11 ó 13, en el que dichos al menos tres anticuerpos se proporcionan como reactivos individuales; o en el que dichos al menos tres anticuerpos se proporcionan como un cóctel.

18. 18.

    Un método para usar el kit de la reivindicación 11 ó 13 para diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado en una muestra procedente de una paciente, que comprende poner en contacto dicha muestra con dichos al menos tres anticuerpos.