CN1957256A - 用于子宫颈疾病检测的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

提供了用于在患者样品中鉴定高度子宫颈疾病的方法和组合物。本发明的方法包括在机体样品中检测至少一种生物标志物的过表达，其中所述生物标志物选择性地在高度子宫颈疾病中过表达。在特定的权利要求中，所述机体样品是Pap抹片或单层宫颈细胞。本发明的生物标志物包括参与细胞周期调控、信号转导和DNA复制及转录的基因和蛋白。在特定的权利要求中，所述生物标志物是S期基因。在本发明的一些方面，使用生物标志物的特异性抗体在蛋白水平上或使用核酸杂交技术在核酸水平上检测目的生物标志物的过表达。还提供了实施本发明方法的试剂盒。

Description

用于子宫颈疾病检测的方法和组合物

                      发明领域

本发明涉及用于检测高度子宫颈疾病的方法和组合物。

                      发明背景

宫颈癌是妇女中的第二大常见肿瘤，大约占所有女性癌症的12％，每年导致大约250,000人死亡。Baldwin等人(2003)Nature ReviewsCancer 3：1-10。在许多不能进行大规模筛查程序的发展中国家，临床问题更加严重。在这些国家，宫颈癌是妇女中癌症死亡的头号病因。

大部分宫颈癌的病例表现为鳞状细胞癌，尽管也观察到腺癌。可通过人群筛查来预防宫颈癌，因为其通过已完全明确的非浸润上皮内阶段演化而来，所述阶段可通过形态学方法进行辨别。Williams等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14932-14937。尽管不知道正常细胞是如何开始转化的，但从正常的复层上皮通过子宫颈上皮内赘瘤(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)至浸润性癌的组织病理学变化的连续谱的概念多年来已被广泛接受。宫颈癌的前身是发育异常，在本领域也称为CIN或鳞状上皮内病变(squamousintraepithelial lesions，SIL)。可使用三级(three-tiered)(CIN)或二级(two-tiered)(Bethesda)系统将鳞状上皮内异常分类。在Bethesda系统下，低度鳞状上皮内病变(LSIL)，对应于CINI和HPV感染，通常代表了有效果的HPV感染，其发展成浸润性疾病的风险相对较低。尽管LSIL和HSIL都被视为恶性肿瘤的潜在前身，但在三级系统中对应于CINII和CINIII的高度鳞状上皮内病变(HSIL)，和LSIL相比显示更高的发展成宫颈癌的风险。在该系统下，也可将患者的样品分类为ASCUS(意义不明的非典型性鳞状细胞，atypical squamouscells of unknown significance)或AGUS(意义不明的非典型性腺细胞，atypical glandular cells of unknown significance)。

已证实宫颈癌和通过高危型的人乳头瘤病毒(HPV)例如16、18和31型的感染之间的强关联性。事实上，大量流行病学和分子生物学证据已将HPV感染确定为宫颈癌的病因因素。此外，在85％或更多的高度子宫颈疾病的病例中发现了HPV。然而，HPV感染非常普遍，可能在5-15％超过30岁的妇女中发生，但很少有HPV阳性的妇女会发展成高度子宫颈疾病或癌症。单独的HPV存在只是感染的指标，而不是高度子宫颈疾病的指标，因此，只对HPV感染进行检测导致许多假阳性。参见，例如，Wright等人(2004) Obstet.Gyhecol.103：304-309。

目前的文献表明HPV感染宫颈的深部组织内的基底干细胞。干细胞向成熟角质形成细胞的分化(结果导致所述细胞迁移至复层子宫颈上皮)和HPV病毒复制以及细胞的再传染有关联。在该病毒复制过程中，发生许多细胞变化，包括细胞周期失控(de-regulation)、活跃的增殖、DNA复制、转录激活和基因组的不稳定性(Crum(2000)ModeriiPatliology 13：243-251；Middleton等人(2003)J.Virol.77：10186-10201；Pett等人(2004)CaracerRes.64：1359-1368)。

大多数HPV感染实际上是短暂的，因为病毒感染会在12个月内将其自身消解。对于那些因为一种或多种HPV的致癌亚型而发生持久性感染的个体，和无HPV感染的患者相比，存在发展瘤形成的风险。已知HPV在子宫颈瘤形成(cervical neoplasia)的发展上的重要性，在鉴定可能发生子宫颈瘤形成的患者上，HPV的临床检测已逐渐成为重要的诊断工具。基于HPV的子宫颈疾病的筛查的临床功效在于其阴性预测价值。HPV阴性结果和正常的Pap抹片检查史一起是无疾病状况和在以后的1-3年期间较少可能发生子宫颈瘤形成的优良指标。然而，阳性HPV结果不是子宫颈疾病的诊断，而只是感染的指征。尽管大多数HPV感染是短暂的并且会在12个月的时期内自发清除，但具有高危HPV病毒亚型的持续性感染预示着发生子宫颈瘤形成的更大可能性。为补充HPV检测，预期和子宫颈瘤形成关联的分子标志物的鉴定可提高针对子宫颈疾病诊断的临床特异性。

对经帕帕尼古拉乌染色的子宫颈抹片(Pap抹片)进行细胞学检查目前是检测子宫颈癌所选用的方法。Pap抹片检查是种主观的方法，60多年来其基本上保持未变。然而，关于其性能存在几个顾虑。报道的单一Pap检查的灵敏度(检查呈阳性的疾病阳性的比例)较低，并且显示较宽的变化范围(30-87％)。对于潜在的高度疾病的确定，单一Pap抹片检查的特异性(经检验呈阴性的疾病阴性的比例)在筛查人群中低达86％，在ASCUS PLUS人群中更要低得多。参见，Baldwin等人，同上。相当比例的鉴定为LSIL或CINI的Pap抹片检查实际上是高度病变阳性。此外，高达10％的Pap抹片检查被分类为ASCUS(意义不明的非典型性鳞状细胞)，即不太可能明确归类为正常、中度或严重病变、或肿瘤。然而，经验显示高达10％的该ASCUS群体具有高度病变，所述病变因此而被忽略掉。参见，例如，Manos等人(1999) JAMA281：1605-1610。

因此，需要这样的用于诊断高度子宫颈疾病的方法，该方法不依赖于常规的Pap抹片检查和针对高危HPV感染的分子检测或者与其一起使用。该方法应当能够特异性地鉴定存在于所有患者群体中的高度子宫颈疾病，包括通过Pap染色被分类为LSIL或CINI、而实际上是高度病变阳性(即，“假阴性”)的病例。因此，本领域需要这样的特异的、可靠的诊断方法，该方法能够检测高度子宫颈疾病以及能够区别高度疾病和不被当作临床疾病的病症例如早期HPV感染和轻度发育异常。

                      发明概述

提供了用于诊断高度子宫颈疾病的组合物和方法。本发明的方法包括检测至少一种生物标志物、特别是核生物标记物在机体样品中的过表达，其中所述所述生物标志物的过表达的检测特异性地鉴定显示高度子宫颈疾病的样品。本方法可将显示高度子宫颈疾病的样品和显示良性增殖、早期HPV感染或轻度发育异常的样品区分开。因此，该方法依赖于这样的生物标志物的检测，该生物标志物选择性地在高度子宫颈疾病状态中过表达，而不在正常细胞或不指示临床疾病的细胞中过表达。

本发明的生物标志物是选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的蛋白和/或基因，包括由于HPV诱导的细胞周期功能失调和负责S期诱导的某些基因的激活造成的蛋白和/或基因的过表达。特别吸引人的生物标志物包括S期基因，其过表达是由于HPV诱导的细胞周期功能失调和随后的转录因子SP-1和E2F的激活造成的。本发明的生物标志物基因或蛋白的过表达的检测可区分显示高度疾病的样品(例如中度至严重的发育异常和宫颈癌)和正常细胞或不指示临床疾病(例如，无发育异常的早期HPV感染和轻度发育异常)的细胞。

可在蛋白或核酸水平上估计生物标志物的过表达。在一些实施方案中，提供了利用抗体在子宫颈细胞学样品中检测生物标志物的过表达的免疫细胞化学技术。在本发明的该方面，使用至少一种针对感兴趣的特定生物标志物的抗体。也可通过基于核酸的技术(包括，例如，杂交和RT-PCR)检测过表达。此外还提供了包含用于实施本发明方法的试剂的试剂盒。

也可将本发明的方法和用于分析形态学特征或HPV感染状况的常规妇科诊断技术结合使用。因此，例如，此处提供的免疫细胞化学方法可和Pap抹片检查一起使用，这样就保存了来自常规方法的所有形态学信息。通过这种方式，对在高度子宫颈疾病中选择性地过表达的生物标记物的检测可减少Pap抹片检查的高假阳性率，从而有助于大规模自动化筛查。

                      附图概述

图1提供了子宫颈结构异常中的增殖和细胞周期失控的图解概述。子宫颈瘤形成中的细胞周期变化和增殖控制缺陷。HPV感染和E6与E7癌蛋白(oncoproteins)的过表达引起了细胞周期和增殖控制中的一系列变化。HPV E6癌蛋白消除了G1/S和G2/M界线上的细胞周期关卡，结果DNA进行复制，产生体细胞突变。E7促进了加速进入S期，结果DNA复制所需的S期基因长时间表达(异常的S期诱导)。同样，E6提高了端粒酶的表达，在增殖和细胞永生化期间确保了连续的染色体端粒完整性。最后，E7消除了TGF-β信号转导途径，从而消除了G1期阻滞的该控制机制和增殖的控制。

图2提供了子宫颈瘤形成中的异常S期诱导的示意性图解说明。HPV蛋白对细胞周期控制和增殖的作用包括p53和Rb肿瘤抑制途径的失活、E2F-1转录的激活、S期基因MCM-2、MCM-6、MCM-7、TOP2A和细胞周期蛋白E1等的诱导。此外，E2和Sp-1转录因子相互作用，从而激活p21-waf-1的基因表达。

图3提供了细胞周期的异常S期中关于细胞增殖的反馈回路的示意图。S期中细胞周期蛋白E和CDK2的过表达导致允许诱导S期基因的独立机制。

图4提供了c-myc在异常S期诱导中的作用的示意图。C-myc是细胞增殖中重要的转录激活物。编码c-myc的基因位于染色体上。该位置与已证实了HPV18的整合以及该基因区域的相应扩增属同一位置。c-myc基因的扩增将导致被编码的蛋白的过表达，c-myc的增加的水平将独立地促进S期基因转录，从而进一步加速细胞增殖。

图5提供了针对MCM7转录体变体的TaqMan引物的示意图。

图6举例说明了具有轻度发育异常的患者和患有鳞状细胞癌的患者在IHC测定法中针对Claudin 1的抗体的差异染色模式。

图7举例说明IHC和ICC形式中针对Claudin 1的抗体的差异染色模式。显示了正常细胞和指示CINIII和HSIL的细胞。

图8举例说明了用核生物标志物(即，MCM2)获得的细胞核染色模式和用细胞质生物标志物(p16)获得的细胞质染色模式。结果来自高度子宫颈疾病患者样品的免疫细胞化学(ICC)测定。

图9举例说明在使用两种不同的针对MCM6的抗体对来自患有高度子宫颈疾病的患者的宫颈组织进行的免疫组织化学(IHC)测定中期望的和不期望的抗体染色。

                      发明详述

本发明提供了用于鉴定或诊断高度子宫颈疾病的组合物和方法。该方法包括检测选择性地在高度子宫颈疾病(例如中度至严重的发育异常和宫颈癌)中过表达的特定生物标志物的过表达。即，本发明的生物标志物能够区别HPV感染的细胞和癌变前、恶性的、或显露癌性的HPV感染的细胞。用于诊断高度子宫颈疾病的方法包括来自患者的组织或体液样品中检测至少一种指示高度子宫颈疾病的生物标志物的过表达。在特定的实施方案中，使用抗体和免疫细胞化学技术检测目的生物标志物的表达。此外还提供了用于实施本发明的方法的试剂盒。

“诊断高度子宫颈疾病”包括，例如，诊断或检测子宫颈疾病的存在、监控疾病的进程，和鉴定或检测指示高度子宫颈疾病的细胞或样品。术语诊断、检测和鉴定高度子宫颈疾病在此处可交换使用。“高度子宫颈疾病”是指通过阴道镜被分类为癌前病理、恶性病理、中度至严重发育异常，和宫颈癌的病症。潜在的高度子宫颈疾病包括CINII、CINIII、HSIL、原位癌、腺癌，和癌(FIGO I-IV期)的组织学鉴定。

如上所述，相当比例的表现Pap抹片检查分类为正常、CINI或ASCUS的患者实际上具有高度子宫颈疾病特征性的病变。因此，本发明的方法允许在所有患者(包括这些“假阴性”患者)群体中鉴定高度子宫颈疾病，并且便于检查患者样品中的稀有异常细胞。尽管本发明的方法也可和常规诊断技术例如Pap抹片检查、针对高危型HPV的分子检测等一起使用，但其可不依赖于细胞形态学和HPV感染状态进行诊断。

基于HPV型和宫颈癌以及癌前病变的相关性已将其分为高危型和低危型类别。低危HPV型包括6、11、42、43、44型，并且和增加的宫颈癌风险无关。相反地，高危HPV型，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型，和宫颈癌以及鳞状上皮内病变强烈相关。参见，例如，Wright等人(2004)Obstet.Gynecol.103：304-309。事实上，超过99％的宫颈癌和高危HPV感染相关。持久的高危HPV感染通过HPV基因E2、E6和E7的作用导致子宫颈细胞中细胞周期和有丝分裂关卡的破坏。具体地说，HPV E7导致细胞周期蛋白E的增加和随后转录因子E2f从视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白(Rb)的释放。然后释放的E2f转录因子触发各种S期基因的转录，导致细胞周期控制的丧失，所述S期基因包括拓扑异构酶IIα(Topo2A)、MCM蛋白、细胞周期蛋白E1和E2以及p14α。HPV E2通过激活Sp-1转录因子进一步刺激S期基因例如p21^Waf-1的过表达。由持久HPV感染引起的细胞周期的破坏可导致轻度宫颈结构异常，然后该疾病可发展为中度或严重发育异常，最终在一些情况下导致宫颈癌。“宫颈癌”指和宫颈组织或子宫颈细胞相关的任何癌症或癌症病变。

宫颈角质形成细胞内的HPV感染导致破坏细胞周期内的活动的多种变化。高危HPV亚型的E6和E7癌蛋白参与许多这样的细胞过程，所述细胞过程和被感染的角质形成细胞的增加的增殖和致瘤性转化相关。E6蛋白参与两个至关重要的过程。第一个过程是通过遍在蛋白介导的蛋白水解进行的P53肿瘤抑制蛋白的降解。功能性p53的除去消除了在进入DNA修复和有丝分裂前负责DNA修复的主要细胞周期关卡(Duensing和Munger(2003)Prog Cell Cycle Res.5：383-391)。此外，已显示E6和c-myc蛋白相互作用，负责hTERT基因的直接转录激活，随后表达端粒酶(McMurray和McCance(2003)J Virol.77：9852-9861；Veldman等人(2003)Proc Natl Acad Sci U.S.A.100：8211-8216)。端粒酶的活化是癌症生物学中负责在复制染色体时保持端粒长度的关键步骤，该酶在细胞永生化期间可确保功能完整的染色体。

已知HPV癌蛋白E7通过两个独立的机制促进细胞增殖。第一机制是通过E7和Smad蛋白(Smad2、3和4)的直接相互作用，从而抑制其结合DNA的能力(Lee等人(2002)J Biol Chem 277：38557-38564)，由此使负责将细胞周期阻滞在G1期的TGF-β肿瘤抑制途径失活。同样，已知E7特异性地和Rb肿瘤抑制蛋白相互作用。在细胞周期的G1期内，Rb和E2F转录因子复合，从而防止E2F激活基因转录。在G1/S边界上，Rb蛋白被磷酸化，释放出E2F转录因子，从而启动E2F基因转录和进入细胞周期的S期。HPV E7癌蛋白通过直接结合Rb并从复合物中置换出E2F来消除该控制机制。这导致受E2F基因驱动的基因转录不依赖于正常的细胞周期控制(Duensing和Munger(2003)Prog Cell Cycle Res.5：383-391；Duensing和Munger(2004)Int J Cancer 109：157-162；Clarke和Chetty(2001)GynecolOncol.82：238-246)。该E2F的释放使基因转录和细胞周期控制解偶联，从而导致负责DNA合成和细胞增殖的S期基因的长时间和异常转录。此外，已显示E6和E7两者的组合作用导致子宫颈瘤形成中的中心体异常和后来的基因组不稳定性(Duensing和Munger(2004)Int JCancer 109：157-162)。

尽管不想限制于特定的机制，但在一些实施方案中，作为HPV的致癌株系感染的结果，可将高度子宫颈疾病的分子行为表征为通常只在细胞周期的S期期间表达的离散基因的过表达。随后不受控制的基因转录的激活和异常的S期诱导通过E2F-1转录因子途径来介导。该行为似乎标示了高度子宫颈疾病并提供了致癌HPV感染和子宫颈瘤形成的分子行为之间的联系。在分子诊断测定形式中使用这些子宫颈瘤形成的分子标志物可改进子宫颈疾病的检测，使之具有比现有方法更高的灵敏度和特异性。一般参见图1-4和Malinowski(2005)BioTechniques 38：1-8(即将出版)，在此以其全文引用作为参考。因此，在特定的实施方案中，用于诊断高度子宫颈疾病的方法包括检测生物标志物的过表达，其中如此处描述的，该生物标志物的过表达标示了异常的S期诱导。在其他实施方案中，所述方法包括检测生物标志物的过表达，其中该生物标志物的过表达标示了HPV E6和HPV E7基因的活跃转录或过表达。

以形态学术语常规地定义发育异常，表现在上皮细胞的正常定位的丧失、伴随细胞和细胞核大小、形状和染色特征上的改变。如通过癌前发育异常病症例如CIN的鉴定所显示的，根据细胞异常的程度对发育异常分级(即，轻度、中度、严重)，发育异常被广泛视作从正常组织到子宫颈瘤形成的进程中的中间阶段。基于对于高度子宫颈疾病特异的生物标志物的过表达，本发明的方法允许鉴定高度子宫颈疾病，包括中度至严重发育异常以及宫颈癌(即，CINII病症和以上病症)。

和Pap抹片检查和/或HPV感染检测法相比，此处公开的方法提供了更优越的高度子宫颈疾病检测法。在本发明的特定方面，本方法的灵敏度和特异性等于或高于常规的Pap抹片检查法。如此处所用的“特异性”是指本发明的方法可准确鉴定已通过阴道镜被确定为NIL(即真阴性)的样品的水平。即，特异性是试验呈阴性的疾病阴性的比例。在临床研究中，通过将真阴性的数目除以真阴性和假阳性之和来计算特异性。“灵敏度”是指本发明的方法可精确地鉴定已通过阴道镜确定为高度子宫颈疾病阳性(即真阳性)的样品的水平。因此，灵敏度是试验呈阳性的疾病阳性的比例。在临床研究中，通过将真实阳性的数目除以真阳性和假阴性之和来计算灵敏度。参见下面的实施例1-3。在一些实施方案中，用于高度子宫颈疾病检测的所公开方法的灵敏度优选地是至少大约70％，更优选地至少大约80％，最优选地至少大约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多。此外，本方法的特异性优选地为至少大约70％，更优选地至少大约80％、最优选地至少大约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多。

术语“阳性预测值”或“PPV”是指当患者限定于通过使用本发明方法分类为阳性的患者时，该患者患有高度子宫颈疾病的概率。在临床研究中，通过将真阳性的数目除以真阳性和假阳性之和来计算PPV。在一些实施方案中，用于诊断高度子宫颈疾病的本发明方法的PPV至少为约40％，同时保持至少大约90％，更优选地至少大约95％的灵敏度。试验的“阴性预测值”或“NPV”是当患者限定于所有试验呈阴性的患者时，该患者不患有该疾病的概率。在临床研究中通过将真阴性的数目除以真阴性和假阴性之和来计算NPV。

本发明的生物标志物包括基因和蛋白，以及其变体和片段。这些生物标志物包括这样的DNA，该DNA包含编码该生物标志物的核酸序列的完整或部分序列、或该序列的互补序列。生物标志物核酸也包括这样的RNA，该RNA包含任何目的核酸序列的完整或部分序列。生物标志物蛋白是由本发明DNA标志物编码的蛋白或对应于本发明DNA标志物的蛋白。生物标志物蛋白包含任何生物标记蛋白或多肽的完整的或部分氨基酸序列。

“生物标志物”是任何这样的基因或蛋白，所述基因或蛋白在组织或细胞中的表达水平与正常的或健康的细胞或组织中的表达水平相比发生了改变。本发明的生物标志物是针对潜在的高度子宫颈疾病而言具有选择性的。“在高度子宫颈疾病中选择性过表达”是指目的生物标记物在高度子宫颈疾病中过表达，但不在被分类为LSIL、CINI的病症、无任何发育异常存在的HPV-感染样品、不成熟的完全发育细胞和不被当作临床疾病的其他病症中过表达。因此，本发明的生物标志物的检测能够区别指示潜在的高度子宫颈疾病的样品和指示良性增殖、早期HPV感染或轻度发育异常的样品。“早期HPV感染”是指未发展成宫颈结构异常的HPV感染。如此处所用的，“轻度发育异常”是指其中无高度病变存在的LSIL和CINI。本发明的方法也可将指示高度疾病的细胞与正常细胞、不成熟的完全发育细胞和不指示临床疾病的其他细胞区分开。这样，本发明的方法允许准确地鉴定高度子宫颈疾病，即使在被常规的Pap抹片检查错误地分类为正常、CINI、LSIL或ASCUS情况(即，“假阴性”)下亦如此。在一些实施方案中，作为对异常的或非典型的Pap抹片检查的反映，进行诊断高度子宫颈疾病的方法。即，可进行本发明的方法以响应具有异常或非典型性Pap抹片检查结果的患者。在本发明的其他方面，将所述方法作为在一般的妇女人群中进行的高度子宫颈疾病的初步筛查来进行，就如同目前进行常规的Pap抹片检查一样。

本发明的生物标志物包括选择性在上面定义的高度子宫颈疾病中过表达的任何基因或蛋白。这些生物标记物能够在细胞学细胞悬浮物中鉴定癌前、恶性或显现癌性的细胞。本发明的生物标志物检测CINII病症和以上病症中的细胞，但不检测CINI和其中不存在潜在的高度疾病的HPV感染细胞。特别感兴趣的生物标志物包括参与细胞周期调控、细胞周期的HPV干扰、DNA复制和转录以及信号转导的基因和蛋白。在一些实施方案中，生物标志物是S期基因，包括其表达受E2f转录因子或Sp-1转录因子刺激的基因。细胞核生物标志物可用于实施本发明的某些方面。“细胞核生物标志物”是指主要在细胞的细胞核中表达的生物标志物。细胞核生物标志物可在细胞的其他部分以较低的程度表达。尽管标示高度子宫颈疾病的任何生物标志物可用于本发明，但在某些实施方案中，生物标志物，特别是细胞核生物标志物，选自MCM2、MCM6、MCM7、p21^Waf1、拓扑异构酶IIα(Topo2A)、p14^arf和细胞周期蛋白E。更具体地，生物标志物可以包含MCM蛋白。

微小染色体维持(MCM)蛋白在真核细胞DNA复制中起着非常重要的作用。微小染色体维持(MCM)蛋白通过在双DNA链的从头合成期间将复制前复合物(prereplication complex)加载至DNA上和充当解旋酶以帮助双链DNA解链而在DNA复制的早期阶段发挥作用。MCM蛋白中的每一个蛋白在其高度保守的中心结构域具有DNA依赖性ATP酶基元。当正常细胞从细胞周期的G0期进行至G1/S期时，MCM蛋白的水平通常以可变的方式增加。在G0期，MCM2和MCM5蛋白远不如MCM7和MCM3蛋白丰富。MCM6和MCM2、MCM4以及MCM7形成结合组蛋白H3的复合物。此外，MCM4、MCM6和MCM7的亚复合物具有解旋酶活性，该活性是通过MCM6的ATP结合活性和MCM4的DNA结合活性介导的。参见，例如，Freeman等人(1999)Clin.Cancer Res.5：2121-2132；Lei等人(2001)J Cell Sci.114：1447-1454；Ishimi等人(2003)Eur.J.Biochem.270：1089-1101，所有文献在此以其全文引用作为参考。

早期的出版物已显示MCM蛋白，特别是MCM-5，可用于检测子宫颈疾病(Williams等人(1998)Proc Natl Acad Sci U.S.A.95：14932-14937)以及其他癌症(Freeman等人(1999)Clin Cancer Res.5：2121-2132)。已出版的文献表明针对MCM-5的抗体能够检测子宫颈瘤形成细胞。MCM-5用于检测高度子宫颈疾病的特异性未得到证实(Williams等人(1998)Proc Natl Acad Sci U.S.A.95：14932-14937)。MCM-5表达的检测不限于高度子宫颈疾病，其还在经鉴定的低度发育异常和在用高危HPV感染后已进入细胞周期的细胞中被检测到。使用针对MCM-5的抗体对子宫颈瘤形成的检测显示于图4。除了MCM-5外，已显示来自MCM家族的其他成员，包括MCM-2和MCM-7，是用于在组织样品中检测子宫颈瘤形成的可能有用的生物标志物(Freeman等人(1999)Clin Cancer Res.5：2121-2132；Brake等人(2003)Cancer Res.63：8173-8180)。近年来的结果已显示MCM-7似乎是用于使用免疫化学形式检测高度子宫颈疾病的特异性标志物(Brake等人(2003)Cancer Res.63：8173-8180；Malinowski等人(2004)Acta Cytol.43：696)。

拓扑异构酶IIα(Topo2a)是参与DNA复制的基本的细胞核酶，其是许多用于癌症治疗的抗癌药物的靶。Topo2a的减少的表达是对几种化疗剂的耐受性的最主要机制。在许多不同的肿瘤中已注意到该蛋白的表达范围的重大变化。Topo2a主要存在于正在增殖的细胞中，其在M期在特定的位点被磷酸化修饰，这对有丝分裂染色体凝集和分离至关重要。

p21是由染色体6p上的WAFl/Cip1编码的蛋白。经显示该基因抑制几种细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的活性，从而阻止细胞周期的进程。p21^Waf1的表达介导p53的细胞周期阻滞功能。因为p21似乎介导p53的几种生长调节功能，其表达可能比p53的积累更准确地反映p53的功能状态。此外，p21^Waf1可通过阻断增殖细胞中的细胞核抗原(PCNA)的作用来抑制DNA复制。

细胞周期蛋白E是cdk-2的调控亚基，其在哺乳动物细胞周期中控制G1/S的转变。细胞周期蛋白E的多种同种型只在肿瘤中表达而不在正常的组织中表达，这暗示着细胞周期蛋白E的转录后调控。体外分析表明，细胞周期蛋白E的这些截短的变体同种型能够磷酸化组蛋白H1。细胞周期蛋白E上的变化已被认为是各种癌症中预后差的指标。

尽管已详细地讨论了上述生物标志物，但可将在高度子宫颈疾病状态(例如，CINII、CINIII和宫颈癌)中过表达的任何生物标志物用于实施本发明。其它感兴趣的生物标志物包括对于G1/S期边界点或S期特异的受细胞周期调控的基因。这些基因包括但不限于解旋酶(DDX11)、尿嘧啶DNA乙二醇酯酶(uracil DNA glycolase，UNG)、E2F5、细胞周期蛋白E1(CCNE1)、细胞周期蛋白E2(CCNE2)、CDC25A、CDC45L、CDC6、p21WAF-1(CDKN1A)、CDKN3、E2F1、MCM2、MCM6、NPAT、PCNA、茎环BP(SLBP)、BRCA1、BRCA2、CCNG2、CDKN2C、二氢叶酸还原酶(DHFR)、组蛋白H1、组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3、组蛋白H4、MSH2、NASP、核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)、核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)、胸苷合成酶(TYMS)、复制因子C4(RFC4)、RAD51、染色质因子1A(CHAF1A)、染色质因子1B(CHAF1B)、拓扑异构酶III(TOP3A)、ORC1、引发酶2A(PRIM2A)、CDC27、引发酶1(PRIM1)、瓣结构内切核酸酶(flap structure endonuclease，FEN1)、fanconi anemia comp.grp A(FNACA)、PKMYT1和复制蛋白A2(RPA2)。参见，例如，Whitfield等人(2002)Mol.Biol.Cell 13：1977-2000，以其全文在此引用作为参考。其他感兴趣的S期基因包括细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、MCM3、MCM4、MCM5、DNA聚合酶Iα(DNA POL1)、DNA连接酶1、B-Myb、DNA甲基转移酶(DNA MET)、中心粒周围蛋白(pericentrin，PER)、KIF4、DP-1、ID-3、RAN结合蛋白(RANBP1)、间隙连接α6(GJA6)、氨基乙酰丙酸脱水酶(amino levulinatedehydratase，ALDH)、组蛋白2A Z(H2A.Z)、精胺合酶(SpmS)、增殖蛋白2、T淋巴细胞激活蛋白、磷脂酶A2(PLA2)和L6抗原(L6)。参见，例如，Neyins等人(2001)Mol.Cell.Biol.21：4689-4699，此处引用作为参考。

在本发明的一些方面，生物标志物包含由E2f转录因子诱导的基因。这些基因包括但不限于胸苷酸合酶(thymidylate synthase)、胸苷激酶1、核糖核苷酸还原酶M1、核糖核苷酸还原酶M2、CDK2、细胞周期蛋白E、MCM3、MCM7、PCNA、DNA引发酶小亚基、拓扑异构酶IIA(Topo2A)、DNA连接酶1、flap endonuclease 1、RAD51、CDC2、细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白B2、KI-67、KIFC1、FIN16、BUB1、输入蛋白α-2、HMG2、zeste增强子、STK-1、组蛋白茎环BP、Rb、P18-INK4C、膜联蛋白VIII、c-Myb、CDC25A、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白E1、脱氧胞嘧啶激酶、DP-1、内皮素转化酶(endothelin converting enzyme)、烯醇化酶2、P18 INK4C、核糖核苷酸还原酶和尿嘧啶DAN乙二醇酯酶2。参见，例如Nevins等人，同上；Muller等人(2000)Genes and Dev.15：267-285。在特定的实施方案中，感兴趣的生物标志物是由参与细胞周期调控和DNA复制的E2f转录因子诱导的基因，例如，细胞周期蛋白E2、Ki-67、p57KIP2、RANBPM和复制蛋白A1。一些E2f诱导的感兴趣基因参与凋亡，其包括APAF1、Bc1-2、caspase 3、MAP3激酶5和TNF受体相关因子。其他E2f诱导的基因参与转录的调控，其包括例如ash2样、polyhomeotic2、embryonic ectoderm protein、Zeste基因增强子、hairy/enhancerof split、同源异形盒A10、同源异形盒A7、同源异形盒A9、同源结构域TF1、早期前B细胞白血病FT3、YY1 TF、POU结构域TF、TAFII130、TBP因子172、碱性TF3、溴区结构(bromodomain)/锌指、SWI/SNF、ID4、TEA-4、NFATC1、NFATC3、BT、CNC-1、MAF、MAFF、MAFG、核心结合蛋白、E74样因子4、c-FOS、JUNB、锌指DNA BP和Cbp/p300转录激活物。参与信号转导的E2f诱导的基因也是潜在的目的生物标志物，其包括TGFβ、卵泡抑素(follistatin)、骨形态发生蛋白2(bonemorphogenetic protein 2)、BMP受体类型1A、曲蛋白同源物1(frizzled homolog1)、WNT10B、鞘氨醇激酶1、双特异性磷酸酶7、双特异性(Y)磷酸酶、FGF受体3、蛋白酪氨酸磷酸酶、双特异性(Y)磷酸酶D6655、胰岛素受体、成熟T细胞增殖蛋白1、FGF受体2、TGFα、CDC42效应蛋白3、Met、CD58、CD83、TACC1和TEAD4。

尽管本发明的方法要求在患者样品中检测至少一个生物标志物以检测高度子宫颈疾病，但可使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个生物标志物来实施本发明。已认识到对机体样品中的超过一个生物标志物的检测可用于鉴定高度子宫颈疾病的事件。因此，在一些实施方案中，使用两种或更多种生物标志物，更优选地，使用两种或更多种互补生物标志物。“互补”是指机体样品中生物标志物的组合的检测导致比只使用其中一个生物标志物时以更大比例成功鉴定高度子宫颈疾病。因此，在一些情况下，可通过使用至少两种生物标志物进行高度子宫颈疾病的更准确的确定。因此，当使用至少两种生物标志物时，使用至少两种针对不同生物标志物蛋白的抗体来实施此处公开的免疫细胞化学方法。可同时或共同地将抗体和机体样品接触。在本发明的某些方面，使用3种抗体检测MCM2和Topo2A的过表达，其中抗体中的两种抗体对于MCM2是特异性的，第三种抗体对于Topo2A是特异性的。

在特定的实施方案中，本发明的诊断方法包括从患者收集子宫颈样品，将样品和至少一种对于目的生物标志物特异的抗体接触，检测抗体结合。表现本发明生物标志物的过表达的样品，如通过抗体结合的检测所确定的，被认为是高度子宫颈疾病阳性的。在特定的实施方案中，机体样品是单层子宫颈细胞。在本发明的一些方面，在玻璃载片上提供单层子宫颈细胞。

“机体样品”是指可检测到生物标志物表达的细胞、组织或体液的任何取样。这些机体样品的示例包括但不限于血液、淋巴、尿、妇科流体(gynecological fluids)、活组织检查和涂片。可通过各种技术，包括例如，通过刮取或擦拭表面或通过使用针头抽取体液来从患者获得机体样品。用于收集各种机体样品的方法在本领域是众所周知的。在特定的实施方案中，机体样品包括子宫颈细胞，作为宫颈组织样品或如悬浮物中的子宫颈细胞，特别是基于液体的制备物。在一个实施方案中，按照基于液体的细胞学样品制备指南，例如SurePath(TriPath Imaging，Inc.)或ThinPrep preparation(CYTYC，Inc.)所述收集宫颈样品。可将机体样品转移至玻璃载片上以进行放大观察。可对载片上的细胞使用固定液和染色液以保存样品和帮助检查。在一个实施方案中，收集宫颈样品，对其进行处理以提供单层样品，如美国专利号5,346,831(此处引用作为参考)中所示。

单层方法涉及在带阳离子电荷的基底上制备单层细胞学材料的方法。该方法包括这样的步骤，即在密度梯度上通过离心分离细胞学材料，产生该细胞学材料的紧密聚集的沉淀，混合该细胞学材料的沉淀，从混合的沉淀中取出预先确定体积的等分，将该等分和预先确定体积的水沉积在沉降容器中，该容器可移动地装在带阳离子电荷的基底上，从而可使细胞学材料在重力作用下沉淀在该基底上，在细胞学材料沉淀后，从沉降容器中除去水分。为了进行自动化分析，可将沉淀容器和基底分开。可通过本领域已知的任何方法，例如吹吸法(syringing)、胰蛋白酶法(trypsinizing)、超声处理、震荡、涡旋或通过使用美国专利5,316,814(其内容在此引用作为参考)中描述的装置进行分离。在一些实施方案中，使用PrepStain^TM载片处理器(TriPath Imaging，Inc.)从SurePath^TM(TriPath Imaging，Inc.)制备包含单层子宫颈细胞的载片。

此处包括本领域可获得的用于鉴定或检测生物标志物的任何方法。可在核酸水平或蛋白水平上检测本发明的生物标志物的过表达。为了确定过表达，可将要检查的机体样品和来源于健康人的对应的机体样品进行比较。即，表达的“正常”水平是未遭受高度子宫颈疾病的人受试者或患者的子宫颈细胞中该生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，特别是当机体样品包含单层子宫颈细胞时，生物标志物过表达的确定不需要机体样品和来源于健康人的对应机体样品之间的比较。在该情况下，来自单一患者的单层子宫颈细胞可以每50,000个正常细胞包含少至1-2个异常细胞。这些异常细胞(通过本发明标志物的过表达鉴定的)的检测，排除了和来源于健康人的对应机体样品相比较的需要。

用于检测本发明标志物的方法包括在核酸或蛋白水平上确定生物标志物的量或存在的任何方法。这些方法在本领域是熟知，包括但不限于western印迹法、Northern印迹法、southern印迹法、ELISA、免疫沉淀法、免疫荧光法、流式细胞术、免疫细胞化学法、核酸杂交技术、核酸逆转录法以及核酸扩增法。在特定的实施方案中，使用例如针对特定生物标志物蛋白的抗体在蛋白水平上检测生物标志物的过表达。这些抗体可用于各种方法，例如western印迹法、ELISA、免疫沉淀法或免疫细胞化学技术。同样，可将Pap抹片检查的免疫染色和常规Pap染色结合，这样可获得形态学信息和免疫细胞化学信息。这样，生物标志物的检测可减少Pap抹片检查的高假阴性率，从而可促进大规模自动化筛查。

在一个实施方案中，使用对于生物标志物蛋白特异的抗体检测机体样品中生物标志物蛋白的过表达。该方法包括从患者获得机体样品，将该机体样品和至少一种针对于选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的生物标志物的抗体相接触，和检测抗体结合以确定该生物标志物在患者样品中是否过表达。本发明的优选的方面提供了用于诊断高度子宫颈疾病的免疫细胞化学技术。具体地，该方法包括患者样品中的生物标志物的抗体染色，该生物标志物对于高度子宫颈疾病是特异性的。本领域技术人员认识到，可人工地或以自动化的方式(使用例如Autostainer Universal Staining System(Dako)或Biocare NemesisAutostainer(Biocare))进行本文下面描述的免疫细胞化学法。实施例1中提供了一个用于宫颈样品的抗体染色(即免疫细胞化学)的方案。

在优选的免疫细胞化学法中，将患者的宫颈样品收集入液体培养基中，例如，在SurePath^TM收集小瓶(TriPath Imaging，Inc.)中。使用自动化处理器，例如.PrepStain^TM系统(TriPath Imaging，Inc.)，从液体培养基中收集细胞和将其沉淀在载玻片上的薄层内以待进一步分析。可固定或不固定载片样品，并可在制备后立即对其进行分析或可将其保存以待以后分析。在一些实施方案中，将制备的玻片贮存在95％的乙醇中最少24小时。可选择地，在其他实施方案中，如下所述将载片贮存在预处理缓冲液中。

为制备易于抗体结合的生物标志物抗原，可能需要对样品进行修饰。在免疫细胞化学法的特定方面，将载片转移至预处理缓冲液例如SureSlide制备缓冲液(TriPath Imaging，Inc.)和任选地将其加热以增加抗原的易接近性。样品在预处理缓冲液中的加热快速地破坏了细胞的脂双层，使得抗原(即，生物标志物蛋白)更容易进行抗体结合。预处理缓冲液可包含聚合物、去垢剂、或者非离子或阴离子表面活性剂例如乙氧基化的阴离子或非离子表面活性剂、链烷酸酯或烷氧基化物或甚至这些表面活性剂的混合物，或甚至使用胆盐。在特定的实施方案中，预处理缓冲液包含非离子或阴离子去垢剂，例如和具有大约370kD分子量的烷氧基化物混合的具有大约183kD分子量的链烷酸钠(在下文中称作RAM)。在特定的实施方案中，预处理缓冲液包含1％RAM。在一些实施方案中，预处理缓冲液也可用作上面指出的载片贮存缓冲液。在另一个实施方案中，将0.1％至1％的脱氧胆酸、钠盐、一水合物的溶液用作贮存缓冲液和预处理缓冲液。在本发明的另一个实施方案中，可将月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠(例如，Sandopan LS)或/和乙氧基化的阴离子复合物或甚至烷基芳基乙氧化羧酸的溶液用于贮存和预处理缓冲液。在本发明的特定方面，载片预处理缓冲液包含0.05％至5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠，优选地0.1％至1％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠、更优选地0.5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠。在一个实施方案中，载玻片可在预处理和染色处理前在缓冲液中贮存长达72小时。可将本发明的预处理缓冲液用于制备在免疫测定法(例如，免疫细胞化学法和免疫组织化学法)中更容易进行抗体结合的抗原的方法。参见实施例14。术语“预处理缓冲液”和“制备缓冲液”在此处可交换使用，其是指这样的缓冲液，该缓冲液用于制备，特别是通过增加抗原的对抗体结合的易接近性来制备用于免疫染色的细胞学或组织学样品。

可将制备更容易进行抗体结合的抗原的任何方法用于本发明的实施，所述方法包括本领域已知的抗原修复法(antigen retrievalmethods)。参见，例如，Bibbo等人(2002)Acta.Cytol.46：25-29；Saqi等人(2003)Diagn.CutopatlioL 27：365-370；Bibbo等人(2003)Anal.Quant.Cytol.Histol.25：8-11，此处以其全文引用作为参考。在一些实施方案中，抗原修复包括将载片贮在95％的乙醇中至少24小时，将载玻片浸没在预热至95℃的1X Target RetrievalSolution pH 6.0(DAKOS1699)/dH₂O浴中，将载玻片置于蒸器中25分钟。参见下面的实施例2。

在进行增加抗原的易接近性的预处理或抗原修复后，使用合适的封闭试剂(例如，过氧化物酶封闭试剂例如过氧化氢)封闭样品。在一些实施方案中，使用蛋白封闭剂封闭样品以防止抗体的非特异性结合。所述蛋白封闭剂可包含，例如，纯化的酪蛋白。然后将针对目的生物标志物的抗体，特别是单克隆抗体，和样品一起温育。如上面所指出的，本领域技术人员认识到，在一些情况下，通过在患者样品中检测超过一种生物标志物可获得高度子宫颈疾病的更准确的诊断。因此，在特定的实施方案中，使用至少两种针对两种不同生物标志物的抗体检测高度子宫颈疾病。当使用超过一种抗体时，可将这些抗体作为单个抗体试剂顺次加入至单一样品中或作为抗体混合物同时加入。参见下面实施例3。可选择地，可将各单一抗体加入至来自相同患者的分开的样品，再将所得的数据合并。在特定的实施方案中，抗体混合物包含至少3种抗体，其中两种抗体特异性地结合MCM2，第三种抗体特异性地结合Topo2A。

检测抗体结合的技术在本领域是熟知的。可使用产生对应于抗体结合水平、因此对应于生物标志物蛋白表达水平的可检测信号的化学试剂来检测针对目的生物标志物的抗体结合。在本发明的其中一个免疫细胞化学法中，通过使用缀合了被标记的聚合物的第二抗体来检测抗体结合。经标记的聚合物的示例包括但不限于聚合物-酶缀合物。一般将这些复合物中的酶用于催化色原在抗原-抗体结合位点的沉积，从而引起对应于目的生物标志物的表达水平的细胞染色。特别有吸引力的酶包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。可使用商购获得的抗体检测系统，例如，Dako Envision+系统和Biocare Medical′sMach 3系统实施本发明。

在本发明的一个具体的免疫细胞化学法中，通过使用HRP标记的缀合了二抗的聚合物来检测针对生物标志物的抗体结合。也可使用结合小鼠单克隆抗体的小鼠探针试剂和结合小鼠探针试剂的缀合HRP的聚合物来检测抗体结合。使用色原3，3-二氨基联苯胺(DAB)就抗体结合对载玻片进行染色，然后用苏木精和任选地着色剂例如氢氧化铵或TBS/Tween-20进行复染。在本发明的一些方面，由细胞检验技术员和/或病理学家在显微镜下检查载片以评估细胞染色(即，生物标志物的过表达)和确定是否存在高度子宫颈疾病。可选择地，可通过自动化的显微镜方法或通过人工借助有助于鉴定阳性染色细胞的计算机软件检查样品。

术语“抗体”广义上包括天然发生的抗体形式和重组抗体例如单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体和多特异性抗体以及所有前述抗体的片段和衍生物，所述片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可包含缀合至所述抗体的蛋白或化学部分。

“抗体”和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体表现对抗原的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其他抗体样分子。后一种的多肽通过例如淋巴系统以较低的水平产生，在骨髓瘤中以增加的水平产生。

术语“抗体”以最广的意义使用，其包括完全地组装的抗体、可结合抗原的抗体片段(例如，Fab′、F′(ab)₂、Fv、单链抗体、二价抗体(diabodies))和包含前述抗体的重组肽。

此处使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体的群体中获得的抗体，即，构成该群体的各抗体是完全相同的，除了可能天然发生的可以少量存在的突变。“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选地完整抗体的抗原结合或可变区部分。抗体片段的示例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；二价抗体；线性抗体(Zapata等人(1995)Protein Eng 8(10)：1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶降解产生两个完全相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各片段具有单个抗原结合位点，剩余的“Fc”片段，其名称反应其容易地结晶35的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并能够交联抗原的F(ab′)₂片段。

“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，该区域由一条重链可变结构域和一条轻链可变结构域通过紧密的、非共价缔合形成的二聚体构成。在单链Fv种类中，可通过柔性肽连接体将一条重链可变结构域和一条轻链可变结构域共价连接，从而可使轻链和重链以类似于双链Fv种类中的形式以“二聚”结构结合。正是处于该构型，各可变区的3个CDRs相互作用，从而在V_H-V_L二聚体的表面上确定了抗原结合位点。总之，6个CDRs为抗体提供了抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含3个特异于抗原的CDRs的Fv一半)也具有识别和结合抗原的能力，但以比完整结合位点更低的亲合力结合。

Fab片段也包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(C_H1)。Fab片段和Fab′片段的不同在于在重链C_H1结构域的羧基端加入了少数残基，包括一个或多个来源于抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH在此处是Fab′的名称，在所述Fab’中，恒定区的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab′)₂抗体片段最初作为成对的Fab′片段(在其之间具有铰链半胱氨酸)产生。

可通过用生物标志物蛋白免疫原免疫合适的受试者(例如，兔子、山羊、小鼠或其他哺乳动物)来制备多克隆抗体。可通过标准技术，例如采用使用固定的生物标志物蛋白的酶联免疫吸附测定法(ELISA)在一段时间内监控被免疫的受试者中的抗体滴度。在免疫后的合适时间点，例如当抗体滴度最高时，可从受试者获得抗体生产细胞，并通过标准技术将其用于制备单克隆抗体，所述标准技术是例如最先由Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人(1983)Immunol.Today 4：72)、EBV杂交瘤技术(Cole等人(1985)in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，ed.Reisfeld和Sell(Alan R.Liss，Inc.，New York，NY)，pp.77-96)或trioma技术。用于生产杂交瘤的技术是熟知的(一般参见Coligan等人，编著(1994)Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)；Galfre等人(1977)Nature 266：550-52；Kenneth(1980)in Monoclonal Antibodies：A New Dimension In Biological Analyses(Plenum Publishing Corp.，NY)；和Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54：387-402)。

作为制备单克降抗体分泌性杂交瘤的另一选择，可通过用生物标志物蛋白筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)从而分离结合该生物标志物蛋白的免疫球蛋白文库成员来鉴定和分离单克隆抗体。可商购(例如，the Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，Catalog No.27-9400-01；和the StratageneSurfZAP 9 Phage Display Kit，Catalog No.240612)获得产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒。此外，特别适合用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的示例可见于例如美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；93/01288；WO 92/01047；92/09690；90/02809；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等人(1989)Science 246：1275-1281；Griffiths等人(1993)EMBO J 12：725-734中。

可通过将抗体偶联可检测物质来帮助抗体结合的检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(phycoerythrin)；发光物质的示例包括鲁米诺(lumino)；生物发光物质的示例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性物质的示例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

关于本发明免疫细胞化学法中的抗体染色的检测，本领域内也存在用于在生物学样品中定量确定多分子种类(例如生物标志物蛋白)的量的视频显微术(video-microscopy)和软件方法，其中通过具有特定颜色的代表性染料标志物来指示存在的各分子种类。这些方法作为比色分析法在本领域也是已知的。在这些方法中，在将生物学样品染色以可视地显现特定目的生物标志物的存在后，使用视频显微术提供所述生物样品的图象。这些方法中的一些方法，例如在属于Marcelpoil等人的美国专利申请.09/957,446和属于Marcelpoil等人的美国专利申请10/057,729(此处引用作为参考)中公开的方法，公开了成象系统和相关软件基于代表性颜色染料标志物的存在确定存在的各分子种类的相对量的用途，所述分子种类的相对量分别由成象系统和相关软件确定的所述颜色染料标志物的光密度或透射值(transmittance value)表示。通过使用被“解构”成其组分颜色部分的单一视频图象，这些技术可定量确定各分子种类在经染色的生物样品中的相对量。

选择用于实施本发明的抗体，使其对目的生物标志物蛋白具有高特异性。制备抗体和选择合适抗体的方法在本领域是已知的。参见，例如，Celis，编著(即将出版)Cell Biology & Laboratory Handbook，第3版(Academic Press，New York)，在此以其全文引用作为参考。在一些实施方案中，可使用商购获得的针对特定生物标志物蛋白的抗体来实施本发明。也可基于想要的细胞学而不是组织学样品的染色来选择本发明的抗体。即，在特定的实施方案中，根据最终的样品形式(即，细胞学制备物)和就结合特异性来选择抗体。

在本发明的一些方面，通过多步筛选法选择和纯化针对特定目的生物标志物的抗体。在特定的实施方案中，筛选多元瘤(polydomas)以鉴定具有想要的特异性和灵敏度性状的生物标志物的特异性抗体。如此处所用的，“多元瘤”是指多个杂交瘤。一般地在多孔组织培养板上提供本发明的多元瘤。在最初的抗体筛选步骤中，产生包含多个正常(即，无CIN)、CINIII、鳞状细胞癌和腺癌样品的肿瘤组织微阵列。用于在单张载片上产生多个组织的阵列的方法和设备，例如ChemiconAdvanced Tissue Arrayer在本领域是已知的。参见，例如，美国专利号4,820,504。使用标准的免疫组织化学技术就阳性染色对来自各孔的包含多元瘤的未稀释上清液进行分析。在该起始筛选步骤中，基本上忽略背景，即非特异性结合。选择产生阳性结果的多元瘤并将其用于抗体筛选的第二阶段。

在第二筛选步骤中，将阳性多元瘤接受有限稀释法。使用标准的免疫组织化学技术就CINIII或宫颈癌样品的阳性染色对所得的未经筛查的抗体进行分析。在该阶段，背景染色是相关的，只选择只对异常细胞(即，CINIII和癌细胞)阳性染色的候选多元瘤作进一步分析。

为鉴定可将正常样品和CINI样品与来自标示高度子宫颈疾病(即，CINII和其以上病症)的样品区分开的抗体，产生疾病组组织微阵列。该组织微阵列一般包含多个无CIN的样品、CINI样品、CINII样品、CINIII样品、鳞状细胞癌样品和腺癌样品。使用标准的免疫组织化学技术就只对标示高度子宫颈疾病的样品(即，CINII样品和其以上病症的样品)特异性阳性染色来对候选多元瘤进行测定。选择产生阳性结果和最小背景染色的多元瘤以进行进一步分析。

为了选择单个候选单克隆抗体，将阳性染色的培养物制备为单一克隆。用于分离单个克隆的方法在本领域是熟知的。使用上述的肿瘤和疾病组组织微阵列，就CINII、CINIII、鳞状细胞癌和腺癌样品的特异性染色来测定来自各克隆的包含未纯化抗体的上清液。选择显示高度子宫颈疾病样品(即，CINII和其以上病症)的阳性染色、其他细胞类型(即，正常样品和CINI样品)的最小染色以及极少背景的候选抗体以进行纯化和进一步分析。通过亲和吸附层析纯化抗体的方法在本领域是熟知的。

为了鉴定高度子宫颈疾病样品中展示最大特异性染色而在子宫颈细胞学样品中展示最小背景(非特异性染色)的抗体，使用本发明的免疫细胞化学技术测定在上述基于免疫组织化学的筛选方法中分离和纯化的候选抗体。在实施例1和2中提供了进行免疫细胞化学法的示例性方案。

具体地，使用纯化的目的抗体测定统计学上显著数目的NIL(即，非浸润性病变)、ASCUS、LSIL、HSIL或癌性子宫颈细胞学患者样品。通过此处描述的免疫细胞化学法分析所述样品，并基于对特定生物标志物的阳性抗体染色将其分类为高度子宫颈疾病阳性、阴性或不确定的类型。计算各抗体的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。为本发明选择在子宫颈细胞学样品中展现最大的高度子宫颈疾病特异性染色和最低背景(即，最大信噪比)的抗体。

合适的抗体的鉴定导致测定的信噪比增加和临床功效上的增加。使用的测定形式和样品类型在合适的抗体的选择中是至关重要的因素。许多针对生物标志物的抗体在使用细胞学制备物的免疫细胞化学形式中或在使用福尔马林固定的石蜡包埋样品的免疫组织化学形式中不产生理想的信噪比。此外，在免疫组织化学形式中产生最大信噪比的生物标志物抗体可能在免疫细胞化学测定法中表现不好。例如，在免疫细胞化学形式中产生理想的染色水平的抗体可能在免疫组织化学测定中不产生合适的染色水平(数据未显示)。同样，当用于免疫组织化学测定时产生可按受的信噪比的抗体可能导致免疫细胞化学样品的过度染色(数据未显示)。因此，抗体的选择需要及早考虑所用的测定形式和最终样品类型。

在不能获得支持免疫细胞化学形式中的染色解释的组织结构的情况下，基于细胞学的测定法(即，免疫细胞化学法)和基于组织的测定法(即，免疫组织化学法)不同。例如，在用针对Claudin 1的抗体对来自患有轻度发育异常或鳞状细胞癌的患者的样品进行免疫组织化学测定时，结果显示Claudin 1在轻度发育异常样品的病灶中表达(即，淡棕色染色)，但在癌症病灶(图12)中明显地过表达(即，暗棕色染色)。在免疫细胞化学测定法中用相同的Claudin 1抗体获得的结果是不确定的(图13)。尽管在免疫组织化学测定法中使用Claudn 1抗体可容易地检测异常细胞，但在本发明的免疫细胞化学测定法中通过Claudin 1染色获得的结果更难以解释。因此，适合于免疫组织化学形式的生物标志物可能不适合于免疫细胞化学测定法，从而不包含在本发明的优选实施方案中。

此外，生物标志物在细胞内的定位也是免疫细胞化学测定法中要考虑的重要问题。展示细胞核、细胞质或膜染色模式的生物标志物可通过形态学的方法进行确定并且适合用于免疫组织化学法。然而，细胞质和膜染色使得在免疫组织化学测定法中鉴定子宫颈疾病的至关重要的形态学特征(例如，核质比)非常困难。参见图15。相反地，在细胞核中表达和显示细胞核染色模式的生物标志物有助于抗体染色的检查，也允许形态学分析。参见图15。因此，在一些优选的实施方案中，只有选择性地在细胞核中表达的生物标志物用于本发明的免疫细胞化学测定法。

本领域技术人员认识到，需要对抗体滴度和检测化学条件进行优化，以使特定抗体的信噪比达到最大。要确定使抗体和本发明的生物标志物的特异性结合最大化并使非特异性结合(或“背景”)最小化的抗体浓度。在特定的实施方案中，通过开始时在福尔马林固定、石蜡包埋的正常组织样品和高度子宫颈疾病组织样品上检测各种抗体稀释度来确定用于子宫颈细胞学制备物的合适的抗体滴度。最先确定针对福尔马林固定、石蜡包埋的宫颈组织样品的最适宜抗体浓度和检测化学条件。优化抗体滴度和检测条件的设计是常规的，并且在本领域技术员的常规能力范围之内。在确定了针对固定的组织样品的最优条件之后，在相同的条件下将各抗体用于子宫颈细胞学制备物。一些抗体需要额外的最优化以减少背景染色和/或增加细胞学样品中的染色的特异性和灵敏度。

此外，本领域技术人员认识到用于实施本发明方法的特定抗体的浓度视如下因素(如结合时间、抗体对生物标志物蛋白的特异性水平和机体样品制备的方法)的变化而变化。此外，当使用多个抗体时，所需的浓度可能受到向样品中加入所述抗体的顺序(即，作为混合物同时加入或作为单种抗体试剂顺次加入)影响。此外，也必须优化用于显示针对目的生物标志物的抗体结合的检测化学条件，以产生想要的信噪比。

在另一个实施方案中，在核酸水平上检测目的生物标志物的表达。用于评估表达的基于核酸的技术在本领域是熟知的，其包括，例如，确定机体样品中生物标志物mRNA的水平。许多表达检测方法使用分离的RNA。可使用不对mRNA的分离进行选择的任何RNA分离技术来从子宫颈细胞纯化RNA(参见，例如，Ausubel等人，编著，(1987-1999)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，NewYork)。此外，可使用本领域技术人员熟知的技术，例如Chomczynski的单步RNA分离法(1989，美国专利号4,843,155)，容易地处理大量组织样品。

术语“探针”是指可选择性地结合明确想要的靶生物分子(例如，核苷酸转录物或由生物标志物编码的蛋白或对应于生物标志物的蛋白)的任何分子。探针可由本领域技术人员合成，或其可来源于合适的生物学制剂。可特别地设计探针以使其被标记。可用作探针的分子的示例包括但不限于RNA、DNA、蛋白、抗体和有机分子。

分离的mRNA可用于杂交或扩增测定法，其包括，但不限于，Southern或Northern分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。用于mRNA水平检测的一个方法包括将分离的mRNA和能够与由被检测的基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是，例如，全长cDNA或其部分，例如长度至少为7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并且足以在严格条件下特异性地和编码本发明生物标志物的mRNA或基因组DNA杂交的寡核苷酸。mRNA和探针的杂交表明所述生物标志物正在表达。

在一个实施方案中，将mRNA固定在固体表面上并使其和探针接触，例如通过使分离的mRNA在琼脂糖凝胶上跑胶和将所述mRNA从凝胶转移至膜例如硝酸纤维素上来进行。在可选择的实施方案中，将探针固定在固体表面并将mRNA和探针例如Affymetrix基因芯片阵列中的探针接触。本领域技术人员可容易地改造已知的mRNA检测方法，使之适合用于检测由本发明的生物标志物编码的mRNA的水平。

用于确定样品中生物标志物mRNA的水平的可选择方法包括核酸扩增的方法，例如，通过RT-PCR(Mullis，1987，美国专利号4,683,202中所示的实验实施方案)、连接酶链式反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自主序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology 6：1197)、滚环复制(Lizardi等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果分子以极低的数量存在，则这些检测方案特别适合用于检测这样的核酸分子。在本发明的特定方面，通过荧光定量RT-PCR(即，TaqMan@ System)评估生物标志物的表达。这些方法一般使用成对的特异于目的生物标志物的寡核苷酸引物。用于设计特异于已知序列的寡核苷酸引物的方法在本领域是熟知的。

使用膜印迹(例如用于杂交分析的印迹例如Northern、Southern、斑点印迹等)、或微孔、样品管、凝胶、小珠或纤维(或任何包含结合的核酸的固体支持物)监控RNA的生物标志物表达水平。参见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，其在此引用作为参考。生物标志物表达的检测也可包括使用溶液中的核酸探针。

在本发明的一个实施方案中，使用微阵列检测生物标志物的表达。因为不同实验之间的重复性的原因，微阵列特别适合用于该目的。DAN微阵列提供了用于同时测量大量基因的表达水平的一个方法。各阵列由附着至固体支持物上的捕获探针的可重复模式构成。将标记的RNA或DNA和阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描进行检测。确定阵列上各探针的杂交强度，将其转化为表示相对基因表达水平的数量值。参见，美国专利号6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316，其在此引用作为参考。高密度的寡核苷酸阵列特别适合用于确定样品中大量RNA的基因表达谱。

使用机械合成法合成这些阵列的技术描述于例如美国专利5,384,261中，在所有情况下以其全文在此引用作为参考。尽管平面阵列表面是优选的，但可将阵列制作在实际上是任何形状的表面或甚至多层表面上。阵列可以是小珠、凝胶、聚合物表面、纤维例如光纤、玻璃或任何其他合适的基底上的肽或核酸，参见美国专利号5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992，在所有情况下，各以其全文在此引用作为参考。可以这样的方式包装阵列以使其能够用于诊断学或内含设备的其他操作。参见，例如，美国专利号5,856,174和5,922,591，此处引用作为参考。

在一个方法中，把从样品中分离的总mRNA转变成标记的cRNA，然后将其和寡核苷酸阵列杂交。将各样品和分开的阵列杂交。可通过参考存在于阵列上和样品中的合适对照来计算相对转录水平。

此外还提供了实施本发明方法的试剂盒。“试剂盒”是指包含至少一种用于特异性地检测本发明生物标志物表达的试剂，例如抗体、核酸探针等的任何产品(例如，包装盒或容器)。试剂盒可以作为进行本发明方法的单位形式推销、分发或销售。此外，试剂盒可包含描述试剂盒和其使用方法的说明书。

在特定的实施方案中，提供了用于实施本发明的免疫细胞化学方法的试剂盒。该试剂盒可与下面实施例1中描述的人工和自动化免疫细胞化学技术(例如，细胞染色)相容。这些试剂盒包含至少一种针对目的生物标志物的抗体、用于检测针对生物标志物的抗体结合的化学物质、复染剂和可选地帮助鉴定阳性染色细胞的着色剂。可使用检测抗原-抗体结合的任何化学物质实施本发明。在一些实施方案中，检测化学物质包含缀合至第二抗体的经标记的聚合物。例如，可提供这样的第二抗体，该第二抗体缀合了催化色原在抗原-抗体结合位置沉积的酶。这些酶和使用其检测抗体结合的技术在本领域是熟知的。在一个实施方案中，试剂盒包含缀合至经HRP标记的聚合物的第二抗体。此外还可提供可和缀合的酶相容的色原(例如，在经HRP标记的第二抗体的情况下是DAB)和溶液，例如用于阻止非特异性染色的过氧化氢。在其他实施方案中，通过使用结合小鼠单克隆抗体的小鼠探针试剂，然后加入用结合小鼠探针试剂的HRP缀合的葡聚糖聚合物来检测针对生物标志物蛋白的抗体结合。这些检测试剂可从例如BiocareMedical商购获得。

本发明的试剂盒可进一步包含过氧化物酶封闭试剂(例如，过氧化氢)、蛋白封闭试剂(例如，纯化的酪蛋白)以及复染剂(例如，苏木精)。在试剂盒中还可提供着色剂(bluing agent)(例如，含有Tween-20和叠氮化钠的氢氧化铵或TBS、pH 7.4)以帮助检测阳性染色的细胞。

在另一个实施方案中，本发明的免疫细胞化学试剂盒额外地包含至少两种用于特异性地检测至少两种不同生物标志物表达的试剂，例如，抗体。在试剂盒中可以单一试剂或可选择地以包含针对不同目的生物标志物的所有抗体的抗体混合物形式提供各抗体。此外，可在这样的容器(例如密封的容器)中提供任何或所有试剂盒试剂，该容器保护它们免受外部环境的影响。在下面的实施例8中描述了用于实施本发明方法的示例性试剂盒。

可在试剂盒中包含阳性和/或阴性对照以证明根据本发明使用的试剂的活性和正确用法。对照可包含已知对于目的生物标志物的存在是阳性的或阴性的样品，例如组织切片、固定在载片上的细胞等。在特定的实施方案中，阳性对照包含SiHa细胞。该细胞是超三倍体(hypertriploid)并且HPV-16感染阳性的人宫颈鳞状癌细胞系，因此其可用作高度子宫颈疾病状态中的生物标志物过表达的正对照。可在本发明的试剂盒中以制备的载片或与载片制备物相容的细胞悬浮物的形式提供SiHa对照细胞。对照的设计和使用是标准的并且在本领域技术人员的常规能力范围之内。

在其他实施方案中，还提供了用于鉴定(包括在核酸水平上检测生物标志物过表达)高度宫颈的试剂盒。这些试剂盒包含，例如，至少一种特异性地结合生物标志物核酸或其片段的核酸探针。在特定的实施方案中，试剂盒包含至少两种与不同的生物标志物核酸杂交的核酸探针。

在一些实施方案中，本发明的方法可和分析形态学特征的常规细胞学技术一起使用。例如，本发明的免疫细胞化学技术可和常规的Pap染色一起使用，这样保存了来自常规方法的所有形态学信息。这样，生物标志物的检测可减少Pap抹片检查的高假阴性率，并且可有助于大规模的自动化筛查。在特定的实施方案中，如下面实施例6-7中所描述的，在单一方法中将上面公开的免疫细胞化学法和常规的Pap染色组合使用。组合的免疫细胞化学法和Pap染色法允许显现选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的生物标志物和单一样品(例如，包含单层子宫颈细胞的显微镜载片)中的细胞形态学。组合的免疫细胞化学和Pap染色法可允许更准确的鉴定和诊断高度子宫颈疾病，特别是在被常规的Pap抹片检查检测错误地分类为正常的、LSIL或ASCUS的情况下。在单一方法中对生物标志物的过表达和细胞形态学进行分析可取代Pap抹片检查作为宫颈癌的主要筛选方法。

本领域技术人员认识到需要对该组合方法学的染色参数(例如，温育时间、洗涤时间、色原/染色浓度等)进行优化，以使能够获得免疫细胞化学结果(例如，色原染色)和Pap染色之间的足够反差。使染色参数最优化的测定法的设计是标准的，并且在本领域技术人员的常规能力之内。本发明也包含用于进行组合的免疫细胞化学和Pap染色的方法的试剂盒。如上所述，这些试剂盒包含进行免疫细胞化学法所需的试剂和进行常规的Pap染色所需的试剂，特别是EA50和OrangeG。

本领域技术人员还认识到本发明的方法中的任一步骤或所有步骤可由人执行，或可选择地以自动化的方式进行。因此，可将机体样品制备、样品染色和生物标志物表达的检测的步骤自动化。

通过举例说明的方式但不以限定的方式提供下列实施例：

                      实施例

实施例1：使用免疫细胞化学法进行的生物标志物过表达的检测

载片的制备和预处理

收集患者宫颈样品并将其放入SurePath^TM收集瓶(TriPathImaging，Inc.)。使用PrepStain^TM载片处理系统(TriPathImaging，Inc.)从液体培养基中收集子宫颈细胞并将其沉积在载玻片上的薄层中。将制备的载片立即转移至预处理缓冲液(1％RAM)中并在95℃下加热45分钟。将载片冷却至室温，在TBS(tris缓冲盐溶液)中漂洗3次(每次漂洗2分钟)。

人工免疫细胞化学法

为防止非特异性背景染色，不允许在染色过程中使载片变干。此外，为了阻止非特异性染色，对载片施加过氧化氢5分钟，然后用TBS漂洗。在室温下给载片施用将针对MCM6的抗体，进行1小时。在用MCM6抗体温育后，用TBS洗涤载片3次，每次洗涤2分钟。在室温下给载片施用Dako Envision+HRP标记的聚合物第二抗体，进行30分钟，然后用TBS漂洗。施加HRP底物色原DAB 10分钟，然后用水漂洗载片5分钟。用苏木精复染各载片，然后用水漂洗直至干净。复染后，将载片浸入氢氧化铵10秒，然后用水漂洗1分钟。

通过将载片浸入95％乙醇1分钟，然后浸入无水乙醇再进行1分钟来对样品进行脱水。通过在二甲苯中漂洗3次，每次漂洗1分钟，来透化载片。然后用永久性封片剂封片，在35℃下烘干。使用明视野显微镜显现阳性染色细胞。

自动化的免疫细胞化学法

按照厂商说明书为Dako Autostainer Universal Staining系统编程，将上述人工免疫细胞化学法中所必需的染色和复染试剂装载入机器。将制备的和预处理的载片装入自动染色仪中，运行程序。在运行结束时，取出载片并在水中漂洗5分钟。如上所述将载片脱水、透化、封片和分析。

实施例2：临床样品中生物标志物的检测

收集大约180个代表各种诊断的子宫颈细胞学患者样品。之前通过阴道镜确定了这些患者中存在或不存在指示高度疾病的癌细胞或者病变。下表显示在该研究中分析的各诊断组内的样品数目和阴道镜判定的描述(例如，高度病变的存在或不存在)。

             表1：被分析的样品

诊断	计数	描述
			NIL	72	HPV阴性
ASC-US	26	26个无病变0个具有病变或高危HPV
			LSIL	48	42个高度病变阴性6个高度病变阳性
HSIL	25
			癌症	10	鳞状细胞癌和腺癌

通过免疫细胞化学法分析样品以鉴定高度子宫颈疾病。使用抗体检测6个目的生物标志物的过表达：MCM2、MCM6、MCM7、p21^Waf1、细胞周期蛋白E和Topo2A。测定对照包括在SiHa细胞系上进行的MCM2、MCM6、MCM7、p21^Waf1、细胞周期蛋白E、Topo2A和小鼠IgG阴性。也通过常规的Pap染色技术分析样品。

载片的制备

从贮存室中取出各样品并让其恢复至室温。向各瓶中加入6mlTriPath CytoRich防腐剂并振荡混匀。在TriPathPrepMate自动处理器上处理样品，将小瓶中所有剩余的液体转移至离心管中。在200xg下离心样品2分钟，吸取上清液。然后在800xg下离心样品10分钟，轻轻倒出上清液。将样品管装载至TriPath PrepStain系统上，运行系统软件(版本1.1；Transfer Only)。每个患者样品制备8张载片，在使用Pap染色和免疫细胞化学法之前将其贮存在95％乙醇中至少24小时，但不要超过2周。

Pap染色法

将制备的载片在95％乙醇中温育30秒，然后用水再漂洗30秒。对载片使用苏木精6分钟。在水中漂洗载片1分钟，在酸性水中漂洗2秒和在水中漂洗30秒。使用着色剂(氢氧化铵)30秒，首先在水中漂洗、然后在95％乙醇中漂洗各30秒。使用EA 50和OrangeG(Autocyte)6分钟。在95％乙醇中漂洗载片2分钟，在100％乙醇中漂洗3次，在二甲苯中漂洗3次，每次漂洗30秒。

然后使用Acrytol封片剂封片并在35℃下烘干。由病理学家使用明视野显微镜检查样品。

免疫细胞化学法

从95％的乙醇中取出制备的载片，用去离子水漂洗大约1分钟。将载片置于1X靶修复溶液(Target Retrieval Solution)pH 6.0(DAKO S1699)/预热至95℃的dH₂O水浴中并置于蒸器中进行25分钟。让样品在室温下冷却20分钟，在去离子水中充分漂洗，将其置于TBS中。基本上按照上述实施例1中，“自动化的免疫细胞化学法”部分所述，就生物标志物表达对预处理的载片染色。按照说明稀释商购获得的针对MCM2(1∶200)、MCM7(1∶25)、p21waf1(1∶100)和细胞周期蛋白E(1∶100)的抗体，使用其检测生物标志物的表达。以1∶6000的稀释度使用通过实施例4中描述的多元瘤筛选法鉴定的纯化MCM6抗体。

载片的解释

由细胞检验技术员和病理学家筛选和检查各载片。按照下列参数将样品分类为高度子宫颈疾病阳性、阴性或不确定性：

●排除非细胞人工假象和染成棕色(DAB)的炎性细胞。

●当用DAB染色时，成熟的、正常表现的鳞状细胞和正常表现的腺细胞不计为阳性。

●鳞状完全发育细胞和不正常细胞一起被认为是阳性的。

●低于1.5的染色强度被认为是阴性的。

●通过结合载片的检查解决不一致的结果。

将免疫细胞化学法的结果和前面通过阴道镜获得的结果进行比较。然后给予每张载片最终的结果：真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阳性(FP)、假阴性(FN)或不确定性。计算各生物标志物的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。

结果

下面概述了各生物标志物的结果。

表2：MCM2

灵敏度 0.8718

特异性 0.9478

PPV    0.8293

NPV    0.9621

表3：MCM6

灵敏度 0.9459

特异性 0.8702

PPV    0.6731

NPV    0.9828

表4：MCM7

灵敏度 0.9250

特异性 0.8923

PPV    0.7255

NPV    0.9748

表5：细胞周期蛋白E

灵敏度 0.7059

特异性 0.9779

PPV    0.8889

NPV    0.9301

表6：p21waf1

灵敏度 0.8378

特异性 0.8760

PPV    0.6739

NPV    0.9464

表7：TOPO2A

灵敏度 0.8919

特异性 0.9597

PPV    0.8684

NPV    0.9675

使用本发明的免疫细胞化学法就高度子宫颈疾病的存在分析大约180个病例。在该数目中，MCM生物标志物产生在4％至7％范围内变化的不确定性比率。此外，MCM显示95％的特异性和87％的灵敏度。MCM6和MCM7生物标志物分别产生95％和93％的相当的灵敏度结果。这两个生物标志物的特异性在87％至89％之间。

细胞周期蛋白E产生98％的最高特异性值。尽管不确定性率为6％，但灵敏度只有71％。P21^waf1的不确定性率是所有受测试标志物中最高的，为13％。P21^waf1产生84％的灵敏度和88％的特异性。对于生物标志物Topo2A，观察到96％的特异性。Topo2A的不确定性率为11％，具有89％的灵敏度。

实施例3：使用抗体混合物进行的临床样品中生物标志物的检测

通过免疫细胞化学法分析大约180个通过阴道镜确定的子宫颈细胞学样品以鉴定高度子宫颈疾病。就多个目的生物标志物的表达分析各样品。具体地，就其检测高度子宫颈疾病的能力对针对MCM2、MCM6、MCM7、p21waf1、细胞周期蛋白E和Topo2A的抗体的各种组合进行分析。使用免疫细胞化学法和实施例2中所述的载片解释指南就多个目的生物标志物的表达对这些样品进行评估。

将免疫细胞化学结果和前面通过阴道镜获得的结果进行比较。然后给各载片以真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阳性(FP)、假阴性(FN)或不确定性的最终结果。计算各生物标志物的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。

结果

下面概述各生物标志物的结果。

表8：MCM2和MCM7

灵敏度 0.9268

特异性 0.8810

PPV    0.7170

NPV    0.9737

表9：MCM6和MCM7

灵敏度 0.9500

特异性 0.8516

PPV    0.6667

NPV    0.9820

表10：MCM7和TOPO2A

灵敏度 0.8889

特异性 0.8906

PPV    0.6957

NPV    0.9661

表11：MCM7和细胞周期因子E

灵敏度 0.9268

特异性 0.8923

PPV    0.7308

NPV    0.9748

表12：MCM7和p21waf1

灵敏度 0.9250

特异性 0.8376

PPV    0.6607

NPV    0.9703

表13：MCM2和MCM6

灵敏度 0.9487

特异性 0.8450

PPV    0.6491

NPV    0.9820

表14：MCM2和TOPOIIA

灵敏度 0.8409

特异性 0.9231

PPV    0.8043

NPV    0.9391

表15：MCM2和细胞周期蛋白E

灵敏度 0.8537

特异性 0.9318

PPV    0.7955

NPV    0.9535

表16：MCM2和p21waf1

灵敏度 0.8780

特异性 0.8644

PPV    0.6923

NPV    0.9533

表17：TOPO2A和细胞周期蛋白E

灵敏度 0.8947

特异性 0.9520

PPV    0.8500

NPV    0.9675

表18：TOPO2A和p21waf1

灵敏度 0.9268

特异性 0.8522

PPV    0.6909

NPV    0.9703

表19：p21waf1和周期蛋白E

灵敏度 0.8684

特异性 0.8760

PPV    0.6875

NPV    0.9550

表20：MCM2、MCM6和MCM7

灵敏度 0.9500

特异性 0.8400

PPV    0.6552

NPV    0.9813

表21：MCM2、MCM7和TOPO2A

灵敏度 0.9512

特异性 0.8739

PPV    0.7222

NPV    0.9811

表22：MCM6、MCM7和TOPO2A

灵敏度 0.9512

特异性 0.8455

PPV    0.6724

NPV    0.9811

表23：MCM6、MCM7和细胞周期蛋白E

灵敏度 0.9500

特异性 0.8516

PPV    0.6667

NPV    0.9820

表24：MCM2、MCM7和细胞周期蛋白E

灵敏度 0.9268

特异性 0.8810

PPV    0.7170

NPV    0.9737

表25：MCM2、MCM7和p21waf1

灵敏度 0.9268

特异性 0.8319

PPV    0.6667

NPV    0.9691

表26：MCM2、TOPOIIA和细胞周期蛋白E

灵敏度 0.9250

特异性 0.9180

PPV    0.7872

NPV    0.9739

表27：MCM2、细胞周期蛋白E和p21waf1

灵敏度 0.8780

特异性 0.8644

PPV    0.6923

NPV    0.9533

表28：MCM2、TOPOIIA和p21waf1

灵敏度 0.9268

特异性 0.8482

PPV    0.6909

NPV    0.9694

表29：MCM7、TOPO2A和细胞周期蛋白E

灵敏度 0.9512

特异性 0.8852

PPV    0.7358

NPV    0.9818

表30：MCM7、p21waf1和细胞周期蛋白E

灵敏度 0.9268

特异性 0.8362

PPV    0.6667

NPV    0.9700

表31：MCM7、p21waf1和TOPO2A

灵敏度 0.9512

特异性 0.8273

PPV    0.6724

NPV    0.9785

表32：MCM2、MCM7、细胞周期蛋白E和p21waf1

灵敏度 0.9268

特异性 0.8319

PPV    0.6667

NPV    0.9691

表33：MCM2、MCM7、细胞周期蛋白E和TOPOIIA

灵敏度 0.9512

特异性 0.8739

PPV    0.7222

NPV    0.9811

表34：MCM2、MCM7、细胞周期蛋白E、p21waf1和TOPO2A

灵敏度 0.9512

特异性 0.8241

PPV    0.6724

NPV    0.9780

表35：MCM2、MCM6、MCM7、TOPO2A、细胞周期蛋白E和p21waf1

灵敏度 0.9512

特异性 0.7818

PPV    0.6190

NPV    0.9773

汇集上述关于28个抗体混合物的数据。使用包含针对2、3、4、5或甚至所有6个目的生物标志物的抗体的混合物对生物标志物的表达进行分析。28个抗体混合物中的21个显示大于92％的灵敏度。28个混合物的4个产生高于90％的特异性，最低值为78％。MCM2、TOPOIIA和细胞周期蛋白E的组合获得最高值。该混合物产生93％的灵敏度和92％的特异性。可以看出至少3个生物标志物的组合应当产生大于90％的灵敏度。要认识到，对测定法的调整可进一步增加该测定法的灵敏度和特异性。

实施例4：使用抗体混合物对生物标志物表达的检测

使用各种针对细胞周期蛋白E、MCM2、MCM6、MCM7、p21waf1和TOPO2a的抗体的组合制备抗体混合物。各混合物的组成列于下表。

                表36：抗体混合物的组合

混合物编号	生物标志物
		混合物1	Cyclin E，MCM2，MCM7
混合物2	Cyclin E，MCM6，MCM7
		混合物3	Cyclin E，MCM7，p21waf1
混合物4	Cyclin E，MCM7，topO2a
		混合物5	MCM2，MCM7，p21waf1
混合物6	MCM6，MCM7，p21waf1
		混合物7	MCM7，p21waf1，topO2a
混合物8	MCM2，MCM7，topO2a
		混合物9	MCM6，MCM7，topO2a
混合物10	MCM2，MCM6，MCM7
		混合物11	Cyclin E，MCM2，MCM6，MCM7，p21waf1，topO2a
混合物12	Cyclin E，MCM2，MCM7，p21waf1
		混合物13	MCM2和MCM7
混合物14	MCM7和p21waf1
		混合物15	MCM7和Cyclin E
混合物16	MCM2和p21waf1
		混合物17	Cyclin E和p21waf1
混合物18	MCM2和Cyclin E
		混合物19	MCM7和topO2a
混合物20	MCM2和topO2a
		混合物21	Cyclin E和topO2a
混合物22	p21waf1和topO2a

通过合并HSIL事例(HSIL库)和NIL事例(NIL库)来制备两组子宫颈细胞学样品。然后在HSIL库和NIL库上检验各抗体混合物。也将生物标志物抗体单个地作为对照进行检验。如实施例2中所述，进行载片制备和自动化的免疫细胞化学法。

由细胞检验技术员和病理学家筛查和检查载片。在筛选过程中记录的标示高度子宫颈疾病的细胞的特异性染色、腺细胞的染色、细菌交叉反应性和细胞染色的位置都是可变的。

当和使用单一生物标志物的检测获得的结果相比时，使用生物标志物抗体混合物的免疫细胞化学法的结果显示在HSIL库中标示高度子宫颈疾病的细胞的染色增加。此外，当混合物中抗体的数目从2增加至3、4或6时背景没有明显的增加。另外，当在NIL库上进行检验时，各种抗体的混合物没有显示背景染色上的增加。

实施例5：使用免疫细胞化学法对宫颈样品中生物标志物的过表达进行检测

载片制备和预处理

如上面实施例1中所述收集患者宫颈样品。通过AutoPrepSystem使用“prep only”模式制备包含单层子宫颈细胞的载片。立即将制备的载片置于1XSureSlide预处理缓冲液(去离子水中的0.5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠(Sandopan LS))中进行最少1小时、最多72小时。将预处理的载片放入95℃下的蒸器中进行45分钟而无需预热。从蒸器中取出载片，让其在室温下冷却20分钟，然后在去离子水中充分漂洗。在TBST(TBS/Tween-20)中漂洗载片2次，每次漂洗2分钟。轻拍载片以除去多余的缓冲液并将其放入湿盒。如下所述，将载片接受人工或自动化的免疫细胞化学法。

人工免疫细胞化学法

给各载片施用200μl过氧化物酶封闭剂(0.03％过氧化氢)以覆盖细胞沉积区域，进行5分钟的时间。然后用TBST漂洗载片3次，每次漂洗2分钟。除去过量的缓冲液，然后将载片放入湿盒。给各载片施用200μl蛋白封闭剂(纯化的酪蛋白和表面活性剂)并将其温育5分钟。在除去过量蛋白封闭剂后，将载片放入湿盒中。

给各载片施用200μl包含2种针对MCM2的小鼠抗人抗体(0.39mg/ml的克隆27C 5.6，1∶800的稀释度；0.918mg/ml的克隆26H 6.19，1∶10,000的稀释度)的第一单克隆抗体混合物和特异于Topo2A(100μg/ml的克隆SWT3D1，1∶10,000稀释度)的第三种鼠抗人抗体，以完全覆盖细胞沉积区域。将载片温育30分钟，然后用TBST漂洗3次，每次漂洗2分钟。除去多余的缓冲液，再将载片放回湿盒中。如上施用200μl结合小鼠单克隆抗体的探针试剂，进行20分钟。用TBST漂洗载片3次，每次漂洗2分钟。除去多余的缓冲液，再将载片放入湿盒。

如上施用200μl这样的结合小鼠探针试剂的聚合物试剂进行20分钟，该聚合物试剂包含缀合有HRP和第二山羊抗小鼠抗体的葡聚糖聚合物，然后用TBST漂洗载片3次，每次漂洗2分钟。在除去多余的缓冲液后，将载片放回湿盒。如上施用200μl DAB底物色原溶液，进行5分钟。用去离子水漂洗载片5分钟，然后用TBST漂洗2分钟，其间更换一次缓冲液。如前所述，除去多余的缓冲液，将载片放入温盒。加入200μl苏木精，进行1分钟，然后用去离子水漂洗3次，每次漂洗2分钟。除去多余的去离子水，将载片放入湿盒。给各载片施用200μl着色剂(即，含有tween-20和叠氮化钠的TBS，pH 7.4)，进行1分钟。然后在TBST中漂洗(其间更换一次TBST)载片和在去离子水中漂洗(其间更换一次水)载片，各进行2分钟。然后如实施例1和2中所述对载片进行脱水、透化、封片和分析。

自动化的免疫细胞化学法

按照厂商说明书为自动化染色仪编程，包括下列顺序步骤：

a.2次缓冲液漂洗(TBST)

b.5分钟过氧化物酶封闭

c.2次缓冲液漂洗(TBST)

d.5分钟蛋白封闭，吹风(blow)

e.30分钟一抗混合物温育

f.3次缓冲液漂洗(TBST)

g.20分钟小鼠探针试剂温育

h.3次缓冲液漂洗(TBST)

i.20分钟聚合物-HRP温育

j.3次缓冲液漂洗(TBST)

k.5分钟DAB(加1滴色原至1ml缓冲液中)

l.3次水漂洗

m.2次缓冲液漂洗(TBST)

n.1分钟Mayer′s苏木精染色

o.3次水漂洗

p.1分钟着色剂

q.1次缓冲液漂洗(TBST)

r.1次水漂洗

将必需的染色剂和复染试剂装入机器。将制备的和经预处理的载片加载到自动化染色仪上，运行上述程序。在运行结束时，取出载片，用自来水短暂漂洗。如实施例1和2中所述对载片进行脱水、透化、封片和分析。

结果

       表37：NIL事件(n＝45)

Pap结果
			NIL	其它	不确定
44	1(ASC-US)	0

ICC结果
			阳性	阴性	不确定
0	44	1

      表38：HSIL事件(n＝45)

Pap结果
			HSIL	其它	不确定
45	0	0

ICC结果
			阳性	阴性	不确定
45	0	0

在45个测试的NIL事件中，经Pap染色的载片的检查显示一个ASC-US事件。NIL样品的免疫细胞化学(ICC)结果呈阴性，一个事件被认为不满足评估的要求。对于HSIL事件，基于经Pap染色的载片的检查，45个事件中的每一个都被确定为高度子宫颈疾病。此外，在ICC测定中45个HSIL事件中的每一个也呈阳性。阴性对照，即施用于SiHa细胞系对照的通用小鼠IgG对照，在ICC测定中产生阴性结果。阳性对照，即用于SiHa细胞系对照的一抗混合物在ICC测定中产生阳性结果。

实施例6：组合的免疫细胞化学和Pap染色法

如上面实施例子1中所述收集患者子宫颈样品。如实施例5中所述制备和预处理包含单层子宫颈细胞的载片。将经预处理的各载片接受自动化的免疫细胞化学和Pap染色法，从而允许在单张载片上显现生物标志物的过表达和细胞形态学。

自动化免疫细胞化学法

如上面实施例5中所述在各载片上进行自动化免疫细胞化学法。在染色程序结束时，从自动化染色仪中取出载片，用自来水漂洗3-5分钟。然后如下所述，按照常规Pap染色法对各载片进行染色。

Pap染色法

在进行自动化免疫细胞化学法之后，进一步用Pap染色法对各载片进行染色。首先在95％乙醇中漂洗载片30秒。给一半载片施用EA50和Orange G 3分钟，给剩下的载片施用EA50和Orange G 6分钟。然后在95％乙醇中漂洗所有载片2次，在100％乙醇中漂洗3次，在二甲苯中漂洗3次，每次漂洗30秒。然后如上面实施例1和2中所述用永久性封片剂对载片进行封片并对其进行分析。

结果

在Pap染色法中，使5个NIL和5个HSIL事件的组各自接受3分钟或6分钟的使用EA50和Orange G的染色。结果显示3分钟和6分钟染色方案之间的差异很小。接受3分钟Pap染色的载片表现稍微较弱的染色。此外，用Pap复染容易地观察ICC阳性染色的HSIL细胞。

实施例7：组合的免疫细胞化学和Pap染色法(Pap染色的最优化)

为使免疫细胞化学法的色原(即，DAB)染色和Pap染色的水平之间的反差最大，修改实施例6中概述的组合免疫细胞化学和Pap染色法以优化Pap染色参数。

如上面实施例6中所述制备、预处理载片，并使其接受自动免疫细胞化学法。然后基本上按照实施例6中所描述的，并作下述改动，用常规Pap染色对载片进行染色。使用Harris制剂和Myers制剂检测苏木精。施用EA/Orange G 3分钟或6分钟。此外，在加入EA/OrangeG后更换95％的乙醇3次。

基于免疫细胞化学染色将载片确定为阳性、阴性或不确定性。此外，从形态学上对载片进行评估以便与即将进行的Pap诊断进行比较。

结果

          表39：组合免疫细胞化学和Pap染色法的结果

进行的Pap诊断	ICC结果	备注
			NILN＝7	阴性	所有事件被确定为NIL
LSILN＝6	阴性	6个LSIL中的5个在载片上没有LSIL细胞。这些事件是NIL或ASC-US。
			HSILN＝6	阳性	所有事件被确定为HSIL
癌症n＝4	阳性	所有事件是鳞状细胞癌

组合的ICC和Pap染色法允许进行形态学分析和生物标志物过表达的估量。需要其他的实验来进一步最优化所述方法。

实施例8：用于检测子宫颈样品中生物标志物过表达的免疫细胞化学法试剂盒

I.方法的原理

免疫细胞技术检测试剂盒包含完成常规制备的单层宫颈样品的三步骤免疫细胞化学染色法所需要的试剂。在用单克隆抗体混合物温育后，该试剂盒使用基于葡聚糖技术的立即可使用的显色剂。该试剂由第二山羊抗小鼠抗体分子和连接至葡聚糖聚合物主链的辣根过氧化物酶分子组成。随后加入的色原的酶促转化导致在抗原位置上形成可见的反应产物。然后用苏木精复染样品，使用着色剂，对载片进行封片。使用光学显微镜解释结果。当目的细胞被染成棕色时，获得指示宫颈高度疾病的阳性结果。

可使用自动成象设备建立潜在阳性细胞的图库。然后检查图库以确定阳性结果或阴性结果。

所述免疫细胞化学检测试剂盒可用于人工和自动染色。

II.提供的试剂

免疫细胞化学检测试剂盒包含下列材料，其足以满足75个单层制备物，每个制备物使用200μl立即可使用的小鼠单克隆抗体混合物：

                  表40：免疫细胞化学法试剂盒组分

瓶号	量	描述
			1a	1×15mL	过氧化物酶-封闭剂：缓冲的过氧化氢和稳定剂和合适的组分
1b	1×15mL	蛋白封闭剂：纯化的酪蛋白和含有防腐剂与表面活性剂的经修饰PBS中的蛋白的合适组合
			2	1×15mL	小鼠抗人抗体的混合物：在含有Tween20、pH7.4的TRIS缓冲溶液中提供的立即可使用的单克隆抗体混合物。包含0.39mg/mL MCM2 mAb克隆27C5.6(1∶800的稀释度)、0.918mg/mL MCM2 mAb克隆26H6.19(1∶10000的稀释度)、稳定蛋白和抗微生物剂
3a	1×15mL	小鼠探针试剂：结合小鼠单克隆抗体
			3b	1×15mL	聚合物试剂：缀合有结合小鼠探针试剂的辣根过氧化物酶的聚合物
4a	1×18mL	DAB底物缓冲液：用于制备DAB色原的底物缓冲液
			4b	1×1mL	DAB色原：3，3’-二氨基联苯胺色原溶液
5	1×18mL	苏木精复染液：水性的Mayers苏木精
			6	1×18mL	着色剂：含有Tween 20和0.09％NaN3的Tris缓冲盐溶液，pH7.4

下列材料和试剂是进行免疫细胞化学法所需但试剂盒中未提供的：

●吸收剂Wipes

●SiHa细胞系(TriPath Imaging，Inc.)

●去离子或蒸馏水

●乙醇(95％和100％)

●玻璃盖片

●Gloves

●湿盒

●光学显微镜(10x、20x、40x物镜)

●封片剂

●移液器和移液器吸头(能够递送20μl、200μl和1000μl体积)

●SureSlide制备缓冲液(TriPath Imaging，Inc.)-预处理缓冲液(去离子水中的0.5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠(SandopanLS))

●染色缸或或水浴

●定时器(能够1-60分钟的时间间隔)

●Tris缓冲盐溶液(TBS)

●Tween 20

●通用小鼠IgG阴性对照

●涡旋器

●二甲苯或二甲苯替代物

●蒸器(Steamer)/水浴锅

III.使用说明书

样品制备

进行下列制备宫颈样品的步骤：

●参考用于从残留样品制备载片的SurePath PrepStainSystem^TM的操作员手册。

●向SurePath^TM瓶(大约2mL)中的残留样品加入8mLSurePath^TM防腐液。使用标准技术在PrepMate^TM上和使用GYN版本1.1，Slide Preparation在PrepStain^TM上处理经稀释的样品。

●在免疫染色之前，将制备的载片立即放入预处理缓冲液中最短1小时，最长72小时。

●为了获得最优化的试剂盒性能，必须使用抗原表位修复法。该方法包括在室温下将制备的载片浸于预处理缓冲液中最短1小时，然后在预处理缓冲液中加热载片至95℃。将载片在95℃下保持15分钟，让其在室温下冷却20分钟。推荐使用经校准的水浴锅或能够保持所需温度的蔬菜蒸器(vegetable steamer)。位于更高海拔的实验室应当确定保持所需温度的最好方法。在抗原表位修复和冷却后立即开始染色过程。偏离所述方法可影响结果。

试剂制备

在染色前制备下列试剂：

含有0.05％Tween 20的Tris缓冲盐溶液(TBST)

●按照厂商说明书制备TBS。

●以0.05％的终浓度加入Tween 20。

●如果在一周内使用，在室温下贮存。

●未使用的溶液可在2-8℃下贮存3个月。

●溶液是清亮和无色的。如果出现混浊弃去稀释的溶液。

底物色原溶液(DAB)(足够5张载片的体积)

●将1mL DAB缓冲的底物移入试管。

●加入一滴(20-30μL)DAB+色原。充分混合并用移液器加至载片上。

●每天重新配制底物-色原溶液。

●溶液中产生的任何沉淀不影响染色质量。

IV.染色方案(在室温下进行，20-25℃)

进行下列步骤以便对子宫颈细胞学样品进行免疫染色：

染色方法注意事项：

●用户应当在使用前仔细阅读这些说明书并且熟悉所有成分。

●在免疫染色前将所有试剂平衡至室温(20-25℃)。在室温下进行所有温育。

●在染色过程中不要让载片变干。变干的细胞制品可表现增加的非特异性染色。将盖片暴露于通风处(drafts)。应当将载片置于温盒中以进行长时间温育。

抗原表位修复

●将制备的载片置于预处理缓冲液，最短1小时至最长72小时。

●在95℃下温育15分钟。

●将整个科普林缸和载片从水浴锅或蒸器中取出，让载片在缓冲液中冷却20分钟。

●用双蒸水漂洗载片并转移至TBST水浴中。

过氧化物酶封闭

●使多余的缓冲液流出。

●将载片放入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。

●施加200μL过氧化物酶封闭剂覆盖细胞沉积区域。

●温育5分钟(±1分钟)。

●在TBST中漂洗，更换3次，每次2分钟。

蛋白封闭

●使多余的缓冲液流出。

●将载片放入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。

●使用200μL蛋白封闭剂完全覆盖细胞沉积区域。

●温育5分钟(±1分钟)。

●不漂洗载片。

一抗混合物

●使多余的蛋白封闭液流出。

●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。

●使用200μL一抗混合物(以完全覆盖细胞沉积区域)。

●在室温下温育30分钟。

●使用洗瓶(不要将液流直接对着细胞沉积区域)用TBST单个地漂洗每张载片。将载片装入载片架中。

●在TBST中漂洗载片，更换3次，每次2分钟。

检测化学法

●使多余的缓冲液流出。

●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。

●使用200μL小鼠探针以完全覆盖细胞沉积区域。

●温育20分钟(±1分钟)。

●在TBST中漂洗载片，更换3次，每次2分钟。

●使多余的缓冲液流出。

●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。

●使用200μL聚合物以完全覆盖细胞沉积区域。

●温育20分钟(±1分钟)。

●在TBST中漂洗载片，更换3次，每次2分钟。

●流出多余的缓冲液。

●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。

●使用200μL DAB工作溶液以完全覆盖细胞沉积区域。

●温育5分钟(±1分钟)。

●在diH₂O中漂洗载片5分钟。

复染

●在TBST中漂洗载片，更换1次，进行2分钟。

●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。

●使用200μL苏木精以完全覆盖细胞沉积区域。

●温育1分钟(±10秒)。

●在流动的H₂O中漂洗载片3分钟。

●将载片装入制备的湿盒(装填有用水湿润的纸巾或纱布)。

●使用200μL着色剂使载片着色，进行1分钟(±10秒)。

●重复流水漂洗1分钟。

封片

●将载片浸入95％乙醇中，1分钟或25次浸入。

●将载片浸入无水乙醇，更换4次，每次1分钟或25次浸入。

●用二甲苯透化，更换3次，每次1分钟或25次浸入。

●使用玻璃盖玻片用非水性、永久性封片剂遮盖载片。

V.质量控制

当使用本实施例中描述的免疫细胞化学法试剂盒时考虑下列质量控制问题：

结果的可变性通常来源于样品操作中的差异和检测方法中的变化。参考免疫细胞化学法的NCCLS质量保证的提议的质量控制指南以获得额外的信息。

可从TriPath Imaging，Inc.商购获得对照细胞系。各瓶装有被作为临床样品以相似的方式进行处理的宫颈癌细胞系。在各染色方法中应当染两张载片。对照载片细胞系的评估显示染色进行的有效性。

VI.染色的解释

对照载片：

首先检查用免疫细胞化学检测试剂盒染色的对照载片以确定所有试剂功能正常。细胞的细胞核中棕色(3，3′-二氨基联苯胺四盐酸，DAB)反应产物的存在表示阳性反应性。

患者的样品：

由细胞检验技术员或病理学家使用光学显微镜进行载片评估。人工地检查细胞或通过电子技术将其贮存在来源于光学显微镜的图象库中。

收集大约1610个代表各种诊断的宫颈样品。下表显示在各诊断组(通过常规Pap染色法或活组织检查确定的)中使用免疫细胞化学试剂盒分析的样品的数目。

         表41：各诊断组(Pap染色)中的患者样品

细胞学结果	数目	％
			NIL	671	41.7％
LSIL	395	24.53％
			ASCUS	349	21.68％
HSH	150	9.32％
			ASC-H	38	2.36％
AGUS	6	0.37％
			SCC	1	0.06％
总计	1610

表42：各诊断组(活组织检查)内的患者样品

活组织检查结果	数目	％
			NIL	968	60.20％
CIN1	369	22.95％
			CIN2	140	8.71％
CIN3	131	8.15％
			遗失	2
总计	1610

载片打分指导

进行下列步骤以给通过本实施例中描述的免疫细胞化学法分析的所有载片打分：

步骤1：其是恰当的样品吗？

The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology(第2版)指出，“恰当的基于液体的制品应当具有至少5000个良好显现的/良好保存的鳞状细胞的估量最低值。”当评估所有载片时使用这些相同的标准。然而，正如常规的Pap制备一样，按照定义，具有表现阳性分子反应的异常细胞的任何样品是符合评估要求的。如果对该步骤的回答是“是”，那么细胞检验技术员进行下一步骤；如果回答是“否”，那么该结果不符合评估要求。

步骤2：在上皮细胞中存在中度至强烈的棕色细胞核染色吗？

用于本实施例的免疫细胞化学法试剂盒(例如，SureDetectDetection Chemistry试剂盒)的检测化学药品将和≥CIN2相关的发育异常细胞核染上棕色色源DAB。对该步骤回答“是”，就容易显现的棕色染色对样品进行分析。如果只看到微弱的棕色或呈现“红色”的棕色，那么不足以确保其是阳性。如果没有看到棕色的细胞核染色，则认为其是阴性检测结果。如果具有足够的棕色染色，分析进入下一步骤。

步骤3：这是具有棕色细胞核染色的鳞状细胞(或腺)细胞吗？该细胞≥ASC(AGC)吗？

使用The Bethesda System for Reporting Cervica1 Cytology(第2版)(“TBS”)中概述的相同形态学标准，确定含有棕色细胞核的鳞状细胞是否≥ASC(非典型性鳞状细胞)。这包括ASC-US、ASC-H、LSIL、HSIL和癌细胞。如果细胞在外表上是腺细胞，那么使用确定细胞是否≥AGC(非典型性腺细胞)的TBS标准。其包括子宫颈内AGC、子宫内膜AGC、AIS和腺癌。如果细胞被认为≥ASC(或≥AGC)，那么这将导致阳性结果。如果所述细胞和NILM(上皮内病变或恶性肿瘤呈阴性)一致，那么这应该是阴性检测结果。

VII.结果

最初通过常规Pap染色法分类为NIL的27个事件在免疫细胞化学检测中被染成阳性。根据通过行业认证的病理学家(aboardcertified pathologist)的检查，在这27个事件中，7件被分类为HSIL，10件为ASC-H，3件为ASC-US，3件为不确定事件。7个HSIL事件被认为是高度子宫颈疾病。在免疫细胞化学测定中通过阳性免疫染色鉴定了这27个事件，从而显示此处公开的用于鉴定通过Pap染色被错误分类为NIL的患者的方法的价值。

没有获得所有NIL样品的活组织检查结果。基于和“黄金标准”活组织检查结果的比较计算本实施例中描述的免疫细胞化学法的灵敏度和阳性预测值(PPV)的估计值。单一的活组织检查作为黄金标准具有局限性。通过对患者的系列监控或使用积极手术终点例如电圈切除术(loop electrosurgical excision procedure)或锥形活组织检查将提高ICC测定法的PPV。已知单一的活组织检查具有至少31％的疾病的假阴性结果。参见Elit等人(2004)J.Lower Genital TractDisease 8(3)：181-187。

表43：基于活组织检查结果的ICC检测法的估量的灵敏度和阳性

                                                    预测值

	ASC-H	ASCUS	LSIL	HSIL	≥ASCUS
						灵敏度	76.5％(52.7％，90.4％)*	92.6％(76.6％，97.9％)	97.7％(92.1％，99.4％)	98.5％(94.6％，99.6％)	96.2％(93.1％，97.9％)
PPV	59.1％(38.7％，76.7％)	26.0％(18.3％，35.6％)	31.0％(25.9％，36.7％)	90.1％(84.1％，94.0％)	46.9％(42.8％，51.2％)

*(95％的置信区间)

也将免疫细胞化学法的灵敏度和PPV与用常规Pap染色获得的灵敏度和PPV进行比较。使用Pap染色的两个临床终点(即，≥LSIL和≥HSIL)。同样，所有计算的标准是活组织检查的结果。

                表44：Pap检测法和免疫细胞化学法的比较

	≥LSIL(采用Pap检验法)	≥HSIL(采用Pap检验法)	≥ASCUS(采用ICC)
				灵敏度	76.5％(52.7％，90.4％)*	92.6％(76.6％，97.9％)	97.7％(92.1％，99.4％)
PPV	59.1％(38.7％，76.7％)	26.0％(18.3％，35.6％)	31.0％(25.9％，36.7％)

*(95％的置信区间)

表42中提供的结果表明免疫细胞化学法检测出更多的高度子宫颈疾病样品，同时保持高PPV。

在使用免疫细胞化学试剂盒的本研究中有14个假阴性。对该14个患者样品中的13个进行HPV检测。没有获得其中一个假阴性患者的多余样品。

使用NucleoSpinTissue DNA试剂盒(BD Clontech，Cat#635967)从宫预细胞学样品分离基因组DAN。为了进行质量控制，进行β珠蛋白(一种管家基因)的PCR分析。

如本领域中所述通过常规的L1 PCR用MY09/11引物组和通过嵌套式PCR用MY09/11和GP5+/6+引物组进行HPV L1基因的扩增以提高检测灵敏度。进一步对L1扩增子进行DNA测序以鉴定存在的HPV的类型。

从13个临床细胞学样品中的10个样品中分离出质量好的基因组DNA。如通过β珠蛋白PCR分析所显示的，3个样品具有质量差的基因组DNA。在13个样品中的10个样品中，使用常规的L1 PCR(用MY09/11引物)和嵌套式L1 PCR(用MY09/11和GP5+/6+引物)不能检测到HPVDNA或HPV DNA经检测呈阴性。该数据表明，假定HPV对于高度子宫颈疾病呈阳性(＞92％的灵敏度)，那么对于大部分假阴性样品发生了取样错误。

实施例8：MCM6抗体的抗择

多元瘤筛选

筛选多孔组织培养板中提供的多元瘤以鉴定具有想要的灵敏度和特异性性质的MCM6生物标志物特异性抗体。产生在单张载片上包含多个正常(即无CIN)、CINIII、鳞状细胞癌和腺癌样品的组织微阵列。就组织微阵列的阳性染色对来自各孔的包含多元瘤的未稀释上清液进行分析。在该阶段基本上忽略背景，即非特异性结合。35个受试多元瘤中的11个产生阳性染色结果，选择其以作进一步分析。

为了确定选择的多元瘤的特异性，将用所述多元瘤上清液获得的染色模式和用商购获得的MCM 6抗体(BD Transduction Laboratories)的染色模式进行比较。用所述多元瘤上清液获得的染色模式似乎比用商购获得的MCM 6抗体(图17)观察到的染色模式更具特异性。

然后将11个选择的多元瘤接受有限稀释法。就包含多个正常(即，无CIN)、CINIII、鳞状细胞癌和腺癌样品的组织微阵列的阳性染色对30个由选择的多元瘤的上清液产生的有限稀释度进行测定。基于异常和癌性宫颈组织样品的阳性染色选择两个作为最好的上清液的有限稀释度克隆9D4.3和9D4.4。然后就其和NIL、LSIL、HSIL组织的反应性检测这些克隆的不同稀释度并合并基于液体的细胞学样品。1∶100稀释度的克隆9D4.3产生最大的信噪比，选择其以作进一步的表征。

MCM6，克隆9D4.3的表征

为了进一步表征克隆9D4.3，就40个基于液体的细胞学样品的阳性染色对该克隆进行测定，所述细胞学样品选自下列诊断类别：NIL(7)、LSIL(10)、HSIL(18)和宫颈癌(5)。使用PrepStain^TM载片处理器(TriPath Imaging，Inc.)制备40个样品中每一个样品的载片。每个样品的两张载片各用MCM 2抗体(Dako)和克隆9D4.3进行染色。剩下的载片用于PAP染色或作为阴性对照。

为制备载片，将各样品在200xg下离心2分钟以形成沉淀，轻轻倒出上清液。向各样品中加入2mL去离子水，涡旋样品，然后在600xg下离心5分钟。在轻轻倒出上清液后，加入另外的700μL tris缓冲的水。最后将样品装在PrepStain^TM载片处理器(Tripath Imaging，Inc.)，版本1.1上，运行Transfer Only程序。

制备后，将所有载片保持在95％的ETOH中至少24小时并且不超过3天。通过将载片置于1x靶修复溶液(Target Retrieval Solution)pH6.0(DAKO S1699)/dH₂O浴(预热至95℃)中，在蒸器中进行25分钟来实现MCM2的抗原修复。对于MCM6，通过将载片放入1x Tris pH 9.5缓冲液(Biocare)/dH₂O水浴(预热至95℃)中，在蒸器中进行25分钟来实现抗原的可接近性。在蒸后，让所有载片在室温下冷却20分钟。

通过使用实施例1(“自动化免疫组织化学法”)中所述的DAKO通用自动化染色仪的免疫组织化学法，来对载片进行染色。由经验丰富的细胞检验技术员就通过形态学确定的诊断分类来对载片进行筛选和评估。就标志物染色强度(0-3)、阳性染色细胞的百分比和标志物染色的定位(细胞核、细胞质、膜或其组合)来评估样品。细胞染色强度按0-3评分。对细胞评分≥1.5的进行计数。当表现成熟正常的鳞状细胞和表现正常的腺细胞染色呈棕色时，不将其当作阳性计数。然而，将鳞状成熟细胞和异常细胞作为阳性计数。然后将免疫细胞化学载片命名为TN(真阴性)、FN(假阴性)、TP(真阳性)或FP(假阳性)。

表45：克隆9D4.3(MCM6)

表46：MCM

使用的计算

灵敏度＝TP/(TP+FN)

特异性＝TN/(FP+TN)

阳性预测指数(Positive Predictive Power，PPP)＝TP/(TP+FP)

阴性预测指数(Negative Predictive Power，NPP)＝TN/(FN+TN)

将克隆9D4.3的灵敏度和特异性与用商购获得的MCM2抗体获得的相当。一个NIL事件对于两个抗体都呈阴性。在使用克隆9D4.3和商购获得的MCM2抗体的情况下，10个LSIL事件中的9个为阴性。在使用9D4.3和商购获得的MCM2抗体的情况下，24个HSIL事件中的23个为阳性。对于宫颈癌样品，在使用克隆9D4.3的情况下，所有5个样品都为阳性，在使用MCM 2抗体的情况下，5个样品中的4个为阳性。

MCM 6、克隆9D4.3的纯化

由于其灵敏度、特异性和显示细胞核染色模式的原因，纯化克隆9D4.3以作进一步分析。按照标准方法，使用StreamlinerProteinA(Amersham Biosciences)亲和吸附层析获得纯化的抗体。然后在1∶500和1∶6000之间的各种稀释度下就对HSIL的基于液体的子宫颈细胞学集库(pool)的反应性对所得的抗体溶液进行检测。在达到1∶6000的滴度时，信号仍然明显。

实施例10：临床组织样品中生物志物的实时PCR检测

使用ABI Prism 7700序列检测系统(Applied Biosystems)进行TaqMan^实时PCR。在本研究中，在Primer Express^TM程序，版本1.5(Applied Biosystems)的帮助下，设计用于靶宫颈生物标志物(即，MCM7、p21^waf、p14^ARF/p16、细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白E2)的特异性扩增的引物和探针。下面显示了引物和探针的序列信息：

MCM7：

引物名称：MCM7_T1T3-F

序列：CTCTGAGCCCGCCAAGC(SEQ ID NO：25)

引物名称：MCM7_T1T3-R

序列：TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA(SEQ IDNO：26)

探针名称：MCM7_T1T3-探针

序列：CCCTCGGCAGCGATGGCACT(SEQ ID NO：27)

引物名称：MCM7_T2T4-F

序列：GAGGAATCCCGAGCTGTGAA(SEQ ID NO：28)

引物名称：MCM7_T2T4-R

序列：CCCGCTCCCGCCAT(SEQ ID NO：29)

探针名称：MCM7_T2T4-探针

序列：CCCATGTGCTTCTTGTTTACTAAGAGCGGAA(SEQ IDNO：30)

引物名称：MCM7_T2-F

序列：GTCCGAAGCCCCCAGAA(SEQ ID NO：31)

引物名称：MCM7_T2-R

序列：CCCGACAGAGACCACTCACA(SEQ ID NO：32)

探针名称：MCM7_T2-探针

序列：CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA(SEQ ID NO：33)

引物名称：MCM7_T3T4-F

序列：CGCTACGCGAAGCTCTTTG(SEQ ID NO：34)

引物名称：MCM7_T3T4-R

序列：CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA(SEQ ID NO：35)

探针名称：MCM7_T3T4-探针

序列：TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA(SEQ ID NO：36)

p21waf1：

引物名称：p21T1T2-F

序列：CAAACGCCGGCTGATCTT(SEQ ID NO：37)

引物名称：p21T1T2-R

序列：CCAGGACTGCAGGCTTCCT(SEQ ID NO：38)

探针名称：p21T1T2-探针

序列：CAAGAGGAAGCCCTAATCCGCCCA(SEQ ID NO：39)

引物名称：p21T2-F

序列：GAGCGGCGGCAGACAA(SEQ ID NO：40)

引物名称：p21T2-R

序列：CCGCGAACACGCATCCT(SEQ ID NO：41)

探针名称：p21T2-探针

序列：CCCAGAGCCGAGCCAAGCGTG(SEQ ID NO：42)

引物名称：p21T3-F

序列：TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA(SEQ ID NO：43)

引物名称：p21T3-R

序列：TCCAGTCTGGCCAACAGAGTT(SEQ ID NO：44)

探针名称：p21T3-探针

序列：CGGCGGCAGACCAGCATGAC(SEQ ID NO：45)

p14ARF/p16：

引物名称：p16T4-F

序列：GCC CTC GTG CTG ATG CTA CT(SEQ ID NO：46)

引物名称：p16T4-R

序列：TCA TCA TGA CCT GGT CTT CTA GGA(SEQ ID NO：47)

探针名称：p16T4-探针

序列：AGC GTC TAG GGC AGC AGC CGC(SEQ ID NO：48)

引物名称：p16T1-F

序列：TGCCCAACGCACCGA(SEQ ID NO：49)

引物名称：p16T1-R

序列：GGGCGCTGCCCATCA(SEQ ID NO：50)

探针名称：p16T1-探针

序列：TCGGAGGCCGATCCAGGTCATG(SEQ ID NO：51)

引物名称：p16T2-F

序列：AAGCTTCCTTTCCGTCATGC(SEQ ID NO：52)

引物名称：p16T2-R

序列：CATGACCTGCCAGAGAGAACAG(SEQ ID NO：53)

探针名称：p16T2-探针

序列：CCCCCACCCTGGCTCTGACCA(SEQ ID NO：54)

引物名称：p16T3-F

序列：GGAAACCAAGGAAGAGGAATGAG(SEQ ID NO：55)

引物名称：p16T3-R

序列：TGTTCCCCCCTTCAGATCTTCT(SEQ ID NO：56)

探针名称：p16T3-探针

序列：ACGCGCGTACAGATCTCTCGAATGCT(SEQ ID NO：57)

引物名称：p16通用-F

序列：CACGCCCTAAGCGCACAT(SEQ ID NO：58)

引物名称：p16通用-R

序列：CCTAGTTCACAAAATGCTTGTCATG(SEQ ID NO：59)

探针名称：p16通用-探针

序列：TTTCTTGCGAGCCTCGCAGCCTC(SEQ ID NO：60)

细胞周期蛋白E1：

引物名称：CCNE1T1T2-F

序列：AAAGAAGATGATGACCGGGTTTAC(SEQ ID NO：61)

引物名称：CCNE1T1T2-R

序列：GAGCCTCTGGATGGTGCAA(SEQ ID NO：62)

探针名称：CCNE1T1T2-P

序列：CAAACTCAACGTGCAAGCCTCGGA(SEQ ID NO：63)

引物名称：CCNE1T1-F

序列：TCCGCCGCGGACAA(SEQ ID NO：64)

引物名称：CCNE1T1-R

序列：CATGGTGTCCCGCTCCTT(SEQ ID NO：65)

探针名称：CCNE1T1-探针

序列：ACCCTGGCCTCAGGCCGGAG(SEQ ID NO：66)

细胞周期蛋白E2：

引物名称：CCNE2T1T2-F

序列：GGAATTGTTGGCCACCTGTATT(SEQ ID NO：67)

引物名称：CCNE2T1T2-R

序列：CTGGAGAAATCACTTGTTCCTATTTCT(SEQ ID NO：68)

TaqMan探针名称：CCNE2T1T2-P

序列：CAGTCCTTGCATTATCATTGAAACACCTCACA(SEQ IDNO：69)

引物名称：CCNE2T1T3-F

序列：TCAACTCATTGGAATTACCTCATTATTC(SEQ ID NO：70)

引物名称：CCNE2T1T3-R

序列：ACCATCAGTGACGTAAGCAAACTC(SEQ ID NO：71)

TaqMan探针名称：CCNE2T1T3-P

序列：CCAAACTTGAGGAAATCTATGCTCCTAAACTCCA(SEQ IDNO：72)

引物名称：CCNE2T2-F

序列：TTTTGAAGTTCTGCATTCTGACTTG(SEQ ID NO：73)

引物名称：CCNE2T2-R

序列：ACCATCAGTGACGTAAGCAAGATAA(SEQ ID NO：74)

TaqMan探针名称：CCNE2T2-P

序列：AACCACAGATGAGGTCCATACTTCTAGACTGGCT(SEQ IDNO：75)

在5’碱基上用荧光染料FAM(6-羧基荧光素)标记探针，并在3’碱基上用淬灭染料TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)标记探针。扩增子的大小大约为100bp。使用18S核糖体RNA作为内源对照。用荧光染料VIC^TM标记18S rRNA探针。从Applied Biosystems购买已配好的18S rRNA引物/探针混合物。通过使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems)用随机六碱基聚合物将从正常(N)或癌(T)宫颈组织中提取的5μg总RNA定量地转化成单链cDNA形式。

制备下列反应试剂：

20X引物/探针的主混合物(Master Mix)(200μl中)

180μM正向引物           20μl

180μM反向引物         20μl

100μM TaqMan探针      10μl

H₂O                  150μl

最终的反应混合物(25μl/小孔)

20X引物/探针的主混合物                    1.25μl

2X TaqMan通用PCR主混合物(P/N：4304437)    12.5μl

cDNA模板                                  5.0μl

H₂O                                     6.25

从Applied Biosystems购买20X TaqMan通用PCR主混合物。在25μl总体积中，最终的引物和探针浓度分别为0.9μM和0.25μM。每个小孔使用10ng总RNA。扩增条件是：50℃下进行2分钟，95℃下进行10分钟，和2步骤循环：95℃下进行15秒和60℃下进行60秒，总共40个循环。各轮中包含至少3个无模板对照反应混和物。所有实验一式三份进行。

在各反应结束时，将记录的荧光强度用于下面的计算：Rn⁺是包含所有组分的反应的Rn值。Rn^-是未反应样品的Rn值(基线值或在NTC中检测到的值)。ΔRn是Rn⁺和Rn^-之间的差，其是通过PCR产生的信号大小的指标。在本研究中使用比较C_T法，该方法不使用已知量的标准，但将靶序列的相对量和选择的任何参照值(例如18SrRNA)进行比较。使用TaqMan^Human Endogenous Control Plate方案转换原始数据以进行实时PCR数据分析。

结果

以列表的形式在下面列出用各生物标志物和用特异性引物获得的结果。用正常宫颈组织样品(即，NIL)获得的结果称为N；用宫颈癌组织获得的结果标记为T。

表47：MCM7 TaqMan的结果

样品	T2	T5	T1T3	T2T4	T3T4
						CV01-T	4	0.04	29.9	4.5	1.4
CV03-T	5.7	0.02	36.8	6.1	2.6
						CV05-T	4.13	0.08	17.3	1.35	3.68
CV07-T	2.6	0.06	18.77	0.88	3.27
						CV09-T	4.96	0.08	15.01	3.69	3.22
CV11-T	5.9	0.01	7.37	3.08	1.75
						CV13-T	6.74	0.04	19.74	4.55	4.11
CV15-T	3.04	0.05	3.65	3.43	1.25
						CV17-T	5.21	0.02	20.07	2.74	1.56
CV19-T	3.34	0.09	21.17	2.88	6
						CV21-T	6.7	0.08	10.64	4.75	4.59
CV23-T	7.08	0.33	32.17	5.6	4.25
						CV25-T	4.87	0.03	18.11	4.58	4.51
CV27-T	4.24	0.03	36.25	4.6	2.82
						平均值	4.89	0.07	20.50	3.77	3.22
中值	4.89	0.05	19.74	3.77	3.22
						STD	1.32	0.07	9.46	1.39	1.32
						CV02-N	2.5	0.02	10.6	2.6	1.1
CV04-N	4.6	0.02	7.1	4.8	2.4
						CV06-N	1.75	0.01	2.14	1.36	2.63
CV08-N	1.35	0.01	4.8	1.71	1.54
						CV10-N	5.6	0.03	5.07	5.12	1.85
CV12-N	5.68	0.02	7.34	3.19	2.29
						CV16-N	4.35	0.08	3.72	2.75	1.78
CV18-N	3.98	0.01	4.74	3.63	1.7
						CV20-N	2.03	0.03	5.42	1.4	2.78
CV22-N	2.66	0.02	4.33	2.26	2.42
						CV24-N	4.88	0.09	9.03	1.53	2.77
CV28-N	2.71	0.01	10.38	1.36	1.7
						平均值	3.51	0.03	6.22	2.64	2.08
中值	3.51	0.02	5.42	2.60	2.08
						STD	1.40	0.03	2.48	1.21	0.50

表48：p21^waf1 TaqMan的结果

患者	T1T2	T2	T3
				Pt01-T	23.33	0.06	0.00
Pt02-T	14.66	0.01	0.00
				Pt03-T	11.86	0.00	0.00
Pt04-T	27.04	0.01	0.00
				Pt05-T	14.72	0.00	0.00
Pt06-T	22.84	0.01	0.00
				Pt07-T	14.04	0.00	0.00
Pt08-T	31.93	0.01	0.01
				Pt09-T	35.02	0.00	0.00
Pt10-T	13.2	0.00	0.00
				Pt11-T	24.87	0.01	0.00
Pt12-T	10.85	0.00	0.00
				Pt13-T	36.51	0.02	0.01
Pt14-T	12.72	0.00	0.00
				Pt15-T	10.64	0.00	0.00
Pt16-T	22.58	0.04	0.00
				Pt17-T	39.64	0.14	0.04
				Pt01-N	4.57	0.03	0.00
Pt02-N	5.57	0.00	0.00
				Pt03-N	3.54	0.00	0.00
Pt04-N	8.18	0.00	0.00
				Pt05-N	5.4	0.10	0.00
Pt06-N	11.01	0.00	0.00
				Pt08-N	10.39	0.00	0.00
Pt09-N	9.11	0.00	0.00
				Pt10-N	4.41	0.00	0.00
Pt11-N	8.64	0.00	0.00
				Pt12-N	3.03	0.00	0.00
Pt14-N	3.55	0.00	0.00
				Pt15-N	2.42	0.01	0.00
Pt17-N	11.46	0.05	0.01
T-平均值	21.5559
				N-平均值	6.52
St.T-检验＝	7.3E-06

表49：p14^ARF/p16 TaqMan的结果

患者	T1	T2	T3	T4	通用
						Pt01-T	0.2	0.1	0.2	0.2	0.2
Pt02-T	16.3	11.2	5.1	21.7	36.5
						Pt03-T	16.5	6.2	3.1	15.1	29.6
Pt04-T	10.1	2.8	2.6	13.2	27.7
						Pt05-T	12.7	3.6	2.1	11.3	23.1
						Pt01-N	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
Pt02-N	2.5	2.6	1.6	2.7	6.8
						Pt04-N	2.6	0.6	0.8	2.4	5.8
Pt05-N	2.1	0.8	0.7	4.1	4.6
T-平均值	11.2	4.8	2.6	12.3	23.4
						N-平均值	1.8	1.0	0.8	2.3	4.3

表50：细胞周期蛋白E1 TaqMan的结果

患者	T1T2癌M.	癌SD	T1T2正常M.	正常SD	T1癌M.	癌SD	T1正常M.	正常SD
									Pt01	12.19	0.12	4.11	0.13	1.34	0.04	0.5	0.03
Pt02	16.72	0.21	4.44	0.34	1.35	0.02	0.47	0.05
									Pt03	11.45	0.41	2.81	0.13	1.17	0.01	0.06	0.02
Pt04	21.33	0.45	5.33	0.09	0.76	0.1	0.23	0.01
									Pt05	11.17	0.25	3.68	0.15	0.95	0.05	0.15	0.03
Pt06	21.65	0.24	3.11	0.22	0.89	0.03	0.13	0.02
									Pt07	23.26	0.54	0	0	0.75	0.06	0	0.01
Pt08	8.37	0.24	3.1	0.01	0.12	0.01	0.13	0.02
									Pt09	17.74	0.43	2.17	0.08	0.73	0.02	0.09	0.01
Pt10	18.51	0.29	4.56	0.17	1.37	0.03	0.41	0.04
									Pt11	10.58	0.52	3.92	0.12	0.57	0.01	0.23	0.03
Pt12	33.67	0.58	7.87	0.1	0.78	0.01	0.28	0.05
									Pt13	36.9	0.41	0	0	1.05	0.04	0	0
Pt14	31.01	0.29	6.01	0.26	1.68	0.05	0.24	0.03
									Pt15	7.35	0.23	124	0.09	0.34	0.08	0.08	0.02
Pt16	12.71	0.61	3.72	0	1.1	0.06	0.07	0.01
									Pt17	12.13	0.21	11.46	0.15	0.34	0.07	0.05	0.01
Pt18	14.22	0.14	5.94	0.06	0.73	0.08	0.26	0.04
									Pt19	12.69	0.81	3.52	0.02	0.41	0.04	0.24	0.02
Pt20	16.56	0.16	6.1	0.12	0.17	0.02	0.06	0
									Pt21	11.63	0.23	3.01	0.06	0.54	0.04	0.23	0.01
Pt22	17.39	0.34	2.36	0.02	0.47	0.02	0.24	0.05
									Pt23	16.56	0.16	2.1	0.02	0.18	0.03	0.09	0.01
Pt24	22.23	0.33	4.06	0.28	1.9	0.17	0.52	0.01
									Pt25	13.98	0.48	3.72	0.05	0.54	0.04	0.23	0.01
Pt26	22.71	0.76	4.48	0.07	0.47	0.02	0.24	0.05
									Pt27	16.17	0.4	5.64	0.3	0.18	0	0.12	0.01
Pt28	12.6	0.56	3.8	0.06	0.29	0.03	0.05	0
									Pt29	13.69	0.34	3.1	0.18	0.29	0.03	0.11	0
Pt30	17.69	0.61	4.3	0.11	0.36	0.01	0.03	0
									Pt31	20.46	0.3	3.91	0.21	0.47	0.03	0.08	0
Pt32	18.38	0.18	3.16	0.06	0.42	0.02	0.17	0.01
									Pt33	21.1	0.62	4.52	0.33	1.07	0.05	0.24	0.01
Pt34	21.5	1.37	4.56	0.13	0.24	0.01	0.11	0.01
									平均	17.54		4.26		0.68		0.20
T/N	4.1
									t-检验P＝	7.80E-14

表51：细胞周期蛋白E2 TaqMan的结果

患者	T1T2	T1T2 Std.Dev.	T1T3	T1T3 Std.Dev.	T2	T2 Std.Dev.
							Pt01-T	13.17	1.02	16.11	0.39	0.01	0.00
Pt02-T	13.42	0.3	18.12	2.21	0.15	0.02
							pt03-T	13.64	0.50	17.40	2.16	0.05	0.01
Pt04-T	19.37	1.41	24.26	1.01	0.01	0.00
							Pt05-T	10.59	1.1	14.71	1.58	0.17	0.02
Pt06-T	7.96	0.91	9.32	0.51	0.06	0.01
							Pt07-T	14.1	1.73	16.92	0.84	0.54	0.06
Pt08-T	8.11	0.67	9.50	0.66	0.34	0.07
							Pt09-T	13.04	0.72	18.27	0.99	0.02	0.00
Pt10-T	19.56	2.29	23.42	0.00	0.02	0.01
							Pt11-T	16.8	1.57	18.71	2.15	0.08	0.01
Pt12-T	16.05	0.85	18.81	0.74	0.91	0.01
							Pt13-T	14.91	0.87	18.51	1.59	0.61	0.16
Pt14-T	14.89	0.32	20.49	0.86	0.42	0.03
							Pt15-T	12.44	0.47	15.26	1.00	0.68	0.18
Pt16-T	11.54	1.58	13.13	0.75	1.02	0.14
							Pt17-T	6.78	0.47	7.91	0.45	0.85	0.10
Pt01-N	4.89	0.21	5.94	0.53	0.00	0.00
							Pt02-N	6.32	0.47	8.91	0.61	0.13	0.00
Pt03-N	4.8	0.31	5.89	0.30	0.04	0.00
							Pt04-N	13.28	0.74	15.28	1.37	0.01	0.00
Pt05-N	6.51	1.2	9.04	0.82	0.16	0.02
							Pt06-N	4.96	0.83	6.41	0.84	0.05	0.01
Pt08-N	6.48	0.73	6.82	0.60	0.07	0.02
							Pt09-N	3.74	0.48	4.63	0.66	0.03	0.01
Pt10-N	10.32	0.93	11.31	0.89	0.02	0.00
							Pt11-N	10.34	0.26	13.90	0.53	0.04	0.04
Pt12-N	13.81	1.69	16.60	1.45	0.24	0.07
							Pt14-N	6.92	0.63	9.07	0.95	0.14	0.03
Pt15-N	4.8	0.73	8.55	1.40	0.10	0.03
							Pt17-N	5.33	0.2	5.78	0.27	0.23	0.07
							T-平均值	13.32		16.52		0.35
N-平均值	7.32		9.15		0.09
							St.T-检验	4.16E-05		3.31742E-05		0.008813

实施例11：临床组织样品中生物标志物的实时PCR检测

如实施例9中所述，使用宫颈癌组织样品(例如，腺癌、鳞状细胞癌)和正常宫颈组织样品进行TaqMan^实时PCR。在本研究中，在Primer Express^TM程序，版本1.5(Applied Biosystems)的帮助下，设计用于靶宫颈生物标志物(即，MCM2、MCM6、MCM7和Topo2A)的特异性扩增的引物和探针。下面显示引物和探针的序列信息：

TaqMan引物

MCM2：

引物名称：MCM2-F

序列：5’-GGAGGTGGTACTGGCCATGTA-3’(SEQ ID NO：80)

引物名称：MCM2-R

序列：5’-GGGAGATGCGGACATGGAT-3’(SEQ ID NO：81)

TaqMan探针名称：MCM2-P

序列：5’-CCAAGTACGACCGCATCACCAACCA-3’(SEQ ID NO：82)

MCM6：

引物名称：MCM6-F

序列：5’-CATTCCAAGACCTGCCTACCA-3’(SEQ ID NO：83)

引物名称：MCM6-R

序列：5’-ATGCGAGTGAGCAAACCAATT-3’(SEQ ID NO：84)

TaqMan探针名称：MCM6-P

序列：5’-ACACAAGATTCGAGAGCTCACCTCATCCA-3’(SEQ IDNO：85)

MCM7：

引物名称：MCM7_T1T3-F

序列：CTCTGAGCCCGCCAAGC(SEQ ID NO：25)

引物名称：MCM7_T1T3-R

序列：TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA(SEQ IDNO：26)

探针名称：MCM7_T1T3-探针

序列：CCCTCGGCAGCGATGGCACT(SEQ ID NO：27)

引物名称：MCM7_T2T4-F

序列：GAGGAATCCCGAGCTGTGAA(SEQ ID NO：28)

引物名称：MCM7_T2T4-R

序列：CCCGCTCCCGCCAT(SEQ ID NO：29)

探针名称：MCM7_T2T4-探针

序列：CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA(SEQ IDNO：30)

引物名称：MCM7_T2-F

序列：GTCCGAAGCCCCCAGAA(SEQ ID NO：31)

引物名称：MCM7_T2-R

序列：CCCGACAGAGACCACTCACA(SEQ ID NO：32)

探针名称：MCM7_T2-探针

序列：CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA(SEQ ID NO：33)

引物名称：MCM7_T3T4-F

序列：CGCTACGCGAAGCTCTTTG(SEQ ID NO：34)

引物名称：MCM7_T3T4-R

序列：CCTTTGTTTGCCATTGTFCTCTAA(SEQ ID NO：35)

探针名称：MCM7_T3T4-探针

序列：TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA(SEQ ID NO：36)

TOPO2A：

引物名称：TOP2A_F

序列：5’-GGCTACATGGTGGCAAGGA-3’(SEQ ID NO：86)

引物名称：TOP2A_R

序列：5’-TGGAAATAACAATCGAGCCAAAG-3’(SEQ ID NO：87)

TaqMan探针名称：TOP2A_P

序列：5’-TGCTAGTCCACGATACATCTTTACAATGCTCAGC-3’(SEQ ID NO：88)

结果

以列表的形式在下面列出获得的各标志物的结果。也在下面对数据进行概述。

                     表52：速冻的宫颈癌组织样品

患者	TPOID	诊断的病程	HPV类型	MCM2TaqM	MCM6TaqMan	MCM7TaqM	top2ATaqM
								Pt 01	CV-001	鳞状细胞癌	HPV16	8.93	11.31	29.9	23.76
Pt 02	CV-003	腺癌	HPV18	10.94	14.29	36.8	25.28
								Pt 03	CV-005	腺癌	HPV18	17.67	13.84	17.3	23.18
Pt 04	CV-007	鳞状细胞癌	HPV16	23.61	13.3	18.77	23.26
								Pt 05	CV-009	鳞状细胞癌	HPV16	9.3	11.26	15.01	20.33
Pt 06	CV-011	鳞状细胞癌	HPV16	13.86	11.58	7.37	8.37
								pt 07	CV-013	腺癌	HPV18	27.03	16.32	19.74	34.29
Pt 08	CV-015	鳞状细胞癌	HPV16，HPV18，+	8.28	8.16	3.65	8.57
								Pt 09	CV-017	鳞状细胞癌	HPV18	12.61	13.56	20.07	11.31
Pt 10	CV-019	鳞状细胞癌	HPV18	31.88	23.38	21.17	27.48
								Pt 11	CV-021	鳞状细胞癌	HPV16	11.27	14.76	10.64	12.73
Pt 12	CV-023	鳞状细胞癌	HPV16	11.39	11.29	32.17	21.11
								Pt 13	CV-025	鳞状细胞癌	HPV16	23.88	18.98	18.11	27.96
Pt 14	CV-027	鳞状细胞癌	HPV18，HPV16，+	12.26	15.53	36.25	26.63
								Pt 15	CV-029	鳞状细胞癌	HPV16	6.56	7.92	9.64	7.81
Pt 16	CV-031	鳞状细胞癌	HPV73	28.12	12.21	27.3	21.4
								Pt 17	CV-033	鳞状细胞癌	HPV16	8.76	7.59	14.37	12.42
Pt 18	CV-035	鳞状细胞癌	HPV16	21.4	12.65	23.63	27.57
								Pt 19	CV-037	鳞状细胞癌	HPV18	12.59	13.06	14.37	9.24

患者	TPOID	诊断的病程	HPV类型	MCM2TaqM	MCM6TaqMan	MCM7TaqM	top2ATaqM
								Pt 20	CV-039	腺、鳞细胞癌	HPV16，HPV18，+	7.24	8.17	16.97	15.13
Pt 21	CV-041	鳞状细胞癌	HPV16	9.61	11.84	13.88	11.92
								Pt 22	CV-043	鳞状细胞癌	HPV16	21.57	13.21	18.31	24.19
Pt 23	CV-045	鳞状细胞癌	HPV16	21.19	13.18	18.76	19.97
								Pt 24	CV-047	鳞状细胞癌	HPV18	24.61	19.09	20.19	28.14
Pt 25	CV-049	鳞状细胞癌	HPV18	11.43	10.2	13.70	10.55
								Pt 26	CV-051	鳞状细胞癌	HPV16	24.25	20.54	23.26	33.26
Pt 27	CV-053	鳞状细胞癌	HPV45	26.74	21.34	20.96	20.34
								Pt 28	CV-055	鳞状细胞癌	HPV16，HPV18，+	12.65	12	14.42	12.17
Pt 29	CV-057	鳞状细胞癌	HPV16	16	14.72	25.46	22.16
								Pt 30	CV-059	鳞状细胞癌	HPV16，HPV18，+	22.55	17.87	15.30	25.54
Pt 31	CV-061	鳞状细胞癌	HPV16	24.08	21.88	23.11	25.28
								Pt 32	CV-063	鳞状细胞癌	HPV18，HPV16，+	24.16	12.55	21.63	22.39
Pt 33	CV-065	鳞状细胞癌	HPV16	26.63	16.05	27.56	28.84
								Pt 34	CV-067	鳞状细胞癌	HPV16	19.61	23.28	19.03	25.57

                            表53：相邻的正常组织样品

患者	TPOID	HPV类型	MCM2TaqM	MCM6TaqMan	MCM7TaqM	top2ATaqM
							Pt 01	CV-002	阴性	3.04	4.4	10.6	10.52
Pt 02	CV-004	阴性	6.26	6.28	7.1	9.06
							Pt 03	CV-006	HPV18	2.06	2.53	2.14	3.86
Pt 04	CV-008	阴性	3.14	4.15	4.8	8.03
							Pt 05	CV-010	阴性	2.2	3.45	5.07	6.91
Pt 06	CV-012	阴性	2.06	2.29	7.34	6.82
							Pt 07	CV-014	阴性	N/A	N/A	N/A	N/A
Pt 08	CV-016	阴性	2.55	3.13	3.72	2.02
							Pt 09	CV-018	阴性	2.09	3.09	4.74	1.24
Pt 10	CV-020	阴性	8.15	6.76	5.42	10.41
							Pt 11	CV-022	阴性	4.53	5.34	4.33	6.64
Pt 12	CV-024	阴性	1.94	2.45	9.03	6.13
							Pt 13	CV-026	阴性	N/A	N/A	N/A	N/A
Pt 14	CV-028	阴性	2.62	2.95	10.38	5.3
							Pt 15	CV-030	阴性	1.14	1.28	2.06	1.54
Pt 16	CV-032	阴性	N/A	N/A	N/A	N/A
							Pt 17	CV-034	阴性	1.24	1.91	1.32	0.42
Pt 18	CV-036	阴性	3.4	1.89	4.01	4.32
							Pt 19	CV-038	阴性	3.48	4.98	5.60	7.92
Pt 20	CV-040	阴性	1.84	3.28	3.73	1.38

患者	TPOID	HPV类型	MCM2TaqM	MCM6TaqMan	MCM7TaqM	top2ATaqM
							Pt 21	CV-042	阴性	1.53	3.3	4.77	1.01
Pt 22	CV-044	阴性	2.65	4.03	2.74	2.59
							Pt 23	CV-046	阴性	3.09	3.53	5.90	3.42
Pt 24	CV-048	HPV18	2.57	5.19	3.82	5.32
							Pt 25	CV-050	阴性	5.84	4.64	7.78	9.14
Pt 26	CV-052	阴性	5.11	5.22	5.37	5.13
							Pt 27	CV-054	阴性	2.91	3.29	5.10	0.76
Pt 28	CV-056	阴性	4.14	3.74	5.54	4.15
							Pt 29	CV-058	HPV16	2.83	4.98	10.13	7.57
Pt 30	CV-060	阴性	6.41	5	5.39	10.05
							Pt 31	CV-062	阴性	5.72	4.93	9.29	9.95
Pt 32	CV-064	阴性	8.06	5.41	7.64	9
							Pt 33	CV-066	阴性	9.93	7.94	10.78	9.95
Pt 34	CV-068	阴性	2.36	6.39	5.73	1.81

                               结果概述

                       表54：肿瘤对相邻正常组织

标志物	肿瘤(M±SD)	正常(M±SD)	R	P
					MCM2MCM6MCM7top2A	17.43±7.3414.32±4.3219.38±6.9420.53±7.54	3.71±2.214.12±1.565.85±2.595.56±3.33	4.703.483.313.69	＜0.0001＜0.0001＜0.0001＜0.0001

M：平均值：SD：标准误：R：肿瘤平均值对正常平均值的比例；

P：t-test的P值。

                             表55：HPV-16对HPV-18

标志物	肿瘤HPV类型	病例	肿瘤(M±SD)	正常(M±SD)
					MCM2MCM6MCM7top2A	161816+18161816+18161816+18161816+18	1886188618861886	16.77±6.7817.23±8.1614.52±7.1814.19±4.4414.24±4.1012.38±3.8919.39±6.9417.23±4.1618.04±7.7120.92±7.3819.78±9.5218.41±7.49	3.29±2.133.99±2.404.27±2.473.97±1.754.35±1.543.92±1.046.07±2.985.07±1.916.07±2.565.46±3.266.19±3.335.32±3.57

                       表56：鳞状细胞癌与腺癌

标志物	组织病理学	病例	肿瘤(M±SD)	正常(M±SD)
					MCM2MCM6MCM7top2A	SCCACSCCACSCCACSCCAC	304304304304	17.66±7.2815.72±8.6914.48±4.4413.16±3.4919.27±7.2520.20±4.5720.01±7.4721.47±7.87	3.74±2.233.39±2.494.13±1.554.03±1.986.01±2.584.32±2.535.65±3.344.77±3.92

SCC：鳞状细胞癌；AC：腺癌

实施例12：宫颈癌和乳腺癌细胞系中生物标志物的实时PCR检测

进行TaqMan^实时PCR以检测MCM2、MCM6和MCM7在宫颈癌细胞系和乳腺癌细胞系中的表达水平。

实验设计和方案

从ATCC购买三种人宫颈癌细胞系SiHa、Caski和HeLa以及三种人乳腺癌细胞系MCF-7、SK-BR3和CAMA，并将其用于本实验。通过RNeasy^Protect Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从新培养的细胞提取总细胞RNA，并使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems，P/N：4322171)用随机六聚物将其转变成单链cDNA形式。在ABI Prism^7700 Sequence Detection System上使用TaqMan^通用PCR主混合物(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时PCR。

用ABI Primer Express^TM程序(版本1.5)设计用于MCM2、MCM6和MCM7的特异性扩增的引物和探针。MCM7包含4种转录变体：在NCBIEntrez核苷酸数据库中鉴定了转录变体1(T1，refseqNM_005916)和转录变体2(T2，refseq NM_182776)。如通过由NCBI的Model Maker汇集的EST所分析的，变体T3和T4在5′末端附近具有可变的外显子。特别地设计了引物和探针T1T3、T2T4、T2和T3T4用于检测变体T1和T3、T2和T4、T2，以及T3和T4。引物和探针的序列显示于上面的实施例10和11中。

用荧光染料FAM(6-羧基荧光素)在5′碱基上和用淬灭染色TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)在3′碱基上标记探针。使用18S核糖体RNA作为内源对照。用荧光染料VIC标记18S rRNA探针。从AppliedBiosystems购买已配好的18S rRNA引物/探针混和物。在总体积为25μl、分别包含0.9μM和0.25μM的引物和探针的反应混合物中使用10ng cDNA，扩增条件是：50℃下进行2分钟，95℃下进行10分钟，和2步骤循环：95℃下进行15秒和60℃下进行60秒，总共40个循环。各轮反应中包含至少3个无模板对照反应混和物。所有实验一式两次进行。按照ABI的用户指南(P/N4303859)使用相对定量方法，基于其CT值计算靶基因相对于18S内源对照的表达水平。

结果

以列表的形式在下面列出获得的各生物标志物的结果。

表57：宫颈癌细胞系和乳腺癌细胞系的生物标志物的表达

	SiHa	Caski	HeLa	MCF7	SK-BR3	CAMA
							MCM2	21.4	5.01	8.79	18.84	7.65	17.32
MCM6	12.34	5.77	6.46	12.6	5.44	13.14
							MCM7	20.53	17.27	8.31	26.91	30.38	25.36

结论

结果显示宫颈HeLa细胞具有低表达水平的MCM2、MCM6和MCM7生物标志物。宫颈SiHa、乳腺MCM7和CAMA细胞系都显示MCM2、MCM6和MCM7生物标志物的过表达。宫颈Caski和乳腺SK-BR3细胞系显示MCM7的过表达，但显示MCM2和MCM6的低表达。

实施例.13：通过瞬时HPV16 E6/E7基因转染进行的293细胞中宫颈生物标志物表达的诱导

使用TaqMan^实时PCR测定法研究HEK293细胞系系统中宫颈生物标志物的表达和高危HPV癌基因转录之间的关系。

实验设计和方案

在本实验中采用受四环素调控的表达系统(T-Rex系统，Invitrogen，Inc)。构建表达HPV16 E2、E6或E7蛋白的T-Rex载体。将包含突变体E2、E6或E7基因的载体用作负对照。然后用HPV质粒转染T-Rex 293细胞，用四环素激活HPV基因的表达，进行4小时、24小时和72小时。通过RNeasyProtect Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从经转染的细胞提取总细胞RNA，并使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems，P/N：4322171)用随机六核苷酸聚体将其转变为单链cDNA形式。在ABIPrism7700 Sequence Detection System上使用TaqManUniversalPCR Master Mix(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时PCR。

用ABI Primer Express^TM程序(版本1.5)设计用于MCM2、MCM6、MCM7、TOP2A、细胞周期蛋白E1、p21、p14、HPV16 E2、E6和E7的特异性扩增的引物和探针。MCM7包含4种转录变体：在NCBI Entrez核苷酸数据库中鉴定了转录变体1(T1，refseqNM_005916)和转录变体2(T2，refseq NM_182776)。如通过由NCBI的Model Maker汇集的EST装配所分析的，变体T3和T4在5′末端附近具有可变的外显子。用于特异性地检测变体T1和T3、T2和T4、T2以及T3和T4的引物和探针分别称为T1T3、T2T4、T2和T3T4。引物和探针的序列和上面实施例10和11中显示的一样。

用荧光染料FAM(6-羧基荧光素)在5′碱基上和用淬灭染色TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)在3′碱基上标记探针。使用18S核糖体RNA作为内源对照。用荧光染料VIC标记18S rRNA探针。从AppliedBiosystems购买已配好的18S rRNA引物/探针混和物。在总体积为25μl、包含浓度分别为0.9μM和0.25μM的引物和探针的反应混合物中使用10ng cDNA。扩增条件是：50℃下进行2分钟，95℃下进行10分钟，和2步骤循环：95℃下进行15秒和60℃下进行60秒，总共40个循环。每轮包括至少3个无模板对照反应混和物。所有实验一式两份进行。按照ABI的用户指南(P/N4303859)使用相对定量方法，基于其CT值计算靶基因相对于18S内源对照的表达水平。

结果

通过转染的时间进程曲线观察到T-Rex 293细胞中HPV16 E2、E6和E7基因的表达增加。转染后从4小时直到72小时，T-Rex 293细胞中Topo2A、MCM2、MCM6、MCM7和细胞周期蛋白E的mRNA表达显著地由HPV 16 E6或E7基因诱导。然而，在HPV基因感染后对p21和p14并未检测到表达水平升高。E6或E7的表达似乎不被E2基因的共转染抑制。这是因为E6或E7的表达完全由外源CMV启动子驱动而不是由天然的HPV启动子驱动。后者在本模型系统中不存在。

                                    表58：Topo2A

转染	0h	0h SD	4h	4h SD	24h	24h SD	72h	72h SD
									293-H16E2	6.91	0.07	5.22	0.13	5.68	0.14	6.61	0.36
293-H16E6	6.91	0.07	11.31	0.22	18.13	0.89	17.39	0.85
									293-H16E7	6.91	0.07	20.33	0.9	28.94	0.71	35.02	1.03
293-H16dE7	6.91	0.07	6.43	0.35	8.18	0.64	7.39	0.18
									293-LacZ	6.91	0.07	7.4	0.07	7.36	0.22	7.25	0.67

                                     表59：MCM2

转染	0h	0h SD	4h	4h SD	24h	24h SD	72h	72h SD
									293-H16E2	4.79	0.23	5.25	0.36	5.24	0.31	4.44	0.3
293-H16E6	4.79	0.23	6.04	0.21	9.38	0.37	12.08	0.18
									293-H16E7	4.79	0.23	10.81	0.16	12.29	0.36	16.34	0.8
293-H16dE7	4.79	0.23	5.72	0.36	4.98	0.27	5.03	0.39
									293-LacZ	4.79	0.23	5.67	0.61	5.68	0.47	5.98	0.79

                                    表60：MCM6

转染	0h	0h SD	4h	4h SD	24h	24h SD	72h	72h SD
									293-H16E2	3.62	0.2	3.5	0.22	4.72	0	4.44	0.26
293-H16E6	3.62	0.2	4.74	0.07	9.03	0.04	9.68	0.43
									293-H16E7	3.62	0.2	7.7	0.04	13.5	0.33	14.03	0.41
293-H16dE7	3.62	0.2	5.23	0.28	4.6	0.32	4.73	0.37
									293-LacZ	3.62	0.2	4.77	0.12	4.66	0.14	5.34	0.39

                                     表61：MCM7

转染	0h	0h SD	4h	4h SD	24h	24h SD	72h	72h SD
									293-H16E2	4.2	0.04	6.3	0.28	5.3	0.18	5.8	0.31
293-H16E6	4.2	0.04	4.99	0.05	9.55	0.23	15.24	0.3
									293-H16E7	4.2	0.04	10.11	0.84	14.23	0.84	21.18	0.31
293-H16dE7	4.2	0.04	3.65	0.3	6.06	0.3	4.64	0.07
									293-LacZ	4.2	0.04	5.74	0.45	5.31	0.55	5.66	0.17

                                    表62：Cyelin E1

转染	0h	0h SD	4h	4h SD	24h	24h SD	72h	72h SD
									293-H16E2	6.02	0.00	5.06	0.10	5.03	0.35	5.72	0.31
293-H16E6	6.02	0.00	9.19	0.18	8.95	0.79	9.38	0.18
									293-H16E7	6.02	0.00	12.91	0.38	17.63	0.17	17.32	0.25
293-H16dE7	6.02	0.00	5.45	0.24	6.87	0.20	5.11	0.08
									293-LacZ	6.02	0.00	5.72	0.31	6.28	0.37	5.65	0.64

                                   表63：p21

转染	0h	0h SD	4h	4h SD	24h	24h SD	72h	72h SD
									293-H16E2	4.76	0.19	4.05	0.30	5.19	0.61	4.92	0.60
293-H16E6	4.76	0.19	5.56	0.19	5.60	0.08	7.21	0.07
									293-H16E7	4.76	0.19	7.52	0.29	5.22	0.13	6.45	0.13
293-H16dE7	4.76	0.19	4.38	0.26	5.60	0.66	5.10	0.05
									293-LacZ	4.76	0.19	3.86	0.00	4.53	0.27	5.37	0.29

                                    表64：p14

转染	0h	0h SD	4h	4h SD	24h	24h SD	72h	72h SD
									293-H16E2	4.78	0.30	4.44	0.09	5.04	0.44	5.04	0.07
293-H16E6	4.78	0.30	4.77	0.12	5.48	0.13	4.52	0.11
									293-H16E7	4.78	0.30	6.38	0.62	5.60	0.25	6.43	0.35
293-H16dE7	4.78	0.30	5.08	0.12	5.53	0.35	5.10	0.15
									293-LacZ	4.78	0.30	4.54	0.40	4.68	0.16	5.76	0.25

                                     表65：HPV16 E2

	E2	E6	E7	dE2	dE6	dE7	E2+E6	E2+E7	dE2+E6	dE2+E7	LacZ	Mock
													4h	130.22	0	0	110.7	0	0	95.34	36.6	3.94	12.86	0	0
24h	162.12	0	0	111.41	0	0	118.17	90.19	19.77	7.7	0	0
													72h	251.55	0	0	141.57	0	0	162.54	128.41	32.94	9.89	0	0

                                  表66：HPV16E6

	E2	E6	E7	dE2	dE6	dE7	E2+E6	E2+E7	dE2+E6	dE2+E7	LacZ	Mock
													4h	0	205	0	0	219.87	0	128.41	0	199.65	0	0	0
24h	0	329.67	0	0	225.96	0	158.31	0	188.03	0	0	0
													72h	0	757.26	0	0	315.22	0	392	0	271.55	0	0	0

                                  表67：HPV16 E7

	E2	E6	E7	dE2	dE6	dE7	E2+E6	E2+E7	dE2+E6	dE2+E7	LacZ	Mock
													4h	0	0	330.76	0	0	165.48	0	120.65	0	201.19	0	0
24h	0	0	1514.6	0	0	239.63	0	857.89	0	600.57	0	0
													72h	0	0	2806.8	0	0	355.9	0	1444.25	0	809.11	0	0

实施例14：使用载片预处理缓冲液增加免疫细胞化学和免疫组织化学法中的抗原可接近性

样品选择和试剂描述

将成对的来自相同患者的细胞学和组织学样品接受免疫测定以检测生物标志物的过表达。分析来自分类为ASCUS(3)、LSIL(6)和HSIL(5)的患者的石蜡块组织样品和SurePath细胞学样品。所用的试剂是抗体混合物(用于细胞学)、经修饰的抗体混合物(用于组织学)、检测试剂、复染剂和SureSlide制备缓冲液10X(预处理溶液)。

细胞学载片制备和自动免疫细胞化学法

为了进行免疫细胞化学法，如实施例5中所示进行载片制备和预处理。然后如实施例5中所述的一样(除了一点不同外)对各细胞学样品进行自动化免疫细胞化学法。对于本实验，将一抗混合物(MCM2克隆26H6.19 1∶10,000、MCM2克隆27C5.6 1∶800、TOPOIIA克隆SWT3D1 1∶1000)的温育减少至30分钟。

组织学载片制备和自动化免疫细胞化学法

对于各事件，切取4微米的切片并将其干燥过夜或在70℃的鼓风干燥箱中干燥20分钟。将切片在二甲苯中脱蜡，更换3次二甲苯，每次5分钟。然后在无水乙醇中清洗载片，每次5分钟。将载片放入水下并充分漂洗。将载片转移至1XSureSlide制备缓冲液的预热溶液并置于蒸器中温育25分钟。从蒸器中聚出载片并让其在室温下冷却20分钟。慢慢地在水中漂洗载片直至缓冲液被完全替换掉。进行TBST漂洗，更换2次缓冲液，每次2分钟。

如实施例5中针对免疫细胞化学法的描述一样(除了两点不同外)进行自动化免疫组织化学法。在本实验中，一抗混合物的温育减少至30分钟。此外，用下列稀释度(MCM2克隆26H6.19 1∶4,000、MCM2克隆27C5.6 1∶200、TOPOIIA克隆SWT3D1 1∶400)修饰一抗混合物。

结果

使用RUO试剂在组织学和细胞学样品上观察到预期的染色模式。具体地说，成功地证实了用SureSlide制备缓冲液、检测试剂和复染剂对组织学和细胞学样品进行免疫染色的能力。

                    表68：生物标志物核苷酸和氨基酸序列的信息

	核苷酸序列		氨基酸序列
					生物标志物名称	录入号	序列编号	录入号	序列编号
Cyclin E1(同工型1)	NM_001238	SEQ ID NO：1	NP_001229	SEQ ID NO：2
					Cyclin E1(同工型2)	NM_057182	SEQ ID NO：3	NP_476530	SEQ ID NO：4
Cyclin E2(同工型1)	NM_057749)	SEQ ID NO：5	NP_477097	SEQ ID NO：6
					Cyclin E2(同工型2)	NM_057735	SEQ ID NO：7	NP_477083	SEQ ID NO：8
Cyclin E2(同工型3)	NM_004702	SEQ ID NO：9	NP_004693	SEQ ID NO：10
					MCM2	NM_004526	SEQ ID NO：11	NP_0045417	SEQ ID NO：12
MCM6	NM_005915	SEQ ID NO：89	NP_005906	SEQ ID NO：90
					MCM7(同工型1)	NM_005916	SEQ ID NO：13	NP_005907	SEQ ID NO：14
MCM7(同工型2)	NM_182776	SEQ ID NO：15	NP_877577	SEQ ID NO：16
					p21/waf1(变体1)	NM_000389	SEQ ID NO：17	NP_000380	SEQ ID NO：18
p21/waf1(变体2)	NM_078467	SEQ ID NO：19	NP_510867	SEQ ID NO：20
					p14ARF	NM_058195	SEQ ID NO：21	NP_478102	SEQ ID NO：22
Topo2a	NM_001067	SEQ ID NO：23	NP_0010568	SEQ ID NO：24

根据上面的描述和实施例，本领域技术人员认识到，和常规方法相比，本发明的方法允许对高度子宫颈疾病进行更优越的不依赖于年龄的检测。本发明的方法可特别地适合下面所述的用途：

●用于年龄超过30岁的妇女，所述检测可以是HPV阳性结果的反映或作为ASCUS+细胞学结果的反映。

●用于年龄小于30岁的妇女，所述检测可和用于检测高度子宫颈疾病的细胞学检测法一起使用。

●用于年龄超过30岁的妇女，所述检测可和用于检测高度子宫颈疾病的细胞学检测法一起使用。

●用于年龄小于30岁的妇女，将所述检测作为检测高度子宫颈疾病的初步筛查来进行使用。

●用于年龄超过30岁的妇女，将所述检测作为检测高度子宫颈疾病的初步筛查来进行使用。

●在年龄小于30岁的妇女中，所述检测可替代Pap抹片检查。

●最后，不依赖于年龄，所述检测可替代Pap抹片检查。

来源于本发明的实践的其他潜在有利方面包括：

●30岁和30岁以上具有NIL/HPV阳性结果的妇女中的组织学高度异常性的检测。

●年龄超过30岁、对DNA+Pap抹片检查呈阳性的妇女中高度子宫颈疾病的检测有更好的特异性。

●对ASC-US、ASC-H和LSIL分类范围内的妇女中高度子宫颈疾病可更好的检测，不依赖于年龄。

●对HSIL分类范围内的高度子宫颈疾病的检测有更好的特异性。

●和基于细胞学的诊断结合在年龄小于30岁的妇女中用于检测高度子宫颈疾病。

●和基于细胞学的诊断结合用于高度子宫颈疾病的检测，不依赖于年龄。

●作为年龄小于30岁的妇女中的初步筛查用于高度子宫颈疾病的检测有提高的特异性。

●作为初步筛选用于高度子宫颈疾病的检测有提高的特异性，不依赖于年龄。

●鉴定子宫颈疾病和区别HPV感染与高度子宫颈疾病。

●可使用人工解释或通过自动化显微镜技术辅助解释建立可接受的测定表现。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请代表了和本发明所属技术领域内的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都在此处引用作为参考，就如同每一篇出版物或专利申请被明确和单独地指示被引用作为参考一样。

尽管已通过图表和示例对前述发明作了较为详细的描述以便理解清楚，但很显然，可进行某些改变和修饰而不背离所附实施方案的范围。

序列表

序列表

<110>Fischer，Timothy J.

     Malinowski，Douglas P.

     Taylor，Adriann J.

     Parker，Margaret R.

<120>用于检测宫颈疾病的方法和组合物

<130>46143/290269

<150>60/556,495

<151>2004-03-24

<160>90

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>1958

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

agcagccggc gcggccgcca gcgcggtgta gggggcaggc gcggatcccg ccaccgccgc  60

gcgctcggcc cgccgactcc cggcgccgcc gccgccactg ccgtcgccgc cgccgcctgc  120

cgggactgga gcgcgccgtc cgccgcggac aagaccctgg cctcaggccg gagcagcccc  180

atcatgccga gggagcgcag ggagcgggat gcgaaggagc gggacaccat gaaggaggac  240

ggcggcgcgg agttctcggc tcgctccagg aagaggaagg caaacgtgac cgtttttttg  300

caggatccag atgaagaaat ggccaaaatc gacaggacgg cgagggacca gtgtgggagc  360

cagccttggg acaataatgc agtctgtgca gacccctgct ccctgatccc cacacctgac  420

aaagaagatg atgaccgggt ttacccaaac tcaacgtgca agcctcggat tattgcacca  480

tccagaggct ccccgctgcc tgtactgagc tgggcaaata gagaggaagt ctggaaaatc  540

atgttaaaca aggaaaagac atacttaagg gatcagcact ttcttgagca acaccctctt  600

ctgcagccaa aaatgcgagc aattcttctg gattggttaa tggaggtgtg tgaagtctat  660

aaacttcaca gggagacctt ttacttggca caagatttct ttgaccggta tatggcgaca  720

caagaaaatg ttgtaaaaac tcttttacag cttattggga tttcatcttt atttattgca  780

gccaaacttg aggaaatcta tcctccaaag ttgcaccagt ttgcgtatgt gacagatgga  840

gcttgttcag gagatgaaat tctcaccatg gaattaatga ttatgaaggc ccttaagtgg  900

cgtttaagtc ccctgactat tgtgtcctgg ctgaatgtat acatgcaggt tgcatatcta  960

aatgacttac atgaagtgct actgccgcag tatccccagc aaatctttat acagattgca  1020

gagctgttgg atctctgtgt cctggatgtt gactgccttg aatttcctta tggtatactt  1080

gctgcttcgg ccttgtatca tttctcgtca tctgaattga tgcaaaaggt ttcagggtat  1140

cagtggtgcg acatagagaa ctgtgtcaag tggatggttc catttgccat ggttataagg  1200

gagacgggga gctcaaaact gaagcacttc aggggcgtcg ctgatgaaga tgcacacaac  1260

atacagaccc acagagacag cttggatttg ctggacaaag cccgagcaaa gaaagccatg  1320

ttgtctgaac aaaatagggc ttctcctctc cccagtgggc tcctcacccc gccacagagc  1380

ggtaagaagc agagcagcgg gccggaaatg gcgtgaccac cccatccttc tccaccaaag  1440

acagttgcgc gcctgctcca cgttctcttc tgtctgttgc agcggaggcg tgcgtttgct  1500

tttacagata tctgaatgga agagtgtttc ttccacaaca gaagtatttc tgtggatggc  1560

atcaaacagg gcaaagtgtt ttttattgaa tgcttatagg ttttttttaa ataagtgggt  1620

caagtacacc agccacctcc agacaccagt gcgtgctccc gatgctgcta tggaaggtgc  1680

tacttgacct aagggactcc cacaacaaca aaagcttgaa gctgtggagg gccacggtgg  1740

cgtggctctc ctcgcaggtg ttctgggctc cgttgtacca agtggagcag gtggttgcgg  1800

gcaagcgttg tgcagagccc atagccagct gggcaggggg ctgccctctc cacattatca  1860

gttgacagtg tacaatgcct ttgatgaact gttttgtaag tgctgctata tctatccatt  1920

ttttaataaa gataatactg tttttgagac aaaaaaaa                          1958

<210>2

<211>410

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Pro Arg Glu Arg Arg Glu Arg Asp Ala Lys Glu Arg Asp Thr Met

 1               5                   10                  15

Lys Glu Asp Gly Gly Ala Glu Phe Ser Ala Arg Ser Arg Lys Arg Lys

            20                  25                  30

Ala Asn Val Thr Val Phe Leu Gln Asp Pro Asp Glu Glu Met Ala Lys

        35                  40                  45

Ile Asp Arg Thr Ala Arg Asp Gln Cys Gly Ser Gln Pro Trp Asp Asn

    50                  55                  60

Asn Ala Val Cys Ala Asp Pro cys Ser Leu Ile Pro Thr Pro Asp Lys

65                  70                  75                  80

Glu Asp Asp Asp Arg Val Tyr Pro Asn Ser Thr Cys Lys Pro Arg Ile

                85                  90                  95

Ile Ala Pro Ser Arg Gly Ser Pro Leu Pro Val Leu Ser Trp Ala Asn

            100                 105                 110

Arg Glu Glu Val Trp Lys Ile Met Leu Asn Lys Glu Lys Thr Tyr Leu

        115                 120                 125

Arg Asp Gln His Phe Leu Glu Gln His Pro Leu Leu Gln Pro Lys Met

    130                 135                 140

Arg Ala Ile Leu Leu Asp Trp Leu Met Glu Val Cys Glu Val Tyr Lys

145                 150                 155                 160

Leu His Arg Glu Thr Phe Tyr Leu Ala Gln Asp Phe Phe Asp Arg Tyr

                165                 170                 175

Met Ala Thr Gln Glu Asn Val Val Lys Thr Leu Leu Gln Leu Ile Gly

            180                 185                 190

Ile Ser Ser Leu Phe Ile Ala Ala Lys Leu Glu Glu Ile Tyr Pro Pro

        195                 200                 205

Lys Leu His Gln Phe Ala Tyr Val Thr Asp Gly Ala Cys Ser Gly Asp

    210                 215                 220

Glu Ile Leu Thr Met Glu Leu Met Ile Met Lys Ala Leu Lys Trp Arg

225                 230                 235                 240

Leu Ser Pro Leu Thr Ile Val Ser Trp Leu Asn Val Tyr Met Gln Val

                245                 250                 255

Ala Tyr Leu Asn Asp Leu His Glu Val Leu Leu Pro Gln Tyr Pro Gln

            260                 265                 270

Gln Ile Phe Ile Gln Ile Ala Glu Leu Leu Asp Leu Cys Val Leu Asp

        275                 280                 285

Val Asp Cys Leu Glu Phe Pro Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Ser Ala Leu

    290                 295                 300

Tyr His Phe Ser Ser Ser Glu Leu Met Gln Lys Val Ser Gly Tyr Gln

305                 310                 315                 320

Trp Cys Asp Ile Glu Asn Cys Val Lys Trp Met Val Pro Phe Ala Met

                325                 330                 335

Val Ile Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Leu Lys His Phe Arg Gly Val

            340                 345                 350

Ala Asp Glu Asp Ala His Asn Ile Gln Thr His Arg Asp Ser Leu Asp

        355                 360                 365

Leu Leu Asp Lys Ala Arg Ala Lys Lys Ala Met Leu Ser Glu Gln Asn

    370                 375                 380

Arg Ala Ser Pro Leu Pro Ser Gly Leu Leu Thr Pro Pro Gln Ser Gly

385                 390                 395                 400

Lys Lys Gln Ser Ser Gly Pro Glu Met Ala

            405                     410

<210>3

<211>1787

<212>DNA

<213>人

<400>3

gtgctcaccc ggcccggtgc cacccgggtc cacagggatg cgaaggagcg ggacaccatg  60

aaggaggacg gcggcgcgga gttctcggct cgctccagga agaggaaggc aaacgtgacc  120

gtttttttgc aggatccaga tgaagaaatg gccaaaatcg acaggacggc gagggaccag  180

tgtgggagcc agccttggga caataatgca gtctgtgcag acccctgctc cctgatcccc  240

acacctgaca aagaagatga tgaccgggtt tacccaaact caacgtgcaa gcctcggatt  300

attgcaccat ccagaggctc cccgctgcct gtactgagct gggcaaatag agaggaagtc  360

tggaaaatca tgttaaacaa ggaaaagaca tacttaaggg atcagcactt tcttgagcaa  420

caccctcttc tgcagccaaa aatgcgagca attcttctgg attggttaat ggaggtgtgt  480

gaagtctata aacttcacag ggagaccttt tacttggcac aagatttctt tgaccggtat  540

atggcgacac aagaaaatgt tgtaaaaact cttttacagc ttattgggat ttcatcttta  600

tttattgcag ccaaacttga ggaaatctat cctccaaagt tgcaccagtt tgcgtatgtg  660

acagatggag cttgttcagg agatgaaatt ctcaccatgg aattaatgat tatgaaggcc  720

cttaagtggc gtttaagtcc cctgactatt gtgtcctggc tgaatgtata catgcaggtt  780

gcatatctaa atgacttaca tgaagtgcta ctgccgcagt atccccagca aatctttata  840

cagattgcag agctgttgga tctctgtgtc ctggatgttg actgccttga atttccttat  900

ggtatacttg ctgcttcggc cttgtatcat ttctcgtcat ctgaattgat gcaaaaggtt  960

tcagggtatc agtggtgcga catagagaac tgtgtcaagt ggatggttcc atttgccatg  1020

gttataaggg agacggggag ctcaaaactg aagcacttca ggggcgtcgc tgatgaagat  1080

gcacacaaca tacagaccca cagagacagc ttggatttgc tggacaaagc ccgagcaaag  1140

aaagccatgt tgtctgaaca aaatagggct tctcctctcc ccagtgggct cctcaccccg  1200

ccacagagcg gtaagaagca gagcagcggg ccggaaatgg cgtgaccacc ccatccttct  1260

ccaccaaaga cagttgcgcg cctgctccac gttctcttct gtctgttgca gcggaggcgt  1320

gcgtttgctt ttacagatat ctgaatggaa gagtgtttct tccacaacag aagtatttct  1380

gtggatggca tcaaacaggg caaagtgttt tttattgaat gcttataggt tttttttaaa  1440

taagtgggtc aagtacacca gccacctcca gacaccagtg cgtgctcccg atgctgctat  1500

ggaaggtgct acttgaccta agggactccc acaacaacaa aagcttgaag ctgtggaggg  1560

ccacggtggc gtggctctcc tcgcaggtgt tctgggctcc gttgtaccaa gtggagcagg  1620

tggttgcggg caagcgttgt gcagagccca tagccagctg ggcagggggc tgccctctcc  1680

acattatcag ttgacagtgt acaatgcctt tgatgaactg ttttgtaagt gctgctatat  1740

ctatccattt tttaataaag ataatactgt ttttgagaca aaaaaaa                1787

<210>4

<211>395

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Lys Glu Asp Gly Gly Ala Glu Phe Ser Ala Arg Ser Arg Lys Arg

 1               5                  10                  15

Lys Ala Asn Val Thr Val Phe Leu Gln Asp Pro Asp Glu Glu Met Ala

            20                  25                  30

Lys Ile Asp Arg Thr Ala Arg Asp Gln Cys Gly Ser Gln Pro Trp Asp

        35                  40                  45

Asn Asn Ala Val Cys Ala Asp Pro Cys Ser Leu Ile Pro Thr Pro Asp

    50                  55                  60

Lys Glu Asp Asp Asp Arg Val Tyr Pro Asn Ser Thr Cys Lys Pro Arg

65                  70                  75                  80

Ile Ile Ala Pro Ser Arg Gly Ser Pro Leu Pro Val Leu Ser Trp Ala

                85                  90                  95

Asn Arg Glu Glu Val Trp Lys Ile Met Leu Asn Lys Glu Lys Thr Tyr

            100                 105                 110

Leu Arg Asp Gln His Phe Leu Glu Gln His Pro Leu Leu Gln Pro Lys

        115                 120                 125

Met Arg Ala Ile Leu Leu Asp Trp Leu Met Glu Val Cys Glu Val Tyr

    130                 135                 140

Lys Leu His Arg Glu Thr Phe Tyr Leu Ala Gln Asp Phe Phe Asp Arg

145                 150                 155                 160

Tyr Met Ala Thr Gln Glu Asn Val Val Lys Thr Leu Leu Gln Leu Ile

                165                 170                 175

Gly Ile Ser Ser Leu Phe Ile Ala Ala Lys Leu Glu Glu Ile Tyr Pro

            180                 185                 190

Pro Lys Leu His Gln Phe Ala Tyr Val Thr Asp Gly Ala Cys Ser Gly

        195                 200                 205

Asp Glu Ile Leu Thr Met Glu Leu Met Ile Met Lys Ala Leu Lys Trp

    210                 215                 220

Arg Leu Ser Pro Leu Thr Ile Val Ser Trp Leu Asn Val Tyr Met Gln

225                 230                 235                 240

Val Ala Tyr Leu Asn Asp Leu His Glu Val Leu Leu Pro Gln Tyr Pro

                245                 250                 255

Gln Gln Ile Phe Ile Gln Ile Ala Glu Leu Leu Asp Leu Cys Val Leu

            260                 265                 270

Asp Val Asp Cys Leu Glu Phe Pro Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Ser Ala

        275                 280                 285

Leu Tyr His Phe Ser Ser Ser Glu Leu Met Gln Lys Val Ser Gly Tyr

    290                 295                 300

Gln Trp Cys Asp Ile Glu Asn Cys Val Lys Trp Met Val Pro Phe Ala

305                 310                 315                 320

Met Val Ile Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Leu Lys His Phe Arg Gly

                325                 330                 335

Val Ala Asp Glu Asp Ala His Asn Ile Gln Thr His Arg Asp Ser Leu

            340                 345                 350

Asp Leu Leu Asp Lys Ala Arg Ala Lys Lys Ala Met Leu Ser Glu Gln

        355                 360                 365

Asn Arg Ala Ser Pro Leu Pro Ser Gly Leu Leu Thr Pro Pro Gln Ser

    370             375                     380

Gly Lys Lys Gln Ser Ser Gly Pro Glu Met Ala

385                 390                 395

<210>5

<211>2748

<212>DNA

<213>人

<400>5

agcgggtgcg gggcgggacc ggcccggcct atatattggg ttggcgccgg cgccagctga  60

gccgagcggt agctggtctg gcgaggtttt atacacctga aagaagagaa tgtcaagacg  120

aagtagccgt ttacaagcta agcagcagcc ccagcccagc cagacggaat ccccccaaga  180

agcccagata atccaggcca agaagaggaa aactacccag gatgtcaaaa aaagaagaga  240

ggaggtcacc aagaaacatc agtatgaaat taggaattgt tggccacctg tattatctgg  300

ggggatcagt ccttgcatta tcattgaaac acctcacaaa gaaataggaa caagtgattt  360

ctccagattt acaaattaca gatttaaaaa tctttttatt aatccttcac ctttgcctga  420

tttaagctgg ggatgttcaa aagaagtctg gctaaacatg ttaaaaaagg agagcagata  480

tgttcatgac aaacattttg aagttctgca ttctgacttg gaaccacaga tgaggtccat  540

acttctagac tggcttttag aggtatgtga agtatacaca cttcataggg aaacatttta  600

tcttgcacaa gacttttttg atagatttat gttgacacaa aaggatataa ataaaaatat  660

gcttcaactc attggaatta cctcattatt cattgcttcc aaacttgagg aaatctatgc  720

tcctaaactc caagagtttg cttacgtcac tgatggtgct tgcagtgaag aggatatctt  780

aaggatggaa ctcattatat taaaggcttt aaaatgggaa ctttgtcctg taacaatcat  840

ctcctggcta aatctctttc tccaagttga tgctcttaaa gatgctccta aagttcttct  900

acctcagtat tctcaggaaa cattcattca aatagctcag cttttagatc tgtgtattct  960

agccattgat tcattagagt tccagtacag aatactgact gctgctgcct tgtgccattt  1020

tacctccatt gaagtggtta agaaagcctc aggtttggag tgggacagta tttcagaatg  1080

tgtagattgg atggtacctt ttgtcaatgt agtaaaaagt actagtccag tgaagctgaa  1140

gacttttaag aagattccta tggaagacag acataatatc cagacacata caaactattt  1200

ggctatgctg gaggaagtaa attacataaa caccttcaga aaagggggac agttgtcacc  1260

agtgtgcaat ggaggcatta tgacaccacc gaagagcact gaaaaaccac caggaaaaca  1320

ctaaagaaga taactaagca aacaagttgg aattcaccaa gattgggtag aactggtatc  1380

actgaactac taaagtttta cagaaagtag tgctgtgatt gattgcccta gccaattcac  1440

aagttacact gccattctga ttttaaaact tacaattggc actaaagaat acatttaatt  1500

atttcctatg ttagctgtta aagaaacagc aggacttgtt tacaaagatg tcttcattcc  1560

caaggttact ggatagaagc caaccacagt ctataccata gcaatgtttt tcctttaatc  1620

cagtgttact gtgtttatct tgataaacta ggaattttgt cactggagtt ttggactgga  1680

taagtgctac cttaaagggt atactaagtg atacagtact ttgaatctag ttgttagatt  1740

ctcaaaattc ctacactctt gactagtgca atttggttct tgaaaattaa atttaaactt  1800

gtttacaaag gtttagtttt gtaataaggt gactaattta tctatagctg ctatagcaag  1860

ctattataaa acttgaattt ctacaaatgg tgaaatttaa tgttttttaa actagtttat  1920

ttgccttgcc ataacacatt ttttaactaa taaggcttag atgaacatgg tgttcaacct  1980

gtgctctaaa cagtgggagt accaaagaaa ttataaacaa gataaatgct gtggctcctt  2040

cctaactggg gctttcttga catgtaggtt gcttggtaat aacctttttg tatatcacaa  2100

tttgggtgaa aaacttaagt accctttcaa actatttata tgaggaagtc actttactac  2160

tctaagatat ccctaaggaa tttttttttt taatttagtg tgactaaggc tttatttatg  2220

tttgtgaaac tgttaaggtc ctttctaaat tcctccattg tgagataagg acagtgtcaa  2280

agtgataaag cttaacactt gacctaaact tctattttct taaggaagaa gagtattaaa  2340

tatatactga ctcctagaaa tctatttatt aaaaaaagac atgaaaactt gctgtacata  2400

ggctagctat ttctaaatat tttaaattag cttttctaaa aaaaaaatcc agcctcataa  2460

agtagattag aaaactagat tgctagttta ttttgttatc agatatgtga atctcttctc  2520

cctttgaaga aactatacat ttattgttac ggtatgaagt cttctgtata gtttgttttt  2580

aaactaatat ttgtttcagt attttgtctg aaaagaaaac accactaatt gtgtacatat  2640

gtattatata aacttaacct tttaatactg tttattttta gcccattgtt taaaaaataa  2700

aagttaaaaa aatttaactg cttaaaagta aaaaaaaaaa aaaaaaaa               2748

<210>6

<211>404

<212>PRT

<213>人

<400>6

Met Ser Arg Arg Ser Ser Arg Leu Gln Ala Lys Gln Gln Pro Gln Pro

 1               5                   10                  15

Ser Gln Thr Glu Ser Pro Gln Glu Ala Gln Ile Ile Gln Ala Lys Lys

            20                  25                  30

Arg Lys Thr Thr Gln Asp Val Lys Lys Arg Arg Glu Glu Val Thr Lys

        35                  40                  45

Lys His Gln Tyr Glu Ile Arg Asn Cys Trp Pro Pro Val Leu Ser Gly

    50                  55                  60

Gly Ile Ser Pro Cys Ile Ile Ile Glu Thr Pro His Lys Glu Ile Gly

65                  70                  75                  80

Thr Ser Asp Phe Ser Arg Phe Thr Asn Tyr Arg Phe Lys Asn Leu Phe

                85                  90                  95

Ile Asn Pro Ser Pro Leu Pro Asp Leu Ser Trp Gly Cys Ser Lys Glu

            100                 105                 110

Val Trp Leu Asn Met Leu Lys Lys Glu Ser Arg Tyr Val His Asp Lys

        115                 120                 125

His Phe Glu Val Leu His Ser Asp Leu Glu Pro Gln Met Arg Ser Ile

    130                 135                 140

Leu Leu Asp Trp Leu Leu Glu Val Cys Glu Val Tyr Thr Leu His Arg

145                 150                 155                 160

Glu Thr Phe Tyr Leu Ala Gln Asp Phe Phe Asp Arg Phe Met Leu Thr

                165                 170                 175

Gln Lys Asp Ile Asn Lys Asn Met Leu Gln Leu Ile Gly Ile Thr Ser

            180                 185                 190

Leu Phe Ile Ala Ser Lys Leu Glu Glu Ile Tyr Ala Pro Lys Leu Gln

        195                 200                 205

Glu Phe Ala Tyr Val Thr Asp Gly Ala Cys Ser Glu Glu Asp Ile Leu

    210                 215                 220

Arg Met Glu Leu Ile Ile Leu Lys Ala Leu Lys Trp Glu Leu Cys Pro

225                 230                 235                 240

Val Thr Ile Ile Ser Trp Leu Asn Leu Phe Leu Gln Val Asp Ala Leu

                245                 250                 255

Lys Asp Ala Pro Lys Val Leu Leu Pro Gln Tyr Ser Gln Glu Thr Phe

            260                 265                 270

Ile Gln Ile Ala Gln Leu Leu Asp Leu Cys Ile Leu Ala Ile Asp Ser

        275                 280                 285

Leu Glu Phe Gln Tyr Arg Ile Leu Thr Ala Ala Ala Leu Cys His Phe

    290                 295                 300

Thr Ser Ile Glu Val Val Lys Lys Ala Ser Gly Leu Glu Trp Asp Ser

305                 310                 315                 320

Ile Ser Glu Cys Val Asp Trp Met Val Pro Phe Val Asn Val Val Lys

                325                 330                 335

Ser Thr Ser Pro Val Lys Leu Iys Thr Phe Lys Lys Ile Pro Met Glu

            340                 345                 350

Asp Arg His Asn Ile Gln Thr His Thr Asn Tyr Leu Ala Met Leu Glu

        355                 360                 365

Glu Val Asn Tyr Ile Asn Thr Phe Arg Lys Gly Gly Gln Leu Ser Pro

    370                 375                 380

Val Cys Asn Gly Gly Ile Met Thr Pro Pro Lys Ser Thr Glu Lys Pro

385                  390                395                 400

Pro Gly Lys His

<210>7

<211>2613

<212>DNA

<213>人

<400>7

agcgggtgcg gggcgggacc ggcccggcct atatattggg ttggcgccgg cgccagctga  60

gccgagcggt agctggtctg gcgaggtttt atacacctga aagaagagaa tgtcaagacg  120

aagtagccgt ttacaagcta agcagcagcc ccagcccagc cagacggaat ccccccaaga  180

agcccagata atccaggcca agaagaggaa aactacccag gatgtcaaaa aaagaagaga  240

ggaggtcacc aagaaacatc agtatgaaat taggaattgt tggccacctg tattatctgg  300

ggggatcagt ccttgcatta tcattgaaac acctcacaaa gaaataggaa caagtgattt  360

ctccagattt acaaattaca gatttaaaaa tctttttatt aatccttcac ctttgcctga  420

tttaagctgg ggatgttcaa aagaagtctg gctaaacatg ttaaaaaagg agagcagata  480

tgttcatgac aaacattttg aagttctgca ttctgacttg gaaccacaga tgaggtccat  540

acttctagac tggcttttag aggtatgtga agtatacaca cttcataggg aaacatttta  600

tcttgcttac gtcactgatg gtgcttgcag tgaagaggat atcttaagga tggaactcat  660

tatattaaag gctttaaaat gggaactttg tcctgtaaca atcatctcct ggctaaatct  720

ctttctccaa gttgatgctc ttaaagatgc tcctaaagtt cttctacctc agtattctca  780

ggaaacattc attcaaatag ctcagctttt agatctgtgt attctagcca ttgattcatt  840

agagttccag tacagaatac tgactgctgc tgccttgtgc cattttacct ccattgaagt  900

ggttaagaaa gcctcaggtt tggagtggga cagtatttca gaatgtgtag attggatggt  960

accttttgtc aatgtagtaa aaagtactag tccagtgaag ctgaagactt ttaagaagat  1020

tcctatggaa gacagacata atatccagac acatacaaac tatttggcta tgctggagga  1080

agtaaattac ataaacacct tcagaaaagg gggacagttg tcaccagtgt gcaatggagg  1140

cattatgaca ccaccgaaga gcactgaaaa accaccagga aaacactaaa gaagataact  1200

aagcaaacaa gttggaattc accaagattg ggtagaactg gtatcactga actactaaag  1260

ttttacagaa agtagtgctg tgattgattg ccctagccaa ttcacaagtt acactgccat  1320

tctgatttta aaacttacaa ttggcactaa agaatacatt taattatttc ctatgttagc  1380

tgttaaagaa acagcaggac ttgtttacaa agatgtcttc attcccaagg ttactggata  1440

gaagccaacc acagtctata ccatagcaat gtttttcctt taatccagtg ttactgtgtt  1500

tatcttgata aactaggaat tttgtcactg gagttttgga ctggataagt gctaccttaa  1560

agggtatact aagtgataca gtactttgaa tctagttgtt agattctcaa aattcctaca  1620

ctcttgacta gtgcaatttg gttcttgaaa attaaattta aacttgttta caaaggttta  1680

gttttgtaat aaggtgacta atttatctat agctgctata gcaagctatt ataaaacttg  1740

aatttctaca aatggtgaaa tttaatgttt tttaaactag tttatttgcc ttgccataac  1800

acatttttta actaataagg cttagatgaa catggtgttc aacctgtgct ctaaacagtg  1860

ggagtaccaa agaaattata aacaagataa atgctgtggc tccttcctaa ctggggcttt  1920

cttgacatgt aggttgcttg gtaataacct ttttgtatat cacaatttgg gtgaaaaact  1980

taagtaccct ttcaaactat ttatatgagg aagtcacttt actactctaa gatatcccta  2040

aggaattttt ttttttaatt tagtgtgact aaggctttat ttatgtttgt gaaactgtta  2100

aggtcctttc taaattcctc cattgtgaga taaggacagt gtcaaagtga taaagcttaa  2160

cacttgacct aaacttctat tttcttaagg aagaagagta ttaaatatat actgactcct  2220

agaaatctat ttattaaaaa aagacatgaa aacttgctgt acataggcta gctatttcta  2280

aatattttaa attagctttt ctaaaaaaaa aatccagcct cataaagtag attagaaaac  2340

tagattgcta gtttattttg ttatcagata tgtgaatctc ttctcccttt gaagaaacta  2400

tacatttatt gttacggtat gaagtcttct gtatagtttg tttttaaact aatatttgtt  2460

tcagtatttt gtctgaaaag aaaacaccac taattgtgta catatgtatt atataaactt  2520

aaccttttaa tactgtttat ttttagccca ttgtttaaaa aataaaagtt aaaaaaattt  2580

aactgcttaa aagtaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                               2613

<210>8

<211>359

<212>PRT

<213>人

<400>8

Met Ser Arg Arg Ser Ser Arg Leu Gln Ala Lys Gln Gln Pro Gln Pro

 1               5                  10                  15

Ser Gln Thr Glu Ser Pro Gln Glu Ala Gln Ile Ile Gln Ala Lys Lys

            20                  25                  30

Arg Lys Thr Thr Gln Asp Val Lys Lys Arg Arg Glu Glu Val Thr Lys

        35                  40                  45

Lys His Gln Tyr Glu Ile Arg Asn Cys Trp Pro Pro Val Leu Ser Gly

    50                  55                  60

Gly Ile Ser Pro Cys Ile Ile Ile Glu Thr Pro His Lys Glu Ile Gly

65                  70                  75                  80

Thr Ser Asp Phe Ser Arg Phe Thr Asn Tyr Arg Phe Lys Asn Leu Phe

                85                  90                  95

Ile Asn Pro Ser Pro Leu Pro Asp Leu Ser Trp Gly Cys Ser Lys Glu

            100                 105                 110

Val Trp Leu Asn Met Leu Lys Lys Glu Ser Arg Tyr Val His Asp Lys

        115                 120                 125

His Phe Glu Val Leu His Ser Asp Leu Glu Pro Gln Met Arg Ser Ile

    130                 135                 140

Leu Leu Asp Trp Leu Leu Glu Val Cys Glu Val Tyr Thr Leu His Arg

145                 150                 155                 160

Glu Thr Phe Tyr Leu Ala Tyr Val Thr Asp Gly Ala Cys Ser Glu Glu

                165                 170                 175

Asp Ile Leu Arg Met Glu Leu Ile Ile Leu Lys Ala Leu Lys Trp Glu

            180                 185                 190

Leu Cys Pro Val Thr Ile Ile Ser Trp Leu Asn Leu Phe Leu Gln Val

        195                 200                 205

Asp Ala Leu Lys Asp Ala Pro Lys Val Leu Leu Pro Gln Tyr Ser Gln

    210                 215                 220

Glu Thr Phe Ile Gln Ile Ala Gln Leu Leu Asp Leu Cys Ile Leu Ala

225                 230                 235                 240

Ile Asp Ser Leu Glu Phe Gln Tyr Arg Ile Leu Thr Ala Ala Ala Leu

                245                 250                 255

Cys His Phe Thr Ser Ile Glu Val Val Lys Lys Ala Ser Gly Leu Glu

            260                 265                 270

Trp Asp Ser Ile Ser Glu Cys Val Asp Trp Met Val Pro Phe Val Asn

        275                 280                 285

Val Val Lys Ser Thr Ser Pro Val Lys Leu Lys Thr Phe Lys Lys Ile

    290                 295                 300

Pro Met Glu Asp Arg His Asn Ile Gln Thr His Thr Asn Tyr Leu Ala

305                 310                 315                 320

Met Leu Glu Glu Val Asn Tyr Ile Asn Thr Phe Arg Lys Gly Gly Gln

                325                 330                 335

Leu Ser Pro Val Cys Asn Gly Gly Ile Met Thr Pro Pro Lys Ser Thr

            340                 345                 350

Glu Lys Pro Pro Gly Lys His

        355

<210>9

<211>2536

<212>DNA

<213>人

<400>9

agcgggtgcg gggcgggacc ggcccggcct atatattggg ttggcgccgg cgccagctga  60

gccgagcggt agctggtctg gcgaggtttt atacacctga aagaagagaa tgtcaagacg  120

aagtagccgt ttacaagcta agcagcagcc ccagcccagc cagacggaat ccccccaaga  180

agcccagata atccaggcca agaagaggaa aactacccag gatgtcaaaa gaagtctggc  240

taaacatgtt aaaaaaggag agcagatatg ttcatgacaa acattttgaa gttctgcatt  300

ctgacttgga accacagatg aggtccatac ttctagactg gcttttagag gtatgtgaag  360

tatacacact tcatagggaa acattttatc ttgcacaaga cttttttgat agatttatgt  420

tgacacaaaa ggatataaat aaaaatatgc ttcaactcat tggaattacc tcattattca  480

ttgcttccaa acttgaggaa atctatgctc ctaaactcca agagtttgct tacgtcactg  540

atggtgcttg cagtgaagag gatatcttaa ggatggaact cattatatta aaggctttaa  600

aatgggaact ttgtcctgta acaatcatct cctggctaaa tctctttctc caagttgatg  660

ctcttaaaga tgctcctaaa gttcttctac ctcagtattc tcaggaaaca ttcattcaaa  720

tagctcagct tttagatctg tgtattctag ccattgattc attagagttc cagtacagaa  780

tactgactgc tgctgccttg tgccatttta cctccattga agtggttaag aaagcctcag  840

gtttggagtg ggacagtatt tcagaatgtg tagattggat ggtacctttt gtcaatgtag  900

taaaaagtac tagtccagtg aagctgaaga cttttaagaa gattcctatg gaagacagac  960

ataatatcca gacacataca aactatttgg ctatgctgga ggaagtaaat tacataaaca  1020

ccttcagaaa agggggacag ttgtcaccag tgtgcaatgg aggcattatg acaccaccga  1080

agagcactga aaaaccacca ggaaaacact aaagaagata actaagcaaa caagttggaa  1140

ttcaccaaga ttgggtagaa ctggtatcac tgaactacta aagttttaca gaaagtagtg  1200

ctgtgattga ttgccctagc caattcacaa gttacactgc cattctgatt ttaaaactta  1260

caattggcac taaagaatac atttaattat ttcctatgtt agctgttaaa gaaacagcag  1320

gacttgttta caaagatgtc ttcattccca aggttactgg atagaagcca accacagtct  1380

ataccatagc aatgtttttc ctttaatcca gtgttactgt gtttatcttg ataaactagg  1440

aattttgtca ctggagtttt ggactggata agtgctacct taaagggtat actaagtgat  1500

acagtacttt gaatctagtt gttagattct caaaattcct acactcttga ctagtgcaat  1560

ttggttcttg aaaattaaat ttaaacttgt ttacaaaggt ttagttttgt aataaggtga  1620

ctaatttatc tatagctgct atagcaagct attataaaac ttgaatttct acaaatggtg  1680

aaatttaatg ttttttaaac tagtttattt gccttgccat aacacatttt ttaactaata  1740

aggcttagat gaacatggtg ttcaacctgt gctctaaaca gtgggagtac caaagaaatt  1800

ataaacaaga taaatgctgt ggctccttcc taactggggc tttcttgaca tgtaggttgc  1860

ttggtaataa cctttttgta tatcacaatt tgggtgaaaa acttaagtac cctttcaaac  1920

tatttatatg aggaagtcac tttactactc taagatatcc ctaaggaatt ttttttttta  1980

atttagtgtg actaaggctt tatttatgtt tgtgaaactg ttaaggtcct ttctaaattc  2040

ctccattgtg agataaggac agtgtcaaag tgataaagct taacacttga cctaaacttc  2100

tattttctta aggaagaaga gtattaaata tatactgact cctagaaatc tatttattaa  2160

aaaaagacat gaaaacttgc tgtacatagg ctagctattt ctaaatattt taaattagct  2220

tttctaaaaa aaaaatccag cctcataaag tagattagaa aactagattg ctagtttatt  2280

ttgttatcag atatgtgaat ctcttctccc tttgaagaaa ctatacattt attgttacgg  2340

tatgaagtct tctgtatagt ttgtttttaa actaatattt gtttcagtat tttgtctgaa  2400

aagaaaacac cactaattgt gtacstatgt attatataaa cttaaccttt taatactgtt  2460

tatttttagc ccattgttta aaaaataaaa gttaaaaaaa tttaactgct taaaagtaaa  2520

aaaaaaaaaa aaaaaa                                                  2536

<210>10

<211>296

<212>PRT

<213>人

<400>10

Met Ser Lys Glu Val Trp Leu Asn Met Leu Lys Lys Glu Ser Arg Tyr

 1               5                  10                  15

Val His Asp Lys His Phe Glu Val Leu His Ser Asp Leu Glu Pro Gln

            20                  25                  30

Met Arg Ser Ile Leu Lau Asp Trp Leu Leu Glu Val Cys Glu Val Tyr

        35                  40                  45

Thr Leu His Arg Glu Thr Phe Tyr Leu Ala Gln Asp Phe Phe Asp Arg

    50                  55                  60

Phe Met Leu Thr Gln Lys Asp Ile Asn Lys Asn Met Lau Gln Lau Ile

65                  70                  75                  80

Gly Ile Thr Ser Leu Phe Ile Ala Ser Lys Leu Glu Glu Ile Tyr Ala

                85                  90                  95

Pro Lys Leu Gln Glu Phe Ala Tyr Val Thr Asp Gly Ala Cys Ser Glu

            100                 105                 110

Glu Asp Ile Leu Arg Met Glu Leu Ile Ile Leu Lys Ala Lau Lys Trp

        115                 120                 125

Glu Leu Cys Pro Val Thr Ile Ile Ser Trp Leu Asn Leu Phe Leu Gln

    130                 135                 140

Val Asp Ala Leu Lys Asp Ala Pro Lys Val Leu Leu Pro Gln Tyr Ser

145                  150                 155                160

Gln Glu Thr Phe Ile Gln Ile Ala Gln Leu Leu Asp Leu Cys Ile Leu

                165                 170                 175

Ala Ile Asp Ser Leu Glu Phe Gln Tyr Arg Ile Leu Thr Ala Ala Ala

            180                 185                 190

Leu Cys His Phe Thr Ser Ile Glu Val Val Lys Lys Ala Ser Gly Leu

        195                 200                 205

Glu Trp Asp Ser Ile Ser Glu Cys Val Asp Trp Met Val Pro Phe Val

    210                 215                 220

Asn Val Val Lys Ser Thr Ser Pro Val Lys Leu Lys Thr Phe Lys Lys

225                 230                 235                 240

Ile Pro Met Glu Asp Arg His Asn Ile Gln Thr His Thr Asn Tyr Leu

                245                 250                 255

Ala Met Leu Glu Glu Val Asn Tyr Ile Asn Thr Phe Arg Lys Gly Gly

            260                 265                 270

Gln Leu Ser Pro Val Cys Ash Gly Gly Ile Met Thr Pro Pro Lys Ser

        275                 280                 285

Thr Glu Lys Pro Pro Gly Lys His

    290                 295

<210>11

<211>3453

<212>DNA

<213>人

<400>11

acttttcgcg cgaaacctgg ttgttgctgt agtggcggag aggatcgtgg tactgctatg  60

gcggaatcat cggaatcctt caccatggca tccagcccgg cccagcgtcg gcgaggcaat  120

gatcctctca cctccagccc tggccgaagc tcccggcgta ctgatgccct cacctccagc  180

cctggccgtg accttccacc atttgaggat gagtccgagg ggctcctagg cacagagggg  240

cccctggagg aagaagagga tggagaggag ctcattggag atggcatgga aagggactac  300

cgcgccatcc cagagctgga cgcctatgag gccgagggac tggctctgga tgatgaggac  360

gtagaggagc tgacggccag tcagagggag gcagcagagc gggccatgcg gcagcgtgac  420

cgggaggctg gccggggcct gggccgcatg cgccgtgggc tcctgtatga cagcgatgag  480

gaggacgagg agcgccctgc ccgcaagcgc cgccaggtgg agcgggccac ggaggacggc  540

gaggaggacg aggagatgat cgagagcatc gagaacctgg aggatctcaa aggccactct  600

gtgcgcgagt gggtgagcat ggcgggcccc cggctggaga tccaccaccg cttcaagaac  660

ttcctgcgca ctcacgtcga cagccacggc cacaacgtct tcaaggagcg catcagcgac  720

atgtgcaaag agaaccgtga gagcctggtg gtgaactatg aggacttggc agccagggag  780

cacgtgctgg cctacttcct gcctgaggca ccggcggagc tgctgcagat ctttgatgag  840

gctgccctgg aggtggtact ggccatgtac cccaagtacg accgcatcac caaccacatc  900

catgtccgca tctcccacct gcctctggtg gaggagctgc gctcgctgag gcagctgcat  960

ctgaaccagc tgatccgcac cagtggggtg gtgaccagct gcactggcgt cctgccccag  1020

ctcagcatgg tcaagtacaa ctgcaacaag tgcaatttcg tcctgggtcc tttctgccag  1080

tcccagaacc aggaggtgaa accaggctcc tgtcctgagt gccagtcggc cggccccttt  1140

gaggtcaaca tggaggagac catctatcag aactaccagc gtatccgaat ccaggagagt  1200

ccaggcaaag tggcggctgg ccggctgccc cgctccaagg acgccattct cctcgcagat  1260

ctggtggaca gctgcaagcc aggagacgag atagagctga ctggcatcta tcacaacaac  1320

tatgatggct ccctcaacac tgccaatggc ttccctgtct ttgccactgt catcctagcc  1380

aaccacgtgg ccaagaagga caacaaggtt gctgtagggg aactgaccga tgaagatgtg  1440

aagatgatca ctagcctctc caaggatcag cagatcggag agaagatctt tgccagcatt  1500

gctccttcca tctatggtca tgaagacatc aagagaggcc tggctctggc cctgttcgga  1560

ggggagccca aaaacccagg tggcaagcac aaggtacgtg gtgatatcaa cgtgctcttg  1620

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cgagccatct tcaccactgg ccagggggcg tcggctgtgg gcctcacggc gtatgtccag  1740

cggcaccctg tcagcaggga gtggaccttg gaggctgggg ccctggttct ggctgaccga  1800

ggagtgtgtc tcattgatga atttgacaag atgaatgacc aggacagaac cagcatccat  1860

gaggccatgg agcaacagag catctccatc tcgaaggctg gcatcgtcac ctccctgcag  1920

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actttctctg agaacgtgga cctcacagag cccatcatct cacgctttga catcctgtgt  2040

gtggtgaggg acaccgtgga cccagtccag gacgagatgc tggcccgctt cgtggtgggc  2100

agccacgtca gacaccaccc cagcaacaag gaggaggagg ggctggccaa tggcagcgct  2160

gctgagcccg ccatgcccaa cacgtatggc gtggagcccc tgccccagga ggtcctgaag  2220

aagtacatca tctacgccaa ggagagggtc cacccgaagc tcaaccagat ggaccaggac  2280

aaggtggcca agatgtacag tgacctgagg aaagaatcta tggcgacagg cagcatcccc  2340

attacggtgc ggcacatcga gtccatgatc cgcatggcgg aggcccacgc gcgcatccat  2400

ctgcgggact atgtgatcga agacgacgtc aacatggcca tccgcgtgat gctggagagc  2460

ttcatagaca cacagaagtt cagcgtcatg cgcagcatgc gcaagacttt tgcccgctac  2520

ctttcattcc ggcgtgacaa caatgagctg ttgctcttca tactgaagca gttagtggca  2580

gagcaggtga catatcagcg caaccgcttt ggggcccagc aggacactat tgaggtccct  2640

gagaaggact tggtggataa ggctcgtcag atcaacatcc acaacctctc tgcattttat  2700

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cctgctttgt gcttctcacc tttgggtggg atgccttgcc agtgtgtctt acttggttgc  3000

tgaacatctt gccacctccg agtgctttgt ctccactcag taccttggat cagagctgct  3060

gagttcagga tgcctgcgtg tggtttaggt gttagccttc ttacatggat gtcaggagag  3120

ctgctgccct cttggcgtga gttgcgtatt caggctgctt ttgctgcctt tggccagaga  3180

gctggttgaa gatgtttgta atcgttttca gtctcctgca ggtttctgtg cccctgtggt  3240

ggaagagggc acgacagtgc cagcgcagcg ttctgggctc ctcagtcgca ggggtgggat  3300

gtgagtcatg cggattatcc actcgccaca gttatcagct gccattgctc cctgtctgtt  3360

tccccactct cttatttgtg cattcggttt ggtttctgta gttttaattt ttaataaagt  3420

tgaataaaat ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                               3453

<210>12

<211>904

<212>PRT

<213>人

<400>12

Met Ala Glu Ser Ser Glu Ser Phe Thr Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln

 1               5                  10                  15

Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser

            20                  25                  30

Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro

        35                  40                  45

Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu

    50                  55                  60

Glu Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ile Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp

65                  70                  75                  80

Tyr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Asp Ala Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala

                85                  90                  95

Leu Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala

            100                 105                 110

Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu

        115                 120                 125

Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu

    130                 135                 140

Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp

145                 150                 155                 160

Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp

                165                 170                 175

Leu Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp Val Ser Met Ala Gly Pro Arg

            180                 185                 190

Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn Phe Leu Arg Thr His Val Asp

        195                 200                 205

Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys

    210                 215                 220

Glu Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg

225                 230                 235                 240

Glu His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu

                245                 250                 255

Gln Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu Val Val Leu Ala Met Tyr Pro

            260                 265                 270

Lys Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile His Val Arg Ile Ser His Leu

        275                 280                 285

Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Gln Leu His Leu Asn Gln

    290                 295                 300

Leu Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro

305                 310                 315                 320

Gln Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu

                325                 330                 335

Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys

            340                 345                 350

Pro Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Val Asn Met Glu Glu Thr

        355                 360                 365

Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys

    370                 375                 380

Val Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala

385                 390                 395                 400

Asp Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly

                405                 410                 415

Ile Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Asn Thr Ala Asn Gly phe

            420                 425                 430

Pro Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala Asn His Val Ala Lys Lys Asp

        435                 440                 445

Asn Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr Asp Glu Asp Val Lys Met Ile

    450                 455                 460

Thr Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser

465                 470                 475                 480

Ile Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala

                485                 490                 495

Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys Asn Pro Gly Gly Lys His Lys

            500                 505                 510

Val Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala

        515                 520                 525

Lys Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile

    530                 535                 540

Phe Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val

545                 550                 555                 560

Gln Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu

                565                 570                 575

Val Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met

            580                 585                 590

Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser

        595                 600                 605

Ile Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys

    610                 615                 620

Thr Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser

625                 630                 635                 640

Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg

                645                 650                 655

Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp Thr Val Asp pro Val Gln Asp

            660                 665                 670

Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly Ser His Val Arg His His Pro

        675                 680                 685

Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro

    690                 695                 700

Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu Pro Leu Pro Gln G1u Val Leu

705                 710                 715                 720

Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu Arg Val His Pro Lys Leu Asn

                725                 730                 735

Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys

            740                 745                 750

Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro Ile Thr Val Arg His Ile Glu

        755                 760                 765

Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His Ala Arg Ile His Leu Arg Asp

    770                 775                 780

Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met Ala Ile Arg Val Met Leu Glu

785                 790                 795                 800

Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser Val Met Arg Ser Met Arg Lys

                805                 810                 815

Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu

            820                 825                 830

Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg

        835                 840                 845

Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp

    850                 855                 860

Leu Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn Ile His Asn Leu Ser Ala Phe

865                 870                 875                 880

Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn Lys Phe Ser His Asp Leu Lys

                885                 890                 895

Arg Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe

            900

<210>13

<211>2821

<212>DNA

<213>人

<400>13

cgccccttcc cagccccaag ggtctaggat acagtctttg tagatgagcg ggtccccctt  60

ggaggacaga atgaagaatt gggaaatcat ggccgttctg gagagtagac aagaagacgg  120

cgaaagtcgg gcctgccccg ccctgcggcc ccggaacaaa agaacgcgtg tgcgctggcc  180

ctttaagagc gattctcctc cgcccgcgcc agctcggacc gcgggaaacc cggcgcctgc  240

actaccccgc ccggagatcc ccttccgacg cccgcaccgc ctccccgtca ctcattctag  300

gcccgcacgg tgattggctt gcggctagcg ggaggtgaag aaggccgcct tgtccgattg  360

gcccgcacgc agtggcgccg gtcacgtggg gggcgacgtt tcgcgccaat ttcggttggc  420

cggccacagt ccaccgcgcg gagattctca gcttccccag gagcaagacc tctgagcccg  480

ccaagcgcgg ccgcacggcc ctcggcagcg atggcactga aggactacgc gctagagaag  540

gaaaaggtta agaagttctt acaagagttc taccaggatg atgaactcgg gaagaagcag  600

ttcaagtatg ggaaccagtt ggttcggctg gctcatcggg aacaggtggc tctgtatgtg  660

gacctggacg acgtagccga ggatgacccc gagttggtgg actcaatttg tgagaatgcc  720

aggcgctacg cgaagctctt tgctgatgcc gtacaagagc tgctgcctca gtacaaggag  780

agggaagtgg taaataaaga tgtcctggac gtttacattg agcatcggct aatgatggag  840

cagcggagtc gggaccctgg gatggtccga agcccccaga accagtaccc tgctgaactc  900

atgcgcagat ttgagctgta ttttcaaggc cctagcagca acaagcctcg tgtgatccgg  960

gaagtgcggg ctgactctgt ggggaagttg gtaactgtgc gtggaatcgt cactcgtgtc  1020

tctgaagtca aacccaagat ggtggtggcc acttacactt gtgaccagtg tggggcagag  1080

acctaccagc cgatccagtc tcccactttc atgcctctga tcatgtgccc aagccaggag  1140

tgccaaacca accgctcagg agggcggctg tatctgcaga cacggggctc cagattcatc  1200

aaattccagg agatgaagat gcaagaacat agtgatcagg tgcctgtggg aaatatccct  1260

cgtagtatca cggtgctggt agaaggagag aacacaagga ttgcccagcc tggagaccac  1320

gtcagcgtca ctggtatttt cttgccaatc ctgcgcactg ggttccgaca ggtggtacag  1380

ggtttactct cagaaaccta cctggaagcc catcggattg tgaagatgaa caagagtgag  1440

gatgatgagt ctggggctgg agagctcacc agggaggagc tgaggcaaat tgcagaggag  1500

gatttctacg aaaagctggc agcttcaatc gccccagaaa tatacgggca tgaagatgtg  1560

aagaaggcac tgctgctcct gctagtcggg ggtgtggacc agtctcctcg aggcatgaaa  1620

atccggggca acatcaacat ctgtctgatg ggggatcctg gtgtggccaa gtctcagctc  1680

ctgtcataca ttgatcgact ggcgcctcgc agccagtaca caacaggccg gggctcctca  1740

ggagtggggc ttacggcagc tgtgctgaga gactccgtga gtggagaact gaccttagag  1800

ggtggggccc tggtgctggc tgaccagggt gtgtgctgca ttgatgagtt cgacaagatg  1860

gctgaggccg accgcacagc catccacgag gtcatggagc agcagaccat ctccattgcc  1920

aaggccggca ttctcaccac actcaatgcc cgctgctcca tcctggctgc cgccaaccct  1980

gcctacgggc gctacaaccc tcgccgcagc ctggagcaga acatacagct acctgctgca  2040

ctgctctccc ggtttgacct cctctggctg attcaggacc ggcccgaccg agacaatgac  2100

ctacggttgg cccagcacat cacctatgtg caccagcaca gccggcagcc cccctcccag  2160

tttgaacctc tggacatgaa gctcatgagg cgttacatag ccatgtgccg cgagaagcag  2220

cccatggtgc cagagtctct ggctgactac atcacagcag catacgtgga gatgaggcga  2280

gaggcttggg ctagtaagga tgccacctat acttctgccc ggaccctgct ggctatcctg  2340

cgcctttcca ctgctctggc acgtctgaga atggtggatg tggtggagaa agaagatgtg  2400

aatgaagcca tcaggctaat ggagatgtca aaggactctc ttctaggaga caaggggcag  2460

acagctagga ctcagagacc agcagatgtg atatttgcca ccgtccgtga actggtctca  2520

gggggccgaa gtgtccggtt ctctgaggca gagcagcgct gtgtatctcg tggcttcaca  2580

cccgcccagt tccaggcggc tctggatgaa tatgaggagc tcaatgtctg gcaggtcaat  2640

gcttcccgga cacggatcac ttttgtctga ttccagcctg cttgcaaccc tggggtcctc  2700

ttgttccctg ctggcctgcc ccttgggaag gggcagtgat gcctttgagg ggaaggagga  2760

gcccctcttt ctcccatgct gcacttactc cttttgctaa taaaagtgtt tgtagattgt  2820

c                                                                  2821

<210>14

<211>719

<212>PRT

<213>人

<400>14

Met Ala Leu Lys Asp Tyr Ala Leu Glu Lys Glu Lys Val Lys Lys Phe

 1               5                  10                  15

Leu Gln Glu Phe Tyr Gln Asp Asp Glu Leu Gly Lys Lys Gln Phe Lys

            20                  25                  30

Tyr Gly Asn Gln Leu Val Arg Leu Ala His Arg Glu Gln Val Ala Leu

        35                  40                  45

Tyr Val Asp Leu Asp Asp Val Ala Glu Asp Asp Pro Glu Leu Val Asp

    50                  55                  60

Ser Ile Cys Glu Asn Ala Arg Arg Tyr Ala Lys Leu Phe Ala Asp Ala

65                  70                  75                  80

Val Gln Glu Leu Leu Pro Gln Tyr Lys Glu Arg Glu Val Val Asn Lys

                85                  90                  95

Asp Val Leu Asp Val Tyr Ile Glu His Arg Leu Met Met Glu Gln Arg

            100                 105                 110

Ser Arg Asp Pro Gly Met Val Arg Ser Pro Gln Asn Gln Tyr Pro Ala

        115                 120                 125

Glu Leu Met Arg Arg Phe Glu Leu Tyr Phe Gln Gly pro Ser Ser Asn

    130                 135                 140

Lys pro Arg Val Ile Arg Glu Val Arg Ala Asp Ser Val Gly Lys Leu

145                 150                 155                 160

Val Thr Val Arg Gly Ile Val Thr Arg Val Ser Glu Val Lys Pro Lys

                165                 170                 175

Met Val Val Ala Thr Tyr Thr Cys Asp Gln Cys Gly Ala Glu Thr Tyr

            180                 185                 190

Gln Pro Ile Gln Ser Pro Thr Phe Met Pro Leu Ile Met Cys Pro Ser

        195                 200                 205

Gln Glu Cys Gln Thr Asn Arg Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Leu Gln Thr

    210                 215                 220

Arg Gly Ser Arg Phe Ile Lys Phe Gln Glu Met Lys Met Gln Glu His

225                 230                 235                 240

Ser Asp Gln Val Pro Val Gly Asn lle Pro Arg Ser Ile Thr Val Leu

                245                 250                 255

Val Glu Gly Glu Asn Thr Arg Ile Ala Gln Pro Gly Asp His Val Ser

            260                 265                 270

Val Thr Gly Ile Phe Leu Pro Ile Leu Arg Thr Gly Phe Arg Gln Val

        275                 280                 285

Val Gln Gly Leu Leu Ser Glu Thr Tyr Leu Glu Ala His Arg Ile Val

    290                 295                 300

Lys Met Asn Lys Ser Glu Asp Asp Glu Ser Gly Ala Gly Glu Leu Thr

305                 310                 315                 320

Arg Glu Glu Leu Arg Gln Ile Ala Glu Glu Asp Phe Tyr Glu Lys Leu

                325             330                     335

Ala Ala Ser Ile Ala Pro Glu Ile Tyr Gly His Glu Asp Val Lys Lys

            340                 345                 350

Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Gly Gly Val Asp Gln Ser Pro Arg Gly

        355                 360                 365

Met Lys Ile Arg Gly Asn Ile Asn Ile Cys Leu Met Gly Asp Pro Gly

    370                 375                 380

Val Ala Lys Ser Gln Leu Leu Ser Tyr Ile Asp Arg Leu Ala Pro Arg

385                 390                 395                 400

Ser Gln Tyr Thr Thr Gly Arg Gly Ser Ser Gly Val Gly Leu Thr Ala

                405                 410                 415

Ala Val Leu Arg Asp Ser Val Ser Gly Glu Leu Thr Leu Glu Gly Gly

            420                 425                 430

Ala Leu Val Leu Ala Asp Gln Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp

        435                 440                 445

Lys Met Ala Glu Ala Asp Arg Thr Ala Ile His Glu Val Met Glu Gln

    450                 455                 460

Gln Thr Ile Ser Ile Ala Lys Ala Gly Ile Leu Thr Thr Leu Asn Ala

465                 470                 475                 480

Arg Cys Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Tyr Gly Arg Tyr Asn

                485                 490                 495

Pro Arg Arg Ser Leu Glu Gln Asn Ile Gln Leu Pro Ala Ala Leu Leu

            500                 505                 510

Ser Arg Phe Asp Leu Leu Trp Leu Ile Gln Asp Arg Pro Asp Arg Asp

        515                 520                 525

Asn Asp Leu Arg Leu Ala Gln His Ile Thr Tyr Val His Gln His Ser

    530                 535                 540

Arg Gln Pro Pro Ser Gln Phe Glu Pro Leu Asp Met Lys Leu Met Arg

545                 550                 555                 560

Arg Tyr Ile Ala Met Cys Arg Glu Lys Gln Pro Met Val Pro Glu Ser

                565                 570                 575

Leu Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Ala Tyr Val Glu Met Arg Arg Glu Ala

            580                 585                 590

Trp Ala Ser Lys Asp Ala Thr Tyr Thr Ser Ala Arg Thr Leu Leu Ala

        595                 600                 605

Ile Leu Arg Leu Ser Thr Ala Leu Ala Arg Leu Arg Met Val Asp Val

    610                 615                 620

Val Glu Lys Glu Asp Val Asn Glu Ala Ile Arg Leu Met Glu Met Ser

625                 630                 635                 640

Lys Asp Ser Leu Leu Gly Asp Lys Gly Gln Thr Ala Arg Thr Gln Arg

                645                 650                 655

Pro Ala Asp Val Ile Phe Ala Thr Val Arg Glu Leu Val Ser Gly Gly

            660                 665                 670

Arg Ser Val Arg Phe Ser Glu Ala Glu Gln Arg Cys Val Ser Arg Gly

        675                 680                 685

Phe Thr Pro Ala Gln Phe Gln Ala Ala Leu Asp Glu Tyr Glu Glu Leu

    690                 695                 700

Asn Val Trp Gln Val Asn Ala Ser Arg Thr Arg Ile Thr Phe Val

705                 710                 715

<210>15

<211>2900

<212>DNA

<213>人

<400>15

agtgtcgtgt aaacagtgtc cttccgcgcg gcggccgcgg agagagctgc ggcccggggg  60

ggcgtgcctg ggatccggag cttcgctcgg gcccgggaaa ggcggcagtg ggctgggatc  120

gcggtgtctc tgggtgtgat ggccaatggc tggactggct cccgccctgg gcggaggaat  180

cccgagctgt gaagcggctg gaatccgggc ccatgtgctt ctttgtttac taagagcgga  240

agcgatggcg ggagcggggg tggggtgcgg tggcggggtg cggtggcgga ggtcccggtg  300

aaatcagggg ctaaggggac ccaaagaagg cgggggatca taggggtgga aagaaagctg  360

agaaccttga gaccggagtg tgaggggcca acggggaagg gcgctagaat tttaaactaa  420

agtagggacc ggaattcccc tggggagatg ttggatggcc ctgtgcactg ccacgggctc  480

tttattcttc gctggttaga aacagacttg tgaaaaagag ttatgcccac tttggggaga  540

cttcgaaaag gttaagaagt tcttacaaga gttctaccag gatgatgaac tcgggaagaa  600

gcagttcaag tatgggaacc agttggttcg gctggctcat cgggaacagg tggctctgta  660

tgtggacctg gacgacgtag ccgaggatga ccccgagttg gtggactcaa tttgtgagaa  720

tgccaggcgc tacgcgaagc tctttgctga tgccgtacaa gagctgctgc ctcagtacaa  780

ggagagggaa gtggtaaata aagatgtcct ggacgtttac attgagcatc ggctaatgat  840

ggagcagcgg agtcgggacc ctgggatggt ccgaagcccc cagaaccagt accctgctga  900

actcatgcgc agattgtgag tggtctctgt cgggaaagat gtagggattg gttctccagg  960

atcttgtttg tgactgtttt ctccccttag tgagctgtat tttcaaggcc ctagcagcaa  1020

caagcctcgt gtgatccggg aagtgcgggc tgactctgtg gggaagttgg taactgtgcg  1080

tggaatcgtc actcgtgtct ctgaagtcaa acccaagatg gtggtggcca cttacacttg  1140

tgaccagtgt ggggcagaga cctaccagcc gatccagtct cccactttca tgcctctgat  1200

catgtgccca agccaggagt gccaaaccaa ccgctcagga gggcggctgt atctgcagac  1260

acggggctcc agattcatca aattccagga gatgaagatg caagaacata gtgatcaggt  1320

gcctgtggga aatatccctc gtagtatcac ggtgctggta gaaggagaga acacaaggat  1380

tgcccagcct ggagaccacg tcagcgtcac tggtattttc ttgccaatcc tgcgcactgg  1440

gttccgacag gtggtacagg gtttactctc agaaacctac ctggaagccc atcggattgt  1500

gaagatgaac aagagtgagg atgatgagtc tggggctgga gagctcacca gggaggagct  1560

gaggcaaatt gcagaggagg atttctacga aaagctggca gcttcaatcg ccccagaaat  1620

atacgggcat gaagatgtga agaaggcact gctgctcctg ctagtcgggg gtgtggacca  1680

gtctcctcga ggcatgaaaa tccggggcaa catcaacatc tgtctgatgg gggatcctgg  1740

tgtggccaag tctcagctcc tgtcatacat tgatcgactg gcgcctcgca gccagtacac  1800

aacaggccgg ggctcctcag gagtggggct tacggcagct gtgctgagag actccgtgag  1860

tggagaactg accttagagg gtggggccct ggtgctggct gaccagggtg tgtgctgcat  1920

tgatgagttc gacaagatgg ctgaggccga ccgcacagcc atccacgagg tcatggagca  1980

gcagaccatc tccattgcca aggccggcat tctcaccaca ctcaatgccc gctgctccat  2040

cctggctgcc gccaaccctg cctacgggcg ctacaaccct cgccgcagcc tggagcagaa  2100

catacagcta cctgctgcac tgctctcccg gtttgacctc ctctggctga ttcaggaccg  2160

gcccgaccga gacaatgacc tacggttggc ccagcacatc acctatgtgc accagcacag  2220

ccggcagccc ccctcccagt ttgaacctct ggacatgaag ctcatgaggc gttacatagc  2280

catgtgccgc gagaagcagc ccatggtgcc agagtctctg gctgactaca tcacagcagc  2340

atacgtggag atgaggcgag aggcttgggc tagtaaggat gccacctata cttctgcccg  2400

gaccctgctg gctatcctgc gcctttccac tgctctggca cgtctgagaa tggtggatgt  2460

ggtggagaaa gaagatgtga atgaagccat caggctaatg gagatgtcaa aggactctct  2520

tctaggagac aaggggcaga cagctaggac tcagagacca gcagatgtga tatttgccac  2580

cgtccgtgaa ctggtctcag ggggccgaag tgtccggttc tctgaggcag agcagcgctg  2640

tgtatctcgt ggcttcacac ccgcccagtt ccaggcggct ctggatgaat atgaggagct  2700

caatgtctgg caggtcastg cttcccggac acggatcact tttgtctgat tccagcctgc  2760

ttgcaaccct ggggtcctct tgttccctgc tggcctgccc cttgggaagg ggcagtgatg  2820

cctttgaggg gaaggaggag cccctctttc tcccatgctg cacttactcc ttttgctaat  2880

aaaagtgttt gtagattgtc                                              2900

<210>16

<211>543

<212>PRT

<213>人

<400>16

Met Val Val Ala Thr Tyr Thr Cys Asp Gln Cys Gly Ala Glu Thr Tyr

 1               5                  10                  15

Gln Pro Ile Gln Ser Pro Thr Phe Met Pro Leu Ile Met Cys Pro Ser

            20                  25                  30

Gln Glu Cys Gln Thr Asn Arg Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Leu Gln Thr

        35                  40                  45

Arg Gly Ser Arg Phe Ile Lys Phe Gln Glu Met Lys Met Gln Glu His

    50                  55                  60

Ser Asp Gln Val Pro Val Gly Asn Ile Pro Arg Ser Ile Thr Val Leu

65                  70                  75                  80

Val Glu Gly Glu Asn Thr Arg Ile Ala Gln Pro Gly Asp His Val Ser

                85                  90                  95

Val Thr Gly Ile Phe Leu Pro Ile Leu Arg Thr Gly Phe Arg Gln Val

            100                 105                 110

Val Gln Gly Leu Leu Ser Glu Thr Tyr Leu G1u Ala His Arg Ile Val

        115                 120                 125

Lys Met Asn Lys Ser Glu Asp Asp Glu Ser Gly Ala Gly Glu Leu Thr

    130                 135                 140

Arg Glu G1u Leu Arg Gln Ile Ala Glu Glu Asp Phe Tyr Glu Lys Leu

145                 150                 155                 160

Ala Ala Ser Ile Ala Pro Glu Ile Tyr Gly His Glu Asp Val Lys Lys

                165                 170                 175

Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Gly Gly Val Asp Gln Ser Pro Arg Gly

            180                 185                     190

Met Lys Ile Arg Gly Asn Ile Asn Ile Cys Leu Met Gly Asp Pro Gly

        195                 200                     205

Val Ala Lys Ser Gln Leu Leu Ser Tyr Ile Asp Arg Leu Ala Pro Arg

    210                 215                     220

Ser Gln Tyr Thr Thr Gly Arg Gly Ser Ser Gly Val Gly Leu Thr Ala

225                 230                     235             240

Ala Val Leu Arg Asp Ser Val Ser Gly Glu Leu Thr Leu Glu Gly Gly

                245                    250                 255

Ala Leu Val Leu Ala Asp Gln Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp

            260                     265                 270

Lys Met Ala Glu Ala Asp Arg Thr Ala Ile His Glu Val Met Glu Gln

        275                     280                 285

Gln Thr Ile Ser Ile Ala Lys Ala Gly Ile Leu Thr Thr Leu Asn Ala

    290                     295                 300

Arg Cys Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Tyr Gly Arg Tyr Asn

305                     310                 315             320

Pro Arg Arg Ser Leu Glu Gln Asn Ile Gln Leu Pro Ala Ala Leu Leu

                    325                 330                 335

Ser Arg Phe Asp Leu Leu Trp Leu Ile Gln Asp Arg Pro Asp Arg Asp

                340                 345                 350

Asn Asp Leu Arg Leu Ala Gln His Ile Thr Tyr Val His Gln His Ser

            355                 360                 365

Arg Gln Pro Pro Ser Gln Phe Glu Pro Lau Asp Met Lys Leu Met Arg

        370                 375                 380

Arg Tyr Ile Ala Met Cys Arg Glu Lys Gln Pro Met Val Pro Glu Ser

385                 390                 395                 400

Leu Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Ala Tyr Val Glu Met Arg Arg Glu Ala

                405                 410                 415

Trp Ala Ser Lys Asp Ala Thr Tyr Thr Ser Ala Arg Thr Leu Leu Ala

            420                 425                 430

Ile Leu Arg Leu Ser Thr Ala Leu Ala Arg Leu Arg Met Val Asp Val

        435                 440                 445

Val Glu Lys Glu Asp Val Asn Glu Ala Ile Arg Leu Met Glu Met Ser

    450                 455                 460

Lys Asp Ser Leu Leu Gly Asp Lys Gly Gln Thr Ala Arg Thr Gin Arg

465                 470                 475                 480

Pro Ala Asp Val Ile Phe Ala Thr Val Arg Glu Leu Val Ser Gly Gly

                485                 490                 495

Arg Ser Val Arg Phe Ser Glu Ala Glu Gln Arg Cys Val Ser Arg Gly

            500                 505                 510

Phe Thr Pro Ala Gln Phe Gln Ala Ala Leu Asp Glu Tyr Glu Glu Leu

        515                 520                 525

Asn Val Trp Gln Val Asr Ala Ser Arg Thr Arg Ile Thr Phe Val

    530                 535                 540

<210>17

<211>2140

<212>DNA

<213>人

<400>17

agctgaggtg tgagcagctg ccgaagtcag ttccttgtgg agccggagct gggcgcggat  60

tcgccgaggc accgaggcac tcagaggagg cgccatgtca gaaccggctg gggatgtccg  120

tcagaaccca tgcggcagca aggcctgccg ccgcctcttc ggcccagtgg acagcgagca  180

gctgagccgc gactgtgatg cgctaatggc gggctgcatc caggaggccc gtgagcgatg  240

gaacttcgac tttgtcaccg agacaccact ggagggtgac ttcgcctggg agcgtgtgcg  300

gggccttggc ctgcccaagc tctaccttcc cacggggccc cggcgaggcc gggatgagtt  360

gggaggaggc aggcggcctg gcacctcacc tgctctgctg caggggacag cagaggaaga  420

ccatgtggac ctgtcactgt cttgtaccct tgtgcctcgc tcaggggagc aggctgaagg  480

gtccccaggt ggacctggag actctcaggg tcgaaaacgg cggcagacca gcatgacaga  540

tttctaccac tccaaacgcc ggctgatctt ctccaagagg aagccctaat ccgcccacag  600

gaagcctgca gtcctggaag cgcgagggcc tcaaaggccc gctctacatc ttctgcctta  660

gtctcagttt gtgtgtctta attattattt gtgttttaat ttaaacacct cctcatgtac  720

ataccctggc cgccccctgc cccccagcct ctggcattag aattatttaa acaaaaacta  780

ggcggttgaa tgagaggttc ctaagagtgc tgggcatttt tattttatga aatactattt  840

aaagcctcct catcccgtgt tctccttttc ctctctcccg gaggttgggt gggccggctt  900

catgccagct acttcctcct ccccacttgt ccgctgggtg gtaccctctg gaggggtgtg  960

gctccttccc atcgctgtca caggcggtta tgaaattcac cccctttcct ggacactcag  1020

acctgaattc tttttcattt gagaagtaaa cagatggcac tttgaagggg cctcaccgag  1080

tgggggcatc atcaaaaact ttggagtccc ctcacctcct ctaaggttgg gcagggtgac  1140

cctgaagtga gcacagccta gggctgagct ggggacctgg taccctcctg gctcttgata  1200

cccccctctg tcttgtgaag gcagggggaa ggtggggtac tggagcagac caccccgcct  1260

gccctcatgg cccctctgac ctgcactggg gagcccgtct cagtgttgag ccttttccct  1320

ctttggctcc cctgtacctt ttgaggagcc ccagcttacc cttcttctcc agctgggctc  1380

tgcaattccc ctctgctgct gtccctcccc cttgtctttc ccttcagtac cctctcatgc  1440

tccaggtggc tctgaggtgc ctgtcccacc cccaccccca gctcaatgga ctggaagggg  1500

aagggacaca caagaagaag ggcaccctag ttctacctca ggcagctcaa gcagcgaccg  1560

ccccctcctc tagctgtggg ggtgagggtc ccatgtggtg gcacaggccc ccttgagtgg  1620

ggttatctct gtgttagggg tatatgatgg gggagtagat ctttctagga gggagacact  1680

ggcccctcaa atcgtccagc gaccttcctc atccacccca tccctcccca gttcattgca  1740

ctttgattag cagcggaaca aggagtcaga cattttaaga tggtggcagt agaggctatg  1800

gacagggcat gccacgtggg ctcatatggg gctgggagta gttgtctttc ctggcactaa  1860

cgttgagccc ctggaggcac tgaagtgctt agtgtacttg gagtattggg gtctgacccc  1920

aaacaccttc cagctcctgt aacatactgg cctggactgt tttctctcgg ctccccatgt  1980

gtcctggttc ccgtttctcc acctagactg taaacctctc gagggcaggg accacaccct  2040

gtactgttct gtgtctttca cagctcctcc cacaatgctg aatatacagc aggtgctcaa  2100

taaatgattc ttagtgactt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa                        2140

<210>18

<211>164

<212>PRT

<213>人

<400>18

Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro cys Gly Ser Lys

 1               5                  10                  15

Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln Leu Ser Arg

            20                  25                  30

Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala Arg Glu Arg

        35                  40                  45

Trp Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala

    50                  55                  60

Trp Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr

65                  70                  75                  80

Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly

                85                      90                  95

Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Val Asp

            100                 105                 110

Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu Gln Ala Glu

        115                 120                 125

Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys Arg Arg Gln

    130                 135                 140

Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser

145                 150                 155                 160

Lys Arg Lys Pro

<210>19

<211>2281

<212>DNA

<213>人

<400>19

agctgaggtg tgagcagctg ccgaagtcag ttccttgtgg agccggagct gggcgcggat  60

tcgccgaggc accgaggcae tcagaggagg tgagagagcg gcggcagaca acaggggacc  120

ccgggccggc ggcccagagc cgagccaagc gtgcccgcgt gtgtccctgc gtgtccgcga  180

ggatgcgtgt tcgcgggtgt gtgctgcgtt cacaggtgtt tctgcggcag gcgccatgtc  240

agaaccggct ggggatgtcc gtcagaaccc atgcggcagc aaggcctgcc gccgcctctt  300

cggcccagtg gacagcgagc agctgagccg cgactgtgat gcgctaatgg cgggctgcat  360

ccaggaggcc cgtgagcgat ggaacttcga ctttgtcacc gagacaccac tggagggtga  420

cttcgcctgg gagcgtgtgc ggggccttgg cctgcccaag ctctaccttc ccacggggcc  480

ccggcgaggc cgggatgagt tgggaggagg caggcggcct ggcacctcac ctgctctgct  540

gcaggggaca gcagaggaag accatgtgga cctgtcactg tcttgtaccc ttgtgcctcg  600

ctcaggggag caggctgaag ggtccccagg tggacctgga gactctcagg gtcgaaaacg  660

gcggcagacc agcatgacag atttctacca ctccaaacgc cggctgatct tctccaagag  720

gaagccctaa tccgcccaca ggaagcctgc agtcctggaa gcgcgagggc ctcaaaggcc  780

cgctctacat cttctgcctt agtctcagtt tgtgtgtctt aattattatt tgtgttttaa  840

tttaaacacc tcctcatgta cataccctgg ccgccccctg ccccccagcc tctggcatta  900

gaattattta aacaaaaact aggcggttga atgagaggtt cctaagagtg ctgggcattt  960

ttattttatg aaatactatt taaagcctcc tcatcccgtg ttctcctttt cctctctccc  1020

ggaggttggg tgggccggct tcatgccagc tacttcctcc tccccacttg tccgctgggt  1080

ggtaccctct ggaggggtgt ggctccttcc catcgctgtc acaggcggtt atgaaattca  1140

ccccctttcc tggacactca gacctgaatt ctttttcatt tgagaagtaa acagatggca  1200

ctttgaaggg gcctcaccga gtgggggcat catcaaaaac tttggagtcc cctcacctcc  1260

tctaaggttg ggcagggtga ccctgaagtg agcacagcct agggctgagc tggggacctg  1320

gtaccctcct ggctcttgat acccccctct gtcttgtgaa ggcaggggga aggtggggtc  1380

ctggagcaga ccaccccgcc tgccctcatg gcccctctga cctgcactgg ggagcccgtc  1440

tcagtgttga gccttttccc tctttggctc ccctgtacct tttgaggagc cccagctacc  1500

cttcttctcc agctgggctc tgcaattccc ctctgctgct gtccctcccc cttgtccttt  1560

cccttcagta ccctctcagc tccaggtggc tctgaggtgc ctgtcccacc cccaccccca  1620

gctcaatgga ctggaagggg aagggacaca caagaagaag ggcaccctag ttctacctca  1680

ggcagctcaa gcagcgaccg ccccctcctc tagctgtggg ggtgagggtc ccatgtggtg  1740

gcacaggccc ccttgagtgg ggttatctct gtgttagggg tatatgatgg gggagtagat  1800

ctttctagga gggagacact ggcccctcaa atcgtccagc gaccttcctc atccacccca  1860

tccctcccca gttcattgca ctttgattag cagcggaaca aggagtcaga cattttaaga  1920

tggtggcagt agaggctatg gacagggcat gccacgtggg ctcatatggg gctgggagta  1980

gttgtctttc ctggcactaa cgttgagccc ctggaggcac tgaagtgctt agtgtacttg  2040

gagtattggg gtctgacccc aaacaccttc cagctcctgt aacatactgg cctggactgt  2100

tttctctcgg ctccccatgt gtcctggttc ccgtttctcc acctagactg taaacctctc  2160

gagggcaggg accacaccct gtactgttct gtgtctttca cagctcctcc cacaatgctg  2220

aatatacagc aggtgctcaa taaatgattc ttagtgactt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa  2280

a                                                                  2281

<210>20

<211>164

<212>PRT

<213>人

<400>20

Met Ser Glu Pro Ala G1y Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys Gly Ser Lys

 1               5                  10                  15

Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln Leu Ser Arg

            20                  25                  30

Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala Arg Glu Arg

        35                  40                  45

Trp Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala

    50                  55                  60

Trp Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr

65                  70                  75                  80

Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly

                85                  90                  95

Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Val Asp

            100                 105                 110

Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu Gln Ala Glu

        115                 120                 125

Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys Arg Arg Gln

    130                 135                 140

Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser

145                 150                 155                 160

Lys Arg Lys Pro

<210>21

<211>1275

<212>DNA

<213>人

<400>21

cctccctacg ggcgcctccg gcagcccttc ccgcgtgcgc agggctcaga gccgttccga  60

gatcttggag gtccgggtgg gagtgggggt ggggtggggg tgggggtgaa ggtggggggc  120

gggcgcgctc agggaaggcg ggtgcgcgcc tgcggggcgg agatgggcag ggggcggtgc  180

gtgggtccca gtctgcagtt aagggggcag gagtggcgct gctcacctct ggtgccaaag  240

ggcggcgcag cggctgccga gctcggccct ggaggcggcg agaacatggt gcgcaggttc  300

ttggtgaccc tccggattcg gcgcgcgtgc ggcccgccgc gagtgagggt tttcgtggtt  360

cacatcccgc ggctcacggg ggagtgggca gcgccagggg cgcccgccgc tgtggccctc  420

gtgctgatgc tactgaggag ccagcgtcta gggcagcagc cgcttcctag aagaccaggt  480

catgatgatg ggcagcgccc gagtggcgga gctgctgctg ctccacggcg cggagcccaa  540

ctgcgccgac cccgccactc tcacccgacc cgtgcacgac gctgcccggg agggcttcct  600

ggacacgctg gtggtgctgc accgggccgg ggcgcggctg gacgtgcgcg atgcctgggg  660

ccgtctgccc gtggacctgg ctgaggagct gggccatcgc gatgtcgcac ggtacctgcg  720

cgcggctgcg gggggcacca gaggcagtaa ccatgcccgc atagatgccg cggaaggtcc  780

ctcagacatc cccgattgaa agaaccagag aggctctgag aaacctcggg aaacttagat  840

catcagtcac cgaaggtcct acagggccac aactgccccc gccacaaccc accccgcttt  900

cgtagttttc atttagaaaa tagagctttt aaaaatgtcc tgccttttaa cgtagatata  960

tgccttcccc cactaccgta aatgtccatt tatatcattt tttatatatt cttataaaaa  1020

tgtaaaaaag aaaaacaccg cttctgcctt ttcactgtgt tggagttttc tggagtgagc  1080

actcacgccc taagcgcaca ttcatgtggg catttcttgc gagcctcgca gcctccggaa  1140

gctgtcgact tcatgacaag cattttgtga actagggaag ctcagggggg ttactggctt  1200

ctcttgagtc acactgctag caaatggcag aaccaaagct caaataaaaa taaaataatt  1260

ttcattcatt cactc                                                   1275

<210>22

<211>173

<212>PRT

<213>人

<400>22

Met Gly Arg Gly Arg Cys Val Gly Pro Ser Leu Gln Leu Arg Gly Gln

 1               5                  10                  15

Glu Trp Arg Cys Ser Pro Leu Val Pro Lys Gly Gly Ala Ala Ala Ala

            20                  25                  30

Glu Leu Gly pro Gly Gly Gly Glu Asn Met Val Arg Arg Phe Leu Val

        35                  40                  45

Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly Pro Pro Arg Val Arg Val Phe

    50                  55                  60

Val Val His Ile Pro Arg Leu Thr Gly Glu Trp Ala Ala Pro Gly Ala

65                  70                  75                  80

Pro Ala Ala Val Ala Leu Val Leu Met Leu Leu Arg Ser Gln Arg Leu

                85                  90                  95

Gly Gln Gln Pro Leu Pro Arg Arg Pro Gly His Asp Asp Gly Gln Arg

            100                 105                 110

Pro Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Pro Arg Arg Gly Ala Gln Leu Arg

        115                 120                 125

Arg Pro Arg His Ser His Pro Thr Arg Ala Arg Arg Cys Pro Gly Gly

    130                 135                 140

Leu Pro Gly His Ala Gly Gly Ala Ala Pro Gly Arg Gly Ala Ala Gly

145                 150                 155                 160

Arg Ala Arg Cys Leu Gly Pro Ser Ala Arg Gly Pro Gly

                165                 170

<210>23

<211>5698

<212>DNA

<213>人

<400>23

aggttcaagt ggagctctcc taaccgacgc gcgtctgtgg agaagcggct tggtcggggg  60

tggtctcgtg gggtcctgcc tgtttagtcg ctttcagggt tcttgagccc cttcacgacc  120

gtcaccatgg aagtgtcacc attgcagcct gtaaatgaaa atatgcaagt caacaaaata  180

aagaaaaatg aagatgctaa gaaaagactg tctgttgaaa gaatctatca aaagaaaaca  240

caattggaac atattttgct ccgcccagac acctacattg gttctgtgga attagtgacc  300

cagcaaatgt gggtttacga tgaagatgtt ggcattaact atagggaagt cacttttgtt  360

cctggtttgt acaaaatctt tgatgagatt ctagttaatg ctgcggacaa caaacaaagg  420

gacccaaaaa tgtcttgtat tagagtcaca attgatccgg aaaacaattt aattagtata  480

tggaataatg gaaaaggtat tcctgttgtt gaacacaaag ttgaaaagat gtatgtccca  540

gctctcatat ttggacagct cctaacttct agtaactatg atgatgatga aaagaaagtg  600

acaggtggtc gaaatggcta tggagccaaa ttgtgtaaca tattcagtac caaatttact  660

gtggaaacag ccagtagaga atacaagaaa atgttcaaac agacatggat ggataatatg  720

ggaagagctg gtgagatgga actcaagccc ttcaatggag aagattatac atgtatcacc  780

tttcagcctg atttgtctaa gtttaaaatg caaagcctgg acaaagatat tgttgcacta  840

atggtcagaa gagcatatga tattgctgga tccaccaaag atgtcaaagt ctttcttaat  900

ggaaataaac tgccagtaaa aggatttcgt agttatgtgg acatgtattt gaaggacaag  960

ttggatgaaa ctggtaactc cttgaaagta atacatgaac aagtaaacca caggtgggaa  1020

gtgtgtttaa ctatgagtga aaaaggcttt cagcaaatta gctttgtcaa cagcattgct  1080

acatccaagg gtggcagaca tgttgattat gtagctgatc agattgtgac taaacttgtt  1140

gatgttgtga agaagaagaa caagggtggt gttgcagtaa aagcacatca ggtgaaaaat  1200

cacatgtgga tttttgtaaa tgccttaatt gaaaacccaa cctttgactc tcagacaaaa  1260

gaaaacatga ctttacaacc caagagcttt ggatcaacat gccaattgag tgaaaaattt  1320

atcaaagctg ccattggctg tggtattgta gaaagcatac taaactgggt gaagtttaag  1380

gcccaagtcc agttaaacaa gaagtgttca gctgtaaaac ataatagaat caagggaatt  1440

cccaaactcg atgatgccaa tgatgcaggg ggccgaaact ccactgagtg tacgcttatc  1500

ctgactgagg gagattcagc caaaactttg gctgtttcag gccttggtgt ggttgggaga  1560

gacaaatatg gggttttccc tcttagagga aaaatactca atgttcgaga agcttctcat  1620

aagcagatca tggaaaatgc tgagattaac aatatcatca agattgtggg tcttcagtac  1680

aagaaaaact atgaagatga agattcattg aagacgcttc gttatgggaa gataatgatt  1740

atgacagatc aggaccaaga tggttcccac atcaaaggct tgctgattaa ttttatccat  1800

cacaactggc cctctcttct gcgacatcgt tttctggagg aatttatcac tcccattgta  1860

aaggtatcta aaaacaagca agaaatggca ttttacagcc ttcctgaatt tgaagagtgg  1920

aagagttcta ctccaaatca taaaaaatgg aaagtcaaat attacaaagg tttgggcacc  1980

agcacatcaa aggaagctaa agaatacttt gcagatatga aaagacatcg tatccagttc  2040

aaatattctg gtcctgaaga tgatgctgct atcagcctgg cctttagcaa aaaacagata  2100

gatgatcgaa aggaatggtt aactaatttc atggaggata gaagacaacg aaagttactt  2160

gggcttcctg aggattactt gtatggacaa actaccacat atctgacata taatgacttc  2220

atcaacaagg aacttatctt gttctcaaat tctgataacg agagatctat cccttctatg  2280

gtggatggtt tgaaaccagg tcagagaaag gttttgttta cttgcttcaa acggaatgac  2340

aagcgagaag taaaggttgc ccaattagct ggatcagtgg ctgaaatgtc ttcttatcat  2400

catggtgaga tgtcactaat gatgaccatt atcaatttgg ctcagaattt tgtgggtagc  2460

aataatctaa acctcttgca gcccattggt cagtttggta ccaggctaca tggtggcaag  2520

gattctgcta gtccacgata catctttaca atgctcagct ctttggctcg attgttattt  2580

ccaccaaaag atgatcacac gttgaagttt ttatatgatg acaaccagcg tgttgagcct  2640

gaatggtaca ttcctattat tcccatggtg ctgataaatg gtgctgaagg aatcggtact  2700

gggtggtcct gcaaaatccc caactttgat gtgcgtgaaa ttgtaaataa catcaggcgt  2760

ttgatggatg gagaagaacc tttgccaatg cttccaagtt acaagaactt caagggtact  2820

attgaagaac tggctccaaa tcaatatgtg attagtggtg aagtagctat tcttaattct  2880

acaaccattg aaatctcaga gcttcccgtc agaacatgga cccagacata caaagaacaa  2940

gttctagaac ccatgttgaa tggcaccgag aagacacctc ctctcataac agactatagg  3000

gaataccata cagataccac tgtgaaattt gttgtgaaga tgactgaaga aaaactggca  3060

gaggcagaga gagttggact acacaaagtc ttcaaactcc aaactagtct cacatgcaac  3120

tctatggtgc tttttgacca cgtaggctgt ttaaagaaat atgacacggt gttggatatt  3180

ctaagagact tttttgaact cagacttaaa tattatggat taagaaaaga atggctccta  3240

ggaatgcttg gtgctgaatc tgctaaactg aataatcagg ctcgctttat cttagagaaa  3300

atagatggca aaataatcat tgaaaataag cctaagaaag aattaattaa agttctgatt  3360

cagaggggat atgattcgga tcctgtgaag gcctggaaag aagcccagca aaaggttcca  3420

gatgaagaag aaaatgaaga gagtgacaac gaaaaggaaa ctgaaaagag tgactccgta  3480

acagattctg gaccaacctt caactatctt cttgatatgc ccctttggta tttaaccaag  3540

gaaaagaaag atgaactctg caggctaaga aatgaaaaag aacaagagct ggacacatta  3600

aaaagaaaga gtccatcaga tttgtggaaa gaagacttgg ctacatttat tgaagaattg  3660

gaggctgttg aagccaagga aaaacaagat gaacaagtcg gacttcctgg gaaagggggg  3720

aaggccaagg ggaaaaaaac acaaatggct gaagttttgc cttctccgcg tggtcaaaga  3780

gtcattccac gaataaccat agaaatgaaa gcagaggcag aaaagaaaaa taaaaagaaa  3840

attaagaatg aaaatactga aggaagccct caagaagatg gtgtggaact agaaggccta  3900

aaacaaagat tagaaaagaa acagaaaaga gaaccaggta caaagacaaa gaaacaaact  3960

acattggcat ttaagccaat caaaaaagga aagaagagaa atccctggtc tgattcagaa  4020

tcagatagga gcagtgacga aagtaatttt gatgtccctc cacgagaaac agagccacgg  4080

agagcagcaa caaaaacaaa attcacaatg gatttggatt cagatgaaga tttctcagat  4140

tttgatgaaa aaactgatga tgaagatttt gtcccatcag atgctagtcc acctaagacc  4200

aaaacttccc caaaacttag taacaaagaa ctgaaaccac agaaaagtgt cgtgtcagac  4260

cttgaagctg atgatgttaa gggcagtgta ccactgtctt caagccctcc tgctacacat  4320

ttcccagatg aaactgaaat tacaaaccca gttcctaaaa agaatgtgac agtgaagaag  4380

acagcagcaa aaagtcagtc ttccacctcc actaccggtg ccaaaaaaag ggctgcccca  4440

aaaggaacta aaagggatcc agctttgaat tctggtgtct ctcaaaagcc tgatcctgcc  4500

aaaaccaaga atcgccgcaa aaggaagcca tccacttctg atgattctga ctctaatttt  4560

gagaaaattg tttcgaaagc agtcacaagc aagaaatcca agggggagag tgatgacttc  4620

catatggact ttgactcagc tgtggctcct cgggcaaaat ctgtacgggc aaagaaacct  4680

ataaagtacc tggaagagtc agatgaagat gatctgtttt aaaatgtgag gcgattattt  4740

taagtaatta tcttaccaag cccaagactg gttttaaagt tacctgaagc tcttaacttc  4800

ctcccctctg aatttagttt ggggaaggtg tttttagtac aagacatcaa agtgaagtaa  4860

agcccaagtg ttctttagct ttttataata ctgtctaaat agtgaccatc tcatgggcat  4920

tgttttcttc tctgctttgt ctgtgttttg agtctgcttt cttttgtctt taaaacctga  4980

tttttaagtt cttctgaact gtagaaatag ctatctgatc acttcagcgt aaagcagtgt  5040

gtttattaac catccactaa gctaaaacta gagcagtttg atttaaaagt gtcactcttc  5100

ctccttttct actttcagta gatatgagat agagcataat tatctgtttt atcttagttt  5160

tatacataat ttaccatcag atagaacttt atggttctag tacagatact ctactacact  5220

cagcctctta tgtgccaagt ttttctttaa gcaatgagaa attgctcatg ttcttcatct  5280

tctcaaatca tcagaggcca aagaaaaaca ctttggctgt gtctataact tgacacagtc  5340

aatagaatga agaaaattag agtagttatg tgattatttc agctcttgac ctgtcccctc  5400

tggctgcctc tgagtctgaa tctcccaaag agagaaacca atttctaaga ggactggatt  5460

gcagaagact cggggacaac atttgatcca agatcttaaa tgttatattg ataaccatgc  5520

tcagcaatga gctattagat tcattttggg aaatctccat aatttcaatt tgtaaacttt  5580

gttaagacct gtctacattg ttatatgtgt gtgacttgag taatgttatc aacgtttttg  5640

taaatattta ctatgttttt ctattagcta aattccaaca attttgtact ttaataaa    5698

<210>24

<211>1531

<212>PRT

<213>人

<400>24

Met G1u Val Ser Pro Leu G1n Pro Val Asn Glu Asn Met G1n Val Asn

 1               5                  10                  15

Lys Ile Lys Lys Asn Glu Asp Ala Lys Lys Arg Leu Ser Val Glu Arg

            20                  25                  30

Ile Tyr Gln Lys Lys Thr Gln Leu Glu His Ile Leu Leu Arg Pro Asp

        35                  40                  45

Thr Tyr Ile Gly Ser Val Glu Leu Val Thr Gln Gln Met Trp Val Tyr

    50                  55                  60

Asp Glu Asp Val Gly Ile Asn Tyr Arg Glu Val Thr Phe Val Pro Gly

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Lys Ile Phe Asp Glu Ile Leu Val Asn Ala Ala Asp Asn Lys

                85                  90                  95

Gln Arg Asp Pro Lys Met Ser Cys Ile Arg Val Thr Ile Asp Pro Glu

            100                 105                 110

Asn Asn Leu Ile Ser Ile Trp Asn Asn Gly Lys Gly Ile Pro Val Val

        115                 120                 125

Glu His Lvs Val Glu Lys Met Tyr Val Pro Ala Leu Ile Phe Gly Gln

    130                 135                 140

Leu Leu Thr Ser Ser Asn Tyr Asp Asp Asp Glu Lys Lys Val Thr Gly

145                 150                 155                 160

Gly Arg Asn Gly Tyr Gly Ala Lys Leu Cys Asn Ile Phe Ser Thr Lys

                165                 170                 175

Phe Thr Val Glu Thr Ala Ser Arg Glu Tyr Lys Lys Met Phe Lys Gln

            180                 185                 190

Thr Trp Met Asp Asn Met Gly Arg Ala Gly Glu Met Glu Leu Lys Pro

        195                 200                 205

Phe Asn Gly Glu Asp Tyr Thr Cys Ile Thr Phe Gln Pro Asp Leu Ser

    210                 215                 220

Lys Phe Lys Met Gln Ser Leu Asp Lys Asp Ile Val Ala Leu Met Val

225                 230                 235                 240

Arg Arg Ala Tyr Asp Ile Ala Gly Ser Thr Lys Asp Val Lys Val Phe

                245                 250                 255

Leu Asn Gly Asn Lys Leu Pro Val Lys Gly Phe Arg Ser Tyr Val Asp

            260                 265                 270

Met Tyr Leu Lys Asp Lys Lau Asp Glu Thr Gly Asn Ser Leu Lys Val

        275                 280                 285

Ile His Glu Gln Val Asn His Arg Trp Glu Val cys Leu Thr Met Ser

    290                 295                 300

Glu Lys Gly Phe Gln Gln Ile Ser Phe Val Asn Ser Ile Ala Thr Ser

305                 310                 315                 320

Lys Gly Gly Arg His Val Asp Tyr Val Ala Asp Gln lle Val Thr Lys

                325                 330                 335

Leu Val Asp Val Val Lys Lys Lys Asn Lys Gly Gly Val Ala Val Lys

            340                 345                 350

Ala His Gln Val Lys Asn His Met Trp Ile Phe Val Asn Ala Leu Ile

        355                 360                 365

Glu Asn Pro Thr Phe Asp Ser Gln Thr Lys Glu Asn Met Thr Leu Gln

    370                 375                 380

Pro Lys Ser Phe Gly Ser Thr cys Gln Leu Ser Glu Lys Phe Ile Lys

385                 390                 395                 400

Ala Ala Ile Gly cys Gly Ile Val Glu Ser Ile Leu Asn Trp Val Lys

                405                 410                 415

Phe Lys Ala Gln Val Gln Leu Asn Lys Lys Cys Ser Ala Val Lys His

            420                425                 430

Asn Arg Ile Lys Gly Ile pro Lys Leu Asp Asp Ala Asn Asp Ala Gly

        435                 440                 445

Gly Arg Asn Ser Thr Glu cys Thr Leu Ile Leu Thr Glu Gly Asp Ser

    450                 455                 460

Ala Lys Thr Leu Ala Val Ser Gly Leu Gly Val Val Gly Arg Asp Lys

465                 470                 475                 480

Tyr Gly Val Phe Pro Leu Arg Gly Lys Ile Leu Asn Val Arg Glu Ala

                485                 490                 495

Ser His Lys Gln Ile Met Glu Asn Ala Glu Ile Asn Asn Ile Ile Lys

            500                 505                 510

Ile Val Gly Leu Gln Tyr Lys Lys Asn Tyr Glu Asp Glu Asp Ser Leu

        515                 520                 525

Lys Thr Leu Arg Tyr Gly Lys Ile Met Ile Met Thr Asp Gln Asp Gln

    530                 535                 540

Asp Gly Ser His Ile Lys Gly Leu Leu Ile Asn Phe Ile His His Asn

545                 550                 555                 560

Trp Pro Ser Leu Leu Arg His Arg Phe Leu Glu Glu Phe Ile Thr Pro

                565                 570                 575

Ile Val Lys Val Ser Lys Asn Lys Gln Glu Met Ala Phe Tyr Ser Leu

            580                 585                 590

Pro Glu Phe Glu Glu Trp Lys Ser Ser Thr Pro Asn His Lys Lys Trp

        595                 600                 605

Lys Val Lys Tyr Tyr Lys Gly Leu Gly Thr Ser Thr Ser Lys Glu Ala

    610                 615                 620

Lys Glu Tyr Phe Ala Asp Met Lys Arg His Arg Ile Gln Phe Lys Tyr

625                 630                 635                 640

Ser Gly Pro Glu Asp Asp Ala Ala Ile Ser Leu Ala Phe Ser Lys Lys

                645                 650                 655

Gln Ile Asp Asp Arg Lys Glu Trp Leu Thr Asn Phe Met Glu Asp Arg

            660                 665                 670

Arg Gln Arg Lys Leu Leu Gly Leu Pro Glu Asp Tyr Leu Tyr Gly Gln

        675                 680                 685

Thr Thr Thr Tyr Leu Thr Tyr Asn Asp Phe Ile Asn Lys Glu Leu Ile

    690                 695                 700

Leu Phe Ser Asn Ser Asp Asn Glu Arg Ser Ile Pro Ser Met Val Asp

705                 710                 715                 720

Gly Leu Lys Pro Gly Gln Arg Lys Val Leu Phe Thr Cys Phe Lys Arg

                725                 730                 735

Asn Asp Lys Arg Glu Val Lys Val Ala Gln Leu Ala Gly Ser Val Ala

            740                 745                 750

Glu Met Ser Ser Tyr His His Gly Glu Met Ser Leu Met Met Thr Ile

        755                 760                 765

Ile Asn Leu Ala Gln Asn Phe Val Gly Ser Asn Asn Leu Asn Leu Leu

    770                 775                 780

Gln Pro Ile Gly Gln Phe Gly Thr Arg Leu His Gly Gly Lys Asp Ser

785                 790                 795                 800

Ala Ser Pro Arg Tyr Ile Phe Thr Met Leu Ser Ser Leu Ala Arg Leu

                805                 810                 815

Leu Phe Pro Pro Lys Asp Asp His Thr Leu Lys Phe Leu Tyr Asp Asp

            820                 825                 830

Asn Gln Arg Val Glu Pro Glu Trp Tyr Ile Pro Ile Ile Pro Met Val

        835                 840                 845

Leu Ile Asn Gly Ala Glu Gly Ile Gly Thr Gly Trp Ser Cys Lys Ile

    850                 855                 860

Pro Asn Phe Asp Val Arg Glu Ile Val Asn Asn Ile Arg Arg Leu Met

865                 870                 875                 880

Asp Gly Glu Glu Pro Leu Pro Met Leu Pro Ser Tyr Lys Asn Phe Lys

                885                 890                 895

Gly Thr Ile Glu Glu Leu Ala Pro Asn Gln Tyr Val Ile Ser Gly Glu

            900                 905                 910

Val Ala Ile Leu Asn Ser Thr Thr Ile Glu Ile Ser Glu Leu Pro Val

        915             920                     925

Arg Thr Trp Thr Gln Thr Tyr Lys Glu Gln Val Leu Glu Pro Met Leu

    930                 935                 940

Asn Gly Thr Glu Lys Thr Pro Pro Leu Ile Thr Asp Tyr Arg Glu Tyr

945                 950                 955                 960

His Thr Asp Thr Thr Val Lys Phe Val Val Lys Met Thr Glu Glu Lys

                965                 970                 975

Leu Ala Glu Ala Glu Arg Val Gly Leu His Lys Val Phe Lys Leu Gln

            980                 985                 990

Thr Ser Leu Thr cys Asn Ser Met Val Leu Phe Asp His Val Gly Cys

        995                 1000                1005

Leu Lys Lys Tyr Asp Thr Val Leu Asp Ile Leu Arg Asp Phe Phe Glu

    1010                1015                1020

                                    22

Leu Arg Leu Lys Tyr Tyr Gly Leu Arg Lys Glu Trp Leu Leu Gly Met

1025                1030                1035               1040

Leu Gly Ala Glu Ser Ala Lys Leu Asn Asn Gln Ala Arg Phe Ile Leu

                1045                1050                1055

Glu Lys Ile Asp Gly Lys Ile Ile Ile Glu Asn Lys Pro Lys Lys Glu

            1060                1065                1070

Leu Ile Lys Val Leu Ile Gln Arg Gly Tyr Asp Ser Asp Pro Val Lys

        1075                1080                1085

Ala Trp Lys Glu Ala Gln Gln Lys Val Pro Asp Glu Glu Glu Asn Glu

    1090                1095                1100

Glu Ser Asp Asr Glu Lys Glu Thr Glu Lys Ser Asp Ser Val Thr Asp

1105                1110                1115               1120

Ser Gly Pro Thr Phe Asn Tyr Leu Leu Asp Met pro Leu Trp Tyr Leu

                1125                1130                1135

Thr Lys Glu Lys Lys Asp Glu Leu Cys Arg Leu Arg Asn Glu Lys Glu

            1140                1145                1150

Gln Glu Leu Asp Thr Leu Lys Arg Lys Ser Pro Ser Asp Leu Trp Lys

        1155                1160                1165

Glu Asp Leu Ala Thr Phe Ile Glu Glu Leu Glu Ala Val Glu Ala Lys

    1170                1175                1180

Glu Lys Gln Asp Glu Gln Val Gly Leu Pro Gly Lys Gly Gly Lys Ala

1185                1190                1195               1200

Lys Gly Lys Lys Thr Gln Met Ala Glu Val Leu Pro Ser Pro Arg Gly

                1205                1210                1215

Gln Arg Val Ile Pro Arg Ile Thr Ile Glu Met Lys Ala Glu Ala Glu

            1220                1225                1230

Lys Lys Asn Lys Lys Lys Ile Lys Asr Glu Asn Thr Glu Gly Ser Pro

        1235                1240                1245

Gln Glu Asp Gly Val Glu Leu Glu Gly Leu Lys Gln Arg Leu Glu Lys

    1250                1255                1260

Lys Gln Lys Arg Glu Pro Gly Thr Lys Thr Lys Lys Gln Thr Thr Leu

1265                1270                1275               1280

Ala Phe Lys Pro Ile Lys Lys Gly Lys Lys Arg Asn Pro Trp Ser Asp

                1285                1290                1295

Ser Glu Ser Asp Arg Ser Ser Asp Glu ser Asn Phe Asp Val Pro Pro

            1300                1305                1310

Arg Glu Thr Glu Pro Arg Arg Ala Ala Thr Lys Thr Lys Phe Thr Met

        1315                1320                1325

Asp Leu Asp Ser Asp Glu Asp Phe Ser Asp Phe Asp Glu Lys Thr Asp

    1330                1335                1340

Asp Glu Asp Phe Val Pro Ser Asp Ala Ser Pro Pro Lys Thr Lys Thr

1345                1350                1355               1360

Ser Pro Lys Leu Ser Asn Lys Glu Leu Lys Pro Gln Lys Ser Val Val

                1365                1370                1375

Ser Asp Leu Glu Ala Asp Asp Val Lys Gly Ser Val Pro Leu Ser Ser

            1380                1385                1390

Ser Pro Pro Ala Thr His Phe Pro Asp Glu Thr Glu Ile Thr Asn Pro

        1395                1400                1405

Val Pro Lys Lys Asn Val Thr Val Lys Lys Thr Ala Ala Lys Ser Gln

    1410                1415                1420

Ser Ser Thr Ser Thr Thr Gly Ala Lys Lys Arg Ala Ala Pro Lys Gly

1425                1430                1435               1440

Thr Lys Arg Asp Pro Ala Leu Asn Ser Gly Val Ser Gln Lys Pro Asp

                1445                1450                1455

Pro Ala Lys Thr Lys Asn Arg Arg Lys Arg Lys Pro Ser Thr Ser Asp

            1460                1465                1470

Asp Ser Asp Ser Asn Phe Glu Lys Ile Val Ser Lys Ala Val Thr Ser

        1475                1480                1485

Lys Lys Ser Lys Gly Glu Ser Asp Asp Phe His Met Asp Phe Asp Ser

    1490                1495                1500

Ala Val Ala Pro Arg Ala Lys Ser Val Arg Ala Lys Lys Pro Ile Lys

1505                1510                1515               1520

Tyr Leu Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp Leu Phe

                1525                1530

<210>25

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

ctctgagccc gccaagc                                                 17

<210>26

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

tgtaagaact tcttaacctt ttccttctct a                                 31

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

ccctcggcag cgatggcact                                              20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

gaggaatccc gagctgtgaa                                              20

<210>29

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

cccgctcccg ccat                                                    14

<210>30

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

cccatgtgct tctttgttta ctaagagcgg aa                                32

<210>31

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

gtccgaagcc cccagaa                                                 17

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

cccgacagag accactcaca                                              20

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

cagtaccctg ctgaactcat gcgca                                        25

<210>34

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

cgctacgcga agctctttg                                               19

<210>35

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

cctttgtttg ccattgttct ctaa                                         24

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

tgccgtacaa gagctgctgc ctca                                         24

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

caaacgccgg ctgatctt                                                18

<210>38

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

ccaggactgc aggcttcct                                               19

<210>39

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

caagaggaag ccctaatccg ccca                                         24

<210>40

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

gagcggcggc agacaa                                                  16

<210>41

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

ccgcgaacac gcatcct                                                 17

<210>42

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

cccagagccg agccaagcgt g                                            21

<210>43

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

tggagactct cagggtcgaa a                                            21

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>44

tccagtctgg ccaacagagt t                                            21

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>45

cggcggcaga ccagcatgac                                              20

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

gccctcgtgc tgatgctact                                              20

<210>47

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

tcatcatgac ctggtcttct agga                                         24

<210>48

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>48

agcgtctagg gcagcagccg c                                            21

<210>49

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>49

tgcccaacgc accga                                                   15

<210>50

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>50

gggcgctgcc catca                                                   15

<210>51

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>51

tcggaggccg atccaggtca tg                                           22

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>52

aagcttcctt tccgtcatgc                                              20

<210>53

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>53

catgacctgc cagagagaac ag                                           22

<210>54

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>54

cccccaccct ggctctgacc a                                            21

<210>55

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>55

ggaaaccaag gaagaggaat gag                                          23

<210>56

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>56

tgttcccccc ttcagatctt ct                                           22

<210>57

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>57

acgcgcgtac agatctctcg aatgct                                       26

<210>58

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>58

cacgccctaa gcgcacat                                                18

<210>59

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>59

cctagttcac aaaatgcttg tcatg                                        25

<210>60

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>60

tttcttgcga gcctcgcagc ctc                                          23

<210>61

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>61

aaagaagatg atgaccgggt ttac                                         24

<210>62

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>62

gagcctctgg atggtgcaa                                               19

<210>63

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>63

caaactcaac gtgcaagcct cgga                                         24

<210>64

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>64

tccgccgcgg  acaa                                                   14

<210>65

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>65

catggtgtcc cgctcctt                                                18

<210>66

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>66

accctggcct  caggccggag                                             20

<210>67

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>67

ggaattgttg gccacctgta tt                                           22

<210>68

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>68

ctggagaaat cacttgttcc tatttct                                      27

<210>69

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>69

cagtccttgc attatcattg aaacacctca ca                                32

<210>70

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>70

tcaactcatt ggaattacct cattattc                                     28

<210>71

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>71

accatcagtg acgtaagcaa actc                                         24

<210>72

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>72

ccaaacttga ggaaatctat gctcctaaac tcca                              34

<210>73

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>73

ttttgaagtt ctgcattctg acttg                                        25

<210>74

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>74

accatcagtg acgtaagcaa gataa                                        25

<210>75

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>75

aaccacagat gaggtccata cttctagact ggct                              34

<210>76

<211>156

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>VARIANT

<222>(1)…(156)

<223>p16/p14ARF同工型1的部分氨基酸序列

<400>76

Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu

 1               5                  10                  15

Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu

            20                  25                  30

Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro

        35                  40                  45

Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu

    50                  55                  60

Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg

65                  70                  75                  80

Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val

                85                  90                  95

Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg

            100                 105                 110

Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg

        115                 120                 125

Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg

    130                 135                 140

Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp

145                 150                 155

<210>77

<21I>105

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>VARIANT

<222>(1)…(105)

<223>p16/p14ARF同工型2的部分氨基酸序列

<400>77

Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly

 1               5                  10                  15

Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His

            20                  25                  30

Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg

        35                  40                  45

Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val

    50                  55                  60

Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg

65                  70                  75                  80

Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg Ile Asp Ala

                85                  90                  95

Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp

            100                 105

<210>78

<211>116

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>VARIANT

<222>(1)…(116)

<223>p16/p14ARF同工型3的部分氨基酸序列

<400>78

Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu

 1               5                  10                  15

Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu

            20                  25                  30

Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro

        35                  40                  45

Ile Gln Val Gly Arg Arg Ser Ala Ala Gly Ala Gly Asp Gly Gly Arg

    50                  55                  60

Leu Trp Arg Thr Lys Phe Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Ser Ala Ser

65                  70                  75                  80

Ile Leu Arg Lys Lys Gly Arg Leu Pro Gly Glu Phe Ser Glu Gly Val

                85                  90                  95

Cys Asn His Arg Pro Pro Pro Gly Asp Ala Leu Gly Ala Trp Glu Thr

            100                 105                 110

Lys Glu Glu Glu

        115

<210>79

<211>173

<212>PRT

<213>人

<400>79

Met Gly Arg Gly Arg Cys Val Gly Pro Ser Leu Gln Leu Arg Gly Gln

 1               5                  10                  15

Glu Trp Arg Cys Ser Pro Leu Val Pro Lys Gly Gly Ala Ala Ala Ala

            20                  25                  30

Glu Leu Gly Pro Gly Gly Gly Glu Asn Met Val Arg Arg Phe Leu Val

        35                  40                  45

Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly Pro Pro Arg Val Arg Val Phe

    50                  55                  60

Val Val His Ile Pro Arg Leu Thr Gly Glu Trp Ala Ala Pro Gly Ala

65                  70                  75                  80

Pro Ala Ala Val Ala Leu Val Leu Met Leu Leu Arg Ser Gln Arg Leu

                85                  90                  95

Gly Gln Gln Pro Leu Pro Arg Arg Pro Gly His Asp Asp Gly Gln Arg

            100                 105                 110

Pro Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Pro Arg Arg Gly Ala Gln Leu Arg

        115                 120                 125

Arg Pro Arg His Ser His Pro Thr Arg Ala Arg Arg Cys Pro Gly Gly

    130                 135                 140

Leu Pro Gly His Ala Gly Gly Ala Ala Pro Gly Arg Gly Ala Ala Gly

145                 150                 155                 160

Arg Ala Arg Cys Leu Gly Pro Ser Ala Arg Gly Pro Gly

                165                 170

<210>80

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>80

ggaggtggta ctggccatgt a                                            21

<210>81

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>81

gggagatgcg gacatggat                                               19

<210>82

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>82

ccaagtacga ccgcatcacc aacca                                        25

<210>83

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>83

cattccaaga cctgcctacc a                                            21

<210>84

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>84

atgcgagtga gcaaaccaat t                                            21

<210>85

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>85

acacaagatt cgagagctca cctcatcca                                    29

<210>86

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>86

ggctacatgg tggcaagga                                               19

<210>87

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>87

tggaaataac aatcgagcca aag                                          23

<210>88

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>88

tgctagtcca cgatacatct ttacaatgct cagc                              34

<210>89

<211>3769

<212>DNA

<213>人

<400>89

aaagctgcag cgtctggaaa aaagcgactt gtggcggtcg agcgtggcgc aggcgaatcc 60

tcggcactaa gcaaatatgg acctcgcggc ggcagcggag ccgggcgccg gcagccagca 120

cctggaggtc cgcgacgagg tggccgagaa gtgccagaaa ctgttcctgg acttcttgga 180

ggagtttcag agcagcgatg gagaaattaa atacttgcaa ttagcagagg aactgattcg  240

tcctgagaga aacacattgg ttgtgagttt tgtggacctg gaacaattta accagcaact  300

ttccaccacc attcaagagg agttctatag agtttaccct tacctgtgtc gggccttgaa  360

aacattcgtc aaagaccgta aagagatccc tcttgccaag gatttttatg ttgcattcca  420

agacctgcct accagacaca agattcgaga gctcacctca tccagaattg gtttgctcac  480

tcgcatcagt gggcaggtgg tgcggactca cccagttcac ccagagcttg tgagcggaac  540

ttttctgtgc ttggactgtc agacagtgat cagggatgta gaacagcagt tcaaatacac  600

acagccaaac atctgccgaa atccagtttg tgccaacagg aggagattct tactggatac  660

aaataaatca agatttgttg attttcaaaa ggttcgtatt caagagaccc aagctgagct  720

tcctcgaggg agtatccccc gcagtttaga agtaatttta agggctgaag ctgtggaatc  780

agctcaagct ggtgacaagt gtgactttac agggacactg attgttgtgc ctgacgtctc  840

caagcttagc acaccaggag cacgtgcaga aactaattcc cgtgtcagtg gtgttgatgg  900

atatgagaca gaaggcattc gaggactccg ggcccttggt gttagggacc tttcttatag  960

gctggtcttt cttgcctgct gtgttgcgcc aaccaaccca aggtttgggg ggaaagagct  1020

cagagatgag gaacagacag ctgagagcat taagaaccaa atgactgtga aagaatggga  1080

gaaagtgttt gagatgagtc aagataaaaa tctataccac aatctttgta ccagcctgtt  1140

ccctactata catggcaatg atgaagtaaa acggggtgtc ctgctgatgc tctttggtgg  1200

cgttccaaag acaacaggag aagggacctc tcttcgaggg gacataaatg tttgcattgt  1260

tggtgaccca agtacagcta agagccaatt tctcaagcac gtggaggagt tcagccccag  1320

agctgtctac accagtggta aagcgtccag tgctgctggc ttaacagcag ctgttgtgag  1380

agatgaagaa tctcatgagt ttgtcattga ggctggagct ttgatgttgg ctgataatgg  1440

tgtgtgttgt attgatgaat ttgataagat ggacgtgcgg gatcaagttg ctattcatga  1500

agctatggaa cagcagacca tatccatcac taaagcagga gtgaaggcta ctctgaacgc  1560

ccggacgtcc attttggcag cagcaaaccc aatcagtgga cactatgaca gatcaaaatc  1620

attgaaacag aatataaatt tgtcagctcc catcatgtcc cgattcgatc tcttctttat  1680

ccttgtggat gaatgtaatg aggttacaga ttatgccatt gccaggcgca tagtagattt  1740

gcattcaaga attgaggaat caattgatcg tgtctattcc ctcgatgata tcagaagata  1800

tcttctcttt gcaagacagt ttaaacccaa gatttccaaa gagtcagagg acttcattgt  1860

ggagcaatat aaacatctcc gccagagaga tggttctgga gtgaccaagt cttcatggag  1920

gattacagtg cgacagcttg agagcatgat tcgtctctct gaagctatgg ctcggatgca  1980

ctgctgtgat gaggtccaac ctaaacatgt gaaggaagct ttccggttac tgaataaatc  2040

aatcatccgt gtggaaacac ctgatgtcaa tctagatcaa gaggaagaga tccagatgga  2100

ggtagatgag ggtgctggtg gcatcaatgg tcatgctgac agccctgctc ctgtgaacgg  2160

gatcaatggc tacaatgaag acataaatca agagtctgct cccaaagcct ccttaaggct  2220

gggcttctct gagtactgcc gaatctctaa ccttattgtg cttcacctca gaaaggtgga  2280

agaagaagag gacgagtcag cattaaagag gagcgagctt gttaactggt acttgaagga  2340

aatcgaatca gagatagact ctgaagaaga acttataaat aaaaaaagaa tcatagagaa  2400

agttattcat cgactcacac actatgatca tgttctaatt gagctcaccc aggctggatt  2460

gaaaggctcc acagagggaa gtgagagcta tgaagaagat ccctacttgg tagttaaccc  2520

taactacttg ctcgaagatt gagatagtga aagtaactga ccagagctga ggaactgtgg  2580

cacagcacct cgtggcctgg agcctggctg gagctctgct agggacagaa gtgtttctgg  2640

aagtgatgct tccaggattt gttttcagaa acaagaattg agttgatggt cctatgtgtc  2700

acattcatca caggtttcat accaacacag gcttcagcac ttcctttggt gtgtttcctg  2760

tcccagtgaa gttggaacca aataatgtgt agtctctata accaatacct ttgttttcat  2820

gtgtaagaaa aggcccatta cttttaaggt atgtgctgtc ctattgagca aataactttt  2880

tttcaattgc cagctactgc ttttattcat caaaataaaa taacttgttc tgaagttgtc  2940

tattggattt ctttctactg taccctgatt attacttcca tctacttctg aatgtgagac  3000

tttccctttt tgcttaacct ggagtgaaga ggtagaactg tggtattatg gatgaggttt  3060

ctatgagaag gagtcattag agaactcata tgaaagctag aggccttaga gatgactttc  3120

caaggttaat tccagttgtt tttttttttt tttaagttta taaaagttta ttatactttt  3180

ttaaaattac tctttagtaa tttattttac ttctgtgtcc taagggtaat ttctcaggat  3240

tgttttcaaa ttgctttttt aggggaaata ggtcatttgc tatattacaa gcaatcccca  3300

aattttatgg tcttccagga aaagttatta ccgtttatga tactaacagt tcctgagact  3360

tagctatgat cagtatgttc atgaggtgga gcagttcctg tgttgcagct tttaacaaca  3420

gatggcattc attaaatcac aaagtatgtt aaaggtcaca aaagcaaaat aactgtctga  3480

ggctaaggcc cacgtgggac agtctaatac ccatgagtac tcaacttgcc ttgatgtctg  3540

agctttccag tgcaatgtga atttgagcag ccagaaatct attagtagaa agcaagacag  3600

attaatatag gttaaaacaa tgatttaaat atgtttctcc caataattat ctctttccct  3660

ggaatcaact tgtatgaaac cttgtcaaaa tgtactccac aagtatgtac aattaagtat  3720

tttaaaaata aatggcaaac attaaaaaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaa              3769

<210>90

<211>821

<212>PRT

<213>人

<400>90

Met Asp Leu Ala Ala Ala Ala Glu Pro Gly Ala Gly Ser Gln His Leu

 1               5                  10                  15

Glu Val Arg Asp Glu Val Ala Glu Lys Cys Gln Lys Leu Phe Leu Asp

            20                  25                  30

Phe Leu Glu Glu Phe Gln Ser Ser Asp Gly Glu Ile Lys Tyr Leu Gln

        35                  40                  45

Leu Ala Glu Glu Leu Ile Arg Pro Glu Arg Asn Thr Leu Val Val Ser

    50                  55                  60

Phe Val Asp Leu Glu Gln Phe Asn Gln Gln Leu Ser Thr Thr Ile Gln

65                  70                  75                  80

Glu Glu Phe Tyr Arg Val Tyr Pro Tyr Leu Cys Arg Ala Leu Lys Thr

                85                  90                  95

Phe Val Lys Asp Arg Lys Glu Ile Pro Leu Ala Lys Asp Phe Tyr Val

            100                 105                 110

Ala Phe Gln Asp Leu Pro Thr Arg His Lys Ile Arg Glu Leu Thr Ser

        115                 120                 125

Ser Arg Ile Gly Leu Leu Thr Arg Ile Ser Gly Gln Val Val Arg Thr

    130                 135                 140

His Pro Val His Pro Glu Leu Val Ser Gly Thr Phe Leu Cys Leu Asp

145                 150                 155                 160

Cys Gln Thr Val Ile Arg Asp Val Glu Gln Gln Phe Lys Tyr Thr Gln

                165                 170                 175

Pro Asn Ile Cys Arg Asn Pro Val Cys Ala Asn Arg Arg Arg Phe Leu

            180                 185                 190

Leu Asp Thr Asn Lys Ser Arg Phe Val Asg Phe Gln Lys Val Arg Ile

        195                 200                 205

Gln Glu Thr Gln Ala Glu Leu Pro Arg Gly Ser Ile Pro Arg Ser Leu

    210                 215                 220

Glu Val Ile Leu Arg Ala Glu Ala Val Glu Ser Ala Gln Ala Gly Asp

225                 230                 235                 240

Lys Cys Asp Phe Thr Gly Thr Leu Ile Val Val Pro Asp Val Ser Lys

                245                 250                 255

Leu Ser Thr Pro Gly Ala Arg Ala Glu Thr Asn Ser Arg Val Ser Gly

            260                 265                 270

Val Asp Gly Tyr Glu Thr Glu Gly Ile Arg Gly Leu Arg Ala Leu Gly

        275                 280                 285

Val Arg Asp Leu Ser Tyr Arg Leu Val Phe Leu Ala Cys Cys Val Ala

    290                 295                 300

Pro Thr Asn Pro Arg Phe Gly Gly Lys Glu Leu Arg Asp Glu Glu Gln

305                 310                 315                 320

Thr Ala Glu Ser Ile Lys Asn Gln Met Thr Val Lys Glu Trp Glu Lys

                325                  330                335

Val Phe Glu Met Ser Gln Asp Lys Asn Leu Tyr His Asn Leu Cys Thr

            340                 345                 350

Ser Leu Phe Pro Thr Ile His Gly Asn Asg Glu Val Lys Arg Gly Val

        355                 360                 365

Leu Leu Met Leu Phe Gly Gly Val Pro Lys Thr Thr Gly Glu Gly Thr

    370                 375                 380

Ser Leu Arg Gly Asp Ile Asn Val Cys Ile Val Gly Asp Pro Ser Thr

385                 390                 395                 400

Ala Lys Ser Gln Phe Leu Lys His Val Glu Glu Phe Ser Pro Arg Ala

                405                 410                 415

Val Tyr Thr Ser Gly Lys Ala Ser Ser Ala Ala Gly Leu Thr Ala Ala

            420                 425                 430

Val Val Arg Asp Glu Glu Ser His Glu Phe Val Ile Glu Ala Gly Ala

        435                 440                 445

Leu Met Leu Ala Asp Asn Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp Lys

    450                 455                 460

Met Asp Val Arg Asp Gln Val Ala Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln

465                 470                 475                 480

Thr Ile Ser Ile Thr Lys Ala Gly Val Lys Ala Thr Leu Asn Ala Arg

                485                 490                 495

Thr Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ile Ser Gly His Tyr Asp Arg

            500                 505                 510

Ser Lys Ser Leu Lys Gln Asn Ile Asn Leu Ser Ala Pro Ile Met Ser

        515                 520                 525

Arg Phe Asp Leu Phe Phe Ile Leu Val Asp Glu Cys Asn Glu Val Thr

    530                 535                 540

Asp Tyr Ala Ile Ala Arg Arg Ile Val Asp Leu His Ser Arg Ile Glu

545                 550                 555                 560

Glu Ser Ile Asp Arg Val Tyr Ser Leu Asp Asp Ile Arg Arg Tyr Leu

                565                 570                 575

Leu Phe Ala Arg Gln Phe Lys Pro Lys Ile Ser Lys Glu Ser Glu Asp

            580                 585                 590

Phe Ile Val Glu Gln Tyr Lys His Leu Arg Gln Arg Asp Gly Ser Gly

        595                 600                 605

Val Thr Lys Ser Ser Trp Arg Ile Thr Val Arg Gln Leu Glu Ser Met

    610                 615                 620

Ile Arg Leu Ser Glu Ala Met Ala Arg Met His Cys Cys Asp Glu Val

625                 630                 635                 640

Gln Pro Lys His Val Lys Glu Ala Phe Arg Leu Leu Asn Lys Ser Ile

                645                 650                 655

Ile Arg Val Glu Thr Pro Asp Val Asn Leu Asp Gln Glu Glu Glu Ile

            660                 665                 670

Gln Met Glu Val Asp Glu Gly Ala Gly Gly Ile Asn Gly His Ala Asp

        675                 680                 685

Ser Pro Ala Pro Val Asn Gly Ile Asn Gly Tyr Asn Glu Asp Ile Asn

    690                 695                 700

Gln Glu Ser Ala Pro Lys Ala Ser Leu Arg Leu Gly Phe Ser Glu Tyr

705                 710                 715                 720

Cys Arg Ile Ser Asn Leu Ile Val Leu His Leu Arg Lys Val Glu Glu

                725                 730                 735

Glu Glu Asp Glu Ser Ala Leu Lys Arg Ser Glu Leu Val Asn Trp Tyr

            740                 745                 750

Leu Lys Glu Ile Glu Ser Glu Ile Asp Ser Glu Glu Glu Leu Ile Asn

        755                 760                 765

Lys Lys Arg Ile Ile Glu Lys Val Ile His Arg Leu Thr His Tyr Asp

    707                 775                 780

His Val Leu Ile Glu Leu Thr Gln Ala Gly Leu Lys Gly Ser Thr Glu

785                 790                 795                 800

Gly Ser Glu Ser Tyr Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Val Val Asn Pro Asn

                805                 810                 815

Tyr Leu Leu Glu Asp

            820

Claims (88)

1.用于在患者中诊断高度子宫颈疾病的方法，所述方法包括在来自患者的机体样品中检测至少一种细胞核生物标志物的过表达，其中所述细胞核生物标志物的过表达的检测特异性地鉴定指示高度子宫颈疾病的样品。

2.权利要求1的方法，其中所述生物标志物的过表达的检测将指示高度子宫颈疾病的样品和指示良性增殖、早期HPV感染或轻度发育异常的样品区分开。

3.权利要求1的方法，其中所述用于诊断高度子宫颈疾病的方法不依赖于形态学分析或不依赖于HPV感染状况的确定。

4.权利要求1的方法，其中检测过表达包括使用至少一种抗体检测生物标志物蛋白的表达。

5.权利要求4的方法，其中所述方法包括进行免疫细胞化学法。

6.权利要求1的方法，其中在核酸水平上检测细胞核生物标志物的过表达。

7.权利要求6的方法，其中检测过表达包括进行定量RT-PCR。

8.权利要求1的方法，其中所述样品包括基于液体的制备物中处于悬浮状态的子宫颈细胞。

9.权利要求1的方法，其中所述样品包括子宫颈组织样品。

10.权利要求1的方法，其中所述用于诊断高度子宫颈疾病的方法的灵敏度至少为90％。

11.权利要求10的方法，其中用于诊断高度子宫颈疾病的方法的阳性预测值至少为40％。

12.权利要求1的方法，其中所述用于诊断高度子宫颈疾病的方法的特异性至少为85％。

13.权利要求1的方法，其中针对具有异常Pap抹片检查结果的患者，进行所述方法。

14.权利要求1的方法，其中进行该方法作为一般患者群体中高度子宫颈疾病的初步筛查。

15.权利要求1的方法，其中将所述方法和形态学分析结合进行。

16.用于在患者中诊断高度子宫颈疾病的方法，所述方法包括在来自患者的机体样品中检测至少两种生物标志物的过表达，其中所述生物标志物的过表达的检测特异性地鉴定了指示高度子宫颈疾病的样品。

17.用于在患者中诊断高度子宫颈疾病的方法，所述方法包括：

a)从所述患者获得机体样品；

b)将所述样品和至少一种抗体接触，其中所述抗体特异性地结合选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的细胞核生物标志物蛋白；和

c)检测所述抗体和所述细胞核生物标志物蛋白的结合。

18.权利要求17的方法，其中所述方法包括进行免疫细胞化学法。

19.权利要求18的方法，其中人工地进行所述方法。

20.权利要求18的方法，其中以自动化的方式进行所述方法。

21.权利要求17的方法，其中所述样品包含子宫颈细胞。

22.权利要求21的方法，其中所述样品包含单层子宫颈细胞。

23.权利要求17的方法，其中用于诊断高度子宫颈疾病的所述方法的灵敏度至少为90％。

24.权利要求17的方法，其中所述用于诊断高度子宫颈疾病的方法的特异性至少为85％。

25.权利要求17的方法，其中针对具有异常Pap抹片检查结果的患者进行所述方法。

26.权利要求17的方法，其中将所述方法作为一般患者群体中高度子宫颈疾病的初步筛查来进行。

27.权利要求17的方法，其中所述细胞核生物标志物是参与HPV诱导的细胞周期破坏和S期诱导激活的基因。

28.权利要求27的方法，其中所述细胞核生物标志物选自MCM2、MCM6、MCM7、p14ARF、p21^waf1、Topo2A和细胞周期蛋白E。

29.权利要求28的方法，其中所述细胞核生物标志物是MCM蛋白。

30.权利要求17的方法，其中所述生物标志物是由E2f转录因子诱导的基因。

31.权利要求17的方法，其中所述生物标志物是由Sp-1转录因子诱导的基因。

32.权利要求17的方法，其中所述生物标志物是S期基因。

33.权利要求17的方法，其中所述生物标志物参与细胞周期调控。

34.权利要求17的方法，其中所述生物标志物参与DNA的复制和转录。

35.权利要求17的方法，其还包括样品的帕帕尼古拉乌(Pap)染色。

36.用于在患者中诊断高度子宫颈疾病的方法，所述方法包括；

a)从所述患者获得机体样品；

b)将所述样品和至少两种抗体接触，其中所述抗体中的各抗体特异性地结合选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的不同生物标志物蛋白；和

c)检测所述抗体和所述生物标志物蛋白的结合。

37.权利要求36的方法，其中所述生物标志物选自MCM2、MCM6、MCM7、p14ARF、p21^waf1、Topo2A和细胞周期蛋白E。

38.权利要求37的方法，其中所述生物标志物中的至少一种是MCM蛋白。

39.权利要求37的方法，其中将至少三种抗体和样品接触，其中第一和第二种抗体特异性地结合MCM2，其中第三种抗体特异性地结合Topo2A。

40.权利要求36的方法，其中将所述抗体作为单独的抗体试剂按顺序和所述样品接触。

41.权利要求37的方法，其中将所述抗体作为抗体混和物同时和所述样品接触。

42.权利要求36的方法，其中将抗体中的各抗体和分开的包含部分样品的显微镜载片接触。

43.用于在患者中诊断高度子宫颈疾病的方法，所述方法包括：

a)从所述患者获得机体样品；

b)将所述样品和至少一种抗体接触，其中所述抗体特异性地结合选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的生物标志物蛋白；和

c)检测所述抗体和所述生物标志物蛋白的结合；和

d)用帕帕尼古拉乌(Pap)染色法对样品进行染色。

44.权利要求43的方法，其中针对具有异常Pap抹片检查结果的患者进行所述方法。

45.权利要求43的方法，其中将所述方法作为一般患者群体中高度子宫颈疾病的初步筛查来进行。

46.用于诊断高度子宫颈疾病的方法，所述方法包括在来自患者的机体样品中检测至少一种生物标志物的过表达，其中所述生物标志物的过表达标示异常的S期诱导。

47.用于诊断高度子宫颈疾病的方法，所述方法包括在来自患者的机体样品中检测至少一种生物标志物的过表达，其中所述生物标志物的过表达指示着致瘤性HPV E6和HPV E7的活跃转录。

48.用于诊断高度子宫颈疾病的方法，所述方法包括在来自患者的机体样品中检测至少一种生物标志物的过表达，其中所述生物标志物的过表达指示着致瘤性HPV E6和HPV E7的过表达。

49.包含至少一种抗体的试剂盒，其中所述抗体特异性地结合选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的细胞核生物标志物蛋白。

50.权利要求49的试剂盒，其中所述细胞核生物标志物选自MCM2、MCM6、MCM7、p14ARF、p21^waf1、Topo2A和细胞周期蛋白E。

51.权利要求50的试剂盒，其中所述细胞核生物标志物是MCM蛋白。

52.权利要求49的试剂盒，其中所述试剂盒还包含过氧化物酶封闭剂、蛋白封闭剂、用于检测抗体与所述生物标志物蛋白的结合的化学试剂、复染剂、着色剂和使用说明书。

53.权利要求52的试剂盒，其中所述用于检测抗体结合的化学试剂包括色原和缀合至被标记的聚合物上的二抗，其中所述色原包含3′，3′-二氨基联苯胺，其中所述被标记的聚合物包含缀合至葡聚糖聚合物的辣根过氧化物酶。

54.权利要求52的试剂盒，其中所述复染剂包含苏木精。

55.权利要求52的试剂盒，其中所述着色剂包含含有pH7.4的Tris缓冲盐水、Tween-20和叠氮化钠的溶液。

56.权利要求52的试剂盒，还包含阳性对照样品。

57.权利要求56的试剂盒，其中所述阳性对照样品包含SiHa细胞。

58.权利要求49的试剂盒，还包含用于Pap染色的试剂。

59.权利要求58的试剂盒，其中用于Pap染色的试剂包含EA50和Orange G。

60.包含至少两种抗体的试剂盒，其中所述抗体中的每一种特异性地结合选择性地在高度子宫颈病症中过表达的不同生物标志物蛋白。

61.权利要求60的试剂盒，其中将所述至少两种抗体作为分开的试剂提供。

62.权利要求60的试剂盒，其中将所述至少两种抗体作为混合物来提供。

63.权利要求60的试剂盒，其中所述抗体中的至少一种特异性地和MCM蛋白结合。

64.权利要求60的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少3种抗体，其中试剂盒中的第一和第二种抗体特异性地结合MCM2，第三种抗体特异性地结合Topo2A。

65.权利要求64的试剂盒，还包含过氧化物酶封闭剂、蛋白封闭剂、用于检测抗体与所述生物标志物蛋白的结合的化学试剂、复染剂、着色剂和使用说明书。

66.包含至少一种抗体和用于Pap染色的试剂的试剂盒，其中所述抗体特异性地结合选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的生物标志物蛋白，其中所述用于Pap染色的试剂包含EA50和Orange G。

67.使用权利要求52的试剂盒诊断高度子宫颈疾病的方法。

68.使用权利要求65的试剂盒诊断高度子宫颈疾病的方法。

69.用于在患者中诊断高度子宫颈疾病的方法，其包括检测编码选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的细胞核生物标志物的至少一种核酸分子的过表达，其中所述细胞核生物标志物选自MCM2、MCM6、MCM7、p14ARF、p21^waf1、Topo2A和细胞周期蛋白E，该方法包括：

a)从患者获得机体样品；

b)从样品分离核酸物质；

c)在适合通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增的条件下，将所述核酸物质和至少一对特异于所述细胞核生物标志物的寡核苷酸引物以及热稳定性DNA聚合酶混合；

d)进行PCR；和

e)检测PCR扩增产物。

70.权利要求69的方法，其中进行PCR包括进行RT-PCR。

71.权利要求70的方法，其中所述样品包含在基于液体的制备物中的悬浮状态子宫颈细胞。

72.权利要求70的方法，其中所述样品包含子宫颈组织样品。

73.权利要求69的方法，其中所述细胞核生物标志物是MCM蛋白。

74.权利要求69的方法，其中针对具有异常Pap抹片检查结果的患者进行所述方法。

75.权利要求69的方法，其中将所述方法作为一般患者群体中的高度子宫颈疾病的初步筛查来进行。

76.用于诊断高度子宫颈疾病的方法，所述方法包括在来自患者的机体样品中检测至少二种生物标志物的过表达，其中所述生物标志物的过表达的检测特异性地鉴定指示高度子宫颈疾病的样品，其中在核酸水平上检测所述生物标志物的过表达。

77.权利要求76的方法，其中检测过表达包括进行RT-PCR。

78.一种试剂盒，其中包含至少一对特异于选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的细胞核生物标志物的寡核苷酸引物。

79.一种试剂盒，其中包含至少两对寡核苷酸引物，其中每一对寡核酸引物对于选择性地在高度子宫颈疾病中过表达的生物标志物是特异性的。

80.使用权利要求79的试剂盒诊断患者中的高度子宫颈疾病的方法。

81.包含0.05％至5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠的载片预处理缓冲液。

82.权利要求81的载片预处理缓冲液，包含0.1％至1％的月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠。

83.权利要求82的载片预处理缓冲液，包含0.5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠。

84.用于制备用于免疫细胞化学测定法的样品的方法，其包括给样品施用包含0.05至5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠的组合物。

85.权利要求84的方法，其中所述组合物包含0.1％至1％的月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠。

86.权利要求85的方法，其中所述组合物包含0.5％的月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸钠。

87.权利要求84的方法，其中给样品施用所述组合物少于1小时。

88.权利要求84的方法，还包括加热样品。

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