DE102009021734B4

DE102009021734B4 - Diagnostische Marker für die Bestimmung der Prädisposition der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und für die Bestimmung eingesetzte Oligonukleotide

Info

Publication number: DE102009021734B4
Application number: DE102009021734A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Iftner Thomas; Dr. Stubenrauch Frank; Anna Manawapat; Susanne Krüger Kjaer
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2012-02-02
Anticipated expiration: 2029-05-13
Also published as: AU2010247333A1; DE102009021734A1; WO2010130809A1; US20120129705A1; CA2761860A1; EP2430182A1; US20140058000A1

Abstract

Verwendung von diagnostischen Markern zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV) und/oder zum Nachweis einer persistierenden Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV), wobei die Marker ausgewählt sind aus zumindest einem der in Tabelle 1 gezeigten diagnostischen Marker.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von diagnostischen Markern zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus sowie zum Nachweis einer persistierenden Infektion mit dem humanen Papillomvirus.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (im Folgenden auch: HPV), bei dem diagnostische Marker nachgewiesen werden, sowie die Bereitstellung von hierfür geeigneten Oligonukleotiden.
Papillomviren sind weit verbreitete, kleine doppelsträngige DNA-Viren, die Zellen in der Basalschicht der Epidermis bzw. des zervikalen Epithels u. a. des Menschen infizieren können. Während die meisten Infektionen zeitlich begrenzt sind und einen asymptomatischen Verlauf haben, kann eine persistierende Infektion der genitalen Schleimhäute mit bestimmten Papillomviren zu einer Bildung einer zervikalen intraepithelialen Neoplascie (CIN) führen, welche sich wiederum zu einem Zervix-Karzinom entwickeln kann.
Gebärmutterhalskrebs ist weltweit der zweithäufigste Krebs bei Frauen, und die weltweite Prävalenz von humanen Papillomviren in Zervix-Karzinomen beträgt 99,7%. Die Infektion mit bestimmten genitalen HPV-Typen ist ein notwendiger Risikofaktor für die Entstehung eines Zervix-Karzinoms.
Obgleich HPV-Infektionen sehr häufig sind, verläuft eine Infektion in den meisten Fällen transient und wird spontan abgewehrt. Die Persistenz einer HPV-Infektion ist ein notwendiger Risikofaktor für die Entstehung und Progression von zervikalen präkanzerösen Läsionen, jedoch nur ca. 10% der Frauen mit einer HPV-Infektion zeigen eine Progression zu solchen Läsionen; von diesen entwickeln unbehandelt ca. 20 bis 50% der Frauen, abhängig vom persistierenden HPV-Typ, innerhalb eines Zeitraums von bis zu 12 Jahren Krebsvorstufen oder Gebärmutterhalskrebs.
Gegenwärtig sind im Stand der Technik keine diagnostischen Tests bekannt, die zwischen persistent mit HPV infizierten Frauen und Frauen, die gesund bleiben, diskriminieren.
Die bisherige Krebsfrüherkennung detektiert Krebsvorstufen mit einem zytologischen Screening, bei dem ein Abstrich vom Muttermund und dem Endozervikalkanal entnommen wird, nach Papanicolaou gefärbt und mikroskopisch beurteilt wird (Papanicolaou-Abstrich bzw. Pap-Test). Des Weiteren gibt es Tests zum Nachweis von humanen Papillomviren auf DNA- und RNA-Ebene, die jedoch nicht zwischen den häufigen transienten Infektionen und den eher selteneren persistenten Infektionen unterscheiden können und daher nur einen geringen positiven Vorhersagewert (PPV) von 15 bis 25% für Krebsvorstufen haben.
Ausgehend von einem solchen HPV-Test alleine würden bzw. werden viele Frauen zu Nachsorgeuntersuchungen geschickt, was eine erhöhte Übertherapie zur Folge hat.
Auf Proteinebene ist der genetische Marker p16 beschrieben, der einen Surrogatmarker für die HPV-Infektion darstellt, der in Studien jedoch eine zu geringe Spezifität und ebenso einen nur geringen PPV für Krebsvorstufen zeigt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Test bereitzustellen, anhand dessen die Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus vorhergesagt werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verwendung von diagnostischen Markern gelöst, die ausgewählt sind aus zumindest einem der in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker. Tabelle 1: Diagnostische Marker

Gen Symbol	Gen Name
ABCA1	ATP-bindende Kassette, Unterfamilie A (ABC1), Mitglied 1
ACSL1	Acyl-CoA Synthetase langkettiges Familienmitglied 1
ACSL5	Acyl-CoA Synthetase langkettiges Familienmitglied 5
ADORA2A	Adenosin A2a Rezeptor
AGFG2	ArfGAP mit FG Repeats (Wiederholungen) 2
AIG1	Androgen-induziert 1
AIP	Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor-wechselwirkendes Protein
ALDOB	Aldolase B, Fructose-bisphosphat, mRNA (cDNA Klon MGC:32618 IMAGE:4593670)
ANKRD13D	Ankyrin Repeat (Wiederholungs) Domäne 13 Familie, Mitglied D
APTX	Aprataxin
AQP3	Aquaporin 3 (Gill Blutgruppe)
ARHGAP15	Rho GTPase-aktivierendes Protein 15
ARHGAP26	Rho GTPase-aktivierendes Protein 26
ARMC8	Armadillo repeat (Wiederholung) enthaltendes 8
ARPC5L	Actin-verwandter Protein 2/3 Komplex, Untereinheit 5-ähnlich
ASAP1	ArfGAP mit SH3 Domäne, Ankyrin Repeat (Wiederholung) und PH Domäne 1
ATF7	Aktivierender Transkriptionsfaktor 7
ATP2B1	ATPase, Ca++ transportierend, Plasmamembran 1
ATP2B1	ATPase, Ca++ transportierend, Plasmamembran 1
ATP6V1C1	ATPase, H+ transportierend, lysosomal 42 kDa, V1 Untereinheit C1
ATP9A	ATPase, Klasse II, Typ 9A
BCL6	B-cell CLL/Lymphom 6
BEST1	Bestrophin 1
BIC	BIC Transkript
BID	BH3 wechselwirkende Domäne Tod Agonist (BH3 interacting domain death agonist)
BRE	Gehirn und Fortpflanzungsorgan-exprimiert (TNFRSF1A Modulator)
C12orf35	Chromosom 12 ”open reading frame” (offenes Leseraster) 35
C17orf91	Chromosom 17 ”open reading frame” (offenes Leseraster) 91
C19orf66	Chromosom 19 ”open reading frame” (offenes Leseraster) 66
C22orf37	Chromosom 22 ”open reading frame” (offenes Leseraster) 37
C9orf72	Chromosom 9 ”open reading frame” (offenes Leseraster) 72
CAMKK2	Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase-Kinase 2, beta
CAND1	Cullin-assoziiert und Neddylierungs-dissoziiert 1
CARD16	Caspase Rekrutierungs-Domänen Familie, Mitglied 16
CARD8	Caspase Rekrutierungs-Domänen Familie, Mitglied 8
CCL18	Chemokin (C-C Motiv) Ligand 18 (Lungen- und Aktivierungs-reguliert)
CCRL2 /// LOC72	Chemokin (C-C Motiv) Rezeptor-ähnlich 2 /// ähnlich zu Chemokin (C-C Motiv) Rezeptor-ähnlich
CD2AP	CD2-assoziiertes Protein
CD44	CD44 Molekül (Indische Blutgruppe)
CD83	CD83 Molekül
CDC42EP3	CDC42 Effektorprotein (Rho GTPase bindend) 3
CHD1	Chromodomänen-Helikase DNA bindendes Protein 1
CLCA2	Chlorid-Kanal-Regulator 2
CPSF2	Spaltungs- und Polyadenylierungs- spezifischer Faktor 2,100 kDa
CREM	cAMP reagierender Element-Modulator
CSGALNACT2	Chondroitinsulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2
CTNNA1	Catenin (Cadherin-assoziiertes Protein), alpha 1, 102 kDa
CTSD	Cathepsin D
CXorf21	Chromosom X ”open reading frame” (offenes Leseraster) 21
CXXC5	CXXC Finger 5
CYLC1	Cylicin, Grundprotein des Spermienkopf-Zytoskelett 1
DSC3	Desmocollin 3
DSE	Dermatansulfate-Epimerase
DSG3	Desmoglein 3 (Pemphigus vulgaris Antigen)
DYNC1H1	Dynein, zytoplasmatisch 1, schwere Kette 1
EHF	Ets homologer Faktor, mRNA (cDNA Klon MGC:47678 IMAGE:6055934)
ELF1	E74-ähnlicher Faktor 1 (ets Domänen-Transkriptionsfaktor)
ELL2	Elongationsfaktor, RNA Polymerase II, 2
EMR1	egf-ähnlich Modul-enthaltend, Mucin-ähnlich, Hormon-Rezeptor-ähnlich 1
ERMP1	Endoplasmatisches Retikulum Metallopeptidase 1
FBX045	F-box Protein 45
FLJ44342	hypothetisch LOC645460
FLNA	Flamin A, alpha (Actin bindendes Protein 280)
FNDC3B	Fibronectin Typ III Domäne-enthaltend 3B
FTL	Ferritin, leichtes Polypeptide
GBP1	Guanylat bindendes Protein 1, Interferon-induzierbar, 67 kDa
GBP5	Guanylate bindendes Protein 5
GCNT7	Glucosaminyl (N-acetyl) Transferasen-Familienmitglied 7 (GCNT7), mRNA
GEMIN4	Gern (nucleäres Organell) assoziiertes Protein 4
GK	Glycerolkinase
GK3P	Glycerolkinase-3 Pseudogen
GLS2	Glutaminase-2 (Leber, mitochondrial)
GNA13	Guanin-nucleotid-bindendes Protein (G Protein), alpha 13
GNB1	Guanin-nucleotid-bindendes Protein (G Protein), beta Polypeptid 1
GNG2	Guanin-nucleotid-bindendes Protein (G Protein), gamma 2
GPR84	G-Protein-gekoppelter Rezeptor 84
GRAMD1A	GRAM Domänen-enthaltend 1A, mRNA (cDNA Klon IMAGE:5921205)
GRB2	Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenes Protein 2
HAS2	Hyaluronan-Synthase 2
HBB	Hämoglobin, beta
HIF3A	Hypoxie-induzierbarer Faktor 3, alpha Untereinheit
HK3	Hexokinase 3 (weiße Zellen)
HMCN2	CDNA FLJ23816 fis, Klon HSI02685
HN1L	Hämatologisch und neurologisch exprimiert 1-ähnlich
HSPA6	Hitzeschock 70 kDa Protein 6 (HSP70B')
IFNGR2	Interferon gamma Rezeptor 2 (Interferon gamma Transducer 1)
IL18BP	Interleukin 18 bindendes Protein
1L20RB	Interleukin 20 Rezeptor beta
1L7R	Interleukin 7 Rezeptor
INHBA	Inhibin, beta A
INSIG1	Insulin induziertes Gen 1
IQCA1	IQ Motiv enthalten mit AAA Domäne 1
IQCE	IQ Motiv enthaltend E
IRAK3	Interleukin-1 Rezeptor-assoziierte Kinase 3
ITGA5	Integrin, alpha 5 (Fibronectin Rezeptor, alpha Polypeptid)
ITGB3	Integrin, beta 3 (Plättchen-Glycoprotein IIIa, Antigen CD61)
ITGB5	Integrin, beta 5
IVNS1ABP	Influenza Virus NS1A bindendes Protein
JMJD3	Jumonji Domäne enthaltend 3, Histon Lysin Demethylase
KIAA0999	KIAA0999 Protein
LOC 100128821	/// hypothetisches Protein LOC100128821 /// Zinkfinger E-box bindend „Homeobox” 2
LOCI 42937	Hypothetisches Protein BC008131
LOC338758	Hypothetisches Protein LOC338758
LOC728153	Ähnlich zu FAM133B Protein
LPCAT1	Lysophosphatidylcholin-Acyltransferase 1
LRP11	”low density” (niedere Dichte) Lipoprotein Rezeptor-verwandtes Protein 11
LYN	v-yes-1 Yamaguchi Sarcom virales verwandtes Oncogen Homolog
LYST	lysosomaler ”trafficking” Regulator
MAL2	mal, T-cell Differenzierung-Protein 2
MALAT1	Metastasen-assoziiertes Lungen-Adenocarcinom Transkript 1 (nicht-Protein codierend)
MAN2A1	Mannosidase, alpha, class 2A, member 1
MAP3K8	CDNA FLJ78064 vollständige cds, hochgradig ähnlich zu humaner mRNA für das Proto-Oncogen-Protein
MAP4K4	Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase Kinase Kinase 4
MCOLN2	Mucolipin 2
METAP2	Methionyl-Aminopeptidase 2
MLL5	myeloid/lymphoid oder geschmischt-Linie Leukämie 5 (Trithorax Homolog, Drosophila)
M0BKL1B	MOB1, ”Mps One Binder” Kinase Aktivator-ähnlich 1B (Hefe)
MRPS28	Mitochondriales ribosomales Protein S28
MRPS7	Mitochondriales Ribosomales Protein S7
MTF1	Metall-regulatorischer Transkriptionsfaktor 1
NAMPT	Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase
NBN	Nibrin
NFKB1	Nucleärer Faktor des kappa leichten Polypeptid-Gen Enhancers in B-Zellen 1
NFKBIE	Nucleärer Faktor des kappa leichten Polypeptid-Gen Enhancers in B-Zellen-Inhibitor, Epsilon
NFKBIZ	Nucleärer Faktor des kappa leichten Polypeptid-Gen Enhancers in B-Zellen Inhibitor, Zeta
NKX3-1	NK3 ”homeobox” 1
NLRP3	NLR Familie, Pyrin-Domäne enthaltend 3
NR4A2	Nucleärer Rezeptor Unterfamilie 4, Gruppe A, Mitglied 2
NR4A3	Nucleärer Rezeptor Unterfamilie 4, Gruppe A, member 3
NSMAF	Neutraler Sphingomyelinase (N-SMase) Aktivierungs-assoziierter Faktor
0R1F1	Olfactorischer Rezeptor, Familie 1, Unterfamilie F, Mitglied 1
PAG1	Phosphoprotein assoziiert mit Glycosphingolipid Microdomänen 1
PCDH1	Protocadherin 1
PCY0X1	Prenylcystein-Oxidase 1
PERP	PERP, TP53 Apoptose Effektor
PHACTR1	Phosphatase und Actin Regulator 1
PHF20L1	PHD Fingerprotein 20-ähnlich 1
PIK3AP1	Phosphoinositide-3-kinase Adaptor Protein 1
PIK3R5	Phosphoinositide-3-kinase, regulatorische Untereinheit 5
PNPLA8	Patatin-ähnlich Phospholipase Domäne enthaltend 8
POLH	Polymerase (DNA ausgerichtet), eta
POU6F1	POL) Klasse 6 ”homeobox” 1
PPP1R10	Protein Phosphatase 1, regulatorische (Inhibitor) Untereinheit 10
PPP2R3C	Protein Phosphatase 2 (früher 2A), regulatorische Untereinheit B”, Gamma
PROM2	Prominin 2
PRR14	Prolin-reich 14
PTGER4	Prostaglandin E Rezeptor 4 (Subtyp EP4)
PTK2	PTK2 Protein-Tyrosin-Kinase 2
PTPRE	Protein-Tyrosin-Phosphatase, Rezeptor-Typ, E
PTX3	Pentraxin-verwandtes Gen, schnell induziert durch IL-1 beta
QKI	”quaking Homolog”, KH Domäne RNA bindende (Maus)
RAB8B	RAB8B, Mitglied RAS Oncogen-Familie
RAP2C	RAP2C, Mitglied der RAS Oncogen-Familie
RBX1	Ring-Box 1
REG4	regenerierende Insel-abgeleitete Familie, Mitglied 4
RGS1	Regulator des G-Protein Signalwegs 1
RHOQ	ras Homolog Genfamilie, Mitglied Q
RIPK2	Rezeptor-wechselwirkende Serin-Threonin-Kinase 2
RNF213	Ringfinger-Protein 213
RPP21 /// TRIM39	Ribonuclease P/MRP 21 kDa subunit /// TRIM39-ähnliches Protein
SAMSN1	SAM Domäne, SH3 Domäne und nucleäre Lokalisierungssignale 1
SC02	SCO Cytochrom-Oxidase defizientes Homolog 2 (Hefe)
SDC1	Syndecan 1
SEC14L1	SEC14-ähnlich 1 (S. cerevisiae)
SERPINB5	Serpin-Peptidase-Inhibitor, Stamm B (Ovalbumin), Mitglied 5
SERPINB9	Serpin-Peptidase-Inhibitor, Stamm B (Ovalbumin), Mitglied 9
SF3B1	Splice-Faktor 3b, Untereinheit 1, 155 kDa
SF3B3	Splice-Faktor 3b, Untereinheit 3, 130 kDa
SFRS2IP	Splice-Faktor, Arginin-/Serin-reich 2, wechselwirkendes Protein
SH3BP5	SH3-Domäne bindendes Protein 5 (BTK-assoziiert)
SLC16A10	Lösliche Trägerfamilie 16, Mitglied 10 (aromatischer Aminosäure-Transporter)
SLC25A33	Lösliche Trägerfamilie 25, Mitglied 33
SLC25A37	Lösliche Trägerfamilie 25, Mitglied 37 CDNA FLJ90227 fis, Klon NT2RM1000899, hochgradig ähnlich zu mitochondrialem löslichen Trägerprotein
SNX10	sortierendes Nexin 10
S0D2	Superoxide-Dismutase 2, mitochondrial
S0X15	SRY(Geschlechts-bestimmende Region Y)-Box 15
SPAG9	Spermienassoziertes Antigen 9
SRA1	Steroid-Rezeptor RNA Aktivator 1
SRGN	Serglycin
STX4	Syntaxin 4
SUMF1	Sulfatase modifizierender Faktor 1
TACSTD2	Tumor-assoziierter Calcium-Signal-Übermittler 2
TANK	TRAF Familienmitglied-assoziierter NFKB Aktivator
TFEC	Transkriptionsfaktor EC
TGFB1	Transformierender Wachstumsfaktor, beta 1
TLR10	toll-ähnlicher Rezeptor 10
TMED3	Transmemnbran-emp24 Protein-Transportdomäne enthaltend 3
TMEM45A	Transmembran-Protein 45A
TMEM87A	Transmernbran-Protein 87A
TNFAIP3	Tumornekrose-Faktor, alpha-induziertes Protein 3
TNFAIP6	TumornekroseFaktor, alpha-induziertes Protein 6
TNFSF10	Tumornekrose-Faktor (Ligand) Superfamilie, Mitglied 10
TNFSF8	Tumornekrose-Faktor (Ligand) Superfamilie, Mitglied 8
TNK2	Tyrosin-Kinase, nicht-Rezeptor, 2
TPD52L1	Tumorprotein D52-ähnlich 1
TRAF1	TNF Rezeptor-assoziierter Faktor 1
TRIM38	Dreiteilig Motiv-enthaltend 38
UMPS	Uridin-monophosphat Synthetase
UNC13A	unc-13 Homolog A (C. elegans)
USP36	Ubiquitin spezifische Peptidase 36
WBSCR22	Williams Beuren Syndrom Chromosom Region 22
WDR43	WD Repeat(Wiederholungs-)Domäne 43
WTAP	Wilms Tumor 1 assoziiertes Protein
WTAP	Wilms Tumor 1 assoziiertes Protein (WTAP), Transkriptvariante 2, mRNA
ZBTB11	Zinkfinger und BTB Domäne enthaltend 11
ZEB2	Zinkfinger E-box bindende „homeobox” 2
ZMYM6	Zinkfinger, MYM-Typ 6
ZNF267	Zinkfingerprotein 267
ZNF438	Zinkfingerprotein 438
ZSWIM7	Zinkfinger, SWIM-Typ enthaltend 7
ZXDB	Zinkfinger, X-verbunden, dupliziertes B

Die Aufgabe wird ferner gelöst durch die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV) und/oder zum Nachwies einer persistierenden HPV-Infektion gelöst, das den Schritt des Nachweisens von zumindest einem der in Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker oder Fragmente davon in einer von dem Menschen isolierten Probe aufweist.
Ferner wird die Aufgabe gelöst durch die PCR-Nachweisprimer (im folgenden auch: ”Oligonukleotide”), die bei der erfindungsgemäßen Verwendung und dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, und mit denen zumindest einer der in Tabelle 1 dargestellten diagnostischen Marker nachgewiesen werden kann, sowie durch einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der zumindest einen erfindungsgemäßen PCR-Nachweisprimer enthält.
Die Erfinder konnten in aufwendigen Versuchen zeigen, dass es anhand der untersuchten Marker möglich ist, beispielsweise in einer von einem zu untersuchenden Menschen entnommenen Probe diese Marker nachzuweisen, und bei deren Vorhandensein, entweder alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren der anderen aufgeführten Marker, eine Prädisposition des Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs zu bestimmen. Diese Bestimmung kann bspw. anhand des Vergleichs der erfindungsgemäßen Marker mit den entsprechenden Markern aus entsprechenden HPV-negativen Proben und/oder HPV-positiven, aber nicht progressiven Proben erfolgen.
Mit der vorliegenden Erfindung wird daher ein hervorragendes Werkzeug für eine verbesserte Früherkennung für Gebärmutterhalskrebs bereitgestellt, da mit Hilfe der in der vorliegenden Erfindung identifizierten Marker auf dem Boden einer persistierenden HPV-Infektion bis zu 12 Jahre vorher die Entwicklung von hochgradigen Krebsvorstufen mit hoher Signifikanz vorhergesagt werden kann.
Ferner bieten die bereitgestellten Marker, neben der Möglichkeit zur Diskriminierung zwischen Frauen mit progredientem Verlauf und Frauen, die trotz einer HPV-Infektion gesund bleiben, auch die Möglichkeit, zwischen Frauen zu unterscheiden, die keine HPV-Infektion aufweisen, und Frauen, die eine persistierende HPV-Infektion besitzen.
Damit lässt sich auch das Riskio von Frauen, ausgehend von einer persistierenden HPV-Infektion Gebärmutterhalskrebs zu entwickeln, hervorsagen.
Vorliegend werden dabei die Begriffe ”progredient” und ”progressiv” synonym verwendet, und sollen – so wie auch der Begriff ”Progressoren” – die Entwicklung von Dysplasien bzw. Krebsvorstufen und Krebs/Tumoren bedeuten.
Die in Tabelle 1 wiedergegebenen Namen sind die – auch in Deutschland – offiziellen Gennamen, bzw. deren offizielle Abkürzung, deren Übersetzung ins Deutsche weder zweckdienlich noch empfohlen ist, um Verwechslungen zu vermeiden. Weitere Informationen zu den genannten Genen, deren Sequenzen und Namen, sind über deren angegebene Abkürzungen bspw. in der Datenbank des National Center für Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) unter dem Suchwerkzeug ”Gene” zu finden, wo die Informationen öffentlich zugänglich und dauerhaft gespeichert angelegt sind.
Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn die Marker ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die Marker mit den offiziellen Gennamen SERPINB5, CNAD1, CPSF2, CCRL2, TNFAIP6, CD44, TMEM45A, WDR43, NBN, ERMP1, LRP11, CDKN2A, HPV16E4, HPV16E7, SERP1, ASAH1, HIGD1A, PGH1, die auch in der nachstehenden Tabelle 2 mit ihren jeweiligen Sequenzen, sowie den für die Marker jeweils spezifischen Primern (siehe auch Tabelle 3) und der jeweiligen Produktgröße, aufgeführt sind. Tabelle 2: ausgewählte diagnostische Marker
Den Erfindern war es möglich, insbesondere für die in Tabelle 2 aufgeführten Marker, deren Sequenzen ebenfalls in der Tabelle angegeben sind, deren Geeignetheit für die Bestimmung der Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen zu untersuchen und nachzuweisen. In eigenen Versuchen zeigten die Erfinder, dass es insbesondere anhand dieser Marker möglich ist, einen hohen positiven Vorhersagewert der Erkrankungen zu erreichen.
Vorliegend wird dabei unter ”Diagnostische Marker” jedes bereitgestellte diagnostische Gen bzw. das durch dieses Gen codierte Protein sowie die ausgehend von dem Gen transkribierte RNA verstanden, bzw. auch jedes für das Gen oder das Protein oder die mRNA charakteristisches Sequenzfragment. Dabei wird unter ”charakteristisches Sequenzfragment” jeder Sequenzabschnitt des Gens, des hierdurch codierten Proteins bzw. der von dem Gen transkribierten mRNA verstanden, der für das jeweilige Gen, Protein, mRNA spezifisch ist, d. h. in dieser Sequenz nicht in anderen Genen, Proteinen, mRNAs zu finden ist.
Dementsprechend ist in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt, wenn die Vorhersage durch die Bestimmung der Genexpression der diagnostischen Marker erfolgt.
Unter ”Genexpression” sind dabei, wie weiter oben ähnlich erläutert, die von den Markergenen abgeleitete/transkribierte mRNA zu verstehen, sowie die wiederum durch die Markergene codierten Proteine. Diese werden vorliegend daher auch als ”Marker-mRNA” und ”Marker-Proteine” bezeichnet.
Der Nachweis der Genexpression der diagnostischen Marker bietet den Vorteil, dass damit bei der Untersuchung einer menschlichen Probe ein Vergleich zu der Genexpression der entsprechenden Marker in einer gesunden oder einer nicht-progressiven Probe gezogen werden kann. Anhand des Vergleichs kann dann für die einzelnen Markergene ggf. eine Hoch- oder eine Herunterregulierung dieser Markergene bestimmt werden, wonach in diesem Fall die Prädisposition zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs vorhergesagt werden kann.
Dementsprechend ist in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt, wenn die Vorhersage durch den Nachweis von mRNA-Transkripten von zumindest einem der diagnostischen Marker erfolgt, und insbesondere, wenn der Nachweis der mRNA-Transkripte über eine quantitative RT-PCR (Real Time (Echtzeit) Polymerase-Ketten-Reaktion) erfolgt.
Die Real-Time-quantitative-PCR (vorliegend auch kurz qRT-PCR) ist ein Verfahren zur Amplifizierung/Vervielfältigung von Nukleinsäuren, das auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht, und zusätzlich die Quantifizierung der hierdurch gewonnenen DNA ermöglicht. Die Quantifizierung wird in der Regel mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die während eines PCR-Zyklus erfasst werden, wobei die Fluoreszenz proportional mit der Menge der PCR-Produkte zunimmt. Am Ende eines aus mehreren Zyklen bestehenden Laufs wird anhand von erhaltenen Fluoreszenzsignalen die Quantifizierung in der exponentiellen Phase der PCR vorgenommen.
Die quantitative Real-Time-PCR ist damit ein hervorragendes Werkzeug zur Quantifizierung von Nukleinsäuren.
In bevorzugten Ausführungsbeispielen wird also die mRNA der diagnostischen Marker zunächst in cDNA umgeschrieben und dann für die quantitative Real-Time-PCR eingesetzt, wodurch die Transkripte der diagnostischen Marker quantifiziert werden und basierend hierauf eine Vorhersage zur Prädisposition für die Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs getroffen werden kann.
Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn Sequenzen bzw. Sequenzabschnitte der diagnostischen Marker nachgewiesen werden, die für den jeweiligen diagnostischen Marker charakteristische Fragmente bzw. Abschnitte darstellen, d. h. also Abschnitte, die ganz spezifisch mit der angegebenen Sequenz nur in dem jeweiligen Marker zu finden bzw. nachzuweisen ist.
Hierbei ist insbesondere bevorzugt, wenn bei der quantitativen Real-Time-PCR zumindest ein PCR-Nachweisprimer, vorzugsweise ein PCR-Nachweisprimerpaar, eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden:

(a) ein in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführter PCR-Nachweisprimer/PCR-Nachweisprimer paar oder dessen komplementärer Strang;
(b) PCR-Nachweisprimer, die unter stringenten Bedingungen an die in (a) definierten PCR-Nachweisprimer hybridisieren, oder Fragmente davon; und
(c) PCR-Nachweisprimer, die eine Sequenzhomologie von mindestens 80% zu den PCR-Nachweisprimern aus Tabelle 3 aufweisen, und die wie die PCR-Nachweisprimer aus (a) zum Nachweis der hierin offenbarten diagnostischen Marker geeignet sind.

Unter ”Oligonukleotid/-en” werden vorliegend – wie auch im Stand der Technik und im betreffenden Gebiet allgemein – aus wenigen Nukleotiden (DNA oder RNA) aufgebaute Oligomere verstanden, wobei die Nukleotidsequenz in der Regel aus ca. 10 bis 100 Nukleotideinheiten besteht.
Vorliegend werden die Oligonukleotide auch in der Polymerase-Ketten-Reaktion eingesetzt, weshalb die beanspruchten und offenbarten Oligonukleotide auch als ”PCR-Nachweisprimer/Primer” bezeichnet werden. Auch die in der Tabelle 3 wiedergegebene allgemeine Bezeichnung bestimmter Oligonukleotide mit ”forward” (vorwärts) oder ”reverse” (rückwärts) stellen im relevanten technischen Gebiet auch in Deutschland übliche Bezeichnungen von Primern/Oligonukleotiden dar, so dass vorliegend auch diese englischen Begriffe gewählt werden, um Klarheit zu verschaffen.
Unter ”Hybridisierung unter stringenten Bedingungen” wird vorliegend verstanden, dass die Hybridisierung in vitro unter Bedingungen durchgeführt wird, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten. Solche stringenten Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können bspw. der Literatur entnommen werden (siehe Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Allgemein bedeutet vorliegend ”spezifisch hybridisieren”, dass ein Molekül, vorliegend insbesondere ein Oligonukleotid, unter stringenten Bedingungen präferenziell an eine bestimmte Nukleotidsequenz bindet, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von DNA oder RNA vorliegt, und somit nicht, oder zu einem deutlich geringerem Ausmaß, an andere Sequenzen. Stringente Bedingungen sind unter Anderem Sequenz-abhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere(Oligonukleotid-)Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Temperatur etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Oligonukleotidsequenz liegt. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der zu der Zielsequenz komplementären Moleküle zu der Zielsequenz im Gleichgewichtszustand hybridisieren. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens ungefähr 0,01 bis 1,0 M Natriumionen-Konzentration (oder ein anderes Salz) bei einem pH zwischen 7,0 und 8,3 beträgt und die Temperatur mindestens 30°C für kürzere Moleküle (also z. B. 10–50 Nukleotide) beträgt. Zusätzlich können stringente Bedingungen durch Zugabe destabilisierender Agenzien, wie beispielsweise Formamid, erreicht werden.
So kann die Hybridisierung etwa unter den folgenden Bedingungen stattfinden: Hybridisierungspuffer: 2 × SSC, 10 × Denhardt's Lösung (Ficoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1:1:1), 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Na₂HPO₄, 2501 lg/ml Heringssperma-DNA; 50 μg/ml tRNA oder 0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 1 mM EDTA, 7% SDS bei einer Hybridisierungstemperatur von 65°C bis 68°C; Waschpuffer: 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei einer Waschtemperatur von 65°C bis 68°C.
Die unter c) aufgeführten PCR-Nachweisprimer weisen eine Sequenzidentität von mindestens 80%, vorzugsweise von mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu der unter a) angegebenen PCR-Nachweisprimern oder Teilen davon auf, bezogen auf die in der Tabelle 3 gezeigten Sequenzen der unter a) angegebenen PCR-Nachweisprimer.
Vorzugsweise wird die Sequenzidentität von PCR-Nachweisprimern gemäß c) durch Vergleich mit den in Tabelle 1 angegebenen Sequenzen bestimmt. Wenn zwei unterschiedlich lange Nukleinsäuresequenzen miteinander verglichen werden, bezieht sich die Sequenzidentität vorzugsweise auf den prozentualen Anteil der Nukleotidreste der kürzeren Sequenz, die identisch sind mit den entsprechenden Nukleotidresten der längeren Sequenz. Sequenzidentitäten werden üblicherweise über verschiedene Alignment-Programme, wie z. B. CLUSTAL festgestellt. Allgemein stehen dem Fachmann zur Bestimmung der Sequenzidentität geeignete Algorithmen zur Verfügung, z. B. auch das Programm, das unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (z. B. der Link ”Standard nucleotide-nucleotide BLAST”) öffentlich zugänglich und ständig zugänglich ist.
In einer anderer Ausführungsform der erfindungsgemäßen diagnostischen Marker ist bevorzugt, wenn die Vorhersage durch den Nachweis der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine erfolgt.
Es versteht sich, dass dieser Nachweis der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine dabei nicht immer für das gesamte Protein erfolgen muss, sondern auch über bestimmte, jeweils spezifische Abschnitte erfolgen kann. Die Proteine können bspw. über spezifische Antikörper, d. h. Antikörper die spezifisch an die Proteine/Proteinfragmente bzw. -abschnitte binden, detektiert werden, bspw. unter Einsatz von Western-Blots und Enzym-gekoppelten Immunabsorptionsassays. Verfahren zum quantitativen Nachweis von Proteinen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt, diesbezüglich wird bspw. auf ”Using Antibodies: A laboratory Manual. Ed Harlow/David Lane 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press” verwiesen, das ein entsprechendes Lehrbuch darstellt und Anleitungen zu den beschriebenen Verfahren enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei lediglich ein diagnostische Marker für die Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs verwendet, wohingegen es in anderen Ausführungsformen bevorzugt ist, wenn zwei oder mehrere der in Tabelle 1 oder 2 aufgeführten diagnostischen Marker in Kombination für die Vorhersage verwendet werden.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist bevorzugt, wenn die Vorhersage im Vergleich zu mindestens einem den folgenden Markern erfolgt:

a) dem/den zu testenden Markern entsprechenden Markern aus einer entsprechenden HPV-negativen menschlichen Probe;
b) dem/den getesteten Markern entsprechenden Markern aus einer HPV-positiven, nicht-progressiven menschlichen Probe; und/oder
c) Referenzmarker, die auf konstantem Level in verschiedenen menschlichen Gewebe/Flüssigkeiten vorkommen.

Mit ”dem/den zu testenden Markern entsprechenden Markern” ist vorliegend gemeint, dass, wenn in einer zu untersuchenden Probe bspw. der Marker TMEM45A (oder einer der anderen hierin offenbarten erfindungsgemäßen Marker) für die Vorhersage zur Prädisposition verwendet werden soll, dann in einer entsprechenden (bekannten) Probe, die nachweislich HPV-negativ oder die HPV-positiv, aber zumindest nicht progressiv ist, ebenfalls der Marker TMEM45A, insbesondere dessen Genexpression, bestimmt wird.
Insbesondere ist bevorzugt, wenn die Vorhersage durch den Nachweis einer Veränderung, insbesondere einer Herunter- und/oder Hochregulierung, der Genexpression der diagnostischen Marker im Vergleich zu der Genexpression von zumindest einem der Marker a) bis c) erfolgt:

a) dem/den getesteten diagnostischen Markern entsprechenden Markern aus einer entsprechenden HPV-negativen menschlichen Probe;
b) dem/den getesteten diagnostischen Markern entsprechenden Markern aus einer HPV-positiven, nicht-progressiven menschlichen Probe; und/oder
c) Referenzmarker, die auf konstantem Level in verschiedenen menschlichen Gewebe/Flüssigkeiten vorkommen.

Die Erfinder haben in eigenen Versuchen nachgewiesen, dass einerseits bestimmte der Markergene im Vergleich zu den entsprechenden Markern aus einer HPV-negativen bzw. HPV-positiven, aber nicht-progressiven Probe, in ihrer Genexpression entweder hoch- oder herunterreguliert sind, und dass diese unterschiedliche Genexpression der Marker zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs eingesetzt werden kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist bevorzugt, wenn der Schritt des Nachweisens über die Bestimmung der Genexpression der diagnostischen Marker in der isolierten Probe erfolgt, und insbesondere wenn er über die Bestimmung der Transkripte der diagnostischen Marker und/oder der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine erfolgt. Hierbei ist bevorzugt, wenn zum Nachweis der diagnostischen Marker ein PCR-Nachweisprimer eingesetzt wird, der ausgewählt ist aus den in der Tabelle 3 aufgeführten Sequenzen.
Die weiter oben für die erfindungsgemäße Verwendung dargestellten Begriffsdefinitionen und Vorteile gelten auch für das erfindungsgemäße Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Schritte auf:

(a) Isolieren von mRNA aus einer von dem Menschen enthaltenen Probe;
(b) Umschreiben der in Schritt (a) isolierten mRNA in cDNA;
(c) In-Kontakt-Bringen der in Schritt b) gewonnenen cDNA Probe mit zumindest einem PCR-Nachweisprimer, der ausgewählt ist aus den in der Tabelle 3 aufgeführten PCR-Nachweisprimern;
(d) Durchführen einer quantitativen Real-Time-PCR zur Herstellung von Amplifizierungsprodukten der in cDNA umgeschriebnen mRNA der diagnostischen Marker; und
(e) Bestimmung der in Schritt (d) gewonnenen Amplifizierungsprodukte.

Dabei ist in einer Weiterbildung bevorzugt, wenn das Verfahren den zusätzlichen Schritt (f) aufweist:

(f) Abgleichen der in Schritt (e) bestimmten Amplifizierungsprodukte mit diesen entsprechenden Amplifizierungsprodukten von entsprechenden Vergleichsmarkern aus einer HPV-negativen entsprechenden menschlichen Probe und/oder einer entsprechenden HPV-positiven, aber nicht-progressiven menschlichen Probe, wobei eine Veränderung, insbesondere eine Herunter- und/oder Hochregulierung, der Genexpression der diagnostischen Marker im Vergleich zu den Vergleichsmarkern die Prädisposition eines Menschen, Gebärmutterhalskrebs zu entwickeln, zeigt.

Die Isolierung der mRNA kann dabei mit im Stand der Technik bekannten Mitteln erfolgen, bspw. mittels des RNeasy^® Mini-Kits der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland. Die Umschreibung der so isolierten mRNA kann ebenfalls mit im Stand der Technik bekannten Mitteln erfolgen, bspw. mittels des Reverse-Transkriptase-Kits der Firma Qiagen. Es versteht sich, dass auch andere Mittel und Verfahren von anderen Firmen zum Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind; diesbezüglich wird auf das Standardwerk von Sambrook und Maniatis verweisen (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausgabe Januar 2001).
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, im Übrigen wie auch bei der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt, wenn parallel zum Nachweis der diagnostischen Marker Referenzmarker nachgewiesen werden.
Dabei soll vorliegend ”Referenzmarker” jeder diagnostische Marker bzw. jedes menschliche Gen bedeuten, das ubiquitär vorkommt und auf konstantem Level in verschiedenen Genen exprimiert wird, wobei die Expression der Gene unter verschiedenen Bedingungen konstante bleibt.
Vorliegend sind für die erfindungsgemäße Verwendung sowie für das Verfahren insbesondere zumindest eines der folgenden Referenzgene, bzw. deren Genexpressionsprodukte bevorzugt, die die folgenden offiziellen Gennamen besitzen: ASAH1 (N-Acylsphingosin-Amidhydrolase 1, HIGD1A (HIG1 Domain Family Member 1A; Hyoxie-induzierbares Gen 1), SERP1 (Stress-assoziiertes Endoplasmatisches Retikulum-Protein 1), PGK1 (Phosphoglyceratkinase).
Anhand der Referenzgene können bspw. die Transkriptionsmuster der mRNA zwischen verschiedenen Proben standardisiert werden, und somit dann die erhaltenen relativen Mengen miteinander verglichen werden.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung sowie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ferner bevorzugt, wenn die zu untersuchende, von einem Menschen isolierte Probe eine Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe ist, und insbesondere eine Biopsie-, eine Zervixzellenprobe und/oder ein Papanicolaou-Abstrich ist.
Die erfindungsgemäßen PCR-Nachweisprimer sind ausgewählt aus zumindest einem der folgenden:

(a) ein in Tabelle 3 aufgeführter PCR-Nachweisprimer oder dessen komplementärer Strang;
(b) PCR-Nachweisprimer, die unter stringenten Bedingungen an die in (a) definierten PCR-Nachweisprimer hybridisieren, oder Fragmente davon; und
(c) PCR-Nachweisprimer, die eine Sequenzhomologie von mindestens 80%, vorzugsweise von mindestens 85%, 90%, 95%, 98% zu den in (a) definierten PCR-Nachweisprimern besitzen und mit denen die diagnostischen Marker ebenfalls nachgewiesen werden können

Zu den unter den Alternativen a), b) und c) aufgeführten PCR-Nachweisprimern, deren Bestimmung bzw. Definition und/oder Auffinden gelten die weiter oben für die erfindungsgemäße Verwendung ausgeführten Bestimmungen, Definitionen, Mittel zum Auffinden.
Der erfindungsgemäße Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist dabei zumindest einen erfindungsgemäßen PCR-Nachweisprimer, vorzugsweise ein in Tabelle 3 aufgeführtes PCR-Nachweisprimerpaar, oder die in Tabelle 3 aufgeführten PCR-Nachweisprimerpaare, die unter stringenten Bedingungen an die in der Tabelle 3 aufgeführten PCR-Nachweisprimerpaare hybridisieren, oder Fragmente davon, auf.
Es versteht sich, dass neben dem zumindest einen PCR-Nachweisprimer bzw. dem PCR-Nachweisprimerpaar weitere, für das erfindungsgemäße Verfahren im Stand der Technik bekannte Reagenzien und/oder Substanzen enthalten sein können, mithin also Mittel, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann. Solche Mittel, Reagenzien, Substanzen sind insbesondere Mittel zum Durchführen einer Polymerase-Ketten-Reaktion, also bspw. die hierfür notwendigen Puffer und Enzyme, Nukleotide. Dem Fachmann wird klar sein, welche Reagenzien zusammen mit den erfindungsgemäßen PCR-Nachweisprimern in dem Kit enthalten sein müssen, um das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich durchführen zu können.
Auch für die im erfindungsgemäßen Kit vorliegenden PCR-Nachweisprimer/PCR-Nachweisprimerpaare gelten die weiter oben für die erfindungsgemäße Verwendung ausgeführten Bestimmungen, Definitionen, und Mittel zum Auffinden.
Der Kit kann ferner PCR-Nachweisprimer zum Nachweis von zumindest einem Referenzmarker enthalten, insbesondere zumindest eines der folgenden: ASAH1 (N-Acylsphingosin-Amidhydrolase 1, HIGD1A (HIG1 Domänen Familienmitglied 1A; Hypoxie-induzierbares Gen 1), SERP1 (Stress-assoziiertes Endoplasmatisches Retikulum-Protein 1), PGK1 (Phosphoglyceratkinase) bzw. Genexpressionsprodukte davon.
Es versteht sich, dass die obenstehend beschriebenen und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird in der nachfolgenden Beschreibung der Beispiele bzw. Ausführungsbeispiele sowie anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigen:
1 eine Übersicht über die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Kohortenstudie
2 ein Balkendiagramm, das die Korrelation von Microarray-Experimenten, bei denen Veränderungen in der Genexpression in Proben bestimmt wurden, und quantitativen Real-Time-PCR-Experimenten, mit welchen ebenfalls die Veränderung der Genexpression in Proben untersucht wurden, graphisch darstellt, und für dessen Erstellung die Ergebnisse der HPV-negativen und HPV-positiven Proben verglichen wurden; und
3 ein Balkendiagramm, das die Korrelation von Microarray-Experimenten, bei denen Veränderungen in der Genexpression in Proben bestimmt wurden, und quantitativen Real-Time-PCR-Experimenten, mit welchen ebenfalls die Veränderung der Genexpression in Proben untersucht wurden, graphisch darstellt, und für dessen Erstellung die Ergebnisse aus der Gruppe der HPV-positiven Progressoren und der HPV-positiven nicht-Progressoren verglichen wurden.
Detaillierte Beschreibung der Figuren und der Ausführungsbeispiele
Material und Methoden:
Wie bereits weite oben erwähnt, stammt das Untersuchungsmaterial für die vorliegende Erfindung aus einer dänischen Kohorten-Studie, für die Frauen zwischen 20 und 29 Jahren zufällig ausgewählt wurden. 1 zeigt eine Übersicht des in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Probenmaterials. So wurden, in den Jahren 1991 bis 1993 Proben von Endo- und Ektozervix von ca. 11088 dänischen Frauen entnommen, sowie Pap-Abstriche vorgenommen; beide Proben wurden in Puffer überführt und dahingehend untersucht, ob diese HPV-negativ oder HPV-positiv waren. In den Jahren 1993 bis 1995 erfolgte die zweite Untersuchung von 78% der zuvor untersuchten Frauen, und zehn Jahre später, im Jahr 2005, erfolgte die Verlinkung mit der Pathologie-Datenbank, wonach die Frauen identifiziert wurden, die leichte bis schwere Dysplasien/Karzinome entwickelten.
1 erläutert auch schematisch, dass unter einer transienten Infektion HPV-Infektionen zu verstehen sind, die nach einem bestimmten Zeitraum (2 Jahre) nicht mehr nachweisbar sind und damit nach dem Zeitraum keine HPV-Infektion mehr vorliegt. (also: HPV-Positive bei der ersten Untersuchung wurden bei der zweiten Untersuchung als HPV-Negative diagnostiziert). Bei diesen kam es dann, ebenso wie bei bereits mit der ersten Untersuchung diagnostizierten HPV-Negativen, zu keiner Progression. IM Gegensatz hierzu zeigten die auch bei der zweiten Untersuchung HPV-Positiven eine Progression.
Für die Genexpressionsanalyse mittels Microarray, mit dem die Genexpression vieler Gene aus einer geringen Menge Probenmaterial gleichzeitig bestimmt werden kann, wurden Profile von 52 Proben (entnommen in der zweiten Phase) der dänischen Kohorte bestimmt und untereinander verglichen. Die Analyse wurde bezüglich HPV-Negativen gegen HPV-Positive, HPV16-positive ohne Progression, d. h. ohne zytologische Auffälligkeiten nach zehn Jahren Follow-up) gegen HPV16-positive Progressoren, d. h., während des 10-Jahres Follow-ups (Weiterverfolgung) wurde eine leichte Dysplasie, eine schwere Dysplasie, ein Carcinoma in situ (im Folgenden Auch: CIS), oder Krebs/ein Karzinom diagnostiziert. Die Gene, für die eine differentielle Genexpression nachgewiesen wurde, sind in den obigen Tabellen 1 und 2 mit ihrem jeweiligen Gennamen aufgeführt.
Durch den Vergleich der Gruppen wurden einerseits Gene identifiziert, die in HPV-Negativen Proben eine andere Expression zeigten als die HPV16-positiven Probe, und andererseits wurden Gene identifiziert, deren Expression unterschiedlich war zwischen Frauen, die keine histologische Veränderungen während des Follow-ups aufwiesen, und Frauen, die im weiteren Verlauf Dysplasien und Karzinome entwickelten.
Um die mittels der Microarray-Analyse gewonnenen Erkenntnisse über die differentielle Genexpression zu validieren, wurden die Proben mittels quantitativer Real-Time-(Echtzeit)Polymerase Kettenreaktion untersucht. Hierzu wurden bisher die folgenden Proben untersucht: 19 Proben HPV-negativ (keine Dysplasie bis zur zweiten Untersuchung), sowie insgesamt 81 Proben HPV 16-positiv, davon 37 nicht-progressive (ohne Dysplasieentwicklung) und 44 progressive, davon wiederum 10 Proben mit leichten Dysplasien, 20 Proben mit schweren Dysplasien, 12 mit CIS und 2 mit Krebs/Karzinom.
Die Gesamt-RNA der bei –80°C eingefrorenen Proben wurde mittels eines modifizierten RNeasy Mini-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert, wofür die Proben kurz und vorsichtig aufgetaut wurden.
Entweder wurde die so isolierte RNA dann direkt mittels des Reverse-Transcription-Kits (Qiagen) in cDNA umgeschrieben, oder aber zunächst noch zur Generierung von cRNA amplifiziert, und dann in cDNA umgeschrieben.
Für die quantitative Real-Time-PCR wurden Primer entworfen, die für die einzelnen Gene spezifisch sind. Die schließlich entwickelten Primer erfüllten demnach die folgenden Eigenschaften: a) die Sequenz, an die der Primer bindet, kommt im menschlichen Genom nur einmal vor; b) die hybridisierende Sequenz war 18 bis 23 Nukleotide lang; c) die Schmelztemperatur lag zwischen 58°C und 62°C (Optimum: 60°C); d) der GC-Gehalt der Komplettsequenz war zwischen 30% und 80% (Optimum: 50%).
Die schließlich generierten Primer sind in Tabelle 2, rechte Spalte, sowie in Tabelle 3 aufgeführt.
Die quantitative Real-Time-PCR wurde im LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Deutschland) durchgeführt, wofür die spezifischen Primer und SYRER Green verwendet wurde, das sich in doppelsträngige DNA einlagert. Durch diese Bindung wir die emittierte Fluoreszenz bei gleicher Anregungsintensität um ein Vielfaches verstärkt. Im LightCycler wird während der Amplifikation nach jedem Zyklus am Ende der Elongationsphase die Fluoreszenz gemessen. Der jeweilige Ansatz für die Real-Time-PCR war wie folgt:

20 μl Ansatz: 10 μl SybrGReen I Master (Roche)

2 μl forward Primer (3 μM)

2 μl reverse Primer (3 μM)

1 μl H₂O (DEPC-behandelt)

Anschließend wurden jeweils 5 μl der entsprechenden cDNA hinzugefügt und folgendes Programm durchgeführt:

Initialer Aktivierungsschritt:	95°C	5 min
Denaturierung:	94°C	15 sec
Primerbindung:	55°C	30 sec
Produkt-Amplifikation:	72°C	30 sec
Schmelzkurve:	95°C	5 min
	65°C	1 min
	72°C
Ende	4°C

Mittels der dazugehörigen Software (Roche) konnte der Crossing Point(CP-)-Wert, also der Zyklus, an dem sich die Signalintensität der cDNA-Probe von der Hintergrundfluoreszenz abhebt, bestimmt werden. Dieser CP-Wert dient als indirekter Indikator der Genexpression, d. h. Proben mit einer hohen Genexpression eines Gens zeigen kleinere CP-Werte als eine Probe mit geringerer Genexpression.
Zusätzlich zu den Genen, die in den Microarrays eine unterschiedliche Expression zwischen den zu untersuchenden Gruppen zeigten, wurden auch Referenzgene gemessen, die fast keine Unterschiede zeigten. Mittels der Referenzgene wurden die untersuchten Gene normalisiert. Jede PCR umfasste mindestens eine Template-Kontrolle und zwei Positivkontrollen. Für den Vergleich der Ergebnisse aus den Microarray-Tests und der qRT-PCR wurde die n-fache Expression mit Hilfe der folgenden Formel berechnet: n-fache Expression = (Effizienz Zielgen)^{ΔCPZielgen (Kontrolle-Probe)}/(Effizienz Referenz)^{ΔCPReferenz (Kontrolle-Probe)}
Ergebnisse
In der Tabelle 2 sind in der linke Spalte diejenigen Namen der Markergene aufgeführt, deren Expression mittels der qRT-PCR untersucht wurden. In der zweiten Spalte findet sich die Sequenz dieser Gene, und in der dritten Spalte die für die Amplifikation eines bestimmten, charakteristischen bzw. spezifischen Abschnitts der Markergene eingesetzten Oligonukleotide/PCR-Nachweisprimer. Ferner ist in der dritten Spalte auch die Größe des Reaktionsproduktes angegeben.
Ausgewählt wurden die folgenden Marker, bzw. Gene:
Chemokin (C-C Motiv) Rezeptor-ähnliches Protein 2 (CCRL2), Tumornekrosefaktor, alpha-induziertes Protein 6 (TNFAIP6), die beide in der Expression verringert waren; CD44-Antigen, KIAA1815 und das Transmembran-Protein45A (TMEM45A), deren Expression sämtlich induziert war. Die vorstehenden Gene wurden beim Vergleich von HPV-positiven Proben gegen HPV-negativen Proben identifiziert.
Ferner wurden die folgenden Marker beim Vergleich der HPV16-positiven, nicht-progressiven Proben mit den HPV16-positiven, progressiven Proben identifiziert:
Serpin-Peptidase-Inhibitor, Member 5 (SERPINB5), Cullin-assoziiertes und Neddylierungs-dissoziiertes Protein 1 (CAND1), Spaltungs- und Polyadenylierungs-spezifischer Faktor 2 (CPSF2), Splice-Faktor 3b, Untereinheit 3 (SF3B3), deren Genexpression sämtlich induziert war, und SEC14-ähnliches Protein 1 (SEC14L1), dessen Genexpression verringert war.
Als Referenzgene, die zur Normalisierung der Proben verwendet wurden, wurden die folgenden Gene eingesetzt:
ASAH1 (N-Acylsphingosin-Amidhydrolase 1, HIGD1A (HIG1 Domänen Familienmitglied 1A; Hypoxie-induzierbares Gen 1), SERP1 (Stress-assoziiertes Endoplasmatisches Retikulum-Protein 1), PGK1 (Phosphoglyceratkinase), bzw. Genexpressionsprodukte davon.
Weitere Informationen zu den genannten Genen sind, wie bereits weiter oben erwähnt, über deren angegebene Abkürzungen bspw. in der Datenbank des National Center für Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) unter dem Suchwerkzeug ”Gene” zu finden.
Da viele der aus den Proben extrahierte RNAs eine geringe Konzentration zeigten, wurden für die Microarrays und auch für einen Versuchsansatz der qRT-PCR eine zwei-Runden-Amplifikation der RNA zur Generierung con cRNA durchgeführt, um die RNA-Mengen zu vervielfältigen. Die amplifizierte RNA (und auch nicht-amplifizierte RNA) wurde in cDNA umgeschrieben und für die qRT-PCR eingesetzt.
Um die n-fache Expression eines Gens aus den Microarray-Experimenten mit denen der qRT-PCR vergleichen zu können, wurde die veränderte Expression der einzelnen Gene mit einer alternativen Methode berechnet: Hierzu wurde der Median der CP-Werte der einzelnen Proben in einer Gruppe berechnet. Als Referenz dient der Median der PGK1-Werte der jeweiligen Gruppen. Es zeigte sich, dass diejenigen Gene, welche in den Microarrays zwischen HPV-negativen und HPV-positiven Proben eine unterschiedliche Expression aufgezeigt hatten, eine annähernd gleiche Veränderung der Expression in der qRT-PCR zeigten.
Die qPCR Daten der cRNA wurden zusätzlich auf statistische Relevanz getestet. Es zeigte sich, dass in der Gruppe der HPV-negativen gegen die HPV16-positiven Proben alle Gene, die in den Microarrays identifiziert wurden, einen signifikanten Expressionsunterschied zeigten, also in allen statistischen Tests p-Werte < 0,05 oder im Fall von TMEM45A sogar < 0,000 (Daten nicht gezeigt).
In 2 ist die Korrelation von Daten aus Microarray-Experimenten mit Daten von qRT-PCR-Experimenten gezeigt. Wie dem in 2 dargestellten Balkendiagramm gezeigt, korreliert beim Vergleich von HPV-negativen mit HPV16-positiven Proben das Ausmaß der Genexpressionsveränderungen in qPCR-Experimenten mit cRNA, der Original-RNA und den Microarray-Analysen bei TMEM45A und CD44. Bei TNFAIP6 und CCRL2 wurde eine Deregulation in den Microarray-Analysen beobachtet, die nicht in den qPCR-Experimenten der Original-RNA bestätigt werden konnte. CAND1 ist in cRNA und Original-RNA ähnlich stark reguliert, SERPINBS ist in der Original-RNA stärker als in der cRNA dereguliert.
Beim quantitativen Vergleich der Gruppe der Progressoren mit den Nicht-Progressoren zeigte sich nur für SERPINBS und TMEM45A ein deutlicher Expressionsunterschied (siehe 3). CAND1 zeigte im Gegensatz zu Microarray und cRNA-Analyse keine Deregulation in der Original-RNA. Im Einklang mit der Signifikanzanalyse konnte keine Deregulation für CCRL2, CD44 oder TNFAIP6 beobachtet werden.
In weiteren Versuchen sollten weitere Marker für die Progression und Persistenz von HPV-Infektionen untersucht werden. So wurden in einem Versuchsansatz die Mengen an E6/E7-Transkripten bestimmt. Hierzu wurde ein E7-spezifisches Primerpaar, welches den 5'-Bereich der viralen RNA detektiert und ein E4-spezifisches Primerpaar, welches den 3'-Bereich der HPV 16 Transkripte detektieren kann, entwickelt (siehe Tabelle 2, linke Spalte und Tabelle 3, rechte Spalte)
Zusätzlich wurden die Transkriptmenge an CDKN2A untersucht; dieses Gen codiert für zwei strukturell unterschiedliche Proteine, p16 und p14ARF.
In der Original-RNA wurden die relativen mRNA-Mengen von HPV16E4, HPV16E7 und CDKN2A durch qPCR bestimmt. Die Auswertung erfolgte nach Normalisierung mit PGK1. Statistische Unterschiede wurden, wie bereits für die anderen, weiter oben geschilderten Versuche, mittels des Wilcoxon-Tests berechnet. Die Auswertung ergab für die viralen Transkripte E4 und E7 eine erwartet hohe Signifikanz zwischen HPV-positiven und HPV-negativen Proben (p = 0,0002). Auch für die Expression des CDKN2A Gens war ein signifikanter Unterschied zwischen diesen Gruppen festzustellen (p = 0,00029). Auch zwischen den beiden HPV-positiven Gruppen (Progressoren/Nicht-Progressoren) war für E4 und für CDKN2A ein signifikanter Unterschied festzustellen (p = 0,02 bzw. p = 0,0053).
Diskussion
Mit den vorliegenden Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass die getesteten und untersuchten Gene nicht nur geeignete Surrogatmarker für das Vorliegen einer persistenten HPV-Infektion sind, sondern auch dass eine Veränderung der Genexpression der bestimmten Marker einen prognostischen Marker für die Entstehung von Gebärmutterhalskrebs und Krebsvorstufen wie Dysplasien darstellt.
So konnte anhand der oben dargestellten Versuche gezeigt werden, dass bspw. die Erhöhung der CDKN2A-, SERPINB5-, TMEM45A-RNA ein Marker für eine HPV-Infektion und ein Marker für die Prognose zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs ist. Weitere Kandidaten aus der in Tabelle 1 dargestellten Markerliste befinden sich gegenwärtig in der Testung.
Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung der Menge an E6/E7 RNA, bzw. eine Erhöhung der frühen viralen Transkription (E4 Primer) einen prognostischen Marker für die Progression von persistent HPV16 infizierten Menschen darstellt. Die hierbei geeigneten Primerpaare sind im 3'-Bereich der frühen viralen Transkription lokalisiert, so dass sich zusätzlich zu den E6/E7 Transkripten auch E1^E4 Transkripte nachweisen lassen. SEQUENZ PROTOKOLL

Claims

Verwendung von diagnostischen Markern zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV) und/oder zum Nachweis einer persistierenden Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV), wobei die Marker ausgewählt sind aus zumindest einem der in Tabelle 1 gezeigten diagnostischen Marker.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die in Tabelle 2 aufgeführten Marker.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch die Bestimmung der Genexpression der diagnostischen Marker erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch den Nachweis von mRNA-Transkripten von zumindest einem der diagnostischen Marker erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der mRNA-Transkripte über eine quantitative RT-PCR (Real Time (Echtzeit) Polymerase-Ketten-Reaktion) erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur quantitativen RT-PCR zumindest ein PCR-Nachweisprimer eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden: (a) ein in Tabelle 3 aufgeführter PCR-Nachweisprimer oder dessen komplementärer Strang; (b) PCR-Nachweisprimer, die unter stringenten Bedingungen an die in (a) definierten PCR-Nachweisprimer hybridisieren, oder Fragmente davon; und (c) PCR-Nachweisprimer, die eine Sequenzhomologie von mindestens 80% zu den in (a) definierten PCR-Nachweisprimern besitzen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch den Nachweis der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch den Nachweis von einem der in der Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der die Vorhersage durch den Nachweis von einer Kombination aus zwei oder mehreren der in Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage im Vergleich zu mindestens einem den folgenden Markern erfolgt: a) dem/den getesteten Markern entsprechenden Markern aus einer entsprechenden HPV-negativen menschlichen Probe; b) dem/den getesteten Markern entsprechenden Markern aus einer HPV-positiven, nicht-progressiven menschlichen Probe; und/oder c) Referenzmarker, die auf konstantem Level in verschiedenen menschlichen Gewebe/Flüssigkeiten vorkommen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch den Nachweis einer Veränderung, insbesondere einer Herunter- und/oder Hochregulierung, der Genexpression der diagnostischen Marker im Vergleich zu der Genexpression von zumindest einem der Marker a) bis c) erfolgt: a) dem/den getesteten diagnostischen Markern entsprechenden Markern aus einer entsprechenden HPV-negativen menschlichen Probe; b) dem/den getesteten diagnostischen Markern entsprechenden Markern aus einer HPV-positiven, nicht-progressiven menschlichen Probe; und/oder c) Referenzmarker, die auf konstantem Level in verschiedenen menschlichen Gewebe/Flüssigkeiten vorkommen.
Verfahren zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV) und/oder zum Nachweis einer persistierenden HPV-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass es den Schritt des Nachweisens von zumindest einem der in Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker oder Fragmente davon in einer von dem Menschen isolierten Probe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Nachweisens über die Bestimmung der Genexpression der diagnostischen Marker in der isolierten Probe erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Nachweisens über die Bestimmung der Transkripte der diagnostischen Marker und/oder der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis der diagnostischen Marker ein PCR-Nachweisprimer eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus den in der Tabelle 2 aufgeführten Sequenzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: (a) Isolieren von mRNA aus einer von dem Menschen enthaltenen Probe; (b) Umschreiben der in Schritt (a) isolierten mRNA in cDNA; (c) In-Kontakt-Bringen der in Schritt b) gewonnenen cDNA Probe mit zumindest einem PCR-Nachweisprimer, das ausgewählt ist aus den in der Tabelle 3 aufgeführten PCR-Nachweisprimern; (d) Durchführen einer quantitativen RT-PCR zur Herstellung von Amplifizierungsprodukten der in cDNA umgeschriebnen Transkripte der diagnostischen Marker; und (e) Bestimmung der in Schritt (d) gewonnenen Amplifizierungsprodukte.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es den zusätzlichen Schritt (f) aufweist: (f) Abgleichen der in Schritt (e) bestimmten Amplifizierungsprodukte mit diesen entsprechenden Amplifizierungsprodukten von entsprechenden Vergleichsmarkern aus einer HPV-negativen entsprechenden menschlichen Probe und/oder einer entsprechenden HPV-positiven, aber nicht-progressiven menschlichen Probe, wobei eine Veränderung, insbesondere eine Herunter- und/oder Hochregulierung, der Genexpression der diagnostischen Marker im Vergleich zu den Vergleichsmarkern die Prädisposition eines Menschen, Gebärmutterhalskrebs zu entwickeln, zeigt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass parallel zum Nachweis der diagnostischen Marker Referenzmarker nachgewiesen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Biopsie-, eine Zervixzellenprobe und/oder ein Papanicolaou-Abstrich ist.
PCR-Nachweisprimer zum Nachweis von zumindest einem der in Tabelle 2 dargestellten diagnostischen Marker, wobei der PCR-Nachweisprimer ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden: (a) ein in Tabelle 3 aufgeführter PCR-Nachweisprimer oder dessen komplementärer Strang; (b) PCR-Nachweisprimer, die unter stringenten Bedingungen an die in (a) definierten PCR-Nachweisprimer hybridisieren, oder Fragmente davon; und (c) PCR-Nachweisprimer, die eine Sequenzhomologie von mindestens 80%, vorzugsweise von mindestens 85%, 90%, 95%, 98% zu den in (a) definierten PCR-Nachweisprimern besitzen und mit denen die diagnostischen Marker ebenfalls nachgewiesen werden können.
Kit zur Durchführung einer der in den Ansprüchen 12 bis 20 beanspruchten Verfahren, wobei der Kit zumindest einen PCR-Nachweisprimer gemäß Anspruch 21 enthält.
Kit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass er die in Tabelle 3 paarweise aufgeführten PCR-Nachweisprimerpaare aufweist oder PCR-Nachweisprimerpaare, die unter stringenten Bedingungen an die in der Tabelle 3 aufgeführten PCR-Nachweisprimerpaare hybridisieren, oder Fragmente davon.
Kit nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass er ferner PCR-Nachweisprimer zum Nachweis eines Referenzmarkers enthält.
Kit nach Anspruch 24, Verfahren nach Anspruch 18, oder Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzmarker ausgewählt sind aus zumindest einem von N-Acylsphingosin-Amidhydrolase 1, HIG1 Domain Family Member 1A (Hypoxie-induzierbares Gen 1), Stress-assoziiertes Endoplasmatisches Retikulum-Protein 1, Phosphoglyceratkinase, bzw. Genexpressionsprodukte davon.