JP5693895B2 - 子宮頸がん検査用マーカー及び子宮頸がんの検査方法 - Google Patents
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Description
1.MIK1、MIK2及びMIK3から選択されるいずれかの遺伝子を含む子宮頸がん検査用マーカー。
2.遺伝子が、MIK1及びMIK2についてはプロモーター領域のCpG領域におけるDNAがメチル化された遺伝子からなり、MIK3についてはプロモーター領域のCpG領域におけるDNAが脱メチル化された遺伝子からなるものである、前項1に記載の子宮頸がん発症高検査用マーカー。
3.さらに、RARB、FHIT、TERC、p16、TIMP3、CDH1、GSTP1、MGMT、MLH1、PTENから選択される少なくとも2種の遺伝子を含む、前項1又は2に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
4.前項2に記載の各遺伝子が、プロモーター領域のCpG領域におけるDNAがメチル化された遺伝子からなる、前項3に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
5.子宮頸がん検査用マーカーが、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測するマーカーである、前項1〜4のいずれか1に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
6.被検者から取得した検体から、前項1〜5のいずれか1に記載の子宮頸がん検査用マーカーを検出することを特徴とする、子宮頸がんの検査方法。
7.以下の工程を含む、子宮頸がんの検査方法:
1)被検者から取得した検体から、DNAを抽出する工程;
2)抽出したDNAについて、前項1〜5のいずれか1に記載の子宮頸がん検査用マーカーを構成するDNAを増幅しうるプライマーを用いて、DNAを増幅させる工程;
3)増幅産物を検出する工程。
8.子宮頸がんの検査が、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測する検査である、前項6又は7に記載の子宮頸がんの検査方法。
9.各遺伝子マーカー検出用のプライマーを含む、子宮頸がん検査用キット。
プライマー1:5'-GTCGGTAGCGCGTTTCGTTC(配列番号1)
プライマー2:5'-GACGACGACGCGACTATAC(配列番号2)
プライマー3:5'- GAGTTGGTAGTGTGTTTTGTTT(配列番号3)
プライマー4:5'- CACTCACAAAACACTCAACA(配列番号4)
一方、プライマー3(配列番号3)とプライマー4(配列番号4)はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もしメチル化シトシンが存在しないならばこれらのプライマーにより、122bpの増幅産物が得られる。
プライマー5:5'- GGATATTTGGCGTTTTCGATTC(配列番号5)
プライマー6:5'- GAACGCTTCGAAACACCG(配列番号6)
プライマー7:5'- GGATATTTGGTGTTTTTGATTT(配列番号7)
プライマー8:5'- ACAAACACTTCAAAACACCA(配列番号8)
一方、プライマー7(配列番号7)とプライマー8(配列番号8)はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もしメチル化シトシンが存在しないならば、これらのプライマーにより、100bpの増幅産物が得られる。
プライマー9:5'- ATTTTTCGGTTTTGCGTGGGTC(配列番号9)
プライマー10:5'- ACCCAACTCCACGCCCCG(配列番号10)
プライマー11:5'- TATTTTTTGGTTTTGTGTGGGTT(配列番号11)
プライマー12:5'- CCCAACTCCACACCCCA(配列番号12)
一方、プライマー11(配列番号11)とプライマー12(配列番号12)はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もしメチル化シトシンが存在しないならば、これらのプライマーにより脱メチル化を検出する122bpの増幅産物が得られる。
本実施例では、ヒト子宮頸がん細胞株9種について、HPV感染の有無を確認し、各細胞株におけるがん関連遺伝子10種について、CpG領域のDNAメチル化状態を、メチル化特異的PCR法で解析した。ヒト子宮頸がん細胞株としては、CX−8、CX−1、CX−6、EM−1、EM−2、CX−7、CX−2、CX−5、CX−3を用い、遺伝子としてはRARB、FHIT、TERC、p16、TIMP3、CDH1、GSTP1、MGMT、MLH1、PTENについて解析を行なった。
実施例では、実施例1で用いたヒト子宮頸がん細胞株9種について、3種のエピジェネティクスマーカーMIK1及びMIK2の遺伝子についてはメチル化を、MIK3遺伝子については脱メチル化について確認した。
プライマー1:5'-GTCGGTAGCGCGTTTCGTTC(配列番号1)
プライマー2:5'-GACGACGACGCGACTATAC(配列番号2)
プライマー3:5'- GAGTTGGTAGTGTGTTTTGTTT(配列番号3)
プライマー4:5'- CACTCACAAAACACTCAACA(配列番号4)
プライマー5:5'- GGATATTTGGCGTTTTCGATTC(配列番号5)
プライマー6:5'- GAACGCTTCGAAACACCG(配列番号6)
プライマー7:5'- GGATATTTGGTGTTTTTGATTT(配列番号7)
プライマー8:5'- ACAAACACTTCAAAACACCA(配列番号8)
プライマー9:5'- ATTTTTCGGTTTTGCGTGGGTC(配列番号9)
プライマー10:5'- ACCCAACTCCACGCCCCG(配列番号10)
プライマー11:5'- TATTTTTTGGTTTTGTGTGGGTT(配列番号11)
プライマー12:5'- CCCAACTCCACACCCCA(配列番号12)
本実施例では、子宮頸がん7症例から採取した膣洗浄液について、3種のエピジェネティクスマーカーMIK1及びMIK2各遺伝子のメチル化、並びにMIK3の脱メチル化を確認した。
本実施例では、子宮頸部細胞診71株のうち、異常を認めた23症例について、3種のエピジェネティクスマーカーについてメチル化の有無を確認した。各検体は全てHPV感染を認めた。
Claims (9)
- MIK2遺伝子のプロモーター領域のCpG領域におけるDNAがメチル化された遺伝子を含む子宮頸がん検査用マーカー。
- さらに、MIK1遺伝子のプロモーター領域のCpG領域におけるDNAがメチル化された遺伝子及び/又はMIK3遺伝子のプロモーター領域のCpG領域におけるDNAが脱メチル化された遺伝子を含む、請求項1に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
- さらに、RARB、FHIT、TERC、p16、TIMP3、CDH1、GSTP1、MGMTから選択される少なくとも2種の遺伝子のプロモーター領域のCpG領域におけるDNAがメチル化された遺伝子を含む、請求項1又は2に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
- 子宮頸がん検査用マーカーが、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測するマーカーである、請求項1〜3のいずれか1に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
- 以下の工程を含む、子宮頸がんの発症リスク予測のための子宮頸がんの検査方法:
1)被検者から取得した検体から、DNAを抽出する工程;
2)抽出したDNAについて、請求項1に記載のMIK2遺伝子に係る子宮頸がん検査用マーカーを構成するDNAを増幅しうるプライマーを用いて、DNAを増幅させる工程;
3)増幅産物を検出する工程。 - 請求項5の1)に記載の、被検者から取得した検体から抽出したDNAについて、さらに以下の工程を含む、請求項5に記載の子宮頸がんの検査方法:
a)前記抽出したDNAについて、請求項2に記載のMIK3遺伝子に係る子宮頸がん検査用マーカーを構成するDNAを増幅しうるプライマーを用いて、DNAを増幅させる工程;
b)増幅産物を検出する工程。 - 請求項5の1)に記載の、被検者から取得した検体から抽出したDNAについて、さらに以下の工程を含む、請求項5又は6に記載の子宮頸がんの検査方法:
a’)前記抽出したDNAについて、請求項2に記載のMIK1遺伝子に係る子宮頸がん検査用マーカーを構成するDNAを増幅しうるプライマーを用いて、DNAを増幅させる工程;
b’)増幅産物を検出する工程。 - 下記配列番号5〜8のいずれかに示す塩基配列からなるプライマーを2種以上含む、請求項5に記載の検査方法に使用するための子宮頸がん検査用キット:
プライマー5:5'- GGATATTTGGCGTTTTCGATTC(配列番号5);
プライマー6:5'- GAACGCTTCGAAACACCG(配列番号6);
プライマー7:5'- GGATATTTGGTGTTTTTGATTT(配列番号7);
プライマー8:5'- ACAAACACTTCAAAACACCA(配列番号8)。 - さらに、下記配列番号1〜4のいずれかに示す塩基配列からなるプライマーを2種以上、及び/又は下記配列番号9〜12のいずれかに示す塩基配列からなるプライマーを2種以上含む、請求項6又は7に記載の検査方法に使用するための子宮頸がん検査用キット:
プライマー1:5'-GTCGGTAGCGCGTTTCGTTC(配列番号1);
プライマー2:5'-GACGACGACGCGACTATAC(配列番号2):
プライマー3:5'- GAGTTGGTAGTGTGTTTTGTTT(配列番号3):
プライマー4:5'- CACTCACAAAACACTCAACA(配列番号4):
プライマー9:5'- ATTTTTCGGTTTTGCGTGGGTC(配列番号9):
プライマー10:5'- ACCCAACTCCACGCCCCG(配列番号10):
プライマー11:5'- TATTTTTTGGTTTTGTGTGGGTT(配列番号11):
プライマー12:5'- CCCAACTCCACACCCCA(配列番号12)。
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