CN118086498A - 用于诊断肺癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断肺癌的方法。具体地，本发明涉及用于通过分析源自受试者的生物样品鉴定所述受试者的肺癌的方法。更具体地，本发明涉及通过分析来自血浆样品的DNA鉴定肺癌。该方法是基于正常和肺癌DNA之间DNA甲基化的差异。提供了用于基于在选择的基因组基因座处DNA甲基化的改变鉴定受试者的肺癌的方法和试剂盒。

Description

用于诊断肺癌的方法
本申请是申请日为2018年05月02日，申请号为201810410227.1，发明名称为“用于诊断肺癌的方法”的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于通过分析源自受试者的生物样品鉴定所述受试者的肺癌的方法。更具体地，本发明涉及通过分析来自血浆样品的DNA鉴定肺癌。该方法是基于正常和肺癌DNA之间DNA甲基化的差异。
发明背景
肺癌是起因于肺细胞的癌症，是最常见和最严重的癌症类型之一。肺癌有两种主要类型，即非小细胞肺癌(NSCLC)(最常见的类型)和小细胞肺癌。NSCLC有几种亚型，包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。
肺癌的一般预后很差，因为肺癌通常不引起明显的症状，直到传遍肺，且有时也扩散到身体的其他部位。有效的早期检测方法可以导致改善后果，然而没有可以用于早期诊断的很好的肺癌筛查方法，特别是在出现症状之前。
已经研究了三种筛查测试以确定它们是否能够降低肺癌的死亡率：胸部低剂量计算机断层扫描(CT)、胸部X光和痰细胞学。在所测试的方法中，只有对高风险个体(重度吸烟者)的低剂量CT筛查显示降低肺癌死亡率。然而，CT扫描，即使在低剂量，也会使胸部暴露于辐射。另外，低剂量CT扫描发现的许多异常证明不是癌症，而是仍需要用更多的CT扫描和另外的测试来检查，其中一些是侵入性的。
肺癌的明确诊断是基于对活检后可疑组织的组织学检查。该程序涉及支气管镜检查或CT引导的活检以取样可疑组织。
属于本发明的申请人的WO 2011/001274和WO 2011/070441，分别公开了基于特定基因组基因座之间的信号比率，鉴定来自天然来源的DNA的方法和将DNA样品分类成不同类型的组织的方法。
本发明的申请人的WO 2017/006317，公开了用于基于在选择的基因组基因座处DNA甲基化的改变鉴定受试者的膀胱癌的方法和试剂盒。
对于用于非侵入性地筛选和诊断有相应需要的受试者的肺癌而不要求良好训练的病理学家且具有高特异性和高灵敏度特征的改进的方法和试剂盒存在未被满足的需要。
发明概述
根据一些方面，本发明提供了用于通过分析来自血浆样品的DNA鉴定有相应需要的受试者的肺癌的方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒基于在正常DNA和肺癌DNA之间在选择的基因组基因座处的甲基化差异。
更具体地，本发明的方法和试剂盒利用一组基因组基因座，该组基因组基因座被出乎意料地发现在来自肺癌患者的血浆样品的DNA中被高度甲基化，并且在来自健康受试者的血浆样品的DNA中未被高度甲基化。从而，本文公开的一组基因组基因座可以用于确定给定的血浆样品是来自肺癌患者还是来自健康受试者。
根据本发明的方法和试剂盒，用至少一种甲基化敏感性限制性酶消化来自测试的受试者的血浆样品的DNA，只有在DNA未被甲基化时该甲基化敏感性限制性酶才裂解其识别序列。本文公开的被称为“限制性基因座”的基因组基因座的组包括至少一种甲基化敏感性限制性酶的识别序列，并且因此根据其甲基化水平而被切割(消化)，其中较高程度的甲基化导致较少的酶消化。出乎意料地，来自健康个体的DNA样品在本文公开的基因组基因座的组处比来自癌症患者的DNA样品更彻底地被切割。因此，在其中本发明的限制性基因座被高度甲基化的DNA样品和其中这些基因座具有低甲基化水平的DNA样品之间消化效率的差异，确立了在随后的扩增步骤和定量步骤中的不同扩增模式。出乎意料地，扩增模式的差异允许区分来自肺癌患者的DNA和来自无肺癌的健康个体的DNA。
根据本发明的方法和试剂盒的扩增和定量步骤包括共扩增来自被消化的DNA的至少一种限制性基因座和对照基因座。对照基因座可以是不被消化步骤中使用的甲基化敏感性限制性酶切割的基因座。然后确定扩增的基因座的信号强度并计算每个限制性基因座和对照基因座的信号强度之间的比率。现在第一次公开了，来自肺癌患者的DNA和来自健康个体的DNA产生不同的信号比率，因此使得能够鉴定肺癌。
通过将计算的来自测试的受试者的DNA的信号比率与确定的已知来源即正常个体和/或癌症患者中的相同限制性和对照基因座的一种或更多种参考比率比较，来进行肺癌的鉴定。基于该比较，将测试的样品鉴定为源自癌症患者或源自健康受试者。应注意的是，本发明的试剂盒和方法绝不需要确定个体基因座本身的甲基化水平。
本发明的方法和试剂盒使得能够通过测试血浆样品鉴定肺癌，从而有利地提供了非侵入性、基于分子的疾病诊断。请求保护的方法和试剂盒的另一种益处是，尽管血浆样品可包含少量的源自肿瘤的DNA，可以在血浆样品中进行鉴定。通过本文公开的方法和试剂盒诊断肺癌所赋予的另外的益处是诊断的高灵敏度和特异性。另外，本文描述的方法产生了不依赖使用者的客观结果。
根据一个方面，本发明提供了一种用于鉴定人受试者的肺癌的方法，该方法包括：
(a)将来自从受试者获得的血浆样品的DNA应用于通过至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化，以获得限制性内切核酸酶处理的DNA；
(b)从所述限制性内切核酸酶处理的DNA共扩增包含SEQ ID NO:4中列出的基因座的至少一种限制性基因座和对照基因座，从而生成每种基因座的扩增产物；
(c)确定每种生成的扩增产物的信号强度；
(d)计算所述至少一种限制性基因座的每一种和对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率；以及
(e)检测所述比率关于肺癌比率的高概率评分，从而鉴定人受试者的肺癌。
在一些实施方案中，检测所述比率关于肺癌比率的高概率评分包括检测高于预先定义的阈值的关于肺癌比率的概率评分。
在一些实施方案中，至少一种限制性基因座还包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中列出的基因座的组的至少一种另外的限制性基因座，并且所述概率评分为所述SEQ ID NO:4的比率以及所述至少一种另外的限制性基因座的至少一种另外的比率关于肺癌比率的组合概率评分。
在一些实施方案中，至少一种另外的限制性基因座包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中列出的所有基因座，并且所述组合概率评分为SEQ ID NO:4的比率、SEQ ID NO:1的比率、SEQ ID NO:2的比率、SEQ ID NO:3的比率、SEQID NO:5的比率和SEQ ID NO:6的比率关于肺癌比率的组合概率评分。
因此，在一些实施方案中，至少一种限制性基因座包括SEQ ID NO:1-6中列出的基因座。
在一些实施方案中，方法还包括：提供第一对照DNA和第二对照DNA，所述第一对照DNA和所述第二对照DNA各自包括人细胞系来源的DNA，其中所述第一对照DNA包括来自其中本文公开的至少一种限制性基因座大部分被甲基化的人细胞系的DNA，且所述第二对照DNA包括来自其中本文公开的至少一种限制性基因座的一种或更多种大部分未被甲基化的人细胞系的DNA；用所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化所述第一对照DNA和所述第二对照DNA；以及从所述第一对照DNA和所述第二对照DNA扩增所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座；其中所述第一对照DNA中所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座的充分扩增的检测指示成功的DNA扩增，且其中所述第二对照DNA中所述至少一种限制性基因座的一种或更多种的低扩增或不扩增伴随所述对照基因座的正常扩增指示成功的DNA消化。
在一些实施方案中，其中所述至少一种限制性基因座大部分被甲基化的人细胞系是HCT-15。
在一些实施方案中，所述其中一种或更多种限制性基因座大部分未被甲基化的人细胞系是A673。
在一些实施方案中，所述其中所述至少一种限制性基因座大部分被甲基化的人细胞系是HCT-15，且其中一种或更多种限制性基因座大部分未被甲基化的人细胞系是A673。
在一些实施方案中，至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶选自由以下组成的组：AatII、Acc65I、AccI、Acil、ACII、Afel、Agel、Apal、ApaLI、AscI、AsiSI、Aval、AvaII、BaeI、BanI、BbeI、BceAI、BcgI、BfuCI、BglI、BmgBI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BseYI、BsiEI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspDI、BsrBI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstAPI、BstBI、BstUI、BstZl7I、Cac8I、ClaI、DpnI、DrdI、EaeI、EagI、Eagl-HF、EciI、EcoRI、EcoRI-HF、FauI、Fnu4HI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HincII、Hinfl、HinP1I、HpaI、HpaII、Hpyl66ii、Hpyl88iii、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、MmeI、MspAlI、MwoI、NaeI、NacI、NgoNIV、Nhe-HFI、NheI、NlaIV、NotI、NotI-HF、NruI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PleI、PmeI、PmlI、PshAI、PspOMI、PvuI、RsaI、RsrII、SacII、Sall、SalI-HF、Sau3AI、Sau96I、ScrFI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TfiI、TscI、TseI、TspMI和ZraI。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，步骤(a)使用一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶进行。在一些实施方案中，甲基化敏感性限制性内切核酸酶是HinP1I。在另外的实施方案中，甲基化敏感性限制性内切核酸酶是HhaI。
在一些实施方案中，对照基因座是缺乏甲基化敏感性限制性内切核酸酶的识别序列的基因座。
在一些实施方案中，对照基因座是SEQ ID NO:7中列出的基因座。
在一些实施方案中，步骤(b)利用实时PCR进行。
在一些实施方案中，步骤(b)利用实时PCR进行，并且该方法还包括添加荧光探针用于特异性地检测至少一种限制性基因座和至少一种对照基因座的扩增产物。
在一些实施方案中，步骤(b)利用实时PCR进行，并且所述计算所述至少一种限制性基因座的每一种和对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率包括确定每种基因座的定量循环(Cq)和计算2(Cq对照基因座-Cq限制性基因座)。在一些实施方案中，相应的肺癌参考比率为2(Cq参考DNA中的对照基因座-Cq参考DNA中的限制性基因座)，其中参考DNA是肺癌DNA。
在一些实施方案中，该方法包括提供源自健康受试者的DNA中的至少一种限制性基因座和对照基因座的扩增产物的信号强度之间的健康参考比率。
在另外的实施方案中，该方法包括提供源自患有肺癌的受试者的DNA中的所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座的扩增产物的信号强度之间的肺癌参考比率。
在一些实施方案中，该方法还包括检测所述比率关于健康比率的低概率评分。
在一些实施方案中，所述肺癌选自由以下组成的组：非小细胞肺癌(NSCLC)亚型鳞状细胞癌、腺癌或大细胞癌，以及小细胞肺癌。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据另一方面，本发明提供了一种治疗有相应需要的受试者的肺癌的方法，该方法包括根据本发明的方法鉴定肺癌，以及向所述受试者施用抗肺癌疗法。
在一些实施方案中，所述抗肺癌疗法包括外科手术、射频消融(RFA)、放射疗法、化学疗法、靶向疗法和免疫疗法中的一种或更多种。
根据又另一方面，本发明提供了一种用于测量疑似患有肺癌的人受试者的DNA的甲基化比率的方法，该方法包括：(a)从受试者的血浆样品获得DNA；(b)使DNA经历用至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化以获得限制性内切核酸酶处理的DNA；(c)从限制性内切核酸酶处理的DNA共扩增包含SEQ ID NO:4中列出的基因座的至少一种限制性基因座和对照基因座，从而生成每种基因座的扩增产物；以及(d)利用计算机软件将所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座的信号强度的比率与健康DNA、肺癌DNA或二者中的所述基因座的参考比率比较，从而评估所述比率是否指示肺癌。
根据又另一方面，本发明提供了一种用于测量疑似患有肺癌的人受试者中的血浆DNA的甲基化比率的方法，该方法包括：(a)从受试者的血浆样品获得DNA；(b)使血浆DNA经历用至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化以获得限制性内切核酸酶处理的DNA；(c)从限制性内切核酸酶处理的DNA共扩增包含SEQ ID NO:4中列出的基因座的至少一种限制性基因座和对照基因座，从而生成每种基因座的扩增产物；以及(d)从扩增产物生成鉴定人类受试者血浆DNA的甲基化比率的数据。
在一些实施方案中，所述从扩增产物生成鉴定人类受试者血浆DNA的甲基化比率的数据包括通过计算2(Cq对照基因座-Cq限制性基因座)，其中Cq是定量循环，计算至少一种限制性基因座的扩增产物的信号强度与对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率。
本发明的这些和另外的方面和特征从以下的详细描述、实施例和权利要求将变的明显。
附图说明
图1A展示了来自健康受试者的样品中的对照基因座和两种限制性基因座的示例性扩增曲线。
图1B展示了来自肺癌患者的样品中的对照基因座和两种限制性基因座的示例性扩增曲线。
图2是描述根据本发明的一些实施方案的用于鉴定受试者的肺癌的方法的流程图。
发明详述
本发明涉及使用来自血浆样品的DNA，基于检测确定的基因座处的DNA甲基化的改变鉴定肺癌。
本发明包括计算在用至少一种甲基化敏感性限制性酶消化DNA后从测试DNA样品共扩增的选择的基因座之间的信号强度比率，并将这些比率与一种或更多种参考比率比较，该一种或更多种参考比率从源自已知来源的健康或肺癌的多于一个(a plurality of)DNA样品获得。基于该比较，将测试的样品鉴定为源自癌症患者或源自健康受试者。
如本文使用的，术语“多于一个/种(a plurality of)”指‘至少两个/种’或‘两个/种或更多个/种’。
本发明的方法是特别地有益的，因为它们提供了用于诊断肺癌的非侵入性并且不依赖使用者的高度灵敏且特异的手段。令人惊讶的是，尽管血浆样品含有少量的肿瘤来源的DNA的事实，本文公开的方法和试剂盒提供了基于血浆中的DNA的对肺癌的准确诊断。
此外，与利用甲基化分析来区分肿瘤来源的DNA和正常DNA的常规方法(其要求确定特定基因组基因座处的实际甲基化水平)相比，本文描述的方法不要求评价绝对甲基化水平。因此本文公开的方法消除了对在确定甲基化水平本身中涉及的标准曲线和/或另外的费力步骤的需要，从而提供了简单且有成本效益的程序。通过本发明的方法获得的信号比率赋予了超过用于分析甲基化的已知方法的另外的优势，该信号比率在相同的反应混合物中(即，在相同的反应条件下)从相同的DNA模板扩增的基因座之间计算。这致使该方法对多种“噪音”因素诸如模板DNA浓度、PCR条件的改变和抑制剂的存在不敏感。此类噪音则是基于通过比较来自不同扩增反应的信号来定量基因座的甲基化水平的现有方法固有的。
人基因组中的甲基化以5-甲基胞嘧啶的形式存在，并且局限于为也被称为CpG二核苷酸的序列CG的一部分的胞嘧啶残基(为其他序列的一部分的胞嘧啶残基不被甲基化)。人基因组中的一些CG二核苷酸被甲基化，并且其他的不被甲基化。另外，甲基化是细胞和组织特异性的，以使得特定的CG二核苷酸在特定细胞中可被甲基化并且同时在不同的细胞中未被甲基化，或者在特定组织中被甲基化并且同时在不同的组织中未被甲基化。DNA甲基化是基因转录的重要调节器。
癌症DNA的甲基化模式与正常DNA的甲基化模式不同，其中一些基因座被高甲基化，而另一些被低甲基化。这种异常甲基化模式可以在体液诸如血浆中的肿瘤来源的DNA中检测到，促进了非侵入性、‘液体活检’类型测定的开发，用于早期检测、伴随诊断(companion diagnostics)、监测对治疗的响应、检测复发和预后。然而，体液也含有大量来自正常细胞的DNA，且因此为了使液体活检测定有效，它应该能够在数量多得多的正常的DNA分子背景上检测到少量肿瘤来源的DNA。本发明有利地提供了用于检测与肺癌相关的高甲基化基因组基因座的方法。该方法是基于用甲基化敏感性酶对DNA进行酶促消化，随后对高甲基化的靶基因座和内部参考基因座进行实时PCR，并精确定量从两种基因座获得的信号之间的比率。本文公开的方法在鉴定来自患有肺癌的受试者的血浆样品方面是高度灵敏且特异性的。
在一些实施方案中，提供了一种用于鉴定受试者的肺癌的方法，该方法包括：(a)用至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化来自从受试者获得的血浆样品的DNA；(b)至少扩增消化的DNA样品中的SEQ ID NO:4中列出的限制性基因座和对照基因座，其中对照基因座为在肺癌DNA中和在正常DNA中表现出相同的消化和扩增图谱的基因座，从而生成所述DNA样品中的每种基因座的扩增产物；(c)确定每种生成的扩增产物的信号强度；(d)计算所述DNA样品中的限制性基因座和对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率；以及(e)检测所述比率关于肺癌比率的高概率评分，从而鉴定人受试者的肺癌。
在一些实施方案中，检测所述比率关于肺癌比率的高概率评分包括检测高于预先定义的阈值的概率评分。
在一些实施方案中，本发明的方法包括计算测试的DNA样品的信号比率并将计算的信号比率与相应的健康参考比率、肺癌参考比率或两者进行比较，并基于该比较将测试的DNA样品鉴定为肺癌DNA样品。
在一些实施方案中，检测关于肺癌比率的高概率评分包括将该比率与相应的健康参考比率比较，以及基于该比较分配反映该比率是肺癌比率(即代表肺癌)的概率的概率评分，其中高概率评分指示肺癌。
在另外的实施方案中，检测关于肺癌比率的高概率评分包括将该比率与相应的肺癌参考比率比较，以及基于该比较分配反映该比率是肺癌比率的概率的概率评分，其中高概率评分指示肺癌。
在又另外的实施方案中，检测关于肺癌比率的高概率评分包括将该比率与相应的健康参考比率和相应的肺癌参考比率比较，以及基于该比较分配反映该比率是肺癌比率的概率的概率评分，其中高概率评分指示肺癌。
因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括提供以下的至少一种：健康参考比率和肺癌参考比率。
在一些实施方案中，步骤(e)包括将该比率与参考标度(a reference scale)比较，该参考标度包括在肺癌患者中和/或在健康个体中确定的比率，其中所述概率评分为基于所述比率在参考标度内的相对位置分配给所述比率的评分。在一些实施方案中，比率的值越高，分配至其的评分越高。
在一些实施方案中，该方法还包括在步骤(b)中扩增至少一种另外的限制性基因座，从而生成该至少一种另外的限制性基因座的扩增产物；以及针对每种另外的限制性基因座重复步骤(c)-(d)。在一些实施方案中，在步骤(e)中，获得多于一个比率关于相应的肺癌比率的多于一个的个体概率评分，其中每个比率为在不同的限制性基因座和对照基因座之间。组合概率评分基于该多于一个的概率评分计算。
在一些实施方案中，组合评分可以是平均评分。在其他实施方案中，组合评分可以是个体概率评分的加权平均值。在一些实施方案中，组合评分可以是所有个体概率评分的和。通常，组合评分可以包括代表所有个体概率评分的任何数学或统计值。
在一些实施方案中，检测到高组合概率评分鉴定出人受试者的肺癌。在一些实施方案中，检测到高组合概率评分为检测到高于预先定义的阈值的组合概率评分。
术语“来自......的DNA”、“源自......的DNA”、“......内的DNA”等可互换，并且指从血浆样品获得的DNA、从血浆样品分离的DNA或血浆样品本身，即其中含有DNA的血浆样品。
术语“肺癌”指起因于肺中的细胞的恶性肿瘤。如本文使用的肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)(鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌亚型)以及小细胞肺癌。除了类型之外，肺癌通常还通过基于例如活检染色和/或成像的阶段来表征，包括I期、II期、III期和IV期。
在一些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在一些具体实施方案中，非小细胞肺癌是鳞状细胞癌。在另外的具体实施方案中，非小细胞肺癌是腺癌。在又另外的具体实施方案中，非小细胞肺癌是大细胞癌。在其他实施方案中，肺癌是小细胞肺癌。
如本文使用的，术语“肺癌的鉴定”、“鉴定受试者的肺癌”和“将受试者鉴定为患有肺癌”可互换，并且包括以下的任一种或更多种：筛选肺癌、检测肺癌的存在、检测肺癌的复发、检测对肺癌的易感性、检测对肺癌治疗的响应、确定对肺癌的治疗有效性、确定肺癌的阶段(严重度)、确定肺癌的预后以及受试者的肺癌的早期诊断。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
如本文使用的，术语“受试者”与“个体”可互换并且指人受试者。受试者可以疑似患有肺癌。在一些实施方案中，受试者可以例如基于疾病的既往史、遗传素质(geneticpredisposition)和/或家族史而处于发展肺癌的风险，可以是已经暴露于致癌物、职业危害、环境危害的任一种或更多种的受试者和/或表现出疑似临床癌症征象的受试者。在一些实施方案中，受试者可以显示出肺癌的至少一种症状或特征，包括例如，呼吸系统症状诸如咳嗽、咳血、喘息或气短，全身症状诸如体重减轻、虚弱和发热，以及由于癌症块压迫邻近结构引起的症状诸如胸痛、骨痛或吞咽困难。在其他实施方案中，受试者可以是无症状的。
血浆样品收集和处理
术语“血浆”是指在全血样品经历分离过程以除去血细胞之后剩余的液体。血浆样品可以是使用任何分离方法从全血分离的样品，所述分离方法包括例如通过离心和/或过滤。可以利用常规收集容器或管收集血浆样品。
在一些实施方案中，可以根据本领域已知方法从血浆样品提取基因组DNA。示例性程序被描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2012中。
DNA消化
根据本发明的方法，使来自血浆样品的DNA经历用至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化，例如用一种、两种、三种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，从血浆样品提取的全部DNA被用于消化步骤。在一些实施方案中，在经历消化之前，未对DNA定量。在其他实施方案中，在DNA的消化之前，可以对其定量。
本文使用的“限制性内切核酸酶”与“限制性酶”可互换使用，指在或靠近被称为限制性位点的特异性识别核苷酸序列处切割DNA的酶。
“甲基化敏感性”限制性内切核酸酶是只有在其识别序列未被甲基化时才裂解其识别序列(而被甲基化的位点则保持完整)的限制性内切核酸酶。因此，DNA样品被甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化的程度取决于甲基化水平，其中较高的甲基化水平保护免于裂解并且相应地导致较少的消化。
在一些实施方案中，至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶可以选自由以下组成的组：AatII、Acc65I、AccI、Acil、ACII、Afel、Agel、Apal、ApaLI、AscI、AsiSI、Aval、AvaII、BaeI、BanI、BbeI、BceAI、BcgI、BfuCI、BglI、BmgBI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BseYI、BsiEI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspDI、BsrBI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstAPI、BstBI、BstUI、BstZl7I、Cac8I、ClaI、DpnI、DrdI、EaeI、EagI、Eagl-HF、EciI、EcoRI、EcoRI-HF、FauI、Fnu4HI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HincII、Hinfl、HinP1I、HpaI、HpaII、Hpyl66ii、Hpyl88iii、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、MmeI、MspAlI、MwoI、NaeI、NacI、NgoNIV、Nhe-HFI、NheI、NlaIV、NotI、NotI-HF、NruI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PleI、PmeI、PmlI、PshAI、PspOMI、PvuI、RsaI、RsrII、SacII、Sall、SalI-HF、Sau3AI、Sau96I、ScrFI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TfiI、TscI、TseI、TspMI和ZraI。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，来自血浆样品的DNA可以经历用一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化。在一些具体实施方案中，甲基化敏感性限制性内切核酸酶可以是HinP1I。
在一些实施方案中，DNA消化可以进行至完全消化。在一些实施方案中，甲基化敏感性限制性内切核酸酶可以是HinP1I，并且完全消化可以在与酶在37℃孵育1至2个小时之后完成。
在一些实施方案中，血浆样品可以经历用一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化。在一些具体实施方案中，甲基化敏感性限制性内切核酸酶可以是HhaI。
在一些实施方案中，DNA消化可以进行至完全消化。在一些实施方案中，甲基化敏感性限制性内切核酸酶可以是HhaI，并且完全消化可以在与酶在37℃孵育1至2个小时之后完成。
基因组基因座的扩增
如本文使用的术语“基因组基因座”或“基因座”可互换并且指染色体上特定位置处的DNA序列。特定位置可以通过分子位置，即通过染色体上的起始碱基对和终止碱基对的编号来标识。如本文使用的，这些术语还包括特定位置的DNA序列连同紧邻所述DNA序列的上游和/或下游的多达约50个碱基的5'和/或3'侧翼序列。
在一些实施方案中，5’侧翼序列可以包含1-50个之间的碱基。在另外的实施方案中，5’侧翼序列为在10-40个之间的碱基。例如，5’侧翼序列可以包含紧邻基因座上游的多达10个碱基、多达15个碱基、多达20个碱基、多达25个碱基、多达30个碱基、多达35个碱基、多达40个碱基、多达45个碱基或多达50个碱基。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，3’侧翼序列可以包含1-50个之间的碱基。在另外的实施方案中，3’侧翼序列为在10-40个之间的碱基。例如，3’侧翼序列可以包含紧邻基因座下游的多达10个碱基、多达15个碱基、多达20个碱基、多达25个碱基、多达30个碱基、多达35个碱基、多达40个碱基、多达45个碱基或多达50个碱基。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
给定基因组位置处的DNA序列的变体被称为等位基因。基因座的等位基因位于同源染色体上的相同位点处。基因座包括基因序列以及其他遗传元件(例如，基因间序列)。
在本文“限制性基因座”被用于描述包含方法中使用的甲基化敏感性限制性酶的识别序列的基因座。
“对照基因座”和“内部参考基因座”可互换并且在本文用于描述其被消化步骤中应用的限制性酶的消化与癌症的存在或不存在无关的基因座。在一些实施方案中，对照基因座是在肺癌DNA中和在正常DNA中表现出相同的消化和扩增图谱的基因座。在一些实施方案中，对照基因座是缺乏消化步骤中应用的限制性酶的识别序列的基因座。有利地，对照基因座是内部基因座，即分析的DNA样品内的基因座，从而消除了对外部/另外的对照样品的需要。
在一些实施方案中，限制性基因座(the restriction locus or restrictionloci)包括如下的SEQ ID NO:1-6中列出的基因座中的任一个或更多个：
SEQ ID NO:1，开始于第5号染色体上的位置43030476(基因间区域)；
SEQ ID NO:2，开始于第2号染色体上的位置176712760(基因间区域)；
SEQ ID NO:3，开始于第17号染色体上的位置44151837(基因间区域)；
SEQ ID NO:4，开始于第1号染色体上的位置168907269，(PRRX1基因)；
SEQ ID NO:5，开始于第7号染色体上的位置158629293，(VIPR2基因)；
SEQ ID NO:6，开始于第7号染色体上的位置154860262(基因间区域)；
出乎意料地，本发明的发明人鉴定出SEQ ID NO:1-6中列出的限制性基因座在来自肺癌患者的血浆的DNA和来自健康受试者的血浆的DNA之间被不同地甲基化。更具体地，与正常非癌性DNA相比，在肺癌DNA(源自肺肿瘤的DNA)中这些基因座具有增加的甲基化。
与正常非癌性DNA相比，在肺癌DNA中这些基因座中的每一种包含被更多地甲基化的CG二核苷酸。有利地，被不同地甲基化的CG二核苷酸位于甲基化敏感性限制性酶的识别位点内。
在一些实施方案中，这些基因座的每一种可以包含甲基化敏感性限制性酶的至少一个限制性位点，其中CG二核苷酸在来自肺癌患者的血浆的DNA中比来自健康受试者的血浆的DNA中被更多地甲基化，这意味着与健康受试者的血浆相比，在癌症患者的血浆中更大量的DNA分子在该位置处被甲基化。在一些实施方案中，这些基因座的每一种可以包含至少一个HinP1I限制性位点(GCGC)。此类甲基化敏感性限制性酶只有在其识别序列未被甲基化时才裂解其识别序列。因此，包含较高百分比的其中限制性位点中的CG二核苷酸被甲基化的DNA分子的DNA样品与包含较高百分比的其中CG二核苷酸未被甲基化的DNA分子的DNA样品相比，将以较低的程度被消化。基于本文公开的方法，与来自正常(健康)个体的DNA相比，来自肺癌患者的血浆样品的DNA通过甲基化敏感性限制性酶的DNA消化较不彻底。出乎意料地发现，消化效率的差异确立了在随后的扩增和定量步骤中的不同扩增模式，该不同扩增模式使得能够区分来自肺癌患者的DNA和来自健康受试者的DNA。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-6中列出的基因座中的每一种可以包含另外的CG二核苷酸，该另外的CG二核苷酸的甲基化状态与测定无关或对测定无影响—只有在限制性酶(例如HinP1I)的识别序列处的甲基化是相关的。
在一些实施方案中，对照基因座是如SEQ ID NO:7中列出的，其对应于第7号染色体上的位置121380854-121380913(基因间区域)。
在一些实施方案中，也被称为内部参考基因座的对照基因座不包含限制性酶的识别序列。在一些实施方案中，当用甲基化敏感性限制性酶消化DNA样品时，对照基因座的序列保持完整，不管其甲基化状态如何。
在一些实施方案中，对照基因座的序列在肺癌DNA中和在正常DNA中表现出相同的消化和扩增谱。
在一些实施方案中，对照基因座包含SEQ ID NO:7中列出的基因座。在用甲基化敏感性限制性酶消化之后的对照基因座的扩增模式不受甲基化影响。
在下文中使用甲基化敏感性限制性酶HinP1I示例了使用SEQ ID NO:1-6中列出的限制性基因座区分肺癌患者的血浆样品和健康个体的血浆样品的优势。包括SEQ ID NO:1-6的每一种的限制性基因座和包括SEQ ID NO:7的对照基因座在用HinP1I消化后的扩增在来自癌症患者和健康个体的血浆DNA中进行。与对照组相比，在癌症组中，每种限制性基因座和对照基因座的扩增产物之间的信号比率的计算结果显示出显著较高的信号比率(高至少一个数量级)。
在一些实施方案中，方法包括在消化DNA样品后扩增至少一种限制性基因座和至少一种对照基因座。
如本文使用的，“至少一种(限制性/对照)基因座”可以包括单种基因座或多于一种的单独的基因座，以使得措辞诸如“包含SEQ ID NO:1中列出的基因座和SEQ ID NO:2中列出的基因座的至少一种限制性基因座”表示至少这两种单独的基因组基因座被扩增。
在一些实施方案中，方法包括扩增包含SEQ ID NO:4中列出的序列的限制性基因座和对照基因座以及任选地至少一种另外的限制性基因座。
在一些实施方案中，方法包括扩增包含SEQ ID NO:4中列出的序列的限制性基因座和包含SEQ ID NO:7中列出的序列的对照基因座。
在一些实施方案中，方法包括扩增多于一种限制性基因座(即，至少两种限制性基因座)和对照基因座。
在一些实施方案中，多于一种限制性基因座包括包含SEQ ID NO:4中列出的序列的限制性基因座和包含选自由以下组成的组的序列的至少一种另外的限制性基因座：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，多于一种限制性基因座包括包含SEQ ID NO:4中列出的序列的基因座且还包括包含选自由以下组成的组的序列的一种、两种、三种、四种、五种另外的限制性基因座：SEQ ID NO:1、2、3、5和6。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，多于一种限制性基因座包括包含SEQ ID NO:1-6中列出的序列的基因座。在一些实施方案中，多于一种限制性基因座由SEQ ID NO:1-6中列出的限制性基因座组成。在一些实施方案中，方法包括扩增如SEQ ID NO:1-6中列出的多于一种限制性基因座。
如本文使用的，“扩增”指一种或更多种感兴趣的特定核酸靶的拷贝数的增加。扩增通常通过聚合酶链式反应(PCR)在PCR反应混合物的存在下进行，该PCR反应混合物可以包括补充有DNA模板、聚合酶(通常地Taq聚合酶)、dNTP、引物和探针(视情况而定)的合适的缓冲液，如本领域已知的。
如本文使用的术语“多核苷酸”包括任何长度的聚合形式的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。本文还使用术语“寡核苷酸”以包括通常长度多达100个碱基的聚合形式的核苷酸。
“扩增产物”总体地指在扩增反应中生成并积累的特定靶序列的核酸分子。该术语通常指使用给定的扩增引物组通过PCR生成的核酸分子。
如本文使用的，“引物”定义了能够与靶序列退火(杂交)，从而产生可在适合的条件下作为DNA合成的起始点的双链区域的寡核苷酸。术语“引物对”在本文中指被选择为一起用于通过许多类型的扩增方法中的一种，优选地PCR，扩增选择的核酸序列的一对寡核苷酸。如本领域通常已知的，引物可以被设计为在选择的条件下与互补序列结合。
取决于特定的测定形式和特定需要，引物可以是任何合适的长度。在一些实施方案中，引物可以包括至少15个核苷酸的长度，优选地19-25个核苷酸之间的长度。可以改造引物以特别地适于选择的核酸扩增系统。如本领域通常已知的，可以通过考虑寡核苷酸引物与其靶向的序列的杂交的解链点设计该寡核苷酸引物(Sambrook等，同上)。
在一些实施方案中，可以使用反向和正向引物对从相同的DNA样品(消化的样品)扩增限制性基因座和对照基因座，所述反向和正向引物对如本领域已知地被设计为特异性地扩增每种基因座。在一些实施方案中，引物可以被设计为扩增基因座连同其5’和3’侧翼序列。
在一些实施方案中，5’侧翼序列可以包含1-60个之间的碱基。在另外的实施方案中，5’侧翼序列为在10-50个之间的碱基。例如，5’侧翼序列可以包含紧邻基因座上游的10个碱基、15个碱基、20个碱基、25个碱基、30个碱基、35个碱基、40个碱基、45个碱基或50个碱基。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，3’侧翼序列可以包含1-60个之间的碱基。在另外的实施方案中，3’侧翼序列为在10-50个之间的碱基。例如，3’侧翼序列可以包含紧邻基因座下游的10个碱基、15个碱基、20个碱基、25个碱基、30个碱基、35个碱基、40个碱基、45个碱基或50个碱基。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，引物可以被设计为生成长度为60-150bp之间的扩增产物。在一些具体实施方案中，引物可以被设计为生成长度为70-140bp之间的扩增产物。
在一些实施方案中，方法包括在相同的反应混合物中同时扩增多于一种靶序列(至少一种限制性基因座和一种对照基因座)，这是一种被称为多重扩增或共扩增的过程。该过程要求同时使用多个引物对。如本领域已知的，可以设计引物以使得它们可以在扩增期间在相同的退火温度工作。在一些实施方案中，在本文公开的方法中使用具有相似解链温度(Tm)的引物。对于以混合物(pool)使用的引物，在约3℃-5℃之间的Tm变化被认为是可接受的。
在一些实施方案中，所有的限制性基因座和对照基因座可以在单个反应混合物中扩增。在其他实施方案中，例如由于特定仪器的技术限制，可以将消化的DNA样品分成若干等份，每一等份补充有用于扩增一种或更多种限制性基因座和对照基因座的引物对。因此，即使DNA样品被分成若干等份，在每个等份中扩增对照基因座，并进行一起扩增(即，来自同一等份)的对照基因座和限制性基因座的信号比率的计算。
在一些实施方案中，方法可以在消化和扩增步骤中使用源自人细胞系的一种或更多种对照DNA。
对照DNA可以被用于评价消化和扩增过程，例如监测消化和扩增步骤的有效性和质量。在一些实施方案中，对照DNA和测试DNA样品通过至少一种甲基化敏感性限制性酶消化。在一些实施方案中，对照DNA和测试DNA样品经历至少一种限制性基因座和对照基因座的PCR扩增。
在一些实施方案中，第一对照DNA包括来自其中所述至少一种限制性基因座大部分被甲基化的人细胞系的DNA。在一些具体实施方案中，第一对照DNA包括来自HCT-15细胞系的DNA。
在一些实施方案中，第二对照DNA包括来自其中本文公开的限制性基因座的一些限制性基因座大部分未被甲基化的人细胞系的DNA。在一些具体实施方案中，第二对照DNA包括来自A673细胞系的DNA。
在第一对照DNA中，用甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化后，本文公开的限制性基因座大部分保持完整。在随后的扩增步骤中，本文公开的限制性基因座被大大扩增(wellamplified)。如本文公开的对照基因座在第一对照DNA中也被大大扩增。
如此，检测第一对照DNA中限制性基因座和对照基因座的充分扩增指示，本发明方法中的扩增步骤是成功的。
如本文使用的，“充分扩增(adequate amplification)”是指荧光水平高于100,000个单位。
在第二对照DNA中，用甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化后，大部分未被甲基化的限制性基因座被彻底切割。在随后的扩增步骤中，这些限制性基因座显示低扩增或不扩增。如本文公开的对照基因座在第二对照DNA中被大大扩增。
如此，检测第二对照DNA中一种或更多种限制性基因座的低扩增或不扩增伴随对照基因座的充分扩增(如以上定义的)指示，本发明方法中的消化步骤是成功的。
如本文使用的，“低扩增或不扩增”是指限制性基因座的Cq与对照基因座的Cq之间的ΔCq为至少9个循环。
在一些实施方案中，基因组基因座的扩增可以利用实时PCR(RT-PCR)(也被称为定量PCR(qPCR))进行，其中扩增和扩增产物的检测同时进行。
在一些实施方案中，在RT-PCR中检测扩增产物可以使用多核苷酸探针，通常地荧光标记的多核苷酸探针，完成。
如本文使用的，“多核苷酸探针”或“寡核苷酸探针”可互换并且指与感兴趣的基因座的核酸序列内，例如限制性基因座或对照基因座的序列内的特定子序列互补的标记的多核苷酸。在一些实施方案中，检测基于组合的报告物和猝灭物分子(Roche MolecularSystems Inc.)通过利用TaqMan测定完成。在此类测定中，多核苷酸探针具有附连至其5’末端的荧光部分(荧光团)和附连至3’末端的猝灭物。在PCR扩增期间，多核苷酸探针与模板上的其靶序列选择性地杂交，并且随着聚合酶复制模板，由于聚合酶的5’核酸酶活性，它还裂解多核苷酸探针。当多核苷酸探针是完整的时，猝灭物和荧光部分之间紧密靠近，往往导致低水平的背景荧光。当多核苷酸探针被裂解时，猝灭物与荧光部分解偶联，导致荧光强度的增强。荧光信号与扩增产物的量相关联，即，信号随着扩增产物积累而增强。
如本文使用的，“与......选择性地杂交”(以及“选择杂交”、“与......特异性地杂交”和“特异性杂交”)指核酸分子(诸如引物或探针)在严格条件下优先与特定的互补核苷酸序列结合、双链化或杂交。术语“严格条件”指这样的条件：核酸分子在所述条件下将优先与其靶序列杂交，并且在较小程度上与其他非靶序列杂交或根本不与其他非靶序列杂交。在核酸杂交的上下文中的“严格杂交”是序列依赖性的，并且在不同的条件下不同，如本领域已知的。
多核苷酸探针的长度可以变化。在一些实施方案中，多核苷酸探针可以包含15-30个之间的碱基。在另外的实施方案中，多核苷酸探针可以包含25-30个之间的碱基。在一些实施方案中，多核苷酸探针可以包含20-30个之间的碱基，例如20个碱基、21个碱基、22个碱基、23个碱基、24个碱基、25个碱基、26个碱基、27个碱基、28个碱基、29个碱基、30个碱基。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
多核苷酸探针可以被设计为与模板的任一链结合。另外的考虑因素包括多核苷酸探针的Tm，其应优选地与引物的Tm相容。可以使用计算机软件来设计引物和探针。
如以上所述的，本文公开的方法可以包括在相同的反应混合物中同时扩增多于一种靶序列(至少一种限制性基因座和一种对照基因座)。为了区分平行扩增的多个靶序列，可以使用用不同荧光颜色标记的多核苷酸探针。
在一些实施方案中，多核苷酸探针形成如本领域已知的荧光团/猝灭物对，并且包括例如FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、Yakima Yellow-BHQ1、ATTO550-BHQ2和ROX-BHQ2。
在一些实施方案中，染料组合可以与选择的RT-PCR热循环仪相兼容。
在一些实施方案中，可以在每个PCR循环期间监测荧光，提供扩增曲线，该扩增曲线将来自探针的荧光信号的变化显示为循环数的函数。
在实时PCR的上下文中，使用以下术语：
“定量循环”(“Cq”)指其中荧光增强高于阈值的循环数，该阈值通过软件自动地设置或由使用者手动地设置。在一些实施方案中，阈值可以是对于所有基因座恒定的，并且可以在进行扩增和检测之前提前设置。在其他实施方案中，可以在运行后基于在扩增循环期间检测的每个基因座的最大荧光水平，分别定义该基因座的阈值。
“阈值”指用于Cq确定的荧光值。在一些实施方案中，阈值可以是高于基线荧光和/或高于背景噪音并且在扩增曲线的指数生长阶段内的值。
“基线”指其中存在很小或不存在荧光变化的PCR的初始循环。
可以使用计算机软件来分析扩增曲线并确定基线、阈值和Cq。
在用至少一种甲基化敏感性限制性酶消化之后，其中酶的识别位点中的CG二核苷酸被甲基化的基因座以高效率扩增，因为DNA分子被保护免于消化。结果是相对低的Cq值，因为可检测的扩增产物在相对少(低)的扩增循环数之后显示。相反，其中酶的识别位点中的CG二核苷酸未被甲基化的基因座在消化步骤期间被更彻底地切割，并且因此在扩增和定量步骤中导致较高的Cq值(即，在相对高的扩增循环数之后显示可检测的扩增产物)。
在可选的实施方案中，可以通过使用荧光标记的引物的常规PCR、随后进行扩增产物的毛细管电泳来进行扩增产物的扩增和检测。在一些实施方案中，在扩增后，通过毛细管电泳分离扩增产物，并定量荧光信号。在一些实施方案中，可以生成绘出作为大小(bp)或距注射的时间的函数的荧光信号变化的电泳图，其中电泳图中的每个峰对应于单个基因座的扩增产物。峰高(例如使用“相对荧光单位”，rFU提供)可以代表来自扩增的基因座的信号的强度。计算机软件可以被用来检测峰，并计算其扩增产物在毛细管电泳仪器上运行的一组基因座的荧光强度(峰高)以及随后信号强度之间的比率。
对于用甲基化敏感性限制性酶例如HinP1I消化的DNA样品，其中酶的识别位点中的CG二核苷酸被甲基化的基因座在电泳图中产生相对强的信号(较高的峰)。相反，其中酶的识别位点中的CG二核苷酸未被甲基化的基因座在电泳图中产生相对弱的信号(较低的峰)。
在一些实施方案中，引物的荧光标记物包括以下的任一种：荧光素、FAM、丽丝胺(lissamine)、藻红蛋白、罗丹明、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX、JOE、HEX、NED、VIC和ROX。
信号比率
如本文使用的术语“比率”或“信号比率”指从单个DNA样品中(相同的反应混合物中)的一对基因组基因座的共扩增，特别地限制性基因座和对照基因座的共扩增，获得的信号的强度之间的比率。
如本文使用的，“SEQ ID NO:X的比率”指在用如本文详述的限制性酶消化的DNA样品中的SEQ ID NO:X中列出的基因座和对照基因座这一对基因座的共扩增之后，SEQ IDNO:X中列出的基因座的信号强度和对照基因座的信号强度之间的比率。
如本文使用的术语“信号强度”指反映对应于完整拷贝的基因座的初始量的基因座特异性扩增产物的量的量度。然而，信号强度可以不指示扩增产物/完整基因座的实际量，并且可以不涉及扩增产物/完整基因座的任何绝对量的计算。因此，为了计算扩增子信号的比率，可以不需要标准曲线或参考DNA，因为不需要计算实际DNA浓度或DNA甲基化水平本身。
在一些示例性实施方案中，扩增以及扩增产物的检测通过RT-PCR进行，其中特定基因座的信号强度可以通过计算的该基因座的Cq表示。在该情况中，信号比率可以通过以下计算结果表示：2(对照基因座的Cq–限制性基因座的Cq)。
在另外的示例性实施方案中，扩增产物的检测通过毛细管电泳进行，其中特定基因座的信号强度为其对应峰的相对荧光单位(rfu)数。信号比率可以通过将每个限制性基因座的峰高除以对照基因座的峰高来计算。
在一些实施方案中，计算DNA样品中的限制性基因座和对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率包括：(i)确定限制性基因座的扩增产物的信号强度；(ii)确定对照基因座的扩增产物的信号强度；以及(iii)计算两种信号强度之间的比率。
在一些实施方案中，计算DNA样品中的限制性基因座和对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率包括：确定每种基因座的Cq，以及计算对照基因座的Cq和限制性基因座的Cq之间的差异。在一些实施方案中，该计算还包括应用下式：2^(对照基因座的Cq-限制性基因座的Cq)。
在一些实施方案中，计算信号比率可以是计算每种限制性基因座和对照基因座之间的多于一个信号比率。
在一些实施方案中，计算信号比率可以是计算SEQ ID NO:4中列出的限制性基因座和对照基因座之间的比率。
在一些实施方案中，扩增SEQ ID NO:1-6中列出的基因座中的多于一种基因座，其中方法包括计算SEQ ID NO:1-6中列出的基因座的每一种和对照基因座之间的比率，例如SEQ ID NO:1中列出的基因座和对照基因座之间的比率、SEQ ID NO:2中列出的基因座和对照基因座之间的比率等。
在一些实施方案中，可以使用计算机软件来计算扩增产物的信号强度之间的比率。
参考比率
术语“参考比率”或“参考信号比率”可互换使用，并且指在来自已知来源的DNA中确定的信号强度比率。给定的一对限制性基因座和对照基因座的参考比率可以以很多种方式表示。在一些实施方案中，给定的一对基因座的参考比率可以是单个比率。在一些实施方案中，给定的一对基因座的参考比率可以是从来自已知来源的大的DNA样品组获得的统计值，诸如大的参考比率组的平均值，例如，在大的癌症患者组中确定的平均值或在大的健康个体组中确定的平均值。
在其他实施方案中，给定的一对基因座的参考比率可以是多于一种比率，诸如在来自已知来源的大的DNA样品组中确定的该对基因座的比率分布。在一些实施方案中，参考比率可以是参考标度。
在一些实施方案中，给定的一对基因座的参考标度可以包括在来自相同参考来源的多于一个DNA样品中测量的该对基因座的信号比率。例如，参考肺癌患者的参考标度或参考健康个体的参考标度。在其他实施方案中，给定的一对基因座的参考标度可以包括来自健康个体和患病个体两者的信号比率，即组合了来自两种来源的参考比率的单个标度。通常，当使用单个标度时，对值进行分布以使得来自健康个体的值在标度的一端，例如低于截止值(cutoff)，而来自癌症患者的值在标度的另一端，例如高于截止值。在一些实施方案中，可以将计算的来自未知来源的测试DNA样品的信号比率与健康和/或癌症参考比率的参考标度相比较，并且概率评分可以是基于计算的信号比率在标度内的相对位置分配至该计算的信号比率的评分。在一些实施方案中，计算的信号比率越高，分配至其的评分越高，并且相应地，关于肺癌的概率高。
术语“肺癌参考比率”或“肺癌DNA中的参考比率”可互换地指在来自肺癌患者的血浆样品的DNA中测量的给定的限制性基因座和给定的对照基因座之间的信号强度比率。肺癌参考比率代表肺癌DNA，即来自肺癌患者的血浆样品的DNA中的信号强度比率。肺癌参考比率可以是单个比率、统计值或多于一个比率(例如，分布)，如以上详述的。
术语“健康参考比率”、“正常参考比率”或“健康DNA中的参考比率”可互换地指在来自正常个体的血浆样品中测量的给定的限制性基因座和给定的对照基因座之间的信号强度比率。在本文中，“健康”或“正常”个体被定义为通过常规诊断方法确定时无可检测的肺疾病或症状、和/或肺相关疾病(包括肺癌)的个体。健康参考比率代表正常DNA，即来自健康个体的血浆样品的DNA中的信号强度比率。健康参考比率可以是单个比率、统计值或多于一个比率(例如，分布)，如以上详述的。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括预先确定来自肺癌DNA的参考比率。在一些实施方案中，本发明的方法包括预先确定来自正常DNA的参考比率。
如以上所述的，信号比率可以通过多种方法确定，包括例如在毛细管电泳后测量峰或在RT-PCR后计算Cq。要理解的是，利用本文公开的方法获得参考比率以及测量的未知来源的测试样品的比率以确定肺癌。
确定肺癌
在一些实施方案中，本文公开的方法基于与参考比率相比评价计算的来自未知来源的血浆样品的DNA的信号比率来鉴定肺癌。
在一些实施方案中，计算的信号比率指示DNA是肺癌DNA。
本领域技术人员将领会到，计算的测试样品的信号比率与相应的参考信号比率的比较可以利用多种统计手段以很多种方式进行。
在一些实施方案中，将计算的给定的一对基因座的测试信号比率与参考信号比率比较包括将测试信号比率与单个参考值比较。单个参考值可以对应于获得的来自大的癌症患者群体或健康个体群体的参考信号比率的平均值。在其他实施方案中，将计算的给定的一对基因座的测试信号比率与参考信号比率比较包括将测试信号比率与多于一个参考信号比率的分布或标度进行比较。
可以采用已知的统计手段，以确定计算的给定的限制性基因座和对照基因座之间的信号比率是对应于肺癌参考比率还是对应于正常参考比率。在一些实施方案中，检测到计算的比率与肺癌参考比率紧密接近将受试者鉴定为患有肺癌的受试者。相反，在一些实施方案中，检测到计算的比率与正常参考比率紧密接近则将受试者鉴定为未患有肺癌的受试者。
本发明的方法是基于分析测试的DNA样品的信号比率是否是肺癌比率，即是否指示肺癌。在一些实施方案中，方法包括将计算的信号比率与其相应的健康参考比率(即，与对健康受试者的同一对基因座确定的信号比率)比较，以获得反映计算的信号比率是肺癌比率的可能性的评分(概率评分)。在一些实施方案中，方法包括将计算的信号比率与其相应的肺癌参考比率(即，与确定的肺癌中的同一对基因座的信号比率)比较，以获得反映计算的信号比率是肺癌比率的可能性的概率评分。计算的信号比率与肺癌参考比率越接近，概率评分越高并且相应地计算的信号比率是肺癌比率的可能性越高。在一些实施方案中，概率评分是基于计算的信号比率在肺癌参考比率的分布内的相对位置。
在一些实施方案中，方法包括将计算的多于一种限制性基因座关于对照基因座的多于一种信号比率与其相应的健康和/或肺癌参考比率比较。
在一些实施方案中，信号比率的模式可以利用统计手段和计算机化的算法来分析，以确定其代表肺癌的模式还是正常的健康模式。例如在属于本发明的申请人的WO2011/070441中公开了示例性算法。算法可以包括但不限于机器学习和模式识别算法。
在一些示例性实施方案中，可以将每个计算的比率(针对每对限制性基因座和对照基因座)，与从来自癌症患者、未罹患癌症的个体、或两者的大的血浆样品组生成的该对的参考比率的标度进行比较。标度可以代表在来自癌症患者和/或正常个体的大量样品中计算的限制性基因座和对照基因座对之间的信号比率。标度可以呈现出阈值(在后文也被称为‘截止值’或‘预先定义的阈值’)，高于阈值的为对应于肺癌的参考比率并且低于阈值的为对应于健康个体的参考比率，或颠倒过来。
在一些实施方案中，在标度底部和/或低于截止值的较低的比率可以来自正常个体(健康，即未罹患肺癌)的样品，而在标度上部和/或高于预先确定的截止值的较高的比率可以来自癌症患者。对于每个比率(每种限制性基因座和对照基因座之间的比率)，可以基于其在标度上的相对位置给出评分，并且将每种基因座的个体评分组合来给出单个评分。在一些实施方案中，可以对个体评分求和来给出单个评分。在其他实施方案中，可以对个体评分求平均值来给出单个评分。在一些实施方案中，可以使用单个评分来确定受试者是否患有癌症，其中高于预先定义的阈值的评分指示肺癌。
在一些实施方案中，评分是0-100之间的数，其反映计算的信号比率是肺癌比率的概率，其中0为最低的概率并且100是最高的概率。在一些实施方案中，阈值评分被确定，其中等于或高于该阈值评分的评分指示肺癌。阈值可以是例如60、70或80。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在另外的示例性实施方案中，对于每个计算的比率(每种限制性基因座和对照基因座之间的比率)，其代表肺癌DNA的概率可以基于与相应的肺癌参考比率和/或正常参考比率的比较来确定，并且可以指定评分(概率评分)。因此，将计算的每个比率(针对每种基因座)的个体概率评分组合(例如对其求和或求平均值)，以给出组合评分。组合评分可以用于确定受试者是否患有癌症，其中高于预先定义的阈值的组合评分指示肺癌。
因此，在一些实施方案中，确定阈值或截止值评分，高于(或低于)该阈值或截止值评分，受试者被鉴定为患有肺癌。阈值评分将健康受试者群体与非健康受试者群体区分开来。
在一些实施方案中，本发明的方法包括提供阈值评分。
在一些实施方案中，确定阈值评分包括在健康或患有肺癌的大的受试者群体中测量信号比率。
在一些实施方案中，阈值为在统计学上显著的值。统计学显著性通常通过比较两个或更多个群体，并确定置信区间(CI)和/或p值来确定。在一些实施方案中，统计学上显著的值指置信区间(CI)为约90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％及99.99％，同时优选的p值为小于约0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或小于0.0001。每种可能性代表本发明的单独实施方案。根据一些实施方案，阈值评分的p值为至多0.05。
如本文使用的，当提及可测量的值时术语“约”意指包括从指定的值的+/-10％、更优选地+/-5％、甚至更优选地+/-1％、并且仍然更优选地+/-0.1％的变化。
在一些实施方案中，方法还包括将计算的给定的限制性基因座和对照基因座之间的信号比率与其相应的正常/健康参考比率进行比较，以获得概率评分，其中检测到所述比率关于相应的健康参考比率的低概率评分指示受试者患有肺癌。
在一些实施方案中，本文公开的方法的灵敏度可以是至少约75％。在一些实施方案中，方法的灵敏度可以是至少约80％。在一些实施方案中，方法的灵敏度可以是至少约85％。在一些实施方案中，方法的灵敏度可以是至少约90％。
在一些实施方案中，如本文使用的诊断测定的“灵敏度”指测试为阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。相应地，未被测定检测出的患病个体为“假阴性”。未患病并且在测定中测试为阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”为一(1)减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为无疾病、测试为阳性的那些受试者的比例。尽管特定的诊断方法可能不提供状况的最终诊断，但是如果该方法提供了有助于诊断的阳性指示，这就足够了。
在一些实施方案中，本文公开的方法的特异性可以是至少约65％。在一些实施方案中，方法的特异性可以是至少约70％。在一些实施方案中，方法的特异性可以是至少约75％。在一些实施方案中，方法的特异性可以是至少约80％。
肺癌治疗
在一些实施方案中，提供了用于治疗肺癌的方法，所述方法包括根据本发明的方法鉴定肺癌，以及向所述受试者施用抗癌疗法。
用于治疗肺癌的方法可以包括以下的一种或更多种：外科手术以去除肿瘤；射频消融(RFA)；放射疗法；化学疗法；靶向疗法；以及免疫疗法，如本领域已知的。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
试剂盒
在一些实施方案中，提供了一种用于鉴定人受试者的肺癌的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒用于根据本发明的方法鉴定肺癌。在一些实施方案中，试剂盒包括：至少一种甲基化敏感性限制性酶；用于扩增至少一种限制性基因座和至少一种对照基因座的引物对；用于检测至少一种限制性基因座和至少一种对照基因座的扩增产物的工具；以及用于进行肺癌的鉴定的说明手册。在一些实施方案中，说明手册可以是电子说明手册。
在一些实施方案中，说明手册可以提供肺癌参考比率和/或健康参考比率。
在一些实施方案中，说明手册可以包括用于进行以上描述的方法步骤的说明。
在一些实施方案中，说明手册可以包括指导信号比率与肺癌参考比率和/或健康参考比率之间的关联性的说明。
在一些实施方案中，说明手册可以提供用于计算给定的限制性基因座的概率评分的说明。在一些实施方案中，说明手册可以提供用于计算多于一个概率评分的总评分的说明。在一些实施方案中，说明手册可以提供用于确定肺癌的阈值评分，高于该阈值评分，受试者被鉴定为患有肺癌。在其他实施方案中，说明手册可以提供用于确定肺癌的阈值评分，低于该阈值评分，受试者被鉴定为患有肺癌。
在一些实施方案中，试剂盒包括单种甲基化敏感性内切核酸酶。在一些实施方案中，甲基化敏感性内切核酸酶是HinP1I。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包括被储存在计算机可读介质上的计算机软件。在一些实施方案中，计算机软件可以是计算根据本文公开的方法的信号强度、信号比率和概率评分中的至少一种并输出给定的DNA样品是肺癌DNA还是健康DNA的计算机软件。
在一些实施方案中，试剂盒包括：HinP1I；与如本文描述的至少一种限制性基因座和至少一种对照基因座互补的引物对；以及与至少一种限制性基因座和至少一种对照基因座互补的荧光多核苷酸探针。
用于扩增SEQ ID NO:1-6中列出的限制性基因座的示例性引物在如下的SEQ IDNO:8-79中列出：
基因座1(SEQ ID NO:1)
正向引物：
反向引物：
基因座2(SEQ ID NO:2)
正向引物：
反向引物：
基因座3(SEQ ID NO:3)
正向引物：
反向引物：
基因座4(SEQ ID NO:4)
正向引物：
反向引物：
基因座5(SEQ ID NO:5)
正向引物：
反向引物：
基因座6(SEQ ID NO:6)
正向引物：
反向引物：
用于扩增SEQ ID NO:7中列出的对照基因座的示例性引物在如下SEQ ID NO:80-91中列出：
对照基因座(SEQ ID NO:7)
正向引物：
反向引物：
在一些实施方案中，试剂盒包括第一对照构建体和第二对照构建体的至少一种，每种对照构建体包含如以上描述的人细胞系DNA。在一些实施方案中，试剂盒包括如以上描述的第一对照DNA和第二对照DNA两者。
在一些实施方案中，试剂盒包括填充有至少一种核苷酸引物对的一个或更多个容器。在一些实施方案中，本发明的试剂盒中包括的每种核苷酸引物对可以包括与选自SEQID NO:1-6中列出的限制性基因座的限制性基因座内的子序列或与其侧翼序列互补的引物，其中所述每种核苷酸引物对被设计为选择性地扩增基因组的包含该基因座的片段。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于选择性地扩增以上描述的基因座的组合的引物对。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包括寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针用于检测使用试剂盒中的引物扩增的基因座的扩增产物。每种寡核苷酸探针可以与基因座内的子序列互补，并且可以能够与其杂交。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可以是荧光标记的。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包括DNA消化、基因座扩增和扩增产物的检测所需要的至少一种另外的成分，诸如DNA聚合酶和核苷酸混合物。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包括用于消化和扩增的合适的反应缓冲液，以及用于进行肺癌鉴定的书面方案。书面方案可以包括用于进行本文公开的任一步骤的说明，包括但不限于DNA消化参数、PCR循环参数、信号比率分析以及与参考比率的比较。
以下实施例被展示以更充分地说明本发明的某些实施方案。但是，它们绝不应以任何方式被解释为限制本发明的广泛的范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化和修改，而不背离本发明的范围。
实施例
实施例1-用于检测肺癌的基因组基因座
六(6)种人基因组基因座被鉴定为与来自无肺癌或其他肺疾病的个体的血浆的DNA相比在来自肺癌患者的血浆的DNA中具有增加的甲基化(下文表1，SEQ ID NO:1-6)。发现这些基因座使得能够区分来自肺癌患者的血浆的DNA和来自正常个体(未罹患肺癌或其他肺疾病)的血浆的DNA。
表1-基因组基因座
*描述指在hg18基因组构造(build)上的位置
实施例2-测试基因组基因座的小组(panel)
从年龄超过50岁的133名肺癌患者和未罹患肺癌的121名健康受试者获取血浆样品，他们现在或过去是抽烟者。在肺癌患者群体中，49名患有鳞状细胞癌，50名患有腺癌，2名患有混合型非小细胞肺癌，且4名患有其他类型的非小细胞肺癌。11名患者患有小细胞肺癌，另有17名患者患有组织学类型未知的肺癌。在非小细胞肺癌群体中，18名患者患有I期疾病，17名患者患有II期疾病，49名患者患有III期疾病，32名患者患有IV期疾病，并且6名患者的阶段未知。在小细胞肺癌群体中，4名患者具有局限期疾病(limited disease)，且7名患者具有广泛期疾病(extensive disease)。
使用循环核酸试剂盒(Circulating Nucleic Acid Kit)(QIAGEN,Hilden,Germany)从血浆样品提取DNA。如图2中概述的处理从每个样品提取的DNA。简而言之，使提取的DNA经历用甲基化敏感性限制性内切核酸酶HinP1I消化。消化反应物(总体积100微升)包括80微升提取的DNA(未定量)和在消化缓冲液中的HinP1I。在37℃进行消化持续2小时。
接下来，对消化的DNA样品进行实时PCR，以在每个DNA样品中扩增以上表1中详述的6种限制性基因座和如SEQ ID NO:7中列出的对照基因座(参见表1)。对照基因座是不含HinP1I的识别序列并且不管其甲基化状态如何当用限制性酶消化DNA样品时保持完整的基因座。该对照基因座(也被称为内部参考基因座)具有在用HinP1I消化后不受甲基化影响的扩增模式。
具体地，将每个消化的DNA样品分成三(3)个包含12微升消化的DNA的等份。将每个等份补充用于扩增6个限制性基因座中的2个限制性基因座和对照基因座(对照基因座将在每个等份中都被扩增)的引物对。在77至139个碱基之间的扩增子被扩增。
每个扩增反应物(总体积30微升)还包含dNTP和反应缓冲液。为了使得能够在扩增期间检测扩增产物，向反应物添加荧光标记的多核苷酸探针(每种基因座一种)。使用以下荧光标记物：FAM、JOE、ROX。在ABI 7500FastDx仪器中用以下PCR程序进行实时PCR反应：95℃,10min->45X(95℃,15sec)->60℃,1min。
扩增后，对关于作为循环数的函数的来自探针的荧光信号的水平的数据进行分析，以计算每种基因座的定量循环(Cq)和每种限制性基因座的ΔCq(限制性基因座的Cq与对照基因座的Cq之间的差异)。
图1A和图1B显示了来自癌症患者的样品(图1A)和来自健康受试者的样品(图1B)中的对照基因座和两种限制性基因座的示例性定量PCR曲线。在来自癌症患者的样品中，其中限制性基因座具有高甲基化水平并因此在用HinP1I消化时几乎保持完整，两种限制性基因座以高效率被扩增，即它们的Cq与对照基因座的Cq之间的差异(ΔCq)为约3个循环。在健康样品中，其中限制性基因座的特征为低甲基化水平并因此当用HinP1I消化时被彻底切割，扩增效率比对照基因座的扩增效率低的多，反映为相对于对照基因座的高ΔCq。如可从图获知的，在癌症患者和健康受试者之间限制性基因座相对于对照基因座的ΔCq值不同。
对于每个样品，如下计算限制性基因座1-6(SEQ ID No:1-6)的每一种的信号强度和对照基因座(SEQ ID No:7)的信号强度之间的比率：确定每种限制性基因座和对照基因座的Cq。Cq值被用于下式：
2(对照基因座的Cq–限制性基因座的Cq)。
要理解的是，计算是针对在同一等份中共扩增的限制性基因座和对照基因座进行的。
获得的每种限制性基因座相对于对照基因座的数值代表该限制性基因座和对照基因座之间的信号比率(反映甲基化比率)。
总而言之，计算每个样品的6个信号比率。表2列出了对来自健康受试者的10个血浆样品和来自肺癌患者的10个样品计算的示例性信号比率。如可从表中看出的，对癌症样品计算的信号比率比对健康样品计算的信号比率显著更高(高多达七个数量级)。
接下来，计算每个样品中每个基因座的评分(概率评分)，该评分是将信号比率关于参考比率归一化，使得最高信号比率评分为“100”，且最低信号比率评分为“0”。
接下来，将对每个样品获得的六个评分合并为单个评分，称为“EpiScore”，它是在0和100之间的数字，反映了在6个限制性基因座小组，样品的总体相对甲基化水平。
表2列出了示例性信号比率和EpiScore，表明较高的EpiScore与肺癌相关(根据Kolmogorov-Smirnov良好拟合假设检验，对于整组样品，P＝2.44·10-25)，突显了使用本发明的方法区分肺癌患者的血浆样品和正常/健康个体的血浆样品的优势。
如果样品的EpiScore大于或等于70(基于来自之前样本组的信息确定的阈值)则样品被分类为“肺癌”，并且如果其EpiScore低于70则样品被分类为“健康”。
表2-信号比率
计算SEQ ID NO:4中列出的基因座以及基因座1-6的组合关于肺癌的鉴定的灵敏度、特异性和ROC曲线下面积(AUC)。数据被总结于表3。
表3-灵敏度、特异性和AUC
以上具体实施方案的描述将如此完全地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用现有的知识，容易地为各种应用修改和/或调整此类具体实施方案而不需要过度实验且不背离一般概念，且因此，此类调整和修改应当并且预期被包含在本公开的实施方案的等同实施方案的含义和范围内。应理解的是，本文采用的措辞或术语是为了描述而非限制的目的。用于进行多种公开的化学结构和功能的手段、材料和步骤可采取多种替代形式而不背离本发明。
本申请还提供了以下实施方案：
1.一种用于鉴定人受试者的肺癌的方法，所述方法包括：
(a)将来自从所述受试者获得的血浆样品的DNA应用于用至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化，以获得限制性内切核酸酶处理的DNA；
(b)从所述限制性内切核酸酶处理的DNA共扩增包含SEQ ID NO:4中列出的基因座的至少一种限制性基因座和对照基因座，从而生成每种基因座的扩增产物；
(c)计算所述至少一种限制性基因座的每一种和所述对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率；以及
(d)检测所述比率关于肺癌比率的高概率评分，从而鉴定人受试者的肺癌。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述至少一种限制性基因座还包括选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中列出的基因座的组的至少一种另外的限制性基因座，并且所述概率评分为所述SEQ ID NO:4的比率以及所述至少一种另外的限制性基因座的至少一种另外的比率关于肺癌比率的组合概率评分。
3.如实施方案2所述的方法，其中所述至少一种另外的限制性基因座包括SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中列出的所有基因座，并且所述组合概率评分为SEQ ID NO:4的比率、SEQ ID NO:1的比率、SEQ ID NO:2的比率、SEQID NO:3的比率、SEQ ID NO:5的比率和SEQ ID NO:6的比率关于肺癌比率的组合概率评分。
4.如实施方案1所述的方法，所述方法还包括：
提供第一对照DNA和第二对照DNA，所述第一对照DNA和所述第二对照DNA各自包括人细胞系来源的DNA，其中所述第一对照DNA包括来自其中所述至少一种限制性基因座大部分被甲基化的人细胞系的DNA，且所述第二对照DNA包括来自其中所述至少一种限制性基因座的一种或更多种大部分未被甲基化的人细胞系的DNA；
用所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化所述第一对照DNA和所述第二对照DNA；以及
从所述第一对照DNA和所述第二对照DNA扩增所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座；
其中所述第一对照DNA中所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座的充分扩增的检测指示成功的DNA扩增，且其中所述第二对照DNA中所述至少一种限制性基因座的一种或更多种的低扩增或不扩增伴随所述对照基因座的正常扩增指示成功的DNA消化。
5.如实施方案4所述的方法，其中，所述其中所述至少一种限制性基因座大部分被甲基化的人细胞系是HCT-15。
6.如实施方案4所述的方法，其中，所述其中所述至少一种限制性基因座的一种或更多种大部分未被甲基化的人细胞系是A673。
7.如实施方案1所述的方法，其中所述至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶选自由以下组成的组：AatII、Acc65I、AccI、Acil、ACII、Afel、Agel、Apal、ApaLI、AscI、AsiSI、Aval、AvaII、BaeI、BanI、BbeI、BceAI、BcgI、BfuCI、BglI、BmgBI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BseYI、BsiEI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspDI、BsrBI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstAPI、BstBI、BstUI、BstZl7I、Cac8I、ClaI、DpnI、DrdI、EaeI、EagI、Eagl-HF、EciI、EcoRI、EcoRI-HF、FauI、Fnu4HI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HincII、Hinfl、HinP1I、HpaI、HpaII、Hpyl66ii、Hpyl88iii、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、MmeI、MspAlI、MwoI、NaeI、NacI、NgoNIV、Nhe-HFI、NheI、NlaIV、NotI、NotI-HF、NruI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PleI、PmeI、PmlI、PshAI、PspOMI、PvuI、RsaI、RsrII、SacII、Sall、SalI-HF、Sau3AI、Sau96I、ScrFI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TfiI、TscI、TseI、TspMI和ZraI。
8.如实施方案1所述的方法，其中步骤(a)使用一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶进行。
9.如实施方案8所述的方法，其中所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶为HinP1I。
10.如实施方案8所述的方法，其中所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶为HhaI。
11.如实施方案1所述的方法，其中所述对照基因座是缺乏所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶的识别序列的基因座。
12.如实施方案1所述的方法，其中所述对照基因座是SEQ ID NO:7中列出的基因座。
13.如实施方案1所述的方法，其中步骤(b)利用实时PCR进行。
14.如实施方案13所述的方法，其中所述方法还包括添加荧光探针用于特异性地检测所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座的扩增产物。
15.如实施方案14所述的方法，其中所述计算所述至少一种限制性基因座的每一种和所述对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率包括确定每种基因座的定量循环(Cq)和计算2(Cq对照基因座-Cq限制性基因座)。
16.如实施方案15所述的方法，其中所述相应的肺癌参考比率为2(Cq 对照基因座-Cq限制性基因座)，其中所述参考DNA是肺癌DNA。
17.如实施方案1所述的方法，包括提供源自健康受试者的DNA中的所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座的扩增产物的信号强度之间的健康参考比率。
18.如实施方案1所述的方法，包括提供源自患有肺癌的受试者的DNA中的所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座的扩增产物的信号强度之间的肺癌参考比率。
19.如实施方案1所述的方法，所述方法还包括检测所述比率关于健康比率的低概率评分。
20.如实施方案1所述的方法，其中所述肺癌选自由以下组成的组：非小细胞肺癌(NSCLC)亚型鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌，以及小细胞肺癌。
21.一种治疗有相应需要的受试者中的肺癌的方法，所述方法包括根据实施方案1所述的方法鉴定肺癌，以及向所述受试者施用抗癌疗法。
22.如实施方案21所述的方法，其中所述抗癌疗法包括以下的一种或更多种：外科手术、射频消融(RFA)、放射疗法、化学疗法、靶向疗法和免疫疗法。

Claims (10)

1.一种用于鉴定人受试者的肺癌的方法，所述方法包括：
(a)将来自从所述受试者获得的血浆样品的DNA应用于用至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化，以获得限制性内切核酸酶处理的DNA；
(b)从所述限制性内切核酸酶处理的DNA共扩增包含SEQ ID NO:4中列出的基因座的至少一种限制性基因座和对照基因座，从而生成每种基因座的扩增产物；
(c)计算所述至少一种限制性基因座的每一种和所述对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率；以及
(d)检测所述比率关于肺癌比率的高概率评分，从而鉴定人受试者的肺癌。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种限制性基因座还包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6中列出的基因座的组的至少一种另外的限制性基因座，并且所述概率评分为所述SEQ ID NO:4的比率以及所述至少一种另外的限制性基因座的至少一种另外的比率关于肺癌比率的组合概率评分。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述至少一种另外的限制性基因座包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6中列出的所有基因座，并且所述组合概率评分为SEQ ID NO:4的比率、SEQ ID NO:1的比率、SEQ ID NO:2的比率、SEQ IDNO:3的比率、SEQ ID NO:5的比率和SEQ ID NO:6的比率关于肺癌比率的组合概率评分。
4.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
提供第一对照DNA和第二对照DNA，所述第一对照DNA和所述第二对照DNA各自包括人细胞系来源的DNA，其中所述第一对照DNA包括来自其中所述至少一种限制性基因座大部分被甲基化的人细胞系的DNA，且所述第二对照DNA包括来自其中所述至少一种限制性基因座的一种或更多种大部分未被甲基化的人细胞系的DNA；
用所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化所述第一对照DNA和所述第二对照DNA；以及
从所述第一对照DNA和所述第二对照DNA扩增所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座；
其中所述第一对照DNA中所述至少一种限制性基因座和所述对照基因座的充分扩增的检测指示成功的DNA扩增，且其中所述第二对照DNA中所述至少一种限制性基因座的一种或更多种的低扩增或不扩增伴随所述对照基因座的正常扩增指示成功的DNA消化。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述其中所述至少一种限制性基因座大部分被甲基化的人细胞系是HCT-15。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述其中所述至少一种限制性基因座的一种或更多种大部分未被甲基化的人细胞系是A673。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶选自由以下组成的组：AatII、Acc65I、AccI、Acil、ACII、Afel、Agel、Apal、ApaLI、AscI、AsiSI、Aval、AvaII、BaeI、BanI、BbeI、BceAI、BcgI、BfuCI、BglI、BmgBI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BseYI、BsiEI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspDI、BsrBI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstAPI、BstBI、BstUI、BstZl7I、Cac8I、ClaI、DpnI、DrdI、EaeI、EagI、Eagl-HF、EciI、EcoRI、EcoRI-HF、FauI、Fnu4HI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HincII、Hinfl、HinP1I、HpaI、HpaII、Hpyl66ii、Hpyl88iii、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、MmeI、MspAlI、MwoI、NaeI、NacI、NgoNIV、Nhe-HFI、NheI、NlaIV、NotI、NotI-HF、NruI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PleI、PmeI、PmlI、PshAI、PspOMI、PvuI、RsaI、RsrII、SacII、Sall、SalI-HF、Sau3AI、Sau96I、ScrFI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TfiI、TscI、TseI、TspMI和ZraI。
8.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)使用一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶进行。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶为HinP1I。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶为HhaI。
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IL265451B (en) 2019-03-18 2020-01-30 Frumkin Dan Methods and systems for the detection of methylation changes in DNA samples
US20210304896A1 (en) * 2020-03-31 2021-09-30 Shanghai United Imaging Intelligence Co., Ltd. Systems and methods for medical diagnosis
WO2023175434A1 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Diagenode S.A. Detection of methylation status of a dna sample
KR20240104309A (ko) * 2022-12-27 2024-07-05 (주)지노믹트리 폐암 특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 폐암 검출 방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8399193B2 (en) * 2007-08-30 2013-03-19 City Of Hope DNA methylation biomarkers for lung cancer
WO2011001274A2 (en) 2009-07-02 2011-01-06 Nucleix Methods for distinguishing between natural and artificial dna samples
PL2510124T3 (pl) 2009-12-11 2018-03-30 Nucleix Kategoryzacja próbek DNA
AU2012321248A1 (en) 2011-09-30 2014-04-24 Genentech, Inc. Diagnostic methylation markers of epithelial or mesenchymal phenotype and response to EGFR kinase inhibitor in tumours or tumour cells
US9476100B1 (en) * 2015-07-06 2016-10-25 Nucleix Ltd. Methods for diagnosing bladder cancer
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